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Bacteria are true artists of survival, which rapidly adapt to environmental changes like pH shifts, temperature changes and different salinities. Upon osmotic shock, bacteria are able to counteract the loss of water by the uptake of potassium ions. In many bacteria, this is accomplished by the major K+ uptake system KtrAB. The system consists of the K+-translocating channel subunit KtrB, which forms a dimer in the membrane, and the cytoplasmic regulatory RCK subunit KtrA, which binds non-covalently to KtrB as an octameric ring. This unique architecture differs strongly from other RCK-gated K+ channels like MthK or GsuK, in which covalently tethered cytoplasmic RCK domains regulate a single tetrameric pore. As a consequence, an adapted gating mechanism is required: The activation of KtrAB depends on the binding of ATP and Mg2+ to KtrA, while ADP binding at the same site results in inactivation, mediated by conformational rearrangements. However, it is still poorly understood how the nucleotides are exchanged and how the resulting conformational changes in KtrA control gating in KtrB is still poorly understood.
Here,I present a 2.5-Å cryo-EM structure of ADP-bound, inactive KtrAB, which for the first time resolves the N termini of both KtrBs. They are located at the interface of KtrA and KtrB, forming a strong interaction network with both subunits. In combination with functional and EPR data we show that the N termini, surrounded by a lipidic environment, play a crucial role in the activation of the KtrAB system. We are proposing an allosteric network, in which an interaction of the N termini with the membrane facilitates MgATP-triggered conformational changes, leading to the active, conductive state.
The adaptive immune system protects against daily infections and malignant transformation. In this, the translocation of antigenic peptides by the transporter associated with antigen processing (TAP) into the ER lumen is an essential step in the antigen presentation by MHC I molecules. The heterodimeric ATP-binding cassette transporter (ABC) TAP consist of the two halftransporters TAP1 and TAP2. Each monomer contains an N-terminal transmembrane domain (TMD) and a conserved C-terminal nucleotide-binding domain (NBD). Together, the TMDs build the translocation core and the NBDs bind and hydrolyze ATP, energizing the peptide transport. TAP features an asymmetry in the two ATP-binding sites that are built of several conserved motifs. One motif is the D-loop with the consensus sequence SALD. The highly conserved aspartate of the D-loop of TAP1 reaches into the canonic ATP-binding site and contacts the Walker A motif and the H-loop of the opposite NBD, while the Asp of D-loop of TAP2 is part of the non-canonic ATP-binding site.
To examine this ABC transport complex in mechanistic detail, a purification and reconstitution procedure was established with the function of TAP being preserved. The heterodimeric TAP complex was purified via a His10-tag at TAP1 in a 1:1 ratio of the subunits. Nucleotide binding to the purified transporter was elucidated by tryptophan quenching assays and the affinity constants for MgADP and MgATP were determined to be 1.0 μM and 0.7 μM, respectevely. In addition, the TAP complex shows strict coupling between peptide binding and ATP hydrolysis, revealing no basal ATPase activity in the absence of peptides. Furthermore, TAP was reconstituted into proteoliposomes and the activity was tested by peptide transport and ATP hydrolysis. Interestingly, the kinetic parameters of the transporter in the reconstituted state are comparable to the data gained for TAP in microsomes.
To characterize the functional importance of the D-loop, D-loop mutants of either TAP1 or TAP2 were analyzed. Strikingly, TAP containing a mutated D-loop in TAP1 (D674A) shows an ATP-hydrolysis independent peptide translocation. Accordingly, the MHC I surface expression is similar to the wildtype situation. However, the same mutation in TAP2 (D638A) results in an ATPase dependent peptide transport similar to wildtype, whereas TAP containing mutations in both subunits leads to an inactive transporter. Although all D-loop mutants showed no altered peptide binding activity, the TAP1 mutant is inactive in peptide-stimulated ATPase activity. Strikingly, ATP or ADP binding is strictly required for the peptide translocation. Experiments carried out in proteoliposomes demonstrate that wildtype TAP can export peptides against their gradient when low peptide concentrations are offered. In contrast, the D674A mutant can facilitate peptide translocation along their concentration gradient in the two directions. At high peptide concentrations, TAP is trapped in a transport incompetent state induced by trans-inhibition. In conclusion, a TAP mutant that uncouples solute translocation from ATP hydrolysis was created. Since this passive substrate movement is strictly dependent on binding of ATP or ADP, an active transporter was turned into a “nucleotide-gated facilitator”.
In a cysteine cross-linking approach the conformational changes of TAP during peptide transport and the flexibility of the nucleotide binding domains were examined. Single cysteines were introduced in the D-loops of TAP1 and TAP2. Cross-linking by copper-phenantroline (CuPhe) was possible for all combinations. However, by adding ATP, ADP or peptide to the TAP complex no differences in the cross-linking efficiency were detected. By CuPhe cross-linking TAP was trapped in a conformation, in which the peptide binding site was not accessible. To complete a transport cycle, a flexibility of at least 17.8 Å of the NBDs is needed, since TAP cross-linked by CuPhe (2.0 Å) or bismaleimidoethane (BMOE, 8.0 Å) was transport inactive but when TAP was cross-linked by 1,11-bismaleimido-triethyleneglycol (BM[PEG]3, 17.8 Å) transport activity was preserved.
Die membranintegrierten, rotierenden F-Typ ATP-Synthasen zählen zu den essentiellen Komponenten der bakteriellen Energieversorgung. Ihre Rolle im zellulären Energiehaushalt bestehtin der Synthese von ATP unter Nutzung des transmembranen, elektrischen Ionengradienten (Mitchell 1961, Duncan et al. 1995, Noji et al. 1997, Kinosita et al. 1998). Die rotierenden ATP-Synthasen werden entsprechend der Kationenselektivität, die sie unter physiologischen Bedingungen zeigen, in zwei verschiedene Klassen eingeteilt, die H+-selektiven, sowiedie Na+-selektiven ATP-Synthasen. Hierbei bildet die Selektivität beider Klassen für einwertige Kationen (H+ oder Na+) eine essenzielle Grundlage für ihre Rolle im Energiehaushalt der bakteriellen Zellen. Jedoch gibt es nur eine begrenzte Anzahl von anaeroben Eubakterien und Archaeen, die noch einen auf Na+- Ionen basierenden Energiehaushalt besitzen. Gut charakterisierte Beispiele für Na+-selektive ATP-Synthasen bilden die F-Typ-Synthasen von I. tartaricus, P. modestum, sowie die V/A-Typ-Enzyme von E. hirae und A. woodii. Trotz der Unterschiede in der Kationenselektivitätder unterschiedlichen F-Typ ATP-Synthasen sind sie jedoch sowohl inihre Organisation, als auch hinsichtlich ihre Wirkungsweisen ähnlich. Das Ziel, der im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Forschung, bestand in der Identifizierung der Faktoren, die sowohl die hohen Selektivität, als auch die Affinität des in der Membran-eingebetteten Rotor-C-Rings der ATP-Synthasezu Protonen (H+) und Na+- Ionen beeinflussen. Die Untersuchungen wurden hierbei andem c11-Ring der F-Typ-ATP-Synthase aus dem anaeroben Bakterium Ilyobacter tartaricus durchgeführt, das hierbei als Modellsystem diente. Der untersuchte Ring zeigt unter physiologischen Bedingungen eine hohe Bindungsselektivität für Na+ Ionen, kann jedoch unter nicht-physiologischen Bedingungen auch Li+ und H+ Ionen binden und zur ATP-Synthese verwenden (Neumann et al. 1998).
Das Ziel, der im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Forschung, bestand in der Identifizierung der Faktoren, die sowohl die hohen Selektivität, als auch die Affinität des in der Membran-eingebetteten Rotor-C-Rings der ATP-Synthasezu Protonen (H+) und Na+- Ionen beeinflussen. Die Untersuchungen wurden hierbei andem c11-Ring der F-Typ-ATP-Synthase aus dem anaeroben Bakterium Ilyobacter tartaricus durchgeführt, das hierbei als Modellsystem diente. Der untersuchte Ring zeigt unter physiologischen Bedingungen eine hohe Bindungsselektivität für Na+ Ionen, kann jedoch unter nicht-physiologischen Bedingungen auch Li+ und H+ Ionen binden und zur ATP-Synthese verwenden (Neumann et al. 1998). Die Kd- und KM-Werte wurden verwendet, um die Na+ -Bindungsaffinität der C-Ringe bzw. ATP-Synthasen zu quantifizieren. Über die Selektivität wurdebeschrieben, welche Kationen an die C-Ringe und ATP-Synthasen binden können (z. B. H+/Na+/Li+, H+/Na+ - oder nur H+ Ionen).Das Verhältnis der absoluten Bindungsaffinitäten zwischen zwei Kationen (z. B. Kd (Na+)/Kd (H+)) wurde verwendet, um die Präferenz des Enzyms für eines der Ionen zu quantifizieren. Die Faktoren, dieder Kationenselektivität und der Affinität des I. tartaricus c-Rings zugrunde liegen, wurden mit Hilfe von Mutageneseexperimenten der Aminosäuren in der Ionenbindungsstelle untersucht. Im I. tartaricus-c-Ring erfolgt die Na+ Bindung an der Grenzfläche von zwei benachbarten c-Untereinheiten des c-Rings. An der Bindung der Na+-Ionen sind sowohl Aminosäuren aus Helix 1 (Gln32), sowie von Helix 2 (Val63, Ser66, Thr67 und Tyr70) beteiligt, die in der Nähe, des für den Mechanismusessentiellen Glu65 liegen. Insgesamt wurden 19 verschiedene, spezifische Einzel- und Doppelmutationen in die Sequenz des atpE-Gens eingeführt, die für die I. tarticus-ATP-Synthase-c-Untereinheit kodiert. Bei den Experimenten mit dem I. tartaricus c-Ring (Ser66, Thr67 und Tyr70) wurden drei polare Reste der Ionenbindungsstelle durch die polaren Reste (Ser67, Ile67 oder Leu67) oder hydrophobe Reste (Ala66, Gln67 und Phe70) ersetzt, während das geladene Glu65 durch die kürzere, aber immer noch geladene Seitenkette Asp65 ausgetauscht wurde. Zur Charakterisierung der monovalenten Kationenbindung durch die Wildtyp, sowie die mutierten C-Ringe von I.-tartaricus, wurde ein Ansatz verwendet, der biochemische (DCCD-Ionen-Kompetitionsassay) und biophysikalische (ITC) Methoden kombiniert.
Die Daten der in dieser Arbeit durchgeführten Experimente, zeigen, dass c-Ringe selektiv für H+ sind, solange in der Ionenbindungsstelle des c-Rings ein ionisierbarer Glu/Asp-Rest vorhanden ist. Die H+-Bindungsaffinität des c-Rings hängt von der Hydrophobizität der Reste ab, aus der die Ionenbindungsstelle aufgebaut ist.Jedoch ist die Zahl der Faktoren, die die Na+-Selektivität des C-Rings bestimmen, weitaus größer. Von den in dieser Arbeit untersuchten Faktoren war die Zahl der polaren Reste, die Wasserstoffbrücken zu Na+ bilden, die Co-Koordination von Na+ durch strukturell vorhandene Wassermoleküle und die Anwesenheit von negativ geladenen Resten besonders wichtig für die Bindung der Na+-Ionen an den Ring. Die hohe Bindungsaffinität des c-Rings für Na+-Ionen, wird sowohl durch Wechselwirkungen begünstigt die das gebundene Na+-Ion stabilisieren, als auch den gesamten atomaren Aufbau der Ionenbindestelle, der die enthalpiegetriebene Na+-Bindungan den c-Ring begünstigen. Im Rahmen dieser eingehenden Studien konnten zum ersten Mal die thermodynamischen Eigenschaften aufgeklärt werden, die der hohen Na+-Bindungsaffinität des c-Rings zugrunde liegen, sowie der Einfluss von Mutationen auf diese Parameter ermittelt werden. Durch zahlreiche Experimente mit ATP-Synthasen, die mit mutierten c-Ringen zusammengesetzt wurden, sollte eine Verbindung zwischen Veränderungen der H+- und der Na+-Bindungsaffinitäten und Unterschiede im Betrieb der ATP-Synthase aufgeklärt werden. Die wichtigste Schlussfolgerung, die sich aus dieser Arbeit ableiten lässt, ist, besteht darin, dass sich Na+/H+-selektiven ATP-Synthasen durch den Austausch von 1-2 Aminosäureresten innerhalb der rotierenden c-Ring-Ionenbindungsstelle in ausschließlich H+-selektive, vollfunktionelle ATP-Synthasen umwandeln lassen.
Cell-free-synthesized voltage-gated proton channels: Approaches to the study of protein dynamics
(2018)
We often only realize how important health is when diseases manifest themselves through their symptoms and, ultimately, in a diagnosis. Over time, we suffer from many diseases starting with the first childhood disease to colds to gastrointestinal infections. Most diseases pass harmlessly and symptoms fade away. However, not all diseases are so harmless. Alzheimer’s disease, breast cancer, Parkinson’s disease, and colorectal cancer usually cause severe illness with high mortality rates. In pharmaceutical research, efforts are therefore being made to determine the molecular basis of them in order to provide patients with potential relief and, at best, healing. A special group of regulators, involved in the previously mentioned diseases, are voltage-gated proton channels. Thus, the understanding of their structure, function, and potential drug interaction is of great importance for humanity.
Voltage-gated proton channels are localized in the cell membrane. As their name indicates, they are controlled by voltage changes. Depolarization of the cell membrane induces conformational changes that open these channels allowing protons to pass through. Here, the transfer is based on a passive process driven by a concentration gradient between two individual compartments separated by the cell membrane. Voltage-gated proton channels are highly selective for protons and show a temperature- and pH-dependent gating behavior. However, little is known about their channeling mechanism. Previous experimental results are insufficient for understanding the key features of proton channeling.
In this thesis, for the first time, the cell-free production of voltage-sensing domains (VSD) of human voltage-gated proton channels (hHV1) and zebrafish voltage-sensing phosphatases (DrVSP) is described. Utilizing the cell free approach, parameters concerning protein stability, folding and labeling can be easily addressed. Furthermore, the provision of a membrane mimetic in form of detergent micelles, nanodiscs, or liposomes for co-translational incorporations of these membrane proteins is simple and efficient. Both VSDs were successfully produced up to 3 mg/ml. Furthermore, the cell-free synthesis enabled for the first time studies of lipid-dependent co-translational VSD insertions into nanodiscs and liposomes. Cell-free produced VSDs were shown to be active, and to exist mainly as dimers. In addition, also their activation was stated to be lipid-dependent, which has not been described so far. Solution-state NMR experiments were performed with fully and selectively labeled cell-free produced VSDs. With respect to the development of potential drug candidates, I could demonstrate the inhibition of the VSDs by 2-guanidinobenzimidazole (2GBI). Determined KD values were comparable to literature data for the human construct. For the first time, a low affinity for 2GBI of the zebrafish VSD could be described.
In future, the combination of a fast, easy and cheap cell-free production of fully or selectively labeled VSDs and their analysis by solution state NMR will enable structure determinations as well as inhibitor binding studies and protein dynamic investigations of those proteins. The results of these investigations will serve as a basis for example for the development of new drugs. In addition, a detailed description of the lipid-dependent activity might be helpful in controlling the function of voltage-gated proton channels in cancer cells and thereby reducing their growth or disturbing their cell homeostasis in general.
Zika-virus (ZIKV), a flavivirus mainly transmitted by Aedes mosquitoes, is a single-stranded, positive-sense RNA virus. The viral genome is surrounded by a nucleocapsid and a lipid bilayer, in which membrane and envelope proteins are embedded. ZIKV disease is mainly characterized by mild symptoms, such as fever, rash as well as pain in head and joints. However, after epidemics it caused in the Americas in 2015/16, ZIKV infections were also associated with severe neurological complications like the Guillain-Barré syndrome (GBS) and microcephaly in fetuses and newborns. So far there are no specific antiviral treatments or vaccines available against ZIKV. This strengthens the need for a detailed understanding of the viral life cycle and virus-host interactions.
The antiviral host factor tetherin (THN) is an interferon-stimulated protein and therefore part of the cellular innate immune response. It comprises an N-terminal cytoplasmic domain, followed by a transmembrane helix, an extracellular coiled-coil domain and a C-terminal glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor. Containing two sites for membrane insertion linked by a flexible structure, THN is able to integrate into the membrane of budding viruses, thereby attaching them to each other and to the cell membrane and preventing their further release and spread.
In this study, the crosstalk of ZIKV and THN was analyzed. Previous gene expression analyses by microarray and quantitative polymerase chain reaction (qPCR) had revealed a strong upregulation of the BST2 gene encoding for THN in ZIKV-infected cells. However, this enhanced expression did not correlate with an enhanced THN protein level. On the contrary, the amount of THN in THN-overexpressing cells was after infection even heavily reduced. Furthermore, immunofluorescence analyses revealed a loss of THN membrane localization in these cells. By performing a cycloheximide assay, this loss could be traced back to a reduced protein half-life of THN in infected versus uninfected cells. Treatment with inhibitors of different protein degradation pathways as well as colocalization analyses with markers of several subcellular compartments indicated an involvement of the endo-lysosomal route. A knock-down of the ESCRT-0 protein HRS however prevented the sorting of THN for lysosomal degradation and led to a stabilization of THN protein levels. After HRS depletion, the release and spread of viral particles was reduced in THN-overexpressing compared to wildtype cells.
Taken together, the data obtained in this study revealed the potential of THN to restrict ZIKV release and spread. The enhanced degradation of THN in ZIKV-infected cells via the endo-lysosomal pathway could therefore be explained as an effective viral escape strategy. This could be circumvented by knockdown of the ESCRT-0 protein HRS, which highlighted HRS as a potential target for the development of antiviral treatments.
Life-saving pig-to-human xenotransplantation is a promising technology with the potential to balance the shortage of human organs in allotransplantation. Before this approach is applied on solid vascularized organs, several barriers must be overcome. Patient safety is menaced by infectious porcine endogenous retroviruses (PERV) which are able to infect human cell lines in vitro. Successful infection with PERV is associated with diverse life-threatening consequences including gene disruption, tumorigenicity, immune suppression as well as PERV proliferation throughout the whole human body. This could cause a catastrophic xenozonoosis leading to the emergence of new forms of pathogens and pandemic diseases similar to AIDS. However, in vivo, there is hitherto no incidence of any infection with PERV in preclinical xenotransplantations performed in the past.
PERV infection of human peripheral blood mononuclear cells (huPBMC) is a critical issue discussed controversially in several studies. It is essential to address the sensitivity of huPBMC to infection by PERV since it is generally one of the first retroviral targets upon viral invasion and infection of the human body. To assess definitely if huPBMC are infected productively by PERV, target cells were challenged with the highest infectious PERV class, recombinant PERV-A/C, in different assays. Modern and standard methods to detect PERV at different stages of viral cycles were used to monitor PERV development upon contact with host cells. Indeed, PERV-A/C in supernatants of producer cell lines failed to infect mitogen-activated huPBMC. Neither retroviral reverse transcriptase (RT) nor viral RNA packaged in virus particles were observed in supernatants of cells exposed to viral supernatants. In addition, provirus was not detected in huPBMC until 56 days p. i. with PERV-A/C. Independently of the virus load applied, culture conditions of huPBMC or administration of polybrene as enhancer, PERV was unable to infect huPBMC. Results suggest that PERV in supernatants lack sufficient infectious potential to be productively generated in huPBMC.
In order to approximate xenotransplantation scenarios, different PERV producing cells including PHA-activated porcine PBMC (poPBMC) were adopted as virus source in co-cultivation studies with huPBMC. In this case, expression of viral RNA was successfully measured. However, RT activity did not increase until 28 days p. e. with PERV producer cells which indicates that viral particles devoid of infectious capacity were released from non-productively infected cells.
On the other hand, co-cultivation of both virus producer and virus recipients increases the contact pressure between PERV and target cells. Consequently, PERV was able to be detected at least as provirus in huPBMC. Although virions produced were not functional, presence of provirus in infected cells will sooner or later provoke expression of provirus. This could lead to chromosomal rearrangements as well as virus reinfection and insertional mutagenesis.
Ecotropic PERV-C displays a restricted host range to porcine cells. Given its ability to serve as template to form recombinant xenotropic PERV-A/C, PERV-C represents a potent hazard in the course of xenotransplantation. Thus, isolation and functional characterization of PERV-C in the genome of pigs in use and intended for xenotransplantation is necessary to analyze the genetics of these virions as well as to select animals lacking proviral PERV-C or to generate transgenic PERV-C negative donors.
PERV-C was isolated from the genome of a female SLAd/d haplotype pig via screening of a bacteriophage library which was constructed from the genomic DNA of poPBMC extracted from this PERV non-transmitting sow. Upon genetic complementation of provirus using a PCR fragment infectious ability of full-length PERV-C clones was investigated in cell culture. PERV-C clones were successfully reproduced in susceptible porcine cells as RT activity as well as viral RNA were detected in supernatants of infected cells 56 days p. i. Furthermore, presence of proviruses in challenged cells was confirmed by nested PCR.
PERV-C clones were also isolated from a bacteriophage library generated on genomic DNA of an Auckland island pig of the DPF colony, whose individuals display a PERV-null phenotype and are already in use for xenotransplantation, and of a Göttingen minipig, whose relatives serve as animal models to study human diseases. In contrast to PERV clones isolated from the female SLAd/d haplotype sow PERV-C clones of the Auckland island pig as well as of the Göttingen minipig were not functional and therefore unable to infect target cells. This confirms the PERV-null phenotype which renders these animals putative candidates as donors in xenotransplantation. On the other hand, presence of functional PERV-C in SLAd/d haplotype pigs exerts a negative impact on patient safety in xenotransplantation. The suitability of these animals as potent organ donors should be intensively investigated.
In conclusion, PERV of all classes pose a virological risk in xenotransplantation which should not be ignored. Since exclusion of all PERV from donor herds is impossible, generation of transgenic humanized animals lacking genomic infectious PERV represents the best strategy to guarantee patient safety in future life-saving pig-to-human xenotransplantation.
Prokaryotische Organismen werden in ihrer natürlichen Umgebung mit schwankenden Umwelteinflüssen konfrontiert oder müssen gegebenenfalls extremen Bedingungen standhalten. Um sich an derartige Veränderungen anpassen zu können und damit ein weiteres Überleben zu sichern, ist es wichtig neue genetische Informationen zu akquirieren. Die molekulare Basis dieser Anpassung sind Genmutationen, Genverlust, intramolekulare Rekombination und/oder horizontaler Gentransfer. Der vorliegende Selektionsdruck der Umwelt begünstigt schlussendlich die Spezialisierung und damit die Erschließung neuer Standorte aufgrund des Erwerbs neuer metabolischer Eigenschaften, Resistenzgene oder Pathogenitätsfaktoren. Vergleichende Analysen bakterieller Genome, welche auf Analysen der GC-Gehalte, der Codon- und Aminosäurenutzung und der Genlokalisation beruhen, zeigten, dass bei diesem evolutiven Prozess bzw. der Weiterentwicklung der bakteriellen Genome der horizontale Gentransfer als treibende Kraft eine entscheidende Rolle spielt. So indizieren Genomstudien, dass 0-22% der gesamten bakteriellen und 5-15% der archaeellen Gene horizontal erworben wurden, wobei der DNA-Transfer nicht ausschließlich zwischen Vertretern einer Domäne, sondern ebenfalls zwischen Organismen unterschiedlicher Domänen stattgefunden hat. So sind z.B. 24 bzw. 16% der Gene von Genomen hyperthermophiler Organismen wie Thermotoga maritima oder Aquifex aeolicus archaeellen Ursprungs. Ebenso finden sich Gene für Chaperone und DNA-Reparaturenzyme im Genom des thermophilen Bakteriums Thermus thermophilus wieder, welche wahrscheinlich ebenfalls durch horizontalen Gentransfer aus hyperthermophilen und archaeellen Genomen erworben wurden um eine Anpassung an extreme Standorte zu ermöglichen. Durch vergleichende Genomstudien wurde ebenfalls festgestellt, dass die durch horizontalen Gentransfer erworbenen Gene oftmals zu einer Neuorganisation von Transkriptionseinheiten und zu einer veränderten Genomorganisation führten. Dennoch finden sich immer wieder Beispiele von horizontal erworbenen Operonen in den verschiedenen Organismen. Gut charakterisierte Vertreter horizontal übertragener Operone sind dabei z.B. das archaeelle H+-ATPase-Operon, das Operon der Na+-translozierenden NADH:Ubichitonoxidoreduktase oder das Nitratreduktase-Operon.
Man unterscheidet bei dem horizontalen Gentransfer zwischen drei Mechanismen der DNAAufnahme: Konjugation, Transduktion und Transformation. Die DNA-Übertragung durch Konjugation ist durch einen spezifischen Zell-Zell-Kontakt definiert, der durch einen von der Donorzelle ausgehenden, sogenannten F-Pilus hergestellt wird. Die Donorzelle überträgt schließlich Plasmid-kodierte genetische Informationen und oftmals Eigenschaften für die eigenständige Konjugation auf eine Rezipientenzelle. Die Transduktion hingegen beschreibt die DNA-Übertragung von Bakteriophagen auf eine Wirtszelle, wobei hier eine hohe Wirtsspezifität Voraussetzung ist. Die Übertragung der DNA von einer Bakterienzelle in eine andere erfolgt dabei ohne Kontakt der Zellen. Die natürliche Transformation ist definiert als Transfer von freier DNA und ermöglicht damit im Gegensatz zu den beiden ersten spezifischen Mechanismen der DNA-Übertragung ein größeres Spektrum der Verbreitung genetischer Informationen. Freie DNA, welche entweder durch Zelllyse oder Typ-IVSekretion ausgeschieden wird und aufgrund von Adsorption an mineralische Oberflächen über längere Zeiträume stabil in der Umgebung vorliegen kann, kann unter der Voraussetzung der Existenz eines speziellen Aufnahmesystems von Bakterien aufgenommen werden. Mittlerweile sind über 44 Bakterien aus unterschiedlichen taxonomischen Gruppen beschrieben, die eine natürliche Kompetenz ausbilden können. Die bekanntesten Beispiele für natürlich transformierbare Gram-negative Bakterien sind Heliobacter pylori, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas stutzeri, Haemophilus influenzae, T. thermophilus und Acinetobacter baylyi. Auch unter den Gram-positiven Bakterien finden sich einige Vertreter, die natürlich kompetent sind, wie Deinococcus radiodurans, Bacillus subtilis und Streptococcus pneumoniae. Ungeachtet der relevanten Rolle der Transformation im horizontalen Gentransfer, ist über die Struktur und Funktion der komplexen DNA-Aufnahmesysteme wenig bekannt.
Diese Arbeit ist ein detaillierter Bericht über die Forschungsaktivitäten, die ich während meiner Promotion am Max-Planck-Institut für Biophysik durchgeführt habe. Mit dem Aufkommen der direkten Elektronendetektoren erlebte die Transmissionselektronenmikroskopie von gefrorenen hydratisierten Proben (Kryo-EM) einen epochalen Wandel, die sogenannte “Auflösungsrevolution”. Ab den 2010er Jahren ermöglichte die Kommerzialisierung der ersten direkten Detektoren die Erforschung biologischer Phänomene in beispiellosem Detail und machte Kryo-EM zu einer der leistungsstärksten (und gefragtesten) Forschungsmethoden in den Biowissenschaften. Meine Forschung konzentrierte sich auf die Verwendung der Elektronen-Kryotomographie, um zwei herausfordernde Ziele zu erreichen. Das erste bestand darin, die Denaturierung von Proteinen an der Luft-Wasser-Grenzfläche zu untersuchen, und das zweite die molekulare Landschaft eines lichtempfindlichen Chloroplastenvorläufers, des Etioplasten, zu beschreiben. Um die Relevanz, Herausforderungen und Auswirkungen meiner Arbeit zu vermitteln, habe ich diese Arbeit in drei Kapitel unterteilt.
Kapitel eins enthält eine Einführung in die Transmission-Elektronenmikroskopie.
Nach einer kurzen Zusammenfassung der historischen Meilensteine in der Disziplin beschreibe ich die wesentlichen Komponenten des TEM und deren Funktionsweise. Hier lege ich besonderen Wert auf die Struktur elektromagnetischer Linsensysteme, wie sie den Weg der Elektronen beim Durchlaufen der Säule beeinflussen und wie Bilder entstehen. Der hardwarebezogene Teil der Einführung wird durch eine vereinfachte Beschreibung der Elektronendetektoren abgeschlossen, in der ich die revolutionären Aspekte der direkten Elektronendetektoren, mit der Struktur und Funktion von CCD-Detektoren (Charge Coupled Device detector) vergleiche. Als nächstes konzentriere ich mich auf die theoretischen Prinzipien der Bilderzeugung. Um die Hauptphänomene im Zusammenhang mit der Bildqualität in TEM hervorzuheben, stelle ich grundlegende Konzepte wie den Einfluss von Elektronenenergie und optischen Aberrationen vor, gefolgt von einer ausführlicheren Beschreibung des Ursprungs von Kontrast und Rauschen. Der Unterabschnitt schließt mit einigen Überlegungen darüber, wie - und vor allem wie effizient - Detektoren kontinuierliche Elektronenwellen in diskrete Bereiche (Pixel) abtasten. Der folgende Unterabschnitt ist der Erfassung und Verarbeitung tomografischer Daten gewidmet. Hier gebe ich eine vereinfachte Beschreibung, wie Kippserien mit dem Mikroskop erfasst werden und wie die Rohdaten zu einer dreidimensionalen Darstellung der Probe verarbeitet werden. Der Einfluss der Neigungsgeometrie und der Dosisverteilung auf die Rekonstruktionsqualität wird ebenfalls diskutiert. Der zweite Teil des Unterabschnitts befasst sich mit der Strukturbestimmung durch Subtomogramm-Mittelung und der Errechnung der Auflösung von Kryo-EM-Rekonstruktion. Zuletzt schließe ich das Kapitel mit einer Beschreibung der Vorbereitung biologischer Proben für die Kryo-EM-Bildgebung mit einigen abschließenden Bemerkungen zur Dynamik und den Grenzen der Vitrifizierung ab.
Kapitel zwei folgt dem Thema der Kryo-Präparation biologischer Proben mit der Untersuchung der Denaturierung von Proteinen an der Luft-Wasser-Grenzfläche.
Im Einführungsabschnitt skizziere ich die wichtigsten Aspekte dieses Phänomens. Frühe Experimente zum Verhalten von Proteinen in Lösung zeigten ihre Neigung, aus der Lösung zu ihrer Grenzfläche mit der Atmosphäre zu diffundieren. Hier bilden sie meist unlösliche Schichten denaturierter Fibrillen Es wurde vorgeschlagen, dass die Korrelation zwischen Proteindenaturierung und Kontakt mit der Grenzfläche auf einen allmählichen Entfaltungsprozess zurückzuführen ist, bei dem Tausende von Wechselwirkungen pro Sekunde zu einer immer größeren strukturellen Schädigung führen würden. Ein direkter Beweis für diesen Mechanismus wurde jedoch nie dokumentiert. Um einen tieferen Einblick in die Dynamik an der Luft-Wasser-Grenzfläche zu erhalten, sammelte ich Kryotomogramme vitrifizierter Präparate der Fettsäuresynthase (FAS, Fatty Acid Synthase) aus Hefe. Im ersten Unterabschnitt der Ergebnisse beschreibe ich, wie die biochemische und Negativkontrastierung-TEM-Analyse von FAS-Fraktionen zeigte, dass der Komplex während des gesamten Reinigungsverfahrens intakt und katalytisch aktiv blieb. Nach der Vitrifizierung ergab die Einzelpartikelanalyse jedoch, dass 90% aller Komplexe stark beschädigt waren. Die tomographische Rekonstruktion derselben Proben zeigte, dass alle FAS-Komplexe an die Luft-Wasser-Grenzfläche gebunden waren. Die Seite des Moleküls, die der Grenzfläche ausgesetzt war, schien abgeflacht zu sein, während die Seite, in der wässrigen Phase, ihre native Struktur beibehielt. Die Mittelung der Subtomogramme bestätigte, dass eine Seite von fast 90% der Partikel stark beschädigt war. Durch den Vergleich der Ausrichtung dieser beschädigten Seite mit der Position eines Rechenmodells der Luft-Wasser-Grenzfläche konnte ich nachweisen, dass sie perfekt übereinstimmen, was den ersten direkten Beweis dafür liefert, dass die Wechselwirkung mit der Luft-Wasser-Grenzfläche die lokale Denaturierung großer Proteinkomplexe herbeiführt.
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In mitochondria, biogenesis of oxidase is a crucial process involving the participation of an array of assembly factors. Studying the process of biogenesis in eukaryotes is highly complicated due to the presence and partaking of two genetic systems. Employing a bacterial model such as Paracoccus denitrificans that utilizes only one genetic system enables easy studying of the assembly process. The aa3 cytochrome c oxidase of P. denitrificans shows high structural and functional homology to its mitochondrial counterpart despite its simple subunit composition. The assembly of the core subunits I and II that house the active redox centers (heme a, and heme a3.CuB centre in subunit I; and the binuclear CuA centre in subunit II) along with the chaperons responsibly for their incorporation form the crux of this work. This work concentrates particularly on CtaG, a chaperone previously speculated to be involved in the delivery of copper to the CuB center in subunit I. As the full length structure of CtaG or its structural homologues have not been solved, attempts were made to obtain high-diffracting crystals of CtaG by heterologously expressing it in E. coli. Growth media, expression strains and induction parameters were some of the conditions screened in order to obtain optimal yield. Additives, pH and detergent were screened to yield a homogeneous preparation of CtaG. Crystallization trials were conducted by employing the sitting drop, vapour diffusion, method and later the bicelles were employed. Preliminary crystals obtained were further optimized employing seeding, detergent and additives, to improve diffraction. The diffraction improved from 30 Å to 15 Å. BN PAGE (Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis) analysis and cross-linking studies were undertaken to decipher the oligomeric condition of CtaG. Both the methods indicate that the protein is a dimer under native conditions. To study the importance of CtaG in the process of oxidase assembly, two deletion mutants were obtained from the lab; one with only ctaG deleted and the other with ctaG and most of the upstream ORF. The effect of the deletion was assayed on the assembly and activity of oxidase. The deletion mutants showed residual activity of approx. 20 %, while displaying a very low heme signal (both in membranes and in purified COX). In order to exclude polar effects arising due to gene manipulation, complementation strains were prepared, reintroducing ctaG alone into both the deletion strains. Complementation strains, where only ctaG was deleted and re-introduced assayed for COX activity showed a restoration in activity to approx. 70 %. Further, calculating the heme:protein ratio, the deletion strains displayed a value of 7 nmol/mg of oxidase which was increased to wild type levels of 16 nmol/mg in the complementation strains. To further confirm the absence of the copper in subunit I, total reflection X-ray fluorescence spectroscopy analysis was carried out, which showed a decrease in the copper content in the deletion strain, restored on complementation. The strain lacking in the ORF and ctaG when complemented with ctaG alone illustrated no increase in activity or heme signal in comparison to that of the deletion strain. These point at a possible role for ORF in the assembly of COX, which is still absent in the complementation strains. To further characterize the ORF, a series of bioinformatical analysis was carried out, the results from which were insufficient to characterize the ORF conclusively. In order to enlist the proteins involved in the biosynthesis of COX, two independent approaches were employed. Two-dimensional gel examinations of solubilised membranes from untreated and cross-linked cells were analyzed by Western blotting. The CtaG-COX interaction was observed in untreated membranes, which was additionally strengthened by cross-linking. To further confirm this association, pull-down assays were done employing protein A coated magnetic beads coated with different antibodies and incubated with solubilised membranes derived from untreated or cross-linked cells. The elutions were assayed by Western blotting and confirmed for the CtaG-COX interaction. These fractions were further analysed by mass spectrometry to identify other chaperons involved in biogenesis of oxidase. Along with CtaG, I also noticed Sco, Surf1c and other factors involved in the recruitment and transport of heme (CtaB, CtaA, and Ccm proteins). Interestingly, protein components of both ribosomal subunits and protein translocation factors were observed, which indicated a co-translational approach for co-factor insertion into COX.
Disturbances in lipid metabolism are responsible for many chronic disorders, such as type 2 diabetes and atherosclerosis. Regulation of lipid metabolism occurs by activated transcription factors peroxisome proliferator-activated receptor δ (PPARδ) and liver X receptor α (LXRα) mediating transcription of different target genes involved in regulation of fatty acid uptake and oxidation or cellular cholesterol homeostasis. This is especially relevant for the macrophages, since pathways regulated by PPARδ and LXRα affect foam cell formation, a process driving the progression of atherosclerotic lesion. AMP-activated protein kinase (AMPK) plays a central role in energy homeostasis in every type of eukaryotic cell, but its role in human macrophages, particularly with regard to lipid metabolism, is not precisely defined yet. Thus, I investigated the impact of AMPK activity on PPARδ and LXRα and the expression of their target genes involved in fatty acid oxidation (FAO) and cholesterol metabolism.
As PPARδ has been described as a potential target for prevention and treatment of several disorders and AMPK as interesting drug target for diabetes and metabolic syndrome, the aim of the first part of my studies was to investigate their interaction in primary human macrophages. Completing the first challenge successfully, I was able to establish a lentiviral transduction system for constitutively active AMPK (consisting of a truncated catalytic AMPKα1 subunit bearing an activating T198D mutation) in primary human macrophages.
Using genome-wide microarray analysis of gene expression, I demonstrate FAO as the strongest affected pathway during combined AMPKα1 overexpression and PPARδ activation.
The most influenced genes were validated by quantitative PCR as well as by Western analysis. I found that AMPK increases the expression of FAO-associated genes targeted by PPARδ. Corroborating the results obtained using AMPKα1 overexpression, PPARδ target gene expression was increased not only by PPARδ agonist GW501516, but also by pharmacological allosteric AMPK activator A-769662. Additional enhancement of target gene mRNA expression was achieved upon co-activation of PPARδ and AMPK. Silencing PPARδ expression increased basal expression of target genes, confirming the repressive nature of ligand-free PPARδ, abolishing the increased target gene expression upon AMPK or PPARδ activation. Measurements of triglyceride contents of human macrophages incubated with VLDL following PPARδ activation demonstrated a reduction of intracellular triglyceride accumulation in cells, which may reflect the enhancement of fat catabolism.
In the second part of my studies, I concentrated on the regulation of cholesterol transporter ATP-binding cassette transporter A1 (ABCA1) expression by AMPK. ABCA1 facilitates
cholesterol efflux from macrophages thus, preventing atherosclerosis progression. For the first time, AMPK implication in the regulation of the ABCA1 pathway could be presented. Both AMPK overexpression and activation lead to significantly increased ABCA1 expression, whereas AMPKα1 knock-down strongly reduced this effect. Besides, I was able to prove an enhanced activity of ABCA1 during AMPK activation in human THP-1 macrophages by measuring cholesterol efflux into apolipoprotein AI-containing medium.
Previous findings showed regulation of ABCA1 by LXRα. I confirmed these results by silencing experiments indicating an essential role of LXRα in ABCA1 regulation pathway.
Here, ABCA1 mRNA as well as protein expression were positively mediated by LXRα. LXRα activation elevated ABCA1 levels, whereas its silencing down-regulated this effect.
Interestingly, ABCA1 was found to be regulated only by LXRα and not through LXRα. At the same time, knock-down of PPARδ, -γ or -δ, which may be also involved in the regulation of LXR/ABCA1 axis, did not influence the activation of ABCA1 expression by an AMPK activator. To confirm that LXRE on Abca1 promoter is essential for ABCA1 regulation, I performed luciferase reporter assay using constructs based on Abca1 promoter with or without LXRE mutation. Mutation of LXRE abolished reporter activity, whereas AMPK activation increased luciferase activity of wild-type LXRE construct. Furthermore, I demonstrate AMPK-dependent LXRα binding to the LXRE site of Abca1 promoter using the method of chromatin immunoprecipitation. AMPK activation significantly increased, whereas silencing of AMPK significantly attenuated LXRα binding, indicating AMPK as one of the most important regulators of ABCA1 expression.
In summary, I provided an evidence for AMPK involvement into lipid and cholesterol metabolism in human macrophages showing the regulation of PPARδ and LXRα target genes. The understanding of AMPK and PPARδ interaction allows the development of new approaches for treatment of metabolic syndrome and related diseases. Increased FAO during the activation of both proteins may exhibit better therapeutic benefit. On the other hand, I have shown the impact of AMPK activation on ABCA1 via LXRα up-regulation leading to increased cholesterol efflux in human macrophages for the first time. These findings thus may impact future improving of anti-atherosclerosis therapies.
Die Translokation von gelösten Stoffen über zelluläre Membranen ist ein essentieller biologischer Prozess, der durch eine Vielfalt an integralen Membranproteinen vermittelt wird. Diese sind in den selektiven Austausch verschiedenster Stoffe bzw. Teilchen involviert und ermöglichen somit die Kommunikation zwischen den einzelnen Zellkompartimenten untereinander bzw. mit der extrazellulären Umgebung. Eine der größten Familien paraloger Proteine, die den vektoriellen Transport von Substanzen über Zellmembranen katalysieren, stellen die ATP‐binding cassette (ABC)‐Transporter dar. Mitglieder dieser Proteinfamilie sind in allen bisher untersuchten Organismen von Prokaryoten bis hin zu höheren Eukaryoten vertreten und übernehmen essentielle Funktionen in einer Vielzahl von zellulären Abläufen. ABC‐Transporter zeichnen sich durch eine breite Substratdiversität aus, d.h. sie energetisieren unter ATP‐Verbrauch die Translokation zahlreicher, strukturell und chemisch unterschiedlicher Substanzen wie Zucker, Lipide, Ionen, Aminosäuren, Proteine oder auch zelltoxische Stoffe. In Bakterien können sie sowohl als Importproteine fungieren, welche hauptsächlich die Aufnahme von Nährstoffen vermitteln, als auch als Exportproteine, deren Hauptaufgabe es ist, zelltoxische Substanzen aus der Zelle heraus zu schleusen. Eukaryotische ABC‐Transporter sind sowohl in der Plasmamembran als auch in den intrazellulären Membranen zu finden – beispielsweise in denen des Endoplasmatischen Retikulums, des Golgi Apparats, der Lysosomen, der Peroxisomen und der Mitochondrien. Sie fungieren als Exportproteine und sind z.B. an der Ionen‐Homöostase, der Antigenprozessierung, der Insulinfreisetzung oder am Cholesterol‐ und Lipidtransport beteiligt. ...
Funktionelle und strukturelle Charakterisierung von SLC-Transportern in eukaryotischen Systemen
(2018)
Die evolutionäre Voraussetzung für die Entwicklung komplexer, differenzierter Organismen bildet die Separierung der Zelle in Reaktionsräume, die so genannte Kompartimentierung. Das Prinzip der Kompartimentierung ermöglicht zahlreiche lebensnotwendige, biochemische Prozesse, wie die Konservierung von Energie durch Protonengradienten in der Atmungskette oder parallele, gegenläufige Stoffwechselwege. Zelluläre Kompartimente werden häufig durch Biomembranen gebildet, welche aus einer zweilagigen Lipidschicht bestehen. Lipidmoleküle in einer Zelle sind meistens amphipathisch, das bedeutet, sie bestehen aus einer polaren, hydrophilen Kopfgruppe und einem unpolaren, hydrophopen Ende (Abbildung 1). Die Lipidzusammensetzung in einer Biomembran ist sehr divers und unterscheidet sich in verschiedenen Organismen und Organellen. Phosphoglyceride bilden den Hauptbestandteil der Lipidschicht. Phosphoglyceride besteht aus einem Glycerin Rückgrat, welches an dem C1- und C2-Atom mit zwei Fettsäuren verestert und an dem C3-Atom mit einem Phosphorsäurediester verbunden ist. ...
In the past century, scientists have realized that venoms are a source of a number of natural substances presenting a wide range of pharmacological properties and often displaying a high specificity for their targets. Thus, the field of toxinology came into being, which is defined as the study of toxic substances of biological origin. Toxins are found in a wide variety of animals, including fish, cone snails, scorpions, snakes, and even some mammals. To be classified as venom, these must contain substances, i.e. toxins, which disturb physiological processes and must be deliberately delivered to the target animal. Snakes have evolved one of the most sophisticated mechanisms for venom delivery. Envenomation by snakebite can induce and inhibit aggregation/agglutination of platelets as well as inhibit/activate hemostasis, but also disrupt other physiological functions via neurotoxins and angioneurin growth factors. Snake venoms contain a substantial amount of C-type lectin-related proteins (CLRPs) which are known to function, notably, as integrin inhibitors. CLRPs are heterodimers composed of homologous α and β subunits which can assemble either covalently or noncovalently to oligomers, resulting in αβ, (αβ)2 and (αβ)4 structures. Some of the main targets of CLRPs are membrane receptors, coagulation factors, and proteins essential to hemostasis. The platelet collagen receptors GPVI and α2β1 integrin as well as the von Willebrand factor receptor GPIb play important roles in platelet activation and aggregation and are considered main targets of antithrombotic drugs. In this thesis, the integrin α2β1 is particularly considered as it is the sole collagen-binding integrin on platelets. Reduced expression of this platelet receptor results in dysfunction of platelet responses. Equivalently, overexpression of α2β1 integrin results in an increased risk of thrombosis. As a result, selective inhibitors of the collagen-α2β1 interaction could give rise to effective antithrombotic drugs. Integrins are large receptors which mediate cell-cell contacts and the binding of cells to the extracellular matrix (ECM). Therefore, they play a role in physiological processes, e.g. hemostasis and immunity, as well as in pathological processes, e.g. tumor angiogenesis and atherosclerosis. 18 α and 8 β integrin subunits, with nine α subunits containing an additional A domain, associate non-covalently to form 24 heterodimers with distinct binding specificities. Integrin collagen receptors are a subclass of four receptors which all utilize the β1 subunit. The α2β1 integrin is a collagen-binding receptor expressed not only on platelets, but also on endothelial and epithelial cells. Consequently, this integrin is also essential for cell adhesion and migration playing a role in angiogenesis as well as tumor metastasis. To date, there are five known antagonists of α2β1 integrin: EMS16, rhodocetin, vixapatin, and most recently rhinocetin and flavocetin-A. The first four have been shown to be specific for the integrin α2A domain, the major collagen-binding domain. All these antagonists are CLRPs and present new leads for drug design. In the past few years, many insights into the structure and function of rhodocetin were obtained. Monoclonal antibodies proved to be advantageous in disclosing this information, making them not only useful as therapeutic agents, but also as tools for protein characterization. The venom of the Vipera palaestinae snake was recently shown to contain an α2β1 integrin inhibitor, which prevented the integrin from binding collagen. This inhibitor, called vixapatin, was the initial focus of this dissertation. Vixapatin’s interaction with the α2β1 integrin needed further characterization on a molecular and cellular level to assess its medical potential and monoclonal antibodies were to be used as a tool. Originally, vixapatin had been isolated by reversed-phase high-performance liquid chromatography. To avoid the stringency of this method, for this study, it was replaced with gentler chromatographic methods. First, the α2β1 integrin inhibitor was isolated from the crude snake venom with affinity chromatography using the α2A domain as bait, establishing a method to quickly screen venoms for α2β1-binding proteins which affect the collagenintegrin interaction. The applicability of this method to other snake venoms was shown by isolating an α2A domain-specific toxin from the venom of Trimeresurus flavoviridis. To allow further characterization of both these toxins, gel filtration and ion exchange chromatography were employed to purify the protein without the α2A domain. These classical protein purification methods resulted in similar separation patterns of both the V. palaestinae and T. flavoviridis venom proteins. Purified proteins exhibiting the potential of inhibiting integrinbinding to collagen were analyzed by two-dimensional gel electrophoresis. Both VP-i and flavocetin-A, the integrin inhibitors from V. palaestinae and T. flavoviridis, respectively, were shown to have more complex structures than was evident from the purification. Each consisted of four low-molecular-weight proteins which assembled into two bands (for VP-i) or one single band (for flavocetin-A) under non-reducing conditions. Mass spectrometry analyses revealed VP-i to belong to the family of CLRPs, just like vixapatin does. However, these two proteins differed in their primary sequences and only showed homology to one another. The toxin purified from T. flavoviridis revealed this toxin to be flavocetin-A, a heterodimeric CLRP which had so far only been shown to have GPIb-binding activity. At the time of flavocetin-A’s purification, flavocetin-B was co-purified; flavocetin-B consists of the same two α and β subunits, plus an additional γ subunit. As no sequence information is known to date for the γ subunit, it may be one of the additional proteins purified here, along with an additional δ subunit. Therefore, the toxin isolated here may actually consist of four different subunits forming a tetramer of two different heterodimers, generating an (αβ)2(γδ)2 structure. This proposed (αβ)2(γδ)2 flavocetin-A structure has binding sites for both α2β1 integrin and GPIb, with no sterical overlap, as shown by affinity chromatography using the α2A domain and the extracellular domain of the GPIb receptor. The potential of VP-i and flavocetin-A to inhibit integrin-binding to type I collagen was shown during purification: Both toxins efficiently bind to the integrin α2A domain; also, VP-i and vixapatin bind to the A domain with the same affinity. Surface plasmon resonance showed the interaction of flavocetin-A with the α2β1 integrin to be extremely strong and association to be very fast. Furthermore, both toxins were shown to inhibit binding of the wildtype integrin to collagen: VP-i and flavocetin-A acted antagonistically on cell adhesion and cell migration. Initially, the interaction between VP-i and α2β1 integrin was to be further characterized with the help of monoclonal antibodies. However, this proved problematic, the procedure requiring various optimizations. Although, after expert consultation, some monoclonal antibodies could be obtained, the cells were extremely sensitive and gave unsatisfactory results when tested as detection tools in Western blot and immunoassays. Concluding, two novel α2β1 integrin inhibitors were discovered: VP-i and flavocetin-A, which were purified using the same procedure and which have similar functions. Both are Ctype lectin-related proteins which effectively inhibit cell adhesion and migration. This underlines that nature has instrumentalized CLRPs to specifically inhibit α2β1 integrin. Further characterization of VP-i and flavocetin-A will be able to provide leads for future drug development.
Die NADPH-Oxidasen stellen eine wichtige Quelle für reaktive Sauerstoffspezies (Reactive oxygen species; ROS) im Organismus dar. Hierbei dienen die NADPH-Oxidasen nicht nur der Pathogenabwehr, sondern haben einen Einfluss auf eine Vielzahl an oxidativen, physiologischen Prozessen. Unter den NADPH-Oxidasen ist NOX4 einzigartig, da es hauptsächlich im endoplasmatischen Retikulum (ER) lokalisiert ist, konstitutiv aktiv ist und Wasserstoffperoxid (H2O2) produziert. Wir vermuten, dass diese besonderen Eigenschaften eine Konsequenz aus der Interaktion mit bislang unentdeckten NOX4-interagiereden Proteinen ist.
Zweidimensionale blau-native Polyacrylamid-Gelelektrophorese (BN-PAGE) kombiniert mit SDS-PAGE zeigte NOX4 in makromolekularen Komplexen. Interagierende Proteine wurden durch eine quantitative SILAC (stable isotope labeling of amino acids in cell culture)-Co-immunopräzipitation (Co-IP) in NOX4-überexprimierenden HEK293-Zellen gescreent. Hierdurch konnten verschiedene interagierende Proteine identifiziert werden, wobei Calnexin die robusteste Interaktion aufwies. Calnexin konnte zudem in NOX4-haltigen Komplexen durch Complexome Profiling der BN-PAGE oder gleichzeitiger Antikörperfärbung nachgewiesen werden. Die Calnexin-NOX4-Interaktion konnte mittels reverser Co-IP und Proximity ligation assay bestätigt werden, während NOX1, NOX2 und NOX5 nicht mit Calnexin interagierten. Calnexin-Defizienz, untersucht in embryonalen Mausfibroblasten oder durch shRNA gegen Calnexin, reduzierte die NOX4-Proteinexpression und ROS-Bildung, wobei die mRNA-Expression unverändert blieb. Des Weiteren wurde untersucht, ob der bekannte Interaktionspartner von NADPH-Oxidasen, p22phox, wirklich essentiell für die Expression oder Aktivität von NOX4 ist, da es nur in manchen der NOX4-Co-IPs nachgewiesen wurde. Um den Einfluss von p22phox für NOX4 aufzuklären wurde ein CRISPR/Cas9 Knockdown in NOX4-überexprimierenden HEK293 Zellen etabliert. p22phox zeigte keinen Einfluss auf die NOX4-Expression, jedoch war die NOX4-abhängige ROS-Produktion in p22phox-Knockout Zellen verschwunden.
Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass endogenes NOX4 makromolekulare Komplexe mit Calnexin ausbildet, welches für die korrekte Reifung, Prozessierung und Funktion von NOX4 im ER nötig ist. Darüber hinaus ist p22phox nicht für die Reifung von NOX4, aber für dessen Aktivität nötig. Diese Ergebnisse zeigen eine vielfältige Regulation von NOX4 auf Proteinebene.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der vergleichenden funktionalen Charakterisierung der E.coli Transporter LacY, FucP und XylE und des Glucose-Transporters GlcP aus Staphylococcus epidermidis sowie funktionsrelevanter Mutanten. Sie katalysieren in vivo den PMF-gekoppelten Zuckertransport und repräsentieren die major facilitator superfamily (MFS), einer der größten Transporter-Familien überhaupt. Die Studien wurden mithilfe einer elektrophysiologischen Methode auf Basis Festkörper-unterstützter Membranen (SSM) durchgeführt. Komplementär dazu wurden radioaktive Transportassays, fluorometrische Messungen, kinetische Simulationen und theoretische Berechnungen auf Basis der 3D-Strukturen durchgeführt. Experimentell bestimmte Zucker- und pH-Abhängigkeiten elektrogener steady-state und pre steady-state Reaktionen wurden verwendet, um ein allgemeingültiges kinetisches Modell aufzustellen.
Insgesamt konnten bei allen Transportern zwei elementare elektrogene Reaktionen identifiziert werden. Eine schnelle Zucker-induzierte Konformationsänderung wurde dem induced fit des Zuckermoleküls zugeordnet. Die Elektrogenität im steady-state wird dagegen durch den langsamen Transfer der negativ geladenen Protonenbindestelle bestimmt. Die für den Symport ratenlimitierende Reaktion ist abhängig von den äußeren Bedingungen wie pH-Werten, Zuckerkonzentrationen, Substrat-Spezies und Membranpotential meist die Konformationsänderung des leeren (P) oder des beladenen (PSH) Carriers, welche die Substratbindestellen im Zuge des Alternating Access über die Membran transferieren. Ein Wechsel zwischen hohen Protonenbindungs-pK-Werten und niedrigen Protonenfreisetzungs-pK-Werten durch weitere lokale Konformationsänderungen ist zentraler Bestandteil des Transportmechanismus. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die Kopplung zwischen Zucker- und Protonen-Translokation, die sich zwischen E.coli Transportern und GlcP strikt unterscheidet. In E.coli Transportern erfolgt eine kooperative Bindung von Zucker und Proton. Zudem erfolgt keine Konformationsänderung im Zucker-gebundenen, unprotonierten Carrier (PS). In GlcP ist die Kopplung erheblich reduziert. Der Transport-Modus selbst ist abhängig von den äußeren Bedingungen. So katalysiert GlcP abhängig vom pH-Gradienten Uniport, Symport oder Antiport.
Die vorliegende Arbeit leistet einen wichtigen Beitrag zum Verständnis des PMF-gekoppelten Zuckertransports und zeigt die Grenzen des für LacY formulierten 6-Zustands-Modells mit nur zwei Konformationsänderungen auf. Ein erweitertes 8-Zustands-Modell mit vier Konformationsänderungen, die unterschiedliche Ratenkonstanten aufweisen können, erklärt sowohl Symport, Antiport als auch Uniport und berücksichtigt zudem die zahlreichen Ergebnisse für LacY aus der Literatur.
Mechanistic and structural insights into the quality control of the MHC I antigen processing pathway
(2022)
The human body is permanently exposed to its environment and thus to viruses and other pathogens, which require a flexible response and defense. Alongside to the innate immune system, the adaptive immune system provides highly specialized protection against these threats. The major histocompatibility complex class I (MHC I) antigen presentation system is a cornerstone of the adaptive immune system and a major constituent of cellular immunity. Pathogens such as viruses that invade a cell will leave traces in the form of proteins and peptides which are degraded and loaded onto MHC I molecules. MHC I peptide loading is performed by peptide loading complex (PLC) in the membrane of the endoplasmic reticulum as part of a multifaceted and comprehensive quality control machinery. Monitored by multiple layers of quality assurance, the MHC I molecules consequently display the immune status of the cell on its surface. In this context, the captured fragment of the virus serves as a call for help issued by the cell, alerting the adaptive immune system to the infection to mount an appropriate immune response.
The three-dimensional structure as well as the mechanistic details of parts of this complex machinery were characterized in the context of this dissertation. Among other tools, light-modulable nanotools were developed in this thesis, which permit external regulation of cellular processes in temporal and spatial resolution. Furthermore, methods and model systems for the biochemical characterization of cellular signaling cascades, proteins, as well as entire cell organelles were developed, which are likely to influence the field of cellular immunity and protein biochemistry in the future.
This cumulative work comprises a total of six publications whose scientific key advances will be briefly outlined in this abstract. In the introduction, the scientific background as well as the current state of research and methodological background knowledge are conveyed. The results section condenses the main aspects of the publications and links them to each other. Further details can be retrieved from the attached original publications.
In “Semisynthetic viral inhibitor for light control of the MHC I peptide loading complex, Winter, Domnick et al., Angew Chem Int Ed 2022” a photocleavable viral inhibitor of the peptide loading complex was produced by semi-synthesis. This nanotool was shown to be suitable for both purifying the PLC from human Raji cells as well as reactivating it in a light-controlled manner. Thus, this tool establishes the isolation of a fully intact and functional peptide loading complex for biochemical characterization. In addition, a novel flow cytometric analysis pipeline for microsomes was developed, allowing cellular vesicles to be characterized with single organelle resolution, similar to cells.
In “Molecular basis of MHC I quality control in the peptide loading complex, Domnick, Winter et al., Nat Commun 2022” the peptide loading complex was reconstituted into large nanodiscs, and a cryo-EM structural model of the editing module at 3.7 Å resolution was generated. By combining the structural model with in vitro glycan editing assays, an allosteric coupling between peptide-MHC I assembly and glycan processing was revealed, extending the known model of MHC I loading and dissociation from the PLC. These mechanisms provide a prototypical example for endoplasmic reticulum quality control.
In a related context, in “Structure of an MHC I–tapasin–ERp57 editing complex defines chaperone promiscuity, Müller, Winter et al., Nat Commun 2022” a recombinantly assembled editing module comprised of MHC I-tapasin-ERp57 was crystallized for X-ray structural biology. The resulting crystal structure at a resolution of 2.7 Å permitted the precise identification of characteristic features of the editing module and particularly of the peptide proofreading mechanism of tapasin. This study provided pivotal insights into the tapasin-mediated peptide editing of different MHC I allomorphs as well as similarities to TAPBPR-based MHC I peptide proofreading.
In “TAPBPR is necessary and sufficient for UGGT1-mediated quality control of MHC I, Sagert, Winter et al. (in preparation)” novel insights concerning the peptide proofreader TAPBPR and its close interplay with the folding sensor and glucosyltransferase UGGT1 were obtained. It was shown that TAPBPR is an integral part of the second level of endoplasmic quality control and is indispensable for effective MHC I coordination by UGGT1.
In “Light-guided intrabodies for on-demand in situ target recognition in human cells, Joest, Winter et al., Chem Sci 2021” intracellular nanobodies were equipped with a photocaged target recognition domain by genetic code expansion via amber suppression. These intrabodies, acting as high-affinity binding partners endowed with a fluorophore, could be used in a light-triggered approach to instantaneously visualize their target molecule...
Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene metabolische Anpassungsmechanismen des humanpathogenen Bakteriums Acinetobacter baumannii an seinen Wirt untersucht. Im ersten Teil wurde die Rolle von verschiedenen Trimethylammoniumverbindungen (Cholin, Glycinbetain und Carnitin) und den zugehörigen Aufnahmesystemen, sowie ihren Stoffwechselwegen während dieses Prozesses analysiert. Für die Analyse der Transportsysteme wurde eine markerlose Vierfachmutante (Δbcct) von A. baumannii generiert, sodass alle bekannten Transportsysteme für die genannten Verbindungen deletiert vorlagen. Wachstumsversuche mit dieser Mutante zeigten, dass es in A. baumannii keine weiteren Transporter für die Aufnahme von Cholin gibt, jedoch weitere primär aktive oder sekundär aktive Transporter für die Aufnahme von Glycinbetain. Weiterhin konnten innerhalb dieser Arbeit die KM-Werte der Transporter bestimmt werden. Verschiedene Virulenz- und Infektionsanalysen führten zu dem Schluss, dass die Transporter keine Rolle bei der Virulenz von A. baumannii spielen. In Genomanalysen konnten die Gene, die für die Enzyme des Oxidationsweges von Cholin zu Glycinbetain kodieren identifiziert werden (Cholin-Dehydrogenase (betA), GlycinbetainAldehyd-Dehydrogenase (betB) und ein potenzieller Regulator (betI)). Es wurden Deletionsmutanten innerhalb dieses Genclusters generiert, mit dessen Hilfe gezeigt werden konnte, dass Cholin unter Salzstress ausschließlich als Vorläufer für das kompatible Solut Glycinbetain fungiert und nicht als kompatibles Solut von A. baumannii genutzt werden kann. Virulenz- und Infektionsstudien mit den Deletionsmutanten zeigten, dass der Cholin-Oxidationsweg keine Rolle bei der Virulenz von A. baumannii spielt.
Die Cholin-Dehydrogenase BetA wurde zusätzlich in E. coli produziert und anschließend mittels NiNTA-Affinitätschromatographie aufgereinigt. Die biochemische Charakterisierung des Enzyms zeigte, dass BetA membranständig ist und die höchste Aktivität bei einem pH-Wert von 9,0 hat. Salze wie NaCl oder KCl hatten keinen Effekt auf die Aktivität des Enzyms, während Glutamat die Aktivität stimulierte.
Weiterhin konnte FAD als Cofaktor identifiziert werden und der KM-Wert ermittelt werden. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Oxidation von Cholin zu Glycinbetain unter isoosmotischen Bedingungen zu einem Anstieg der ATP-Konzentration in A. baumannii-Zellsuspensionen führt und damit, dass Cholin als alternative Energiequelle genutzt wird. Das Phospholipid Phosphatidylcholin konnte als natürliche Cholinquelle identifiziert werden. Eine Rolle der Phospholipasen D bei der Abspaltung der Cholin-Kopfgruppe des Phosphatidylcholins konnte ausgeschlossen werden. Die Gene für die Oxidation von Cholin zu Glycinbetain werden ausschließlich in Anwesenheit von Cholin exprimiert, jedoch unabhängig von der extrazellulären Salzkonzentration. Diese Studien zeigten, dass der Cholin-Oxidationsweg eine Rolle in der metabolischen Adaptation von A. baumannii an den Wirt spielt. Phosphatidylcholin kann hier als natürliche Cholinquelle im Wirt genutzt werden, da die Wirtsmembranen aus bis zu 70 % Phosphatidylcholin bestehen. Transportstudien mit Carnitin führten zu dem Schluss, dass der Transporter Aci01347 aus A. baumannii neben Cholin ebenfalls Carnitin transportiert. Wachstumsversuche mit einer aci01347-Mutante bestätigen, dass Aci01347 essenziell für die Aufnahme und anschließende Verwertung von Carnitin als Kohlenstoffquelle ist. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass das Transportergen mit essenziellen Genen für den Carnitin-Abbau in einem Operon liegt. Für die Analyse des Abbauweges von Carnitin wurden markerlose Deletionsmutanten innerhalb des Operons generiert. In Wachstumsstudien mit diesen Mutanten konnte der Abbauweg aufgeklärt werden und der Regulator des Operons identifiziert werden. Carnitin wird hier über Trimethylamin und Malat-Semialdehyd zu D-Malat umgewandelt und anschließend über Pyruvat in den TCA-Zyklus eingespeist. Der Regulator wurde zusätzlich in E. coli produziert und mittels Ni-NTA-Affinitätschromatographie aufgereinigt. Mithilfe von EMSA-Studien konnte die Bindestelle des Regulators auf eine 634 Bp lange DNA-Sequenz stromaufwärts des CarnitinOperons eingegrenzt werden. Durch Transkriptomanalysen konnte gezeigt werden, dass bei Wachstum mit Acetylcarnitin, Carnitin und D-Malat die Expression des Carnitin-Operons induziert wurde. Darüber hinaus wurden die Gene konservierter Aromatenabbauwege wie z. B. des Homogentisatweges, des Phenylacetatweges und des Protocatechuat-Abbaus, verstärkt exprimiert. In G. mellonellaVirulenzstudien konnte eine Rolle des Abbaus von Carnitin bei der Virulenz von A. baumannii nachgewiesen werden. Zusätzlich konnte dieser Effekt dem entstehenden Trimethylamin zugesprochen werden...
Starkes Übergewicht und eine damit einhergehende Hypertrophie von Geweben aber auch des Herz-Kreislauf-Systems führen zu einer Reihe von Folgeerkrankungen wie z. B. Diabetes mellitus Typ 2 oder auch Arteriosklerose. Während im Fettgewebe freie Fettsäuren, die von Makrophagen aufgenommen werden, eine entscheidende Rolle spielen, scheint in der Pathogenese von Arteriosklerose die Aufnahme von Fettsäuren aus Lipoproteinpartikeln durch Makrophagen von großer Wichtigkeit zu sein. Ein weiterer Faktor, der durch freie Fettsäuren ausgelöst wird ist ER-Stress. Makrophagen, die zu Triglycerid (TG) reichen Schaumzellen geworden sind, akkumulieren in arteriosklerotischen Läsionen. Der Lipidmetabolismus von Makrophagen wird transkriptionell u.a. durch den Transkriptionsfaktor PPARγ (Peroxisomproliferator aktivierter Rezeptor γ) reguliert. Sein Zielgen FABP4 (Fettsäuren bindendes Protein 4) beschleunigt die Entwicklung von Arteriosklerose in Mausmodellen. Da die Expression von PPARγ und FABP4 in IL 4- (Interleukin-4) polarisierten Makrophagen induziert wird, sollte die Rolle von FABP4 in humanen, mit IL 4 polarisierten Makrophagen untersucht werden. Hierfür wurden primäre humane Monozyten in Anwesenheit von LPS/IFNγ (Lipopolysaccharid/Interferon γ) bzw. IL 4 zu Makrophagen differenziert. Es zeigte sich, dass in LPS/IFNγ stimulierten Makrophagen PPARγ und dessen Zielgene nicht exprimiert wurden. Dagegen waren sie bei unstimulierten Makrophagen bei IL 4 stimulierten Makrophagen deutlich erhöht. Dies spiegelte sich auch in einer erhöhten Aufnahme von Triglyceriden aus VLDL-Partikeln (Lipoproteinpartikel sehr niedriger Dichte) wider. IL 4 induzierte also einen Fettsäuren akkumulierenden Phänotyp. Durch einen PPAR-Luciferase-Reporter-Test wurde untersucht, ob FABP4 für die Aktivierung von PPARγ nötig war. Dies konnte bestätigt werden, da PPARγ durch seinen Liganden Linolsäure nur in Anwesenheit von FABP4 aktiviert werden konnte. Diese Aktivierung konnte zusätzlich durch den FABP4-Inhibitor HTS01037 verhindert werden. Nun sollte der Einfluss von FABP4 auf die PPARγ-abhängige Genexpression untersucht werden. Hierfür wurde FABP4 während der Differenzierung mit den beiden Inhibitoren HTS01037 oder BMS309403 in IL 4 stimulierten Makrophagen inhibiert. Durch die Inhibition von FABP4 sank die Expression von FABP4 und LPL (Lipoproteinlipase), während die von PPARγ unverändert blieb. Die LPL spielt eine entscheidende Rolle in der Aufnahme von Lipiden aus VLDL-Partikeln und trägt somit zur TG-reichen Schaumzellbildung bei. Die verminderte Expression von LPL spiegelte sich in einer verminderten Lipidaufnahme aus VLDL-Partikeln wider. Gleichzeitig wurde durch die FABP4-Inhibition die Entzündungsantwort der Makrophagen auf VLDL-Partikel abgeschwächt. IL 4 induziert also LPL, indem es PPARγ aktiviert. FABP4 unterstützt hierbei die Aktivierung von PPARγ. Durch die Inhibition kann die LPL-Expression vermindert werden, was die TG-reiche Schaumzellbildung und die Entzündungsreaktion in einem VLDL-reichen Umfeld vermindert und eine neue Therapiemöglichkeit von Arteriosklerose eröffnet. Im Fettgewebe kommt bei starkem Übergewicht, bedingt durch die erhöhte Konzentration an freien Fettsäuren und Hypoxie, zu einer leichten Entzündungsreaktion. Diese Entzündungsreaktion wurde durch eine Stimulation mit Palmitat unter Hypoxie (1 % O2) nachgebildet. Überstände von Makrophagen nach dieser Stimulation (MCM) wurden auf primäre humane Adipozyten übertragen. Diese Überstände konnten zwar keine Insulinresistenz in Adipozyten auslösen, induzierten jedoch eine Entzündungsreaktion. Diese zeigte sich in einer erhöhten Expression der proentzündlichen Zytokine CCL2 (CC-Chemokin-Ligand-2) und IL 6. Gleichzeitig wurde die Expression des antientzündlichen Zytokins Adiponectin vermindert. Der Transfer von MCM ist also ein Modell für die Entstehung der Insulinresistenz in einem frühen Stadium. Beim Versuch, die entzündungsfördernde Fähigkeit des MCMs zu verhindern, wurde AMPK mit verschiedenen Aktivatoren stimuliert. Es zeigte sich, dass der AMPK-Aktivator AICAR (5-Aminoimidazol-4-carboxamidribonukleotid) die Entzündungsantwort und den ER-Stress von mit Hypoxie und Palmitat stimulierten Makrophagen deutlich reduzierte. Der starke Effekt auf den ER-Stress konnte auch mit anderen ER-Stress-Auslösern wie Thapsigargin oder Tunicamycin nachvollzogen werden. Da AICAR ein AMPK-Aktivator ist, wurden typische Effekte der AMPK-Aktvierung wie reduzierte Proteinexpression, verstärkte Sirtuin-1-Aktivierung und Steigerung der Fettsäurenoxidation mittels Inhibitoren verhindert. Dies hatte keinen Einfluss auf die Wirkung von AICAR. Ebenso wurde untersucht, ob AICAR in die Zelle aufgenommen werden musste und ob es zu seiner phosphorylierten Form ZMP umgewandelt werden musste. Durch den Inhibitor ABT 702 kann die Adenosinkinase inhibiert werden, welche die Phosphorylierung katalysiert. Es zeigte sich, dass die Phosphorylierung von AICAR zu ZMP nicht erforderlich war, damit AICAR die ER-Stress-Antwort hemmen konnte. AICAR und nicht ZMP wirkte gegen den ER-Stress. Da durch das fehlende ZMP die AMPK nicht aktiviert wurde, war das ein weiteres Zeichen, dass AICAR AMPK-unabhängig wirkte. Dies konnte durch einen AMPK-Knockdown bestätigt werden. Durch einen Knockdown verschiedener Adenosintransporter konnte gezeigt werden, dass SLC28A3 (Soluttransporterfamlie 28 Typ A3) verantwortlich für die Aufnahme von AICAR in primäre humane Makrophagen war. Es konnte demnach gezeigt werden, dass AICAR den ER-Stress in primären humanen Makrophagen in einem von AMPK unabhängigen Mechanismus vermindert. Dafür wird es mittels SLC28A3 in die Zelle aufgenommen und wirkt als AICAR und nicht als ZMP. Diese Erkenntnisse stellen eine interessante, neue therapeutische Möglichkeit im Feld von Arteriosklerose und Diabetes dar.
Acinetobacter baumannii is a worldwide opportunistic pathogen responsible for nosocomial infections. One of the main factors contributing to multidrug resistance in A. baumannii is the upregulation of various chromosomally encoded or acquired efflux pumps, which expel toxic compounds out of the cells with high efficiency.
The resistance-nodulation-cell division (RND)-type efflux pump gene deletion strains ∆adeAB, ∆adeFG or ∆adeIJ and the major facilitator superfamily (MFS) chloramphenicol efflux pump gene deletion strain ∆craA of A. baumannii ATCC 19606 were created and a differential gene expression study was conducted via RT-qPCR. The expression of efflux pump genes adeB, adeG, adeJ, craA, and the outer membrane protein ompA were examined in the absence and presence of chloramphenicol. No significant up- or downregulation of these genes for any of these deletion strains in comparision to the wild-type strain in absence of the drug chloramphenicol.
In contrast, craA was significantly up-regulated in A. baumannii exposed to chloramphenicol, emphasizing the importance of CraA in chloramphenicol resistance. CraA is widely present in clinical isolates of A. baumannii. It is homologous to the well-studied multiple-drug efflux transporter MdfA from Escherichia coli (61% similarity), but surprisingly reported to be acting as a specific chloramphenicol transporter of A. baumannii (Roca et al., 2009).
The drug susceptibility assay done with A. baumannii ATCC 19606 ΔcraA showed that CraA could confer resistance towards phenicols (chloramphenicol, thiamphenicol, and florfenicol), which was in line with the previous report. CraA was heterologously overproduced in E. coli BW25113 ∆emrE∆mdfA and its substrate specificity was determined by drug susceptibility assays and whole cell fluorescent dye uptake experiments. We observed that the substrate specificity of craA overexpressed in E. coli was more diverse and resembling that of the E. coli MdfA homolog. Apart from resistance towards phenicols (chloramphenicol, thiamphenicol, and florfenicol), CraA also confer resistance towards monovalent cationic drugs (benzalkonium, TPP+, and ethidium), long dicationic drugs (dequalinium and chlorhexidine), fluoroquinolones (norfloxacin and ciprofoxacin) and anticancer drugs (mitomycin C). We showed that CraA is a drug/H+ antiporter by ACMA quenching in inverted CraA or CraA variant containing membrane vesicles.
To address the molecular determinants for multidrug binding and transport, 45 mostly single Ala-substitution variants of CraA were created. These include substitution variants for membrane-embedded proton-titratable residues (E38, D46, and E338) and residues predicted to be important for binding and transport of drug, as inferred from docking experiments on basis of a MdfA-derived CraA model. The combined results indicated a high degree of functional similarities between MdfA and CraA. The conserved titratable residues E26 and D34 (E38 and D46 in CraA) are important for transport in both these homologs. The CraA variant E38A is inactive against all tested drugs, but D46A is only inactive for some drugs, suggesting that only E38 is involved in H+-transport.
Another focus of this thesis is the three tetracycline transporters of A. baumannii strain AYE, TetA, TetG and TetA(A). Susceptibility assays involving tetracycline, minocycline, doxycycline and the last-resort antibiotic tigecycline were conducted on E. coli BW25113 ∆emrE∆mdfA overexpressing these transporters. TetA(A) was excluded from further study due to toxicity of the cells caused by protein overexpression. Both TetA and TetG confer resistance against tetracycline, minocycline and doxycycline. Although tigecycline was reported not to be recognized by tetracycline efflux pumps, we surprisingly found that TetA is able to transport tigecycline. The role of TetA in tigecycline efflux in A. baumannii was confirmed by conducting tigecycline susceptibility assays on A. baumannii.
We speculate that TetA embedded in the inner membrane acts in cooperation with RND-type tripartite systems that span the inner and outer membrane to extrude tigecycline from the periplasm across the outer membrane. A. baumannii ATCC 19606 ∆adeAB were indeed sensitive to tigecycline in comparison to wild-type strain. Deletion of adeIJ also leads to sensitivity to tigecycline, but less so compared to the DadeAB phenotype, while A. baumannii ATCC 19606 ∆adeFG did not show any difference compared to wild-type strain in tigecycline susceptibility. Differential gene expression analysis of the RND efflux pumps (adeB, adeG and adeJ) and tetA of A. baumannii strain AYE showed that the expression of tetA expression is significantly upregulated when tigecycline is present in the growth medium.
We conclude that craA encodes a broad-spectrum efflux pump rather than a specific chloramphenicol transporter. In A. baumannii, the synergistic effects with the outer membrane and/or the presence of other transporters could result in the discrepancy observed. Thus, the possibility of CraA in conferring multidrug resistance should not be overlooked, especially when it is up-regulated under antibiotic stress conditions.
Locomotion, the way animals independently move through space by active muscle contractions, is one of the most apparent animal behaviors. However, in many situations it is more beneficial for animals to actively prevent locomotion, for instance to briefly stop before reorienting with the aim of avoiding predators, or to save energy and recuperate from stress during sleep. The molecular and cellular mechanisms underlying such locomotion inhibition still remain elusive. So, the aim of this study was to utilize the practical genetic model organism Caenorhabditis elegans to efficiently tackle relevant questions on how animals are capable of suppressing locomotion.
Nerve cells, mostly called neurons, are known to control locomotion patterns by activating some and inhibiting other muscle groups in a spatiotemporal manner via local secretion of molecules known as neurotransmitters. This study particularly focuses on whether neuropeptides modulate such neurotransmission to prevent locomotion. Neuropeptides are small protein-like molecules that are secreted by specific neurons and that act in the brain by activating G protein-coupled receptors (GPCRs) expressed in other target neurons. They can act as hormones, neuromodulators or neurotransmitters. DNA sequences coding for neuropeptides and their cognate receptors are similar across diverse species and thus indicate evolutionary conservation of their molecular signaling pathways. This could potentially also imply that regulatory functions of specific neuropeptides are also similar across species and are thus meaningful to unravel more general mechanisms for instance underlying locomotion inhibition.
Specifically, we find that the modulatory interneuron RIS constitutes a dedicated stop neuron of which the activity is sufficient to initiate rapid locomotion arrest in C. elegans while maintaining its body posture. Similar to its known function in larval sleep, RIS requires RFamide neuropeptides encoded by the flp 11 gene for this activity, in addition to GABA. Furthermore, we find that spontaneous calcium activity transients in RIS are compartmentalized and correlated with locomotion stop. These findings illustrate that a single neuron can regulate both stopping and sleeping phenotypes.
Secondly, we show that C. elegans RPamide neuropeptides encoded by nlp-22 and nlp-2 regulate sleep and wakefulness, respectively. We unexpectedly find that these peptides activate gonadotropin-releasing hormone (GnRH)-like receptors dose dependently and we highlight their sequence resemblance to other bilaterian GnRH-like neuropeptides. In addition, we show that these receptors are expressed in distinct subsets of neurons that are associated with motor behavior. Finally, we show that nlp 22 encoded peptides signal through GNNR 6 receptors to regulate larval sleep and that nlp 2 encoded peptides require both GNRR 3 and GNRR 6 receptors to promote wakefulness.
In sum, we find that locomotion inhibition in C. elegans is regulated by multiple, but evolutionary conserved RFamide and GnRH-like RPamide neuropeptidergic signaling pathways.