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Im Forschungsgebiet der Proteomik hat sich die Massenspektrometrie als essenzielles Werkzeug etabliert. Zur Probengewinnung und deren Präparation für die chromatogra-phische Trennung und massenspektrometrische Analyse existieren eine Vielzahl von Protokollen, deren Verwendung jedoch unterschiedlichste Vor- und Nachteile mitbringt. Im Idealfall wäre ein solches Protokoll schnell und kostengünstig durchführbar, würde mit hoher Robustheit die Proteine aus den Ausgangszellmaterial quantitativ extrahieren und Probenverluste auf ein Minimum beschränken. Ziel dieser Arbeit war es, in einem strukturierten Ansatz sich diesem Ideal zu nähern und mögliche Kompatibilitaten mit anderen Methoden wie dem Arg-C analogen Proteinverdau zu untersuchen. Als Maß-stäbe dienen hierbei die aktuellen Standardprotokolle: die Acetonfällung der Proteine mit anschließender Solublisieung und das FASP-Protokoll, bei dem die zur Proteinpro-zessierung notwendigen Arbeitsschritte auf einer Größenausschlussmembran stattfinden. Dazu wurde zunächst das Adsorptionsverhalten von Proteinen auf den Silica-Oberflächen paramagnetischer Beads untersucht und dabei insbesondere der Einfluss von Chemikalien zur Zell-Lyse und den im Anschluss verwendeten Reduktions- und Alkylierungsreagenzien analysiert. Dabei wurde festgestellt, dass die Proteine aus dem Totalzelllysat sehr effektiv an die Silicaoberfläche binden und dass der Prozess der Re-duktion von Disulfidbrücken mit nachfolgender Carbamidomethylierung positiv zur Adsorption beiträgt und negative Einflüsse auf die Immobilisierung negieren kann. Dar-aus wurde ein Protokoll zur kombinierten Lyse, Aufreinigung, Modifikation und Proteo-lyse (abgekürzt: ABP) entwickelt. Parallel dazu konnte die Kompatibilität des Protokolls mit dem ArgC-analogen Verdau gezeigt werden und in der Folge konnte die Komple-mentarität der Methoden erfolgreich getestet werden. Mit frischen Zell-Lysaten wurde der Einfluss der Lysisreagentien unter Einschluss einer kommerziellen Variante ("Bug-buster" Lysis-Puffer) bestimmt und Harnstoff konnte als Mittel der Wahl definiert wer-den, da mit diesem höhere Identifikationszahlen erreicht wurden, lipophile Proteine vermehrt in der Probe erhalten blieben und größere Ionscores ermittelt werden konnten. Das Potential von ABP wurde im Direktvergleich mit FASP und dem Verdau in Lösung anhand eines humanen Proteoms genauestens untersucht, wobei eine konsequente Ver-besserung gegenüber beiden Methoden festgestellt werden konnte, insbesondere im Hinblick auf Praktikabilität und die Zahl der erforderlichen Arbeitsschritte, Reprodu-zierbarkeit und Zahl der identifizierten Peptide. Ein Bias des ABP zugunsten spezieller Proteineigenschaften konnte nach ausführlicher Analyse der identifizierten Proteine und Peptide nicht festgestellt werden. Eine vermehrt auftretende Oxidation von Methionin wurde identifiziert, allerdings zeigten sich keine negativen Auswirkungen auf die Pro-teinidentifizierungen. Zur Unterdrückung potentieller und unerwünschter Nebenpro-dukte in Form von Methylierungen, die als Folge des ursprünglichen ArgC-analogen Verdaus36 auftreten, wurde mit Verwendung von Acetonitril eine Alternative erfolg-reich getestet. Ein humanes Proteom wurde mittels des formulierten Protokolls sowohl tryptisch als auch mit ArgC-analogen Verdau (mit Acetonitril bzw. Methanol) analysiert. In diesem Zusammenhang wurde die Vollständigkeit der Modifikation der Lysine unter Verwendung von ACN mit zufriedenstellenden 99% bestätigt und die unerwünschte Carbamylierung der Aminosäure durch Harnstoff als Lysisreagenz konnte ausgeschlos-sen werden. Beide Ansätze zum ArgC-analogen Verdau erwiesen sich zudem gegenüber der tryptischen Variante als überlegen, was sich in einer Erhöhung der Identifikations-zahlen des humanen Proteoms widerspiegelt. Insbesondere wenig abundante Proteine, Histone und membranassoziierte Proteine bildeten den Großteil der zusätzlich identifi-zierten Proteine. Zusätzlich konnte eine günstigeres Fragmentierungsverhalten beobach-tet werden. Die effektiven Grenzen des ABP im Hinblick auf die erforderliche Protein-menge wurden untersucht und beschrieben. Der zu erwartende Zusammenhang zwi-schen abnehmender Proteinmenge und Identifikationszahlen niedrig abundanter Protei-ne wurde bestätigt und ein effektiver Grenzwert von 5µg Ausgangsmenge humanen Proteoms ermittelt. Abschließend wurden Dauer und Aufwand der Probenvorbereitung durch Etablierung paralleler Reduktion, Carbamidomethylierung und Propionylierung minimiert und damit zusätzlich Probenverluste reduziert. Die dadurch erreichte Erhö-hung der Identifikationszahlen ergab sich wiederum aus der höheren Repräsentanz nied-rig abundanter Proteine.
Im Rückblick ist es überraschend, dass die Verwendung der Adsorptionstendenzen von Proteinen bisher keine größere Rolle in der Probenvorbereitung proteomischer Analysen eingenommen hat. Die symbiotisch wirkende, aktive Denaturierung als Resultat der durchgeführten Derivatisierung zur Analysenpräparation macht die Adsorption auf Sili-ca-Oberflächen zum prädestinierten Mittel der Probengewinnung und schafft die Vo-raussetzung für die erreichte Verkürzung der Arbeitsabläufe und Verbesserung der Ergebnisse.
Top-down and bottom-up approaches are the general methods used to analyse proteomic samples today, however, the bottom-up approach has been dominant in the last decade. Establishing a bottom-up method involves not only the choice of adequate instruments and the optimisation of the experimental parameters, but also choosing the right experimental conditions and sample preparation steps. LC-ESI MS/MS has widely been used in this field due to its advanced automation. The primary objective of the present study was to establish a sensitive high-throughput nLC-MALDI MS/MS method for the identification and characterisation of proteins in biological samples. The method establishment included optimisation and validation of parameters such as the capillaries in the HPLC systems, gradient slopes, column temperature, spotting frequencies or the MS and MS/MS acquisition methods. The optimisation was performed using two HPLC-systems (Agilent 1100 series and Proxeon Easy nLC system), three spotters and the 4800 MALDI-TOF/TOF analyzer. Furthermore, samples preparation protocols were modified to fit to the established nLCMALDI- TOF/TOF-platform. The potentials of this method was demonstrated by the successful analysis of complex protein samples isolated from lipid particles, pre-adipocytes/adipocytes tissues, membrane proteins and proteins pulled-down from protein-proteins interaction studies. Despite the small amount of proteins in the lipid particles or oil bodies, and the challenges encountered in studying such proteins, 41(6 novel + 14 mammal specific + 21 visceral specific) proteins were added to the already existing proteins of the secretome of human subcutaneous (pre)adipocytes and 6 novel proteins localised in the yeast lipid particles. Protein-protein interaction studies present another area of application. Here the analytical challenges are mostly due to the loss of binding partner upon sample clean-up and to differentiate from non-specific background. Novel interaction partners for AF4•MLL and AF4 protein complex were identified. Furthermore, a novel sample protocol for the analysis of membrane proteins, based on the less specific protease, elastase, was established. Compared to trypsin, a higher sequence coverage and higher coverage of the transmembrane domains were achieved. The use of this enzyme in proteomics has been limited because of its non specific cleavage. However, from the results obtained in these studies, elastase was found to cleave preferentially at the C-terminal site of the amino acids AVLIST. The advantage of the established protocol over conventional protocols is that the same enzyme can be used for shaving of the soluble dormains of intact proteins in membranes and the digestion of the hydrophobic domain after solubilisation. Furthermore, the solvents used are compatible with the nLC-MALDI method setup. In addition, it was also shown that for less specific enzymes, a higher mass accuracy is required to reduce the rate of false positive identifications, since current search engines are not perfectly adapted for these types of enzymes. A brief statistical analysis of the MS/MS data obtained from the LC-MALDI TOF/TOF system showed that for less specific enzymes, under high-energy collision conditions, approximately 43 % of the fragment ions could not be matched to the known y- b type ions and their resultant internal fragments. This limitation greatly influenced the search results. However, this limitation can be overcome by modifying the N-terminal amino acids with basic moieties such as TMT. The use of elastase as a digestion enzyme in proteomic workflow further increased the complexity of the sample. Therefore, orthogonal multidimensional separation was necessary. Offgel-IEF was used as the separation technique for the first dimension. Here peptides are separated according to the pI. However, the acquired samples could not be loaded to the nLC due to the high viscosity of the concentrated samples when using the standard protocol. In order to achieve compatibility of the Offgel-IEF to the nLC-MALDI-TOF/TOF-platform, the separation protocol of the Offgel-IEF was modified by omitting the glycerol, which was the cause of the viscous solution. The novel glycerol free protocol is advantageous over the conventional method because the samples could directly be picked-up and loaded onto the pre-column without resulting in an increase in back pressure or a subsequent pre-column clogging. The glycerol free protocol was then assessed using purple membrane and membrane fraction of C. glutamicum. The results obtained were comparable to those applied in published reports. Therefore, the absence of glycerol did not affect the separation efficiency of the Offgel-IEF. In addition the applicability of elastase and the glycerol free Offgel-IEF for quantitation of membrane proteins was assessed. Most of the unique peptides identified were in the acidic region and 85 % were focused only into one fraction and approximately 95 % in only two fractions. These results are in accordance with previously published results (Lengqvist et al., 2007). When compared with theoretical digests of the proteins identified in this study, it can be concluded that basic moiety (TMT) on the peptide backbone, did not affect the separation efficiency of the Offgel-IEF. In an applied study, changes in the protein content of yeast strain grown in two different media were relatively quantified. For example, prominent proteins, such as the hexose tranporter proteins responsible for transporting glucose accross the membrane, were successfully quantified. Last but not least, the nLC-MALDI-TOF/TOF platform also served as a basis for the development of a high-throughput method for the identification of protein phosphorylation. The establishment of such a method using MALDI has been challenging due to the lack of sensitive matrices, such as CHCA for non-modified peptides, which exhibit a homogenous crystallisation and thus yield stable signal intensity over a long period of time in an automated setup. The first step of this method was the establishment of a matrix/matrix mixture with better crystal morphology and higher analyte signal intensity than the matrix of choice, i.e. DHB. From MS and MS/MS measurements of standard phosphopeptides, a combination of FCCA and CHAC in a 3:1 ratio and 3 mM NH4H2PO4 facilitated high analyte signal intensities and good fragmentation behaviour. Combining a custom-packed biphasic column for the enrichment of phosphopeptides, the applicability of the matrix mixture was assessed in anautomated phosphopeptide analysis using standard phosphopeptides spiked to a 20-fold excess BSA digest. These analyses showed that this method is reproducibile and both flow throughs can be analysed. Applying the method to the analysis of 2 standard phosphoproteins, alpha/beta-casein, and a leukemia related protein, ENL, 13 phosphopeptides from both alpha/beta-Casein and 13 phosphopeptides with 6 phosphorylation sites from the ENL were identified. As a general conclusion, it can be stated that the nLC-MALDI-TOF/TOF method established here in various modifications for different analytical purposes is a robust platform for proteomic analyses.
Diese Dissertation befasst sich mit der massenspektrometrischen Analytik von Membranproteinen. Diese gestaltet sich aufgrund der hydrophoben Natur der Proteine und der damit verbundenen schlechten Löslichkeit in wässrigen Puffersystemen als deutlich schwieriger als die Untersuchung löslicher Proteine. Einige weitere Probleme entstehen durch die konsequente Verwendung der Referenzprotease Trypsin zur Hydrolyse der Proteine. Sie spaltet ausschließlich Peptidbindungen nach basischen Aminosäuren, die naturgemäß in den unpolaren Helixbereichen der Membranproteine nur vereinzelt anzutreffen sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurden auf weniger spezifischen Proteasen basierende Protokolle zur Analyse von ganzen Membranproteomen entwickelt, welche einige der ursprünglichen Probleme umgehen oder zumindest vermindern. Die Proteolysereaktion fand in Anwesenheit von Methanol statt, welcher die Membranstruktur destabilisiert und so die Zugänglichkeit der in die Membran eingebetteten Proteinteile für das Enzym erhöht. Zusätzlich erhöhte sich dadurch die Löslichkeit gebildeter hydrophober Peptide im Puffer. Das neue Protokoll wurde an Bacteriorhodopsin, einem geläufigen Modellsystem für α helikale Membranproteine, erfolgreich etabliert. Bei Verwendung der Proteasen Elastase und Pepsin konnten nach nLC-Trennung und MALDI-MS/MS deutlich mehr Peptide des Membranproteins signifikant identifiziert werden, als es mit Trypsin möglich gewesen ist. Auch qualitativ ergaben sich Unterschiede zwischen beiden Enzymen. Mit den alternativen Enzymen ließen sich nicht nur die hydrophilen peripheren Proteinabschnitte nachweisen, sondern auch zahlreiche Peptide aus den hydrophoben Transmembranbereichen. Das am Modellprotein etablierte Elastase-Protokoll konnte problemlos auf die Analyse des komplexeren Membranproteoms von Corynebacterium glutamicum transferiert werden. So konnten ca. 150 verschiedene Proteine identifiziert werden, darunter auch zahlreiche Membranproteine. Die erzeugten Peptidmischungen wurden nicht nur mittels nLC-MALDI-TOF/TOF sondern auch mit einer nLC-ESI-Orbitrap-Plattform analysiert. Anhand einer detaillierten Analyse der physikochemischen Eigenschaften der entstandenen Peptide konnte gezeigt werden, dass der dabei beobachtete Vorteil des ESI-Instrumentes zu großen Teilen auf die bessere Detektion aliphatischer Neutralpeptide zurückzuführen war. Diese werden bei der MALDI vornehmlich aufgrund der schlechteren Ionisation bei Verwendung der Standardmatrix α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure diskriminiert. Ein weiterer Vorteil des verwendeten ESI-Gerätes ist seine bessere Massengenauigkeit durch den hochauflösenden Orbitrap-Massenanlysator. Wurden die MALDI-TOF/TOF-Fragmentierungsdaten durch, auf einem zweiten Instrument gemessene, genaue MALDI-Orbitrap-Vorläufermassen supplementiert, konnten über 30% mehr Peptide signifikant identifiziert werden. Die gesammelten Daten konnten zur Erhebung einiger Statistiken über Elastase und Pepsin herangezogen werden. Erstmals wurde eine umfassende Untersuchung der Spaltspezifität von Elastase vorgenommen. Das Enzym hydrolysiert in ca. 82% der Fälle nach den kleinen hydrophoben Aminosäuren Ala, Val, Ile, Leu, Ser und Thr. Diese Spezifität ist für proteolytische Schnitte innerhalb der hydrophoben Helixbereiche von Membranproteinen äußerst vorteilhaft. Sie reicht aus, um Peptide Mass Fingerprinting an Einzelproteinen durchzuführen, wie exemplarisch am Modellprotein Bacteriorhodopsin gezeigt wurde. Die für Pepsin erhaltene Spezifität ist hingegen zu undifferenziert für solche Experimente, weshalb hier MS/MS-basierte Strategien vorzuziehen sind. Weitergehende Verbesserungen für Datenbanksuchen mit weniger spezifischen Proteasen wurden vorgeschlagen. Hierzu wurde erstmals eine größere Fragmentierungsstatistik eines nichttryptischen Datensatzes auf einem MALDI-Instrument erstellt, deren Aussage zur Verifizierung von Suchergebnissen in die Algorithmen implementiert werden kann. Beim Einsatz weniger spezifischer Proteasen erhöht sich im Vergleich zu Trypsin die entstehende Peptidkomplexität. Zur Kompensation dessen wurde eine Fraktionierung mittels Off-gel IEF vor der nLC-MALDI-Analyse etabliert. Zwecks direkter Kompatibilität zur nLC wurde ein Off-gel IEF-Protokoll ohne die Probeninjektion störendes Glycerol entwickelt. So ließ sich die dreifache Menge an Peptiden nachweisen, als mit ausschließlich eindimensionaler nLC-Trennung. In Verbindung mit den durch Trypsin erzielbaren Resultaten lassen sich mit den weniger spezifischen Enzymen viele Membranproteine umfassender charakterisieren, da zusätzlich die hydrophoben Transmembranbereiche und somit mehr Informationen für die Analytik zugänglich sind. Der gezielte Einsatz von alternativen Enzymen verbessert die momentane Situation in der Membranproteom-Analytik deutlich und führt diese einen weiteren Schritt an die Analytik löslicher Proteine heran.
Als Teil der Atmungskette des hyperthermophilen Bakteriums Aquifex aeolicus besteht die NADH:Ubichinon-Oxidoreduktase aus 13 Untereinheiten, die durch 24 unterschiedliche Gene codiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde für den massenspektrometrischen Nachweis dieser Untereinheiten nach der Aufreinigung des Komplexes eine SDS-PAGE durchgeführt, an die sich eine tryptische Proteolyse und eine Messung per MALDI MS und MS/MS anschlossen. Mit dieser analytischen Strategie war es möglich, jede nicht-homologe Untereinheit nachzuweisen und 20 von 24 genombasierten Isoformen eindeutig zu identifizieren. Selbst kleine bzw. sehr hydrophobe Untereinheiten mit vielen Transmembranhelices konnten mit Hilfe dieser Methode analysiert werden. Die hohe Anzahl an präsenten, unterschiedlichen Isoformen und die vorherrschenden Verunreinigungen durch Fremdproteine (z.B. ATP-Synthase) könnten Indizien dafür sein, dass bis jetzt keine hinreichend stabile und reproduzierbare Enzympräparation gelungen ist, um eine Kristallstrukturanalyse durchzuführen. Im Allgemeinen kann der Ablauf eines solchen Proteomics-Experiments in drei Teile gegliedert werden: die Auftrennung eines Protein- oder Peptidgemischs zur Verringerung der Probenkomplexität, die Identifikation des Proteins per Massenspektrometrie und die damit verbundene bioinformatische Datenanalyse. Neben chromatographischen Methoden ist die Elektrophorese in Polyacrylamidgelen immer noch das am häufigsten angewandte Trennverfahren im Proteomics-Bereich. Vor der MS-Messung werden die aufgetrennten Proteine in der Regel direkt in der Gelmatrix verdaut. Die Qualität der Ergebnisse wird stark durch Proteinmenge und die auftretenden Probenverluste beeinflusst. Diese werden beispielsweise durch eine unzureichende Peptidextraktion aus dem Gel hervorgerufen. Im Rahmen dieser Dissertation wurde ein neues Gelsystem entwickelt, dass vor allem für die Proteolyseeffizienz, die Peptidextraktion und somit auch für die anschließende massenspektrometrische Messung von Vorteil ist. Das Monomer Acrylamid wird hierzu mit den beiden Quervernetzern N,N-Methylenbisacrylamid (MBA) und Ethylenglykoldiacrylat (EDA) polymerisiert. Es entsteht ein Gel, dessen Poren durch die basische Hydrolyse der Esterbindungen des EDAs vergrößert werden können, ohne die dreidimensionale Grundstruktur des Gels zu zerstören.   Die gemischten Gele mit MBA und EDA als Crosslinkern sind sowohl für Tris-Glycin- als auch Tris-Tricin-Puffersysteme einsetzbar. Die Evaluierung der Daten erfolgte meist gegen ein Standardgel mit T= 14% und C= 2,6%. Durch eine experimentell ermittelte Anpassung der Mischgele auf T+10% und C+45% mit einem MBA/EDA-Verhältnis von 0,5 verhalten sich die beiden Gelsysteme empirisch gleich und zeigen eine übereinstimmende elektrophoretische Trennung und Auflösung. Es gibt keine wesentlichen Nachteile in Bezug auf die Handhabung, die elektrophoretische Trennung und die anschließenden Analysen und Techniken, solange diese in sauren bis leicht basischen pH-Bereichen durchgeführt werden. So wurde das gemischte Gelsystem sowohl bei einer 2D IEF/SDS-PAGE als auch bei einem Western Blot-Experiment angewendet und für vollständig kompatibel befunden. Die gemessenen MS-Daten profitieren im Fall von Trypsin und Elastase erheblich von der besseren Zugänglichkeit des Enzyms zum Substratprotein und der verbesserten Peptidextraktion. Die Gelaufweitung führt zu signifikant besseren Ergebnissen, die größtenteils auf höhere S/N-Werte zurückzuführen sind. Die Signalintensitäten der Peptide sind um den Faktor 5 besser als die des Referenzgels. Der Nachweis von je 1 pmol der Proteine BSA, Serotransferrin und Alkoholdehydrogenase profitiert stark von den zusätzlich erhaltenen Daten, da die Zunahme an identifizierten Peptiden bei der PMF-Suche im Bereich von 40 bis 80% liegt. Auch bei geringen Proteinmengen wie 250 bzw. 50 fmol BSA ist die Anzahl der zugeordneten Signale um den Faktor 2-3 besser. Der in-Gel Verdau von 1 pmol Bacteriorhodopsin mit Elastase zeigt ebenfalls einen Anstieg der Peptidsignale um 60% im Vergleich zum Referenzgel. Da die Proteine im Gel alle mit kolloidalem Coomassie Brilliant Blue angefärbt wurden, kann davon ausgegangen werden, dass sich die guten MS-Ergebnisse auf jede mit diesem Farbstoff visualisierte Probe übertragen lassen. Für den Fluoreszenzfarbstoff RuPBS trifft dies ebenso zu, insgesamt wurden aber weniger Peptide als bei kolloidaler Coomassie Brilliant Blue-Färbung detektiert. Dementsprechend handelt es sich bei Acrylamidgelen mit MBA/EDA-Vernetzung um ein vielversprechendes alternatives Gelsystem, dass auf eine Vielzahl anderer Methoden angewendet werden kann.
Im Rahmen der Arbeit wurde eine Methodik zur umfassenden und automatischen Identifizierung von nativen Peptiden aus Extrakten komplexer biologischer Quellen entwickelt und am Beispiel des humanen Hämofiltrats angewendet. Die Firma BioVisioN führt seit der Gründung Forschung auf dem Gebiet der Peptide und kleinen Proteine mit dem Ziel, diagnostisch und therapeutisch relevante Substanzen zu finden, durch. Die Analyse sogenannter Peptidome, der qualitativen und quantitativen Beschreibung aller nativen Peptide und kleinen Proteinen bis ca. 15 kDa, ist als Analogon zur Proteom-Analytik zu verstehen, welche sich umfassend mit Proteinen beschäftigt. Quantitativ wird ein Peptidom über die Kombination chromatographischer Trennung und Fraktionierung mit der massenspektrometrischen „Inventarisierung“ der einzelnen Peptidspezies sowie den relativen Konzentrationen in der Probe erfasst, welches an anderer Stelle ausführlich beschrieben ist. Das Ergebnis einer solchen Peptidomanalyse besteht aus einer Peptidkarte, die die Peptide der Probe repräsentativ abbildet. Die Qualität eines Peptidoms wird über die Massen der Peptide, deren Aminosäuresequenzen und Elutionsverhalten und weitere biologische Informationen beschrieben. Zu diesen Zweck wird der Begriff des Peptide-Inventory eingeführt. Ein Inventory besteht aus allen verfügbaren Informationen nativer Peptide einer Quelle. Zu Beginn der Arbeit standen mit der reproduzierbaren Erstellung von Peptidbanken und deren systematischer Kartierung über MALDI-MS bereits zwei Werkzeuge zur Verfügung, um Daten eines Inventories zu erheben. Lediglich für die Erzeugung der Sequenzdaten wurde mit dem Edman-Abbau zwar eine etablierte, aber viel zu langsame und wenig sensitive Methode eingesetzt. Hier wurde der Ersatz durch eine schnelle und leicht zu automatisierenden Methode angestrebt. Die massenspektrometrische Sequenzierung über MS/MS mit anschließender Datenbanksuche ist ein aus der Proteom-Analytik durchaus bekanntes Verfahren, musste aber für die Analyse der nativen Peptide in einigen Bereichen modifiziert werden. Obwohl die Massenspektrometrie Peptide direkt aus komplexen Mischungen heraus identifizieren kann, stellte sich schnell heraus, dass die vorliegende biologische Beispielprobe (humanes Blutfiltrat) zu komplex war, um sie direkt für die geplante Sequenzierung einzusetzen. Es wurde eine erneute Auftrennung und Feinkartierung der Peptidbank notwendig. Jede dritte Fraktion wurde rechromatographiert und anschließend wiederum kartiert. Die entstandenen 97 Peptidkarten enthalten im Linear Modus ca. 100.000 Signale und im Reflektron Modus ca. 30.000 Signale, so dass nach der Feinkartierung > 10.000 native, im menschlichen Körper zirkulierende Peptide durch diese Methode dargestellt werden können. Zur Automatisierung der Kartierungsmessungen mit MALDI-MS wurde im Laufe dieser Arbeit ein Autosampler für ein MALDI-TOF-MS-System entwickelt und implementiert (DiskJockey). Das System hat eine Kapazität von 20 MALDI-Targets und ist vollständig über die Gerätesoftware steuerbar, so dass MALDI-MS-Messungen vollständig automatisiert über mehrere Tage ablaufen können. Zur Erzeugung der Sequenzdaten wurde eine Kombination aus elektrischer Ionenfalle und Datenbanksuche angewendet. Um zu gewährleisten, dass nur die zuvor kartierten Peptide einer MS/MS-Messung unterzogen werden, wurde das Softwaretool Alcatrap entwickelt. Diese Software übernimmt aus MALDI-MS-Messungen die Werte der monoisotopischen Peaks, überführt sie in mehrfach geladene Spezies und erstellt sowohl eine Methode für das MS-Gerät, als auch eine in die Gerätesoftware importierbare Arbeitsliste. Hierbei wird jeweils die Kollisionsenergie in Abhängigkeit der m/z-Wertes dynamisch gesetzt. Um den Datentransfer vom Fragmentspektrum zur Datenbanksuchmaschine zu gewährleisten, wurde mit „D2M“ eine weitere Softwareschnittstelle entwickelt. Die Erstellung des Inventories aus humanem Hämofiltrat liefert 1.225 verschiedene native, im menschlichen Blut zirkulierende Peptide aus 146 Proteinvorläufern. Darunter befinden sich mehrere Peptide, die neben ihrer physiologischen Bedeutung auch eine potenzielle medizinische Relevanz besitzen. Weiterhin ist auch der dynamische Bereich von acht Größenordnungen, in dem Sequenzen erzeugt wurden, vergleichbar mit dem des menschlichen Blutes. Eine Charakterisierung von Peptidomen ist in diesem Umfang bisher noch nicht durchgeführt worden und stellt eine Neuerung in der Proteomforschung dar. Die Studie ist durchaus vergleichbar mit kürzlich veröffentlichten umfangreichen Proteomstudien aus menschlichem Plasma und Serum und stellt eine Ergänzung dieser für den Bereich der Peptide und kleinen Proteine dar. Limitierungen bei der Identifizierung von Peptiden mit der Ionenfalle wurden analysiert und mit der Adaptierung des Peptide-Inventory Konzepts auf hochauflösende Quadrupol-Time-of-Flight Massenspektrometer zufriedenstellend gelöst. In diesem Rahmen wurde eine Methode entwickelt, die es ermöglicht, native Peptide bis zu einem Molekulargewicht von bis zu 8.500 Da direkt aus der komplexen Mischung zu fragmentieren und über eine Datenbanksuche zu identifizieren. Außerdem konnte exemplarisch gezeigt werden, dass durch die größere Massengenauigkeit und das größere Auflösungsvermögen des QTOF die Datenbanksuche wesentlich effektiver ist und durch die Kombination von Rechromatographie und QTOF-MS/MS nahezu jedes Signal einer Peptidbank der Identifizierung zugänlich gemacht werden kann. Sowohl die integrierte Methodik der Herstellung eines Peptide-Inventories, als auch die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse von nativen Peptiden in humanem Blut stellen wissenschaftliche Neuerungen dar, auf denen eine weitergehende Peptidom-Analytik aufsetzen kann.
Die Analyse der Phosphorylierung mittels Massenspektrometrie stellt in vielerlei Hinsicht große Anforderungen an die Analysenmethoden, die eingesetzt werden. Durch die substöchiometrische Modifzierung einer Aminosäure mit einem Phosphatrest ist die grundlegende Herausforderung der Sensitivtät an anzuwendende Analysetechniken gegeben. Die Biomassenspektrometrie hat mit den weichen Ionisierungmethoden ESI und MALDI zwar die Techniken zur Verfügung gestellt, die eine routinemäßige Identifzierung von vorher per MS nicht zugänglichen Proteinen über die Untersuchung der enzymatischen Spaltpeptides ermöglicht, gleichwohl ist der Aufwand, der für die massenspektrometrische Charakterisierung eines bestimmten Proteins besteht, um ein vielfaches höher. Wegen des in vivo variablen und potentiell sehr geringen Phosphorylierungsgrades ist die genaue Identifizierung der Phosphorylierungstelle allein durch das Vermessen der Probe in einem modernen Massenspektrometer nicht zu bewerkstelligen. Die sich in der Probe befindlichen Phosphopeptide stehen nach einem Verdau des entsprechenden Proteins einer mengenmäßig großen Zahl unphosphorylierter Peptide gegenüber. Auch die hohe Sensitivität von modernen Massenspektrometern reicht in der Regel nicht aus, um das entsprechende Phosphopeptid zu analysieren. Soll die exakte Phosphorylierungstelle des untersuchten Phosphopeptids bestimmt werden, so müssen ausreichende Mengen an Analyten für eine MS/MS-Analyse generiert werden. Bei realen Proben kann der Phosphorlyierungsgrad nicht erhöht werden, somit ist auch die Menge an vorhandenen Phosphopeptiden begrenzt. Somit kommt man an eine Anreicherung von Phosphopeptiden bzw. Abreicherung von unmodifzierten Peptiden nicht vorbei. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Anreicherungstechniken für Phosphopeptide hinsichtlich ihrer Sensitivität und Spezifität untersucht. Hierfür wurden verschiedene Affinitätstechniken (Graphit, IMAC und TiO¬¬2) hinsichtlich Empfindlichkeit und Selektivität untersucht. Von diesen drei Methoden zeigte sich Graphit aufgrund zu geringer Wechselwirkung zwischen Analyt und Medium als ungeeigneteste Methode. IMAC zeigt bei verbesserter Sensitvität eine höhere Spezifität, gleichwohl saure Peptide nicht von Phosphopeptiden zu trennen sind. Von den drei genannten Methoden zeigte TiO¬¬2 die höchste Sensitivität und Selektivität. Da das TiO¬¬2 als Goldstandard in der Anreicherung von Phosphopeptiden angesehen wird, sollte im Rahmen dieser Dissertation eine neuartige Methode entwickelt werden, die dieser Technik sowohl im Hinblick auf Spezifität und Selektivität überlegen sein sollte. Im Rahmen dieser Arbeit wurden MALDI-Probenteller erstmals mit Hilfe von SAMs (Self Assembled Monolayers) mit Phosphonatgruppen modifiziert, aus denen durch Beladen mit vierwertigem Zirkonium eine neue funktionelle Oberfläche für die Anreicherung von Phoshopeptiden hergestellt werden kann, die der Titandioxid-Methode überlegen ist. Anhand von reproduzierbaren Modellsystemen von bekannten Phosphoproteinverdaus (z.B. Ovalbumin) konnte gezeigt werden, dass diese neue Technik Analyten im niedrigen Femtomol-Bereich auch vor einem großen nicht-phosphorlyierten Hintegrund selektiv anreichern kann. Um zu demonstrieren, dass die Phosphonat-Oberfläche auch bei realen Proben die massenspektrometrische Phosphorylierungsanalyse ermöglicht, wurden in der vorliegenden Arbeit zum einen die Mitogen Activated Protein Kinase 1 (MAPK-1) aus einem in-Lösungs-Verdau und das Heat Shock Protein (HSP), welches aus einem 2-D-Gel stammt, untersucht. Mit der neu etablierten Phosphonat-Oberfäche konnten die Phosphopeptide aus den Proben angereichert und mittels MALDI-MS/MS die Phosphatgruppe eindeutig der modifizierten Aminosäure zugeordnet werden. Neben dem Komplex der Anreicherungstechniken wurden im Rahmen dieser Dissertation noch andere relevante Fragestellungen für die Phosphoproteomanalytik untersucht. So konnte gezeigt werden, dass für phosphorylierte Peptide keine Suppression der Signale im MALDI-Gerät stattfindet, was eine noch weit verbreitete Meinung in vielen Arbeitsgruppen ist. Auch Versuche zur MALDI-Matrix und deren Kombination mit der Säurekomponente wurden durchgeführt. Es stellte sich heraus, dass es neben DHB in Kombination mit Phosphorsäure momentan keine bessere Matrix-Kombination gibt. Im Hinblick auf die Quantifizierung der Phosphorlyierung eines Proteins konnte exemplarisch am Ovalbumin als Modellsystem eine einfache und valide Quantifizierungsmethode mit Hilfe der Dephosphorylierung entwickelt werden, die nicht die Nachteile von sonst häufig eingesetzten Derivatisierungsreagenzien besitzt.