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Einleitung: Um die empfindlichen Nervenzellen des Gehirns vor den Einflüssen schädigender Substanzen im systemisch zirkulierenden Blut zu schützen, besitzen höhere Lebewesen einen Barrieremechanismus, der das zentrale Nervensystem (ZNS) nach außen hin abriegelt. Diese Blut-Hirn-Schranke (BHS) wird durch die Gefäßendothelzellen im Gehirn gebildet, die über eine Kombination mehrerer Mechanismen Substanzen vom Eindringen in das Gehirngewebe abhalten. Zum einen stellt die Existenz dieser Barriere einen lebensnotwendigen Schutz dar, zum anderen jedoch bedeutet sie eine große Hürde in der Pharmakotherapie von Erkrankungen des zentralen Nervensystems, da nur wenige Arzneimittel in der Lage sind sie zu überwinden. Eine gute Gehirngängigkeit besitzen in der Regel kleine Moleküle mit einer hohen Lipophilie oder solche, die aktiv über Transporter oder Rezeptoren in das ZNS aufgenommen werden. Alle anderen Substanzen, wie effektiv sie auch im restlichen Körper sein mögen, stehen für die Therapie zerebraler Krankheiten wie z.B. Epilepsie, Alzheimer, Gehirntumore oder ZNS-HIV unter normalen Umständen nicht zur Verfügung. Das Gebiet der kolloidalen Trägersysteme bietet eine Lösung für dieses Problem. Durch den Einsatz von Liposomen oder Nanopartikeln als „Carrier“ können verschiedene Arzneistoffe aktiv in das Gehirn transportiert warden, um dort ihre Wirkung zu entfalten. Des Weiteren führt ein solches „Drug targeting“ nicht nur zu einer Überwindung der BHS sondern gleichzeitig zu einer vermehrten Anreicherung des Arzneistoffs im ZNS und dadurch zu geringeren Nebenwirkungen im restlichen Organismus. Durch die erhöhte Selektivität für das ZNS können kleinere und somit für den Körper verträglichere Dosen des Arzneistoffs eingesetzt werden. In der Vergangenheit konnte gezeigt werden, dass unter anderem Nanopartikel aus humanem Serumalbumin, welche mit Polysorbat 80 überzogen waren oder deren Oberfläche mit Apolipoproteinen modifiziert wurde, Arzneistoffe, die üblicherweise nicht in der Lage sind die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden, zentral zur Wirkung brachten. Der genaue Mechanismus, durch den diese Arzneistoffe mithilfe der Trägersysteme ins Gehirn gelangen,war bisher weitgehend ungeklärt. Ein Eindringen des arzneistoffbeladenen Nanopartikels als Ganzes in das Gehirn sowie die Einleitung 2 Vermittlung des Arzneistoff-Transportes durch das Partikel am Endothel oder gar eine unselektive Zerstörung der Barrierefunktion wurden diskutiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden mit Apolipoproteinen modifizierte Partikel aus humanem Serumalbumin hergestellt und hinsichtlich ihrer Größe, der Größenverteilung, des Partikelgehaltes, der Oberflächenladung und ihres morphologischen Erscheinungsbildes charakterisiert. Anschließend wurde die Interaktion dieser kolloidalen Trägersysteme mit isolierten Endothelzellen des Nagergehirns mittels verschiedener Analytiken untersucht. Gleichzeitig wurden in umfangreichen Untersuchungen an Mäusen und Ratten die Geschehnisse in vivo beleuchtet und mit Hilfe eines bildgebenden Verfahrens, der Elektronenmikroskopie, dargestellt. Des Weiteren wurde der Effekt einer nanopartikulären Applikation auf die Integrität der Barrierefunktion der BHS untersucht, wodurch eine schädliche Wirkung der Partikel ausgeschlossen und die der Aufnahme in das ZNS zugrunde liegenden Transportmechanismen aufgeklärt werden konnten.
The NS5B protein of the hepatitis C virus (HCV) is a RNA-dependent RNA polymerase, which is the key enzyme for viral replication. It is recognized as one of the promising targets for antiviral intervention within the new HCV treatment approach of direct-acting antivirals (DAA). However, several of the known non-nucleoside HCV polymerase inhibitors (NNIs) identified by screening approaches show limitations in the coverage of all six major HCV genotypes (GT). Genotypic profiling therefore has to be implemented early in the screening cascade to discover new broadly active NNIs. This implies knowledge of the specific individual biochemical properties of polymerases from all GTs which is to date limited to GT 1 only. The work submitted here gives a comprehensive overview of the biochemical properties of HCV polymerases derived from all major GTs 1 - 6. Biochemical analysis of polymerases from 38 individual sequences revealed that the optima for monovalent cations, pH and temperature were similar between the GTs, whereas significant differences concerning concentration of the preferred cofactor Mg2+ were identified. Implementing the optimal requirements for the polymerases from each individual GT led to significant improvements in their enzymatic activities. However, the specific activity was distributed unequally across the GTs and could be ranked in the following descending order: 1b, 6a > 2a, 3a, 4a, 5a > 1a. Furthermore, the optimized assay conditions for GT profiling were confirmed by testing the inhibitory activity of four known prototype NNIs, each addressing one of the four NNI binding sites. Additionally, a novel NNI chemotype - identified by screening - is described, the substituted N-phenyl-benzenesulphonamides (SPBS). This inhibitor class showed reversible inhibition of NS5B from HCV 1b Con1 with IC50 values up to 39 nM. Based on the decreased inhibitory activity against a recombinant NS5B protein carrying the mutation L419M, it was assumed that the SPBS inhibitors bound to the thumb site II as it has been described for the carboxy thiophene inhibitors. The postulated binding site was consequently confirmed by analysing a provided co-crystal structure of NS5B in complex with a SPBS analogue. Notably, the two SPBS analogues SPBS-1 and SPBS-2 reported here revealed significant differences in addressing the NH-group of the main chain Y477 by hydrogen-bonds, watermediated or directly, which provoked a shift of the carboxyphenyl group of the inhibitors towards the H475 position for the water-mediated binding mode. Interestingly, the differences observed in the binding mode led to a different cross resistance profile at positions M423 and I482. Using the previously optimized biochemical primer-dependent transcription assay, inhibitory activity of the SPBS could be demonstrated against polymerases from HCV GTs 1a and 1b whereas the inhibitor class failed to inhibit any of the non-GT 1 polymerases. Furthermore, initial antiviral activity for SPBS was demonstrated against the subgenomic replicons of HCV GTs 1a and 1b, respectively, and no considerable cytotoxic potential against a panel of ten different cell types. Finally, concerning a possible future treatment without PEG-IFN α or ribavirin, the SPBS analogues were found to display additive to synergistic effects in combination with the benzothiadiazine, the benzofuran and the indole - representative inhibitors for the binding sites palm I, palm II and thumb I, repectively - in the biochemical assay. Within the same binding site as the SPBS, the reference compound hydroxydihydropyranone displayed additive interactions only with the benzothiadiazine (palm I) in the biochemical assay as well as in cell culture. Hence it could be concluded that, having characterized one individual NNI, no universal predication is possible concerning the combinatory behaviour of NNIs binding to the same binding site. As synergistic, antagonistic or additive interactions are inhibitor-dependent (not binding sitedependent) each novel NNI has to be characterized individually in one-to-one combinations.
Einleitung: Glioblastome, die aggressivsten malignen Gehirntumore, gehören zu den menschlichen Karzinomen mit der schlechtesten Prognose. Ihre Therapie stellt eine große Herausforderung dar. Eine komplette chirurgische Entfernung des Tumors ist auf Grund des infiltrativen Wachstums in gesundes Hirngewebe meist nicht möglich, und trotz der Standardtherapie, die Operation, Chemo- und Radiotherapie umfasst, sind die Behandlungserfolge nicht zufriedenstellend. Erschwerend kommt hinzu, dass das Gehirn vom übrigen Organismus durch die hochselektive Blut-Hirn-Schranke abgegrenzt ist, welche für viele potentiell wirksame therapeutische Substanzen eine Permeabilitätsbarriere darstellt. Somit stehen viele Zytostatika für die systemische Glioblastomtherapie nicht zur Verfügung und eine relative Therapieresistenz ist zu verzeichnen.
Nicht nur die Neuentwicklung von Arzneistoffen für die Pharmakotherapie von Erkrankungen des zentralen Nervensystems, wie den Gehirntumoren, sondern auch die Etablierung neuer Arzneiformen zur kontrollierten, gewebsspezifischen Arzneistoffapplikation gewinnt immer mehr an Bedeutung.
Ein Ansatz, der in der Vergangenheit vielversprechende Erfolge erzielte, ist die Einbettung von Arzneistoffen in kolloidale Trägersysteme wie polymere Nanopartikel oder Liposome. Diese Carrier sind in der Lage verschiedene Arzneistoffe über die Blut-Hirn-Schranke zu transportieren, damit diese im zentralen Nervensystem ihre Wirkung ausüben können. Der Grund für diesen Erfolg ist offensichtlich begründet in der nanopartikulären Größe und der besonderen Oberflächenstruktur dieser Träger. Zusätzlich geht mit der vermehrten Anreicherung der Wirkstoffe im Zentralnervensystem eine Verminderung der unerwünschten Arzneimittelwirkungen in peripheren Organen einher, was die Therapie positiv beeinflusst.
In der vorliegenden Arbeit wird die antitumorale Effizienz nanopartikulärer Formulierungen, die den Wirkstoff Doxorubicin enthalten, eingehend untersucht. Hierbei liegt der Schwerpunkt auf der histologischen und immunhistochemischen Analyse der Gehirntumore, die eine genaue
Differenzierung zwischen den Zubereitungen und eine aussagekräftige Effizienzbeurteilung erlaubt. Weiterhin wird der Fokus dieser Arbeit auf die Quantifizierung der Doxorubicinmenge gerichtet, die nach Applikation der nanopartikulären Formulierungen im Gehirn vorliegt.
Enthält u.a. die Publikationen:
Publikation 1:
Transport of drugs across the blood-brain barrier by nanoparticles – A review
Journal of Controlled Release – Special Issue: Drug delivery research in Europe
Status: accepted, geplantes Erscheinungsdatum: 01.2012
Publikation 2:
Increased numbers of injections of doxorubicin bound to nanoparticles lead to enhanced efficacy against rat glioblastoma 101/8
Wohlfart et al. 2009, Journal of Nanoneuroscience, Volume 1, Number 2, December 2009, pp. 144-151 (8)
Publikation 3:
Treatment of glioblastoma with poly (isohexyl cyanoacrylate) nanoparticles
Wohlfart et al. 2011, International Journal of Pharmaceutics 415 (2011) 244-251
Publikation 4:
Drug delivery to the brain using surfactant-coated poly (lactide-co-glycolide)
nanoparticles: Influence of the formulation parameters
Gelperina et al. 2010, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 74 (2010) 157–163
Publikation 5:
Efficient chemotherapy of rat glioblastoma using doxorubicin-loaded PLGA nanoparticles with different stabilizers
Wohlfart et al. 2011, PloS One May 2011, Volume 6, Issue 5, e 19121
Publikation 6:
Kinetics of transport of doxorubicin bound to nanoaprticles across the blood-brain barrier
Wohlfart et al. 2011, Journal of Controlled Release (2011),
doi:10.1016/j.jconrel.2011.05.010, in press
Nanopartikuläre Arzneistoffsysteme sind ein viel versprechender Ansatz die speziellen Anforderungen, die an eine Arzneiform gestellt werden, zu erfüllen. Mit ihnen scheint das lang verfolgte Ziel der Pharmaforschung, das gezielte Transportieren ("Drug-Targeting") und das kontrollierte Freisetzen des Arzneistoffs am Wirkort ("Controlled Release") und damit das Minimieren unerwünschter Nebenwirkungen, in greifbare Nähe zu rücken. In der vorliegenden Arbeit konnte durch verschiedene Versuchsansätze in der präklinischen Testung der gezielte Wirkstofftransport zielgerichtet-modifizierter Nanopartikel (NP) auf humanem Serumalbumin (HSA)-Basis sowohl für das spezifische Tumor-Targeting als auch für die Überwindung der Blut-Hirn-Schranke (BHS) gezeigt werden. Die NP für das spezifische Tumor-Targeting waren mit dem Zytostatikum Doxorubicin beladen und mit dem tumorspezifischen Liganden Trastuzumab für ein Mammakarzinom-Zellen-Targeting oder DI17E6 für ein Melanom-Zellen-Targeting modifiziert. Ihre zielgerichtete Funktionalität konnte an verschiedenen Target-exprimierenden-Zelllinien gezeigt werden. Dabei konnte ihre spezifische zelluläre Bindung, Aufnahme und subzellulären Verteilung verifiziert werden. Die Ligand-modifizierten NP wurden bei diesen Untersuchungen spezifisch in die Zielzellen aufgenommen, während die unmodifizierten Kontroll-Partikel unspezifisch an der Zellmembran klebten. Die Freisetzung des Doxorubicins in einer biologisch aktiven Form konnte anhand entsprechender Zellviabilitäts-Assays gezeigt werden. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass der nanopartikulär transportierte Wirkstoff über den Rezeptor-internalisierenden Aufnahmeweg nicht in den Endosomen oder Lysosomen akkumulierte und damit inaktiv war, sondern dass er in wirksamer Form freigesetzt wurde. Als Besonderheit wurde mit DI17E6 für das spezifische Melanom-Zellen-Targeting ein Antikörper als ziel-orientierter Ligand eingesetzt, der zusätzliche anti-tumorale Eigenschaften hat, die bei der Ankopplung an die NP-Oberfläche erhalten werden sollten. Durch speziell entwickelte in vitro Assays, die auf diese Eigenschaften abzielten, konnte der Erhalt der biologischen Wirksamkeit des Antikörpers bestätigt werden. Mit derartigen nanopartikulären Formulierungen, basierend auf biologisch abbau¬barem HSA, modifiziert mit entsprechenden zielgerichteten Liganden und anti-tumoralen Wirkstoffen, sollte aufgrund der hier gezeigten präklinischen Daten eine spezifische Tumortherapie möglich sein. Zum Überwinden der BHS wurden NP getestet, die mit Apolipoprotein E (ApoE) modifiziert waren. Dabei handelte es sich zum einen um leere NP für Aufnahmemechanismus-Studien und zum anderen um Obidoxim-beladene NP für Transportstudien. Bei Obidoxim handelt es sich um einen Vertreter der Stoffklasse der Oxime. Diese werden als Antidote bei Organophosphat (OP)-Vergiftungen eingesetzt. Oxime können die nach einer OP-Vergiftung inhibierte lebensnotwendige Acetylcholinesterase (AChE) reaktivieren. Da Oxime die BHS aber kaum überwinden können, wird die in den zentralnervösen Kompartimenten inhibierte AChE nicht in therapeutisch ausreichendem Maß erreicht. Daher sollte beispielhaft Obidoxim nanopartikulär-vermittelt über die BHS transportiert werden. Für beide Formulierungen konnte die spezifische zelluläre Bindung, Aufnahme und die subzelluläre Verteilung sowie ihre für ein BHS-Targeting kompatiblen, untoxischen Eigenschaften gezeigt werden. Mit den ApoE-modifizierten unbeladenen NP konnte durch verschiedene Koinkubations- und Hemmexperimente eindeutig die Beteiligung der "Low Density Lipoprotein" (LDL)-Rezeptor-Familie, und besonders des "Low Density Lipoprotein Receptor Related Protein" (LRP), bei der spezifischen ApoE-vermittelten NP-Aufnahme gezeigt werden. Dabei ließ sich die NP-Aufnahme auf zwei Wegen hemmen. Zum einen konnte von der zellulären Seite aus der beteiligte Aufnahme-Rezeptors mit dem "Receptor Associated Protein" gehemmt werden, wodurch eine spezifische ApoE-vermittelte NP-Aufnahme über eine Rezeptor-Bindung verhindert wurde. Zum anderen konnte aber auch, durch Blockade des ApoE auf der Partikeloberfläche mittels löslicher Fragmente des LRP, die ApoE-vermittelte NP-Aufnahme von nanopartikulärer Seite gehemmt werden. Durch die Kenntnis des Aufnahmemechanismus der nanopartikulären Formulierungen sollte es für zukünftige Entwicklungen im breiten Feld der BHS-Forschung möglich sein, sehr spezifische und effektivere Carrier maßzuschneidern. Zu Untersuchungen des Wirkstofftransports wurden frisch isolierte porcine Gehirnkapillarendothel-Zellen im Transwell-System als adäquates in vitro BHS-Modell etabliert und eingesetzt. Für den Nachweis des tatsächlichen Obidoxim-Transports wurde ein biologischer Assay entwickelt, der gemäß der therapeutischen Funktion von Oximen nach OP-Vergiftungen auf die Reaktivierung OP-vergifteter AChE abzielte. Es konnte gezeigt werden, dass nanopartikuläre Formulierungen tatsächlich einen verbesserten Transport von Obidoximen gegenüber freiem Obidoxim in einem in vitro BHS-Modell vermitteln. Diese nanopartikulären Transportsysteme stellen daher ein bisher einzigartiges, viel versprechendes Hilfsmittel zum Transport von Oximen über die BHS dar. Durch die in dieser Arbeit dargestellten Untersuchungen konnte insgesamt gezeigt werden, dass NP auf HSA-Basis für einen zielgerichteten Wirkstofftransport geeignet sind und aufgrund ihrer biokompatiblen, bioabbaubaren Eigenschaften einen viel versprechenden Ansatz für die zukünftige Pharmaforschung darstellen.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der Einfluss des HIV-Protease-Inhibitors Saquinavir und seines Derivates Saquinavir-NO auf die ABC-Transporter vermittelte Chemoresistenz in Tumorzellen untersucht. Saquinavir-NO zeigte in drei verschiedenen Tumorentitäten stärkere zytotoxische Wirkung als Saquinavir. Weder die Expression der ABC-Transporter MDR1 oder BCRP1 noch der zelluläre p53-Status hatten einen Einfluss auf die Zellsensitivität. MDR1-exprimierende chemoresistente Tumorzellen wurden durch Saquinavir-NO stärker gegen ausgewählte Zytostatika resensitiviert als durch Saquinavir. An chemosensitiven MDR1-negativen Zellen wurden keine Effekte beobachtet. Des Weiteren wurde die Neuroblastomzelllinie UKF-NB-3 mit Hilfe lentiviraler Vektoren mit cDNA für MDR1 transduziert. In diesem MDR1-transduzierten Zellmodell wurde die Sensiti-vität gegen das MDR1-Substrat Vincristin durch Saquinavir-NO stärker erhöht als durch Saquinavir. Am Durchflusszytometer wurde der Einfluss von Saquinavir und Saquinavir-NO auf die intrazelluläre Akkumulation des fluoreszierenden MDR1-Substrates Rhodamin 123 untersucht. In MDR1-exprimierenden Zelllinien führte Saquinavir-NO zu einer deutlich stärkeren Akkumulation von Rhodamin 123 als Saquinavir. In MDR1-negativen Zellen wurden keine Effekte beobachtet. Mit Hilfe des MDR1-ATPase-Assays und Wash-Out-Kinetiken am Durchflusszytometer wurde die Frage geklärt, ob Saquinavir und Saquinavir-NO als Substrate oder als allosterische Inhibitoren für MDR1 fungieren. Die Ergebnisse beider Assays lassen den Schluss zu, dass sowohl Saquinavir als auch Saquinavir-NO jeweils ein Substrat für MDR1 darstellen. Um den Einfluss von Saquinavir und Saquinavir-NO auf den ABC-Transporter BCRP1 zu untersuchen, wurde die Neuroblastomzelllinie UKF-NB-3 mit Hilfe lentiviraler Vektoren mit cDNA für BCRP1 transduziert. Die BCRP1-transduzierten Zellen wurden durch Saquinavir und Saquinavir-NO in vergleichbarem Ausmaß zu dem BCRP1-Substrat Mitoxantron sensibilisiert. Saquinavir-NO ist somit im Vergleich zu Saquinavir der deutlich potentere MDR1-Inhibitor, während beide Substanzen gleichermaßen BCRP1 beeinflussten. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde der Einfluss des MDM2-Inhibitors Nutlin-3 auf die ABC-Transporter-vermittelte Chemoresistenz in Tumorzellen untersucht. Nutlin-3 zeigte aufgrund seiner Funktion als MDM2-Inhibitor an Zellen mit Wildtyp-p53 stark zytotoxische Effekte. An Zellen mit einer p53-Mutation oder an Zellen, die p53-negativ sind, waren diese Effekte nicht zu beobachten. Die Behandlung mit Nutlin-3 führte in p53-Wildtypzellen zur Induktion diverser p53-Zielgene (p21, MDM2, GADD). In Zellen mit mutiertem p53 blieb diese Induktion nach Nutlin-3-Behandlung aus. Chemoresistente MDR1-exprimierende Tumorzellen wurden durch Nutlin-3 stark gegen ausgesuchte Zytostatika resensitiviert. Des Weiteren wurde die chemosensitive, p53-mutierte (Nutlin-3-insensitive) und MDR1-negative Rhabdomyosarkomzelllinie RH30 mit Hilfe lentiviraler Vektoren mit cDNA für MDR1 transduziert. In diesem MDR1-transduzierten Zellmodell wurde die Sensitivität gegen das MDR1-Substrat Vincristin durch Nutlin-3 stark erhöht. Am Durchflusszytomter zeigte sich in MDR1-exprimierenden Zellen durch Behandlung mit Nutlin-3 eine signifikant erhöhte intrazelluläre Akkumulation des fluoreszierenden MDR1-Substrates Rhodamin 123. In MDR1-negativen Zellen wurde dieser Effekt nicht beobachtet. Mit Hilfe des ATPase-Assays und Wash-Out-Kinetiken am Durchflusszytometer wurde die Frage geklärt, ob Nutlin-3 als Substrat oder als allosterischer Inhibitor für MDR1 fungiert. Die Ergebnisse beider Assays lassen den Schluss zu, dass Nutlin-3 ein Substrat für MDR1 darstellt. Nutlin-3 ist ein Racemat und wurde in allen Versuchen als solches verwendet. Das Enantiomer Nutlin-3a hemmt die MDM2-p53-Interaktion als aktives Enantiomer ca. 150-fach stärker als Nutlin-3b. Im letzten Schritt der vorliegenden Arbeit wurde Nutlin-3 in seine Enantiomere Nutlin-3a und Nutlin-3b aufgetrennt und beide Enantiomere wurden im Hinblick auf ihre Wirkung auf MDR1 untersucht. Dabei wurden keine Unterschiede zwischen den beiden Enantiomeren festgestellt. Nutlin-3a und Nutlin-3b interferieren demnach zu gleichen Teilen mit MDR1. Um den Einfluss von Nutlin-3 auf den ABC-Transporter MRP1 zu untersuchen, wurde mit zwei verschiedenen Zellmodellen gearbeitet. In beiden Zellmodellen zeigte sich, dass Nutlin-3 auch den MRP1-vermittelten Efflux der fluoreszierenden Substrate Rhodamin 123 und Calcein-AM inhibiert. Der Befund, dass Nutlin-3 mit der MDR1- und MRP1 vermittelten Chemoresistenz interferiert, ist neu und eine wichtige Information für die Bewertung der beginnenden klinischen Studien zur Untersuchung von Nutlin-3 als antitumorale Substanz.
In den vergangenen Jahren wurden zahlreiche Stoffe als Photosensibilisatoren evaluiert, deren photodynamische Aktivität gegenüber den Pioniersubstanzen deutlich verbessert werden konnte. Vielen dieser Moleküle blieb jedoch aufgrund ihrer ungünstigen physikochemischen Eigenschaften oder der auftretenden Toxizität die Marktreife versagt. Nanopartikuläre Trägersysteme sind geeignet, Verträglichkeit und Effektivität der Photodynamischen Therapie zu verbessern sowie die Selektivität bei der Behandlung bestimmter Tumorspezies deutlich zu erhöhen. Um dieses Prinzip auf verschiedene Photosensibilisatoren anwenden zu können, wurden in der vorliegenden Arbeit Nanopartikel aus humanem Serumalbumin (HSA) durch Desolvatation hergestellt und die adsorptive, die inkorporative sowie die kovalente Bindung an das Trägersystem untersucht. ...
Kollagen des marinen Schwammes Chondrosia reniformis Nardo: Optimierte großtechnische Herstellung, Analytik und neue pharmazeutisch-technologische Anwendungsmöglichkeiten Großtechnische Isolierung und Untersuchung von Chondrosia-Kollagen Schwämme spielen eine wichtige Rolle im Ökosystem des Meeres und ihr Vorkommen ist begrenzt. Zur schonenden und nachhaltigen Nutzung als Rohstoffquelle müssen im Hinblick auf eine industrielle Nutzung alternative Wege zur Gewinnung von marinem Schwammkollagen entwickelt werden. Ein Beispiel hierfür sind die sogenannten „Marikulturen“ direkt im Meer, aus denen die im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Schwämme stammten. Im Gegensatz zu den früher eingesetzten Methoden zur Isolierung des Chondrosia-Kollagens, die Laborcharakter trugen, konnte in der vorliegenden Dissertationsarbeit ein stark vereinfachtes, für die großtechnische Produktion geeignetes Verfahren mit einer hohen Ausbeute (ca. 35%) beschrieben werden. Das Schwammausgangsmaterial wurde über ca. 4 Tage mit Hilfe von Natriumsulfit reduktiv behandelt und die Kollagenfasern (nach einem Filtrationsschritt) in saurem Medium gewonnen. Atomkraftmikroskopische Aufnahmen des isolierten Materials zeigten die kollagentypische Fibrillenquerstreifung, die Unlöslichkeit der Faserbündel in saurem Milieu sowie deren Abbau in die einzelnen Fibrillen in neutraler Pufferlösung. Die von tierischen Kollagenen abgeleitete Bestimmung des Proteingehaltes ergab einen im Vergleich zum kalkulierten Kollagenanteil höheren Gesamtproteingehalt. Dies ist ein Hinweis auf mögliche nichtkollagene Proteinanteile, die an Kollagen assoziiert vorliegen können. Untersuchungen zur Aminosäurenzusammensetzung des isolierten Materials ergaben im Vergleich zu den von Swatschek et al. (2002a) publizierten Ergebnissen einen deutlich höheren Glycin- und einen mehr als doppelt so hohen Hydroxyprolingehalt. Dies kann dahingehend gedeutet werden, dass die neue Isolierungsmethode die bekannten Verunreinigungen des Kollagens mit Glykoproteinen reduziert und zu einem deutlich reineren Kollagenmaterial führt. Mit Hilfe einer neu entwickelten Methode konnten erstmalig Partikel aus Chondrosia-Kollagen hergestellt werden, deren Größe im Nanometerbereich lag. Hierbei handelte es sich um eine kontrollierte alkalische Hydrolyse des isolierten, gefriergetrockneten Kollagens in 1,5 M NaOH. Es konnte eine Partikelausbeute in Höhe von ca. 10% erzielt werden. Atomkraftmikroskopische Aufnahmen zeigten gleichförmige, sphärische Partikel. Die Partikelgrößenuntersuchungen mittels Photonenkorrelationsspektroskopie (nach Resuspension der gefriergetrockneten Schwammkollagennanopartikel (SKNP)) ergaben eine Größe von 168 ± 9,1 nm. Somit sind diese Partikel im Gegensatz zu den bisher aus Chondrosia-Kollagen gewonnenen Mikropartikeln auch für intravenöse Anwendungen geeignet und haben eine größere Trägerkapazität. Die hergestellten Nanopartikel wurden adsorptiv mit dem Wirkstoff 17?-Estradiol-Hemihydrat beladen. In Abhängigkeit von der eingesetzten Stoffkonzentration (1,25 bis 5,0 mg/ml) konnten Beladungsraten von bis zu 13,1% erzielt werden. Die Stabilitätsprüfung von wässrigen Partikelsuspensionen ergab nach 180 Tagen Einlagerung eine auf 7 bis 8% reduzierte Beladungsrate. Nach Inkorporation der beladenen Partikel in eine Hydrogelgrundlage wurde die transdermale Bioverfügbarkeit des Arzneistoffs im Rahmen der Hormonersatztherapie bei postmenopausalen Frauen untersucht. SKNP-Gele mit einer Estradiolkonzentration in Höhe von 0,06% wurden mit gleichkonzentrierten partikelfreien Gelen verglichen. In den Speichelproben der Patientinnen konnten nach täglicher einmaliger Applikation des Nanopartikelgels nach 28 Tagen signifikant höhere Estradiolkonzentrationen gemessen werden. Die ermittelten Flächen unter den Konzentrations-Zeit-Kurven (AUC) über 24 h nach der einmaligen topischen Applikation von 0,75 mg Estradiol waren um das 2,3 bis 3,4-fache höher als die entsprechenden AUC-Werte des Vergleichsgels. 24 h nach Auftragen des Gels lagen die Estradiolspiegel des Vergleichsgels in etwa wieder auf Höhe der Basalwerte, wohingegen die Estradiolwerte nach Applikation des SKNP-Gels zum gleichen Messzeitpunkt mindestens doppelt so hoch waren. Somit konnten bei Anwendung der SKNP-Zubereitung eine deutlich erhöhte transdermale Estradiolabsorption und eine verlängerte Arzneistoffwirkung beobachtet werden. Das nanopartikuläre Trägersystem aus Chondrosia-Kollagen stellt damit eine vielversprechende Möglichkeit zur Erhöhung der transdermalen Bioverfügbarkeit von lipophilen, schlecht resorbierbaren Wirkstoffen dar. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine Formulierung für einen magensaftresistenten Überzug mit Chondrosia-Kollagen als Filmbildner entwickelt. Die Sprühsuspension bestand aus 15% gefriergetrocknetem Kollagen, dem Weichmacher Triethylcitrat (1,5%), dem Trennmittel Talkum (7,5%) und Wasser. Der Coating-Prozess wurde in einem Dragierkessel mit Placebotabletten durchgeführt. In regelmäßigen Abständen wurden Tabletten-Stichproben entnommen, um die erforderliche Kollagenschichtdicke für eine Magensaftresistenz zu bestimmen. Tabletten mit einer Kollagenauftragsmenge von 12,9 mg/cm2 entsprachen der Prüfung auf Magensaftresistenz gemäß Europäischem Arzneibuch. Die Widerstandsdauer in 0,1 M Salzsäure betrug mehr als 2 h und der Zerfall in Phosphatpufferlösung pH 6,8 höchstens 10 min. Rasterelektronenmikrosko-pische Aufnahmen bei unterschiedlichen Vergrößerungen zeigten eine gleichmäßige und glatte beschichtete Oberfläche. Das Auftragsverfahren im Dragierkessel erwies sich als reproduzierbar. Die mechanischen Eigenschaften der überzogenen Tabletten waren zufriedenstellend und die Magensaftresistenz wurde durch eine 6-monatige Lagerung nicht beeinträchtigt. Als Naturprodukt eignet sich Schwammkollagen als Überzugsmaterial für Nichtarzneimittel. Der schnelle Zerfall des Kollagenüberzugs in neutraler Pufferlösung stellt einen Vorteil gegenüber den häufig verwendeten Schellacküberzügen dar, die sich im Darmtrakt zu langsam auflösen und daher nicht selten mit synthetischen Polymeren kombiniert werden.
Ziel dieser Arbeit war es, die Zytotoxizität von Treosulfan und Busulfan auf Leukämiezellen von pädiatrischen Patienten mit Akuten Leukämien zu untersuchen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden in vitro und erste in vivo Untersuchungen durchgeführt: 1. In vitro Untersuchungen Zuerst wurde eine durchflusszytometrische Methode optimiert zum Nachweis der Zytotoxizität von Treosulfan und Busulfan auf maligne Zellen pädiatrischer Patienten mit Akuten Leukämien. Mit diesem durchflusszytometrischen Assay war es möglich, die Zytotoxizität auf maligne von der auf nicht maligne Zellen zu unterscheiden. Dies war unerlässlich, da in den frisch isolierten Leukämiezellen der Patienten bis zu 55% normale Lymphozyten enthalten waren. Darüber hinaus erlaubte diese Methode die simultane Bestimmung der Zell-Apoptose in jeder Probe. An Leukämie-Zelllinien wurde dieser multiparametrische Assay anschließend mit dem MTT-Assay verglichen. Es konnte gezeigt werden, dass die Bestimmung von Zytotoxizitäten mit beiden Methoden an den Zelllinien Molt 4/8 und H9 gut korrelierte (r≥0,95). Für das Arbeiten mit Patientenmaterial wurde ausschließlich die durchflusszytometrische Methode angewendet, da in den Proben der Patienten die Differenzierung zwischen leukemischen Zellen und normalen Lymphozyten essentiell war. In den Leukämie-Zelllinien Molt4/8, H9 und K562 zeigte sich, dass Treosulfan eine stärkere Zytotoxizität zeigte als Busulfan. In die Untersuchungen frischer Leukämiezellen pädiatrischer Patienten mit Akuten Leukämien konnten 24 Proben unterschiedlicher Leukämien (cALL, reife B-ALL, reife TALL, AML) und unterschiedlicher Erkrankungszeitpunkte (bei Diagnose oder bei Rezidiv) eingeschlossen werden. In diesen Proben zeigte Treosulfan eine deutlich bessere Wirkung als Busulfan. Es wurde trotz des kleinen Patientenkollektivs deutlich, dass die T-ALL gegenüber der cALL sensitiver auf Treosulfan reagiert. Außerdem war die Zytotoxizität von Treosulfan und Busulfan gegenüber der T-ALL signifikant höher als gegenüber c-ALL (Treosulfan: p=0,02, Busulfan: p=0,03). Die IC50-Werte stiegen vom Zeitpunkt der Diagnose (Median: Treosulfan: 11,45 μM, Busulfan: 96,45 μM) über die Progression (Median: Treosulfan: 45,95 μM, Busulfan: 253,75 μM) bis zum Rezidiv (Median: Treosulfan: 153,15 μM, Busulfan: 223,3 μM) hin an, und zwar um das 8-fache bei Treosulfan und das 2,5-fache bei Busulfan. Der Unterschied der Zytotoxizität von Treosulfan auf Leukämieproben zum Zeitpunkt der Diagnose gegenüber dem Rezidiv war statistisch signifikant (p=0,02). Für Busulfan ergab sich für diese Untersuchungszeitpunkte keinen signifikanten Unterschied (p=0,13). Vergleichend zu den Ergebnissen an frisch isolierten Leukämiezellen wurde die Wirkung von Treosulfan und Busulfan auf normale Lymphozytensubpopulationen und Stammzellen untersucht. Auch hier zeigte Treosulfan eine stärkere Zytotoxizität im Vergleich zu Busulfan. Insgesamt reagierten normale Lymphozyten sensitiver auf die Alkylanzien im Vergleich zu den Leukämiezellen (Mediane IC50-Werte für Treosulfan und Busulfan auf Lymphozyten: 12,3 μM und 89,9 μM, auf Leukämieproben: 30,6 μM und 133 μM mit p=0,03 und p=0,02). In einem weiteren Experiment sollte die Interaktion von Treosulfan und Busulfan mit Fludarabin untersucht werden. Fludarabin ist ein Purin-Analogon, das in der Pädiatrie in Kombination mit Alkylanzien zur Chemo-Konditionierung eingesetzt wird. Bei der Inkubation von Fludarabin mit Treosulfan-Konzentration größer 1 μM war ein deutlicher Synergismus zu verzeichnen. Die Kombination von Fludarabin mit Busulfan ergab Antagonismus. 2. In vivo Untersuchungen Es wurde die zelluläre Immunrekonstitution bei pädiatrischen Patienten mit AML (n=9) nach allogener Knochenmarktransplantation überwacht. Ein Patient wurde mit Treosulfan konditioniert (n=1), die anderen Patienten (n=8) erhielten Busulfan zur Konditionierung. Die Rekonstitution der Leukozyten, B-Zellen, NK-Zellen und T-Helferzellen verlief in beiden Gruppen ähnlich. Ein signifikanter Unnterschied konnte für die Rekonstitution der CD3+CD8+ zytotoxischen T-Zellen gezeigt werden, die bei dem Patienten, der mit Treosulfan konditioniert wurde, signifikant niedriger war im Vergleich zur Busulfangruppe. Da bei dem Patienten, der Treosulfan erhielt, die CRP-Werte über einen längeren Zeitraum erhöht waren und Infektionen die Rekonstitution von zytotoxischen T-Zellen maßgeblich beeinflussen, bietet dies eine mögliche Erklärung für diesen Unterschied. Aussagen können jedoch nur mit einem größeren Patientenkollektiv getroffen werden.
Many highly active antitumour agents are currently not employable for the systemic chemotherapy of brain tumours since their entrance into the brain is blocked by the BBB. Obviously, the development of a strategy allowing effective delivery of these agents across the BBB would enormously extend the potential of the systemic chemotherapy. Chemotherapy of rat glioblastoma using nanoparticle-bound doxorubicin Doxorubicin bound to polysorbate-coated nanoparticles had been previously shown to significantly enhance survival in the orthotopic rat 101/8 glioblastoma model. The objective of this study was to investigate the therapeutic effects of this formulation by morphometric, histological and immunohistological methods. The 101/8 glioblastoma was implanted intracranially into the male Wistar rats. The animals were randomly divided into 3 groups; one group served as untreated control (n = 20). The second group received doxorubicin in solution (Dox-sol, n = 18), and the third group received doxorubicin bound to PBCA nanoparticles coated with PS 80 (Dox-NP + PS 80, n = 18). The treatment regimen was 3 × 1.5 mg/kg on days 2, 5, and 8 after tumor implantation. The formulations were injected into the tail vein. The untreated control animals were sacrificed on days 6, 8, 10, 12, and 14 after the implantation. The animals that had received chemotherapy were sacrificed on day 10, 14 and 18 after the implantation. The brains were investigated by morphometrical, histochemical, and immunohistochemical methods such as the measurement of the tumor size, proliferation of tumor cells, vessel density, expression of glial fibrillary acidic protein (GFAP), expression of vascular endothelial growth factor (VEGF), incidence and dimension of necrosis, and microvascular proliferation. Tumours showed signs of malignancy including invasion to brain tissue and brisk mitotic activity. The tumor proliferation remained stable at high levels throughout the host survival time. Overall, the tumor showed a reproducible growth pattern and temporal development that is comparable to human glioblastoma. Furthermore, the 101/8 glioblastoma had infiltrated diffusely the surrounding host brain at the edge of the solid tumor mass showed no signs of encapsulation. Thus the 101/8 glioblastoma fulfills the most criteria for an adequate glioma model and can be qualified as a reliable model. ...
Natural killer (NK) cells are white blood lymphocytes of the innate immune system that have diverse biological functions, including recognition and destruction of certain microbial infections and neoplasms [1]. NK cells comprise ~ 10% of all circulating lymphocytes and are also found in peripheral tissues including the liver, peritoneal cavity and placenta. Resting NK cells circulate in the blood, but, following activation by cytokines, they are capable of extravasation and infiltration into most tissues that contain pathogen-infected or malignant cells [2-5]. NK cells discriminate between normal and abnormal cells (infected or transformed) through engagement and dynamic integration of multiple signaling pathways, which are initiated by germline-encoded receptors [6-8]. Healthy cells are protected from NK cell-mediated lysis by expression of major histocompatibility complex (MHC) class I ligands for NK cell inhibitory receptors [6, 9]. The MHC is a group of highly polymorphic glycoproteins that are expressed by every nucleated cell of vertebrates, and that are encoded by the MHC gene cluster. The human MHC molecules are termed human leucocyte antigen (HLA)-A, B and C molecules. Every NK cell expresses at least one inhibitory receptor that recognizes a self-MHC class I molecule. So, normal cells that express MHC class I molecules are protected from self-NK cells, but transformed or infected cells that have down-regulated MHC class I expression are attacked by NK cells [10]. There are 2 distinct subsets of human NK cells identified mainly by cell surface density of CD56. The majority (approximately 90%) of human NK cells are CD56dimCD16bright and express high levels of FcγRIII (CD16), whereas a minority (approximately 10%) are CD56brightCD16dim/- [11]. Resting CD56dim NK cells are more cytotoxic against NK-sensitive targets than CD56bright NK cells [12]. However, after activation with interleukin (IL)-2 or IL-12, CD56bright cells exhibit similar or enhanced cytotoxicity against NK targets compared to CD56dim cells [12-14]. The functions of NK cells are regulated by a balance of signals (Fig. 1.1). These are transmitted by inhibitory receptors, which bind MHC class I molecules, and activating receptors, which bind ligands on tumors and virus-infected cells [15]. These receptors are completely encoded in the genome, rather than being generated by somatic recombinations, like T- and B-cell receptors.