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Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der Einfluss des HIV-Protease-Inhibitors Saquinavir und seines Derivates Saquinavir-NO auf die ABC-Transporter vermittelte Chemoresistenz in Tumorzellen untersucht. Saquinavir-NO zeigte in drei verschiedenen Tumorentitäten stärkere zytotoxische Wirkung als Saquinavir. Weder die Expression der ABC-Transporter MDR1 oder BCRP1 noch der zelluläre p53-Status hatten einen Einfluss auf die Zellsensitivität. MDR1-exprimierende chemoresistente Tumorzellen wurden durch Saquinavir-NO stärker gegen ausgewählte Zytostatika resensitiviert als durch Saquinavir. An chemosensitiven MDR1-negativen Zellen wurden keine Effekte beobachtet. Des Weiteren wurde die Neuroblastomzelllinie UKF-NB-3 mit Hilfe lentiviraler Vektoren mit cDNA für MDR1 transduziert. In diesem MDR1-transduzierten Zellmodell wurde die Sensiti-vität gegen das MDR1-Substrat Vincristin durch Saquinavir-NO stärker erhöht als durch Saquinavir. Am Durchflusszytometer wurde der Einfluss von Saquinavir und Saquinavir-NO auf die intrazelluläre Akkumulation des fluoreszierenden MDR1-Substrates Rhodamin 123 untersucht. In MDR1-exprimierenden Zelllinien führte Saquinavir-NO zu einer deutlich stärkeren Akkumulation von Rhodamin 123 als Saquinavir. In MDR1-negativen Zellen wurden keine Effekte beobachtet. Mit Hilfe des MDR1-ATPase-Assays und Wash-Out-Kinetiken am Durchflusszytometer wurde die Frage geklärt, ob Saquinavir und Saquinavir-NO als Substrate oder als allosterische Inhibitoren für MDR1 fungieren. Die Ergebnisse beider Assays lassen den Schluss zu, dass sowohl Saquinavir als auch Saquinavir-NO jeweils ein Substrat für MDR1 darstellen. Um den Einfluss von Saquinavir und Saquinavir-NO auf den ABC-Transporter BCRP1 zu untersuchen, wurde die Neuroblastomzelllinie UKF-NB-3 mit Hilfe lentiviraler Vektoren mit cDNA für BCRP1 transduziert. Die BCRP1-transduzierten Zellen wurden durch Saquinavir und Saquinavir-NO in vergleichbarem Ausmaß zu dem BCRP1-Substrat Mitoxantron sensibilisiert. Saquinavir-NO ist somit im Vergleich zu Saquinavir der deutlich potentere MDR1-Inhibitor, während beide Substanzen gleichermaßen BCRP1 beeinflussten. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde der Einfluss des MDM2-Inhibitors Nutlin-3 auf die ABC-Transporter-vermittelte Chemoresistenz in Tumorzellen untersucht. Nutlin-3 zeigte aufgrund seiner Funktion als MDM2-Inhibitor an Zellen mit Wildtyp-p53 stark zytotoxische Effekte. An Zellen mit einer p53-Mutation oder an Zellen, die p53-negativ sind, waren diese Effekte nicht zu beobachten. Die Behandlung mit Nutlin-3 führte in p53-Wildtypzellen zur Induktion diverser p53-Zielgene (p21, MDM2, GADD). In Zellen mit mutiertem p53 blieb diese Induktion nach Nutlin-3-Behandlung aus. Chemoresistente MDR1-exprimierende Tumorzellen wurden durch Nutlin-3 stark gegen ausgesuchte Zytostatika resensitiviert. Des Weiteren wurde die chemosensitive, p53-mutierte (Nutlin-3-insensitive) und MDR1-negative Rhabdomyosarkomzelllinie RH30 mit Hilfe lentiviraler Vektoren mit cDNA für MDR1 transduziert. In diesem MDR1-transduzierten Zellmodell wurde die Sensitivität gegen das MDR1-Substrat Vincristin durch Nutlin-3 stark erhöht. Am Durchflusszytomter zeigte sich in MDR1-exprimierenden Zellen durch Behandlung mit Nutlin-3 eine signifikant erhöhte intrazelluläre Akkumulation des fluoreszierenden MDR1-Substrates Rhodamin 123. In MDR1-negativen Zellen wurde dieser Effekt nicht beobachtet. Mit Hilfe des ATPase-Assays und Wash-Out-Kinetiken am Durchflusszytometer wurde die Frage geklärt, ob Nutlin-3 als Substrat oder als allosterischer Inhibitor für MDR1 fungiert. Die Ergebnisse beider Assays lassen den Schluss zu, dass Nutlin-3 ein Substrat für MDR1 darstellt. Nutlin-3 ist ein Racemat und wurde in allen Versuchen als solches verwendet. Das Enantiomer Nutlin-3a hemmt die MDM2-p53-Interaktion als aktives Enantiomer ca. 150-fach stärker als Nutlin-3b. Im letzten Schritt der vorliegenden Arbeit wurde Nutlin-3 in seine Enantiomere Nutlin-3a und Nutlin-3b aufgetrennt und beide Enantiomere wurden im Hinblick auf ihre Wirkung auf MDR1 untersucht. Dabei wurden keine Unterschiede zwischen den beiden Enantiomeren festgestellt. Nutlin-3a und Nutlin-3b interferieren demnach zu gleichen Teilen mit MDR1. Um den Einfluss von Nutlin-3 auf den ABC-Transporter MRP1 zu untersuchen, wurde mit zwei verschiedenen Zellmodellen gearbeitet. In beiden Zellmodellen zeigte sich, dass Nutlin-3 auch den MRP1-vermittelten Efflux der fluoreszierenden Substrate Rhodamin 123 und Calcein-AM inhibiert. Der Befund, dass Nutlin-3 mit der MDR1- und MRP1 vermittelten Chemoresistenz interferiert, ist neu und eine wichtige Information für die Bewertung der beginnenden klinischen Studien zur Untersuchung von Nutlin-3 als antitumorale Substanz.
Ziel dieser Arbeit war es, die Zytotoxizität von Treosulfan und Busulfan auf Leukämiezellen von pädiatrischen Patienten mit Akuten Leukämien zu untersuchen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden in vitro und erste in vivo Untersuchungen durchgeführt: 1. In vitro Untersuchungen Zuerst wurde eine durchflusszytometrische Methode optimiert zum Nachweis der Zytotoxizität von Treosulfan und Busulfan auf maligne Zellen pädiatrischer Patienten mit Akuten Leukämien. Mit diesem durchflusszytometrischen Assay war es möglich, die Zytotoxizität auf maligne von der auf nicht maligne Zellen zu unterscheiden. Dies war unerlässlich, da in den frisch isolierten Leukämiezellen der Patienten bis zu 55% normale Lymphozyten enthalten waren. Darüber hinaus erlaubte diese Methode die simultane Bestimmung der Zell-Apoptose in jeder Probe. An Leukämie-Zelllinien wurde dieser multiparametrische Assay anschließend mit dem MTT-Assay verglichen. Es konnte gezeigt werden, dass die Bestimmung von Zytotoxizitäten mit beiden Methoden an den Zelllinien Molt 4/8 und H9 gut korrelierte (r≥0,95). Für das Arbeiten mit Patientenmaterial wurde ausschließlich die durchflusszytometrische Methode angewendet, da in den Proben der Patienten die Differenzierung zwischen leukemischen Zellen und normalen Lymphozyten essentiell war. In den Leukämie-Zelllinien Molt4/8, H9 und K562 zeigte sich, dass Treosulfan eine stärkere Zytotoxizität zeigte als Busulfan. In die Untersuchungen frischer Leukämiezellen pädiatrischer Patienten mit Akuten Leukämien konnten 24 Proben unterschiedlicher Leukämien (cALL, reife B-ALL, reife TALL, AML) und unterschiedlicher Erkrankungszeitpunkte (bei Diagnose oder bei Rezidiv) eingeschlossen werden. In diesen Proben zeigte Treosulfan eine deutlich bessere Wirkung als Busulfan. Es wurde trotz des kleinen Patientenkollektivs deutlich, dass die T-ALL gegenüber der cALL sensitiver auf Treosulfan reagiert. Außerdem war die Zytotoxizität von Treosulfan und Busulfan gegenüber der T-ALL signifikant höher als gegenüber c-ALL (Treosulfan: p=0,02, Busulfan: p=0,03). Die IC50-Werte stiegen vom Zeitpunkt der Diagnose (Median: Treosulfan: 11,45 μM, Busulfan: 96,45 μM) über die Progression (Median: Treosulfan: 45,95 μM, Busulfan: 253,75 μM) bis zum Rezidiv (Median: Treosulfan: 153,15 μM, Busulfan: 223,3 μM) hin an, und zwar um das 8-fache bei Treosulfan und das 2,5-fache bei Busulfan. Der Unterschied der Zytotoxizität von Treosulfan auf Leukämieproben zum Zeitpunkt der Diagnose gegenüber dem Rezidiv war statistisch signifikant (p=0,02). Für Busulfan ergab sich für diese Untersuchungszeitpunkte keinen signifikanten Unterschied (p=0,13). Vergleichend zu den Ergebnissen an frisch isolierten Leukämiezellen wurde die Wirkung von Treosulfan und Busulfan auf normale Lymphozytensubpopulationen und Stammzellen untersucht. Auch hier zeigte Treosulfan eine stärkere Zytotoxizität im Vergleich zu Busulfan. Insgesamt reagierten normale Lymphozyten sensitiver auf die Alkylanzien im Vergleich zu den Leukämiezellen (Mediane IC50-Werte für Treosulfan und Busulfan auf Lymphozyten: 12,3 μM und 89,9 μM, auf Leukämieproben: 30,6 μM und 133 μM mit p=0,03 und p=0,02). In einem weiteren Experiment sollte die Interaktion von Treosulfan und Busulfan mit Fludarabin untersucht werden. Fludarabin ist ein Purin-Analogon, das in der Pädiatrie in Kombination mit Alkylanzien zur Chemo-Konditionierung eingesetzt wird. Bei der Inkubation von Fludarabin mit Treosulfan-Konzentration größer 1 μM war ein deutlicher Synergismus zu verzeichnen. Die Kombination von Fludarabin mit Busulfan ergab Antagonismus. 2. In vivo Untersuchungen Es wurde die zelluläre Immunrekonstitution bei pädiatrischen Patienten mit AML (n=9) nach allogener Knochenmarktransplantation überwacht. Ein Patient wurde mit Treosulfan konditioniert (n=1), die anderen Patienten (n=8) erhielten Busulfan zur Konditionierung. Die Rekonstitution der Leukozyten, B-Zellen, NK-Zellen und T-Helferzellen verlief in beiden Gruppen ähnlich. Ein signifikanter Unnterschied konnte für die Rekonstitution der CD3+CD8+ zytotoxischen T-Zellen gezeigt werden, die bei dem Patienten, der mit Treosulfan konditioniert wurde, signifikant niedriger war im Vergleich zur Busulfangruppe. Da bei dem Patienten, der Treosulfan erhielt, die CRP-Werte über einen längeren Zeitraum erhöht waren und Infektionen die Rekonstitution von zytotoxischen T-Zellen maßgeblich beeinflussen, bietet dies eine mögliche Erklärung für diesen Unterschied. Aussagen können jedoch nur mit einem größeren Patientenkollektiv getroffen werden.
Schwerlösliche Arzneistoffe besitzen häufig unbeliebte biopharmazeutische Eigenschaften und ihre erfolgreiche Formulierung zur oralen Verabreichung stellt eine der häufigsten und größten Herausforderungen an die pharmazeutische Technologie dar. Unter zahlreichen Verfahren zur Überwindung von absehbaren Bioverfügbarkeitsproblemen kommt den physikalischen Methoden nach wie vor eine zentrale Bedeutung zu. In der vorliegenden Arbeit wurde erforscht, wie die Bioverfügbarkeit schwerlöslicher Verbindungen durch Anwendung physikalischer Verfahren und in fester Formulierung erhöht und ihre Auflösungsgeschwindigkeit als entscheidender Schritt hierzu optimiert werden kann. Als schwerlösliche Substanzen wurden die Arzneistoffe EMD 57033 und Albendazol, die eine vergleichweise niedrige Lipophilie aufwiesen, sowie Danazol, Felodipin und Fenofibrat (hohe Lipophilie) ausgewählt. Zunächst wurde untersucht, inwieweit eine klassische Wirkstoffmikronisierung dem Problem der schlechten Wasserlöslichkeit und der unzureichenden Auflösungsgeschwindigkeit zu begegnen vermag. In klassischer Art und Weise wurde gemäß der Noyes-Whitney-Beziehung durch Partikelgrößenreduktion die Auflösungsrate gesteigert. Bei großem Dosislöslichkeitsvolumen (>1000 ml) war eine Verbesserung nur bis zu einem gewissen Ausmaß möglich. Es wurde auch festgestellt, dass mit alleiniger Wirkstoffmikronisierung selbst bis in den unteren Mikrometerbereich und sogar bei Vorliegen eines kleinen Dosislöslichkeitsvolumens (<100 ml) eine optimale Auflösungsgeschwindigkeit nicht garantiert und oft nicht erzielt werden kann. Der Ansatz der Wirkstoffmikronisierung kann jedoch grundsätzlich empfohlen werden, da sich unabhängig von Dosis und Löslichkeit signifikante Verbesserungen in der Auflösungskinetik ergeben können. Luftstrahlmahlung ist eine zahlreichen anderen Verfahren überlegene Vermahlungstechnik. Sie erlaubt bei entsprechenden Einstellungen die trockene Herstellung ultrafeiner Partikel (1–3 Mikrometer) in kontinuierlichem oder Batch-Betrieb bei gut steuerbarem Prozess, der das Mahlgut praktisch keiner Temperaturbelastung unterwirft. Staubentwicklung und Abrieb müssen jedoch beachtet werden. Freisetzungen wurden in biorelevantem Medium (z.B. FaSSIF), das bestmöglich die gastrointestinalen Gegebenheiten simuliert, sowie zusätzlich in einem Mediumhöheren Tensidgehaltes durchgeführt, das zur Berücksichtigung einer ungehinderten Absorption der BCS-Klasse II-Substanzen in vivo-Sink-Bedingungen darstellte. Diese Vorgehensweise ist grundsätzlich zu empfehlen. Für EMD 57033 wurde zudem nachgewiesen, dass eine biorelevante Freisetzungsprüfung auch in einfachen SLSLösungen möglich ist. Das Dosislöslichkeitsvolumen nimmt grundsätzlich bedeutenden Einfluss auf das Freisetzungsverhalten. Die trockene Covermahlung ist ein äußerst erfolgreicher prozesstechnischer Schritt zur Formulierungsverbesserung. Sie wird durch Vermahlung eines Wirkstoffes mit einem oder mehreren Hilfsstoffen dargestellt. Durch Covermahlung per Gasstrahl zubereitete Formulierungen mit 10% Wirkstoffanteil erzielten für alle untersuchten Arzneistoffe eine optimale Auflösungsgeschwindigkeit und rasches Erreichen maximaler Freisetzung. Vergleichbaren physikalischen Mischungen sowie einfacher Mikronisierung war sie deutlich überlegen. Im Gegensatz zu reiner Wirkstoffmikronisierung bildete die Freisetzung nach Covermahlung nicht ausschließlich diskrete messbare Stoffeigenschaften ab (z.B. Korngröße), sondern war vielmehr das Ergebnis eines Herstellungsprozesses. Die qualitative und quantitative Auswahl der Hilfsstoffe prägte zudem das Freisetzungsverhalten entscheidend und in stärkerem Ausmaß als der Vermahlungsgrad. Die deutliche Verbesserung der Auflösungsgeschwindigkeit eines Wirkstoffes nach Covermahlung war unabhängig von der Wahl des Freisetzungsmediums und dem vorliegenden Dosislöslichkeitsvolumen. Die Kristallinität aller Arzneistoffe, mittels Röntgendiffraktometrie und DSC untersucht, wurde durch die Covermahlung nicht verändert. Die Korngröße eines covermahlenen Produktes konnte bei Einsatz schwer vermahlbarer Hilfsstoffe unter Umständen nicht auf den Wirkstoff projiziert werden. HPMC erwies sich als schwer vermahlbar. Für eine Aktivsubstanz (EMD 57033) wurde sogar die Ausbildung übersättigter Lösungen bei Freisetzung covermahlener Formulierungen nachgewiesen, die nicht in Phasenumwandlungen des Wirkstoffes oder in reiner Partikelgrößenreduktion begründet war. Lactose als Hilfsstoff förderte eine sehr hohe initiale Auflösungsgeschwindigkeit, oftmals wurde vollständige Freisetzung bereits nach 15 Minuten erreicht. Polymere wie HPMC und PVP wirkten stabilisierend, jedoch auch verzögernd. SLS förderte ebenfalls eine optimale Auflösungsrate durch Überwindung von etwaigen Benetzbarkeitsproblemen einesein gemahlenen) Wirkstoffes, unterband jedoch die Bildung von übersättigten Konzentrationen. Covermahlungen zeichneten sich durch eine sehr gute Reproduzierbarkeit von Herstellungsprozess und Produkt (einschließlich Freisetzungscharakteristik) aus und waren als deutlich robuster gegenüber reinen Wirkstoffvermahlungen einzustufen. Covermahlene Mischungen zeigten perfekte Homogenität. Der Wirkstoffgehalt ist zwingend nach Covermahlung zu prüfen, da sich durch den Herstellungsprozess leichte Verschiebungen in der quantitativen Zusammensetzung der Formulierung ergeben können. Covermahlungen sind industriell problemlos abbildbar. Covermahlene Formulierungen von EMD 57033 mit Lactose oder Polymeren bildeten ihre Überlegenheit gegenüber reinen Wirkstoffmikronisierungen, die sich in vitro durch die Ausbildung übersättigter Lösungen darstellte, auch in vivo in Hunden ab. Zwar steigerte bereits die Vermahlung des reinen Arzneistoffes seine orale Bioverfügbarkeit (0% - 37% relative BV), der Einsatz der Covermahlung konnte diese jedoch noch weiter erhöhen und nahezu verdoppeln (55%, 68%). Multiple Level CKorrelationen covermahlener und mikronisierter Wirkstoffformulierungen belegten erfolgreiche in vitro-Simulationen. Sprühtrocknungen schwerlöslicher Stoffe aus wässriger Umgebung geht das Problem voraus, den Stoff nicht in ausreichendem Maße auflösen zu können. In der vorliegenden Arbeit wurde daher mit Hilfe einer Rührwerkskugelmühle Kristallsuspensionen von Wirkstoffnanopartikeln (<200 nm, Messung durch Laserbeugung und Auswertung nach der Mie-Theorie) hergestellt, die dann getrocknet wurden. Den zwischenzeitigen Vorteil der extrem hohen Oberfläche in Form von Nanoteilchen gab der Wirkstoff nach Sprühtrocknung oder Sprüheinbettung (bei Anwesenheit gelöster oder (nano-) suspendierter Hilfsstoffe) wieder ab. Die Kombination aus Nanonisierung und Sprühtrocknung stellt prozesstechnisch zwei Herstellungsschritte dar und beeinträchtigt – neben der fundamentalen Problematik der Stabilisierung von Intermediaten – die Stabilität eines Wirkstoffes durch Flüssigkeitskontakt (Nassmahlung) und thermische Belastung (Sprühtrocknung). EMD 57033 verblieb bei Sprühtrocknungen kristallin und wies verglichen mit covermahlenen Formulierungen eine schwächere Auflösungsgeschwindigkeit auf. Eine Ausnahme bildete die Sprüheinbettung mit SLS, die jedoch in derPharmakokinetikstudie den Covermahlungen unterlegen war (relative Bioverfügbarkeit 47%). Fenofibrat ging fast vollständig in den amorphen Zustand über und zeigte bei Freisetzung das typische Bild einer schnellen Rekristallisation. Fazit Im Gegensatz zu Wirkstoffmikronisierungen oder Sprühtrocknungsverfahren können trockene Covermahlungen mit ausgewählten Hilfsstoffen universell das Ausmaß und die Geschwindigkeit der Auflösung schwerlöslicher Stoffe optimieren (vollständige Auflösung oder Sättigung erreicht). In Abhängigkeit von Wirk- und Hilfsstoffen werden sogar Übersättigungen erzielt, die auch in vivo in einer gesteigerten oralen Bioverfügbarkeit abgebildet werden können.
Die Eigenschaften, die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Co-Polymeren auf Basis von a-Hydroxycarbonsäuren und Polyolen, unterscheiden sich deutlich von denn entsprechenden reinen Polymeren ohne Polyolkomponente. Die Polymere dieser Klasse, die sich durch Variation der Parameter Alkoholkomponente, Alkohol/Lactid-Verhältnis, Lactid/Glycolid-Verhätnis, L/DL-Verhältnis ergibt sind äußerst vielfältig. Schwerpunktmäßig wurden Polymere untersucht, die als Carbonsäurekomponente Milch- und/oder Glycolsäure enthalten und bei denen Glycerin oder Ethylenglycol als Polyol verwendet wurde. Diese Arbeit verfolgte zum einen das Ziel, grundlegende Erkenntnisse über die neuartige Polymerklasse zu gewinnen und zum anderen die Eignung dieser Polymere als implantierbares Arzneistoffdepot zu untersuchen. Dabei konnte – wie im ersten Teil dieser Arbeit beschrieben – nur ein Ausschnitt aus dem großen Spektrum der Polymere beispielhaft synthetisiert und untersucht werden. Von vornherein ausgeschlossen waren bei diesen Untersuchungen Polymere, deren Glasübergangstemperatur unter Raum- und über Körpertemperatur lagen. Es sollten so lagerstabile, aber nach Applikation ins Gewebe anpassungsfähige Formkörper erhalten werden. Die Untersuchungen mit den entwickelten Polymerstäbchen haben gezeigt, dass sich die Klasse der Polyol-oligolactide/co-glycoliden von herkömmlichen, reinen Polylactiden bzw. Polylactiden/co-glycoliden in einigen Punkten unterscheidet. So wurde bei keinem der Versuche ein inhomogenes Abbauverhalten festgestellt, wie dies in der Literatur bei reinen Polylactiden/co-glycoliden beschrieben ist. Es kam also nicht zu einem beschleunigten Polymerabbau im Inneren der Stäbchen durch Autokatalyse der sich dort akkumulierenden Milchsäure. Die Glycerol-Polymere scheinen eine ausreichende Diffusion der Degradationsprodukte nach außen zu gewährleisten. Dies ist eine wichtige Voraussetzung für die gleichmäßige Freisetzung von Wirkstoffen. Die Eigenschaften der Polymerstäbchen ließen sich auf unterschiedliche Weise beeinflussen. So konnte ihre Wasseraufnahmefähigkeit durch das Verhältnis der Mischung von L-Polymeren zu DL-Polymeren sehr weit variiert werden. Das amorphe DL-Polymer ermöglicht eine erleichterte Wasseraufnahme gegenüber der reinen teilkristallinen L-Variante. Die Co-Polymerisation mit Glycolid bot eine weitere Möglichkeit, die Eigenschaften der Polymere zu beeinflussen. So stieg bei den Polymeren mit gleichem Glycerin/Monomer-Verhältnis die Hydrophilie in der Reihe GOL-DL-1:18 < GOL-DL-1:13,5:4,5 < GOL-DL-1:9:9 < GOL-L-1:4,5:13,5 an. Die Versuche, die im zweiten Teil der Arbeit beschrieben werden, wurden im Rahmen der Entwicklung eines Applikationssystems für niedermolekulare Cyclooligo-peptide durchgeführt, die in der Krebstherapie eingesetzt werden sollten. Es wurde deutlich, dass die bisher verwendeten Polymerstäbchen für eine solche Anwendung nicht geeignet waren. Sie boten der zur Applikation notwendigen Menge an Peptid eine zu geringe Menge an Polymermatrix, was zu einer hohen Beladungsrate führte. Die Folge war ein mechanisch instabiles System, das nach Implantation zerbrechen könnte und so den Wirkstoff unkontrolliert freisetzen würde. Aus diesem Grund wurde ein Verpressungsverfahren gewählt, um Tabletten beziehungsweise stäbchenförmige Presslinge als Applikationssystem zu erhalten. Für beide Varianten wurde das Polymer gemahlen, die zu untersuchenden Hilfs- oder Wirkstoffe eingemischt und dann verpresst. Bei den Untersuchungen zeigte es sich, dass eine gleichmäßige Freisetzung über mehrere Tage mit diesen resorbierbaren Trägersystemen nicht möglich war. Der Grund hierfür war ein zweiphasiger Verlauf der Freisetzung. Im ersten Teil des zweiphasigen Verlaufs wurde eine große Menge des Wirkstoffes zusammen mit der niedermolekularen Komponente ausgespült. In der zweiten Phase wurde der Wirkstoff im Zuge der Degradation der höhermolekularen Komponente langsam freigesetzt. Der Einfluss des Pressdruckes bei Erstellen der Prüfkörper war für die Freisetzung eher von untergeordneter Bedeutung, während eine vermehrte Zumischung von leicht wasserlöslichen Substanzen oder die Verwendung von hydrophileren Polymeren (DL-Lactide anstelle von reinen L-Lactiden) die Freisetzung des Peptides deutlich erhöhte. Im dritten Teil der Arbeit wurde beispielhaft an den Substanzen Gentamicinsulfat, Methotrexat und einem Cyclo-Oligo-Peptid die Freisetzung aus 13 verschiedenen halbfesten Polymersystemen untersucht. Diese Systeme wurden durch Mischung von nieder- mit höhermolekularen Polymeren hergestellt. Die Menge an freigesetztem Arzneistoff korrelierte erwartungsgemäß mit der Oberfläche der Probenkörper. Die Freisetzung des gut wasserlöslichen Gentamicinsulfats erfolgte aus den Systemen mit einem hohen Anteil an niedermolekularem Polymer sehr schnell und vollständig. Systeme mit überwiegend höhermolekularem Polymer gaben den Wirkstoff weniger schnell frei und es konnte gezeigt werden, dass der Wirkstoff sich in beiden Polymeren der Mischung verteilt. Das Freisetzungsverhalten bei dem in Wasser schwerlöslichen Methotrexat war nicht grundsätzlich anders. Die Verteilung zwischen der höher- und niedermolekularen Phase ähnelt der des Gentamicinsulfates. Eine relativ hohe Beladungsrate mit einem hydrophilen Wirkstoff (EMD 121974) führte zu einer deutlich höheren Freisetzung aus dem höhermolekularen Teil des Polymergemisches, so dass insgesamt eine beinahe vollständige Freisetzung erreicht wurde. Das im vierten Teil der Arbeit untersuchte Beschichten von Hydroxylapatit- Zylindern aus einer Kombination von bFGF mit einem Glycerin-L-1:13 Lactid Polymer führte zu einer gleichmäßigeren Freisetzung als bei Zylindern, die ohne Einsatz von Polymer beschichtet wurden. Außerdem war auch noch nach dem 5. Tag eine Freisetzung von bFGF zu beobachten. Eine signifikante Verzögerung des Einwachsens von Knochen in das Implantat nach 42 und 84 Tagen konnte bei der Gruppe mit bFGF/Polymer-Beschichtung histomorphologisch gezeigt werden. Die Poren des Implantates waren mit dem Polymer gefüllt, was das Einwachsen in den ersten Wochen deutlich erschwerte. Erst nach Beginn der Degradation des Polymers war das Eindringen des umgebenden Knochen möglich. Das Polymer GOL-L-1:12 war also aufgrund seiner langsamen Degradation für eine solche Anwendung ungeeignet. Für eine Verwendung als Beschichtungsmaterial sollte ein Polymer deutlich schneller degradieren und die Beschichtungsdicke müsste optimiert werden. Die Charakterisierung der Polyol-oligolactide/co-glycoliden in dieser Arbeit hat gezeigt, dass es sich bei dieser Polymerklasse um eine sehr interessante Variante der resorbierbaren Polymere handelt. Die einfache Synthese, die gute Bioverträglichkeit und die in sehr weiten Bereichen variierbaren Eigenschaften machen diese Polymere zu vielversprechenden Kandidaten bei der Entwicklung von Arzneimittelträgern oder Medizinprodukten.
Die vorliegende Arbeit setzt sich mit den Auswirkungen der Blutkomponenten (neutrophile Granulozyten und Seren) von mit HLM operierten Patienten auf die interzellulären Kontakte in cerebralen mikrovaskulären Zellverbänden auseinander. Dabei wurden Blutkomponenten sowohl von Patienten mit langen (> 80 min) als auch mit kurzen (< 80 min) HLM-Zeiten isoliert. Das Ziel war herauszufinden, welche der Blutkomponenten für die Veränderungen der Integrität und der Morphologie der Zell-Zell-Kontakte verantwortlich sind und dadurch pathologische Störungen der Blut-Hirn-Schranke verursachen können. Die Untersuchungen wurden mit einem BHS-Modell aus cerebralen mikrovaskulären Endothelzellen [BCEC] vom Schwein durchgeführt. Dabei wurde in vitro nach Behandlung des BHS-Modells mit den entsprechenden Blutkomponenten die Integrität der interzellulären Kontakte durch TEER-Messungen untersucht und die morphologischen Veränderungen sowie die Expression der zellkontaktbildenden Moleküle (VE-Cadherin, β-Catenin und Occludin) beobachtet. Es stellte sich heraus, dass Patientenseren, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Herzoperationen isoliert wurden, keinen Einfluss auf die interzellulären Kontakte der BCEC-Kulturen ausüben. Dagegen führten die Kokultivierungen der BCEC mit den neutrophilen Granulozyten [PMN], die zu den gleichen Operationszeitpunkten isoliert wurden wie die Seren, zu Veränderungen innerhalb der Zell-Zell-Kontakte sowohl auf funktioneller (TEER-Abnahme) als auch auf morphologischer Ebene. Unabhängig von der Dauer der HLM-Zeiten und den PMNEntnahmezeitpunkten wirkte sich die Zugabe von PMN herzchirurgischer Patienten durch die TEER-Reduktion negativ auf die Integrität der BCEC-Kulturen aus, wobei PMN, die während des herzschirurgichen Eingriffes isoliert wurden, zu etwas stärkeren aber nicht signifikanten TEER-Abnahmen führten als die preoperativ (vor Narkose) isolierten. Auf morphologischer Ebene konnte man ebenfalls durch die Zugabe von PMN herzchirurgischer Patienten verschiedene Veränderungen der interzellulären Kontakte in BCEC-Kulturen beobachten. Die Patienten-PMN führten unabhängig von den Operationszeitpunkten, an denen sie isoliert wurden, und der Länge der HLM-Zeiten zu einer Ausstreckung der BCEC und somit zu einer Zellformveränderung sowie zu einer Verminderung des membranassoziierten β-Catenin- und Occludin-Anteils und einer Umwandlung des „zickzack“ Membranmusters in ein glattes, fast linienförmiges Muster. Zusätzlich konnte man mit Hilfe der Western-Blot-Analyse eine Abnahme der β-Catenin-Expression (AJ-Protein) in BCEC-Kulturen feststellen, die mit während und nach HLM-Einsatz isolierten PMN kokultiviert wurden. Dabei stammten die isolierten PMN von herzchirurgischen Patienten mit langen HLM-Zeiten aber auch von älteren (77 und 79 Jahre) mit kurzen HLM-Zeiten, was auf eine Abhängigkeit des durch die Patienten PMN verursachten negativen Expressionseffektes vom Patientenalter und der Dauer der HLM-Einsatzzeit deutete. Einen Einfluss der Patienten PMN auf die Expression von VE-Cadherin und Occludin konnte nicht festgestellt werden. Durch die Charakterisierung der Konzentrationsverläufe von neurologischen Markern in herzchirurgischen Patientenseren konnte eine Korrelation zwischen der Dauer der HLM-Einsätze und der NSE- und S-100B-Konzentration in Patientenseren fesgestellt werden. Pathologische Werte der beiden neurologischen Marker konnten jedoch nur bei Patienten mit HLM-Zeiten von mehr als 80 Minuten gemessen werden. Im tierexperimentellen Modell wurde dann die Modifikation der Blut-Hirn-Schranken-Permeabilität im Rahmen von herzchirurgischen Eingriffen mit HLM untersucht. Durch quantitativen Nachweis im Hirngewebe von intravenös appliziertem Evan's-Blue Farbstoff konnte eine erhöhte Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke bei den mit HLM operierten Tieren festgestellt werden. Eine Hirnödembildung war jedoch 6 Stunden nach Experimentende mit Hilfe von MRT-Untersuchungen in keinem der untersuchten Fällen zu beobachten. Zusätzlich zu den oben genannten Experimenten wurde die stabilisierende Eigenschaft von Interferon-β [FN-β] gegenüber dem Blut-Hirn-Schranke-Modell untersucht. Dabei führte die Behandlung der konfluenten BCEC-Kulturen mit IFN-β verschiedener Konzentrationen zu hohen TEER-Anstiegen, was auf eine Stabilisierung der interzellulären Kontakte und somit der Integrität und der Barriereeigenschaften der konfluenten BCEC-Kulturen hinwies.
Für pädiatrische Patienten mit Hochrisikoleukämien ist die Donor-Lymphozyten-Infusion eine etablierte Therapieform, um nach Stammzelltransplantation die Immunrekonstitution zu verbessern oder ein beginnendes Rezidiv abzuwehren. Als schwerwiegende Nebenwirkung kann jedoch eine „Graft-versus-host“-Krankeit (graft-versus-host disease; GVHD) auftreten, bei der die T-Zellen gesundes Gewebe angreifen. In ersten klinischen Studien mit veränderten, Suizidgen tragenden Donor-Lymphozyten konnte durch die rechtzeitige Gabe eines Suizidinduktors die GVHD unterbunden werden. Die genetische Manipulation der T-Zellen führte jedoch zu einem Funktionsverlust, der vermutlich auf die zur Transduktion notwendige Aktivierung zurückzuführen ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Aktivierungsprotokolle mit Beads-gekoppelten oder löslichen Antikörpern hinsichtlich der Expansionsrate und dem Einfluss auf die Funktionalität der T-Zellen näher untersucht. Dazu wurden primäre humane T-Zellen im klinischen oder im Labormaßstab immunomagnetisch über eine CD3 sowie CD4/CD8 Selektion oder mittels der RosetteSep-Prozedur auf > 96% angereichert und anschließend expandiert. Die Transduktion erfolgte an den Tagen 3 und 4 mit einem „GMP-grade“ CD34/HSV-TK Vektor. Zur Aktivierung wurden zum einen lösliche CD3/CD28 Antikörper und zum anderen zellgroße Kügelchen - sogenannte Beads – verwendet. Die Beads wurden mit CD3/CD28 Antikörper und fakultativ mit CD2 beladen. Die beladenen Beads imitieren in der Zellkultur eine Antigen präsentierende Zelle und sollten damit eine möglichst physiologische Situation schaffen. Außerdem wurden unterschiedliche IL-2 Konzentrationen zugesetzt (20-1000 U/ml), um einen potentiellen IL-2 Effekt auf die T-Zellen zu untersuchen. Die Aktivierung mit den löslichen Antikörpern führte zu einer IL-2 abhängigen Proliferation der T-Zellen über 14 Tage mit maximaler Expansionsrate (47fach) bei 1000 U/ml IL-2. Die Expansion mit Beads-gekoppelten Antikörpern war ebenfalls IL-2 abhängig, beschränkte sich jedoch auf die erste Woche und erreichte eine maximale Expansionsrate von 3-4. In der zweiten Woche fiel die Zellzahl ab. Zusammenfassend sind für eine starke Expansion der T-Zellen eine hohe IL-2 Konzentration, aber auch die löslichen Antikörper per se verantwortlich. Gleichzeitig konnte demonstriert werden, dass es große individuelle Unterschiede in der T-Zellexpansion verschiedener Spender gibt. Der Einfluss der Aktivierung auf die Veränderung der T-Zellsubpopulationen wurde mit Hilfe von multiparametrischen Analysen am Durchflusszytometer untersucht. Hohe IL-2 Konzentrationen (100 und 1000 U/ml) sowie die Verwendung löslicher Antikörper führten zu einer starken Zunahme der CD8+ T-Zellen. Der CD4/CD8 Quotient blieb lediglich unter Stimulierung mit den Beads-gekoppelten Antikörpern in Verbindung mit 20 U/ml IL-2 konstant. Mit allen Aktivierungsprotokollen ergab sich für den immunologischen Phänotyp eine Verschiebung vom naiven zum Gedächtniszelltyp. Die Proliferation CMV-spezifischer T-Zellen konnte mit allen Aktivierungsprotokollen erreicht werden und korrelierte mit der Expansionsrate der gesamten CD3+ T-Zellen. Die Zytokinausschüttung war verringert bei den T-Zellen, die mit den löslichen Antikörpern stimuliert wurden. Eine verminderte Zytokinproduktion könnte auf einen Verlust der Funktionalität der T-Zellen hindeuten. Von besonderer Bedeutung ist, dass die Stimulierung über Beads-gekoppelte Antikörper zu einer gleichmäßigen Transduktion von CD4+ und CD8+ T-Zellen führte. Im Gegensatz dazu hatte die Aktivierung mit löslichen Antikörpern zur Folge, dass hauptsächlich CD8+ T-Zellen transduziert wurden. Für eine kompetente Immunantwort im Rahmen einer DLI erscheint jedoch eine physiologische Zusammensetzung der CD4+ und CD8+ T-Zellen äußerst wichtig. Residuale Stammzellen könnten potentiell co-transduziert werden. Um diese Gefahr abschätzen zu können, wurden ficollisierte PBSC analog der T-Zellen expandiert. Unter allen T-Zellaktivierungsprotokollen blieben die CD34+ Stammzellen in den ersten Tagen der Kultur vital und durchflusszytometrisch nachweisbar. Die Stammzellen expandierten sogar geringfügig und waren damit potentiell transduzierbar - mit der Gefahr einer klonalen Entartung durch Insertionsmutagenese. Dies deutet auf die Wichtigkeit einer T-Zellselektion zur Manipulation von DLI hin, um residuale Stammzellen zu entfernen. Die Suizidstrategie ist eine vielversprechende Möglichkeit zur Kontrolle der GVHD im Rahmen einer DLI. Voraussetzung ist aber, dass die infundierten Zellen auch immunologisch kompetent bleiben und einen GvL-Effekt bewirken. Die Aktivierung mit Beads-gekoppelten Antikörpern scheint zum Erhalt der Immunkompetenz den löslichen Antikörpern überlegen zu sein.
The analysis of doxorubicin-loaded poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticles in in vitro glioma models
(2005)
The use of doxorubicin for the treatment of glioma tumours would be an important approach in the chemotherapy treatment since doxorubicin is a very effective neoplastic agent. However, one problem faced by the use of doxorubicin for the treatment of brain tumours is the fact that doxorubicin is a substrate of an efflux pump protein, P-glycoprotein (P-gp), which is located on the luminal side of the brain capillary endothelium and in many tumour cells, which acts pumping out of the cell such substrate, and blocking its transport into the cell. A strategy to enhance the doxorubicin delivery into the brain would be the use of nanoparticles. This work showed, that the treatment of doxorubicin bound to poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticles decreased the viability of the three glioma cell lines, the GS-9L, the RG-2, and the F-98 cell lines significantly in comparison to doxorubicin in solution, indicating an improvement of the nanoparticles-bound doxorubicin transport into the cells. The modification of the nanoparticles surface with different surfactants may even enhance the delivery of the drug into the cells. Searching for an improvement of the doxorubicin internalization, the nanoparticles surface was modified using polysorbate 80, poloxamer 188 and poloxamine 908 surfactants. The poloxamer 188 and polaxamine 908 surfactant modified nanoparticles did not show a significant enhancement of the doxorubicin internalization. Contrary, the treatment of polysorbate 80 surfactant modified nanoparticles led in some cases to a significant decrease of cancer cell viability. The use of doxorubicin in the three glioma cell lines allowed the measurement of different responses towards doxorubicin treatment. The different responses were due to the entry of various amounts of doxorubicin into the glioma cells, which express the P-glycoprotein in their cellular membrane. A higher level of the P-gp expression correlated with a weaker response towards the doxorubicin treatment. The GS-9L cell line showed a significant higher level of P-gp expression than the F-98, and RG-2 cell lines, and consequently, the GS-9L cell line presented the highest resistance to doxorubicin with the highest viability values after doxorubicin treatment. Due to the fact that the transport of doxorubicin is governed by the activity of the P-gp in the studied glioma cells, the use of poloxamer 185 as a P-gp inhibitor resulted in an enhancement of the uptake as well as of the accumulation of doxorubicin into the cells. The effect of poloxamer 185 on the doxorubicin uptake was significant marked in the case of doxorubicin-resistance cells, as the GS-9L cell line. In some cases, the presence of the nanoparticles formulation showed also an influence on such uptake improvement. The use of a P-gp inhibitor in combination with chemotherapeutic agents leads to encouraging results. Because of the wide spectrum of substances acting as P-gp inhibitors, the exact inhibitory mechanisms remain still unclear. For instance in our results the evaluation of a described P-gp inhibitor, polysorbate 80 did not show an important improvement in the doxorubicin uptake in the P-gp-expressing cell line, GS-9L. On the other hand, the Polysorbate 80-Dox-PBCA nanoparticles formulation decreased in greater extend the viability of the glioma cells than the poloxamer185-Dox-PBCA nanoparticles. Although, the P-gp inhibition was undoubtedly higher in the presence of poloxamer 185, polysorbate 80 showed a main effect on the disruption of the cellular membrane, resulting in an important cellular viability decrease. It seems that poloxamer 185 presents a direct effect on the functionality of the P-gp protein, which would be of great importance in the sensitization of resistant cancer cells. The range of concentration of poloxamer 185 is very important to yield an inhibitory effect on the P-gp-mediated transport mechanism. The accumulation of Rhodamine-123 (Rho-123), a known P-gp substrate, increased in a range of concentration from 0.001 % to 0.01, whereas at 0.1 % poloxamer 185 the accumulation significantly decreased. A maximal Rho-123 accumulation was reached at 0.01 % poloxamer 185.
Nanopartikuläre Arzneistoffsysteme sind ein viel versprechender Ansatz die speziellen Anforderungen, die an eine Arzneiform gestellt werden, zu erfüllen. Mit ihnen scheint das lang verfolgte Ziel der Pharmaforschung, das gezielte Transportieren ("Drug-Targeting") und das kontrollierte Freisetzen des Arzneistoffs am Wirkort ("Controlled Release") und damit das Minimieren unerwünschter Nebenwirkungen, in greifbare Nähe zu rücken. In der vorliegenden Arbeit konnte durch verschiedene Versuchsansätze in der präklinischen Testung der gezielte Wirkstofftransport zielgerichtet-modifizierter Nanopartikel (NP) auf humanem Serumalbumin (HSA)-Basis sowohl für das spezifische Tumor-Targeting als auch für die Überwindung der Blut-Hirn-Schranke (BHS) gezeigt werden. Die NP für das spezifische Tumor-Targeting waren mit dem Zytostatikum Doxorubicin beladen und mit dem tumorspezifischen Liganden Trastuzumab für ein Mammakarzinom-Zellen-Targeting oder DI17E6 für ein Melanom-Zellen-Targeting modifiziert. Ihre zielgerichtete Funktionalität konnte an verschiedenen Target-exprimierenden-Zelllinien gezeigt werden. Dabei konnte ihre spezifische zelluläre Bindung, Aufnahme und subzellulären Verteilung verifiziert werden. Die Ligand-modifizierten NP wurden bei diesen Untersuchungen spezifisch in die Zielzellen aufgenommen, während die unmodifizierten Kontroll-Partikel unspezifisch an der Zellmembran klebten. Die Freisetzung des Doxorubicins in einer biologisch aktiven Form konnte anhand entsprechender Zellviabilitäts-Assays gezeigt werden. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass der nanopartikulär transportierte Wirkstoff über den Rezeptor-internalisierenden Aufnahmeweg nicht in den Endosomen oder Lysosomen akkumulierte und damit inaktiv war, sondern dass er in wirksamer Form freigesetzt wurde. Als Besonderheit wurde mit DI17E6 für das spezifische Melanom-Zellen-Targeting ein Antikörper als ziel-orientierter Ligand eingesetzt, der zusätzliche anti-tumorale Eigenschaften hat, die bei der Ankopplung an die NP-Oberfläche erhalten werden sollten. Durch speziell entwickelte in vitro Assays, die auf diese Eigenschaften abzielten, konnte der Erhalt der biologischen Wirksamkeit des Antikörpers bestätigt werden. Mit derartigen nanopartikulären Formulierungen, basierend auf biologisch abbau¬barem HSA, modifiziert mit entsprechenden zielgerichteten Liganden und anti-tumoralen Wirkstoffen, sollte aufgrund der hier gezeigten präklinischen Daten eine spezifische Tumortherapie möglich sein. Zum Überwinden der BHS wurden NP getestet, die mit Apolipoprotein E (ApoE) modifiziert waren. Dabei handelte es sich zum einen um leere NP für Aufnahmemechanismus-Studien und zum anderen um Obidoxim-beladene NP für Transportstudien. Bei Obidoxim handelt es sich um einen Vertreter der Stoffklasse der Oxime. Diese werden als Antidote bei Organophosphat (OP)-Vergiftungen eingesetzt. Oxime können die nach einer OP-Vergiftung inhibierte lebensnotwendige Acetylcholinesterase (AChE) reaktivieren. Da Oxime die BHS aber kaum überwinden können, wird die in den zentralnervösen Kompartimenten inhibierte AChE nicht in therapeutisch ausreichendem Maß erreicht. Daher sollte beispielhaft Obidoxim nanopartikulär-vermittelt über die BHS transportiert werden. Für beide Formulierungen konnte die spezifische zelluläre Bindung, Aufnahme und die subzelluläre Verteilung sowie ihre für ein BHS-Targeting kompatiblen, untoxischen Eigenschaften gezeigt werden. Mit den ApoE-modifizierten unbeladenen NP konnte durch verschiedene Koinkubations- und Hemmexperimente eindeutig die Beteiligung der "Low Density Lipoprotein" (LDL)-Rezeptor-Familie, und besonders des "Low Density Lipoprotein Receptor Related Protein" (LRP), bei der spezifischen ApoE-vermittelten NP-Aufnahme gezeigt werden. Dabei ließ sich die NP-Aufnahme auf zwei Wegen hemmen. Zum einen konnte von der zellulären Seite aus der beteiligte Aufnahme-Rezeptors mit dem "Receptor Associated Protein" gehemmt werden, wodurch eine spezifische ApoE-vermittelte NP-Aufnahme über eine Rezeptor-Bindung verhindert wurde. Zum anderen konnte aber auch, durch Blockade des ApoE auf der Partikeloberfläche mittels löslicher Fragmente des LRP, die ApoE-vermittelte NP-Aufnahme von nanopartikulärer Seite gehemmt werden. Durch die Kenntnis des Aufnahmemechanismus der nanopartikulären Formulierungen sollte es für zukünftige Entwicklungen im breiten Feld der BHS-Forschung möglich sein, sehr spezifische und effektivere Carrier maßzuschneidern. Zu Untersuchungen des Wirkstofftransports wurden frisch isolierte porcine Gehirnkapillarendothel-Zellen im Transwell-System als adäquates in vitro BHS-Modell etabliert und eingesetzt. Für den Nachweis des tatsächlichen Obidoxim-Transports wurde ein biologischer Assay entwickelt, der gemäß der therapeutischen Funktion von Oximen nach OP-Vergiftungen auf die Reaktivierung OP-vergifteter AChE abzielte. Es konnte gezeigt werden, dass nanopartikuläre Formulierungen tatsächlich einen verbesserten Transport von Obidoximen gegenüber freiem Obidoxim in einem in vitro BHS-Modell vermitteln. Diese nanopartikulären Transportsysteme stellen daher ein bisher einzigartiges, viel versprechendes Hilfsmittel zum Transport von Oximen über die BHS dar. Durch die in dieser Arbeit dargestellten Untersuchungen konnte insgesamt gezeigt werden, dass NP auf HSA-Basis für einen zielgerichteten Wirkstofftransport geeignet sind und aufgrund ihrer biokompatiblen, bioabbaubaren Eigenschaften einen viel versprechenden Ansatz für die zukünftige Pharmaforschung darstellen.
Optimierung Apolipoprotein-modifizierter Albumin-Nanopartikel zur Überwindung der Blut-Hirn-Schranke
(2007)
Das Gehirn höherer Säugetiere ist durch die Blut-Hirn-Schranke vor dem Eindringen toxischer und schädlicher Substanzen geschützt. Allerdings bildet diese Barriere auch ein Hindernis für die gezielte medikamentöse Therapie von Erkrankungen des zentralen Nervensystems wie zum Beispiel Alzheimer, Gehirntumore oder Parkinson. Leider sind nur wenige potentielle Arzneistoffe für die Therapie dieser Krankheiten in der Lage die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden. Somit stellt die Blut-Hirn-Schranke einen limitierenden Faktor für die Arzneimitteltherapie dar. Diese Doktorarbeit beschäftigt sich mit der Herstellung, Charakterisierung, in vitro und in vivo Testung Liganden-modifizierter Nanopartikel auf Proteinbasis zur Überwindung der Blut-Hirn-Schranke. Als Ligand wurde das Apolipoprotein E, ein Bestandteil von physiologisch vorkommenden HDL, VLDL und LDL-Partikel, verwendet, welches sich in vorangegangenen Untersuchungen als potentieller Ligand zum Transport von Nanopartikeln ins Gehirn erwiesen hat. Diese so mit Apolipoprotein modifizierten Nanopartikel wurden mit dem Modellarzneistoff Loperamid, einem nicht gehirngängigen Opioid, beladen. Diese Zubereitung wurde Mäusen injiziert und der analgetische Effekt mittels des Tail-Flick-Tests bestimmt. Um auch eine therapeutische Anwendung zu erzielen, wurden Apolipoprotein modifizierte Partikel beladen mit dem Zytostatikum Doxorubicin entwickelt und die chemotherapeutische Effizienz an Gehirntumor tragenden Ratten getestet.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit dem Transport von PBCA-Nanopartikeln über die Blut-Hirn-Schranke und deren Einsatz als Arzneiform bei verschiedenen Erkrankungen des ZNS. Die Untersuchung des Einfluß von Nanopartikeln auf die Barriere-Eigenschaften postkonfluenter Endothelzellen und des Transportmechanismus von Nanopartikeln über einen Endothelzelllayer erfolgte in einem komplexen in vitro-BHS-Zellkulturmodell. Der Ausgangspunkt für diese Untersuchung war die Erkenntnis, daß PS80-überzogene PBCA-Nanopartikel von Endothelzellen in vitro aufgenommen werden und das nach Applikation von Doxorubicin-beladenen Nanopartikeln in Ratten erhöhte Wirkstoffspiegel im ZNS festgestellt werden konnten. Als in vitro-Zellkulturmodell der BHS wurden primäre bovine Endothelzellen verwendet. An diesen Modellen wurden die Transportmechanismen für PBCA-Nanopartikel untersucht. Dabei zeigte sich, daß PS80-überzogene PBCA-Nanopartikel bevorzugt über einen konfluenten Endothelzellayer transportiert wurden. Die Zugabe verschiedener Nanopartikelzubereitungen zu postkonfluenten Endothelzellmonolayern führte zu einer deutlichen und konzentrationsabhängigen Erhöhung der Permeabilität für Ionen und Makromoleküle. Der zugrundeliegende Aufnahme- bzw. Transportmechanismus ist jedoch noch nicht aufgeklärt. Die Effizienz der wirkstoffbeladenen Zubereitungen wurde in einem intrakranialen Gehirntumor-Modellsystem untersucht. Dabei zeigten Doxorubicin-beladene PBCA-Nanopartikel mit PS 80 die längste und ausgeprägteste antitumorale Wirkung. Der Effekt, der mit nicht-überzogenen Partikeln und mit Doxorubicin-Lösung erzielt wurde, war dagegen nicht so ausgeprägt. Die Überlebenszeit der Tiere liess sich durch die Chemotherapie deutlich verlängern. Dieses Ergebnis ist überaus bemerkenswert, da es in einem solchem Modell mit einer vergleichbaren Arzneiform noch nicht erreicht werden konnte. Es zeigte sich außerdem keine Neurotoxizität der überzogenen partikulären Zubereitungen. Auch dieses Ergebnis ist wichtig, da wiederholt von einer neurotoxischen Wirkung des Wirkstoffes Doxorubicin berichtet worden war. In einem murinen Trypanosomen-Modellsystem liess sich mit den Wirkstoffen CGP 40215, Trybizin und Diminazen der Erfolg, welcher im Gehirntumormodell durch die Bindung von Doxorubicin an Nanopartikel erzielt wurde, nicht wiederholen. Die partikulären Zubereitungen waren gegen die Trypanosomen nicht wirksamer als die reinen Substanzlösungen. Es liess sich keine Lebensverlängerung der Tiere erreichen. Ebenso konnte kein Tier geheilt werden. Das ist wahrscheinlich auf die mangelnde Bindung des Wirkstoffes an die Nanopartikelzubereitungen zurückzuführen. Ebenso kann die geringe Aktivität der Erreger im ZNS und die damit verbundene mangelnde Wirksamkeit der Enzyminhibitoren eine Rolle spielen. Zusammenfassend lässt sich sagen, daß P80-überzogene PBCANanopartikel über die BHS transportiert werden, und für Gehirntumore eine neue, innovative Arzneiform darstellen, welche den herkömmlichen Zubereitungen in Hinblick auf Lebensverlängerung im Tierversuch überlegen ist. Bei konsequenter Weiterentwicklung ist ein Einsatz dieser modernen Arzneiform im Menschen denkbar und möglich.