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Untersuchung von long non-coding RNA im Entzündungsmodell mit mesenchymalen Stamm-/Stromazellen
(2022)
Entzündungsprozesse sind essentiell zur Abwehr exogener und endogener Pathogene sowie bei der Geweberegeneration. Ihre Dysregulation ist an unzähligen Krankheitsprozessen beteiligt. Die Auslösung einer Entzündung ist besonders gut untersucht bei Toll-like Rezeptoren, die Strukturen von Mikroorganismen erkennen können und durch Signalkaskaden beispielsweise ΝF-κB aktivieren. LncRNAs regulieren die Genexpression und wurden dabei bereits im Rahmen von Entwicklung, Proliferation, Karzinogenese und Entzündung nachgewiesen. ASC sind für die regenerative Medizin aufgrund ihrer einfachen Gewinnung und ihrer Differenzierbarkeit höchst interessant. Zudem haben sie einen Einfluss auf inflammatorische Prozesse. Daher könnte es relevant sein, welche Rolle lncRNAs während Entzündungsprozessen bei ASC spielen. Daraus könnten sich auch potentielle Ansätze für Diagnostik und Therapie entwickeln.
Es wurde ein Entzündungsmodell mit ASC etabliert, welche mit Bakterientoxinen stimuliert wurden. Das Modell wurde mit einem im nephrologischen Labor etablierten Modell mit renalen Epithelzellen hinsichtlich der Entzündungsantwort verglichen. Diese Entzündungsantwort wurde anhand der Zytokinproduktion auf mRNA- und Proteinebene quantifiziert. Anschließend erfolgte eine RNA-Sequenzierung und Vergleich der RNA bei stimulierten und nicht-stimulierten ASC. Die detektierten veränderten lncRNAs wurden mittels qPCR validiert. Zuletzt wurde durch knockdown einer ausgewählten lncRNA versucht, Einfluss auf die Entzündungsprozesse zu nehmen.
Die vorgelegte Arbeit zeigt deutlich, dass ASC eine stärkere Entzündungsantwort als renale Epithelzellen zeigen. Als Mittelweg aus maximaler Entzündungsantwort und realistischen Stimulationsbedingungen wurde eine Stimulation mit 10 ng/ml LPS für 4 h gewählt. Nach der RNA-Sequenzierung zeigte die funktionelle Analyse der veränderten codierenden RNA Hinweise auf Entzündungsprozesse, Zellmigration, Chemotaxis, Differenzierung, Proliferation sowie Alkoholismus, Atherosklerose, Diabetes mellitus und Insulinresistenz. Diese Ergebnisse lassen sich mit dem aktuellen Stand der Forschung in Einklang bringen und legen die Bedeutung von Entzündung und ASC in diesen Bereichen dar. Bei den lncRNAs ergab die Sequenzierung insgesamt 48 expressionsveränderte Transkripte, H19 konnte hierbei erfolgreich validiert werden. Diese lncRNA war im Rahmen der LPS-induzierten Entzündung expressionsvermindert. Aufgrund donorspezifischer Einflussfaktoren auf die Genexpression bei ASC wie Körpergewicht und Morbidität sowie allgemeiner interindividueller Schwankung der Expression von lncRNA sind aber weitere Untersuchungen zur Detektion relevanter lncRNAs erforderlich. Die Transfektionsversuche zeigten Hinweise darauf, dass der H19-knockdown möglicherweise die LPS-vermittelte Entzündungsantwort bei ASC verstärkt.
Zusammenfassend wurde ein Modell zur Untersuchung von lncRNA bei LPS-induzierter Inflammation in ASC etabliert sowie im Rahmen dessen H19 als relevante lncRNA detektiert, die den Ausgangspunkt für weitere Forschung darstellt.
Die Relevanz von MSC aus Fettgewebe (ASC) in der regenerativen Medizin überrascht in Anbetracht ihrer breit gefächerten Eigenschaften nicht. Neben antiinflammatorischen Eigenschaften und Hypoxieresistenz können sie in eine Vielzahl von Geweben differenzieren und in geschädigtes Gewebe migrieren, wo sie an Reperaturvorgängen beteiligt sind. Dabei stehen unterschiedliche Quellen zur Isolierung von MSC (und ASC) zur Verfügung. Um ASC therapeutisch einsetzen zu können, ist es essentiell ihre Quellen und ihr Potenzial zu erforschen. Es konnte gezeigt werden, dass perirenales Fettgewebe eine geeignete Quelle für ASC (prASC) darstellt. Der Nachweis der Oberflächenantigene CD73, CD90 und CD105 mittels Durchflusszytometrie sowie die Fähigkeit der prASC an Zellkulturplastik zu adhärieren, erlauben die Schlussfolgerung, dass es sich bei den nach einem bereits etablierten Verfahren isolierten Zellen um MSC handelt. Außerdem konnte durch eine zweiwöchige Kultivierung der prASC in supplementierten Medien die Differenzierung in Adipozyten, Chondrozyten sowie Osteozyten induziert werden. Der Nachweis erfolgte durch cytochemische Färbemethoden. In dieser Arbeit wurde die Differenzierung von prASC in Epithelzellen untersucht. Dafür wurden die Zellen in unterschiedlichen ATRA-haltigen Kulturmedien und konditioniertem Medium aus Tubulusepithelzellen kultiviert. Der Einfluss der Medien wurde mittels Western Blot, qPCR und Immunfluoreszenzfärbung nachgewiesen. Die Kultivierung mit ATRA führte zu einer signifikanten Erhöhung der Expression von CK18 und ZO-1. Dabei handelt es sich um Marker, die charakteristisch für Epithelzellen sind. Es konnte folglich gezeigt werden, dass humane prASC in vitro eindeutig in epithelialer Richtung differenzieren können. Unter dem Einfluss von ATRA-supplementierten Medien exprimierten die kultivierten Zellen Genprodukte, die Epithelzellen zuzuordnen sind.
Welche Bedeutung diese Erkenntnis hat ist noch unklar. Möglicherweise sind prASC, als Stammzellen aus Nischen mit anatomischer Nähe zu den Nieren, potente Kandidaten, um untergegangenes Nierengewebe, wie beispielsweise Tubulusepithelzellen, zu ersetzen.
In Deutschland leidet ca. jeder zehnte Mensch über 40 Jahren an einer chronischen Einschränkung seiner Nierenfunktion. Nicht wenige davon sind im Laufe der Erkrankung auf eine Nierenersatztherapie angewiesen. Die Ursachen für eine Nierenschädigung sind vielfältig. Als neuartiger und vielversprechender Therapieansatz werden aktuell Mesenchymale Stamm-/Stromazellen (MSC) als Therapeutikum für diverse Nierenerkrankungen getestet. Erste Ergebnisse klinischer Phase-I-Studien zeigen, dass MSC sicher als Immunsuppressivum nach Nierentransplantation angewendet werden können. Auch für weitere Erkrankungen der Niere sind erste klinische Studien am Laufen. MSC gelten als regenerativ, immunsupprimierend und antientzündlich. Dennoch gibt es noch einige Limitationen. Nach der Transplantation der Zellen ist das Wachstum der Zellen oft eingeschränkt und es kommt zur vermehrten Apoptose. Auch wird immer wieder ein paradoxes und entzündungsförderndes Verhalten der MSC am Wirkort beobachtet. Ein wichtiger Lösungsansatz ist eine in vitro Vorbehandlung der MSC zur Modulierung der zellulären Eigenschaften. In dieser Arbeit wurden drei Substanzen und Arzneimittel auf ihre Fähigkeit untersucht, die entzündungshemmenden Eigenschaften der MSC zu verbessern und die entzündungsfördernden zu unterdrücken. Der Fokus lag hierbei auf dem Arzneimittel Niclosamid und den beiden bisher noch nicht zugelassenen Substanzen Berberin und Gedunin, die alle in vitro und in vivo bereits erste vielversprechende antientzündliche Wirkungen bewiesen haben. Für diese Arbeit wurden MSC aus Fettgewebe isoliert (ASC) und mit LPS oder einem Cytokin-Mix (Mischung aus TNF-α, IFN-γ und IL-1β) sowie den drei Substanzen stimuliert. Untersucht wurden im Anschluss die mRNA-Expressionen der gängigsten proinflammatorischen (TNF-α, IL-6, TLR-4, ICAM-1, HLA-DR) und antiinflammatorischen Marker (IDO, IL-10), sowie mittels ELISA die Protein-Freisetzung von IL-6 und IL-8. Die vielversprechendsten Ergebnisse ließen sich durch Berberin hervorrufen. Hier zeigte sich eine deutliche Senkung der IL-8-Konzentration im ELISA. Die Anwendung des Gedunin hatte keine signifikante Wirkung auf die ASC. Niclosamid hingegen scheint widererwarten sogar entzündungsfördernd zu wirken, in dem es die IL-6-, ICAM-1-mRNA-Expression steigerte und die IDO-mRNA-Expression absenkte. Unter den drei getesteten Subtanzen hat Berberin die beste Wirkung bewiesen. Nach weiterer Testung könnte eine Anwendung mit Berberin als in vitro Präkonditionierung von MSC vielversprechend sein. Die Verwendung von Niclosamid hingegen sollte vermieden werden, die Wirkung von Gedunin müsste genauer untersucht werden.