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Echolocation allows bats to orientate in darkness without using visual information. Bats emit spatially directed high frequency calls and infer spatial information from echoes coming from call reflections in objects (Simmons 2012; Moss and Surlykke 2001, 2010). The echoes provide momentary snapshots, which have to be integrated to create an acoustic image of the surroundings. The spatial resolution of the computed image increases with the quantity of received echoes. Thus, a high call rate is required for a detailed representation of the surroundings.
One important parameter that the bats extract from the echoes is an object’s distance. The distance is inferred from the echo delay, which represents the duration between call emission and echo arrival (Kössl et al. 2014). The echo delay decreases with decreasing distance and delay-tuned neurons have been characterized in the ascending auditory pathway, which runs from the inferior colliculus (Wenstrup et al. 2012; Macías et al. 2016; Wenstrup and Portfors 2011; Dear and Suga 1995) to the auditory cortex (Hagemann et al. 2010; Suga and O'Neill 1979; O'Neill and Suga 1982).
Electrophysiological studies usually characterize neuronal processing by using artificial and simplified versions of the echolocation signals as stimuli (Hagemann et al. 2010; Hagemann et al. 2011; Hechavarría and Kössl 2014; Hechavarría et al. 2013). The high controllability of artificial stimuli simplifies the inference of the neuronal mechanisms underlying distance processing. But, it remains largely unexplored how the neurons process delay information from echolocation sequences. The main purpose of the thesis is to investigate how natural echolocation sequences are processed in the brain of the bat Carollia perspicillata. Bats actively control the sensory information that it gathers during echolocation. This allows experimenters to easily identify and record the acoustic stimuli that are behaviorally relevant for orientation. For recording echolocation sequences, a bat was placed in the mass of a swinging pendulum (Kobler et al. 1985; Beetz et al. 2016b). During the swing the bat emitted echolocation calls that were reflected in surrounding objects. An ultrasound sensitive microphone traveling with the bat and positioned above the bat’s head recorded the echolocation sequence. The echolocation sequence carried delay information of an approach flight and was used as stimulus for neuronal recordings from the auditory cortex and inferior colliculus of the bats.
Presentation of high stimulus rates to other species, such as rats, guinea pigs, suppresses cortical neuron activity (Wehr and Zador 2005; Creutzfeldt et al. 1980). Therefore, I tested if neurons of bats are suppressed when they are stimulated with high acoustic rates represented in echolocation sequences (sequence situation). Additionally, the bats were stimulated with randomized call echo elements of the sequence and an interstimulus time interval of 400 ms (element situation). To quantify neuronal suppression induced by the sequence, I compared the response pattern to the sequence situation with the concatenated response patterns to the element situation. Surprisingly, although the bats should be adapted for processing high acoustic rates, their cortical neurons are vastly suppressed in the sequence situation (Beetz et al. 2016b). However, instead of being completely suppressed during the sequence situation, the neurons partially recover from suppression at a unit specific call echo element. Multi-electrode recordings from the cortex allow assessment of the representation of echo delays along the cortical surface. At the cortical level, delay-tuned neurons are topographically organized. Cortical suppression improves sharpness of neuronal tuning and decreases the blurriness of the topographic map. With neuronal recordings from the inferior colliculus, I tested whether the echolocation sequence also induced neuronal suppression at subcortical level. The sequence induced suppression was weaker in the inferior colliculus than in the cortex. The collicular response makes the neurons able to track the acoustic events in the echolocation sequence. Collicular suppression mainly improves the signal-to-noise ratio. In conclusion, the results demonstrate that cortical suppression is not necessarily a shortcoming for temporal processing of rapidly occurring stimuli as it has previously been interpreted.
Natural environments are usually composed of multiple objects. Thus, each echolocation call reflects off multiple objects resulting in multiple echoes following the calls. At present, it is largely unexplored how neurons process echolocation sequences containing echo information from more than one object (multi-object sequences). Therefore, I stimulated bats with a multi-object sequence which contained echo information from three objects. The objects were different distances away from each other. I tested the influence of each object on the neuronal tuning by stimulating the bats with different sequences created from filtering object specific echoes from the multi-object sequence. The cortex most reliably processes echo information from the nearest object whereas echo information from distant objects is not processed due to neuronal suppression. Collicular neurons process less selectively echo information from certain objects and respond to each echo.
For proper echolocation, bats have to distinguish between own biosonar signals and the signals coming from conspecifics. This can be quite challenging when many bats echolocate adjacent to each other. In behavioral experiments, the echolocation performance of C. perspicillata was tested in the presence of potentially interfering sounds. In the presence of acoustic noise, the bats increase the sensory acquisition rate which may increase the update rate of sensory processing. Neuronal recordings from the auditory cortex and inferior colliculus could strengthen the hypothesis. Although there were signs of acoustic interference or jamming at neuronal level, the neurons were not completely suppressed and responded to the rest of the echolocation sequence.
An exciting in vivo function of ATP-sensitive potassium channels in substantia nigra dopamine neurons Ð Implications for burst firing and novelty coding ÐPhasic burst activity is a key feature of dopamine (DA) midbrain neurons. This particular pattern of excitation of DA neurons occurs via a synaptically triggered transition from low-frequency background spiking to transient high-frequency discharges. Burst-firing mediated phasic DA release is critical for flexible switching of behavioural strategies in response to unexpected rewards, novelty and other salient stimuli. However, the cellular and molecular bases of burst signalling in distinct DA subpopulations of the substantia nigra (SN) or the ventral tegmental area (VTA) are unknown.
DA neuron excitability is controlled by synaptic network inputs, neurotransmitter receptors and ion channels, which generate action potentials and determine frequency and pattern of electrical activity in a complex interplay. ATP-sensitive potassium (K-ATP) channels are widely expressed throughout the brain, where in most cases they are believed to act as metabolically-controlled 'excitation brakes' by matching excitability to cellular energy states. However, their precise physiological in vivo function in DA neurons remains elusive.
To study burst firing and the underlying ionic mechanisms with single cell resolution, in vivo single-unit recordings were combined with juxtacellular neurobiotin labelling as well as immunohistochemical and anatomical identification of individual DA neurons. In vivo recordings were performed in adult isoflurane-anaesthetised wildtype (WT) and global K-ATP channel knockout mice, lacking the pore forming Kir6.2 subunit (Kir6.2-/-). In addition, DA cell-selective functional silencing of K-ATP channel activity in vivo was established using virus-mediated expression of dominant-negative Kir6.2 subunits. Careful control experiments ruled out any significant contributions from nonDA neurons as transduction was effectively limited to SN DA neurons rather than affecting those cells that innervate them. Virus-based K-ATP channel silencing in combination with juxtacellular recording and labelling was achieved to define the electrophysiological phenotype of individually identified, virally-transduced DA neurons in vivo.
Single-unit recordings revealed that K-ATP channels Ð in contrast to their conventional hyperpolarising role Ð in a subpopulation of DA neurons located in the medial SN (m-SN) act as cell-type selective gates for excitatory burst firing in vivo. The percentage of spikes in bursts was threefold reduced in Kir6.2-/- compared to WT mice. Classification of firing patterns based on visual inspection of autocorrelation histograms and on a newly developed spike-train-model confirmed the dramatic shift from phasic burst to tonic single-spike oscillatory firing in Kir6.2-/-. This significant decrease of burstiness was selective for m-SN DA neurons and was not exhibited by DA cells in the lateral SN or VTA. Virus-based K-ATP channel silencing in vivo unequivocally demonstrated that the activity of postsynaptic K-ATP channels was sufficient to disrupt bursting in m-SN DA neuron subtypes. Patch-clamp recordings in brain slices indicated an essential role of K-ATP channels for NMDA-mediated in vitro bursting. In accordance with previous studies in DA midbrain neurons, NMDA receptor stimulation triggered burst-like firing in m-SN DA cells in vitro, but only when K-ATP channels were co-activated in these neurons.
K-ATP channel-gated burst firing in m-SN DA neurons might be functionally relevant in awake, freely moving mice. To explore the behavioural consequences of SN DA neuron subtype-selective K-ATP channel suppression, spontaneous open field (OF) behaviour of mice with bilateral K-ATP silencing across the whole SN (medial + lateral) or in only the lateral SN was tested. Analysis of WT and global Kir6.2-/- mice showed reduced exploratory locomotor activity of Kir6.2-/- in a novel OF environment. Remarkably, K-ATP channel silencing in m-SN DA neurons phenocopied this novelty-exploration deficit, indicating that K-ATP channel-gated burst firing in medial but not lateral SN DA neurons is crucial for WT-like novelty-dependent exploratory behaviour.
In summary, a novel role of K-ATP channels in promoting the excitatory switch from tonic to phasic firing in vivo in a cell-type specific manner was discovered. The present PhD thesis provides several important insights into the pivotal function of K-ATP channels in medial SN DA cells, which project to the dorsomedial striatum, for burst firing and its important consequences for context-dependent exploratory behaviour.
In collaboration with two other research groups transcriptional up-regulation of K-ATP channel and NMDA receptor subunits and high levels of in vivo burst firing were detected in surviving SN DA neurons from Parkinson's disease (PD) patients Ð providing a potential link of K-ATP channel activity to neurodegenerative pathomechanisms of PD. Using high-resolution fMRI imaging another study in humans has recently identified distinct DA midbrain regions that are preferentially activated by either reward or novelty. Taken together, these human data and the results of the present PhD thesis suggest that burst-gating K-ATP channel function in SN DA neurons impacts on phenotypes in disease as well as in health.
Das Hören hat für den Menschen eine maßgebliche Bedeutung hinsichtlich Kommunikation und Orientierung. Auch wenn sich der Mensch stark auf seinen visuellen Sinn verlässt, wird mit dem Ausfall des Hörvermögens deutlich, wie viele Informationen oft unterbewusst über die Analyse von Schallsignalen gezogen werden. Trotz dieser grundlegenden Relevanz sind bis heute noch nicht alle Komponenten, die dem Hörprozess zugrunde liegen, entschlüsselt.
Um sich diesen offenen Fragestellungen anzunähern, müssen Forscher oft auf Tiermodelle zurückgreifen. Auf Grund ihres exzellenten Gehörs haben sich hier in den letzten Jahrzehnten Fledermäuse als taugliche Versuchstiere qualifiziert. Diese Tiere sind in der Lage sich ohne Verwendung des visuellen Systems in absoluter Dunkelheit zu orientieren, indem sie mit Hilfe der wiederkehrenden Echos ihrer ausgesendeten Ultraschalllaute die Umgebungsstrukturen analysieren. Weiterhin umfasst der zur Kommunikation und Ortung verwendete Frequenzbereich bei Fledermäusen ein Vielfaches von dem des menschlichen, was ebenfalls verschiedene Aspekte der Hörforschung begünstigt. Die in dieser Studie verwendete fruchtfressende Fledermausart Carollia perspicillata eignet sich hervorragend für akustische Untersuchungen, da ihr Innenohr keine speziellen morphologischen Spezialisierungen aufweist.
Anhand der Fledermausart C. perspicillata sollen innerhalb der vorliegenden Studie verschiedene offene Fragestellungen bezüglich der Innenohrmechanik näher beleuchtet werden. Um sich diesen Fragestellungen anzunähern, wurde eine Kombination aus zwei etablierten Methoden verwendet. Zum einen die Messung von Distortions-Produkt otoakustischen Emissionen (DPOAEs), welche auf Grund ihrer Generierung durch aktive Prozesse innerhalb der Kochlea die Möglichkeit bietet, Veränderungen im Innenohr festzustellen und zum anderen kontralaterale akustische Stimulation (KAS), welche eine erprobte Methode zur Aktivierung des efferenten Systems darstellt. Dadurch, dass die äußeren Haarsinneszellen in der Kochlea direkte synaptische Kontakte mit efferenten Fasern der absteigenden Hörbahn eingehen, kann eine Aktivierung des efferenten Systems Modulationen des kochleären Verstärkers bewirken, wodurch sich wiederum die Antworteigenschaften der Kochlea verändern. Mit einer Kombination dieser beiden Methoden lassen sich demnach zum einen höhere Zentren der Hörbahn aktivieren, die über efferente Fasern einen direkten Einfluss auf das Innenohr nehmen, zum anderen die induzierten Modulationen in Form von DPOAEs mit Hilfe eines sensitiven Mikrofons aufnehmen. Die Grundvoraussetzung für die Funktionalität dieser Methodenkombination ist das Vorhandensein von efferenten Fasern innerhalb der Kochlea. Da das efferente System verschiedener Säuger eine große Diversität aufweist, wurden innerhalb dieser Arbeit zusätzlich zu den akustischen Untersuchungen histologische Schnittserien der Kochlea von C. perspicillata angefertigt. Hierbei lag das Hauptaugenmerk auf dem Verlauf der efferenten Fasern innerhalb der Kochlea. Mit Hilfe der Thiocholinmethode wurde der Ort der Umsetzung des Achetylcholinabbauenden Enzyms Achetylcholin-esterase angefärbt. Achetylcholin ist der vorranig vorkommende Transmitter an den efferenten Synapsen.
Diese Studie untersucht weiter den Einfluss der Narkose auf das Innenohr. In zahlreichen Studien, die Innenohrmechanik betreffend, wurden die Untersuchungen an narkotisierten Tieren durchgeführt. Oftmals wird zwar die Problematik der möglichen Beeinflussung des Innenohres durch das verwendete Narkosemittel diskutiert, aber meisthin als unumgänglich eingestuft. Innerhalb der vorliegenden Studie wurde ein Großteil der Experimente an narkotisierten und auch wachen Tieren durchgeführt, um die Auswirkungen der häufig verwendeten Ketamin-Xylazin-Narkose auf die Innenohr-aktivität zu verdeutlichen.
In der Literatur lässt sich eine Vielzahl von akustischen Untersuchungen finden, in denen artifizielle Stimuli wie Reintöne oder Rauschen verwendet werden. Die Problematik dahinter ergibt sich daraus, dass diese Art der Töne in der Natur selten zu finden sind. Derartige Studien werfen daher die Frage auf, ob das Innenohr beispielsweise Rauschstimuli auf die gleiche Weise verarbeitet wie natürliche, komplexere Stimuli. Innerhalb der vorliegenden Studie wurden demzufolge im Vergleich zu artifiziellen Stimuli arteigene Rufe der Fledermausspezies C. perspicillata aufgenommen und als akustische Stimuli während der Messungen verwendet.
Im Zuge dieser Fragestellung wurde in einem weiteren Teilprojekt versucht ein neues Verfahren zur Messung von OAEs zu etablieren, mit dem es möglich ist das Ohr nicht ausschließlich mit den herkömmlich verwendeten Reintönen zu stimulieren, sondern ebenfalls mit komplexen Lauten, wie arteigenen Kommunikations- und Echo-ortungsrufen. Hierfür wurde ein von Douglas Keefe vorgestelltes Paradigma zur Messung von OAE-Residualen herangezogen, welches die am Trommelfell gemessenen akustischen Signale von den Trommelfellantworten auf einzelne Komponenten dieser Signale subtrahiert.
Anhand der in dieser Studie gewonnenen Ergebnisse kann deutlich gezeigt werden, dass eine akustische Stimulation der kontralateralen Kochlea mit verschiedenen artifiziellen sowie arteigenen Stimuli zuverlässig eine Änderung des Pegels der 2f1-f2 DPOAE von bis zu 37,3 dB in der ipsilateralen Kochlea bei wachen Tieren bewirkt. Dabei unterscheidet sich die Art der Beeinflussung deutlich je nach verwendetem kontralateralem Stimulus. Die Stimulation mit artifiziellem Breitbandrauschen supprimiert den Emissionspegel über den gesamten getesteten Frequenzbereich um etwa 11,6 dB, während die verwendeten arteigenen Laute eine vergleichbare Beeinflussung des DPOAE-Pegels ausschließlich in einem Frequenzbereich zwischen 50 und 70 kHz bewirken. Im Frequenzbereich von 20 bis 30 kHz verursachen die arteigenen Laute nahezu keine Pegelabsenkung, was im deutlichen Kontrast zu den Ergebnissen unter KAS mit Breitbandrauschen steht. Unter Narkoseeinfluss konnte, unabhängig vom verwendeten Stimulus, keine Beeinflussung des DPOAE-Pegels festgestellt werden, was die Annahme bestätigt, dass die verwendete Ketamin-Xylazin-Narkose einen drastischen Einfluss auf den Hörprozess und insbesondere auf das efferente System nimmt. Die Ursache dafür, dass arteigene Stimuli anders verarbeitet werden als artifizielle Stimuli (wie z. B. Breitbandrauschen) konnte zwar nicht abschließend geklärt werden, aber die Vermutung liegt nahe, dass in diesem Verarbeitungsprozess höhere Zentren der Hörbahn involviert sind und selektiven Einfluss auf die ablaufenden Prozesse nehmen.
Die Etablierung des OAE-Residual-Messparadigmas auf der Basis der Methode von Keefe und Ling (1998) sollte die Möglichkeit bieten sowohl Reintöne als auch komplexe, arteigene Stimuli zu verwenden und so eine Erweiterung des herkömmlich verwendeten Messverfahrens darstellen. Über verschiedene Vorversuche unter Anwendung einer Zweitonreizung konnte gezeigt werden, dass die Ergebnisse des neu entwickelten Paradigmas mit denen der herkömmlichen DPOAE-Messungen hinsichtlich Reintonstimuli vergleichbar sind. Anhand der gewonnenen Ergebnisse mit einer Stimulation mit komplexen Signalen zeigen sich allerdings die Schwierigkeiten der neuen Methode. Die bisher erhobenen Daten zeigen keine klaren, reproduzierbare Ergebnisse, sollten aber die Grundbedingungen für die weiterführenden Versuche ebnen.
Reading is an essential ability to master everyday life in our society. The ability to read is based on specific connections between brain regions involved in the reading process – so-called cortical networks for reading. These cortical networks for reading allow us to learn the correct identification of visual words. The use of visual words is based on knowledge about the orthography (lexical) and the meaning of words (semantic). This knowledge must be acquired by beginning readers (first grader), i.e. beginning readers learn in a first step to link letters to a whole word and in a second step associate this whole word with meaning. To retrieve this knowledge during visual word recognition (VWR) a cortical network for lexical-semantic process must be activated. However, it is currently unclear whether beginning readers and reading experts activate the same neuronal network during VWR. Therefore, the aim of this thesis was to investigate the question whether beginning readers (first grader, children) and reading experts (adults) use different cortical networks for the lexical-semantic processing in VWR.
To address this question we recorded electroencephalographic (EEG) activity during VWR in children and adults. Children and adults were instructed to read a visualizable word to compare this word with a following picture stimulus. The first part of this thesis is concerned with the analysis of ERPs for visual word recognition in children and adults at sensor level. For both groups we observed the typical ERP components P100 and N170 for visual word recognition. These components differed in amplitude and time course between both groups. The second part of this thesis investigated the neuronal generators (brain areas) of ERPs during VWR and possible differences between children and adults at source level. We observed a high overlap in brain areas involved during VWR in children and adults. However, the brain areas differed in activation and time course between children and adults. Finally, the third and most important part of the thesis investigated the question whether children and adults use different cortical networks for the lexical-semantic processing in VWR over time. To address this question Dynamic Causal Modeling (DCM) and Bayesian model comparison were used. We compared nine biologically plausible cortical network models underlying the ventral lexical-semantic path in VWR. In addition, increasing time intervals were used to consider possible changes of network structure during VWR. The network models included eight brain regions (four bilateral pairs) involved in the lexical-semantic processing in VWR: occipital cortex (OC), temporo-occipital part of inferior temporal gyrus (ITG), temporal pole (TP), and inferior frontal gyrus (IFG). In almost all time intervals we found evidence that children and adults use the same cortical networks for the lexical-semantic processing in VWR. However, we found differences between adults and children in the connection strengths of the favoured model. Interestingly, we found a stronger direct connection from OC to IFG in adults compared to children.
In conclusion, our results suggest that children and adults activate largely the same lexical-semantic networks during VWR over time. This supports the notion that children and adults use the same biological fiber connections for VWR. However in contrast to children, adults showed increased use of the shortcut pathway from OC to IFG. The increased use of the shortcut pathway from OC to IFG in adults can be interpreted as consequence of learning. Learning causes in accordance with the Hebbian learning rule (“neurons that fire together, wire together” (Hebb, 1949)) synaptic change. Consequently the frequent coactivation of the input and output stage of OC and IFG during the lexical-semantic process facilitates the stronger direct connection between both brain areas. The stronger direct connection from OC to IFG most likely allows adult reading experts to speed up the lexical-semantic process during VWR. Accordingly, we conclude that the stronger direct connections from OC to IFG in adults compared to children underlay the different reading capabilities in both groups.
In der vorliegenden Studie wurde der modulierende Einfluss von Acetylcholin auf die Frequenzabstimmung der Neurone im primären Hörkortex untersucht. Im primären Hörkortex von betäubten Wüstenrennmäusen (Meriones unguiculatus) wurden Einzel- und Mehrzellableitungen in Elektrodenpenetrationen senkrecht zur Kortexoberfläche durchgeführt und die Antworteigenschaften der Neurone vor und während der iontophoretischen Applikation von Acetylcholin, dem Agonisten Carbachol bzw. dem muskarinischen Antagonisten Atropin gemessen. Bei rund der Hälfte der gemessenen Neurone konnte ein cholinerger Einfluss auf die Frequenz-Antwortbereiche gemessen werden. Dabei können sich die Frequenz-Antwortbereiche unter dem Einfluss von Acetylcholin sowohl vergrößern als auch verkleinern, so dass für die gesamte Neuronenpopulation keine signifikante gerichtete Veränderung auftrat. Bereits bei den niedrigsten verwendeten Dosen von Acetylcholin waren maximale Effekte zu beobachten. Cholinerge Einflüsse in Form von Veränderungen der Frequenz-Abstimmkurven von Neuronen konnten in allen kortikalen Schichten gemessen werden. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit werden die neuronalen Antworten auf repetitive Schallereignisse, d.h. einfache zeitliche Muster, beschrieben. Für die Versuche wurden drei unterschiedlich zeitlich strukturierte Reize ausgewählt. Es handelte sich um sinusamplituden-modulierte (SAM) Reize, sowie repetitive Ton- und Rauschpulse. SAM Reize und repetitive Tonpulse ähnelten sich in ihrem Frequenzgehalt. Die repetitiven Ton- und Rauschpulse wiesen ein identisches zeitliches Muster auf, das sich von SAM Reizen unterschied. Es wurden sowohl die Wiederholfrequenzen, als auch an der besten Wiederholfrequenz die Schalldruckpegel systematisch verändert. Zusätzlich erfolgte die iontophoretische Applikation von Bicucullin (BIC), um den möglichen Einfluss schneller GABAerger Inhibition zu ermitteln. Während die neuronale Aktivitätsrate mit höheren Wiederholfrequenzen annähernd konstant blieb, war die Stärke der zeitlichen Synchronisation der neuronalen Aktivität von der jeweiligen Wiederholfrequenz des repetitiven Reizes abhängig. Die zeitliche Synchronisation der neuronalen Aktivität sank in der Mehrheit der Neurone mit steigender Wiederholfrequenz drastisch ab (Tiefpasscharakteristik) und nur in einem Bruchteil der Neurone fanden sich einzelne Wiederholfrequenzen, die eine maximale Synchronisation auslösten (Bandpasscharakteristik). Die kortikalen Neurone zeigten unabhängig vom benutzten Reiztyp ein gutes neuronales Folgeverhalten auf repetitive Schallreize bis zu Wiederholfrequenzen von 15 – 30 Hz, mit besten Wiederholfrequenzen von 5 -10 Hz. Unter dem Einfluss von BIC war eine deutliche Veränderung der neuronalen Aktivitätsrate zu erkennen. Diese hatte jedoch weder einen Effekt auf die Synchronizität, noch auf die Repräsentation der Reiztypen. Eine einfache Inhibition im auditorischen Kortex fällt damit als Erklärung für die gemessenen neuronalen Aktivitätsmuster aus. In der realen Umwelt können komplexe akustische Reize in sehr unterschiedlichen Schallintensitäten auftreten. Die reizsynchronisierte neuronale Aktivität erlaubt, ein zeitliches Muster innerhalb eines komplexen Reizes zu kodieren. Es wurde untersucht, inwieweit diese zeitliche Kodierung von der Schallintensität abhängt und inwieweit schnelle GABAerge Inhibition darauf einwirkt. Es fand sich kein Zusammenhang zwischen der allgemeinen neuronalen Aktivitätsrate oder der neuronalen Synchronizität in Abhängigkeit vom Schalldruckpegel. Allerdings konnte bei verschiedenen Neuronenpopulationen ein unterschiedliches Verhalten in der Synchronisation mit höheren Schalldruckpegeln bei Stimulation der Neurone mit SAM Reizen und repetitiven Tonpulsen festgestellt werden, das im Hinblick auf die sich verändernde Flankensteilheit bei höheren Schalldruckpegeln und den daraus resultierenden veränderten Interstimulusintervallen diskutiert wird. Die Ergebnisse aus den Experimenten mit BIC und variierenden Schalldruckpegeln zeigten im Mittel keinen Einfluss der kortikalen Inhibition auf die Abhängigkeit der neuronalen Aktivitätsrate und der Synchronisation vom Schalldruckpegel. Allerdings fanden sich im Einzelfall Änderungen in der Synchronisation auf SAM Reize unter BIC. Insgesamt scheint der Einfluss der kortikalen Inhibition auf Veränderungen der neuronalen Antwort im Zusammenhang mit variierenden Schalldruckpegeln gering bzw. nicht vorhanden zu sein.
Die mittelamerikanische Jagdspinne Cupiennius salei Keys. zeigt nach Reizung ventraler Tasthaare auf den proximalen Beingliedern in freier Natur und auch im Labor das relativ einfache, reflektorische Verhalten des „Körperanhebens“. Ziel der vorliegenden Arbeit war, den am Körperanheben maßgeblich beteiligten Coxamuskel c2 hinsichtlich seiner Anatomie, seiner funktionellen Faserzusammensetzung und Innervation sowie seiner Aktivität beim „Körperanheben“ und bei weiteren Bewegungsweisen der Spinne zu untersuchen. (1) Der c2-Muskel liegt im Prosoma der Spinne und setzt für jedes Bein am anterioren Coxarand an. In den 1. - 3. Beinpaaren liegt c2 zweigeteilt (apodemaler und tergaler Anteil), im Hinterbeinpaar dagegen einteilig (nur tergaler Anteil) vor. (2) Histochemische Nachweisreaktionen (Glykogengehalt, relative Succinatdehydrogenase- und relative myofibrilläre Adenosintriphosphatase-Aktivität) ergeben eine heterogene Faserzusammensetzung des c2-Muskels aus 4 Muskelfasertypen (A, B, C, D). Der apodemale c2-Anteil besteht homogen aus A-Fasern. (3) Messungen mit Laserdiffraktometrie zeigen für die A- und B-Fasern signifikant kürzere Sarkomerlängen als für die C- und D-Fasern. (4) Sodium-Dodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese weist als Besonderheit für die A- und B-Fasern eine Paramyosin-Isoform P1 (107 kDa), eine Isoform der leichten Ketten des Myosins LC2 (22 kDa) und vermehrt eine Troponin-Isoform T4 (46 kDa) nach. In den Cund D-Fasern kommt allein eine 43-kDa-Bande und vermehrt eine Troponin-Isoform T2 (50 kDa) vor. (5) Der c2-Muskel der Vorder- und Hinterbeine wird durch einen eigenen Nerv innerviert. Retrograde Anfüllungen („Backfills“) des Nervs mit neuronalen Tracern legen eine polyneurale Innervation des c2-Muskels aller Beine dar, höchstwahrscheinlich jeweils durch 6 Motoneurone. Zwei davon sind jeweils positiv GABA (Gamma-Amino-Buttersäure) -immunreaktiv; dies ist ein Hinweis auf eine mögliche inhibitorische Innervation des c2-Muskels. (6) Wie Elektromyogramme freilaufender Spinnen zeigen, besteht das Körperanhebeverhalten aus zwei aufeinanderfolgenden Reaktionen: einer lokalen c2-Kontraktion im taktil gereizten Bein, die eine Bewegung im zugehörigen Prosoma-Coxa-Gelenk verursacht, und einer durch diese aktive Bewegung hervorgerufenen plurisegmentalen Reaktion im c2 der übrigen 7 Beine. Wird eine Coxa passiv bewegt, kann auch in festgelegten Spinnen eine plurisegmentale Reaktion aller 8 Beine ausgelöst werden. (7) Sowohl bei der lokalen als auch bei der plurisegmentalen Reaktion des „Körperanhebens“ rekrutiert c2 die gleichen neuromuskulären Einheiten. Dies deutet auf die gleiche zentalnervöse Endstrecke beider Reaktionen hin. Die Anzahl der elektrophysiologisch unterscheidbaren neuromuskulären Einheiten stimmt mit der der anatomisch nachgewiesenen Motoneuronen und Fasertypen überein. (8) Der tergale c2-Anteil ist immer, der apodemale Anteil nur bei schnellem Körperanheben, schnellen Laufstarts und bei Schreckreaktionen (Flucht) der Spinne aktiv. Hierbei rekrutiert der apodemale Teil nur zu Beginn der Verhaltensweise schnelle phasische Einheiten. (9) Ich diskutiere bei welchen Bewegungsweisen der Spinne die 4 Fasertypen vermeindlich zum Einsatz kommen, wie sie höchstwahrscheinlich innerviert werden und welche Konsequenzen die c2-Zweiteilung in den vorderen Beinpaaren (1 - 3) auf die Beinbewegung im Verhalten haben könnte. Am wahrscheinlichsten ist eine verstärkte Druckerhöhung zur Beinextension durch schnelle anfängliche Kontraktionen des „apodemalen Hebels“ und eine vektorielle Kräfteaddition der zwei Muskelteile. (10) Anhang II behandelt den internen Gelenkrezeptor R0 im Prosoma-Coxa-Gelenk. Ausschaltversuche weisen R0 als unentbehrlich für das Zustandekommen der plurisegmentalen Reaktion aus. Lage und Anordnung der R0-Sinneszellen sind in den Beinpaaren 1 - 3 und den Hinterbeinen verschieden.
Die Funktion der äußeren Haarsinneszellen geht weit über die normale Rezeptoreigenschaft der Kategorie Mechanorezeptor hinaus. Äußere Haarzellen mit ihrer reichhaltigen efferenten Innervierung sind nicht nur für die sensorische Aufnahme mechanischer Bewegung zuständig, sondern ermöglichen aufgrund ihrer motorischen Funktionen die mechanische Verstärkung der Wanderwelle in der Cochlea. Äußere Haarzellen sind eine maßgebliche Komponente des ´cochleären Verstärkers` und ihr Ausfall führt zur Schwerhörigkeit. Beiprodukte des cochleä-ren Verstärkers sind otoakustische Emissionen, deren Messung Aufschluss über aktive mechanische Prozesse im Innenohr gibt.
Die äußeren Haarsinneszellen bilden Synapsen mit dem olivo-cochleären efferenten System, welches im Zentrum der vorliegenden Untersuchung steht. Es vermittelt den Einfluss des Zentralnervensystems auf das Corti-Organ des Innenohrs. Über die akustische Reizung des olivo-cochleären Reflexbogens ist man in der Lage, das efferente System zu aktivieren und gleichzeitig die Antworteigenschaften der Cochlea zu verändern. Efferente Modulationen des cochleären Verstärkers können sich z. B. in einer Veränderung des Emissionspegels bemerk-bar machen. Die Fledermausspezies Carollia perspicillata ist aufgrund ihres Echoortungs-systems mit einem sehr sensitiven und hochauflösenden Hörvermögen ausgestattet und eignet sich hervorragend als Modelltier in der Hörforschung, insbesondere auch deshalb, da oto-akustische Emissionen sehr gut messbar sind.
Das efferente System von C. perspicillata wurde in dieser Untersuchung durch akustische Stimulation der kontralateralen Cochlea angeregt. Die Stimuli, die nicht nur in ihrem Pegel sondern auch in ihrer Bandbreite und in der Mittelfrequenz in Relation zu den ipsilateralen Stimulusfrequenzen variierten, beeinflussten dabei die Generierung der otoakustischen Emis-sionen (DPOAE, engl: distortion product otoacoustic emissions) im ipsilateralen Ohr: akustische Stimulation der kontralateralen Cochlea bewirkte zuverlässig eine Änderung der DPOAE- Amplitude im kontralateralen Ohr. Vor allem eine Suppression des cochleären Verstärkers in Form von DPOAE-Pegelverminderungen wurde beobachtet. Die supprimieren-den Effekte erreichten trotz leiser bis moderater kontralateraler Rauschpegel (bis maximal 54 dB SPL) Werte von bis zu 14, 17.1 und 13.9 dB SPL (bei f2 = 20, 40 und 60 kHz und effek-tivstem kontralateralen Rauschstimulus) und waren damit deutlich größer als in vorangegang-enen Studien an anderen Spezies. Die DPOAE-Pegelverminderungen waren positiv mit dem x Pegel der kontralateralen akustischen Stimulation, ebenso wie seiner Bandbreite und der Mittelfrequenzen in Relation zu den ipsilateralen Stimulusfrequenzen korreliert. Es gab keinen absoluten Frequenzbereich, in dem die efferenten Effekte am größten gewesen wären. Vielmehr traten maximale Effekte immer durch etwas oberhalb der ipsilateralen Stimulusfre-quenzen gelegene kontralaterale Rauschstimuli auf. Die Effekte waren auch abhängig von der Bandbreite des kontralateralen Rauschstimulus und maximal bei einer relativen Bandbreite von 1.5 Oktaven. Die Verschiebung des efferenten Effekts hin zu hohen Frequenzen und die Bandbreitenabhängigkeit sind vereinbar mit den anatomischen Eigenschaften der Projektio-nen der medialen olivo-cochleären Efferenzen in der Säugetiercochlea. Kontralaterale akusti-sche Reizung bewirkte auch eine Verschiebung der Wachstumsfunktionen der 2f1-f2 -DPOAE in einen unsensitiven Bereich und außerdem eine Verformung der Wachstumsfunktion. Bei-des könnte durch Beeinträchtigung des cochleären Verstärkers verursacht sein. Eine Beteili-gung des Mittelohrmuskels an den Effekten kann nahezu ausgeschlossen werden und die beobachteten Effekte sind höchstwahrscheinlich dem olivo-cochleären System zuzuschreiben.
Funktionell ist denkbar, dass bei C. perspicillata das mediale olivo-cochleäre System im Kontext einer Frequenzverschärfung bei der cochleären Verstärkung der Basilarmembranbe-wegung aktiv wird. Aus diesem Grund wurden ipsilateral sogenannte DPOAE-Suppressions- Abstimmkurven gemessen, welche die mechanische Abstimmschärfe im Innenohr beschrei-ben. Während und nach kontralateraler Reizung kam es zu Veränderungen der Abstimmkur-ven. Signifikante Effekte konnten allerdings nicht festgestellt werden, da die Veränderungen der Suppressions-Abstimmkurven variabel und schlecht kategorisierbar war.
Die vorliegenden Ergebnisse unterstützen weit verbreitete Hypothesen zur Funktion der medialen olivo-cochleären Effernzen in Bezug auf mechanische Suppression, Verbesserung des cochleären Signal-Rauschverhältnisses und einer generellen frequenzspezifischen Wirkung.
Die paravertebralen Grenzstränge entwickeln sich aus Neuralleistenzellen des Rumpf- und Lendenbereichs. Diese sammeln sich im Hühnerembryo an Embryonaltag 2,5-3 an der dorsalen Aorta und formen die primären sympathischen Ganglien. Die dorsale Aorta sezerniert Morphogene, welche einen Teil der Vorläuferzellen zur Differenzierung zu Neuroblasten anregt. Die sympathischen Neuroblasten sind, obgleich sie bereits neurale und noradrenerge Marker exprimieren, zur Zellteilung fähig. Sie unterscheiden sich darin von anderen Neuralleistenderivaten wie beispielsweise den Neuronen der parasympathischen Ziliarganglien und der sensorischen Hinterwurzelganglien. Schließlich wandern die primären sympathischen Ganglien weiter und bilden lateral zum Notochord die paravertebralen Grenzstränge (Rohrer, 2011).
Der Homöodomänen-Transkriptionsfaktor PROX1 wird im Laufe der Entwicklung höherer Vertebraten in vielen Geweben exprimiert. Welche Wirkung PROX1 dabei auf Überleben, Migration, Proliferation und Differenzierung hat, hängt davon ab, in welchem Zelltyp er aktiv ist (Dyer et al., 2003; Lavado et al., 2010). Im peripheren Nervensystem konnte PROX1 embryonal in den Hinterwurzelganglien und den sympathischen Ganglien nachgewiesen werden (Becker et al., 2009; Diplomarbeit Julia Holzmann, 2010). Zielsetzung dieser Dissertation war es, die Expression und die Funktion von PROX1 in sympathischen Ganglien von Hühnerembryonen zu analysieren.
Die Expressionsanalyse von PROX1 zeigte, dass der Anteil der PROX1-positiven Neurone an Embryonaltag 5 (E5) ein Maximum erreicht und danach im Laufe der Entwicklung stetig abnimmt. Dies gilt ebenso für die Population der proliferierenden Neuroblasten, welche ebenfalls im Laufe der Hühnerentwicklung erstmals detailliert untersucht wurde. Diese Korrelation führte zu der Vermutung, dass PROX1 hauptsächlich in proliferierenden Zellen exprimiert wird, welche anschließend experimentell bestätigt werden konnte. Die Population der PROX1-positiven und die der p27-negativen Neuroblasten haben in allen untersuchten Hamburger Hamilton-Stadien (HH-St 21-37) eine vergleichbare Größe. Dennoch ist PROX1 durchgehend in einem kleinen Teil der p27-positiven Neurone enthalten. Diese Population verändert sich im Laufe der Entwicklung kaum und das Fluoreszenzsignal eines oder beider Proteine ist bei doppelpositiven Zellen deutlich schwächer. Diese und andere Daten dieser Arbeit weisen darauf hin, dass es sich um Neuroblasten handelt, welche gerade aus dem Zellzyklus austreten. In postmitotischen Neuronen geht PROX1 verloren. Obwohl PROX1 in allen untersuchten HH-Stadien stark in der Population proliferierender Neurone exprimiert wird, zeichnet sich ab E7 eine kleinere Population von Neuroblasten in S-Phase ab, welche kein PROX1 enthalten.
Die Vorläuferzellen von Ziliarganglien werden, ähnlich wie die der sympathischen Ganglien, durch BMP-Proteine zur Differenzierung angeregt (Müller und Rohrer, 2002). Aufgrund der Ähnlichkeiten in der Entwicklung beider Neuralleistenderivate wurde die Expression von PROX1 in dieser Dissertation auch in Ziliarganglien untersucht: Der Transkriptionsfaktor wird dort nur an E4 und E5 vereinzelt in Neuronen exprimiert und nahezu gar nicht in Vorläuferzellen. In späteren HH-Stadien ist PROX1 in Ziliarganglien nicht mehr nachweisbar.
Ebenfalls konnte hier gezeigt werden, dass PROX1 in primären sympathischen Ganglien an E3 (HH-St 21) in Vorläuferzellen exprimiert wird, welche bereits begonnen haben, sich zu Neuroblasten zu differenzieren. Noch bevor die Differenzierung dieser Zellen jedoch abgeschlossen ist, wird PROX1 transient herunterreguliert. Die entstehenden Neuroblasten treten in dieser Phase kurzzeitig aus dem Zellzyklus aus. Da sich die Größe der p27-negativen und der PROX1-positiven Population auch an E3 stark ähnelt, kann man schließen, dass die Zellteilung in den Neuroblasten erst bei erneuter PROX1-Expression wieder aufgenommen wird. Ab E5 ist PROX1 fast ausschließlich in Neuroblasten nachweisbar.
Eine Funktionsanalyse von PROX1 unter Kulturbedingungen und im Hühnerembryo sollte durch Knockdown und Überexpression zeigen, welchen Einfluss der Transkriptionsfaktor auf die Proliferation der Neuroblasten nimmt. Die Manipulation der PROX1-Expression hatte in vitro einen proproliferativen Effekt. In vivo unterschieden sich Knockdown und Überexpression aber nicht von der Kontrolle.
Zusammenfassend wurde in dieser Doktorarbeit die Expression von PROX1 in sympathischen Ganglien von Hühnerembryonen im Detail analysiert. Der Transkriptionsfaktor ist sowohl in Vorläuferzellen als auch in Neuroblasten nur transient vorhanden. Zwar konnte eine klare Korrelation zwischen der Expression von PROX1 und der Proliferation der sympathischen Neuroblasten festgestellt werden, allerdings konnte eine Wirkung von PROX1 auf die Proliferation durch Funktionsanalysen nur teilweise bestätigt werden. Zusammen weisen die Daten darauf hin, dass PROX1 eine Rolle in der Feinregulation der Proliferation spielt.
The midbrain DA system comprising dopamine (DA) neurons of the substantia nigra (SN) and the ventral tegmental area (VTA) is involved in various brain functions, including voluntary movement and the encoding and prediction of behaviorally relevant stimuli. In Parkinsonʼs disease (PD), a progressive degeneration of particularly vulnerable SN DA neurons causes a progressive DA depletion of striatal projection sites. As a consequence, motor symptoms such as tremor, hypokinesia and rigidity appear once about 50 % to 70 % of SN DA neurons have been lost. Under physiological conditions, SN DA neurons can encode behaviorally salient events and coordinated movements through tonic and phasic activity and correlated striatal DA release. Burst-activity mediates a phasic, supralinear rise of striatal DA levels and allows to activate coordinated movements via modulation of corticostriatal signals.
In the present dissertation project, pathophysiological adaptations of surviving SN DA neurons after a partial degeneration of the nigrostiatal system have been studied using a 6-hydroxydopamine mouse model of PD. Combining in vivo retrograde tracing techniques with in vitro whole-cell patch-clamp recordings, multifluorescent immunolabeling and confocal microscopy allowed an unambiguous correlation of electrophysiological phenotypes, anatomical positions and neurochemical phenotypes of recorded neurons on a single-cell level. In vitro, neuronal activity of SN DA neurons is characterized by spontaneous, slow pacemaker activity of 1 to 10 Hz and a high degree of spike-timing precision. In vitro current-clamp recordings of surviving SN DA neurons using acute brain slice preparations after a partial, PD-like degeneration of the nigrostriatal DA system showed a significant perturbation of spontaneous pacemaker activity, mirrored by a decreased spike-timing precision compared to controls. Selective pharmacology and whole-cell voltage-clamp recordings served to identify calciumactivated SK channels as molecular effectors of a perturbated pacemaker activity of surviving SN DA neurons. SK channels and have been shown to critically contribute to the spike-timing precision of SN DA neurons. Consistently, in vitro current-clamp recordings after pharmacological blockade of SK channels in vitro caused a significant decrease of spike-timing precision, occluding previously observed differences between surviving SN DA neurons and controls.In addition to in vitro patch-clamp recordings, extracellular single-unit recordings in anaesthetized animals in vivo served to study surviving SN DA neurons embedded in an intact neuronal network after a partial, PD-like degeneration of the nigrostriatal DA system. Combining in vivo single-unit recordings, juxtacellular neurobiotin labeling and multifluorescent immunohistochemistry allowed to directly correlate electrophysiological and neurochemical phenotypes as well as anatomical positions on a single-cell level. In vivo, surviving SN DA neurons showed a significant decrease of spike-timing precision as reflected by an increased irregularity and an augmented burst activity compared to controls.
The present dissertation project provided a unique combination of a neurotoxicological PD mouse model, retrograde tracing techniques and in vitro as well as in vivo electrophysiologiy, allowing to unambiguously correlate electrophysiological adaptations, projection-specific anatomical positions and neurochemical phenotypes of SN DA neurons after a partial degeneration of the nigrostriatal system. Surviving SN DA neurons exhibited a significant deficit of SK channel activity after a partial degeneration of the nigrostriatal DA system. In consequence of a diminished SK channel activity observed in vitro, surviving SN DA neurons exhibited and enhanced burst activity in vivo, providing a plausible mechanism to compensate a striatal DA depletion.