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Die vorliegende Doktorarbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung von molekularen Systemen, die aus mehreren Chromophoren bestehen und über einen Zweiphotonen-Prozess aktiviert werden können.
Die Zweiphotonen-Absorption (2PA) beschreibt die nahezu simultane Absorption zweier Photonen, deren Summe die Energie ergibt, die für den entsprechenden elektronischen Übergang nötig ist. Da für die Anregung somit zwei niederenergetische Photonen benötigt werden, kann für die 2PA Nahinfrarot-Licht (NIR-Licht) verwendet werden, welches eine geringe Phototoxizität aufweist und eine tiefe Gewebedurchdringung ermöglicht. Weiterhin wird durch die intrinsische dreidimensionale Auflösung der 2PA eine hohe Ortsauflösung der Photoaktivierung erzielt.
Photolabile Schutzgruppen (PPGs) bzw. Photocages sind chemische Verbindungen, die der vorübergehenden Maskierung der biologischen Funktion eines (Makro-)Moleküls dienen. Sie können durch Licht geeigneter Wellenlängen abgespalten werden (uncaging), wodurch die Aktivität des geschützten Substrats wiederhergestellt wird. Leider weisen viele der etablierten PPGs schlechte Zweiphotonen-Eigenschaften auf. Um die 2P-Aktivität einer PPG zu erhöhen, kann sie kovalent mit einem guten Zweiphotonen-Absorber verknüpft werden, der bei Bestrahlung das Licht über einen Zweiphotonen-Prozess absorbiert und anschließend mittels Energietransfer auf die photolabile Schutzgruppe überträgt. Dies führt schließlich zur Uncaging-Reaktion.
Im Zuge von Projekt I dieser Dissertation wurde eine solche molekulare Dyade für verbessertes Zweiphotonen-Uncaging bestehend aus einem Rhodamin-Fluorophor als Zweiphotonen-Absorber und einem Rotlicht-absorbierenden BODIPY als photolabile Schutzgruppe hergestellt und charakterisiert. Die Zweiphotonen-Aktivität des Fluorophors wurde mittels TPEF-Messungen (two-photon excited fluorescence) untersucht. Anschließend wurde das Rhodamin an einen 3,5-Distyryl-substituierten BODIPY-Photocage gekuppelt. Der Energietransfer innerhalb dieser Dyade wurde mithilfe von transienter Ultrakurzzeit-Spektroskopie und quantenmechanischen Berechnungen untersucht. Die Freisetzung der Abgangsgruppe para-Nitroanilin (PNA) bei Belichtung der Dyade konnte sowohl nach Einphotonen-Anregung des Rhodamins als auch des BODIPYs mithilfe von UV/vis-Absorptionsmessungen qualitativ nachgewiesen werden.
Da die Uncaging-Reaktion allerdings nicht besonders effektiv war, wurde für die Weiterführung des Projekts ein neuer BODIPY Photocage, der eine verbesserte Photolyse-Effizienz und eine höhere Photostabilität aufwies, verwendet und erneut an einen Rhodamin-Fluorophor geknüpft. Anhand dieser optimierten Dyade konnte die Einphotonen-Photolyse quantifiziert, d.h. eine Uncaging-Quantenausbeute für die Freisetzung von PNA bestimmt werden. Weiterhin wurde beobachtet, dass die Photolyse der Dyade mit einer deutlichen Änderung ihrer Fluoreszenzeigenschaften einherging. Dies ermöglichte einen Nachweis des Zweiphotonen-Uncagings mithilfe eines Fluoreszenzmikroskops. Die Dyaden-Moleküle wurden zur Immobilisierung in Liposomen eingeschlossen und unter dem konfokalen Fluoreszenzmikroskop belichtet. Sowohl nach Einphotonen- als auch nach Zweiphotonen-Anregung der Rhodamin-Einheit konnte die gewünschte Fluoreszenzänderung beobachtet und somit das Uncaging bestätigt werden.
In Projekt II der Dissertation wurde ein photoaktivierbarer Fluorophor (PAF) hergestellt. PAFs liegen in ihrer geschützten Form dunkel vor. Durch die Aktivierung mit Licht können sie Fluoreszenzsignale emittieren. Sie liefern somit ein direktes Feedback über die Lichtverteilung und –intensität innerhalb einer Probe und werden somit unter anderem für die Charakterisierung und Optimierung von Belichtungsapparaturen verwendet. Besonders wünschenswert ist hierbei eine Fluoreszenzaktivierung mit sichtbarem Licht bzw. mit NIR-Licht über einen Zweiphotonen-Prozess.
Im Zuge der Arbeit wurde ein Rhodamin-Derivat synthetisiert, das durch die Anbringung eines DEACM450-Photocages in seine nichtemittierende Form gezwungen wurde. Bei Bestrahlung mit 455 nm konnte die Abspaltung der Cumarin-Schutzgruppe und der damit verbundene Anstieg der Rhodamin-Fluoreszenz beobachtet und eine Uncaging-Quantenausbeute bestimmt werden. Für die Untersuchung der Zweiphotonen-Photolyse wurde der geschützte Fluorophor in einem Hydrogel immobilisiert und unter dem konfokalen Fluoreszenzmikroskop betrachtet werden. Anschließend wurden Fluoreszenzbilder vor und nach Photoanregung von bestimmten Regionen des Hydrogels aufgenommen. Durch das Uncaging der Probe konnten helle, definierte Muster geschrieben und ausgelesen werden. Die Photoaktivierung führte dabei sowohl über die Einphotonen-Anregung mit blauem Licht (488 nm) als auch über die Zweiphotonen-Anregung mit NIR-Licht (920 nm) zur Generierung von stabilen, gleichmäßigen Fluoreszenzmustern mit hohem Kontrast.
Gegenstand der vorliegenden Arbeit sind die Untersuchungen lichtgesteuerter Reaktionen der zwei Retinalproteine Channelrhodopsin-2 (ChR-2) und Proteorhodopsin (PR) mit Hilfe zeitaufgelöster Laserspektroskopie.
Da der Mechanismus der Kanalöffnung des ChR-2 bis heute nicht vollständig aufgeklärt werden konnte, beschäftigt sich diese Arbeit insbesondere mit den Prozessen, die direkt nach der Photoanregung des Retinals stattfinden und die Kanalöffnung vorbereiten. Es wurde dabei gezielt auf für die Funktion des Proteins wichtige Faktoren wie strukturelle Besonderheiten des Chromophors und seiner Umgebung eingegangen und deren Auswirkung auf die Dynamik der Photoreaktionen sowie die Veränderungen im Protein nach der Anregung untersucht.
Zunächst wurden die Ergebnisse der vis-pump-IR-probe-Experimente an ChR-2 im Bereich der Carbonylschwingungsbanden protonierter Glutamat- und Aspartat-Reste dargestellt. Dabei wurde insbesondere die Bildungsdynamik der Differenzbanden in diesem Spektralbereich untersucht und in Anlehnung an die vorhandene Literatur eine Bandenzuordnung der für die Funktion des Proteins wichtigen Aminosäurereste vorgenommen. Aus den Messergebnissen konnte geschlossen werden, dass die mit der Kanalöffnung einhergehenden Konformationsänderungen in ChR-2 durch eine effektive Aufnahme der Überschussenergie durch das Protein auf einer sub-Pikosekunden-Zeitskala vorbereitet werden.
Des Weiteren wurden spektroskopische Untersuchungen an der R120H-Mutante des ChR-2 vorgestellt. Da diese Mutante bei elektrophysiologischen Messungen keine Kanalaktivität zeigte, sollte zunächst geklärt werden, ob die Mutation einen Einfluss auf die Retinalisomerisierung und den nachfolgenden Photozyklus hat. Dabei stellte sich heraus, dass die Retinalisomerisierung bei der R120H-Mutante zwar im Vergleich zum Wildtyp etwas verzögert stattfindet, der Einfluss der Punktmutation auf den weiteren Photozyklus jedoch insgesamt gering ist. Mit Hilfe der Kurzzeit-IR-Spektroskopie im Bereich der Amid I-Schwingung des Proteinrückgrats konnten für die Mutante allerdings signifikante Veränderungen der Bildungsdynamik sowie eine deutliche Abnahme der Amplitude des Amid I-Signals detektiert werden. Anhand weiterer Experimente an den Mutanten E123T und D253N in diesem Spektralbereich konnte anschließend ein Zusammenhang zwischen der Intensität der Amid I-Bande und der Kanalaktivität von ChR-2 festgestellt werden. Diese Ergebnisse ließen somit die Schlussfolgerung zu, dass die Aminosäurereste R120 und D253 eine entscheidende Rolle beim schnellen Transfer der Überschussenergie an das Protein nach der Retinalanregung und der so initiierten Kanalöffnung spielen.
Zusätzlich wurde der Frage nachgegangen, inwieweit Veränderungen am Chromophor die Isomerisierungsreaktion, den nachfolgenden Photozyklus sowie die Funktion des ChR-2 als Ionenkanal beeinflussen können. Zu diesem Zweck wurden spektroskopische Untersuchungen an einem mit 9-12-Phenylretinal (PheRet) rekonstituierten ChR-2 vorgestellt. Es konnte gezeigt werden, dass die Isomerisierung des PheRet zu seiner 13-cis-Form in ChR-2 stark verlangsamt ist und verglichen mit dem nicht modifizierten Chromophor deutlich ineffizienter abläuft. Es wurde außerdem festgestellt, dass die Veränderungen am Retinal zu deutlichen Beeinträchtigungen des Photozyklus führen. Zum einen wurde ein sehr schneller Zerfall des ersten Photoprodukts sowie die Bildung eines zusätzlichen, blauverschobenen Px-Zustands detektiert. Außerdem wurde festgestellt, dass nach der Deprotonierung des isomerisierten PheRet der Großteil der modifizierten Retinale in den Ausgangszustand zurückkehrt und der P3-Zustand nur in geringen Mengen gebildet wird. Die Messergebnisse führten somit zu der Schlussfolgerung, dass die all-trans-Konformation des PheRet in ChR-2 deutlich bevorzugt wird. Da elektrophysiologische Untersuchungen des Retinal-Analogons jodach keine signifikanten Verminderungen der Photoströme im Vergleich zum ATR in ChR-2 zeigten, ließ sich schließlich festhalten, dass die vorgenommenen Veränderungen am Chromophor, die zu einer deutlichen Hemmung der Isomerisierungsreaktion führen und einen starken Einfluss auf den nachfolgenden Photozyklus haben, nicht ausreichend sind, um die Kanalaktivität von ChR-2 komplett zu blockieren, solange noch ein kleiner Anteil der Retinale isomerisieren kann.
Der abschließende Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Absorption des UV-Lichts durch das Retinal mit deprotonierter Schiff-Base im grünabsorbierenden Proteorhodopsin, welches in einem alkalischen Medium im Dunkelzustand akkumuliert werden kann. Die Untersuchungen der Primärreaktion zeigten einen langsamen biexponentiellen Zerfall des angeregten Zustands der UV-absorbierenden Spezies mit anschließender Bildung des 13-cis-Photoprodukts. Aufgrund dieser Ergebnisse konnte ein Reaktionsmodell für die ersten Prozesse nach der UV-Anregung des Retinals im GPR aufgestellt werden, welches möglicherweise für weitere UV-Rezeptoren genutzt werden kann.
Ribonukleinsäure (ribonucleic acid, RNA) wirkt bei der Proteinbiosynthese nicht nur als Informationsüberträger, sondern kann auch beispielsweise durch sogenannten Riboschalter (auch Riboswitches) regulatorische Funktionen übernehmen. Riboschalter sind komplett aus RNA aufgebaut und man kann sie sich als molekulare Schalter vorstellen, die die Genexpression kontrollieren. Konzeptionell besteht ein Riboswitch aus zwei Untereinheiten, dem Aptamer und der Expressionsplattform. Das Aptamer bindet, üblicherweise sehr spezifisch, kleine organische Moleküle, aber auch Ionen. Diese Ligandenbindung induziert Änderungen in der Struktur des Riboswitches, welche wiederum die Expressionsplattform beeinflussen. Je nach Riboswitch ermöglicht oder verhindert dies schließlich die Genexpression. Die vorliegende Doktorarbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung und Etablierung von Methoden der optischen Spektroskopie zur Aufklärung von RNA-Dynamiken und -Strukturen im Allgemeinen und der Erforschung von Aptamerbindungsmechanismen im Besonderen.
Eine der dazu verwendetet Methoden ist die FTIR-Spektroskopie. Hierfür wurden zunächst kritische Parameter wie verschiedenste Messeinstellungen oder die Probenpräparation ausgiebig an RNA-Modellsträngen getestet. Dabei war es möglich, eine kleine Spektrenbibliothek als internen Standard aufzubauen. Gleichzeitig konnte gezeigt werden, dass kleinere RNA-Oligonukleotide (< ca. 20 Nukleobasen) gut mittels FTIR-Methoden untersucht werden können. Anschließend wurde eine statische Bindungsstudie am adenosin- sowie am guanosinbindenden Aptamer vorgenommen.
Die zweite hier vorgestellte Methode zur Untersuchung von RNA-Molekülen ist die Fluoreszenzspektroskopie. Im Gegensatz zur FTIR-Spektroskopie ist dazu allerdings eine Modifizierung der RNA durch ein Fluoreszenzlabel nötig. Deshalb beschäftigt sich der Hauptteil dieser Doktorarbeit mit der Charakterisierung und der Anwendung des quasi bifunktionellen RNA-Markers (auch RNA-Labels) Çmf. So wurden zunächst die photophysikalischen und photochemischen Eigenschaften des Markers untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass Çmf sich als lokale Sonde eignet, da es empfindlich auf Änderungen der Mikroumgebung in Lösung reagiert. Durch direkten Vergleich der optischen Eigenschaften von Çmf mit den entsprechenden Eigenschaften des Spinlabels Çm war es möglich, den starken Fluoreszenzlöschungseffekt (sog. quenching) des Çm aufzuklären. So kann davon ausgegangen werden, dass die Fluoreszenz des Çm durch eine sehr schnelle interne Konversion (IC) in einen dunklen Dublettzustand (D1) gelöscht wird.
Im nächsten Schritt wurde Çmf in RNA-Modellstränge eingebaut, um den Einfluss der RNA auf die Photochemie des Markers zu untersuchen. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich dessen Fluoreszenzsignal abhängig von den direkten Nachbarbasen sowie abhängig vom Hybridisierungszustand signifikant ändert. Gleichzeitig konnte keine deutliche Veränderung der Stabilität der Modellstränge festgestellt werden. So konnte also nachgewiesen werden, dass sich Çmf sehr gut als lokale Sonde in RNA eignet. Im Speziellen wurde aus den Ergebnissen geschlossen, dass der Fluorophor für Ligandenbindungsstudien herangezogen werden kann.
Deshalb wurde Çmf schließlich an mehreren verschiedenen Stellen in das neomycinbindende Aptamer (N1) eingebaut, um dessen Bindungskinetik zu untersuchen. Mittels Stopped-Flow-Messungen war es möglich, die Bindungsdynamik des Aptamers zu beobachten. Anhand dieser transienten Daten konnte ein Zweischrittbindungsmodell abgeleitet werden. Dabei bindet Neomycin zunächst unspezifisch an das weitgehend vorgeformte Aptamer. Anschließend kommt es durch die Ausbildung von Wasserstoffbrücken zu einer spezifischen Bindung des Liganden am Aptamer.
Im dritten Teil dieser Arbeit geht es ebenfalls um die Entwicklung und Etablierung eines spektroskopischen Werkzeuges. Dabei stehen allerdings Rhodopsine im Mittelpunkt der Aufmerksamkeit. Hierbei handelt es sich um Membrantransportproteine, die nach optischer Anregung einen sehr schnellen Photozyklus mit mehreren Intermediaten durchlaufen. Es ist möglich, diese Intermediate dank transienter Absorptionsmessungen mit sehr guter zeitlicher und spektraler Auflösung zu beobachten. Allerdings besteht der Bedarf, diese Intermediate statisch zu präparieren, um sie näher charakterisieren und mit anderen Methoden, wie z.B. der Festkörper-NMR, vergleichen zu können.
Ein spektroskopisches Werkzeug zum Präparieren von frühen Photointermediaten ist kryogenes Einfangen (sog. Cryotrapping) dieser Intermediate. Im Rahmen dieser Arbeit wurden das Cryotrapping und die anschließende statische UV/vis-Absorptionsspektroskopie der fixierten (getrappten) Zustände optimiert und an einer Reihe von Rhodopsinen (ChR2, GPR) demonstriert.
Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung lichtinduzierter Strukturänderungen verschiedener photoschaltbarer Moleküle durch zeitaufgelöste Infrarotspektroskopie. Hierzu war es notwendig, eine komplexe Messapparatur zu konzipieren, aufzubauen und zu optimieren. Das entwickelte Anreg-/Abtast-Experiment ermöglicht die Messung kleinster transienter Absorptionsänderungen (delta A<1E-5) im Spektralbereich von 1000 cm^-1 bis 2500 cm^-1 mit einer Zeitauflösung von etwa 0,3 ps. Es können Anregungspulse im Bereich von 258nm bis über 600nm generiert werden. Über ein computergesteuertes Wellenplättchen kann die Polarisation des Anregungslichtes während der Datenaufnahme variiert werden, was eine Auswertung hinsichtlich der molekularen Anisotropie ermöglicht. Die eingesetzten Probenzellen gestatten die Untersuchung geringster Probenmengen (V <20µL) bei Temperaturen bis zu 50°C. Nitrophenylacetat (NPA) wurde hinsichtlich seiner Photodecarboxylierungsreaktion untersucht. Für alle drei Konstitutionsisomere konnte nachgewiesen werden, dass die Freisetzung von CO2 innerhalb von 1 ns erfolgt. Es zeigen sich signifikante Unterschiede zwischen den Reaktionsverläufen der drei Konstitutionen, wobei die erhaltenen Amplituden der Photoproduktspektren mit den bekannten Decarboxylierungsquantenausbeuten korrelieren. Die globale Analyse ergibt einen multiexponentiellen Aufbau des CO2-Signals. Im Fall von meta- und para-NPA erfolgt die Abspaltung von CO2 über einen dominanten Zerfallskanal mit einer Zeitkonstante von t~200 ps. Quantenchemische Rechnungen legen nahe, dass dieser Hauptreaktionspfad über den Triplettzustand verläuft. Bei ortho- NPA wird dieser Zerfallskanal effektiv gequencht, was mit einer schnellen Deaktivierung des angeregten Singulettzustandes durch einen intramolekularen Protonentransfer erklärt wird. Nach diesen Messungen steht fest, dass meta-Nitrophenylacetat hervorragend als caged compound für CO2 geeignet ist. Die Primärdynamik von solubilisiertem Proteorhodopsin (PR) in D2O wurde im infraroten und sichtbaren Spektralbereich sowohl bei saurem als auch bei alkalischem pD-Wert untersucht. Dies erlaubt den direkten Vergleich der in beiden Spektralbereichen gemessenen Daten. Der primäre Protonenaktzeptor Asp97 liegt dabei entweder protoniert (pD=6,4) oder deprotoniert (pD=9,2) vor. Die transienten vis-Absorptionsspektren ergaben, wie bei PR in H2O, einen biexponentiellen Zerfall des angeregten Zustands und die gleichzeitige Bildung des PRK-Photoproduktes. Die Abweichung der bei PR in D2O ermittelten Werte von den publizierten Zeitkonstanten der H2O-Messung wird als kinetischer Isoptopeneffekt interpretiert. Dieser variiert mit dem pD-Wert, was auf Unterschiede der Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerke in der Retinalumgebung hinweist. Die Signaturen der transienten Infrarotspektren werden den C=C- und C=N-Moden des Retinals sowie der Amid I-Mode des Proteins zugeordnet. Es konnte ebenfalls die Bildung des PRK-Produktes nachgewiesen werden, wobei die Isomerisierungsquantenausbeute des Retinals unabhängig von der Protonierung von Asp97 ist. Die im IR bestimmten Zeitkonstanten sind dabei unabhängig vom pD-Wert und weichen von den im Sichtbaren ermittelten Werten ab. Dieser Befund wird mit dem Einfluss der molekularen Temperatur auf die transienten IR-Spektren und dem Auftreten von Kühlprozessen erklärt. Zusätzlich zum Wildtyp-Protein wurde die PR-D97N-Mutante als Modellsystem für PR im sauren pH-Bereich ebenfalls im vis- und IR-Bereich untersucht. Die dabei erzielten Ergebnisse stehen im Einklang mit den bisherigen Ausführungen. Der geringe kinetische Isotopeneffekt weist auf ein ähnliches Wasserstoffbrückennetzwerk wie beim Wildtyp unter sauren Bedingungen hin. Als letztes wurde ein synthetisches Modellcollagen untersucht. Die Seitenkettenverbrückung der Peptidsequenz mit einem Azobenzol-basierten, künstlichen Photoschalter sollte eine lichtinduzierte Entfaltung der Tertiärstruktur ermöglichen. Der isolierte Photoschalter und die gekoppelte Sequenz wurden zunächst unter Gleichgewichtsbedingungen sowohl im UV/vis- als auch im IR -Bereich umfangreich spektroskopisch charakterisiert. Diese Messdaten lagen zum großen Teil bereits vor und wurden in dieser Arbeit einer detaillierten Auswertung unterzogen. Für den isolierten Schalter konnte im IR-Bereich eine umfassende Bandenzuordnung erstellt werden. Dabei wird im photostationären Gleichgewicht eine reversible trans-> cis-Isomerisierung festgestellt, welche keine Temperaturabhängigkeit aufweist. Darüberhinaus wurden polarisationsabhängige, transiente IR-Spektren des isolierten Azoschalters für die trans->cis- und die cis->trans-Isomerisierungsrichtung aufgenommen. Die instantan auftretenden, markanten Differenzsignale können den Amid I- und Amid II-Moden der im Schalter enthaltenen Peptidbindungen sowie den Phenylmoden zugeordnet werden. Die extrahierten kinetischen Parameter sind für beide Isomere nahezu identisch, was durch einen dominanten Beitrag molekularer Kühlprozesse erklärt werden kann. Aufgrund der geringen Isomerisierungsquantenausbeute (< 10 %) können die Differenzspektren der photostationären Gleichgewichte nicht in den Produktspektren dieser Messungen reproduziert werden. Hinsichtlich der ermittelten Anisotropieparameter ergeben sich kleine Unterschiede zwischen beiden Datensätzen. Zusammen mit theoretischen Modellierungen werden diese in Zukunft genauere Aussagen über die Strukturen der Isomere erlauben. Die UV/vis-Absorptionsspektren des gekoppelten Systems zeigen, dass die Absorptionsbanden des Azoschalters durch die Kopplung an das Collagen nicht signifikant beeinflusst werden. Im IR-Absorptionsspektrum konnten wichtige Amid I-, Amid II- und Amid II0-Banden des Azoschalters und der Peptidsequenz sowie eine große Anzahl weiterer Banden zugeordnet werden. Temperaturabhängige Absolut- und Differenzspektren im UV/vis- und IR-Bereich zeigen eine irreversible thermische Denaturierung der Collagentripelhelix ab etwa 50°C. Das verwendete, deuterierte Lösungsmittelgemisch führt zu einem H/D-Austausch. Anhand der Amid II-Bande der in der tripelhelikalen Struktur geschützten Glycine kann die Existenz der Collagenstruktur und ihre Entfaltung nachgewiesen werden. Die Amplituden der photostationären Differenzspektren sind jedoch kleiner als beim isolierten Schalter, was auf eine verringerte Isomerisierungsquantenausbeute hinweist. Die bei Erwärmung beobachtete Vergrößerung der Differenzsignale wird mit einer effizienteren Isomerisierung nach dem Aufschmelzen der Tripelhelix erklärt. Für die trans->cis-Isomerisierungsrichtung wurden transiente IR-Spektren des Azocollagens bei unterschiedlichen Temperaturen aufgenommen. Alle instantan auftretenden Differenzsignale können auf die Schwingungsmoden des Azoschalters zurückgeführt werden. Bei einer Temperatur von 50°C lässt sich ein Einfluss der Peptidsequenz auf die transienten Spektren nicht nachweisen, was mit einer aufgeschmolzenen Tertiärstruktur im Einklang ist. Hingegen wird bei 20°C das Ausbleichen von Amid I-Schwingungsbanden der Peptidsequenz beobachtet, was eindeutig einen Energietransfer auf diese Moden zeigt. Bei 35°C sind die Bleichsignale des Collagens in diesem Bereich bereits deutlich abgeschwächt. Die transienten Spektren des isolierten Azoschalters besitzen keine derartige Temperaturabhängigkeit.
Untersuchung der Konformation und Dynamik von RNA mit Hilfe fluoreszierender Farbstoffmoleküle
(2010)
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung der konformationellen und elektronischen Eigenschaften sowie der Dynamik verschiedener RNA-Systeme. Zur Durchführung dieser Experimente wurde zusätzlich zu bereits vorhandenen statischen und zeitaufgelösten Absorptionsspektrometern im Rahmen dieser Arbeit eine Apparatur zur Messung von Fluoreszenzlebensdauern entwickelt, die durch die integrative Verwendung zweier verschiedener, etablierter Technologien (TCSPC und Aufkonvertierung) über einen weiten Zeitbereich von 9 Größenordnungen (100 fs - 0,1 ms) operiert. Mit diesem Aufbau konnten neben den RNA-Studien wichtige Beiträge zum Verständnis der Isomerisierung eines Retinalproteins, des Transportprozess des Membrantransportproteins TbSMR und der im Infraroten liegenden Fluoreszenz des Radikalkations von Astaxanthin gewonnen werden. Der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit liegt auf der Untersuchung verschiedener RNA-Systeme: So werden die optischen Eigenschaften einer 1-Ethinylpyren-modifzierten RNA-Adeninbase allein und in RNA-Strängen eingebunden untersucht. Statische Fluoreszenzmessungen zeigen einen ausgeprägten Ladungstransfercharakter des Chromophors und eine generell große Wechselwirkung zwischen Ethinylpyren und Adenin, die in einer substanziellen Änderung der optischen Eigenschaften des Pyrens resultiert. Die Untersuchung der schnellen Photodynamik von Pyrenadenin zeigt zudem eine Verringerung der Lebensdauer von Pyren um etwa 2 Größenordnungen. Pyrenadenin zeigt sowohl Fluoreszenz eines neutralen (100-200 ps), als auch eines energetisch tiefer liegenden Ladungstransferzustands (1-2 ns). Die Formationszeit des Ladungstransferzustandes fällt mit steigender Polarität des Lösemittels. Eingebunden in Modell-RNA-Stränge ist Fluoreszenzquantenausbeute des Chromophors ein deutlicher Indikator für seine Interkalation. Nur in der stabileren Umgebung von GC-Basenpaaren ist das Pyren in der Lage, sich dauerhaft innerhalb des Duplex aufzuhalten, während in einer flexibleren AU-Umgebung eine Position außerhalb des RNA-Duplex präferiert wird. Transiente Absorptionsmessungen zeigen, dass die Photophysik des in RNA eingebundenen Pyrenadenins nur kleine Variationen im Vergleich zur Photophysik des Labels allein aufweist. Die deutliche Abnahme der Quantenausbeute des interkalierten Chromophors geht hauptsächlich auf Kosten der langlebigeren Ladungstransferfluoreszenz, so dass interkaliertes Pyren insgesamt schneller in den Grundzustand zurückkehrt als nicht interkaliertes. Mit Hilfe eines doppelt modifizierten Duplex, bei dem sich jeweils ein Farbstoff an einem der beiden Stränge befindet, kann nachgewiesen werden, dass aufgrund von Exzimerwechselwirkungen eine Verschiebung des Fluoreszenzmaximums von 35 nm auftritt. Kurzzeitspektroskopische Messungen zeigen Signale, die als Superposition von Monomeren und Exzimeren interpretiert werden können, wobei die Lebensdauer des letzteren mit 18,5 ns die der Monomerkomponente um ein Vielfaches übertrifft. Ein weiterer Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit einer Studie zur Bindung des fluoreszenten Liganden Tetrazyklin an das Tetrazyklin bindende Aptamer. Hier wird auf Basis verschiedener Mutanten mit Hilfe des TCSPC eine Analyse der Stabilität der Bindetasche sowie mit der Stopped-Flow-Methode eine Beobachtung des Bindungsprozesses durchgeführt. Insgesamt folgt die Bindung des Tetrazyklins an das Aptamer einer zweistufigen Kinetik, deren zweiter Schritt irreversibel ist. Die Bindung läuft, verglichen mit anderen Aptameren, sehr schnell ab. Während die Mutationen von A13 und A50,die direkte Kontakte zum Substrat bilden, nur einen leichten Einfluss auf beide Bindungsschritte ausüben, führt eine Mutation der für die Präformation verantwortlichen Base A9 zu einer Verlangsamung des Bindungsprozesses um mehr als einen Faktor 20 durch eine immens gesteigerten Rückreaktionsrate des ersten Bindungsschritts. Hieraus lässt sich schließen, dass bei fehlender Präformation des Aptamers nur wenige Tetrazyklinmoleküle ein für vollständige Bindung geeignetes Aptamer vorfinden. Die Bindung an A13 und A50 geschieht bereits im ersten Schritt des Bindungsprozesses. Ferner konnte anhand von Lebensdauermessungen gezeigt werden, dass nach dem Wildtyp die Mutante A9G die stabilste Bindetasche aufwies. Das Fehlen eines direkten Kontaktes wirkt sich deutlich stärker aus. Insbesondere führt die Abwesenheit der Fixierung des Gegenions durch A50 zu der instabilsten Bindetasche. Wie in dieser Arbeit gezeigt wird, ist die zeitaufgelöste optische Spektroskopie insbesondere in Verbindung mit fluoreszierenden Molekülen ein ausgezeichnetes Mittel zur Beobachtung von Struktur und Dynamik von RNA. Die Empfindlichkeit von Fluoreszenz auf die Veränderung der Umgebung des Chromophors erlaubt es, Konformationsdynamik und elektronische Konfigurationen in Echtzeit zu beobachten.
To gain a better understanding of complex mechanisms in biological systems, simultaneous control over multiple processes is key. To this purpose selective photouncaging has been developed. Photo-uncaging is an experimental scheme in which a molecule of interest has been inactivated synthetically and is activated by light. Usually a bond is cleaved and a leaving group is set free. The molecule which inactivates the molecule of interest and sets the leaving group free is called (photo-)cage. In a selective photo-uncaging scheme a number of leaving groups can be released independently, usually by irradiation with light of different wavelengths. This approach is, however, seriously limited in its applicability due to the properties of the involved cages and irradiation schemes. A major drawback is the usually quite broad UV-Vis absorption of the cages. This makes a selective activation by light difficult and limits the maximal number of independent cages severely.
Therefore, the aim of this thesis is to introduce the Vibrationally Promoted Electronic Resonance (VIPER) 2D-IR pulse sequence in a alternative selective uncaging scheme.
The VIPER 2D-IR pulse sequence is a spectroscopic tool which allows to generate 2D-IR signals whose lifetime are independent of the vibrational relaxation lifetime. It has been first used to monitor chemical exchange. It consists of a narrowband infared pump pulse, a subsequent UV-Vis pump pulse and a broadband infrared probe pulse. The UV-Vis pump pulse is off-resonant with regard to the UV-Vis absorption band. Electronic excitation becomes only possible, if the infrared pump pulse modulates the UV-Vis transition of the IR-excited molecule. This modulation brings the UV-Vis transition in resonance with the UV-Vis pump pulse. Thereby, only the molecules which were pre-excited with the infrared pulse can be excited into the electronically excited state. A computational prediction of the modulation was carried out by Jan von Cosel in the Burghardt group.
The narrowband infrared pump pulse can be used to selectively excite a subensemble of molecules in a mixture into an electronically excited state even if the UV-Vis spectra of all molecules are virtually identical. For this the sub-ensemble needs to exhibit an identifiable infrared spectrum. Combined with the introduction of isotope labels, which lead to changes in the infrared absorption spectra, the larger selectivity in the infrared region can be exploited for an alternative selective uncaging approach. In VIPER uncaging the infrared pump pulse selects the species and the subsequent UV-Vis pulse provides the energy needed for electronic excitation upon which the photo cleavage can occur.
After an introduction of the principle idea of uncaging and VIPER spectroscopy, the concept of VIPER uncaging is introduced and its limits and requirements are discussed. Some examples for possible VIPER cages are reviewed.
A coumarin molecule (7-diethylamino coumarin) which can release an azide group was chosen as a first test molecule for VIPER uncaging. Its isotopomers were characterized to determine suitable spectroscopic markers for successful uncaging and to find fitting experimental conditions. The chosen coumarin cage has an UV-Vis absorption band at approximately 380 nm and a steep flank on the high wavelength side of the band. The quantum yield for the azide compound is between 10-20 % depending on the solvent’s water content. The release was found to be on a picosecond timescale which is among the fastest known photo reactions, but the photo reaction mechanism has proven to be not straightforward. For the VIPER experiment on the mixture two isotopomers were chosen with a 13C atom at different positions. In one species a ring mode of the coumarin is changed by the 13C atom. In the other isotopomer the carbonyl stretching mode is influenced. The change in the ring mode region allows to select one species or the other with the infrared pre-excitation. Because of experimental difficulties only isotopomers with the same leaving group could be used. The successful selective electronic excitation of the individual isotopomers in a mixture was monitored by probing the carbonyl region.
As a second VIPER cage, para-hydroxyphenacyl (pHP) was chosen. A thiocyanate group was selected as leaving group. pHP cages have their electronic transition in the UV, with a maximum absorption at 290 nm. The shape of the spectrum is suitable and the quantum yield is very high, with values in the literature of up to 90 %. Also the photo reaction is well studied and the expected byproducts are well characterized. The chosen isotopologues were characterized spectroscopically. The resulting data on the photo reaction were in agreement with the mechanism proposed in the literature. The mixture for the VIPER experiment consisted of two isotopologues, where for one species all the C atoms in the ring were labelled and for the other the C-atom in the thiocyanate leaving group was labelled. Here the release of the different leaving groups, labelled and unlabelled thiocyanate, could be monitored selectively. This shows that it is possible to selectively release a molecule in a mixture of caged molecules by applying the VIPER pulse sequence.
The samples were synthesized by Matiss Reinfelds from the Heckel group and the VIPER experiments were done together with Carsten Neumann and with support
of the Bredenbeck group.
The leaving groups were chosen because of their infrared absorption which allowed to directly monitor the successful cleavage by spectroscopy. This was needed for the proof-of-concept experiment and to allow direct optimization of the experimental parameters but is not necessarily a requirement for VIPER uncaging.
Concerning the selectivity of the VIPER uncaging, the approach is at the moment mainly limited by the infrared pulse energy. The selective VIPER excitation is competing with unselective excitation directly by just the UV-Vis pulse. A more intense infrared pump pulse would increase only the selective VIPER excitation and thereby improve the contrast to the unspecific background.
To address this issue, the first steps towards an alternative infrared light generation are undertaken. In this alternative approach the infrared light for preexcitation is directly generated by difference frequency generation of the laser output, i.e. the high energy 800 nm fundamental, and the output of a non-collinear optical parametric amplifier (NOPA). To achieve a narrowband pump pulse the pulses are chirped before mixing. In the scope of this thesis a NOPA has been installed and the mixing has been tested with available test crystal medium. While infrared wavelength region and power were not in the aspired range with this alternative crystal the feasibility of mixing between a NOPA output and the fundamental could be shown.
Other possibilities to increase the contrast to the unspecific background excitation by the UV-Vis pump pulse are discussed. For most applications of selective VIPER uncaging the detection by fs-laser spectroscopy will not be needed and could be replaced by other methods e.g. chromatography. This will allow the experimental parameters of the VIPER pulse sequence to be changed in a way which reduces unspecific excitation i.e. reducing the UV-Vis-pump energy and result in much better contrast.
In conclusion, the experimental data in this thesis shows the VIPER pulse sequence to be applicable to selective uncaging schemes and indicates measures to arrive at the specificity necessary for uncaging applications. This thesis was focused on uncaging photo reactions with isotopomers and isotopologues, but other types of photo reactions could in principle be controlled in the same way. It should be possible to address different isomers in mixtures or different ground states of proteins selectively. The discussed experiments are a significant step towards control over photo reactions in mixtures.
Photoinduzierte Energietransferprozesse und -reaktionen spielen in vielen Gebieten von Chemie, Physik und Biologie eine wichtige Rolle. Zu den prominentesten Beispielen zählen der Lichtsammelprozess in der Photosynthese und der Anregungsenergietransfer in funktionellen Materialien. Der Fokus dieser Arbeit liegt auf letzterem Bereich, genauer auf organischer Elektronik und flexiblen Donor-Akzeptor-Bausteinen und Schaltern. Im Besonderen werden hier zwei verschiedene Typen von funktionellen organischen Systemen betrachtet: zum einen oligomere Fragmente organischer halbleitender Polymere wie Oligo-p-Phenylen-Vinylen (OPV) und Oligo-Thiophen (OT), welche als Bausteine für neuartige organische Solarzellen dienen, und zum anderen kleine funktionelle Donor-Akzeptor-Einheiten wie Dithienylethen-Bordipyrromethen (DTE-BODIPY). Letzteres wurde in Kooperation mit den experimentellen Gruppen von K. Rück-Braun (TU Berlin) und J. Wachtveitl (Goethe Universität) untersucht. Um die relevanten Energietransfermechanismen genauer zu verstehen, wurden an diesen Systemen elektronische Strukturrechnungen und quantendynamische Untersuchungen durchgeführt. Hierzu wurden mittels ab initio-Methoden Modell-Hamiltonians parametrisiert und mit hochdimensionalen quantendynamischen oder semiklassischen Methoden kombiniert. Während die Parametrisierung für kleinere Fragmente durchgeführt wurde, lässt sich der so parametrisierte Hamiltonian ohne Weiteres auf größere Systeme erweitern. Die dynamischen Studien der betreffenden Systeme wurden mittels der Multikonfigurationellen Zeitabhängigen Hartree (MCTDH) Methode durchgeführt, welche eine vollständige quantendynamische Beschreibung des Systems zulässt. Für größere Systeme wurde die semiklassische Ehrenfest Methode in Verbindung mit dem Langevin-Ansatz zur Beschreibung von Umgebungseffekten genutzt. Hierzu wurde ein eigens für diese Methode und Systeme geschriebenes Programm eingesetzt. Im Falle der OT- und OPV-Oligomere wurde die Dynamik bei Vorliegen eines strukturellen Defekts untersucht. Ziel war es hierbei, die dynamischen Phänomene, welche durch die Photoanregung induziert werden, zu untersuchen. Des Weiteren wurde untersucht, ob das Konzept von „spektroskopischen Einheiten“, welche die Lokalisierung der Anregung durch strukturelle Defekte beschreibt, in diesen Systemen zutrifft. Hierzu wurden die Systeme in einer Frenkel-Basis definiert, welche ein auf einem Monomer lokalisiertes Elektron-Loch-Paar beschreibt. Delokalisierte elektronische Anregungen können somit als Superposition solcher Frenkel-Zustände beschrieben werden. Neben der Frenkel-Basis wurde aber auch eine verallgemeinerte Elektron-Loch-Basis verwendet, welche über zusätzliche Ladungstransferzustände eine räumliche Separation von Elektronen und Löchern erlaubt.Die Parametrisierung des OPV- und OT-Hamiltonians erfolgte mittels der Algebraischen Diagrammatischen Konstruktions (ADC(2))-Methode, welche in Kombination mit einer Übergangs-Dichte-Matrix-Analyse eine sehr akkurate Beschreibung der Frenkel- und Ladungstransferzustände basierend auf den supermolekularen Zuständen erlaubt. Um vibronische Effekte auf die Dynamik miteinzubeziehen,wurden nieder- und hochfrequente Torsions- und alternierende Bindungslängenmoden des Systems im Hamiltonian berücksichtigt. Hierzu wurden eindimensionale Schnitte der Potentialflächen entlang dieser Koordinaten berechnet und mittels einer Transformation in diabatische Potentialflächen überführt. Mit diesem Setup wurden die quantendynamischen und semiklassischen Simulationen für ein OPV/OT-Hexamer und ein 20-mer durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Simulationen zeigen, dass der Energietransfer auf einer Subpikosekunden-Zeitskala stattfindet und eine starke Abhängigkeit vom Vorliegen eines strukturellen Defekts aufweist. Des Weiteren konnte auf einer Zeitskala von 100 Femtosekunden eine Lokalisierung des Exzitons beobachtet werden. Fluktuationseffekte werden zudem über Quantenfluktuationen im Falle von MCTDH bzw. über thermische Fluktuationen im Falle des Ehrenfest-/Langevin-Ansatzes berücksichtigt. Letzterer ist jedoch nicht in der Lage, die kohärente Charakteristik der mit den Schwingungsmoden gekoppelten Exziton- und Lokalisierungsdynamik wiederzugeben. Dagegen kann dieser Ansatz erfolgreich genutzt werden, um eine fluktuationsgetriebene „Hopping“-Dynamik des quasi- stationären Zustandes auf einer längeren Zeitskala in Abhängigkeit von der Temperatur zu beschreiben. Die Beschreibung der Photodynamik der DTE-BODIPY-Dyade zielt darauf ab, experimentell beobachtete vibrationelle Schwingungen des BODIPY-Fragments zu erklären, die ohne eine direkte Anregung dieses Fragments zustande kommen. Diese wurden nach einer selektiven Anregung des DTE-Fragments in zeitaufgelösten UV/Vis Anreg-Abtast-Experimenten beobachtet. Der Fokus der Untersuchung liegt daher auf der Beschreibung der photoinduzierten intramolekulare Energieumverteilung (IVR) auf einer Subpikosekunden-Zeitskala. Die DTE-BODIPY Dyade wurde mittels eines Hamiltonians, welcher durch TDDFT Rechnungen parametrisiert wurde, dargestellt. Basierend auf den Normalmoden des Systems, wurden lokale DTE- und BODIPY-Moden konstruiert, wobei einige dieser Moden miteinander gekoppelt sind und die Photoanregung des DTE auf das BODIPY-Fragment übertragen. Hierbei zeigte sich, dass die Zeitskala und die charakteristischen Frequenzen des Experiments mittels der hochdimensionalen MCTDH-Methode gut reproduziert wurden. Aus den Simulationen ergab sich zudem, dass der beobachtete Energietransfer stark von einem Reservoir von vibrationell angeregten lokalen DTE-Moden beeinflusst wird. Der untersuchte IVR- Prozess zeigt zudem eine ausgeprägte Abhängigkeit von lokalen Kopplungen und der Kopplung an eine Umgebung.
In the last twenty years, there has been splendid progress in energy conversion technologies to have sustainable energy sources. For example, solar cells contribute significantly to energy production as the sun is an enormous source for renewable energy. Currently, the most common commercialized photovoltaic devices are silicon-based. The scientists' main targets are high efficiency, low cost, environmentally friendly, and easy to synthesize new semiconductor materials to replace silicon. Furthermore, understanding the photophysical properties of these materials is very important for designing high efficient photoconversion systems.
This thesis investigates the photophysics of lead-based wide-bandgap perovskites with different dimensionality (2D, 3D) and how they can be optimized for optoelectronic applications. In chapter 1, we present the background and progress in perovskite research. The basic concepts of semiconductor and spectroscopic methods of the applied techniques in this work are discussed in chapter 2.
In the first project (chapter 3.1), we used our time-resolved techniques to study the ultrafast dynamics of energy transfer from the inorganic to the organic layer in a series of three lead-based mixed-halide 2D perovskites containing benzyl ammonium (BA), 1-naphthyl methyl ammonium (NMA), and 1-pyrene methyl ammonium (PMA) thin films.
In the second project (chapter 3.2), we used time-resolved spectroscopic techniques to study the effect of adding 5% of Cs on the dynamics of a mixed-cation wide bandgap bromide-based 3D perovskite.
In another side project (chapter 4), we present the photophysics properties of newly synthesized new Schiff bases containing indole moieties using piperidine as an organic base catalyst and Au@TiO2 as a heterogeneous catalyst. Finally, the results of this work are summarized in Chapter 5 with an outlook and a discussion of open questions for further research.
Time-resolved spectroscopic analysis of fucoxanthin-chlorophyll proteins and isolated carotenoids
(2011)
The aim of this thesis was to elucidate the excitation energy transfer in the fucoxanthin-chlorophyll proteins (FCPs) isolated from the diatom Cyclotella meneghiniana in detail and to clarify the role of the different pigments contained. In a first step the excited state dynamics of the free pigments were studied by means of time-resolved absorption spectroscopy. The FCPs contain three different carotenoid species. Besides the main light-harvesting carotenoid fucoxanthin (fx) the xanthophyll cycle pigments diadinoxanthin (ddx) and diatoxanthin (dtx) are found in substoichiometric amounts. Fx is contained in an unusual carotenoid-to-chlorophyll ratio of about one. In case of ddx and dtx, changing the solvent polarity showed no significant effects on the absorption spectrum and the excited state dynamics were hardly influenced. In contrast, a solvent dependence is observed in the absorption spectrum and excited state dynamics of fx. The S1 lifetime depends strongly on the solvent polarity and an additional broad excited state absorption band red shifted compared to the S1 excited state absorption appears. The occurrence of the described features can be explained with an intramolecular charge transfer state, which is stabilized in a polar environment and appears only in carotenoids with a conjugated carbonyl group. Despite its rather short excited state lifetimes of less than 200 fs (S2) and 30-60 ps (S1), fx acts as a very efficient energy donor in the FCPs. The ultrafast energy transfer dynamics of the isolated proteins FCPa and FCPb were investigated in a comprehensive study using transient absorption in the visible and NIR spectral region complemented with polarized transient absorption spectroscopy. The excitation energy transfer was not influenced significantly by changing the light conditions during the growth, which yields an altered amount of ddx and dtx. It can be concluded that the contribution of the xanthophyll cycle pigments to the energy transfer is not significant. The altered oligomerization state results in a more efficient energy transfer for the trimeric FCPa, which is also reflected in different Chl a fluorescence quantum yields. Thus, an increased quenching in the higher oligomers of FCPb can be assumed. The observed dynamics change drastically for two different excitation wavelengths λ = 500 nm and λ = 550 nm, which both lead to the population of the S2 excited state of individual carotenoids, namely blue and red absorbing fx molecules. The differing absorption maxima result from distinct microenvironments within the protein. For FCPa an additional slow time constant of 25 ps was found after excitation at 500 nm. By means of polarized transient absorption spectroscopy applied to FCPa different transition dipole moments for the S1 and the ICT state of fx could be identified. Based on the presented studies a detailed model explaining the excitation energy transfer pathways could be developed. In agreement with the faster overall transfer rate which is also evident in the anisotropy data in case of 550 nm excitation, upon excitation at 500 nm one slow transfer channel is active. It can be attributed to a blue absorbing fx not strongly associated with a Chl a molecule. Most likely excitation energy transfer takes place between the S1/ICT states of two different fx molecules before the energy is transferred to Chl a. Additional transient absorption experiments with an improved time resolution were performed to investigate the oscillations observed. These coherent effects superimposed the kinetics of isolated carotenoids as well as FCPs within the first 500 fs. The oscillations showed a very unusual damping behavior and vanished already after two oscillation periods. In case of fx, the solvent environment as well as the excitation wavelengths had an influence on the oscillations. The frequencies of the oscillations were 70-100 cm^-1 for fx in solvents with varying polarity and 50-80 cm^-1 for the FCPs. These results could further confirm the assumption that the red absorbing fx molecules are located in a more polar environment within the protein compared to the blue absorbing fx. To clarify the origin of the oscillations in more detail, further experiments with a controlled chirp of the applied pulses and comparison between different carotenoids in various solvents are required. This approach promises to give further insight in the excited state dynamics and to answer the question whether dark states are involved. Right now, the coherent excitation of the strongly coupled excited states 1Bu+ (S2) and 1Bu- resulting in electronic quantum beats and the existence of an additional short lived excited state absorption (S2-SN2) in the visible spectral region are the most reasonable explanations for the occurrence of the coherent effects in the transient absorption spectra of carotenoids.
Many processes in living cells involve interaction and cooperation of multiple proteins to fulfill a specific function. To understand biological processes in their full complexity, it is not sufficient to only identify the molecules being involved but also to understand the kinetic aspects of a reaction. Mass spectrometry (MS) is a very powerful tool which allows to precisely identify the molecules of a reaction. Usually this is done with tandem-MS experiments for purpose of de-novo peptide sequencing. However, since this involves protein digestion, a statement of the in-vivo constitution of non-covalently bound protein complexes is not possible. In order to detect an intact protein complex it is necessary to analyze the biological system softly and in a near-native environment with native MS. Native MS allows the non-destructive analysis of these non-covalent protein complexes as well as to detect their components. However, up to now native MS does not offer a possibility to resolve the timing of the constitution of protein complexes on a fast time-scale. Therefore, the progress of reactions on fast time-scales is invisible. However, a method which delivers both types of information - identification of the components of a protein complex, as well as time-resolving their interaction - would be of high interest.
A suitable ionization technique for native MS is laser-induced liquid-bead ion desorption (LILBID). LILBID employs well-defined droplets which are irradiated by IR laser pulses to generate gas phase ions. The not-continuous, repetitive nature of ion generation offers itself to the development of a time-resolved (TR) native MS system which is able to investigate protein complexes on a fast time scale. The LILBID-droplets can serve as reaction vessels if they are levitated in an electrodynamic Paul-trap. This new setup would allow sample manipulation and MS analysis on precise and fast reaction time-scales. The first part of this dissertation presents the construction and characterization of a setup for TR-LILBID-MS.
An example for a complex biological system is the self-assembly of beta-amyloid (Aβ). This small peptide is the major component in plaques related to Alzheimer’s disease. Clinically relevant is especially the 42 amino acid peptide Aβ42 which aggregates from monomers to oligomers through to fibrils. The oligomers are the neurotoxic species in this process and thus of high interest. Nevertheless, standard analytical techniques are unable to detect those oligomers which makes MS an optimal tool to study the oligomerization process of Aβ with the focus on disease relevant oligomers. TR-LILBID-MS allows to follow the oligomerization of Aβ enabling to study molecules which influence this kinetic. Combining MS with ion-mobility spectrometry adds an additional dimension - the collision cross section - to the mass-to-charge ratio obtained from MS. Therewith structural alterations induced by ligands can be correlated to differences in the aggregation kinetic. This allows to draw a picture of the aggregation process of Aβ for the development of disease-relevant small oligomers on a molecular level.