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Characterization of mouse NOA1 : subcellular localizaion, G-Quadruplex binding and proteolysis
(2013)
Mitochondria contain their own protein synthesis machinery with mitoribosomes that are similar to prokaryotic ribosomes. The thirteen proteins encoded in the mitochondrial genome are members of the respiratory chain complexes that generate a proton gradient, which is the electromotoric force for ATP synthesis.
NOA1 (Nitric Oxide Associated Protein-1) is a nuclear encoded GTPase that positively influences mitochondrial respiration and ATP production. Although a role in mitoribosome assembly was assigned to NOA1 the underlying molecular mechanism is poorly understood. This work shows that the multi-domain protein NOA1 serves multiple purposes for the function of mitochondria. NOA1 is a dual localized protein that makes a detour through the nucleus before mitochondrial import. The nuclear shuttling is mediated by a nuclear localization signal and the now identified nuclear export signal. SELEX (Systemic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) analysis revealed a G-quadruplex binding motif that characterizes NOA1 as ribonucleoprotein (RNP). G-quadruplex binding was coupled to the GTPase activity and increased the GTP hydrolysis rate. The sequence of localization events and the identification of NOA1 being a RNP lead to the discussion of an alternative import pathway for RNPs into mitochondria. The short-lived NOA1 contains ClpX recognition motifs and is specifically degraded by the mitochondrial matrix protease ClpXP. NOA1 is the first reported substrate of ClpXP in higher eukaryotes and augments the contribution of the ClpXP protease for mitochondrial metabolism. To assess the direct action of NOA1 on the mitoribosome co-sedimentation assays were performed. They showed that the interaction of NOA1 and the mitoribosome is dependent on the GTPase function and the nascent peptide chain. In vitro, NOA1 facilitated the membrane insertion of newly translated and isotope labeled mitochondrial translation products into inverted mitochondrial inner membrane vesicles. In conclusion, NOA1 is a G-quadruplex-RNP that acts as mitochondrial membrane insertion factor for mtDNA-encoded proteins.
This thesis provides a comprehensive model of the molecular function of NOA1 and is the basis for future research. The identification of NOA1 as ClpXP substrate is a major contribution to the field of mitochondrial research.
MHC Klasse I Moleküle liegen im Endoplasmatischen Reticulum (ER) als Dimer bestehend aus einer schweren Kette mit Transmembrandomäne und einem 12 kDa-Protein, dem ß2-Mikroglobulin vor. Nach der Beladung des MHC-Klasse I-Moleküls mit einem antigenen Peptid, welche vorwiegend im Cytosol durch proteasomalen Abbau generiert und durch den Transportkomplex TAP ins ER transloziert werden, findet der Transport des MHC-Peptid-Komplexes zur Zelloberfläche statt. Dort wird das Antigen cytotoxischen T-Zellen präsentiert. An der Assemblierung und Reifung von MHC-Klasse I-Molekülen sind verschiedene Chaperone beteiligt. Eine wichtige Rolle beim Peptidbeladungsprozess von MHC-Klasse I-Molekülen spielt Tapasin. Dabei handelt es sich um ein 48 kDa, MHC-codiertes Typ I Transmembran-Glycoprotein aus der Immunglobulinsuperfamilie. Es verbrückt den TAP-Komplex mit MHC-Klasse I-Molekülen, hält unbeladene MHC-Klasse I-Moleküle im ER zurück und führt eine Qualitätskontrolle des gebundenen Peptids durch. Bei dieser Peptideditierung werden Peptide wieder selektiv aus der MHC-Bindungstasche entfernt, wenn sie mit einer niedrigen Affinität gebunden sind. Dadurch wird sichergestellt, dass keine leeren oder suboptimal beladenen MHC-Peptid-Komplexe an die Zelloberfläche gelangen. In der vorliegenden Arbeit wurde ein System etabliert, mit dem der Einfluss von Tapasin auf die Peptidbeladung von MHC-Klasse I-Molekülen in vitro untersucht werden kann. Dazu wurde ein Verfahren zur heterologen Expression und Reinigung von funktionalem, löslichem Tapasin aus E. coli-Zellen aufgestellt. Weiterhin wurden ß2m und die schwere Kette von HLA-B*2705 heterolog in E. coli-Zellen exprimiert, isoliert und zusammen mit einem Reporterpeptid zum funktionalen HLA-B*2705 renaturiert. Bei Untersuchungen der Wechselwirkung zwischen Tapasin und HLA-B*2705-Molekülen konnte mittels der Oberflächen-Plasmonen-Resonanz-Spektroskopie eine direkte Interaktion zwischen Tapasin und unbeladenem HLA-B*2705 gezeigt werden. Detailliertere Untersuchungen zur Rolle von Tapasin bei der Peptidbeladung wurden mittels einer Gelfiltration gekoppelt mit der Fluoreszenzdetektion des Reporterpeptids durchgeführt. Dabei konnte festgestellt werden, dass unbeladene MHC-Klasse I-Moleküle in Anwesenheit von Tapasin stabilisiert werden und in einer Konformation gehalten werden, die eine Assoziation mit Peptid fördert. Weiterhin wurde gezeigt, dass durch Tapasin die Assoziationsrate für die Peptidbindung erhöht ist. Somit kann in Anwesenheit von Tapasin eine größere Anzahl an Peptiden auf eine stabile und hochaffine Bindung an MHC-Klasse I-Moleküle überprüft werden. In Experimenten mit bereits beladenen MHC-Klasse I-Molekülen konnte gezeigt werden, dass der neugebildetete Komplex auch nach erfolgter Peptidassoziation durch Tapasin stabilisiert wird. Dies ist vermutlich auf eine Erniedrigung der Dissoziationsrate für das Peptid zurückzuführen. Mit dem in dieser Arbeit etablierten Untersuchungssystem ist die Grundlage zu detaillierten Studien der Rolle von Tapasin bei der Peptidbeladung von MHC-Klasse I-Molekülen geschaffen.
Hepatitis B caused by infection with the hepatitis B virus (HBV) still ranks among the most challenging infectious diseases of our time. Despite the availability of an effective prophylactic vaccine, 240 million people worldwide are estimated to be chronically infected with HBV and are at risk of developing life-threatening liver diseases, including cirrhosis and liver cancer. The underlying pathogenic mechanisms of HBV-associated liver diseases are only incompletely understood. It is widely accepted that liver pathology results from long-term immune-mediated liver injury and inflammation as a consequence of inefficient viral elimination. This injury can be naturally compensated by liver regeneration. However, chronic liver damage and permanent inflammation debilitates the regenerative capacity of the liver and fosters fibrosis as well as accumulation of chromosomal aberrations, which both contribute to cirrhosis and liver cancer. Liver regeneration requires the presence of the redox-sensitive transcription factor Nrf2 and intact insulin receptor signaling. A lack of Nrf2 causes increased intracellular levels of reactive oxygen species (ROS) that inactivate insulin receptor signaling and induce insulin resistance. Interestingly, HBV was observed to activate Nrf2 and the expression of Nrf2-regulated genes. This argues against an inhibitory effect of HBV on insulin receptor signaling by increased ROS levels. However, chronic HBV infection is associated with dysregulation of hepatocyte proliferation and retardation of liver regeneration. Hence, the aim of this thesis was to investigate the influence of HBV on the process of liver regeneration with respect to the insulin receptor signaling pathway. After short-term carbon tetrachloride (CCl4)-induced liver damage, HBV transgenic mice present prolonged liver damage and impaired liver regeneration as reflected by reduced hepatocyte proliferation and increased apoptosis. Impaired hepatocyte proliferation in HBV transgenic mice correlates with diminished activation of the insulin receptor. It was further observed in vitro that the activation of Nrf2 by HBV induces increased levels of the insulin receptor mRNA and protein in HBV-expressing cells. Strikingly, stably HBV-expressing cells as well as primary mouse hepatocytes from HBV transgenic mice bind less insulin due to reduced amounts of insulin receptor on the cell surface. This is caused by intracellular retention of the insulin receptor in HBV-expressing cells as a consequence of increased amounts of the cellular trafficking factor α-taxilin. The reduced amounts of insulin receptor on the cell surface impair insulin sensitivity in HBV-expressing cells and inactivate downstream signaling cascades that initiate insulin-dependent gene expression and glucose uptake. As a consequence of impaired hepatocyte proliferation and liver regeneration, HBV transgenic mice exhibit increased development of fibrosis after long-term CCl4-induced liver damage. Taken together, in this thesis, a novel pathomechanism could be uncovered that includes inactivation of insulin receptor signaling by HBV via intracellular retention of the insulin receptor leading to impaired liver regeneration after liver damage and promotion of liver fibrosis. These findings significantly contribute to an enhanced understanding of HBV-associated liver pathogenesis.
The power to dissociate : molecular function of the twin-ATPase ABCE1 in archaeal ribosome recycling
(2010)
Der CD95 Ligand (CD95L, FasL) ist ein Mitglied der Tumor-Nekrose-Faktor(TNF)- Superfamilie und ist in der Lage, Apoptose oder -unter bestimmten Bedingungen- Proliferation in CD95 Rezeptor-positiven Zellen auszulösen. Zusätzlich überträgt der CD95 Ligand aber auch als Rezeptor Signale in die ligandentragende Zelle, ein Phänomen, das auch bei anderen TNF-Familienmitgliedern beobachtet und als "reverse signalling" bezeichnet wird. Diese reverse Signalübertragung bewirkt in T-Zellen ein costimulatorisches Signal, welches zur vollständigen Aktivierung nach Antigen-Erkennung durch den T-Zellrezeptor (TZR) benötigt wird und über bisher unbekannte Adaptorproteine stattfindet, die vermutlich an den intrazellulären Anteil des CD95L binden. Die zytoplasmatische CD95L-Domäne ist auf Primärsequenzebene stark konserviert und besitzt eine prolinreiche Proteininteraktionsdomäne sowie eine Casein Kinase I Phosphorylierungsstelle, welche sich auch im intrazellulären Bereich des membrangebundenen TNFalpha findet und bei diesem Protein für die reverse Signalübertragung essentiell ist. Eine weitere Funktion des CD95L ist der Transport des Liganden zu einem speziellen Typ von Lysosomen in NK- und zytotoxischen T-Zellen. Hierfür ist die prolinreiche Region in der CD95L-intrazellulären Domäne wichtig. In diesen sekretorischen Lysosomen wird der CD95L gespeichert, bis er nach einem TZR-vermittelten Signal an die Zelloberfläche transportiert wird und dort mit dem CD95 Rezeptor der Ziel- Zellen interagieren kann. In der vorliegenden Arbeit wurde zur Aufklärung der oben beschriebenen Funktionen des CD95 Liganden ein Hefe-2-Hybrid Screen mit der intrazellulären CD95L-Domäne als Köder durchgeführt. Mit dieser Methode war es möglich, mehrere potentielle Interaktionspartner zu identifizieren. Eines dieser Proteine, FBP11, wurde schon zuvor als "human fas ligand associated factor" in der Datenbank veröffentlicht. Der HMG-Box-Transkriptionsfaktor Lef- 1, das Formin-bindende Protein FBP11, das thymozytenspezifische Protein TARPP und das Adaptorprotein PSTPIP ("proline serine threonin phosphatase interacting protein")/ CD2BP1 ("CD2 binding protein") interagierten in vitro in einem GST-Pulldown-Experiment mit der intrazellulären Domäne des CD95 Liganden. Mit Hilfe von Co- Immunpräzipitationsstudien und Co-Lokalisierungsexperimenten konnte die Interaktion von überexprimiertem CD95L und PSTPIP auch in vivo bestätigt werden. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass diese Interaktion über eine nicht näher eingegrenzte Aminosäuresequenz in der prolinreichen Region des CD95L mit der SH3-Domäne des PSTPIP-Proteins realisiert wird. Die Phosphatase PTP-PEST bindet an einen Bereich der PSTPIP-Coiled-coil-Domäne, und es besteht die Möglichkeit, dass CD95L, PSTPIP und PTPPEST in der Zelle als ternärer Komplex vorliegen, in welchem der Phosphorylierungsstatus von PSTPIP und CD95L durch PTP-PEST reguliert wird. Wie die gleichzeitige Expression von PSTPIP die Oberflächenexpression von CD95L beeinflusst, war ein weiterer Untersuchungsgegenstand dieser Arbeit. Es konnte festgestellt werden, dass bei Überexpression von PSTPIP weniger CD95L auf der Oberfläche nachgewiesen wird. Interessanterweise wurde auch weniger Apoptose durch den CD95L ausgelöst, sobald PSTPIP überexprimiert wurde. Neben den Untersuchungen zur Interaktion von CD95L und PSTPIP (sowie PTP-PEST) wurden auch funktionelle Studien zur reversen Signalübertragung des CD95L durchgeführt. Sowohl in CD4- als auch in CD8-einzelpositiven frisch isolierten Maus-T-Zellen wurde ein co-stimulatorisches Signal nach suboptimaler TZR-Stimulation über CD95L beobachtet, was sich in verstärkter Proliferation und erhöhter Expression von Aktivierungsmarkern wie CD25 äußerte. Außerdem führt die Stimulation des CD95 Liganden zu einer transienten p42/p44-MAPK-Phosphorylierung, die durch Co-Expression von PSTPIP jedoch nicht beeinflusst wird. Die MAPK-Signalkaskade führt zur Zellproliferation und könnte daher eine wichtige Rolle in der CD95L-vermittelten Co- Stimulation spielen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte auch zum ersten Mal gezeigt werden, dass die Lokalisation des CD95L in Lipid Rafts (Mikrodomänen der Zellmembran) wichtig für dessen apoptoseauslösendes Potential ist, da die Behandlung CD95L-positiver Zellen mit Substanzen, die Cholesterol entfernen und so Rafts zerstören, zur Inhibition der Apoptoseinduktion führt. Die Lokalisation sowohl des CD95 Rezeptors als auch des CD95 Liganden in unterschiedlichen Kompartimenten der Zellmembran könnte beide Moleküle voneinander abschirmen und so autokrine Apoptosemechanismen verhindern. Dadurch wird eine weitere Möglichkeit der Regulation der durch CD95L induzierten Apoptose realisiert.
By adopting a variety of shapes, proteins can perform a wide number of functions in the cell, from being structural elements or enabling communication with the environment to performing complex enzymatic reactions needed to sustain metabolism. The number of proteins in the cell is limited by the number of genes encoding them. However, several mechanisms exist to increase the overall number of protein functions. One of them are post-translational modifications, i.e. covalent attachment of various molecules onto proteins. Ubiquitin was the first protein to be found to modify other proteins, and, faithful to its evocative name, it is involved in nearly all the activities of a cell. Ubiquitylation of proteins was believed for a long time only to be responsible for proteasomal degradation of modified proteins. However, with the discovery of various types of ubiquitylation, such as mono-, multiple- or poly-ubiquitylation, new functions of this post-translational modification emerged. Mono-ubiquitylation has been implicated in endocytosis, chromatin remodelling and DNA repair, while poly-ubiquitylation influences the half-life of proteins or modulates signal transduction pathways. DNA damage repair and tolerance are example of pathways extensively regulated by ubiquitylation. PCNA, a protein involved in nearly all types of DNA transaction, can undergo both mono- and poly-ubiquitylation. These modifications are believed to change the spectrum of proteins that interact with PCNA. Monoubiquitylation of PCNA is induced by stalling of replication forks when replicative polymerases (pols) encounter an obstacle, such as DNA damage or tight DNA-protein complexes. It is believed that monoubiquitylation of PCNA stimulates the exchange between replicative pols to one of polymerases that can synthesize DNA across various lesions, a mechanism of damage tolerance known as translesion synthesis (TLS). Our work has helped to understand why monoubiqutylation of PCNA favours this polymerase switch. We have identified two novel domains with the ability to bind Ub non-covalently. These domains are present in all the members of Y polymerases performing TLS, and were named Ub-binding zinc finger (UBZ) (in polη and polκ) and Ub-binding motif (UBM) (in polι and Rev1). We have shown that these domains enable Y polymerases to preferentially gain access to PCNA upon stalling of replication, when the action of translesion polymerases is required. While the region of direct interaction between Y pols and PCNA had been known (BRCT domain in Rev1 and PIP box motif (PIP) in three others members), we propose that Ub-binding domains (UBDs) in translesion Y pols enhance the PIP- or BRCT-domain-mediated interaction between these polymerases and PCNA by binding to the Ub moiety attached onto PCNA. Following these initial studies, we have also discovered that Y polymerases themselves undergo monoubiquitylation and that their UBDs mediate this modification. This auto-ubiquitylation is believed to lead to an intramolecular interaction between UBD and Ub attached in cis onto the UBD-containing protein. We have mapped monoubiquitylation sites in polη in the C-terminal portion of the protein containing the nuclear localization signal (NLS) and the PIP box. Beside PIP, the NLS motif is also involved in direct interaction of polη with PCNA. Based on these findings, we propose that monoubiquitylation of either NLS or PIP masks them from potential interaction with PCNA. Lastly, using several functional assays, we have demonstrated the importance of all these three motifs in the C-terminus of polη (UBZ, NLS and PIP) for efficient TLS. We have also constructed a mimic of monoubiquitylated polη by genetically fusing polη with Ub. Interestingly, this chimera is deficient in TLS as compared to the wild-type protein. Altogether, these studies demonstrate that the C-terminus of polη constitutes a regulatory module involved in multiple-site interaction with monoubiquitylated PCNA, and that monoubiquitylation of this region inhibits the interaction between polη and PCNA. Our work has also revealed that the UBDs of Y pols as well as of other proteins implicated in DNA damage repair and tolerance, such as the Werner helicase-interacting protein 1 (Wrnip1), are required for their proper sub-nuclear localization. All these proteins localize to discrete focal structures inside the nucleus and mutation of their UBDs results in inability to accumulate in these foci. Interestingly, by exchanging UBDs between different proteins we have learned that each UBD seems to have a distinct functional role, surprisingly not limited to Ubbinding ability. In fact, swapping the UBZ of Wrnip1 with the UBM of polι abolished the localization of Wrnip1 to foci despite preserving the Ub-binding ability of the chimeric protein. In summary, this work provides an overview of how post-translation modification of proteins by Ub can regulate several DNA transactions. Firstly, key regulators (e.g. PCNA) can be differentially modified by Ub. Secondly, specialized UBDs (e.g. UBM, UBZ) embedded only in a subset of proteins act as modules able to recognize these modifications. Thirdly, by means of mediating auto-ubiquitylation, UBDs can modulate the behaviour of host proteins by allowing for either in cis or in trans Ub-UBD interactions.
A great challenge in life sciences remains the site-specific modification of proteins with minimal perturbation for in vitro as well as in vivo studies. Therefore, different chemoselective reactions and semi-synthetic techniques such as native chemical ligation or intein-mediated protein splicing have been established. They enable a site-specific incorporation of chemical reporters into proteins, such as organic fluorophores or unnatural amino acids. In this PhD Thesis, protein trans-splicing was guided by minimal high-affinity interaction pairs to trace proteins in mammalian cells. In addition, the temporal modulation of cellular processes by photo-cleavable viral immune evasins was achieved.
Protein trans-splicing mediated by split inteins is a powerful technique for site-specific and 'traceless' protein modifications. Despite recent developments there is still an urgent need for ultra-small high-affinity intein tags for in vitro and in vivo approaches. So far, only a very few in-cell applications of protein trans-splicing are reported, all limited to C-terminal protein modifications. Here, a strategy for covalent N-terminal intein-mediated protein labeling at sub-nanomolar probe concentrations was developed. Combined with the minimalistic Ni-trisNTA/His-tag interaction pair, the affinity between the intein fragments was increased 50-fold (KD ~ 10 nM). Site-specific and efficient 'traceless' protein modification by high-affinity trans-splicing is demonstrated at nanomolar concentrations in mammalian cells.
High background originating from non-reacted, 'always-on' fluorescent probes still is a crucial issue in life sciences. Covalent labeling approaches with simultaneous activation of fluorescence are advantageous to increase sensitivity and to reduce background signal. Therefore, high-affinity protein trans-splicing was combined with fluorophore/quencher pairs for online detection of covalent N-terminal protein labeling in cellular environments. Substantial fluorescence enhancement at nanomolar probe concentrations was achieved. This ultra-small fluorogenic high-affinity split intein system is an unprecedented example for real-time monitoring of the trans-splicing reaction in cell-like environments as well as for protein labeling with fluorogenic probes at nanomolar concentrations.
To extend the field of chemical immunology and to address spatiotemporal aspects in adaptive immune response, new tools to control antigen processing are required. Therefore, synthetic photo-conditional viral immune evasins were designed to modulate antigen processing on demand. By using light, the time and dose controlled antigen translocation by the transporter associated with antigen processing (TAP) was triggered with response in the second regime. Peptide delivery and loading by the peptide-loading complex (PLC) was rendered inactive, whereas blocking was abolished in a light-controlled fashion to inactivate the synthetic viral immune evasin ICP47 along with simultaneous activation of the antigen presentation pathway. Lightresponsive peptide translocation by the TAP complex was assayed in vitro by utilizing microsomes isolated from professional antigen presenting B-cell lymphomas (Raji). To extend these studies, suppression and photo-controlled rescue of antigen presentation was examined at single-cell resolution in human primary immune cells.
Native chemical ligation interconnects peptide chemistry with recombinantly expressed proteins. This technique was applied to generate the semi-synthetic full-length ICP47. Although this approach was realized, the low product yield was not sufficient for further functional studies. Therefore, full-length ICP47 was consecutively generated by utilizing a full synthetic four-fragment ligation approach. However, this synthetic viral immune evasin was not able to block peptide translocation in a robust way.
Rezeptortyrosinkinasen der Familie der epidermalen Wachstumsfaktorrezeptoren (EGFR) sind in vielen Krebsarten dereguliert und ursächlich an der malignen Transformation beteiligt. Da die Aktivierung vom Rezeptor ausgehender Signaltransduktionskaskaden auf spezifischen Protein-Protein-Interaktionen basiert, kann durch gezielte Interferenz mit diesen Interaktionen das proliferative Signal ausgeschaltet und das Tumorwachstum angehalten werden. Für diese gezielte Interferenz wurde in der vorliegenden Arbeit das Peptid-Aptamer-System eingesetzt, mittels dem Peptide, die in ein Gerüstprotein inseriert sind, aufgrund ihrer Affinität zu einem Zielprotein selektiert werden können. Drei Peptid-Aptamere (KDI1, KDI3, KDI4), die spezifisch mit dem EGF-Rezeptor interagieren, konnten isoliert werden. lntrazelluläre Expression von Peptid-Aptamer KDI1 oder Einbringung des bakteriell exprimierten Peptid-Aptamers KDI1 mittels einer Proteintransduktionsdomäne führte zu reduzierter EGF-abhängiger Proliferation und Transformation. Durch Interferenz des Aptamers mit dem EGF-Rezeptor war die EGF-induzierte Phosphorylierung von Tyrosin 845, 1068 und 1148, sowie die Aktivierung von p46 Shc und STAT3 reduziert. Daher wurde gefolgert, dass das Peptid-Aptamer die EGF-abhängige Rekrutierung der zytoplasmatischen Kinase c-Src an den Rezeptor inhibiert. Durch Fusion einer zusätzlichen Domäne wie der SOCS-Box-Domäne konnte den Peptid-Aptameren eine zusätzliche inhibitorische Funktion gegeben werden. Hierbei handelt es sich um eine Domäne, die spezifisch Kontakt mit E3-Ubiquitin-Ligasen aufbauen kann. Es konnte gezeigt werden, dass durch Transduktion eines solchen Peptid-Aptamers der Rezeptor spezifisch ubiquitinyliert und damit degradiert wird. Das Peptid-Aptamer-System eignet sich somit dazu, Inhibitoren für vorgegebene Zielmoleküle zu isolieren, die sowohl in der Grundlagenforschung als auch in der Tumortherapie Anwendung finden können.
The transporter associated with antigen processing (TAP) plays a pivotal role in the adaptive immune response against virus-infected or malignantly transformed cells. As member of the ABC transporter family, TAP hydrolyzes ATP to energize the transport of antigenic peptides from the cytosol into the lumen of the endoplasmic reticulum. TAP forms a heterodimeric complex composed of TAP1 and TAP2 (ABCB2/3). Both subunits contain a hydrophobic transmembrane domain and a hydrophilic nucleotide-binding domain. The aim of this work was to study the ATP hydrolysis event of the TAP complex and gain further insights into the mechanism of peptide transport process. To analyze ATP hydrolysis of each subunit I developed a method of trapping 8- azido-nucleotides to TAP in the presence of phosphate transition state analogs followed by photocross-linking, immunoprecipitation, and high-resolution SDS-PAGE. Strikingly, trapping of both TAP subunits by beryllium fluoride is peptide-specific. The peptide concentration required for half-maximal trapping is identical for TAP1 and TAP2 and directly correlates with the peptide-binding affinity. Only background levels of trapping were observed for low affinity peptides or in the presence of the herpes simplex viral protein ICP47, which specifically blocks peptide binding to TAP. Importantly, the peptideinduced trapped state is reached after ATP hydrolysis and not in a backward reaction of ADP binding and trapping. In the trapped state, TAP can neither bind nor exchange nucleotides, whereas peptide binding is not affected. In summary, these data support the model that peptide binding induces a conformation that triggers ATP hydrolysis in both subunits of the TAP complex within the catalytic cycle. The role of the ABC signature motif (C-loop) on the functional non-equivalence of the NBDs was investigated. The C-loops of TAP transporter contain a canonical C-loop (LSGGQ) for TAP1 and a degenerated ABC signature motif (LAAGQ) for TAP2. Mutation of the leucine or glycine (LSGGQ) in TAP1 fully abolished peptide transport. TAP complexes with equivalent mutations in TAP2 showed however still residual peptide transport activity. To elucidate the origin of the asymmetry of the NBDs of TAP, we further examined TAP complexes with exchanged C-loops. Strikingly, the chimera with two canonical C-loops showed the highest transport rate whereas the chimera with two degenerated C-loops had the lowest transport rate, demonstrating that the ABC signature motifs control the peptide transport efficiency. All single-site mutants and chimeras showed similar activities in peptide or ATP binding, implying that these mutations affect the ATPase activity of TAP. In addition, these results prove that the serine of the C-loop is not essential for TAP function, but rather coordinates, together with other residues of the C-loop, the ATP hydrolysis in both nucleotide-binding sites. To study the coupling between the ATP binding/hydrolysis and the peptide binding, the putative catalytic bases of the TAP complex were mutated to generate the so-called EQ mutants. The mutations did not influence the peptide-binding ability. Dimerization of the NBDs of EQ mutants upon ATP binding does not alter the peptide binding property. At 27°C, both ATP and ADP could induce the loss of peptide-binding ability (Bmax) only in the variants bearing a mutated TAP2. Further studies are required to deduce at which stage in the catalytic cycle the peptide-binding site is affected. In addition, mutation of the putative catalytic base of both subunits showed a magnesium-dependent peptide transport activity, demonstrating these mutants did not abolish the ATP hydrolysis. Thus, the function of this acidic residue as the catalytic base is not likely to be universe for all ABC transporters.
ABCB9 is a peptide transporter belonging to the ATP-binding cassette (ABC) transporter subfamily B. Due to its high sequence identity to the transporter associated with antigen processing (TAP) the protein was named TAP-like (TAPL). The primary aim of this PhD thesis was the functional characterization of the TAPL transport complex. Despite the lack of TAPL function in the classical MHC class I pathway an involvement of TAPL in antigen presentation was still suggested. Apart from the crucial role of TAP for peptide delivery into the ER, TAP-independent translocation pathways in professional antigen presenting cells (pAPC) have been proposed, but not identified so far. Remarkably, TAPL mRNA and protein expression is strongly induced during differentiation of monocytes to immature and mature dendritic cells. This result was confirmed in the promonocytic cell line THP-1, which was used as a model system for monocyte to macrophage differentiation. By using quantitative immunofluorescence microscopy and subcellular fractionation, TAPL was detected in the lysosomal compartment co-localizing with the lysosome associated membrane protein 2 (LAMP-2) thus excluding the ER-localization formerly reported. Furthermore, by in vitro assays, a TAPL-specific and ATPdependent translocation of peptides into isolated lysosomes was demonstrated. Hence, TAPL is a candidate mediating peptide transport in alternative antigen presentation pathways in pAPCs. The presence of an extra N-terminal transmembrane domain (TMD0) lacking sequence homology to any known protein distinguishes TAPL from most other ABC transporters of its subfamily. By dissecting the TAPL translocation complex into its four putative transmembrane helices containing TMD0 and the core complex, distinct functions to the core complex and TMD0 were assigned. The core-TAPL complex composed of six predicted transmembrane helices and the nucleotide-binding domain (NBD) was expressed transiently in HeLa or stably in Raji cells. Crude membranes containing core-TAPL showed the same peptide transport activity as wt-TAPL demonstrating that the six core helices and the NBD are sufficient for peptide transport. This result also shows that the core transport complex is correctly targeted to and assembled in the membrane. Strikingly, in contrast to the wt transporter, the core complex localizes only partially to lysosomes and is mistargeted to the plasma membrane as observed by immunofluorescence microscopy and confirmed biochemically by cell surface biotinylation. Thus, a crucial role for TMD0 in proper subcellular targeting can be postulated. The vast majority of biological processes are mediated by protein complexes, hence characterization of such protein-protein-interactions is essential for understanding protein function on the cellular level. To identify interaction partners of TAPL, the transporter was isolated by tandem affinity purification. By tandem mass spectrometry the membrane proteins LAMP-1 and LAMP-2 were deciphered as specific proteins interacting with wt-TAPL. Notably, core-TAPL lacks these interactions indicating a role for TMD0 in recruiting other proteins. These results were verified for endogenous TAPL by co-immunoprecipitation. Using cells deficient in LAMP-1 and/or in LAMP-2 an escort function for the LAMP proteins was excluded. Very importantly, the physiological function of the LAMP-1and LAMP-2 interaction with TAPL is an increase in stability, since in their absence half-life of TAPL is drastically reduced.
Zur Rolle der Typ-I-Interferone in der Abwehr von viralen Infektionen des zentralen Nervensystems
(2007)
Das zentrale Nervensystem (ZNS) bildet eine einzigartige Umgebung für Immunantworten, da Neuronen eine essentielle und in weiten Teilen nicht-erneuerbare Zellpopulation bilden. Virale Infektionen des ZNS und lokale anti-virale Immunantworten können zu dem Verlust von Neuronen und somit zu katastrophalen Erkrankungen führen. Unter normalen Bedingungen ist das ZNS weitgehend von der Kontrolle durch das Immunsystem ausgeschlossen. In diesem Zusammenhang wurde das ZNS oft auch als „immunprivilegiert“ bezeichnet. Dieses Konzept musste in den letzten Jahren revidiert werden, da es sich gezeigt hat, dass das ZNS nicht völlig vom Immungeschehen isoliert ist. Wichtige Mediatoren antiviraler Immunantworten sind die Typ I Interferone (IFN). Die verschiedenen Typ I IFN binden an einen gemeinsamen Rezeptor, den Typ I Interferon-rezeptor (IFNAR). Die Bedeutung von Typ I IFN Antworten für die Kontrolle viraler Infektionen wurde besonders eindrucksvoll mit IFNAR-defizienten Mäusen (IFNAR-/-) gezeigt. Nach Infektion mit dem neurotropen Vesikulären Stomatitis Virus (VSV) führt das Fehlen des IFNAR zu einer stark erhöhten Empfänglichkeit für tödlich verlaufende Infektionen. In allen Organen und besonders im ZNS von VSV infizierten IFNAR-/- Tieren fanden sich stark erhöhte Virusmengen. Um zu untersuchen, ob die VSV-Infektion des zentralen Nervensystems in IFNAR-/- Mäusen in erster Linie auf ein Versagen der peripheren Immunität oder des IFN Systems innerhalb des ZNS zurückzuführen ist, wurden mittels der Cre loxP Tech-nologie Mäuse hergestellt, die auf allen peripheren Zellen IFNAR exprimieren, während die Neuronen des ZNS IFNAR defizient sind (NesCre+/-IFNARflox/flox). Nach intranasaler VSV Infektion zeigten NesCre+/-IFNARflox/flox Mäuse zunächst keine Krankheitssymptome. Nach 5 bis 6 Tagen traten aber aufsteigende und halbseitige Lähmungen auf, so dass die infizierten Tiere verstärkt im Kreis liefen und schließlich verstarben. Im Vergleich dazu verstarben IFNAR-/- Mäuse bereits nach 2 bis 3 Tagen während normale C57BL/6 Tiere nach Infektion keine Symptome zeigten und überlebten. Der beobachtete Krankheitsverlauf lässt in den IFNAR-/- Mäuse auf ein Multiorganversagen als Todesursache schließen. 3 und 6 Tage nach Infektion konnte in den Organen von C57BL/6 Tieren kein Virus reisoliert werden. In den NesCre+/ IFNARflox/flox Tieren fanden sich zum Todeszeitpunkt nur im Gehirn Viruspar-tikel, während alle anderen Organe virusfrei waren. Die Virustiter im Hirn waren im Vergleich zu den IFNAR-/- Mäusen 10- bis 100-fach erhöht. In den anderen Organen und im Blut sind keine Viruspartikel nachweisbar. Dieser Befund deutete gemeinsam mit den beobachteten Krankheitsverläufen auf eine neuropathologische Symptomatik hin, bei der es wahrscheinlich zu einer VSV-Infektion des Hirnstammes kam. Die Analyse einzelner Regionen des ZNS zeigte in IFNAR-/- Tieren, dass 2 Tage nach Infektion in allen Regionen des ZNS signifikante Virusmengen zu finden waren. In den NesCre+/-IFNARflox/flox und den C57BL/6 Tieren fanden sich zu diesem Zeitpunkt nur im Riechhirn (Bulbus olfactorius) signifikante Virustiter. In den C57BL/6 Tieren blieb das Virus auf diese Region beschränkt und wurde dort innerhalb von 6 Tagen eliminiert. In den NesCre+/-IFNARflox/flox Tieren kam es in den folgenden Tagen jedoch zu einer fortschreitenden Infektion des ZNS, und auch das Großhirn, das Kleinhirn, der Hirn-stamm und das Rückenmark zeigten hohe Virustiter. In der Induktion peripherer Immunantworten unterschieden sich NesCre+/-IFNARflox/flox und C57BL/6 Mäuse nicht. In den WT Tieren kam es im Gegensatz zu den NesCre+/ IFNARflox/flox und IFNAR-/- Tieren innerhalb von 48 Stunden nach Infektion im Riechhirn zu einer Typ I IFN abhängigen Phosphorylierung von STAT-1, einer Komponente des IFNAR-Signaltransduktionsweges. Alles deutet darauf hin, dass die Induktion geringer Mengen Typ I IFN innerhalb des Riechhirns notwendig ist, um Im-munantworten zu aktivieren, die ein Übergreifen der Virusinfektion auf andere Regio-nen des ZNS verhindern. Eine funktionierende Immunität in der Peripherie und die Blut-Hirn-Schranke scheinen nicht ausreichend zu sein, um eine Infektion des ZNS mit VSV zu verhindern. Stattdessen muss es zur Aktivierung von IFN-abhängigen Mechanismen innerhalb des Riechhirns kommen, die ein Übergreifen der VSV Infektion auf andere Hirnregionen verhindert und zur Elimination von VSV im Riechhirn beiträgt.
The ABC protein ABCE1, also called HP68 or RNase L inhibitor (RLI), is one of the most conserved proteins in evolution. It is universally expressed in eukaryotes and archaea, where ABCE1 is essential for life. ABCE1 plays a crucial role in translation initiation and ribosome biogenesis, however, the molecular mechanism of ABCE1 remains unclear. In addition to two ABC ATPase domains, ABCE1 contains a unique N-terminal region with eight conserved cysteines predicted to coordinate iron-sulfur (Fe-S) clusters. To analyze the function of ABCE1, the hyperthermophilic crenarchaeote Sulfolobus solfataricus was chosen as a model system. S. solfataricus ABCE1 was overexpressed homologously in S. solfataricus and heterologously in E. coli. Noteworthy, for tagged-protein production in S. solfataricus a novel expression system based on a virus shuttle vector was established. This is the first example for a successful overexpression and purification of isolated full-length ABCE1. For the first time it was shown that ABCE1 indeed bears biochemical properties of an ABC protein even though it has unique features. Remarkably, the nucleotide binding domains (NBDs) of ABCE1 bound ATP and AMP, but were functionally non-equivalent in ATP hydrolysis. Mutations of conserved residues in the second NBD led to a hyperactive ATPase, which implies an intramolecular mechanism of dimer formation. Truncation of the Fe-S cluster domains did not influence ATPase activity. The Fe-S clusters of ABCE1 were analyzed by biophysical and biochemical methods. As presented in this study, ABCE1 harbors two essential diamagnetic [4Fe-4S]2+ clusters, one ferredoxin-like cluster formed by cysteines at position 4/5/6/7 and one unique ABCE1 cluster formed by cysteines at position 1/2/3/8. ABCE1 was found to be associated with RNA after purification from S. solfataricus and bound ribosomal RNA in vitro. In addition, ABCE1 showed homo-oligomerization and appeared to form a hexameric complex of ~440 kDa, which was RNase sensitive. Archaeal ABCE1 associated with ribosomes, however, the unique Fe-S clusters of ABCE1 were not required for this interaction. Although archaeal ABCE1 assembled with ribosomes and ribosomal RNA, ABCE1 proved not to be essential for translation in S. solfataricus and did not interact with archaeal initiation factors. Nevertheless, the ABCE1 gene is one of the few genes conserved between archaea and eukaryotes and fulfills a universal task, which needs further characterization.
The peptide loading complex (PLC) is a central machinery in adaptive immunity ensuring antigen presentation by major histocompatibility complex class I (MHC I) molecules to immune cells. If nucleated cells present foreign antigenic peptides from various origins (e.g., viral infected or cancer cells) on their cell surface they are targeted and eliminated by effector cells of the immune system to protect the organism against the hazard. The antigen presentation process starts with proteasomal degradation. Peptide loading and quality control of most, if not all, MHC I is performed by the PLC. Despite the main components, architecture, and general functions of this labile and multi-subunit assembly have been described, knowledge about the inner mechanics of MHC I loading and quality control in the PLC is limited. Detailed structural insights into the interactions and functions of key elements are lacking. In this PhD thesis, structural and functional aspects of the PLC in peptide loading and quality control of MHC I are unraveled, and the PLC was analyzed from an evolutionary perspective.
First, composition and architecture of native PLC isolated from different mammalian species was analyzed. Comparison of detergent-solubilized PLC from cow and sheep spleens with PLC isolated from human source showed a compositional conservation in mammals, with the central components TAP, ERp57, tapasin, calreticulin, and the MHC I heterodimer were conserved in these species. Negative-stain electron microscopy (EM) analyses revealed an identical overall architecture of PLCs from human, sheep, and cow with two major densities at opposing sides of the plane of the detergent micelle corresponding to endoplasmic reticulum (ER) luminal and cytosolic domains. Interestingly, the glucose-regulated protein 78 (GRP78) was associated only with the PLC from sheep and cow as revealed by mass spectrometry. This ER chaperone is involved in initial folding steps of MHC I but was not co-purified with human PLC, rendering it an interesting target for future functional and in-depth structural studies.
The human PLC was stabilized by reconstitution in membrane mimicking systems that replace the detergent, which is necessary to solubilize the complex. This stabilization allowed detailed structural analysis by single-particle cryogenic electron microscopy (cryo-EM). The structure of the MHC I editing module in the PLC, composed of tapasin, ERp57, calreticulin, MHC I, and β-2-microglobulin (β2m), was solved at an overall resolution of 3.7 Å. Within the structure, two important features were visualized: (i) the editing loop of tapasin, which is directly involved in peptide proofreading of MHC I; (ii) the A-branch of the Asn86 tethered N-linked glycan on MHC I. Both features are crucial elements in the quality control and peptide editing process on MHC I. The editing loop interacts with the peptide binding groove in MHC I. It disturbs the interaction between a cargo peptide C terminus and the F-pocket in the binding groove by displacing Tyr84 and the helices α1 and α2. The helix displacement widens the F-pocket which allows a faster peptide exchange on MHC I. The glycan is bound in its monoglucosylated form (Glc1Man9GlcNAc2) by the lectin domain of calreticulin. The A-branch of this glycan is stretched between MHC I Asn86 and the lectin domain, leading to the hypothesis that the glycan will be released from calreticulin once MHC I is loaded with a favored peptide (pMHC I).
For investigation of the glycan status of MHC I, intact protein liquid chromatography coupled mass spectrometry (LC-MS) was performed under denaturating conditions. An allosteric coupling between peptide loading and removal of the terminal glucose by α-Glucosidase II (GluII) was discovered. In addition, the PLC remained fully intact after peptide loading, which demonstrated GluII action on the PLC once MHC I is loaded.
With establishing GluII as transient interaction partner, this work deepens the knowledge of the molecular sociology of the PLC and how the PLC is involved in the endoplasmic reticulum quality control (ERQC). Further investigation of the ER aminopeptidases ERAP1 and ERAP2 showed that these enzymes neither alone nor together stably interact with the PLC. In contrast, both work independent from the PLC on free peptides in the ER.
LC-MS analysis of the PLC components revealed a very unusual glycosylation pattern of tapasin. Tapasin was observed with N-linked glycans ranging from the full glycan (Man9GlcNAc2) to heavily trimmed glycans, where only a single GlcNAc remained attached to Asn233. In the PLC, tapasin is probably shielded from degradation by ERQC and can remain functional and intact without a full N-linked glycan.
Guanosine triphosphate (GTP) cyclohydrolase I (GCH1) catalyzes the conversion of GTP to dihydroneopterin triphosphate (H2NTP), the initiating step in the biosynthesis of tetrahydrobiopterin (BH4). Besides other roles, BH4 functions as cofactor in neurotransmitter biosynthesis. The BH4 biosynthetic pathway and GCH1 have been identified as promising targets to treat pain disorders in patients. The function of mammalian GCH1s is regulated by a metabolic sensing mechanism involving a regulator protein, GCH1 feedback regulatory protein (GFRP). GFRP binds to GCH1 to form inhibited or activated complexes dependent on availability of cofactor ligands, BH4 and phenylalanine, respectively. We determined high-resolution structures of human GCH1−GFRP complexes by cryoelectron microscopy (cryo-EM). Cryo-EM revealed structural flexibility of specific and relevant surface lining loops, which previously was not detected by X-ray crystallography due to crystal packing effects. Further, we studied allosteric regulation of isolated GCH1 by X-ray crystallography. Using the combined structural information, we are able to obtain a comprehensive picture of the mechanism of allosteric regulation. Local rearrangements in the allosteric pocket upon BH4 binding result in drastic changes in the quaternary structure of the enzyme, leading to a more compact, tense form of the inhibited protein, and translocate to the active site, leading to an open, more flexible structure of its surroundings. Inhibition of the enzymatic activity is not a result of hindrance of substrate binding, but rather a consequence of accelerated substrate binding kinetics as shown by saturation transfer difference NMR (STD-NMR) and site-directed mutagenesis. We propose a dissociation rate controlled mechanism of allosteric, noncompetitive inhibition.
Translation is a universal process in all kingdoms of life and organized in a cycle that requires ribosomal subunits (40S and 60S), messenger RNA (mRNA), aminoacylated transfer RNAs (tRNAs), and a myriad of regulatory factors. As soon as translation reaches a stop codon or stalls, a termination or surveillance process is launched via release factors eRF1 or Pelota (Dom34), respectively. The ATP-binding cassette (ABC) protein ABCE1 interacts with release factors at the ribosomal A-site and coordinates the recycling process in Eukarya and Archaea. Two asymmetric nucleotide-binding sites (NBSs) control and execute the ribosome splitting upon dimerization and closure of the two nucleotide-binding domains (NBDs).
Ribosome nascent chain complexes (RNCs), ABCE1, and Dom34 from S. cerevisiae were produced for the reconstitution of splitting assays in order to probe for ABCE1’s actions in the splitting process with its native substrate. Translating ribosomes were stalled in vivo in a no-go situation on truncated mRNAs by a 3´-ribozyme motif that generates truncated mRNAs. The initiated decay mechanisms were circumvented by genomic deletion of the release factor Dom34 (Pelota) of the no-go decay machinery. The mRNA coded for an N terminal affinity purification tag (His-tag) and the green fluorescent protein (GFP) as a reporter of the translated nascent chain in the ribosomal complexes. RNCs were successfully in vivo stalled, enriched, and purified. In native gels, the reconstituted splitting experiments were analyzed by separation of RNCs, ribosomal subunits, and nascent chain-tRNA complexes based on the fluorescence readout of the GFP reporter. In addition, the anti-association factor eIF6 was added in the splitting reaction because it blocks the immediate re-association of ribosomal subunits after splitting. The anti-association activity of eIF6 was probed by an anti-/re-association assay, in which ribosomes are anti-associated by high salt and low magnesium conditions and in a second step re-associated. The re-association can be blocked by binding of eIF6 and other anti-associating factors to the ribosomal intersubunit sites. This approach allowed for the discovery of an anti-association activity of ABCE1 that was dependent on the non-hydrolysable ATP analog AMP-PNP. In addition, the formed complex between 40S and ABCE1 represented formally a post-splitting intermediate.
In collaboration with the Beckmann lab, the structure of the post-splitting complex was reconstructed at 3.9 Å. The ABC system of ABCE1 is fully closed and its N-terminal iron-sulfur (FeS) cluster domain is rotated by 150-degree to a cleft at helix 44 and uS12. The FeS cluster domain is stabilized by interactions of Pro30 to uS12, Arg7 to helix 5, and the cantilever arm that links it to NBD1. Tyr301 of NBD1 stabilizes the FeS cluster domain in the rotated position by interaction to the backbone of the cantilever arm. Upon transition to the post-splitting state, the FeS cluster domain must clash with the release factor and push it in between the ribosomal subunits like a wedge and split the ribosome. In addition, in the post-splitting state, the FeS cluster domain would putatively clash with uL14 of the large ribosomal subunit, and this is the structural explanation for the anti-association effect of ABCE1. In Archaea, a similar conformation of the post-splitting complex was reconstructed in collaboration with the Beck and Beckmann labs and Kristin Kiosze-Becker and Elina Nürenberg-Goloub. Based on the high-resolution structure of the post-splitting complex, the post-splitting state of ABCE1 was identified in the 43S initiation complex 40S–ABCE1–tRNA–eIF2–eIF3. Subsequently, we proposed the post-splitting complex as a platform for initiation.
In the quest to elucidate conformational dynamics of ABCE1, a reconstituted system was established to study conformational dynamics in real-time. Single-molecule Förster resonance energy transfer (smFRET) was used for the relative distance detection between a donor and acceptor fluorophore. A cysteine-less ABCE1 variant was engineered with additional cysteines for fluorescent labeling by thiol-maleimide-coupling. In collaboration with Philipp Höllthaler, the double-cysteine variants were labeled for smFRET studies and alternating-laser excitation (ALEX) smFRET measurements were performed with ABCE1 and the small ribosomal subunit. ABCE1’s nucleotide-dependent NBD dimerization and FeS cluster domain rotation was determined in real-time. Finally, a higher opening and closing frequency of the NBDs was discovered than the determined ATPase rate. This observation could be explained by the hypothesis of elastic dimerization that is not immediately connected to ATP hydrolysis.
Zytotoxische T-Lymphozyten und natürliche Killer-Zellen sind hochspezialisierte Zellen des Immunsystems, die durch Sekretion der Serin-Protease Granzym B (GrB) und des membranolytischen Proteins Perforin Virusinfizierte, körperfremde oder auch Tumorzellen durch Induktion von apoptotischem Zelltod eliminieren. Während Perforin für die Aufnahme von Granzym B in Zielzellen verantwortlich ist, wirkt Granzym B im Zytosol als aktive Effektor-Caspase und spaltet Caspase-3 und andere zelluläre Caspasen sowie verschiedene zentrale Caspasen-Substrate. Granzym B aktiviert damit wie Caspase-3 Apoptose-Signalwege am unteren Effektorende und umgeht daher die meisten Kontrollmechanismen, die in Tumorzellen häufig dereguliert sind und zur Resistenz gegenüber klassischer Chemo- und Strahlentherapie führen. Beide Proteasen stellen damit vielversprechende Enzymaktivitäten für die Verwendung als Effektorfunktion in Tumorzell-spezifischen zytotoxischen Fusionsproteinen dar. In der vorliegenden Arbeit wurden rekombinante Formen von Granzym B und Caspase-3 hergestellt und daraufhin untersucht, ob beide Enzyme mit dem ErbB2-spezifischen "single chain" Antikörper scFv (FRP5) als Tumorzell-spezifischer Zellbindungsdomäne fusioniert werden können, ohne dadurch die Faltung der Proteasen zu verhindern, um eine gezielte Applikation in Tumorzellen und Eliminierung der Zellen durch Apoptose zu ermöglichen. Die Herstellung von Granzym B als rekombinantes Protein im präparativen Maßstab war bisher nicht in der Literatur beschrieben worden. In dieser Arbeit konnte humanes aktives Granzym B in der Hefe Pichia pastoris mit Ausbeuten von 1 bis 4 mg/l Kultur exprimiert werden. Zum Nachweis der enzymatischen Aktivität wurde ein in vitro Assays etabliert, bei dem rekombinante Procaspase-3 als Substrat für Granzym B eingesetzt wurde. Nach intrazellulärer Applikation mit einem synthetischen Transduktionsreagens induziert das gereinigte Protein Apoptose in HeLa Zellen. Wie für endogenes Granzym B in der Literatur beschrieben, wird rekombinantes Granzym B aus Pichia pastoris sehr schnell in HeLa Zellen aufgenommen, lokalisiert aber in vesikulären Strukturen, in denen die enzymatische Aktivität eingeschlossen ist. Aus verschiedenen Expressionskulturen wurden jedoch zwei unterschiedliche Proteine isoliert, die bei vergleichbarer molarer Masse und enzymatischer Aktivität in Zellen aufgenommen wurden bzw. nicht internalisierten, was darauf hinweist, daß eine posttranslationale Modifikation der Protease für die Bindung von Granzym B an Zielzellen verantwortlich ist. Während für die Freisetzung von Granzym B aus den Membranvesikeln und Induktion von Apoptose Perforin erforderlich ist, konnte in dieser Arbeit beobachtet werden, daß Kulturen verschiedener etablierter Tumorzellinien nach Behandlung mit Granzym B auch in Abwesenheit von Perforin-Aktivität auffallende morphologische Veränderungen zeigen, die mit dem partiellen Verlust des Kontakts zum Kultursubstrat verbunden sind. Dies deutet darauf hin, daß Granzym B auch extrazellulär auf Zellen einwirkt, indem es Komponenten der extrazellulären Matrix spaltet, und so indirekt Apoptose durch Anoikis induziert. Dieser Effekt ist jedoch für eine mögliche therapeutische Verwendung von Granzym B nicht von Bedeutung, da relativ hohe Proteinkonzentrationen erforderlich sind. Um Granzym B selektiv gegen Tumorzellen zu richten, wurden verschiedene Fusionen mit dem "single chain" Antikörper scFv(FRP5) sowie einer bakteriellen Translokationsdomäne von Exotoxin A oder Diphtherietoxin konstruiert und in E. coli oder Pichia pastoris exprimiert. Während verschiedene in E. coli hergestellte Fusionsproteine nicht enzymatisch aktiv waren, konnte im Überstand einer Pichia Expressionskultur volle-Länge GrB-scFv(FRP5) sowie Granzym B Aktivität nachgewiesen werden. Die Expressionsrate war allerdings so gering, daß eine präparative Isolierung nicht möglich war. Es konnte damit aber gezeigt werden, daß die Fusion heterologer Proteindomänen an den C-Terminus von Granzym B unter Erhalt der enzymatischen Aktivität prinzipiell möglich ist, während zusätzliche Peptidsequenzen am N-Terminus der Protease zumindest partiell zum Verlust der enzymatischen Aktivität führen. Aktive Caspase-3 besteht aus zwei Peptiden p12 und p17, die im aktiven Enzym ein Tetramer (p12 p17)2 bilden. Um Caspase-3 selektiv in Tumorzellen zu applizieren, wurden ebenfalls Möglichkeiten untersucht, eine der beiden Untereinheiten mit dem scFv(FRP5) als Tumorzell-spezifische Zellbindungsdomäne zu fusionieren. Während aus den beiden separat in E. coli exprimierten p12 und p17 Untereinheiten durch gemeinsame Rückfaltung enzymatisch aktive Caspase-3 rekonstituiert werden konnte, führte die Fusion heterologer Proteindomänen an den N- und C-Terminus der p12 Untereinheit sowie an den C-Terminus der p17 Untereinheit zum Verlust der enzymatischen Aktivität, wahrscheinlich aufgrund der Verhinderung der korrekten Faltung des Protease-Tetramers. Dagegen konnte an den N-Terminus der p17 Untereinheit eine bakterielle Translokationsdomäne unter Erhalt der enzymatischen Aktivität fusioniert werden; ein entsprechendes Konstrukt, das zusätzlich den "single chain" Antikörper scFv(FRP5) enthielt, wurde aber in E. coli vollständig degradiert. Nachdem die Idee, Granzym B oder aktive Caspase-3 zur selektiven Induktion von Apoptose in Tumorzellen für therapeutische Zwecke einzusetzen, bereits seit längerem diskutiert wird, es jedoch bisher praktisch nicht möglich war, entsprechende rekombinante Fusionsproteine in funktionaler Form herzustellen, liefern die Ergebnisse dieser Arbeit wichtige grundlegende Informationen, wie die weitere Entwicklung solcher Moleküle erfolgreich durchgeführt werden könnte.
Endolysosomal effectors and their relevance for antiviral activity against the Hepatitis E virus
(2021)
Mit über 20 Millionen registrierter Fälle pro Jahr, repräsentiert das Hepatitis-E-Virus (HEV) eine Hauptursache einer viralen Hepatitis weltweit und stellt ein erhebliches Risiko insbesondere für Schwangere und Immunsupprimierte dar. Jedoch sind Behandlungsoptionen stark limitiert und mit teils schweren Nebenwirkungen verbunden. Neue Erkenntnisse des Wechselspiels zwischen Wirtszelle und HEV werden deshalb benötigt, um neue antivirale Wirkstoffe zu entwickeln. Der Fokus der Arbeit wurde hierbei auf Effektoren des endosomalen Systems gesetzt, welches von HEV zur Freisetzung von Virionen genutzt wird.
Eine virale Infektion führt in der Zelle zur Produktion von Interferonen (IFNs) und weiters zu einer IFN-Antwort. Ein essenzielles Effektormolekül, welches HEV nachweislich effizient repressiert, ist die GTPase guanylate binding protein 1 (GBP1). In dieser Studie wurde beleuchtet, dass Letztere durch eine HEV-Infektion induziert wird. Zusätzlich reduziert die ektopische Expression von GBP1 sowohl die intrazelluläre Menge des HEV Kapsidproteins als auch die Menge freigesetzter Virionen. Mechanistisch liegt diesem Sachverhalt die GBP1-induzierte Inkorporation von Virionen in Lysosomen zugrunde, was schlussendlich deren Abbau nach sich zieht. Erkenntnisse über die Rolle verschiedener GBP1 Proteindomänen innerhalb des Mechanismus wurden unter Verwendung ektopischer Expression von GBP1-Mutanten erlangt. Inkorporation der Mutation R48A führt zum Verlust der GTPase-Aktivität. Andererseits führt eine Inkorporation der Mutation S73A zum Verlust der Homodimerisierung, was die nachfolgende Farnesylierung und gekoppelte Membranassoziation reduziert. Hierbei behält GBP1-R48A Fähigkeiten zur Induktion lysosomalen Abbaus von HEV bei, GBP1-S73A jedoch nicht. Dies wiederum bedeutet, dass eine GBP1 Homodimerisierung notwendig für den antiviralen Mechanismus ist, was eine Adapterfunktion des Moleküls für lysosomale Inkorporation nahelegt. Die Relevanz von GBP1 während einer IFNγ-Antwort wurde deshalb mittels siRNA-basiertem Silencing untersucht. Ähnlich der ektopischen Expression von GBP1 induziert IFNγ die lysosomale Degradation von HEV. In Abwesenheit von GBP1 jedoch, ist dieser Effekt signifikant geringer ausgeprägt, was zu einem Effizienzverlust von IFNy in Bezug auf dessen antiviralen Effekt bedeutet. Dies führte schlussendlich zur Identifizierung von GBP1 als essenziellen Restriktionsfaktor gegen HEV, was seine Rolle in Abhängigkeit seiner Homodimerisierung via Induktion lysosomalen Abbaus erfüllt.
Nebst der Induktion von GBP1, konnte eine Akkumulation von Cholesterin in Lysosomen durch IFNy nachgewiesen werden. Da dieses Lipid einen essenziellen Faktor für endosomale Reifung, Transport und Funktionalität darstellt, wurden Cholesterinspiegel und verbundene transkriptionelle Fußabdrücke im Kontext einer HEV Infektion untersucht. Letztere führt zu einer Dysregulation Cholesterin-assoziierter Genexpression, was eine Reduktion intrazellulären Cholesterins nach sich zieht. Auch in HEV infizierten Patienten liegt eine Abnahme des Serumcholesterins vor. Unter Modulation intrazellulären Cholesterins, wurde deutlich, dass die Inhibition der Cholesterinsynthese durch Simvastatin eine verstärkte Freisetzung von Virionen nach sich zieht, was ebenso in HEV infizierten Patienten nachweisbar war. Im Gegensatz hierzu zieht eine Erhöhung intrazellulären Cholesterins via Supplementierung von Lipoproteinpartikeln niedriger Dichte (LDL) oder 25-Hydroxycholesterin eine signifikante Reduktion des viralen Kapsidproteins und freigesetzter Virionen nach sich. Dem liegt eine verstärkte Inkorporation von HEV in Lysosomen mit anschließender Degradation zugrunde. Ob dieser Mechanismus pharmakologisch nutzbar ist, wurde mittels eines Screenings Lipid modulatorischer Medikamente untersucht. Der p-Glykoprotein Inhibitor PSC833 und besonders der PPARα-Agonist Fenofibrat stellten sich als äußerst effiziente Inhibitoren des HEV heraus. Beide führen zu einer Erhöhung und Akkumulation zellulären Cholesterins in vesikulären Strukturen. Dies zieht eine dramatische Erhöhung lysosomaler Lokalisation von HEV nach sich und führt letzten Endes zu einer signifikanten Reduktion freigesetzter Virionen.
Zusammenfassend konnten in dieser Studie essenzielle Funktionen von GBP1 in Bezug auf dessen restriktiven Effekt gegen HEV identifiziert werden. Weiters wurde dieses als entscheidender Wirtsfaktor für die IFNγ-Antwort gegen das Virus identifiziert. Andererseits legt diese Studie nahe, dass HEV niedrige Cholesterinspiegel innerhalb infizierter Zellen für die Freisetzung von Virionen benötigt. Andererseits sind erhöhte intrazelluläre Cholesterinspiegel schädlich für die virale Freisetzung, da der lysosomale Abbau von Virionen induziert wird. Dies führte zur erfolgreichen Entdeckung eines neuartigen antiviralen Wirkstoffes, welcher diesen cholesterinabhängigen Effekt effizient induziert: Fenofibrat.
Für den mitochondrialen ABC-Transporter MDL1 (multidrug resistance like) aus Saccharomyces cerevisiae wurde eine Funktion als intrazellulärer Peptidexporter vorhergesagt. MDL1 ist wahrscheinlich am Export von Degradationsprodukten der m-AAA (matrixoriented ATPases associated with a variety of cellular activities) Protease in den Intermembranraum beteiligt (Young et al., 2001). Das MDL1-Homodimer besteht aus zwei Transmembrandomänen mit jeweils sechs potentiellen α-Helices und zwei Nukleotidbindedomänen. Eine Überexpression des ABC-Transporters in E. coli und L. lactis ist nicht möglich. Nur im homologen Expressionssystem kann eine bis zu 100-fach gesteigerte MDL1-Konzentration in Anwesenheit des induzierbaren GAL1-Promotors gegenüber dem endogenen Protein erreicht werden. Differentielle Zentrifugation, Immunogold-Markierungen und Proteasezugänglichkeitsexperimente zeigen, dass MDL1 ausschließlich in der mitochondrialen Innenmembran lokalisiert ist und die Nukleotidbindedomänen zur Matrix orientiert vorliegen. Mit Hilfe von Edman Sequenzierung des gereinigten His-getaggten MDL1 wurde eine 59 Aminosäuren lange mitochondriale Leitsequenz identifiziert. Die Deletionsvariante MDL1(60-695) wird ausschließlich in den Membranen des Endoplasmatischen Retikulums exprimiert. Ihre Motordomänen liegen zytosolisch orientiert vor. Beide MDL1-Varianten bilden homooligomere Komplexe vergleichbarer Größe und weisen ähnliche ATPase Aktivitäten auf. Die physiologischen Konsequenzen der Lokalisation in unterschiedlichen Membranen wurden in Zellen näher untersucht, deren mitochondrialer ABC-Transporter ATM1 (ABC transporter of mitochondria) deletiert ist. ATM1 ist von essentieller Bedeutung für die Biogenese zytosolischer Eisen/Schwefel-Proteine (Lill und Kispal, 2000). Der mitochondriale MDL1-Komplex kann zum Teil die ATM1-Funktion übernehmen, wohingegen ER-ständiges MDL1, als auch ATP Binde- und Hydrolyse inaktive Mutanten, den Δatm1 Wachstumsphänotyp nicht komplementieren können. Die physiologische Funktion von MDL1 ist somit eng mit der mitochondrialen Innenmembran und der Funktionalität des Proteins verbunden. Durch in vivo Komplementationsstudien wurden zwei mitochondriale ABC-Transporter ABCB10 und Pa_2_9660 aus H. sapiens bzw. P. anserina als funktionelle MDL1-Homologe identifiziert.
Der Transport von antigenen Peptiden in das Lumen des endoplasmatischen Retikulums ist ein zentraler Vorgang bei der Antigenprozessierung und ihrer MHC-Klasse-I-vermittelten Präsentation auf der Zelloberfläche. Intrazelluläre Translokation über die ER-Membran erfolgt mit Hilfe von TAP, eines ATP-abhängigen ABC-Transporters. Einer ATP-unabhängigen Substratbindung folgt der eigentliche Transportschritt, dessen Energetisierung einer ATP-Spaltung bedarf. In der vorliegenden Dissertation wurde die ATPase-Aktivität des TAP-Komplexes aufgeklärt und detailliert charakterisiert. Es wurde eine schnelle und schonende Isolierungs- und Rekonstitutionsmethode entwickelt, die es erlaubt, den partiell aufgereinigten TAP-Komplex in Liposomen einzubauen und Funktionsstudien in vitro durchzuführen. Zum ersten Mal war es damit möglich, die Peptid-stimulierte TAP-spezifische ATP-Hydrolyse direkt zu beobachten und deren kinetische Parameter zu bestimmen. Eine direkte Korrelation zwischen Bindungsaffinität des Peptides zu TAP (Bindungskonstante KD) und der halbmaximalen Stimulation der ATPase-Aktivität von TAP (Km,pep) wurde festgestellt. Die Versuche mit den verzweigten Peptiden zeigten, dass Peptide, die nicht transportiert werden können, keine Stimulation der ATPase-Aktivität hervorrufen. Somit wurde die allosterische Interaktion zwischen Peptidbindung, ATP-Hydrolyse und Peptidtransport nachgewiesen. Nach der Entfernung des peptidexportierenden Sec61-Komplexes aus den Proteoliposomen konnte die vorläufige Stöchiometrie des Transportschrittes bestimmt werden. Eine weitere Anwendung fand die Rekonstitutionsmethode bei der Aufklärung des molekularen Wirkungsmechanismus des TAP-Inhibitors US6, indem der TAP-Komplex zusammen mit der aktiven ER-luminalen Domäne von US6 in die Proteoliposomen rekonstituiert wurde. Die Bindung von US6(delta147-183) an die ER-luminalen Bereiche von TAP blockiert die ATP-Bindung an die zytoplasmatischen NBD des Transporters. Die Peptid-induzierte ATP-Hydrolyse wird durch die Inhibition der ATP-Bindung unterbunden, wohingegen die Peptid- und ADP-Bindung von TAP nicht beeinflusst sind.
Na+/H+ antiporters are ubiquitous membrane proteins involved in ion homeostasis and pH sensing. The amino acid sequence of one such antiporter, MjNhaP1, from Methanococcus jannaschii, shows a significant homology to eukaryotic sodium proton exchangers like NHE1 from Homo sapiens and SOS1 of Arabidopsis thaliana than to the well-characterized Escherichia coli NhaA or NhaB. MjNhaP1 shows activity at acidic pH unlike NhaA, which is active at basic pH. 13 transmembrane helices have been predicted to be present in NhaP1. A projection map, calculated by Cryo-EM of 2D crystals of MjNhaP1 grown at pH 4, showed it to be a dimer containing elongated densities in the centre of the dimer and a cluster of density peaks on either side of the dimer core (Vinothkumar et al., 2005). Incubation of 2D crystals at pH 8 on the EM grid resulted in well-defined conformational changes, clearly evident in a difference map as a major change in density distribution within the helix bundle (Vinothkumar et al., 2005). The aim of this dissertation is to understand the working mechanism of MjNhaP1 by determining its three-dimensional structure. The aim was initially approached by structure determination by X-ray crystallography. The limitation for this method was the low expression yield, which was 0.5–0.7mg/ml (Vinothkumar et al., 2005). After various optimization trials, the expression yield of the recombinant protein could be elevated to 2-2.5mg of pure protein per litre of culture by the method of autoinduction (Studier et al., 2005). To obtain well diffracting 3D crystals, purification conditions (Vinothkumar et al., 2005) were modified. 3D crystals were obtained under various conditions, which has so far not diffracted X-Ray beyond 8Å. Parallely, optimization of parameters (Vinothkumar et al., 2005) for 2D crystals formation was carried out. A combination of 1% DDM used for lipid solubilization, and 1% OG in the buffer of the purified protein produced 1-2 μm wide tubular 2D crystals of NhaP1. This batch of crystal proved to be the optimal for data collection at higher tilt angle with the electron microscope. A 3D map showed p22121 symmetry and revealed a tight dimer with an oval shape. The region in the central part of the dimer is composed of several tilted helices forming an interface between both monomers. On either side of the dimer interface, a group of six tightly packed helices form a bundle. This bundle contains three straight helices in the centre of the monomer and three helices in the periphery. Comparison of the structures of E.coli NhaA and M. jannaschii NhaP1 show substantial differences in length and slope of corresponding helices between both antiporters. A 3D model of NhaP1 based on the 3D map revealed 13 helices, which has been named as A-M to distinguish it from the NhaA helices. Overlaying the X-ray structure onto the 3D map revealed that the disrupted helices IV and XI of NhaA superimpose two central helices at similar position in the 3D map of NhaP1. The disrupted helices IV and XI in the X-ray structure of NhaA have been proposed as the putative ion-binding and translocation site (Hunte C et al, 2005; Arkin IT et al, 2007; Screpanti & Hunte (2007). This motif appears to be present also in NhaP1, as suggested by the close fit of NhaA helices IV and XI on the putative helices E and L of the NhaP1 model. These two putative helices E and L in NhaP1 contain the highly conserved TDP and GPRVVP motif, which are crucial for antiporter activity (Hellmer et al., 2002, Hellmer et al., 2003). In the overlay, helix V of NhaA containing the two essential, conserved aspartates D163 and D164 fits the density of the putative helix F of NhaP1, which contains the conserved motif FNDP. The homologous D161 in the FNDP motif of NhaP1 is essential for transport activity as show by mutagenesis (Hellmer at al., 2003). Significant differences are visible in the region of the dimer interface of the 3D map of NhaP1 occupied by helices VI, VII, and VIII in NhaA. This region shows an extra helical density (A) in the 3D map of NhaP1. By alignment of MjNhaP1 sequence with the amino acid sequences of several Na+/H+ exchangers, it was evident that the additional helix (A) is located in the N terminus of NhaP1. In our sequence alignment, a putative hydrophobic segment corresponding to this additional helix A is present in other archaeal and eukaryotic antiporters but not in any of the bacterial ones. The N-terminus of the human Na+/H+ exchanger NHE1 has been predicted to contain a highly hydrophobic signal peptide. This indicates the probability of the N-terminal helix A of NhaP1 to be an uncleaved signal peptide. Besides being a signal sequence targeting NhaP1 to the membrane, the map suggests that this helix might be involved in the formation of dimer contacts between both monomers. A gene duplication event is evident in the 3D map of NhaP1, as not only the helices D, E, F and K, L, M are related by an inverted repeat but also the helices B, C and I, J are related. We present here the three-dimensional architecture of a Na+/H+ antiporter from archaea. The presence of the 13th helix suggests the location of the N-terminus to be located in the cytosol and the C-terminus in the periplasm. This would orient NhaP1 in an inverted manner in the membrane in comparison to NhaA. Further structural information at higher resolution and biochemical and biophysical investigations are required to confirm the topology.