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Chromosomale Aberrationen des humanen MLL Gens (Mixed Lineage Leukemia) sind mit der Entstehung von akuten Leukämien assoziiert. 5-10% aller akuten myeloischen und lymphatischen Leukämien beruhen auf einer Translokation des MLL Gens mit einem von mehr als 50 bekannten Partnergenen. Die reziproke Translokation t(4;11), die zur Entstehung der zwei Fusionsgene MLL/AF4 und AF4/MLL führt, stellt die häufigste genetische Veränderung des MLL Gens dar und prägt sich in Form einer akuten lymphatischen Leukämie aus. Besonders häufig sind von dieser Erkrankung Kleinkinder und Patienten mit einer Sekundärleukämie betroffen. Aufgrund einer ungewöhnlich hohen Resistenz der leukämischen Blasten gegenüber gängigen Therapie-Protokollen ist diese Erkrankung mit einer schlechten Prognose verbunden. Die beiden erzeugten Fusionsgene der t(4;11) werden als Fusionsproteine MLL/AF4 (der11) und AF4/MLL (der4) exprimiert. Transduktionsexperimente verschiedener MLL Translokationen zeigten, dass in vielen Fällen das jeweilige der11 Fusionsprotein (MLL_N/Translokationspartner) starkes onkogenes Potential besitzt und daher vermutlich ursächlich für die Transformation der betroffenen Zellen ist. Im Fall der Translokation t(4;11) hingegen, konnte für das der11 Fusionsprotein MLL/AF4 nur sehr schwaches onkogenes Potential nachgewiesen werden, während das der4 AF4/MLL Fusionsprotein sich als potentes Onkoprotein herausstellte. Untersuchungen zur Aufklärung des pathologischen Mechanismus des AF4/MLL Fusionsproteins zeigten, dass es, analog zum MLL Wildtyp Protein, einer Prozessierung durch die Taspase 1 unterliegt. Desweiteren ist bekannt, dass die gebildeten Proteinfragmente, der4_N und der4_C (MLL_C), über intramolekulare Interaktionsdomänen des MLL Proteins, in der Lage sind miteinander zu komplexieren. In der unprozessierten Form wird das Fusionsprotein über einen Bereich des AF4 Proteins unter Einsatz der E3-Ligasen SIAH 1/2 dem proteasomalen Abbau zugeführt. Nach der Proteolyse und Komplexbildung findet weiterhin eine Erkennung durch die SIAH Proteine statt, jedoch erfolgt keine Degradation mehr. Auf diese Weise kommt es zur Akkumulation des Komplexes, was letztendlich zur Transformation der betroffenen Zellen führt. Eine Möglichkeit dem onkogenen Charakter des AF4/MLL Fusionsproteins entgegen zu wirken, besteht in der Inhibition der Interaktion der zwei Proteinfragmente der4_N und der4_C (=MLL_C). Für eine mögliche Inhibition stellt die Kenntnis der minimalen Kontaktdomäne des MLL Proteins (und damit gleichermaßen des AF4/MLL Proteins) eine Grundvoraussetzung dar. Die grundlegende Aufgabe der vorliegenden Arbeit bestand daher in der Bestimmung des minimalen intramolekularen Interaktionsinterface. Zu diesem Zweck wurden Interaktionsanalysen verschiedener C-terminaler und N-terminaler MLL Proteinfragmente unter Verwendung des bakteriellen Zwei-Hybrid-Systems sowie eines zellbasierten Protein-Translokation-Biosensor-Systems durchgeführt. Dabei ist es gelungen, die Größe der minimalen Interaktionsdomänen von den bis heute publizierten >150 Aminosäuren auf 58 Aminosäuren im N-terminalen Proteinfragment (FYRN_A3) bzw. 56 Aminosäuren im C-terminalen MLL Fragment (FYRC_B3) einzugrenzen. Eine weitere Verkleinerung führte zu einem Stabilitätsverlust der Interaktion. Eine ungewöhnliche Akkumulation einiger C-terminaler MLL Fragmente, die während der Interaktionsstudien beobachtet wurde, führte zu der Hypothese, dass die generierten Fragmente mit dem zellulären Wildtyp MLL interagieren und möglicherweise als Inhibitor der intramolekularen Interaktion agieren können. Zusätzlich wurde bei diesen Transfektionen eine abnorm hohe Anzahl abgestorbener Zellen festgestellt. Dies wäre damit zu erklären, dass das zelluläre MLL, durch Interaktion mit dem kleinen MLL Fragment, nicht mehr in der Lage ist, seinen natürlichen Funktionen nachzukommen. Der Nachweis der Interaktion des minimierten C-terminalen MLL Proteinfragments FYRC_B3 mit den full length Proteinen MLL sowie AF4/MLL konnte über Co-Immunopräzipitationsversuche erbracht werden. Durchflusscytometrische Analysen transfizierter und Propidiumiodid gefärbter HeLa Zellen sowie t(4;11)-positiver SEM Zellen zeigten eindeutig letale Effekte einiger FYRC-Fragmente auf. Anhand dieser Daten kann postuliert werden, dass die Fragmente FYRB_B3 und FYRC_B1 durch Interaktion mit MLL_N bzw. der4_N die Interaktion der nativen Proteinfragmente MLL_N/der4_N mit MLL_C verhindern und dies in der Folge zum Absterben der Zellen führt. Die Tatsache, dass diese Fragmente einen solch deutlichen Effekt auf die sehr therapieresistenten SEM Zellen haben, zeigt, dass die Inhibierung der intramolekularen Proteininteraktion einen vielversprechenden therapeutischen Ansatz für Leukämien mit einer Translokation t(4;11) darstellt.
Das NANOG2-Gen ist ein Genduplikat des nur in embryonalen Stammzellen exprimierten Stammzellfaktors NANOG1, der eine Schlüsselrolle bei der Pluripotenz und der Selbsterneuerung der Stammzellen und möglicherweise der Krebsstammzellen hat. Zur Analyse, ob NANOG2 die beschriebenen Funktionen von NANOG1 in Gewebestammzellen und Krebsstammzellen übernimmt und ursächlich für die Leukämieentstehung verantwortlich ist, wurden embryonale Zellen und primäre Leukämiezellen auf NANOG2-Expression durch RT-PCR-Experimente, Western Blot Analysen und ChIP Assays untersucht. Dabei konnte eine Methode zur Unterscheidung der NANOG1 und NANOG2-Transkripte etabliert, neue Genstrukturen dieser Gene charakterisiert und NANOG2-Transkripte in hämatopoetischen Stammzellen und in allen primären Leukämiezellen detektiert werden. Außerdem konnte mit Hilfe von Genexpressionsanalysen eine äquivalente Funktion von NANOG2 zu NANOG1 festgestellt werden.
Etablierung eines universellen Testsystems zur funktionellen Analyse neuer MLL-Fusionspartner
(2010)
Leukämische Erkrankungen entstehen häufig aufgrund genetischer Aberrationen. Dabei handelt es sich in den meisten Fällen um reziproke chromosomale Transloka-tionen, die an der Entstehung chimärer Fusionsgene mit intaktem Leserahmen betei-ligt sind und letztendlich zur Expression neuartiger Fusionsproteine führen. Das auf Chromosom 11 Bande q23 lokalisierte MLL-Gen (Mixed Lineage Leukemia) spielt bei einigen dieser chromosomalen Aberrationen eine wichtige Rolle. Es entstehen Fusi-onsproteine, die phänotypisch sowohl mit akuten myeloischen Leukämien (AML) als auch mit akuten lymphatischen Leukämien (ALL) assoziiert sind. Diese hämatopoie-tischen Erkrankungen werden aufgrund ihrer ungünstigen Prognose und schlechter Heilungschance als Hochrisiko-Leukämien klassifiziert. Neben Translokationen des MLL-Gens sind für die Leukämogenese noch weitere genetische Aberrationen von Bedeutung. Ebenso spielen, allerdings in geringerem Maße, Deletionen, Inversionen sowie Insertionen eine Rolle. Allen chromosomalen Translokationen sowie den übrigen chromosomalen Veränderungen geht mindestens ein DNA-Doppelstrangbruch voraus. Dieser findet sowohl beim MLL als auch beim Partnergen in sogenannten Bruchpunktsregionen statt. Inzwischen sind 104 verschiedene Veränderungen des MLL-Gens bekannt, von de-nen 64 auf molekularer Ebene charakterisiert wurden. Allein über 20 Partnergene wurden in den letzten fünf Jahren im Diagnostikzentrum DCAL (Diagnostic Center of Acute Leukemia) des Universitätsklinikums Frankfurt identifiziert. Allerdings sind bis heute noch keine universellen Ansätze zur Etablierung eines Tiermodells zur Unter-suchung neuer Partnergene bekannt. Somit ist es von großem Interesse möglichst schnell und zuverlässig dieses Ziel zu erreichen, um weitere Informationen über das onkogene Potential der beteiligten MLL-Partner zu erhalten. Als neue Kandidaten wurden im Rahmen dieser Arbeit DCPS, MAML2 sowie NRIP3 untersucht, die auf die Positivkontrolle ENL und auf die Negativkontrolle LASP1 bezogen wurden. Zunächst wurde ein universelles retrovirales Vektorsystem entwickelt, welches den MLL-N-Terminus (Exon 1 - Exon 9) trägt. Das zu untersuchende Partnergen kann durch Einklonieren der entsprechenden DNA-Sequenz in diesen Vektor eingefügt werden. Um ein authentisches Fusionsprodukt mit durchgehendem Leserahmen zu erhalten, sind die beiden Gene durch eine intronische Sequenz voneinander separiert. Die korrekte Fusion konnte auf Transkriptebene via RT-PCR nachgewiesen werden. In Vorversuchen wurden die Konstrukte MLL•DCPS, MLL•ENL (Positivkontrolle), MLL•LASP1 (Negativkontrolle), MLL•MAML2 sowie MLL•NRIP3 in murine hämato-poietische Progenitorzellen (Ba/F3 und 32D) transduziert. Die erfolgreiche Infektion konnte sowohl fluoreszenzmikroskopisch als auch auf Transkriptebene nachgewie-sen werden. Des Weiteren zeigten die Konstrukte unterschiedliche Einflüsse auf die Hox-Genexpression der Hox-Gene a5, a7, a9, a10, b3 und b4. Zur Untersuchung wachstumstransformierender und proliferierender Eigenschaften der Fusionsproteine folgten nach Abschluss der Vorversuche erste Transduktionsex-perimente mit murinen Lin-/Sca1+-hämatopoietischen Zellen. Mittels eines Methylcel-lulose-Assays sollten die transformierenden Eigenschaften der MLL-Fusionen über-prüft werden. Lediglich die Positivkontrolle wies wachstumstransformierende Eigen-schaften auf. Somit legen die bisherigen Ergebnisse die Vermutung nahe, dass noch weitere Faktoren für die Leukämogenese relevant sein müssen. Um Aussagen über das Verhalten der zu untersuchenden MLL-Fusionen in vivo tref-fen zu können, wurden retroviral infizierte, Lin-/Sca1+-aufgereinigte hämatopoietische Stammzellen in Empfängermäuse transplantiert. Bis zum jetzigen Zeitpunkt konnten bei den Mäusen noch keinerlei Symptome einer leukämischen Erkrankung diagnosti-ziert werden. Es ist abzuwarten, ob die transplantierten Mäuse in den nächsten Wo-chen leukämische Verhaltensauffälligkeiten aufweisen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte erfolgreich ein Testsystem etabliert werden, das es ermöglicht, neue Partnergene in kürzester Zeit funktionell zu analysieren. So können in Zukunft hoffentlich neue Erkenntnisse zur Leukämogenese gewonnen werden, die eventuell neue Therapieansätze ermöglichen.
Reziproke chromosomale Translokationen sind häufig mit Leukämien assoziiert und gelten in den meisten Fällen als Erkrankungsursache. Das MLL-Gen auf der Chromosomenbande q23 des Chromosoms 11 ist an einer Vielzahl chromosomaler Translokationen beteiligt, und die dadurch erzeugten reziproken MLL-Fusionsgene sind ausschließlich mit Hochrisikoleukämien assoziiert. Die häufigste Aberration ist eine reziproke Translokation zwischen den beiden Genen MLL und AF4 (4q21), die t(4;11)-Translokation, die in ca. 80% aller Akuten Lymphatischen Leukämien bei Kleinkindern, aber auch bei älteren Patienten mit einer Sekundärleukämie, auftritt. Die leukämischen Blasten dieser Patienten sind meist gegen konventionelle Therapien resistent, so dass t(4;11) Leukämien mit einer ungewöhnlich schlechten Prognose verbunden sind. Welches der beiden Fusionsproteine, MLL-AF4 oder AF4-MLL, die bei der t(4;11)-Translokation entstehen für die Entstehung der Leukämie verantwortlich ist, wird noch kontrovers diskutiert. Bisherige Publikationen zeigen die Onkogenität beider Fusionsproteine, und ihr Potential, Leukämien im Mausmodell hervorzurufen. Frühere Studien dieser Arbeitsgruppe zeigen die onkogene Wirkung des AF4-MLL Fusionsproteins, dessen Expression zur Wachstumstransformation von murinen Zellen und einer Akuten Lymphatischen Leukämie in der Maus führt. Die onkogene Wirkung von AF4-MLL entsteht, sobald das Fusionsprotein nach seiner Prozessierung durch die Endopeptidase Taspase1 heterodimerisiert und dadurch vor SIAH-vermitteltem proteasomalen Abbau geschützt wird. So kann sich das heterodimerisierte Protein - anders als das AF4-Wildtyp Protein - in den Zellen anhäufen und zu unkontrolliertem Wachstum führen. Um die Heterodimerisierung des AF4-MLL Fusionsproteins kompetitiv zu inhibieren, wurden im Rahmen dieser Arbeit kleine Fragmente aus der C-terminalen Interaktionsdomäne FYRC von MLL exprimiert. Dazu wurde die Interaktion kleiner Peptide aus der FYRC-Domäne mit dem N-terminalen Fragment des AF4-MLL Proteins mithilfe eines Biosensorsystems und Co-Immunopräzipitationen getestet. Anschließend wurden die kleinsten Peptide, die noch an das N-terminale Fragment binden können (B1 und B3), ausgewählt, und zusammen mit AF4-MLL co-exprimiert. Mithilfe von Western Blot-Analysen von gereinigtem AF4-MLL·N konnte gezeigt werden, dass die Expression dieser Peptide dazu führt, dass das C-terminale Fragment nicht mehr an das N-terminale Fragment binden kann. Durch diese Inhibition der Heterodimerisierung kann der AF4-MLL Multiproteinkomplex nicht vollständig aufgebaut werden, da auch die C-terminalen Komplexpartner WDR5 und RBBP5 nur noch eingeschränkt binden können. Zusätzlich wurde die Stabilität der prozessierten Fragmente AF4-MLL·N und MLL·C im Falle einer Inhibition der Dimerisierung untersucht. Offensichtlich sind beide Fragmente nur stabil, wenn sie miteinander heterodimerisiert sind. Eine Blockierung der Interaktion durch kompetitive Peptide führt dazu, dass sowohl AF4-MLL·N als auch MLL·C proteasomal degradiert werden. Da auch das MLL-Wildtyp Protein über die Interaktionsdomänen FYRN und FYRC heterodimerisiert, wurde zusätzlich der Effekt der Expression der Peptide auf die Viabilität von MLL-exprimierenden Zellen untersucht. Dazu wurden die Peptide B1 und B3 in sechs unterschiedlichen Zelllinen, von denen zwei die t(4;11)-Translokation tragen, exprimiert. Anschließend wurde nach einer PI-Färbung der Anteil apoptotischer Zellen mithilfe eines Durchflusszytometers ermittelt. Die vorliegenden Daten deuten darauf hin, dass keines der beiden Peptide einen starken Einfluss auf Zelllinien hat, die das Wildtyp-MLL Gen besitzen. Die Apoptose der vier untersuchten Zelllinien war kaum erhöht, wenn diese Peptide exprimiert wurden. Interessanterweise scheint das Peptid B1 dagegen einen Apoptosefördernden Effekt auf diejenigen Zellen zu haben, die das AF4-MLL Protein exprimieren. Basierend auf den vorliegenden Daten kann die Aussage getroffen werden, dass es prinzipiell möglich ist, das AF4-MLL Fusionsprotein spezifisch anzugreifen. Eine Blockierung der Heterodimerisierung blockiert die Ausbildung des onkogenen AF4-MLL Multiproteinkomplexes. Dies führt zudem dazu, dass die beiden Taspase1-prozessierten Fragmente AF4-MLL·N und MLL·C proteasomal degradiert werden. Die Inhibition der Heterodimerisierung von AF4-MLL ist mit einer leicht erhöhten Apoptoserate in t(4;11)-positiven Zellen verbunden. Diese Beobachtung könnte in Zukunft von Bedeutung sein, wenn über neue Therapieansätze bei t(4;11) Leukämien nachgedacht werden sollte.
Die Hodgkin/Reed-Sternberg Zellen des klassischen Hodgkin Lymphoms stammen von Keimzentrums-B-Zellen ab. Dennoch prägen sie fast keine B-Zell-spezifischen Gene aus, stattdessen ko-exprimieren sie Marker anderer hämatopoetischer Linien. Die Ursache für den Verlust des B-Zell-Phänotyps ist weitestgehend unbekannt, da die Transkriptionsfaktoren E2A und PAX5, die in reifen B-Zellen zur Aufrechterhaltung der Expression B-Zell-spezifischer Gene essentiell sind, von primären HRS Zellen ausgeprägt werden. Allerdings wird PAX5 im Vergleich zu normalen B-Zellen deutlich schwächer exprimiert. E2A wird durch direkte Interaktion mit dem inhibitor of DNA binding, ID2, negativ reguliert. ID2 besitzt eine bHLH-Struktur und dimerisiert mit Transkriptionsfaktoren. Da ihm jedoch die DNA-bindende Domäne fehlt, wird die Bindung der Heterodimere an die DNA verhindert und die Transkriptionsfaktoren somit inaktiviert. In hämatopoetischen Zellen scheint die ID2-Expression die B-Zell-Entwicklung und auch die Expression B-Zell-spezifischer Gene zu unterdrücken und stattdessen die Ausprägung von Genen anderer Linien zu unterstützen. In reifen B-Zellen wird ID2 während der Plasmazellentwicklung bei gleichzeitigem Verlust der Expression B-Zell-spezifischer Gene stark exprimiert. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass ID2, das in normalen B-Zellen nicht detektiert werden konnte, dagegen in allen HL-Fällen nicht nur auf RNA-Ebene, sondern auch auf Proteinebene stark exprimiert wird. Ko-Immunopräzipitation des E2A mit ID2 aus HL-Zelllinien zeigte die Interaktion und somit vermutlich auch die transkriptionelle Inaktivierung des E2A durch ID2, wodurch es zum Verlust der Expression B-Zell-spezifischer Gene kommt. Darüber hinaus wird PAX5 zusammen mit EBF durch E2A induziert. So führt die ID2-vermittelte E2A-Inaktivierung im HL vermutlich dazu, dass ID2 via EBF auch die Regulation von PAX5 beeinflusst. PAX5 spielt bei der Differenzierung eine duale Rolle, denn es aktiviert nicht nur B-Zell-spezifische Gene, sondern es unterdrückt auch die Gene anderer Linien. Demnach könnte ID2 auch an der Expression der nicht-B-Zell-spezifischen Gene im HL beteiligt sein. Darüber hinaus ist ID2 im HL durch die E2A-Inaktivierung via EBF auch möglicherweise an der schwächeren Expression des PAX5 im Vergleich zu normalen B-Zellen beteiligt. Obwohl das ID2-Protein in den HL-Zelllinien durch RNA-Interferenz erfolgreich reduziert werden konnte, zeigte sich allerdings weder eine Änderung der Proteinexpression der B-Zell-spezifischen Gene CD19 und CD79A noch der Gene anderer hämatopoetischer Linien GATA-3 und M-CSF-R. Unabhängig von seiner möglichen Beteiligung an der Dedifferenzierung der HRS Zellen im HL, spielt ID2 vermutlich auch eine weitere Rolle in der Pathogenese des HL. Verschiedene Interaktionen weisen darauf hin, dass ID2 auch an der Regulation des Zellzyklus beteiligt ist. Zum einen konnte in dieser Arbeit die Interaktion des ID2 mit dem HLH-Protein HEF1 zumindest in einer der HL-Zelllinien gezeigt werden. HEF1 ist ein Aktivator der Aurora Kinase 1, welche nach Aktivierung Gene phosphoryliert, die den Ablauf der Mitose begünstigen. Zum anderen konnte der negative Zellzyklusregulator p21Cip1 in HL-Zelllinien durch RNAi-vermittelte Reduktion des ID2-Proteins als ID2-Target-Gen identifiziert werden. Auch wenn die Interaktion mit RB, dem zur Familie der Pocket-Proteine gehörenden Schlüsselregulator des Zellzyklusverlaufs, in HL-Zelllinien nicht nachgewiesen werden konnte, zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass die aberrante ID2-Expression offenbar an der Veränderung des Zellzyklus im HL beteiligt ist. Sie lassen jedoch noch keinen endgültigen Schluss zu. Wie in dieser Arbeit gezeigt wurde, wird ID2 ebenfalls im analplastisch großzelligen T-Zell-Lymphom aberrant exprimiert. Auch eine Interaktion mit E2A, das auch in der T-Zell-Entwicklung eine Rolle spielt, konnte gezeigt werden. Nicht zuletzt scheint demnach ID2 auch in der Dedifferenzierung des ALCL ein wichtiger Faktor zu sein. ID2 wird im HL aberrant exprimiert und es konnte die Interaktion mit E2A in den HL-Zelllinien nachgewiesen werden, wodurch die transkriptionelle Aktivität des E2A vermutlich inhibiert wird. Auch wenn in Folge der RNAi-vermittelten Herunterregulation von ID2 in den HL-Linien weder eine Re-Expression B-Zell-spezifischer Gene noch eine Beeinflussung der Expression Marker andere hämatopoetischer Linien gefunden werden konnte, spielt ID2 vermutlich dennoch eine wichtige Rolle in der Dedifferenzierung der HRS Zellen im HL. Unabhängig davon konnte der negative Zellzyklusregulator p21Cip1 als ID2-Target-Gen identifiziert und eine Interaktion mit HEF1 gezeigt werden. Demnach ist ID2 möglicherweise nicht nur an der Dedifferenzierung, sondern auch an der Dysregulation des Zellzyklus im HL beteiligt und somit ein wichtiger Faktor in der Pathogenese des HL.
Antiproliferative und proapoptotische Mechanismen des Morphins - Konsequenzen für die Krebstherapie
(2008)
Im Rahmen dieser Arbeit sollte geprüft werden, ob Morphin in der Prostatakarzinomtherapie eingesetzt werden kann. Prostatakrebs ist bei Menschen eine der vier häufigsten aber kaum therapierbare Krebserkrankung. Nach dem Wiederauftreten des Karzinoms weist diese eine extrem hohe Mortalitätsrate auf. Morphin hemmt in MCF7-Zellen, die wie Prostatakarzinome zu den Adenokarzinomen gehören, das Tumorwachstum bei klinisch relevanten Plasmakonzentrationen und weist einen scheinbar μ-Opioid-Rezeptor unabhängigen antiproliferativen Effekt auf. In Kombination mit Naloxon kann dieser Effekt noch gesteigert werden. Somit könnte in Patienten das Tumorwachstum gehemmt werden, ohne die klassischen Nebenwirkungen hervorzurufen. Für den antiproliferativen Effekt ist die Stabilisierung von p53 notwendig. Prostatakarzinome schienen für eine Therapie mit Morphin prädestiniert, da p53 nur sehr selten in diesen Karzinomen mutiert ist. Für die Experimente wurde die LNCAP Prostatakarzinomzelllinie eingesetzt. Da Morphin weder das Tumorwachstum, noch die Zellproliferation in LNCAP-Zellen hemmte, scheint Morphin für die Behandlung von Prostatakarzinomen nicht geeignet zu sein. Durch Untersuchung der Angiogenese in LNCAP Tumoren konnte gezeigt werden, dass eine geringere Vaskularisierung keine verminderte Tumormasse zur Folge hat. Für eine erfolgreiche Krebstherapie scheint es im Gegenteil wichtig zu sein, eine normale Vaskularisierung in Tumoren wiederherzustellen. Die unterschiedlichen Morphinsensitivitäten der beiden Adenokarzinomzelllinien führte zu der Hypothese, dass der μ-Opioid-Rezeptor - zumindest partiell - doch an der Vermittlung des antiproliferativen Effekts des Morphins beteiligt sein könnte. Morphin induziert verschiedene Effekte in MCF7-Zellen, während LNCAP-Zellen kaum auf Morphin reagierten. Es sollte daher untersucht werden, warum MCF7-Zellen sensitiver auf Morphin ansprechen. Durch Überlebenstests mit MCF7-Zellen konnte gezeigt werden, dass eine Behandlung der Zellen mit Morphin in Kombination mit exogenem Glutathion das Überleben der MCF7-Zellen im Vergleich zu morphinbehandelten Zellen signifikant steigern konnte. Dies war ein Hinweis, dass Morphin erstens die Bildung von ROS induziert und dies zweitens in einem Ausmaß geschieht, dass die Überlebensrate der MCF7-Zellen konzentrationsabhängig gehemmt wurde. In weiteren Experimenten zeigte sich, dass die Inkubation der MCF7-Zellen mit Morphin weder die endogene Glutathionkonzentration noch die Expressionsraten der detoxifizierenden Enzyme SOD1 und P5 moduliert. Morphin induziert bei Konzentrationen von 100 μM und 1000 μM in MCF7-Zellen eine signifikant gesteigerte Superoxidanionenbildung. Wie bei den MCF7 Überlebenstests konnte exogen gegebenes Glutathion die durch 100 μM Morphin induzierte Superoxidanionenbildung unterdrücken. Die verstärkte Bildung der Superoxidanionen ist auf Morphin beschränkt, da sie nicht durch die Gabe von Fentanyl, Levomethadon oder Oxycodon induziert werden konnte. Die Bildung der Superoxidanionen könnte Morphin durch die Modulation einer plasmamembranständigen NADH Oxidase hervorrufen. Weiterhin wurden die Folgen einer chronischen Morphingabe im Rückenmark untersucht. Es wird vermutet, dass Morphin im Rahmen einer chronischen Behandlung Apoptose in GABAergen Neuronen auslöst. Für die neuronenspezifische Apoptose nach chronischer Morphingabe konnten durch FACS-Analysen ebenfalls Hinweise gefunden werden. Mittels vergleichender Proteomanalyse konnte festgestellt werden, dass VDAC1 im Rückenmärkgewebe von Tieren, die eine beginnende Morphintoleranz aufweisen, verstärkt exprimiert wurde. Neue Untersuchungen zeigen, dass VDAC1 in der Plasmamembran als Redoxenzym fungieren kann. Dort ist es mit einer NADH Oxidase in den PMOR Komplex eingebunden, der eine wichtige Rolle in der Regeneration von NAD+ aus NADH spielt und so Überleben und Zellwachstum ermöglicht. Eine Störung des PMOR Komplexes hat die Bildung von Radikalen zur Folge. In dieser Arbeit wird die Hypothese aufgestellt, dass Morphin durch Modulation der plasmamembranstädnigen NADH Oxidase in MCF7-Zellen die Bildung von Superoxidanionen induziert. Als Konsequenz könnte VDAC1 verstärkt phosphoryliert werden, um die NAD+/NADH Homöostase aufrecht zu erhalten. Im Laufe der chronischen Morphingabe wird postuliert, dass sich derart viele Superoxidanionen akkumulieren, dass schwerwiegende Schäden an den Makromolekülen vorliegen und die Zelle daher in die Apoptose geht.
Taspase1 stellt die bisher einzige Typ2-Asparaginase mit proteolytischer Aktivität dar. Das wichtigste Substrat der Taspase1 ist das MLL-Protein, einem Homolog des Trithorax- Proteins aus Drosophila melanogaster, das auch dort eine wichtige Rolle bei Differenzierungsprozessen spielt. Bei Patienten mit einer t(4;11)-Translokation ist Taspase1 maßgeblich an der Ausbildung einer t(4;11)-assoziierten Leukämie beteiligt. Die Inhibierung der proteolytischen Aktivität der Taspase1 könnte daher einen Ansatzpunkt für eine neuartige Krebstherapie darstellen. Aufgrund der ungewöhnlichen Eigenschaften von Taspase1 ist es bisher nicht gelungen einen selektiven Inhibitor für das katalytische Zentrum der Taspase1 zu identifizieren. Unter nativen Bedingungen (ca. 50 mM NaCl) befindet sich Taspase1 bereits in einem nahezu vollständig inhibierten Zustand, da im katalytischen Zentrum der Taspase1 ein Chloridion komplexiert ist. Dieses Chloridion wird einzig und allein nach Interaktion mit dem natürlichen Substrat MLL aus dem katalytischen Zentrum verdrängt, was zu einer kurzfristigen Aktivierung der Taspase1 führt. Nach Ablauf der hydrolytischen Spaltung des Substrates nimmt das Chloridion wieder seine Position im katalytischen Zentrum ein. Unter diesen Bedingungen ist aus sterischen Gründen die Bindung eines potentiellen Inhibitors im katalytischen Zentrum nicht möglich. Durch Herstellung von Mutanten der Taspase1 und deren Substrats konnte der Mechanismus der katalytischen Spaltung durch Taspase1 aufgeklärt werden. Dabei erwiesen sich drei Aminoäuren als essentiell für die Hydrolyse. Interessanterweise ist die Anwesenheit des Substrates, insbesondere des Aspartates an Position Sieben der cleavage sites CS1 bzw. CS2 notwendig um den katalytischen Prozess zu starten. Das negativ geladene Aspartat, verdrängt zunächst das Chloridion von seiner Position und aktiviert dadurch das katalytische Zentrum (Rotation von Threonin 234). Erst dadurch wird Threonin 234 zu einer katalytisch aktiven Aminosäure und kann einen nukleophilen Angriff auf die Peptidbindung zwischen Aspartat und Glycin des Substrates durchführen. Die Hydrolyse wird dabei durch die OH-Gruppe des Serins 252 durch Wechselwirkung mit dem Carboxylsauerstoff unterstützt. Durch Mutation beider Aspartate an Position sieben im artifiziellen Substrat 2CL zu Glycin oder Lysin führte zu einem vollständigen Verlust der hydrolytischen Spaltung an CS1 und zu einem starken Rückgang der hydrolytischen Spaltung an CS2. Die Mutationen T234D und S252D der Taspase1 führten beide zum vollständigen Verlust der katalytischen Spaltung, sowohl in cis, als auch in trans. Unter Verwendung des Taspase1-Aktivitätsassays konnte der transkriptionelle Regulator MLL4 als potentielles Substrat der Taspase1 identifiziert werden.
LINE-1-Retrotransposons sind für die Entstehung von über 35 % des menschlichen Genoms verantwortlich. Während ihre Aktivität entscheidend zur Evolution von Säugetieren allgemein und des Menschen im Speziellen beigetragen hat, kann die L1-Expression und die L1-vermittelte Retrotransposition schädigende Auswirkungen für die Wirtszelle haben (Goodier und Kazazian, 2008). Die Liste der dokumentierten, durch L1-Aktivität hervorgerufenen Erkrankungen umfasst gegenwärtig ca. 65 Fälle von genetischen bzw. Tumorerkrankungen und wird immer länger. Um die Anzahl schädigender L1-Retrotranspositionsereignisse zu minimieren, hat der menschliche Organismus Strategien entwickelt, um die L1-Retrotransposition zu kontrollieren. Eine dieser Strategien ist die Inhibition der L1-Aktivität durch Mitglieder der APOBEC-Proteinfamilie, wobei deren jeweilige Mechanismen der L1-Inhibition gegenwärtig noch nicht aufgeklärt sind. Es war daher das Ziel dieser Arbeit, Einblicke in die Mechanismen der Hemmung der L1-Retrotransposition durch Mitglieder der Familie der humanen APOBEC3-Proteine zu bekommen, wobei eine Fokussierung auf den durch APOBEC3C vermittelten Mechanismus vorgenommen wurde. Aufbauend auf kürzlich publizierte Daten zur Hemmung der L1-Retrotransposition durch die APOBEC3-Proteine A3A, A3B, A3C und A3F (Bogerd et al., 2006; Chen et al., 2006; Muckenfuss et al., 2006) wurde eine Arbeitshypothese entwickelt, welche die L1-Inhibition durch APOBEC3-vermittelte Deaminierung von Cytosinen der L1-cDNA unter der Beteiligung von Faktoren des „Base Excision Repair“-Weges erklärt. Diese Arbeitshypothese steht im Einklang mit der Abwesenheit nachweisbarer G-zu-A-Hypermutationen von L1-Kopien wie sie für die APOBEC3-spezifische Deaminaseaktivität charakteristisch sind, sowie mit der Existenz 5’-verkürzter genomischer L1-Kopien. Die Ergebnisse aus in silico-Analysen der 5’-Enden von 38 L1-Neuinsertionen aus Zellkulturexperimenten, die in Anwesenheit von endogen exprimiertem A3B, A3C und A3H retrotransponiert waren, sowie von 885 genomischen, endogenen L1-Kopien waren in Übereinstimmung mit unserer Arbeitshypothese, da in beiden Fällen Guanin als erste fehlende L1-Nukleobase am L1-5’-Ende statistisch signifikant überrepräsentiert vorliegt. Während für die Inhibition von L1 durch A3A dessen Deaminaseaktivität notwendig ist, wurde gezeigt, dass A3C die L1-Retrotransposition über einen deaminaseunabhängigen Mechanismus hemmt. Die L1-Inhibition durch A3C erforderte sowohl eine funktionelle Dimerisierungsdomäne als auch eine intakte RNA-Bindedomäne. Die Identifizierung von A3C und L1-ORF1p in derselben Saccharosegradientenfraktion sowie die Kolokalisation beider Proteine im Zytoplasma von HeLa- bzw. 143B-Zellen sprechen für eine Interaktion von A3C mit L1-ORF1p bzw. L1-RNPs. Da eine direkte Interaktion von A3C und L1-ORF1p mittels Immunopräzipitation nicht nachgewiesen werden konnte, spricht dies dafür, dass die Interaktion nicht auf einen direkten Kontakt zwischen A3C und L1-ORF1p beruht. Eine direkte Interaktion zwischen A3A und L1-ORF1p konnte ebenfalls nicht nachgewiesen werden. Vielmehr spricht die Abhängigkeit der A3C-vermittelten Hemmung von der intakten RNA-Bindedomäne, experimentelle Daten, welche eine Interaktion mit L1-RNPs vorschlagen, sowie die Kolokalisation von A3C und L1-ORF1p im Zytoplasma für eine Sequestrierung der L1-RNPs, die Behinderung des nukleären Imports der L1-RNPs oder aber eine Blockierung der TPRT-Initiation als mögliche Mechanismen der A3C-vermittelten Hemmung der L1-Retrotransposition.
Die Mehrheit (60%) aller AML-Erkrankungen beruhen auf chromosomalen Aberrationen, genauer genommen Translokationen, bei der zwei chromosomale Bruchstücke zu einem Chimärgen refusionieren. Die daraus resultierenden Fusionsproteine sind charakteristisch für die verschiedenen Formen der AML-Erkrankungen. In 97% aller Fälle der APL-Erkrankungen, einer Unterform der AML, tritt die t(15;17) und in weniger als 2% die t(11;17) auf. Die t(15;17) führt zu dem rekombinanten Fusionsprotein PML/RARK und die t(11;17) zu PLZF/RARK (X-RARK). Der APL-assoziierte leukämische Phänotyp X-RARKpositiver Zellen zeichnet sich durch die Blockierung terminaler Differenzierung früher hämatopoetischer Vorläuferzellen und dem gesteigerten Selbsterneuerungspotenzial leukämischer Stammzellen (LSCs) aus. Demzufolge können PML/RARK und PLZF/RARK auf der Ebene des frühen Vorläufers sowie der HSCs die leukämische Pathogenese initiieren. Bei der Erforschung der molekularen Grundlagen für die X-RARK-vermittelte Steigerung der aberranten Selbsterneuerung LSCs hat sich ergeben, dass die aberrante Aktivierung des Wnt-Signalweges eine zentrale Rolle einnimmt. Die Schlüsselmoleküle der aberranten Aktivierung des Wnt-Signalweges und damit der gesteigerten Selbsterneuerung sind 2-Catenin und Plakoglobin, die wiederum durch AML-assoziierte Fusionsproteine wie PML/RARK, PLZF/RARK und AML1/ETO transkriptionell hochreguliert werden. Das ansteigende Proteinniveau von 2-Catenin und Plakoglobin, welches entscheidend zur Initiation der Leukämieerkrankung beiträgt, führt zur nukleären Akkumulation von 2-Catenin und zur Aktivierung der CF/LEF-Familienmitglieder kontrollierten Genexpression. Aus diesem Grund stellen 2-Catenin und Plakoglobin einen wichtigen Ansatzpunkt für neue Therapieansätze in der Behandlung der AML dar. Die aberrante Aktivierung und pharmakologische Inhibition des Wnt-Signalweges, insbesondere von 2-Catenin, hat in zahlreichen humanen Krebserkrankungen, wie Brust-, Prostata-, Adenom- und Kolonkarzinomen, zu therapeutischen Erfolgen geführt. Grundlage der erfolgreichen pharmakologischen Inhibition des aberranten Wnt-Signalweges ist die Verwendung von Inhibitoren aus der Gruppe der nichtsteroidalen Entzündungshemmer (NSAIDs). Sulindac und seine Metabolite, Sulfon, das keine COX-inhibitorische Wirkung aufweist, und Sulfid, einem spezifischen COX-1/-2- Inhibitor, sind Vertreter der Gruppe der NSAIDs und haben in klinischen Studien erfolgreich die Größe und Anzahl der Kolorektaltumore von FAP-Patienten reduziert. Es deutet alles daraufhin, dass die vermittelten Effekte von Sulindac und seinen Metaboliten in den bisher untersuchten Zellsystemen in einem zur COX-Inhibition unabhängigen Kontext stehen. Zusammenfassung: 135 Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Ziel verfolgt herauszufinden, ob die Verwendung von NSAIDs einen neuen Therapieansatz in der gezielten pharmakologischen Bekämpfung der leukämischen Stammzelle („ stem cell targeting“) zur Behandlung der AML darstellen können. Sulindac (S), Sulindac Sulfid (SSi) und Sulindac Sulfon (SSo) sind in der Lage unabhängig von der PML/RARK-Expression die Viabilität leukämischer monozytärer U937-Zellen zu reduzieren und dosisabhängig in X-RARKpositiven U937-Zellen die Apoptose zu induzieren. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass in einem Konzentrationsbereich von 75-100 μM PML/RARK-positive U937-Zellen geringfügig stärker auf die Apoptoseinduktion reagieren als die Kontrollzellen. Des Weitern senkt SSi in PML/RARK-positiven NB4-Zellen am effektivsten das Proteinniveau von PML/RARK, 2-Catenin und Plakoglobin. Dem gegenüber weist sich SSo in KG-1-Zellen als potenteres Agenz aus, das Proteinniveau von PML/RARK, 2-Catenin und Plakoglobin effektiv zu senken. Zusätzlich deuten die Ergebnisse der Westernblotanalyse aus den KG-1- Experimenten daraufhin, dass der induzierte Proteinabbau nicht auf einen PML/RARKvermittelten Effekt zurückzuführen ist. Hinzu kommt, dass gezeigt werden konnte, dass SSi im Vergleich zu SSo in klinisch relevanten Konzentrationsbereichen weit aus effektiver die Viabilität PML/RARK-positiver NB4-Zellen reduziert und Apoptose induziert. Im Rahmen der seriellen Replattierungsexperimente konnte gezeigt werden, dass SSi in der Lage ist, mit dem leukämogenen Potenzial PML/RARK- und PLZF/RARK-exprimierender Stamm- und Progenitorzellen zu interferieren bzw. dieses zu revertieren. Darüber hinaus beherrscht und hebt SSi die 2-Catenin- und Plakoglobin-vermittelten Effekte auf das Stammzellpotenzial HSCs auf. Im Zuge der experimentellen Analyse des Einflusses von SSi auf die Wnt-Signalwegaktivierung hat sich gezeigt, dass SSi in der Lage ist, die PML/RARK- und S33A-vermittelte aberrante Wnt-Signalwegaktivierung zu reduzieren. Hinzu kommt, dass SSi die Siah1-Promotoraktivität stimuliert, die wiederum zur Expression von Siah-1 führt und einen phosphorylierungsunabhängigen 2-Catenin- und PML/RARK-Abbau induziert. Ferner hebt SSi den X-RARK-vermittelten Differenzierungsblock auf und inhibiert spezifisch die Proliferation PML/RARK- und PLZF/RARK-positiver HSCs. In humanen APL-Zellsystemen ist SSi alleine nicht imstande in vergleichbarem ATRA-Ausmass granulozytäre Differenzierung zu induzieren, aber den ATRA-vermittelten Effekt in der humanen APL-Patienten abgeleiteten NB4-Zelllinie zu verstärken. Infolge der Zellzyklusanalyse konnte gezeigt werden, dass SSi zu einer PML/RARK-spezifischen Apoptoseinduktion, ermittelt durch den Anstieg der subG0/G1-Phase, führt, welche in der PML/RARK-negativen Zelllinie ausbleibt. Darüber hinaus verhindert die Präsenz von PML/RARK ein SSi induziertes Ausscheren der Zellen in die G0/G1-Phase. Zusätzlich haben in vivo Experimente (CFU-S12) ergeben, dass SSi die Kurzzeitstammzellkapazität X-RARK-positiver HSCs senkt. SSi induziert außerdem im humanen Stammzellmodel der KG-1-Zellen die RARK-spezifische Reduktion der stammzellähnlichen CD34+/CD38-/ALDH+-KG1-Subpopulation, wobei die Reduktion dieser Subpopulation nicht auf zytotoxischen Effekten beruht. Des Weiteren ist SSi in der Lage die ALDH+-NB4-Subpopulation zu senken, wohingegen die Abwesenheit von PML/RARK in U937-Zellen eine Stimulation der ALDH+-Population zulässt. Zusammenfassend bleibt zusagen, dass SSi ein vielversprechender Kandidat für den Einsatz in der „Stammzelltargeting-Therapie“ zur Behandlung akuter Leukämien darstellt. Nicht nur die effiziente Inhibition des aberranten Wnt-Signalweges, der maßgeblich am X-RARK-vermittelten leukämischen Phänotyp beteiligt ist, sondern auch die gezielte Reduktion der X-RARK-assoziierten Stammzellpopulation könnte SSi möglicherweise favorisieren, unterstützend zu anderen Chemotherapeutika, in der Erhaltungstherapie eingesetzt zu werden. SSi-assoziierte renale und gastrointestinale Nebeneffekte sowie der beobachtete Wachstumskompensationsmechanismus sollten zum gegenwärtigen Zeitpunkt pharmakologisch beherrschbar sein.
Nukleäre Rezeptoren regulieren eine Vielzahl von Genen durch Bindung an bestimmte DNA-Sequenzen im Promotor dieser Gene. Sie fungieren als Transkriptionsfaktoren, die nach Bindung ihres Ligandendie Transkription aktivieren oder supprimieren. In ihrer Funktion werden sie weiterhin durch verschiedene Signale moduliert, beispielsweise durch posttranslationale Veränderungen. Aufgrund der Möglichkeit, durch Liganden, in der Regel kleine lipophile Moleküle, die Aktivität nukleärer Rezeptoren und in der Folge die Transkription definierter Gene zu beeinflussen, sind nukleäre Rezeptoren gute Zielstrukturen für Arzneistoffe und stehen im Zentrum intensiver Forschungsbemühungen. ROR alpha und RevErb alpha sind nukleäre Rezeptoren aus der Gruppe der sogenannten Orphan-Rezeptoren. Die Angehörigen dieser Gruppe wurden als Waisen bezeichnet, da ihr Ligand zum Zeitpunkt ihrer Charakterisierung unbekannt war. 2007 gelang es zwei Gruppen unabhängig voneinander Häm als den Liganden des RevErb alpha zu identifizieren, für ROR alpha werden verschiedene potentielle Liganden diskutiert, wobei bisher keiner allgemein anerkannt wurde. ROR alpha und RevErb alpha steuern die Expression ihrer Zielgene über ein gemeinsames Response-Element, wobei ROR alpha die Expression dieser Gene aktiviert und RevErb alpha sie inhibiert. Gemeinsam nehmen sie eine zentrale Rolle in der Aufrechterhaltung zirkadianer Rhythmen und an der Integration dieser in metabolische Prozesse ein. ROR alpha ist weiterhin beteiligt an der Reifung der Cerebellums sowie an der Steuerung der Immunabwehr. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Regulation der beiden Rezeptoren auf molekularer Ebene aufzuklären. Hierfür wurden Untersuchungen auf Ebene der Transkription ebenso wie auf posttranslationaler Ebene durchgeführt. Es zeigte sich, dass ROR alpha - hnRNA in vitro extrem stabile Sekundärstrukturen ausbildet und somit bei der reversen Transkription den Transkriptionsstart selbst initiieren kann. Im Zuge der durchgeführten Untersuchungen konnte nicht nachgewiesen werden, welche Auswirkung diese Sekundärstrukturen in vivo zeigen. Studien anderer Gruppen hatten aber gezeigt, dass die Ausbildung von RNA-Doppelsträngen an vielen Stellen in die Regulationen von Genen eingreift, sei es durch Veränderungen des Spleißmusters, RNA-Editierung oder durch Herabregulierung der Transkriptmenge. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass sowohl RevErb alpha als auch ROR alpha einer intensiven Regulation durch posttranslationale Veränderungen unterliegen, im Speziellen durch Phosphorylierung. Vorangegangene Studien hatten Hinweisegeliefert, dass ROR alpha durch ERK-2 phosphoryliert werden kann. In meinen Studien war ich in der Lage nachzuweisen, dass auch RevErb alpha Ziel dieser Kinase ist. Im Gegensatz zu ROR alpha wird RevErb alpha jedoch gleichzeitig an mehreren Stellen phosphoryliert, wobei die physiologische Funktion dieser Phosphorylierungen Gegenstand weiterer Untersuchungen ist. Die Aktivität von ROR alpha am Response-Element wird durch eine Erhöhung des intrazellulären cAMP-Spiegels stark stimuliert. Im Zuge meiner Untersuchungen konnte eine Beteiligung sowohl des cAMP-Response-Elementbindenden Proteins CREBals auch des PPAR gamma - Coaktivators 1a an der Vermittlung dieser Aktivitätssteigerung ausgeschlossen werden. Es zeigte sich jedoch, dass der Effekt durch eine Hemmung der Proteinkinase A dosisabhängig aufgehoben werden konnte. In weiteren Untersuchen konnte ich eine direkte Phosphorylierung von ROR alpha, nicht aber von RevErb alpha durch PKA nachweisen und die Phosphorylierungsstelle als Serin 99 des ROR alpha 4 identifizieren. Da eine Mutation der in der C-terminalen Verlängerung der DNA-bindenden Domäne des Rezeptors gelegenen Aminosäure jedoch nicht in der Lage war, die Aktivitätssteigerung zu verhindern, sind auch noch weitere Faktoren, vermutlich zelluläre Coaktivatoren an deren Vermittlung beteiligt. Bereits in früheren Untersuchungen war beschrieben worden, dass die Aktivität von ROR alpha durch eine Erhöhung des intrazellulären Calciumspiegels stark stimuliert wird. Weiterhin fanden sich Hinweise, dass die Calcium/-Calmodulin-abhängige Kinase IV an der Vermittlung dieser Stimulation beteiligt ist, jedoch ohne direkte Phosphorylierung von ROR alpha durch CaMKIV. Es konnte allerdings nicht aufgeklärt werden, über welchen Mechanismus die Signaltransduktion stattdessen erfolgt. In meinen Untersuchungen konnte ich zeigen, dass eine Inhibition durch Proteinkinase A aktivierter Signalwege auch die Aktivierung von ROR alpha durch CaMKIV dosisabhängig hemmte. Zusammengenommen lieferten meine Untersuchungen weitere Hinweise auf eine wichtige Rolle von ROR alpha in der Regulation metabolischer Prozesse wie des Glycogen- und Lipidstoffwechsels. Außerdem deuten meine Ergebnisse auf eine Verknüpfung der Signalwege von CaMKIV und Proteinkinase A hin und etablieren ROR alpha als gemeinsame Zielstruktur
In der retroviralen Gentherapie von Gliomen ist die effiziente und spezifische Transduktion von Gliomzellen ausschlaggebend für den Therapieerfolg. Als besonders schwierig erwies sich in diesem Zusammenhang [1]: (i) die ausreichende Distribution retroviraler Vektoren im Tumorgewebe (ii) die Transduktion einzelner, infiltrierender Tumorzellen und (iii) die Transduktion von Tumorbereichen mit geringer Zellzeilungsaktivität. In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Strategien angewandt, um diese Ziele zu erreichen. Lentivirale Vektoren wurden mit Glykoproteinen des Lymphozytären Choriomeningitis Virus (LCMV-GP) und des Vesikulären Stomatitis Virus (VSV-G) pseudotypisiert. Lentivirale Vektoren vermitteln anders als gammaretrovirale Vektoren einen effizienten Gentransfer in ruhende Zellen [2]. Auf diese Weise können auch Tumoranteile mit geringer Zellteilungsaktivität transduziert werden. Allerdings sollte dabei die Transduktion des ebenfalls mitotisch inaktiven Hirngewebes vermieden werden. Vergleichende Tropismusstudien mit den oben genannten Pseudotypvektoren zeigten, dass LCMV-GP Pseudotypen einen effizienten und spezifischen Gentransfer in Gliomzellen in vitro und in vivo vermitteln. Auch einzelne, infiltrierende Tumorzellen wurden von LCMV-GP Pseudotypvektoren transduziert. Normale Hirnzellen, insbesondere Neurone, wurden von LCMV-GP Pseudotypen dagegen kaum infiziert. Im Gegensatz dazu transduzierten VSV-G Pseudotypen Neurone in vitro und in vivo mit hoher Effizienz, während Gliomzellen von VSVG Pseudotypen weniger stark transduziert wurden als von LCMV-GP Pseudotypen. Das Suizidgen hsv-tk (Herpes Simplex Virus Thymidinkinase) wurde anschließend durch lentivirale LCMV-GP Pseudotypvektoren in Gliome in vivo eingebracht werden. Diese Suizidgentherapie bewirkte einen starken Antitumoreffekt und führte zu einer kompletten Eliminierung des Tumors bei 90% der behandelten Ratten. Ergebnisse dieser Studien verdeutlichen, dass LCMV-GP-pseudotypisierte lentivirale Vektoren ein hoch effizientes und spezifisches Vektorsystem zum Gentransfer in maligne Gliomzellen darstellen.
The thesis entitled „Investigations on the significance of nucleo-cytoplasmic transport for the biological function of cellular proteins" aimed to unreveal molecular mechanisms in order to improve our understanding of the impact of nucleo-cytoplasmic transport on cellular functions. Within the scope of this work, it could be shown that regulated nucleo-cytoplasmic transport of a subfamily of homeobox transcription factors controlled their intra- and intercellular transport, and thereby influencing also their transcriptional activity. This study describes a novel regulatory mechanism, which could in general play an important role for the ordered differentiation of complex organisms. Besides cis-active transport Signals, also post-translational modifications can influence the localization and biological activity of proteins in trans. In addition to the known impact of phosphorylation on the transport and activity of STAT1, experimental evidence was provided demonstrating that acetylation affected the interaction of STAT1 with NF-kB p65, and subsequently modulated the expression of apoptosis-inducing NF-kB target genes. The impact of nucleo-cytoplasmic transport on the regulation of apoptosis was underlined by showing that the evolutionary conservation of a NES within the anti-apoptotic protein survivin plays an essential role for its dual function in the inhibition of apoptosis and ordered cell division. Since survivin is considered a bona fide cancer therapy target, these results strongly encourage future work to identify molecular decoys that specifically inhibit the nuclear export of survivin as novel therapeutics. In order to further dissect the regulation of nuclear transport and to efficiently identify transport inhibitors, cell-based assays are urgently required. Therefore, the cellular assay Systems developed in this work may not only serve to identify synthetic nuclear export and Import inhibitors but may also be applied in systematic RNAi-screening approaches to identify novel components of the transport machinery. In addition, the translocation based protease- and protein-interaction biosensors can be applied in various biological Systems, in particular to identify protein-protein interaction inhibitors of cancer relevant proteins. In summary, this work does not only underline the general significance of nucleo-cytoplasmic transport for cell biology, but also demonstrates its potential for the development of novel therapies against diseases like cancer and viral infections.
In Deutschland erhalten jährlich etwa 12.500 Patienten die Diagnose Leukämie. Unter ihnen befinden sich ca. 6 % Kinder, welche mit 33,8 % den größten Anteil der kindlichen Krebsneuerkrankungen repräsentieren. Die überwiegende Form im Kindesalter ist die akute lymphatische Leukämie (ALL), deren genetische Ursache meistens in einem hyperdiploiden Karyotyp oder einer chromosomalen Translokation zu finden ist. Bei 8 % der pädiatrischen ALLs ist ein Rearrangement des MLL-Gens involviert. Unter Beteiligung des häufigsten Translokationspartnergens (TPG) AF4 entsteht die t(4;11)(q21;q23)-Translokation mit den beiden Fusionsproteinen AF4•MLL sowie MLL•AF4. Die Therapie erfolgt in der Regel gemäß Hochrisikoprotokollen aufgrund der extrem schlechten Prognose und der mit hoher Therapieresistenz assoziierten Rezidivrate. Eine Studie zur Korrelation zwischen klinischen Merkmalen und molekularen Charakteristika belegte die Abhängigkeit des Outcomes von der Verteilung des Bruchpunkts im MLL-Gen. Bei älteren Patienten treten die Bruchpunkte überwiegend in MLL Intron 9 oder 10 auf und bedeuten eine signifikant bessere Prognose im Vergleich zu den besonders bei Säuglingen präsenten Bruchpunkten im MLL Intron 11. Die damit verbundene Verkürzung der Plant Homeodomain (PHD) 1 kann neben einer modifizierten Funktion des PHD1 auch in einer veränderten Konformation der gesamten PHD-Domäne resultieren. Besondere Bedeutung hat die PHD1-3-Domäne wegen der Fähigkeit des PHD3 einerseits H3K4me-Signaturen zu erkennen und auf der anderen Seite mit CYP33 zu interagieren. Die mit transkriptionell aktivem Chromatin assoziierten H3K4me-Signaturen sowie die CYP33-vermittelte repressive Aktivität bedingen einen ambivalenten Charakter des MLL-Proteins. Daneben ist der PHD3 allein interessant wegen des Vorkommens von 4 differenten Varianten mit keinen, 3, 11 oder 14 fehlenden Aminosäuren, welche durch alternatives Spleißen an der MLL Exon 15/16-Verknüpfung entstehen (PHD3-0, PHD3-3, PHD3 11 und PHD3-14). Semiquantitative Bestimmungen in verschiedenen Zelllinien verdeutlichen die nahezu ähnliche Transkription aller 4 Varianten. Weiterführende Untersuchungen mit dem Yeast Two-Hybrid (Y2H)-System sowie folgende Koimmunpräzipitations (CoIP)-Experimente zeigten, dass der PHD3-0 die beste Dimerisierungsfähigkeit aufweist. Dagegen ist der am schlechtesten dimerisierende PHD3-3 allein in der Lage, CYP33 bzw. dessen RRM-Domäne zu binden. Die Interaktion mit inhibitorischen Proteinen und die folgende Funktion als transkriptioneller Repressor sind allein mit der PHD3-3-Variante möglich. Bei Betrachtung der gesamten PHD1-3-Domäne sowie deren verkürzter Variante (ΔPHD1-3) fällt die reduzierte Bindungsfähigkeit der ΔPHD1-3-Domäne an die CYP33 RRM-Domäne sowie deren fehlende Dimerisierung auf. Über die resultierende geringere Bindung an inhibitorische Proteine kann die transkriptionell repressive Aktivität reduziert werden, während die transkriptionell aktive Funktion an Bedeutung gewinnt. Neben der Untersuchung der PHD-Domänen des MLL-Proteins wurde das Y2H-System zur weiteren Aufklärung der AF4- und AF4•MLL-Multiproteinkomplexe (MPC) verwendet. Ähnlich den Wildtypproteinen MLL und AF4 sind auch die beiden aus der t(4;11)(q21;q23)-Translokation resultierenden Fusionsproteine an der Assemblierung von MPCs beteiligt. Besonders das reziproke AF4•MLL scheint bezüglich des Therapieerfolgs für die Leukämogenese entscheidend zu sein. Die Identifizierung und Verifizierung sowohl bekannter als auch neuer Komponenten der AF4- und AF4•MLL-MPCs gelang in verschiedenen Experimenten. Allerdings wurde meist nur die Präsenz der Proteine im MPC nachgewiesen. Die Y2H-Untersuchungen konnten Interaktionen zwischen den verschiedenen Proteinen der Komplex identifizieren und damit die Kenntnis über die Zusammensetzung der MPCs wesentlich erweitern und vertiefen. Aufgrund der Beteiligung viraler Proteine an der Krebsentstehung sowie der Rekrutierung von Transkriptionsfaktoren der Wirtszelle für die virale Replikation erscheint auch die Nutzung der Superelongationskomplexe (SEC) durch virale Proteine plausibel. Die Funktion des AF4-Proteins als Kofaktor von viralen Proteinen, besonders der HCMV und EBV immediate early (IE)-Proteine, wurde bereits gezeigt. Außerdem konnte der Einfluss des HCMV IE1 auf AF4-abhängige Effekte sowie dessen Beteiligung am AF4-MPC nachgewiesen werden. Mithilfe der Y2H-Experimente konnten nicht nur Interaktionen des HCMV IE1 sondern auch Wechselwirkungen der Onkoproteine E6/E7 des HPV mit den Proteinen der AF4- und AF4•MLL-MPCs identifiziert werden.
Eine Erkrankung wird als monogen bezeichnet, wenn sie auf einen Gendefekt eines einzelnen Gens zurückzuführen ist. Durch einen angeborenen Gendefekt kann bei den sog. primären Immundefekten (PIDs) das Immunsystem von asymptomatisch bis lebensbedrohlich mehr oder weniger stark beeinträchtigt werden. Für lebensbedrohliche Immundefekte gilt die allogene Stammzelltransplantation eines passenden Spenders als einzig kurative Therapie. Weil jedoch für etwa 30 % aller Patienten kein passender Spender verfügbar ist, bietet die Gentherapie in Kombination mit einer autologen Stammzelltransplantation eine häufig lebensrettende Alternative. Dabei werden patienteneigene CD34+-Blutstammzellen isoliert, ex vivo mit einer funktionalen Kopie des defekten Gens genetisch modifiziert und anschließend zurück in den Patienten infundiert. Die dabei eingesetzten Genfähren basieren in der Regel auf viralen Vektoren, mit denen das gesunde Gen in die Patientenzellen eingeschleust wird. Retrovirale Vektoren wurden für die Gentherapie am häufigsten eingesetzt.
In mehreren klinischen Gentherapie-Studien zur Behandlung diverser PIDs kam es aufgrund insertionsbedingter Transaktivierung benachbarter Proto-Onkogene zur Leukämieentwicklung. Deswegen wurde gezielt an der Sicherheit retroviraler Genfähren gearbeitet. Insbesondere wurden die in der ersten Generation benutzten retroviralen Promotor/Enhancer-Elemente aus der U3-Region des 5’ LTRs deletiert (self-inactivating, SIN-Vektoren) und durch interne, gewebespezifische Promotoren ersetzt. Auf Genfallen basierende Vektoren (gene trap, GT-Vektoren) könnten eine sicherere Alternative zu den Standardvektoren bieten, weil sie zum einen auf den γ-retroviralen SIN-Vektoren basieren und zum anderen keinen internen Promotor enthalten, der zur Transaktivierung benachbarter Gene führen kann. Bei GT-Vektoren wird das integrierte Transgen von endogenen Promotoren kontrolliert, was zu einer robusteren Transgenexpression und zu einem erhöhten Sicherheitsprofil führen sollte.
Ziel dieser Arbeit war, GT-Vektoren hinsichtlich ihres Potentials als Vektoren für die Gentherapie zu bewerten. Dafür wurde zunächst die Gentransduktionseffizienz unterschiedlicher GT-Vektoren in murinen, embryonalen Stammzellen (mES-Zellen) untersucht. In einem klassischen GT-Vektor ist das Therapiegen von einem 5‘ liegenden Spleißakzeptor (SA) und einer 3‘ liegenden Polyadenylierungssequenz (pA) flankiert. Dies bewirkt, dass das Therapiegen nach Integration in ein exprimiertes Gen als Fusionstranskript mit den 5‘ liegenden endogenen Genfragmenten exprimiert wird. Sind diese kodierend, entsteht ein Fusionsprotein, das die Funktionalität des Therapiegens beeinträchtigen kann. Zu Vermeidung einer derartigen Konstellation wurden drei Strategien zur Verhinderung N-terminaler Fusionen getestet: Die Fusion (i) einer internen ribosomalen Eintrittsstelle (IRES) und (ii) eines viralen Proteinspaltungspeptids (T2A) an das 5‘ Ende des Therapiegens sowie (iii) die Insertion von drei Stop-Codons hinter den SA. Die Versuche in mES-Zellen zeigten, dass die GT-Variante mit den Stop-Codons am effizientesten war, weshalb sie für alle weiteren Ansätze verwendet wurde.
Dieser Arbeit vorangegangen war die Entwicklung einer Genfallenstrategie zur Korrektur des septischen Granulomatose (X-CGD) verursachenden gp91phox (CYBB)-Gendefektes in einer gp91phox-defizienten Leukämiezelllinie (PLB-XCGD). Obwohl Genfallen transduzierte PLB-XCGD-Zellen das Therapiegen gp91phox exprimierten, war diese Expression im Vergleich zu den mit einem positiven, Promotor-enthaltenden Kontrollvektor (FES-gp91phox) transduzierten Zellen sehr gering. Deswegen war es notwendig eine effiziente Selektionsstrategie für Genfallenereignisse in hämatopoetischen Zellen zu entwickeln. Eine Strategie basierte auf einem FKBP12/Thrombopoetinrezeptor-Fusionsprotein, dessen Expression in hämatopoetischen BaF3 Zellen eine 25-fache Anreicherung von Genfallen exprimierenden Zellen nach Zugabe des chemischen Liganden AP20187 ermöglichte. Allerdings konnte dieses System in primären, hämatopoetischen Zellen leider nicht etabliert werden.
Die andere Selektionsstrategie basierte auf dem X-SCID Krankheitsmodell, in dem IL2RG-Mutationen, einer Untereinheit verschiedenster Zytokinrezeptoren (z. B. des IL-2-Rezeptors), zu einem kompletten Verlust von T-Zellen und somit zur Reduktion funktionaler B-Zellen führen. Nach ex vivo Korrektur und Transplantation der korrigierten, autologen hämatopoetischen Stammzellen (HSZ), kann eine Expansion der IL2RG exprimierenden T-Zellen erzielt werden. Initiale Versuche wurden an der IL2RG-/--Zelllinie ED-7R in vitro durchgeführt. Nachdem über die durchflusszytometrische Analyse der pSTAT5-Expression eine Aktivierung des IL2RG-abhängigen Signalweges in GT-IL2RG-Genfallen transduzierten ED-7R-Zellen nachgewiesen werden konnte, wurde in einem X-SCID-Mausmodell (IL2RG-/-) überprüft, ob es zu der erwarteten Anreicherung von IL2RG exprimierenden T-Zellen nach Transplantation autologer GT-IL2RG transduzierter HSZ kommt. Dabei wurde sowohl die immunologische Rekonstitution der Mäuse als auch die Funktionalität der rekonstituierten Lymphozyten untersucht. In der GT-Gruppe konnte nach Transplantation genetisch modifizierter Zellen weder ein Unterschied der absoluten Zahl an Lymphozyten (B-Zellen, T-Zellen) im Blut, noch ein erhöhter Prozentsatz der verschiedenen Lymphozyten-subpopulationen in KM, Milz oder Thymus beobachtet werden. Lediglich im Thymus einer Maus aus der GT-Gruppe konnten IL2RG exprimierende Zellen nachgewiesen werden. Andererseits konnten aus der Milz transplantierter GT-Mäuse T-Zellen isoliert werden, die nach Interleukin-2-Stimulation STAT5-Phosphorylierung aufwiesen, was eine erfolgreiche obgleich geringe GT-IL2RG Transduktion belegt. Durch die Beurteilung des Engraftments, also des Anwachsens der transplantierten Spenderzellen im Empfängerorganismus, konnte gezeigt werden, dass die niedrigere IL2RG-Rekonstitutionseffizienz durch Genfallen nicht auf einem suboptimalen Engraftment, sondern auf einer zu geringen Anzahl an produktiven Genfallenereignissen beruht.
Zusammenfassend legen die Ergebnisse nahe, dass Genfallen zu diesem Zeitpunkt keine realistische Alternative gegenüber konventionellen Gentherapievektoren zur Korrektur monogener Bluterkrankungen bieten. Neue Entwicklungen, die eine Genkorrektur mittels sog. „Designer Endonukleasen“ vor Ort ermöglichen, werden sicherlich in der nahen Zukunft sämtliche, beliebig ins Genom integrierende Gentherapievektoren ersetzen.
Eine Erkrankung wird als monogen bezeichnet, wenn sie auf einen Gendefekt eines einzelnen Gens zurückzuführen ist. Durch einen angeborenen Gendefekt kann bei den sog. primären Immundefekten (PIDs) das Immunsystem von asymptomatisch bis lebensbedrohlich mehr oder weniger stark beeinträchtigt werden. Für lebensbedrohliche Immundefekte gilt die allogene Stammzelltransplantation eines passenden Spenders als einzig kurative Therapie. Weil jedoch für etwa 30 % aller Patienten kein passender Spender verfügbar ist, bietet die Gentherapie in Kombination mit einer autologen Stammzelltransplantation eine häufig lebensrettende Alternative. Dabei werden patienteneigene CD34+-Blutstammzellen isoliert, ex vivo mit einer funktionalen Kopie des defekten Gens genetisch modifiziert und anschließend zurück in den Patienten infundiert. Die dabei eingesetzten Genfähren basieren in der Regel auf viralen Vektoren, mit denen das gesunde Gen in die Patientenzellen eingeschleust wird. Retrovirale Vektoren wurden für die Gentherapie am häufigsten eingesetzt.
In mehreren klinischen Gentherapie-Studien zur Behandlung diverser PIDs kam es aufgrund insertionsbedingter Transaktivierung benachbarter Proto-Onkogene zur Leukämieentwicklung. Deswegen wurde gezielt an der Sicherheit retroviraler Genfähren gearbeitet. Insbesondere wurden die in der ersten Generation benutzten retroviralen Promotor/Enhancer-Elemente aus der U3-Region des 5’ LTRs deletiert (self-inactivating, SIN-Vektoren) und durch interne, gewebespezifische Promotoren ersetzt. Auf Genfallen basierende Vektoren (gene trap, GT-Vektoren) könnten eine sicherere Alternative zu den Standardvektoren bieten, weil sie zum einen auf den γ-retroviralen SIN-Vektoren basieren und zum anderen keinen internen Promotor enthalten, der zur Transaktivierung benachbarter Gene führen kann. Bei GT-Vektoren wird das integrierte Transgen von endogenen Promotoren kontrolliert, was zu einer robusteren Transgenexpression und zu einem erhöhten Sicherheitsprofil führen sollte.
Ziel dieser Arbeit war, GT-Vektoren hinsichtlich ihres Potentials als Vektoren für die Gentherapie zu bewerten. Dafür wurde zunächst die Gentransduktionseffizienz unterschiedlicher GT-Vektoren in murinen, embryonalen Stammzellen (mES-Zellen) untersucht. In einem klassischen GT-Vektor ist das Therapiegen von einem 5‘ liegenden Spleißakzeptor (SA) und einer 3‘ liegenden Polyadenylierungssequenz (pA) flankiert. Dies bewirkt, dass das Therapiegen nach Integration in ein exprimiertes Gen als Fusionstranskript mit den 5‘ liegenden endogenen Genfragmenten exprimiert wird. Sind diese kodierend, entsteht ein Fusionsprotein, das die Funktionalität des Therapiegens beeinträchtigen kann. Zu Vermeidung einer derartigen Konstellation wurden drei Strategien zur Verhinderung N-terminaler Fusionen getestet: Die Fusion (i) einer internen ribosomalen Eintrittsstelle (IRES) und (ii) eines viralen Proteinspaltungspeptids (T2A) an das 5‘ Ende des Therapiegens sowie (iii) die Insertion von drei Stop-Codons hinter den SA. Die Versuche in mES-Zellen zeigten, dass die GT-Variante mit den Stop-Codons am effizientesten war, weshalb sie für alle weiteren Ansätze verwendet wurde.
Dieser Arbeit vorangegangen war die Entwicklung einer Genfallenstrategie zur Korrektur des septischen Granulomatose (X-CGD) verursachenden gp91phox (CYBB)-Gendefektes in einer gp91phox-defizienten Leukämiezelllinie (PLB-XCGD). Obwohl Genfallen transduzierte PLB-XCGD-Zellen das Therapiegen gp91phox exprimierten, war diese Expression im Vergleich zu den mit einem positiven, Promotor-enthaltenden Kontrollvektor (FES-gp91phox) transduzierten Zellen sehr gering. Deswegen war es notwendig eine effiziente Selektionsstrategie für Genfallenereignisse in hämatopoetischen Zellen zu entwickeln. Eine Strategie basierte auf einem FKBP12/Thrombopoetinrezeptor-Fusionsprotein, dessen Expression in hämatopoetischen BaF3 Zellen eine 25-fache Anreicherung von Genfallen exprimierenden Zellen nach Zugabe des chemischen Liganden AP20187 ermöglichte. Allerdings konnte dieses System in primären, hämatopoetischen Zellen leider nicht etabliert werden.
Die andere Selektionsstrategie basierte auf dem X-SCID Krankheitsmodell, in dem IL2RG-Mutationen, einer Untereinheit verschiedenster Zytokinrezeptoren (z. B. des IL-2-Rezeptors), zu einem kompletten Verlust von T-Zellen und somit zur Reduktion funktionaler B-Zellen führen. Nach ex vivo Korrektur und Transplantation der korrigierten, autologen hämatopoetischen Stammzellen (HSZ), kann eine Expansion der IL2RG exprimierenden T-Zellen erzielt werden. Initiale Versuche wurden an der IL2RG-/--Zelllinie ED-7R in vitro durchgeführt. Nachdem über die durchflusszytometrische Analyse der pSTAT5-Expression eine Aktivierung des IL2RG-abhängigen Signalweges in GT-IL2RG-Genfallen transduzierten ED-7R-Zellen nachgewiesen werden konnte, wurde in einem X-SCID-Mausmodell (IL2RG-/-) überprüft, ob es zu der erwarteten Anreicherung von IL2RG exprimierenden T-Zellen nach Transplantation autologer GT-IL2RG transduzierter HSZ kommt. Dabei wurde sowohl die immunologische Rekonstitution der Mäuse als auch die Funktionalität der rekonstituierten Lymphozyten untersucht. In der GT-Gruppe konnte nach Transplantation genetisch modifizierter Zellen weder ein Unterschied der absoluten Zahl an Lymphozyten (B-Zellen, T-Zellen) im Blut, noch ein erhöhter Prozentsatz der verschiedenen Lymphozyten-subpopulationen in KM, Milz oder Thymus beobachtet werden. Lediglich im Thymus einer Maus aus der GT-Gruppe konnten IL2RG exprimierende Zellen nachgewiesen werden. Andererseits konnten aus der Milz transplantierter GT-Mäuse T-Zellen isoliert werden, die nach Interleukin-2-Stimulation STAT5-Phosphorylierung aufwiesen, was eine erfolgreiche obgleich geringe GT-IL2RG Transduktion belegt. Durch die Beurteilung des Engraftments, also des Anwachsens der transplantierten Spenderzellen im Empfängerorganismus, konnte gezeigt werden, dass die niedrigere IL2RG-Rekonstitutionseffizienz durch Genfallen nicht auf einem suboptimalen Engraftment, sondern auf einer zu geringen Anzahl an produktiven Genfallenereignissen beruht.
Zusammenfassend legen die Ergebnisse nahe, dass Genfallen zu diesem Zeitpunkt keine realistische Alternative gegenüber konventionellen Gentherapievektoren zur Korrektur monogener Bluterkrankungen bieten. Neue Entwicklungen, die eine Genkorrektur mittels sog. „Designer Endonukleasen“ vor Ort ermöglichen, werden sicherlich in der nahen Zukunft sämtliche, beliebig ins Genom integrierende Gentherapievektoren ersetzen.
Die Bildung aller Blutzellen ist ein vielschichtiger Prozess aus Proliferation und Differenzierung der pluripotenten Stammzellen. Die Regulation der hämatopoietischen Differenzierung wird unter anderem durch ein Zusammenspiel von zelltypspezifischen Transkriptionsfaktoren gewährleistet (Barreda & Belosevic, 2001). Der Transkriptionsfaktor RUNX1 spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von hämatopoietischen Stammzellen und eine funktionelle Veränderung von RUNX1 führt zur Ausbildung von Leukämien. In humanen Leukämien ist RUNX1 ein häufiges Ziel von chromosomalen Translokationen. Außerdem ist die Haploinsuffizienz von RUNX1 beim Menschen ursächlich für familiäre Thrombozytopenien (FPD) mit reduzierten Thrombozytenzahlen (Luddy et al., 1978; Gerrard et al., 1991). Ein knock out von RUNX1 in adulten Mäusen zu einem Defekt in der Megakaryozytendifferenzierung und zu Myelodysplasien (Growney et al., 2005; Ichikawa et al., 2004). Die Funktion von RUNX1 wird unter anderem durch die Interaktion mit anderen Transkriptionsfaktoren und Cofaktoren reguliert. Dabei kann RUNX1 die Expression von Zielgenen aktivieren oder reprimieren, abhängig davon welche Cofaktoren rekrutiert werden. Die Rekrutierung von Chromatin-modifizierenden Cofaktoren durch RUNX1 führt zur Veränderung der Chromatinstruktur und leitet epigenetische Regulationsprozesse ein. Bekannte Histon-modifizierende Interaktionspartner von RUNX1 sind p300 und HDAC1. p300 besitzt Histon-Aceyltransferase-Aktivität und führt zur Ausbildung offener Chromatinstrukturen, welche dann Transkriptionsfaktoren erlaubt an die DNA zu binden und somit zur Aktivierung der Expression von Zielgenen beiträgt (Vogelauer et al., 2000). Der Gegenspieler von Acetyltransferasen sind Histon Deacetylasen (z.B. HDAC1), welche Acetylgruppen entfernen und somit reprimierend auf die Genexpression wirken (Berger, 2007). Bestimmte Zelltypen unterscheiden sich stark voneinander trotz eines gemeinsamen genetischen Codes. Die Expression von zelllinienspezifischen Genen muss daher zelltypspezifisch kontrolliert werden. Dies geschieht durch epigenetische Regulationsvorgänge, welche stammzell-spezifische Gene abschalten, wohingegen zelllinienspezifische Gene angeschaltet werden. Neben der Acetylierung von Histonen ist die Methylierung eine häufige posttranslationale Modifikation, die im Histone Code eine wichtige Rolle spielt. Diese Histonmarkierung wird von Methyltransferasen katalysiert. Die epigenetische Regulation von RUNX1-Zielgenen während der Differenzierung von Vorläufer-/Stammzellen wurde bislang noch nicht näher aufgeklärt. Aus diesem Grund sollten neue Interaktionspartner von RUNX1 mit epigenetischer Funktion identifiziert werden. In dieser Arbeit konnte eine Interaktion von RUNX1 mit der Protein Arginin Methyltransferase 6 (PRMT6) gezeigt werden. Expressionsanalysen wiesen eine Expression von RUNX1 und PRMT6 in Stamm-/Vorläuferzellen nach. Während der Megakaryozytendifferenzierung verhielt sich das Expressionsmuster von PRMT6 gegensätzlich zu der RUNX1-Expression. Zur Überprüfung der Auswirkung von PRMT6 auf die Megakaryozytendifferenzierung, wurden ein knock down sowie eine Überexpression von PRMT6 durchgeführt. Die veränderte CD41-Expression einer Beeinflussung des PRMT6-Levels deutet auf einen reprimierenden Effekt von PRMT6 auf die Megakaryopoiese hin. Das daran anschließende Ziel bestand in dem Nachweis der kooperativen Regulation von differenzierungsspezifischen Genen durch PRMT6 und RUNX1. PRMT6 konnte als Teil eines RUNX1-Corepressorkomplexes mit Sin3a und HDAC1 auf dem Promotorbereich von RUNX1-Zielgenen in hämatopoietischen Vorläuferzellen nachgewiesen werden. Ein in vitro Methyltransferaseassay lieferte Hinweise darauf, dass RUNX1 am Arginin 307 von PRMT6 methyliert wird, was zu einer verstärkten Interaktion beider Faktoren, einer verminderten Aktivierungsfähigkeit und einer erhöhten DNA-Bindungskapazität von RUNX1 führt. Außerdem konnte eine Methylierung des H3R2 am Promotor von megakaryozytären Genen durch PRMT6 gezeigt werden, welche die Bindung des WDR5/MLL-Komplexes an die H3K4me2 Markierung verhindert und somit eine Trimethylierung von H3K4 inhibiert (Hyllus et al., 2007). Auf dem Promotorbereich ist neben den reprimierenden Histonmodifikationen H3R2me2 und H3K27me3 die aktivierende H3K4me2+/me3-Histonmodifikation, sowie die initiierende RNA-Polymerase II vorhanden. Die Gene befinden sich in einem Zwischenzustand (intermediary state) und werden basal transkribiert. Während der Differenzierung in Richtung Megakaryozyten konnte ein Austausch des Corepressorkomplexes gegen einen Coaktivatorkomplex mit p300, PCAF, WDR5, PRMT1 und GATA1/FOG1 beobachtet werden. Ein Verlust von PRMT6 führte zu einer Verringerung der H3R2me2 Markierung. Dadurch konnte WDR5 an den Promotor binden und die H3K4-Trimethylierung wurde durch den WDR5/MLL-Komplex katalysiert. Zusätzlich konnte eine Acetylierung des Promotorbereiches und die Belegung des Promotorbereiches mit der elongierenden RNA-Polymerase II, phosphoryliert am Serin 2, nachgewiesen werden, was zur Induktion der Expression der megakaryozytären Gene führte. Zusammenfassend konnte PRMT6 als neuer Interaktionspartner von RUNX1 identifiziert werden, welcher durch die H3R2-Methylierung differenzierungsspezifische Gene in einem Zwischenzustand hält und reprimierend auf die Megakaryozytendifferenzierung wirkt. Die Expression der intermediary state Gene kann während der Differenzierung schnell aktiviert werden. Zusätzlich konnte eine Methylierung von RUNX1 durch PRMT6 gezeigt werden.
Humane endogene Retroviren (HERVs) sind Relikte von Infektionen der Keimzellen von Primatenvorläufern mit exogenen Retroviren vor 40 Millionen Jahren. Die meisten HERV Elemente sind defekt durch die Akkumulation von Mutationen, Deletionen und Rearrangements. Lediglich einige Proviren der HERV-K/HML-2 Familie enthalte noch offenen Leserahmen für alle retroviralen Proteine. Die Expression repetitiver endogener Elemente wird in somatischen Zellen unterdrückt. Transkription und Translation von HERV-K Genprodukten tritt in Keimzelltumoren, Melanomen und Eierstockkrebs auf. In der vorliegenden Arbeit wurde die HERV-K exprimierende Melanomlinie UKRV Mel 2-C9 etabliert und charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass die HERV-K Expressionen durch die dominante Aktivität des Provirus 108 bedingt ist. Die Expression und korrekte Prozessierung der viralen Proteine konnte nachgewiesen werden. Durch Elektronenmikroskopie wurde bestätigt, dass HERV-K 108 virale Partikel mit charakteristischen Strukturen der Hüllproteine produziert. Diese Partikel enthalten virale Volllängen RNA-Genome. Da HERV-K 108 in der Linie UKRV Mel 2-C9 eine Mutation im aktiven Zentrum der Reversen Transkriptase zeigt, sind die Partikel nicht infektiös. Um Einblicke in die der HERV-K Expression in Keimzelltumoren und Melanomen zu Grunde liegenden transkriptionellen Regulationsmechanismen zu erhalten, wurden mittels 5’ und 3’ RACE (rapid amplification of cDNA ends) der Transkriptionsstart und die Terminationsstelle bestimmt. Es konnte gezeigt werden, dass der HERV-K Promotor in den untersuchten Zelllinien TATA-unabhängig agiert obwohl die HERV-K LTR (long terminal repeat) ein TATA-Motiv aufweist. Die transkriptionelle Aktivität des HERV-K Promotors ist abhängig von einer GC-Box in unmittelbarer Nähe zu einem Initiatorelement am Startpunkt der Transkription. Das GC-Sequenzmotiv ist die Bindestelle für die Transkriptionsfaktoren SP1 (specific protein) und SP3. Mutationen des Bindemotivs führten zu einem drastischen Abfall der Promotoraktivität im Luziferaseassay. Durch Proteinknockdown mittels spezifischer siRNA gegen SP1 und SP3 konnte die Promotoraktivität ebenso deutlich reduziert werden. Elektrophoretic mobility shift assays und Chromatinimmunopräzipitationen bestätigten eine Bindung von SP1 und SP3 an die HERV-K LTR. Die Transkriptionsfaktoren SP1 und SP3 sind an der Initiation der basalen Transkription von HERV-K maßgeblich beteiligt.
Die eukaryotische RNA-Polymerase II (RNAPII) ist der zentrale Faktor für die Umsetzung des genetischen Codes in funktionelle Proteine. Durch die Transkription wird die statische Information der DNA in ein transient nutzbares RNA-Molekül umgewandelt. Bei diesem fundamentalen Prozess der Genexpression wird ein spezifischer DNA-Abschnitt des Genoms abgelesen und in die komplementäre RNA transkribiert, die entweder direkt regulatorische bzw. funktionelle Aufgaben in der Zelle übernimmt oder als Matrize für die Proteinbiosynthese dient. Zur Erhaltung der Funktionalität eines Organismus und zur schnellen und gezielten Reaktion auf exogene Reize ist eine strikte Regulation der Transkription und der zahlreichen beteiligten Faktoren notwendig. Aufgrund der zentralen Rolle in der Genexpression ist diese Regulation äußerst vielschichtig und erfordert eine feinabgestimmte Maschinerie an Enzymen und Transkriptionsfaktoren, deren genaue Wirkungsweise und Abhängigkeit noch nicht vollständig verstanden sind. Fehler in der Transkriptionsregulation werden mit einer Reihe von schwerwiegenden metabolischen Störungen und der möglichen malignen Transformation der betroffenen Zelle in Verbindung gebracht.
Während einige Regulationsmechanismen der RNAPII bereits seit längerer Zeit beschrieben sind, ist eine besondere Form der RNAPII-abhängigen Regulation erst in den letzten Jahren Gegenstand genauerer Untersuchungen geworden. So erfährt die RNAPII bei einer Vielzahl von Genen unmittelbar nach der Transkriptionsinitiation einen Arrest, der das Enzym nicht weiter über die DNA prozessieren lässt und somit die produktive Elongation des Gens blockiert. Die Aufhebung dieses promotornahen Arrests wird durch den positiven Transkriptions-Elongationsfaktor b (P-TEFb) dominiert, der durch distinkte post-translationale Modifikationen der C-terminalen Domäne der RNAPII und assoziierter Faktoren den Übergang in die produktive Transkriptionselongation ermöglicht. P-TEFb selbst unterliegt dabei einer strengen Regulation durch die Inkorporation in inhibierende Speicherkomplexe (7SK snRNPs), bestehend aus der 7SK snRNA und mehrerer assoziierter Proteine. Abseits des 7SK snRNP wurde P-TEFb als Bestandteil großer Multiproteinkomplexe identifiziert, die einen positiven Einfluss auf die Transkriptionselongation besitzen. Die Transition von P-TEFb aus dem 7SK snRNP in diese sogenannten Superelongationskomplexe (SECs) stellt einen der zentralen Regulationsmechanismen der eukaryotischen Transkription dar, ist jedoch noch nicht ausreichend verstanden.
Ein zentrales Element aller SECs bilden die Mitglieder der AF4/FMR2-Proteinfamilie, darunter das AF4 Protein, dem neben der Erhaltung der strukturellen Integrität mittlerweile auch eine Funktion in der Rekrutierung von P-TEFb zugeschrieben wird. Dabei scheint AF4 jedoch auf die Hilfe bislang noch nicht charakterisierter Faktoren angewiesen zu sein. AF4 ist über diese Rolle hinaus als Bestandteil des Fusionsproteins AF4-MLL eng mit der onkogenen Zelltransformation im Falle einer durch die Translokation t(4;11)(q21;q23) bedingten, akuten lymphoblastischen Leukämie assoziiert.
Das zentrale Thema dieser Arbeit stellen Untersuchungen zum Transfer von P-TEFb aus dem 7SK snRNP zum AF4-Protein dar. Dabei konnte zunächst die DEAD-Box RNA-Helikase DDX6 als Integraler Bestandteil der AF4-SECs identifiziert werden, der bereits eine Funktion in der Kontrolle des microRNA- wie auch des mRNA-Metabolismus zugeschrieben werden konnte. Aus diesem Grund wurde von uns eine mögliche Beteiligung von DDX6 an der Rekrutierung von P-TEFb zum AF4-SEC durch Modulationen der 7SK snRNA postuliert. Des Weiteren konnte eine Bindefähigkeit von DDX6 gegenüber der 7SK snRNA sowie eine direkte Korrelation zwischen des zellulären DDX6-Proteinlevel und der Akkumulation von P-TEFb im AF4-SEC nachgewiesen werden. Sowohl die Überexpression von DDX6 als auch die von AF4 resultierten in einer gesteigerten mRNA-Produktion, wobei die Ergebnisse auf einen kooperativen Mechanismus zwischen den beiden Proteinen in der Aktivierung der Transkription hindeuteten. Außerdem konnte die These einer DDX6-vermittelten Aktivierung von P-TEFb anhand von Expressionsanalysen des bekannten P-TEFb Zielgens HEXIM1, dessen Expression im Zusammenhang eines negativen Rückkopplungsmechanismus gesteigert wird, bestätigt werden. Damit konnte der DEAD-Box RNA-Helikase DDX6 in dieser Arbeit das erste Mal eine entscheidende Funktion in der Rekrutierung von P-TEFb aus dem 7SK snRNP in den AF4-SEC, und somit an der Kontrolle der eukaryotischen Transkription, zugeschrieben werden.
Die Applikation von therapeutischen Peptiden oder Proteinen kann im Patienten durch Mechanismen des Immunsystems zu unerwünschten Nebenwirkungen führen, die die biologische Wirksamkeit vermindern können. Dies geht mit einer erhöhten Wirkstoffgabe oder einer Therapieresistenz einher und stellt damit ein Sicherheitsrisiko für den Patienten dar. In der vorliegenden Arbeit wurde am Beispiel HIV-inhibitorischer Peptide eine Möglichkeit aufgezeigt, mit der die peptidspezifische humorale und zelluläre Immunogenität vermindert, die Wirksamkeit indes beibehalten werden kann. Als Ausgangspunkt wurden die bereits publizierten Peptide T-20, C46, SC35EK, T-1249 und C34-EHO ausgewählt, welche äußerst effektiv den Eintritt von HIV in dessen Zielzellen verhindern. Alle fünf Peptide sind von der Aminosäuresequenz des transmembranen Hüllproteins gp41 des HIV-1 (T-20, C46, SC35EK), HIV-2 (C34-EHO) bzw. HIV-1/-2/SIV (T-1249) abgeleitet. In dieser Arbeit wurde das HIV-2 Peptid C34-EHO C-terminal um 12 Aminosäuren des HIV-1 verlängert (neue Bezeichnung: C46-EHO). Für die Initiierung einer zellulären Immunantwort muss unter anderem ein Peptidfragment (sog. MHC-I-Epitop) über Ankeraminosäuren an ein MHC-I-Molekül binden. Die in silico Analyse der Aminosäuresequenzen der Peptide ergab diesbezüglich für das Hybridpeptid C46-EHO die geringste potentielle zelluläre Immunogenität, wobei insgesamt fünf starke potentiell immunogene MHC-I-Epitope von den Vorhersageprogrammen BIMAS und SYFPEITHI identifiziert wurden. Die in vitro Analyse der humoralen Antigenität zeigte zudem, dass die überwiegende Mehrheit der HIV-1-infizierten Patienten Antikörper gegen die HIV-1-abgeleiteten Peptide C46 und T-20 im Serum aufwies, nicht jedoch gegen C46-EHO, T-1249 und SC35EK. Die Antikörper waren überwiegend gegen die am C-Terminus lokalisierte HIV-1 MPER (membrane-proximale external region) gerichtet. In den Seren von HIV-2-infizierten Patienten waren hingegen Antikörper gegen T-1249 und C46-EHO detektierbar. Die Peptide T-20, C46, SC35EK, T-1249 und C46-EHO verhinderten spezifisch die Infektion von HIV-1 im nanomolaren Konzentrationsbereich. C46-EHO hemmte überdies den Eintritt von SIVmac251 als auch T-20- und C46-resistenter HI-Viren. T-Zelllinien wurden durch die membranständige Expression von C46-EHO effektiver vor einer HIV-1 Infektion geschützt im Vergleich zu membranständigen C46 Peptid. Aufgrund der geringen Immunogenität und der äußerst breiten und effektiven antiviralen Wirksamkeit wurde C46-EHO für die weitere Optimierung verwendet. Im C46-EHO wurden Aminosäuren an Hauptankerpositionen der MHC-I-Epitope gegen weniger stark bindende Aminosäuren bei fünf potentiellen 9mer MHC-I-Epitopen ausgetauscht. Dies resultierte in den Peptidvarianten V1, V2, V3 und V4, wobei V2 die aussichtsreichsten Eigenschaften aufwies: 1) niedrigste humorale Antigenität in HIV-1 Patientenseren; 2) potente antivirale Wirksamkeit; 3) verringerte potentielle zelluläre Immunogenität. Abschließend wurde basierend auf V2 die optimierte Peptidvariante V2o generiert. Die Glykosylierungsstelle im V2 Peptid wurde an die entsprechende C46 Position verschoben, wodurch die in silico vorhergesagte zelluläre Immunogenität weiter vermindert wurde. Zudem wurde das HIV-1-abgeleitete MPER-Motiv durch die Aminosäuresequenz des HIV-2 Stammes EHO ersetzt, so dass V2o nicht mehr von prä-existierenden Antikörpern in HIV-1 Patientenseren erkannt wurde. Im ELISpot Assay wiesen weder Patienten mit einer HIV-1 bzw. HIV-2 Infektion noch SIV-infizierte Rhesus Makaken eine zelluläre Immunantwort gegen C46-EHO, V2 oder V2o auf. V2o verhinderte den Eintritt von diversen HIV-1 Viren im pikomolaren Konzentrationsbereich und wies somit eine deutlich verbesserte antivirale Wirksamkeit auf. Somit konnte in dieser Arbeit durch Austausch von Aminosäuren die intrinsische Immunogenität des HIV-inhibitorischen Peptids C46-EHO vermindert und zugleich die biologische Wirksamkeit verstärkt werden. Das hieraus resultierende Peptid V2o steht nunmehr für die weitere klinische Entwicklung als Präventativ oder Therapeutikum für die subkutane oder gentherapeutische Applikation zur Verfügung.
Die Transkription ist ein entscheidender Schritt in der Transition der genetischen Information, welche durch die DNA codiert und im Genom hinterlegt ist, zu dreidimensionalen Funktionseinheiten in der Zelle, den Proteinen. Während der Transkription wird die Information von der Ebene der DNA in RNA umgewandelt, welche in der Zelle zusätzlich zu dessen Rolle als Informationsmediator in Form der mRNA eine Vielzahl von Funktionen ausübt. Die Transkription benötigt in Hinblick auf ihre essentielle Rolle in der Errichtung des Proteoms und der notwendigen Adaption von Genexpressionsprogrammen an externe zelluläre Stimuli, den Zellzyklus etc. eine präzise und gleichzeitig flexible Regulation. Besonders für die Transkription von mRNA dient die eukaryotische RNA-Polymerase II (RNAP II) in diesem Prozess als eine zentrale Einheit, die einer Vielzahl regulativer Mechanismen wie post-translationaler Modifikationen und der Assemblierung dynamischer Proteinkomplexe unterliegt. Während Komponenten dieser Regulation wie die Zusammensetzung und Dynamik des Prä-Initiationskomplex bereits seit Jahrzehnten beschrieben sind, ist eine besondere Form der RNAP II-abhängigen Regulation erst in den letzten Jahren Gegenstand genauerer Untersuchungen geworden. So erfährt die RNAP II bei einer Vielzahl von Genen unmittelbar nach der Initiation einen Arrest, der das Enzym nicht weiter über die DNA prozessieren lässt und somit die produktive Elongation des Gens blockiert. Die Aufhebung dieser Blockade wird durch den positiven Transkriptions-elongationsfaktor b (P-TEFb) dominiert, der durch distinkte post-translationale Modifikationen der C-terminalen Domäne der RNAP II und assoziierter Faktoren die produktive Elongation ermöglicht. P-TEFb selbst unterliegt dabei einer strengen Regulation durch eine inaktivierende Assoziation mit Speicherkomplexen. P-TEFb wurde abseits dieser Komplexe in einer Vielzahl von Elongations-assoziierten Proteinkomplexen identifiziert, der Mechanismus der Transition aus dem inaktiven Speicherkomplex zur aktiven Form an der RNAP II war jedoch unbekannt.
Ein zentrales Element aller aktiven Komplexe ist die Anwesenheit von Proteinen der AF4/FMR2-Familie, darunter das AF4 Protein. Bemerkenswerterweise war die genaue Rolle dieses Proteins in den Komplexen bisher unbekannt oder wurde lediglich auf die strukturelle Integrität der Komplexe beschränkt. AF4 und speziell dessen N-Terminus ist über diese Rolle hinaus als Bestandteil des Fusionsproteins AF4-MLL eng mit der onkogenen Zelltransformation im Falle einer durch die t(4;11)(q21;q23) chromosomalen Translokation bedingter, akuter lymphoblastischer Leukämie assoziiert.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das AF4 Protein und im Speziellen sein N-Terminus in der Lage ist, die zelluläre Transkription durch die Aktivierung und Rekrutierung von P-TEFb zu aktivieren. In Anwesenheit von AF4 wird die Kinase-Untereinheit CDK9 des P-TEFb post-translational an Lysinresten modifiziert und damit aktiviert sowie die C-terminale Domäne der RNAP II im Kontext stärker phosphoryliert. Gleichzeitig wurde das P-TEFb inaktivierende Protein HEXIM1 stärker exprimiert. AF4 und AF4-MLL waren weiterhin in der Lage ein Elongations-kontrolliertes Reportergen zu aktivieren. Gleichzeitig führte die Überexpression des AF4 zu einer Erhöhung der zellulären RNA Menge. Zur genaueren Untersuchung der AF4-abhängigen Mechanismen wurden zwei Zelllinien erstellt, die zum Einen eine induzierbare und reproduzierbare Überexpression und Reinigung des AF4 erlaubten (TCZP-AF4ST) und zum Anderen durch lentiviralen knock-down eine an AF4-Mangelsituation nachstellten (AF4kd V100). Es konnte so gezeigt werden, dass AF4 über P-TEFb hinaus eine regulative Funktion gegenüber Transkription-assoziierten Faktoren wie CDK7, MENIN und NF?B besitzt und dass diese Faktoren vorrangig, analog zu P-TEFb, mit dem N-Terminus des AF4 interagieren. Die Überexpression von AF4 führte über die Bindung an die 7SK snRNA und deren Degradation zur Rekrutierung des P-TEFb aus den Speicherkomplexen in distinkte AF4-assoziierte Komplexe und zu einer Umverteilung des Faktors auf distinkte Loci im Zellkern, wobei der AF4 N-Terminus für sich alleine jedoch nicht in der Lage war, diese Funktion auszuüben. Im Falle eines Mangels an AF4 kam es zur Wachstumsretardierung der Zellen sowie zu einem völligen Aktivitätsverlust in Reportergenversuchen.
Die Tatsache, dass AF4 ein zentrales Element in der Elongationskontrolle darstellt führte zu der weitergehenden Vermutung, dass virale immediate early (IE) Proteine zur Kontrolle viraler Genexpression auf der Ebene der Elongation ebenfalls auf dieses Wirtsprotein zugreifen können. Es konnte vor diesem Hintergrund gezeigt werden, dass AF4 tatsächlich mit den IE-Proteinen IE1 (HCMV) und Zta (EBV) aus der Familie der Herpesviren interagiert und durch die Stabilisierung des AF4 Proteins eine kooperative, transaktivierende Funktion auf ein ALOX5 Reportergen ausgeübt wurde. Es wurde gezeigt, dass die viralen IE-Proteine dabei Komponenten der AF4 Komplexe sind und in der Zelle zur epigenetischen Regulation des ALOX5 Gens führen. Weiterhin konnte in diesen Experimenten dargestellt werden, dass AF4 über seine Rolle in der Elongationskontrolle hinaus auch distinkte Effekte in der Aktivierung von Promotoren und damit in der Initiation der Transkription zeigt. Damit konnte in dieser Arbeit zum ersten Mal die essentielle Rolle des AF4 Proteins in der Elongationskontrolle und der Initiation der Transkription als auch in der Infektion durch Herpesviren gezeigt werden.
Mit einer Prävalenz von rund 5% bildet das Hereditäre Nonpolypöse Kolorektalkarzinom (HNPCC), auch Lynch Syndrom genannt, die häufigste genetische Disposition unter allen Kolorektalkarzinomen in Deutschland. Das Lynch Syndrom wird autosomal-dominant vererbt und tritt im Schnitt bereits ab dem 44. Lebensalter auf, während die Mehrheit der Kolorektalkarzinome erst mit 63 Jahren diagnostiziert wird. Ein wichtiges Merkmal sind sogenannte HNPCC-assoziierte Malignome, welche sich außerhalb des Dickdarms befinden. Die Diagnose gestaltet sich allerdings relativ schwierig, da bei Lynch Syndrom-Patienten kein eindeutiger klinisch auffälliger Phänotyp vorliegt und die Diagnosestellung nur in Zusammenhang mit einer Familienanamnese des Patienten möglich ist.
Mittlerweile ist bekannt, dass für das charakteristische Auftreten von hochgradigen Mikrosatelliteninstabilitäten im Tumorgewebe ein defektes DNA-Mismatch-Reparatursystem verantwortlich ist. Diese Defekte treten vor allem in den Genen MLH1, MSH2, MSH6 oder PMS2 auf und können über die Keimbahn vererbt werden.
Das Fusionsprotein MLH1•ITGA9 wurde im Jahr 2009 publiziert, nachdem es bei einer Familie aus Französisch-Guyana gehäuft identifiziert wurde. Mehrere Familienmitglieder waren an unterschiedlichen Krebsarten erkrankt, und die Tatsache, dass neben Dickdarmtumoren auch synchrones und metachrones extrakolonisches Tumorwachstum auftrat, ließen den Schluss einer positiven Familienanamnese für das Lynch Syndrom zu. Auffällig war jedoch, dass das Spektrum dieser extrakolonischen Tumoren nicht im Einklang mit den typischen HNPCC-assoziierten Malignomen stand. Daher lag die Vermutung nahe, dass das Fusionsprotein MLH1•ITGA9 für diesen Phänotyp verantwortlich ist.
Das dem zugrundeliegende Fusionsgen MLH1•ITGA9 ist das Resultat einer interstitiellen Deletion auf Chromosom 3p21.3. Es kodiert für den N-Terminus des Mismatch-Reparaturgens MLH1 sowie den C-Terminus des rund 400 kb downstream gelegenen Integrin α9. Aufgrund der fehlenden nukleären Lokalisationssequenz und weiterer wichtiger im C-Terminus gelegenen Domänen des MLH1-Proteins ist davon auszugehen, dass es außer Stande ist, Basenfehlpaarungen zu reparieren; ebenso sollte das Fusionsprotein theoretisch keine Funktionen des Wildtyp Integrin α9 mehr ausüben können.
Diese Annahmen konnten durch diverse Versuche wie Zelladhäsions- und Zellmigrationsassays bestätigt werden; das Fusionsprotein hatte dabei keinerlei Einfluß auf das Adhäsions- oder Migrationsverhalten unterschiedlicher Zelllinien.
Bezüglich der Lokalisation von MLH1•ITGA9 wurde über Fluoreszenzmikroskopie aufgrund der fehlenden nuklären Lokalisationssequenz im MLH1-Proteinteil der Nachweis erbracht, dass sowohl das Fusionsprotein als auch seine Variante MLH1∆ (bestehend aus dem MLH1-Teil) lediglich im Zytoplasma, und nicht wie der Wildtyp auch im Zellkern, zu finden ist.
Desweiteren zeigten Co-Immunopräzipitationsexperimente eine Interaktion zwischen dem Fusionsprotein und MLH1∆ mit dem Tumorsuppressor BRCA1. Die Folgen dieser Interaktion wurden auf translationeller und Proteinebene mit dem Ergebnis untersucht, dass Zellen, welche das Fusionsprotein oder seine trunkierte Variante MLH1∆ exprimieren, nach Etoposidstimulierung teilweise in gravierendem Ausmaß einen negativen Einfluss auf die p53-abhängige DNA-Reparaturmaschinerie aufweisen. Dies zeigte sich besonders deutlich auf transkriptioneller Ebene in einer bis zu 96%igen Herunterregulierung wichtiger Zellzyklus- sowie proapoptotischer Gene. Die durchflusszytometrische Analyse dieser Zellen zeigte außerdem eine höhere Apoptoseresistenz nach Etoposidstimulierung im Vergleich zu Wildtyp-MLH1 exprimierenden Zellen.
Gene therapy is a promising therapeutic strategy that emerged from the attractive idea of targeting therapy at the molecular level. For many patients who suffer from genetic and acquired diseases that cannot be effectively treated by conventional treatment approaches gene therapy remains a huge hope of cure in spite of the hurdles regarding efficacy and safety that need to be overcome. The development of efficient gene transfer vehicles, mainly retroviral vectors, led to the first successful gene therapy trial, to treat patients suffering from X-linked severe combined immunodeficiency syndrome (X-SCID) using gene modified stem cells (Hacein-Bey-Abina, Le Deist et al. 2002). Despite the success of this trial, it revealed the danger of retroviral insertional mutagenesis as a major adverse event of gene therapy using gene-modified stem cells (Hacein-Bey-Abina, von Kalle et al. 2003). In contrast to stem cells, T cells are relatively resistant to insertional mutagenesis and transformation even after transduction with potent oncogenes using retroviral vectors (Newrzela, Cornils et al. 2008). However, mature T cells can self-renew, proliferate and survive for long periods. These criteria are supposed to render T cells prone to transformation. Therefore, the questions of mature T cells transformability and the control mechanism limiting their transformation are still elusive.
Drug toxicity and viral resistance limit long-term efficacy of antiviral drug treatment for HIV
infection. Thus, alternative therapies need to be explored. Previously, group of “Prof. von Laer”
tested the infusion of T lymphocytes transduced with a retroviral vector (M87o) that expresses an
HIV entry inhibitory peptide (maC46). Gene-modified autologous T cells were infused into 10
HIV-infected patients with advanced disease and multidrug resistant virus during antiretroviral
combination therapy. T cell infusions were tolerated well with no severe side effects. A
significant increase of CD4 counts was observed post infusion. At the end of the one-year
follow-up, the CD4 counts of all patients were still around or above baseline. Gene-modified
cells could be detected in peripheral blood, lymph nodes and bone marrow throughout the oneyear
follow-up, whereby marking levels correlated with the cell dose. No significant changes of
viral load were observed during the first four months. Four of the seven patients that changed
their antiviral drug regimen thereafter responded with a significant decline in plasma viral load.
In conclusion, the transfer of gene-modified cells was safe, led to sustained levels of gene
marking and may improve immune competence in HIV-infected patients with advanced disease
and multidrug resistant virus. However, the low level of gene marking and the lack of substantial
long-term in vivo accumulation of gene-protected cells observed in this trial clearly demonstrate
the requirement for new vectors with new strategy.
In this thesis self‐inactivating lentiviral vectors harboring internal promoters and RNA elements
were therefore evaluated for their potential use in a clinical gene‐therapy trial. The results from
this work provide the basis for the selection of a suitable candidate vector for extensive
preclinical testing. Apart from being capable of transducing non‐dividing cells, lentiviral vectors
incorporate a number of additional features that are of potential value for gene therapeutic
applications. These include a larger packaging capacity, higher titers than γ‐retroviral vectors
and, most importantly, a reduced risk of deregulating cellular genes due to its natural integration
profile. The use of internal promoters to drive expression of the therapeutic transgene maC46
should further improve the safety profile of these new‐generation vectors, while an additional
artificial splice acceptor (SA) into the 5‟UTR of the transgene over all elevate transgene
expression. The rationale for this is that hematopoietic stem and progenitor cells will be
Summary
98
protected from enhancer‐mediated transactivation effects and also from potential side effects due
to the aberrant expression of maC46 while at the same time the full clinical benefit for the
patients is maintained.
In order to find a suitable candidate for preclinical studies, two candidate therapeutic vectors
harboring different regulatory elements were selected based on results from pilot experiments.
The internal promoters used to drive expression of codon optimized maC46 were the PGK
promoter and MPSV promoter. This work focuses on the transgene expression levels in
lymphoid cells and antiviral activity. The issues of long term expression, propensity to
methylation mediated silencing of the promoters, and genotoxicity were also touched. In a first
step the performance of different vectors was evaluated in the human T cell lines. Based on
promising data from ex vivo human peripheral blood mononuclear cells, the vector carrying the
MPSV promoter along with intron were selected for in vivo transplantation experiments.
In summary, the ex vivo data suggested the long term survival of lentiviral gene modified cells,
along with maintained expression of introduced genes. It was observed that the expression of
these constructs depends strongly on the activation and differentiation status of the targeted T
cells. This regulation was not linked to any specific promotor. In vivo study shows that maC46
can be introduced into murine multiple hematopoietic lineages via lentiviral vector and expressed
at high levels in their mulilineage progeny, without altering the hematopoiesis. There was no
sign of any kind of hematopoietic or lymphoid malignancies. Although gene-modified
lymphocytes persisted in-vivo, the downregulation of transgene expression was consistent with
the ex-vivo observation. In contrast to that the T cells transplanted group showed delayed
engraftment of donor cells and there was no expression of C46 in blood and lymphatic organs. .
In conclusion, when considering HIV gene therapy focusing CD4+ T cells, potential problems of
T cell activation status as related to the desired clinical effect must be addressed. These results
might open the way for a gene therapy targeting mainly or exclusively activated T cells and
could be exploited for immunostimulatory as well as suppressive approaches.
In addition to infectious viral particles, hepatitis B virus-replicating cells secrete high amounts of SVPs, which are ssembled by HBsAg in the shape of spheres and filaments but lack any capsid and genome. Filaments are characterized by a much higher amount of the surface protein LHBs as compared to spheres. Spheres are
released via the constitutive secretory pathway, while viral particles are ESCRT-dependently released via MVBs. The interaction of virions with the ESCRT machinery is mediated by α-taxilin that connects the PreS1 domain of LHBs with the ESCRT-component tsg101. Since viral particles and filaments contain a significant amount of LHBs, it is unclear whether filaments are secreted as spheres or released like viral particles. To study the release pathways of HBV filaments in the absence of viral particles, A core-deficient
HBV mutant (1.2×HBVΔCore) was generated by site-directed mutagenesis based on wt1.2x HBV. The start codon of core protein was mutated into stop codon, which was confirmed by DNA sequencing. Data from HBsAg ELISA, Western blot, immunofluorescence microscopy and immunoelectron microscopy showed that the lack of core protein did neither affect the production nor the secretion of HBV SVPs. The intracellular distribution of
LHBs and SHBs showed no difference between wtHBV and the core-deficient mutant expressing cells. Therefore, this system is suitable to investigate the release pathway of HBV filaments in the absence of viral particles. Confocal microscopy analysis of cells cotransfected core-deficient mutants with peYFPRab7 as marker for the endosomal/MVB pathway or with pGalT-eGFP as marker for the trans Golgi apparatus showed that YFP-Rab7, but not GalT-GFP, partially colocalized with LHBs. Furthermore, LHBs could be found in dilated MVBs by immune electron microscopy of ultrathin sections. This was confirmed by isolation of MVBs by cell fractionation using discontinuous sucrose gradient ultracentrifugation and percoll-based linear gradient ultracentrifugation, indicating that filaments enter MVBs in the absence of virion formation. Moreover, inhibition of MVB biogenesis by the small molecular inhibitor U18666A significantly abolished the release of filaments in a dose-dependent manner, but no inhibition could be observed in the production. In contrast, no inhibition on the secretion and production of spheres could be
detected. Inhibition of ESCRT-functionality by coexpression of transdominant negative mutants (Vps4A, Vps4B, CHMP3) abolished the release of filaments while secretion of spheres was not affected. These data indicate that in contrast Abstract 73 to spheres while are secreted via the secretory pathway, filaments are released via ESCRT/MVB pathway like infectious viral particles.
Taspase1 ist eine Threonin-Aspartase, die das MLL-Protein an zwei konservierten Erkennungssequenzen (CS1 und CS2) hydrolysiert. Die daraus entstehenden Spaltprodukte, p320N und p180C bilden ein stabiles Heterodimer und fügen sich mit zahlreichen Proteinen zu einem Multiproteinkomplex zusammen, der die epigenetischen Prozesse während der Embryogenese, Zellzyklus und Stammzell-Wachstum steuert. Der MLL-Komplex weist eine spezifische Histon-Methyltransferase-Aktivität für Lysin-4 des Histon 3 Proteins auf (H3K4me3). Diese spezifische Aktivität hält ein Muster der aktiven Gene während der Entwicklung und Zelldifferenzierung aufrecht. Das AF4-MLL Fusionsprotein, welches durch die chromosomale Translokation t(4;11) gebildet wird, ist ebenfalls ein Substrat von Taspase1. Die Hydrolyse dieses Fusionsproteins führt ebenfalls zu Spaltprodukten, die zunächst miteinander ein Heterodimer bilden, um anschliessend einen onkogenen Multiproteinkomplex auszubilden. Dieser Komplex scheint hämatopoietische Stammzellen zu "reprogrammieren" und den Ausbruch einer lymphoblastischen Leukämie auszulösen.
Die Aktivität der Taspase1 selbst wird durch Eigen-Proteolyse reguliert. Es wird zunächst als Proenzym (p50) hergestellt, das anschliessend durch Autoproteolyse in die enzymatisch aktive Form konvertiert wird. Taspase1 ist ein enzymatisch strikt kontrolliertes Enzym mit geringer Substratanzahl. Neben MLL gibt es nur wenige, bekannte Substrate; allerdings scheint Taspase1 in den Zellen solider Tumoren überexprimiert zu sein. Daraus kann postuliert werden, dass Taspase1/MLL-Aktivität für diese Tumorarten von bedeutung ist. Taspase1 ist die einzige bislang bekannte Protease in Säugerzellen, die dazu befähigt ist, das Leukämie-spezifische AF4-MLL proteolytisch zu spalten und damit seine onkogenen Eigenschaften zu aktivieren. Eine spezifische Inhibierung der Taspase1 könnte deshalb eine mögliche Methode zur Therapie von t(4;11)-Leukämie darstellen. Aus diesem Grund war Taspase1 als ein potentielles Wirkstoffziel interessant und wurde im Rahmen dieser Arbeit genauer untersucht.
Um die Funktionsweise von Taspase1 zu untersuchen, wurde die 2005 veröffentlichte Kristallstruktur der Taspase1 als Grundlage für alle weiteren Arbeiten verwendet. Da die Struktur allerdings nur unvollständig aufgelöst war, wurden die unaufgelösten Bereiche mittels bioinformatischer Tools in Kooperation mit Tim Geppert (Arbeitskreis von Prof. Dr. Gisbert Schneider) modelliert. Die Modellierung führte zu einem detaillierteren Modell des Taspase1-Proenzyms, also dem Zustand vor der autokatalytischen Aktivierung.
Taspase1 weist interessanterweise nur Homologien zu L-Asparaginasen-2 (Familie der Hydrolasen), darunter Glycosylasparaginase, auf. Glycosylasparaginase durchläuft ebenfalls einen Autokatalyse-Prozess, allerdings nach einem N-O-Acyl-shift-Mechanismus. Daher wurde Taspase1 zunächst anhand geeigneter Experimente daraufhin überprüft, ob hier ebenso ein solcher Mechanismus für die Autokatalyse in Betracht kommt. Allerdings widerlegten die durchgeführten Experimente diese Vermutung.
Um die molekulare Funktionsweise der Taspase1 zu eruieren, wurde nun das modellierte Taspase1-Proenzym verwendet. Dies erlaubte die Identifizierung von kritischen Aminosäuren. Durch Mutationsanalysen konnte so die Funktion von Taspase1 aufgeklärt werden. So wurde ein intrinsischer Serin-Protease-Mechanismus für den Prozess der Autokatalyse entdeckt. Dabei spielt Serin-291 - unmittelbar in der Nähe des katalytischen Zentrums - eine wesentliche Rolle.
Anhand weiterer Mutationsanalysen konnte dann schrittweise der Aktivierungsmechanismus von Taspase1 aufgeklärt werden. Dabei scheint die Homodimerisierung zweier Taspase1- Proenzyme der wesentliche Schlüssel für die vollständige Aktivierung der Taspase1 zu sein. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Aminosäuren Tryptophan-173, Arginin-262, und Glutaminsäure-295 als kritische Aminosäuren identifiziert.
Weiterhin konnte anhand der funktionellen Analyse aller Mutanten zuletzt eine trans-dominant-negative Taspase1-Variante (C163E-S291A; tdn-TASP1) hergestellt werden. Das proenzymatische Monomer dieser Mutante ist dabei befähigt, mit einem Wildtyp-Taspase1-Monomer zu heterodimerisieren und seine Aktivität vollständig zu inhibieren. Die Funktion dieser trans-dominant-negativen Mutante validierte den in dieser Arbeit postulierten Aktivierungsmechanismus der Taspase1, der nun zukünftig für ein rationales Wirkstoff-Design verwendet werden kann.
Krebs stellt die zweithäufigste Todesursache in Europa dar. Obwohl sich Diagnose und Heilungschancen über die letzten Jahre verbessert haben, besteht bei bestimmten neoplastischen Erkrankungen eine unverändert schlechte Prognose. Grundlage für eine langfristige Verbesserung des Behandlungserfolges ist ein molekulares Verständnis der Mechanismen, welche zur Krankheitsentstehung, Progression und Therapieresistenz beitragen. Nur so ist es möglich, nach neuen pharmakologischen und oder/genetischen Inhibitoren zu suchen, welche spezifische Eigenschaften dieser Faktoren blockieren und somit die Entwicklung neuer Therapiestrategien erlauben („from bench to bedside“). In diesem Zusammenhang spielen Proteasen nicht nur eine wichtige Rolle in pathobiologischen Prozessen, sondern stellen auch klinisch anerkannte Zielstrukturen derzeitiger Behandlungsstrategien dar. So wurde auch die Threonin-Protease Taspase1 als potenzielles Therapieziel der von Mixed Lineage Leukemia (MLL)-Translokationen verursachten Leukämien postuliert. Die Taspase1-induzierte Spaltung des MLL Proteins spielt eine wichtige physiologische Rolle in Entwicklungs- und Differenzierungsprozessen. Darüber hinaus scheint Taspase1 durch die Prozessierung von MLL-Translokationsprodukten, im speziellen des Produkts der t(4;11), maßgeblich zur Leukämieentstehung beizutragen. Zusätzlich gibt es, wie auch in dieser Arbeit gezeigt, erste Hinweise, dass Taspase1 auch für solide Tumore bedeutsam sein könnte. Jedoch sind unsere Kenntnisse über die molekularen Mechanismen, welche für die (patho)biologischen Funktionen von Taspase1 verantwortlich sind, bislang noch lückenhaft. Obwohl neben MLL-Proteinen einige wenige Taspase1-Zielproteine postuliert wurden, fehlt derzeit eine Übersicht über das „Taspase1-Degradom“. Die Kenntnis aller humanen Taspase1-Zielproteine stellt eine wichtige Voraussetzung dar, um die biologischen Funktionen dieser Typ2-Asparaginase gezielter erforschen und verstehen zu können. Zudem stehen im Gegensatz zu anderen Proteasen für Taspase1 bislang keine wirksamen Inhibitoren zur Verfügung, welche nicht nur als potenzielle Wirkstoffe, sondern vor allem als „chemische Werkzeuge“ der Funktionsaufklärung dienen könnten. Daher wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit das erste effiziente zellbasierte Taspase1- Testsystem entwickelt. Das Translokations-Testsystem basiert auf einem autofluoreszierenden Indikatorprotein, welches eine Taspase1-Spaltstelle enthält und durch die Wahl geeigneter Transportsignale zwischen Kern und Zytoplasma wandert. Nach Koexpression aktiver Taspase1, nicht aber inaktiver Taspase1-Mutanten bzw. anderer Proteasen, wird dieser Biosensor gezielt gespalten und dessen Akkumulation im Zellkern induziert. Die Spezifität des Testsystems mit seinem hohen Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis erlaubte dessen Anpassung an eine Mikroskopie-basierte Hochdurchsatz-Plattform (Knauer et al., PloS ONE eingereicht). Durch gerichtete Mutagenese der Taspase1-Spaltstelle im Biosensor-Kontext konnte eine optimierte Konsensus-Erkennungssequenz für Taspase1 (Aminosäuren Q3[F,I,L,V]2D1¯G1’X2’D3’D4’) definiert werden, welche erstmalig eine zuverlässige bioinformatische Vorhersage des humanen Taspase1-Degradoms erlaubte. Die biologische Relevanz dieser Analyse wurde durch Validierung einzelner Zielproteine unterstrichen, wobei bisher noch nicht beschriebene Taspase1-Zielproteine wie beispielsweise Myosin1F und der Upstream Stimulating Factor 2 identifiziert wurden. Obwohl für beide Proteine bereits eine tumor-assoziierte Funktion beschrieben ist, bleibt die kausale Rolle von Taspase1 für deren (patho)physiologische Funktionen noch zu klären (Bier et al., JBC). Die Tatsache, dass Taspase1 als nukleäres/nukleoläres Protein identifiziert werden konnte, es sich bei den vorhergesagten Zielproteinen jedoch nicht ausschließlich um Kernproteine handelt, belegte die Notwendigkeit, die Regulation der intrazellulären Lokalisation von Taspase1 zu entschlüsseln. Experimentelle und bioinformatische Analysen zeigten erstmalig, dass Taspase1 über ein zweigeteiltes Importsignal über Importin-a aktiv in den Kern transportiert wird, jedoch kein nukleäres Exportsignal besitzt. Interessanterweise ist sowohl die cis- als auch die trans-Aktivität von diesem Kerntransport abhängig. Die nukleoläre Akkumulation wird hingegen durch die Wechselwirkung mit Nukleophosmin vermittelt. Erste Ergebnisse deuten darauf hin, dass Taspase1 am Nukleolus aktiviert wird und möglicherweise durch die Kernexportfunktion von Nukleophosmin transient Zugang zum Zytoplasma erhält, um so auch zytoplasmatische Proteine zu prozessieren (Bier et al., Traffic eingereicht). Zusätzlich konnten erstmalig multiple post-translationale Modifikationen von Taspase1 nachgewiesen werden (Bier et al., Manuskript in Vorbereitung). So kann Taspase1 über die Interaktion mit den Peptidasen Senp1-3 sowohl durch Sumo1 als auch durch Sumo2 sumoyliert werden. Diese so vermittelten dynamischen (De)Sumoylierungszyklen könnten eine Feinregulation der Enzym-Substrat-Interaktion darstellen. Zusätzlich wird Taspase1 durch verschiedene Histon-Acetyltransferasen (HAT) acetyliert und dadurch möglicherweise in seiner enzymatischen Aktivität beeinflusst. Interessanterweise acetylieren die HATs p300 und GCN5 hauptsächlich die Proform von Taspase1, was mit einer verstärkten cis-Aktivität einhergeht, während CBP und pCAF eher die prozessierte Form acetylieren. Andererseits interagieren die Histon-Deacetylasen HDAC-3 und -6 mit Taspase1, was nur die cis-Aktivität zu beeinflussen scheint. HDAC1 hingegen verhindert die Prozessierung der zweiten MLL-Schnittstelle, was auf eine zyklische Regulation im Wechsel mit der Acetylierung schließen lässt. WeitereUntersuchungen müssen klären, ob und wie diese post-translationale Feinregulation die (patho)biologische Aktivität von Taspase1 beeinflussen. Zusammenfassend konnten im Rahmen dieser Arbeit entscheidende neue Einblicke in die biologische Funktion und Regulation von Taspase1 gewonnen werden.
Die akute myeloische Leukämie (AML) ist eine klonale Erkrankung einer myeloischen Vorläuferzelle, welche nicht zur geregelten Selbsterneuerung und terminalen Differenzierung in der Lage ist. Es kommt zur Anhäufung von unreifen Zellen im Knochenmark und peripheren Blut. Häufig werden in AML-Patienten reziproke Chromosomentranslokationen wie t(6;9), t(8;21) und t(15;17) detektiert. Diese Translokationen führen zu Genfusionen und bilden die Fusionsproteine DEK/CAN, AML1/ETO und PML/RARα. In dieser Arbeit wurde DEK/CAN untersucht, das Fusionsprodukt der Translokation t(6;9).
Die t(6;9)-positive Leukämie zeichnet sich durch eine äußerst schlechte Prognose aus sowie einem Eintritt der Krankheit bereits im jungen Erwachsenenalter. Aus diesen Gründen wird die t(6;9)-positive Leukämie nach der neuen WHO-Klassifikation als eigene Entität geführt. Das leukämogene Potential des Fusionsproteins DEK/CAN wurde bereits nachgewiesen, der Mechanismus der Leukämieinduktion ist jedoch völlig ungeklärt.
Von den Leukämie-assoziierten Fusionsproteinen AML1/ETO und PML/RARα ist bekannt, dass sie mutierte Transkriptionsfaktoren sind und die lokale Zusammen-setzung chromatin-assoziierter Proteine beeinflussen. Durch die aberrante Rekrutierung von chromatin-modifizierenden Faktoren kommt es zur Deregulierung von differenzierungsrelevanten Genen. Ziel dieser Arbeit war es daher zu ermitteln, ob es sich bei DEK/CAN ebenso um einen aberranten Transkriptionsfaktor mit Einfluss auf das Chromatin handelt.
Dazu wurden zunächst folgende Grundeigenschaften eines Transkriptionsfaktors untersucht: nukleäre Lokalisation und Chromatinassoziation. Immunfluoreszenz-untersuchungen bestätigten eine nukleäre Lokalisation von DEK/CAN. Es zeigte sich dabei, dass die Fusion mit CAN eine Umverteilung von DEK zur Folge hat. Während DEK diffus im Zellkern verteilt ist, zeigt das Fusionsprotein ein punktiertes Muster. Anschließend wurde die Assoziation von DEK/CAN zum Chromatin mit Hilfe von Zellfraktionierungsexperimenten nachgewiesen. Dabei konnte DEK/CAN aus der gleichen nukleären Fraktion eluiert werden wie andere chromatin-assoziierte Proteine.
Es stellte sich daraufhin die Frage, ob DEK/CAN die epigenetische Maschinerie beeinflussen und möglicherweise Veränderungen von Chromatinmodifikationen verursachen kann. Hierfür wurde die globale Verteilung der Histonmethylierungen H3K9me3, H3K27me3, H3K4me2 und H4R3me2 in An- und Abwesenheit von DEK/CAN untersucht. Es stellte sich heraus, dass DEK/CAN die Verbreitung von H4R3me2 maßgeblich beeinflusst. Histonmethylierungen regulieren das Expressionsniveau der gebundenen DNA, weshalb DEK/CAN durch seine Wirkung auf H4R3me2 die Deregulierung tumorrelevanter Gene verursachen könnte.
AML-assoziierte Fusionsproteine verändern die lokale Zusammensetzung von chromatin-modifizierenden Faktoren, indem sie oligomerisieren und so mehr Inter-aktionsmöglichkeiten für chromatin-modifizierende Proteine schaffen. Eine Gemein-samkeit aller AML-assoziierten Fusionsproteine ist der Besitz einer Oligomeri-sierungsoberfläche. Die putative Coiled coil (CC)-Domäne von CAN wurde hinsichtlich ihres Einflusses auf das leukämogene Potential und der Fähigkeit zur Bildung von Oligomeren untersucht, denn auch beim APL-spezifischen Fusionsprotein PML/RARα ist eine CC-Domäne für die Akkumulation verantwortlich. Die Deletion einzelner Helices aus der putativen CC-Domäne von DEK/CAN führte im CFU-S12 Assay zur Reduktion der Kolonienbildung. Damit konnte gezeigt werden, dass die Integrität der putativen CC-Domäne für den proliferationsstimulierenden Effekt von DEK/CAN auf das Kompartiment der Stammzellen notwendig ist. Eine Funktion als Oligomerisierungsoberfläche wurde für die CC-Domäne jedoch ausgeschlossen.
DEK ist ein nukleäres Phosphoprotein mit vielfältigen Funktionen, die unter anderem durch seinen Phosphorylierungsstatus gesteuert werden. Um die Relevanz der Phosphorylierungsstellen für das leukämogene Potential von DEK/CAN zu ermitteln, wurden DEK- und DEK/CAN-Mutanten erstellt, die nur partiell phosphorylierbar sind. Tatsächlich zeigte ein CFU-S12 Assay, dass die Mutation dieser Phosphorylierungsstellen zur Reduktion der Milzkolonienzahl und damit zur Aufhebung des leukämogenen Potentials führt. Außerdem hebt die Mutation der Phosphorylierungsstellen den DEK-vermittelten Effekt der Apoptoseresistenz auf.
Mit dieser Arbeit wurde durch Chromatinuntersuchungen und Struktur-Funktions-analysen ein Beitrag zur Entschlüsselung des leukämogenen Mechanismus von DEK/CAN geleistet.
Acute myeloid leukemia is a hematopoietic stem cell disorder and a type of acute leukemia which is characterized by clonal proliferation of myeloid precursors with a reduced capacity to differentiate into more mature cellular elements. Clinically AML is characterized by a high degree of heterogeneity with respect to chromosome abnormalities, gene mutations, and changes in expression of multiple genes and microRNAs. Cytogenetic abnormalities can be detected in approximately 50% to 60% of newly diagnosed AML patients. Majority of AML cases are associated with chromosomal aberrations, more specifically translocations that often result in gene arrangements and expression of aberrant fusion proteins. This study was carried out with two fusion proteins: PML/RARα and DEK/CAN which results from the translocations t(15;17) and t (6,9) respectively. PML/RARα is the most common translocation (97%) and the main driver in Acute Promyelocytic Leukemia (APL), a wellcharacterized and well treatable subtype of AML. In contrast, DEK/CAN occurs in 1-5% of AML, associated with poor prognosis and defines a high risk group in AML. The expression of PML/RARα results in a fusion protein that acts as a transcriptional repressor by interfering with gene expression programs involved in differentiation, apoptosis, and selfrenewal. Current therapy focused on the targeting of PML/RARα fusion protien. Success has been achieved by using either ATRA, anthracyclines and Arsenic trioxide or their combinations. These agents induce differentiation in PML/RARα positive AML and hence called differentiation therapy. In comparison with ATRA, ATO and anthracyclines are poor cellular differentiation agents. Despite early promise, several studies have reported that differentiation therapy is unable to target/eradicate leukemic stem cells or eradicate the disease. Therefore current therapeutic focus is to eliminate leukemic stem cells and achieve complete molecular remission not only in APL but also in acute lymphoblastic leukemia and chronic myeloid leukemia as well. Key enzymes of the eicosanoid pathways in the arachidonic acid metabolism, such as COX1/2 as well as the 5-LO have been shown to be good targets for leukemic stem cell therapy approach in AML by interfering with the Wntsignaling which is known to be indispensable for the pathogenesis of AML. Recently it was reported that the third eicosanoid pathway based on the cytochrome P450 (CYP) enzymes interferes with Wnt-signaling as well as with the proliferation and mobilization of hematopoietic stem cells...
Untersuchung hochmolekularer Proteinkomplexe in menschlichen Leukämien mittels Proteomics-Werkzeugen
(2009)
Funktionelle Multiproteinkomplexe stellen im Sinne von Proteomics das kleinste isolierbare Proteom dar. Die Untersuchung von Proteinkomplexen gibt uns die Möglichkeit, Funktionen innerhalb der Zelle oder des Zellkompartiments genauer zu verstehen. Erst durch das Verständnis der einzelnen kleinen Zusammenspiele innerhalb einer Zelle, können wir die Auswirkungen auf ein betreffendes Organ und damit auf den Körper betrachten. Wir erhalten dadurch auch Informationen über die Funktion von spezifischen Genen und können so Erklärungsansätze für Gendefekte finden und über mögliche Therapieansätze nachdenken. Neben den Hefe-Zwei-Hybrid-Analysen und dem Nachweis von Protein-Interaktionen mittels Immunopräzipitationsexperimenten stellt die Massenspektrometrie seit den 90er Jahren ein essentielles Werkzeug der Proteom-Forschung dar. Sie entwickelte sich zu einem etablierten Verfahren für die Charakterisierung von Biomolekülen und ermöglicht die Identifizierung unbekannter Proteine eines Komplexes. Das MLL-Gen auf Chromosom 11 Bande q23 ist in zahlreiche, reziproke chromosomale Translokationen verwickelt, die mit der Entstehung von akuten Leukämien assoziiert sind. Chromosomale Translokationen des MLL-Gens werden aufgrund ihrer sehr schlechten Prognose und Therapierbarkeit als Hochrisiko-Leukämien eingestuft. Bis heute konnten 64 Translokations-Partnergene identifiziert werden, wobei das AF4-Gen mit 42% bei allen untersuchten Leukämien und mit ca. 66% bei ALL (akute lymphatische Leukämie) den größten Prozentsatz ausmacht. Bei der Translokation t(4;11) sind das MLL-Gen auf Chromosom 11 und das AF4-Gen auf Chromosom 4 beteiligt. Akute Leukämien mit einer t(4;11)-Translokation treten häufig bei Säuglingen und Kleinkindern auf und betreffen vorwiegend den lymphatischen Zweig des blutbildenden Systems. Durch die Translokation entstehen zwei neue Derivatchromosomen – Derivat 11 (MLL•AF4, der11) und Derivat 4 (AF4•MLL, der4). Beide Fusionsgene verfügen über einen intakten Leserahmen und führen zur Expression der zwei Fusionsproteine MLL•AF4 (der11) und AF4•MLL (der4). Der pathomolekulare Mechanismus der t(4;11)-vermittelten ALL ist bis heute noch nicht hinreichend geklärt. Funktionen des der11-Fusionsproteins werden zwar schon intensiv erforscht, aber es gibt noch keine Erkenntnisse über die Funktion des der4-Fusionsproteins. Ähnlich sah die Situation zu Beginn dieser Arbeit für das AF4-Protein aus. Während schon einige Daten zur Funktion des MLL-Multiproteinkomplexes vorlagen, gab es nur wenige Informationen über die Funktion von AF4. Im Zuge dieser Arbeit wurden der AF4- und der der4-Multiproteinkomplex mittels affinitätschromatographischer Methoden aus transient transfizierten 293T-Zellen erfolgreich isoliert. Eine Größenbestimmung der Komplexe über eine Größenausschlusschromatographiesäule ergab für beide Komplexe eine Größe von ca. 2 MDa. Die Charakterisierung der beteiligten Interaktionspartner erfolgte mittels nLC-MALDI-MS/MS, Western Blot Analyse und Immunopräzipitation. Es konnte gezeigt werden, dass AF4 zusammen mit den Proteinen ENL/AF9, CDK9, CCNT1, AF10, DOT1L und der RNA-Polymerase II in einem Komplex vorliegt. Bereits 2007 konnte dieser Komplex in einem Mausmodell isoliert werden. Damit fungiert der AF4-Komplex auch in humanen Zellen als Stimulator der RNA-Polymerase-II-abhängigen transkriptionellen Elongation und vermittelt eine DOT1L-abhängige H3K79-Methylierung, die einen aktiven Transkriptionsstatus aufrechterhält. Zusätzlich konnten 6 neue Interaktionspartner identifiziert werden (AF5q31, BDR4, DDX6, HEXIM1, NFkB1/RELA und NPM1). Die Anwesenheit von BRD4 und HEXIM1 lässt vermuten, dass der AF4-Komplex in einem aktiven und einem inaktiven Zustand vorliegen kann. Außerdem wird der AF4-Komplex möglicherweise über den NFkB-Signalweg reguliert bzw. durch die Anwesenheit von NFkB1 an dessen Zielgene rekrutiert. Die Untersuchung des der4-Komplexes zeigte, dass er sich aus Mitgliedern der beiden Wildtyp-Proteinkomplexe zusammensetzt. So wurden die Proteine P-TEFb, HEXIM1, NFkB1, NPM1, DDX6 und das AF4 selbst aus dem AF4-Komplex sowie ASH2L, RBBP5, WDR5, DPY-30, CBP, HCF-1 und HCF-2 aus dem MLL-Komplex identifiziert. Der der4-Komplex weist somit partielle Eigenschaften des AF4- und MLL-Wildtyp-Proteins auf. Diese Eigenschaften sind ausreichend für eine kompetitive Situation zwischen dem der4-Komplex und den beiden AF4- und MLL-Wildtyp-Komplexen. Die Gleichgewichte dieser Wildtyp-Komplexe werden vermutlich gestört. Für beide Komplexe wurde mit Hilfe eines in vitro Histon-Methyltransferase-Assays eine Histon-Methyltransferase-Aktivität nachgewiesen. Für den AF4-Komplex muss zusätzlich eine bisher noch unbekannte Methyltransferase-Aktivität angenommen werden, da eine Methylierung des Histons H3 in den ersten 46 Aminosäuren gezeigt werden konnte, die sich nicht auf die Methyltransferase-Aktivität des DOT1L-Proteins im AF4-Komplex zurückführen lässt. Die H3K4-Methyltransferase-Aktivität des der4-Komplexes wird auf die Anwesenheit des SET-Domänen-Komplexes (ASH2L, WDR5, RBBP5 und DPY-30) zurückgeführt. Im Zusammenhang mit dem AF4-Protein wurde auch der ENL-Komplex untersucht. Mittels Western Blot konnten die Interaktionspartner AF4, CDK9, CCNT1, RNA-Polymerase II, NFkB1 und RING1 identifiziert werden. Damit ist auch das ENL mit dem globalen positiven transkriptionellen Elongationsfaktor P-TEFb assoziiert und beeinflusst die RNA-Polymerase-II-abhängige transkriptionelle Elongation.
Inhibitor of Apoptosis (IAP) proteins are expressed at high levels in many cancers and contribute to apoptosis resistance. Therefore, they represent promising anticancer drug targets. Here, we report that small molecule IAP inhibitors at subtoxic concentrations cooperate with monoclonal antibodies against TRAIL receptor 1 (Mapatumumab) or TRAIL receptor 2 (Lexatumumab) to induce apoptosis in neuroblastoma cells in a highly synergistic manner (combination index <0.1). Importantly, we identify RIP1 as a critical regulator of this synergism. RIP1 is required for the formation of a RIP1/FADD/caspase-8 complex that drives caspase-8 activation, cleavage of Bid into tBid, mitochondrial outer membrane permeabilization, full activation of caspase-3 and caspase-dependent apoptosis. Indeed, knockdown of RIP1 abolishes formation of the RIP1/FADD/caspase-8 complex, subsequent caspase activation and apoptosis upon treatment with IAP inhibitor and TRAIL receptor antibodies. Similarly, inhibition of RIP1 kinase activity by Necrostatin-1 inhibits IAP inhibitor- and TRAIL receptor-triggered apoptosis. By comparison, over-expression of the dominant-negative superrepressor IκBα-SR or addition of the TNFα-blocking antibody Enbrel does not inhibit IAP inhibitor- and Lexatumumab-induced apoptosis, pointing to a NF-κB- and TNFα-independent mechanism. Of note, IAP inhibitor also significantly reduces TRAIL receptor-mediated loss of cell viability of primary cultured neuroblastoma cells, underscoring the clinical relevance. By demonstrating that RIP1 plays a key role in the IAP inhibitor-mediated sensitization for Mapatumumab- or Lexatumumab-induced apoptosis, our findings provide strong rationale to develop the combination of IAP inhibitors and TRAIL receptor agonists as a new therapeutic strategy for the treatment of human cancer.
Patienten mit einer BCR/ABL positiven (Ph+) akuten lymphatischen Leukämie (ALL) bilden die größte genetisch definierte Untergruppe der ALL und gelten wegen ihrer schlechten Prognose als Höchstrisiko ALL. Die bisherigen Therapieergebnisse werden durch die Kombination von Tyrosin-Kinase-Inhibitoren (TKI) wie Imatinib und Chemotherapeutika verbessert, sind aber durch das Auftreten von Resistenzen gegen TKI in ihrer langfristigen Wirkung limitiert. Die derzeitige Forschung fokussiert sich weitestgehend auf konstitutive aktive Kinasen, die für die leukämische Transformation verantwortlich sind. Allerdings kann die Deregulation von Phosphatasen, die als Gegenspieler von Kinasen fungieren, durch eine verminderte Inaktivierung dieser Kinasen, ebenso zur Leukämogenese beitragen, indem ihre physiologische Funktion vermindert wird. Im Vorfeld konnte bereits gezeigt werden, dass die deregulierte Protein Tyrosin Phosphatase 1B (PTP1B) bei Ph+ Leukämien eine partielle Resistenz gegenüber TKI vermitteln kann.1 Darüber hinaus zeigen von Juric et al. (2007)2 publizierte Microarrays von 54 Ph+ ALL Patienten eine transkriptionelle Hochregulierung der Phosphatase „Supressor of T-Cell receptor Signalling 1“ (STS-1).2 STS-1 (TULA-2) gehört zusammen mit STS-2 (TULA-1) zur Familie der STS/TULA Proteine, von denen keine weiteren Mitglieder bekannt sind. STS-1 dephosphoryliert diverse Rezeptor-Tyrosin-Kinasen wie z.B. den T-Cell Receptor (TCR) und den Epidermal-Growth-Factor Receptor (EGFR) und verhindert somit deren Internalisierung und proteosomalen Abbau.3 Weitere durch STS-1 dephosphorylierte Substrate sind die Proteintyrosinkinase Syk, die eine wichtige Rolle bei der Signalweiterleitung des B-Cell-Receptors (BCR) spielt sowie andere SRC-Kinasen (z.B. FYN).4 Aufgrund der oben beschriebenen Zusammenhänge zwischen STS-1 und der Ph+ ALL ist die Untersuchung einer möglichen funktionellen Bedeutung von STS-1 bei der Entwicklung einer mutationsunabhängigen Resistenz von Ph+ ALL Inhalt dieser Arbeit. Als Modellsystem dienen in der hier vorliegenden Arbeit aus der BCR/ABL Zelllinie Sup B15 abgeleitete TKI resistente Zellen (Sup B15 RT). Imatinib ist in diesen immer noch in der Lage BCR/ABL zu binden und führt zu einer Verschiebung der Dosiswirkungskurve ohne Apoptose zu induzieren. Mutationen in der Tyrosinkinase Domäne von BCR/ABL konnten als zugrunde liegender Resistenzmechanismus durch Sequenzanalysen ausgeschlossen werden, ebenso wie zusätzliche Translokationen oder genomischen Amplifikationen von BCR/ABL. Eine Analyse der STS-1 Expression zeigte sowohl transkriptionell als auch auf Proteinebene eine deutliche Herunterregulierung von STS-1 in Sup B15 RT Zellen. Die Interaktion zwischen STS-1 und BCR/ABL wurde in verschiedenen Zellmodellen gezeigt. Dabei konnten bezüglich der Interaktion keine Unterschiede zwischen dem p210BCR/ABL und p185BCR/ABL Fusionsprotein festgestellt werden. Auch die „Gatekeeper“ Mutation T315I hatte keinen Einfluss auf die Interaktion. Die Unabhängigkeit der Bindung von STS-1 und BCR/ABL von einer aktiven BCR/ABL Kinase wurde durch die Zugabe von Imatinib gezeigt. Lediglich auf endogenem Level konnte eine Imatinib vermittelte Reduktion der Interaktion nachgewiesen werden. Durch die Verwendung unterschiedlich trunkierter BCR/ABL Proteine wurde gezeigt, dass STS-1 sowohl mit c-ABL als auch mit dem ABL-Anteil von BCR/ABL interagiert und dass eine Oligomerisierung für diese Interaktion nicht notwendig ist. Als Folge der Interaktion kommt es zu einer Dephosphorylierung von BCR/ABL durch STS-1, wobei vor allem die im ABL Anteil lokalisierten und für die Autophosphorylierung wichtigen Tyrosine 245 und 412 dephosphoryliert werden. Mittels eines Proliferations-Kompetitions-Assay konnte gezeigt werden, dass STS-1 sowohl die Proliferationsrate reduziert als auch erheblich die Sensitivität von SupB15 RT Zellen gegenüber Imatinib steigert. Dieser Befund steht im Einklang mit der Annahme, dass diese Sensitivitätssteigerung durch eine gegenüber den sensitiven Sup B15 WT deutlich verminderte STS-1 Expression bedingt ist. Dexamethason in klinisch relevanten Konzentrationen (10-6 M - 10-9 M) konnte sowohl in SupB15 WT als auch in SupB15 RT Zellen die STS-1 Expression um ein Vielfaches steigern und führte in Kombination mit 1 μM Imatinib sogar in den resistenten Zellen zu einer hoch signifikanten Inhibition der Proliferation sowie einer gesteigerten Apoptose. Die Resultate dieser Arbeit rücken Phosphatasen und im speziellen STS-1 in einen stärkeren Fokus, wenn es um die Bildung von Resistenzen geht. Dadurch können sich eine Vielzahl neuer Behandlungsstrategien sowie neue Ansätze für die klinische Wirkstoffforschung ergeben.
Acute myeloid leukemia (AML) is a clonal malignancy of hematopoietic stem cells (HSCs) characterized by expansion of myeloid blasts in the bone marrow. It has been shown that autophagy is a degradative process, which delivers cytoplasmic components to lysosomes to prevent malignant transformation by maintaining HSC integrity. Besides its function as a bulk degradation machinery to recycle cytoplasmic components during limited energy supply, autophagy also serves as an intracellular quality control mechanism. Selective autophagy requires autophagy receptors such as p62 to specifically bridge the targeted cargos into autophagosomes. p62 is known as a central signaling hub involved in pro-oncogenic signaling pathways and autophagic degradation pathways. However, little is known about the role of p62 as a selective autophagy receptor in AML. This study aims to elucidate the precise function of p62 as an autophagy receptor in leukemia development and maintenance.
In silico analysis revealed that high p62 expression was significantly associated with poor overall survival of adult patients with de novo AML, suggesting that p62 may promote leukemia maintenance. To address the functional role of p62 in leukemia, genome editing by CRISPR/Cas9 was used to knockout p62 in four human AML cell lines. Importantly, p62 loss reduced cell proliferation in all four cell lines. This observation could be transferred to a murine leukemia cell model in which leukemic transformation of lineage-depleted bone marrow (ldMBM) cells was induced by overexpression of the human transcriptional coactivator MN1. Knockdown of p62 by shRNA in MN1-driven leukemia cells impaired proliferation and decreased colony forming ability without altering apoptosis. This indicates that p62 is crucial for leukemia proliferation in vitro. To further characterize the role of p62 in leukemia development and maintenance a murine AML transplantation model was established. Therefore, ldMBM cells isolated from WT and p62-/- mice were transduced with MN1 and transplanted into lethally irradiated mice. As expected, all mice developed fatal myeloid proliferation. Notably, p62 loss in MN1-driven leukemia significantly prolonged survival in mice and caused a more immature phenotype. Consistent with the in vitro results, ex vivo analysis of p62-/- leukemic cells displayed decreased colony-forming ability, although p62 loss did not affect composition and function of HSCs. Moreover, re-transplantation of primary MN1-driven leukemia cells attenuated leukemia progression upon p62 loss. These findings support a decisive role of p62 in leukemia development and maintenance.
To gain molecular insight into the function of p62 during myeloid transformation an interactome analysis of murine MN1-driven leukemia cells was performed. This revealed first that p62 predominantly interacts with mitochondrial proteins and second that inhibition of autophagic degradation causes accumulation of p62-bound mitochondria. This leads to the first assumption that loss of p62 may provoke mitochondrial accumulation with increasing mitochondrial damage and second that p62 may mediate degradation of mitochondria by mitophagy. Indeed, in the absence of p62, accumulation of dysfunctional mitochondria was detected by morphological changes of the mitochondria, increased mitochondrial ROS and impaired mitochondrial respiration capacity. Furthermore, induction of PINK1/Parkin-independent mitophagy revealed that loss of p62 caused impaired degradation of mitochondrial proteins and reduced translocation of damaged mitochondria into autophagosomes. Taken together, p62 is required for effective degradation of dysfunctional mitochondria by mitophagy in AML.
Due to the fact that p62 is a multifunctional protein, rescue experiments with different mutants of p62 were performed to clarify if p62-mediated mitophagy contributes to leukemia proliferation. Notably, the autophagy-deficient mutant (disabled to bind autophagosomes) reduced cell growth and colony-forming ability to the same extent as knockdown of p62, as the clustering-deficient mutant (disabled to form aggregates) displayed an intermediate phenotype. Strikingly, only the autophagy-deficient mutant failed to rescue mitophagy.
In conclusion, this study demonstrates the prominent role of p62 as a selective autophagy receptor for mitochondrial quality control which contributes to leukemia development and maintenance. Therefore, targeting selective autophagy opens new venues in the treatment of AML.
Suicide genes have been broadly used in gene therapy. They can serve as safety tools for conditional elimination of infused cells or for directed tumor therapy. To date, the Herpes simplex virus thymidine kinase/ ganciclovir (HSVtk/GCV) system is the most prominent and the most widely used suicidegene/prodrug combination. Despite its promising performance, the system displays limitations, which include relatively slow killing kinetics and toxicity of the prodrug GCV. Consequently, several groups have either developed new suicide-gene/prodrug combinations or attempted to improve the established HSVtk/GCV suicide system. The present study also aimed towards optimization of the HSVtk/GCV system. To do so, a novel, codon-optimized point mutant (A168H) of HSVtk was developed. The novel mutant was named TK.007. It was extensively tested for its efficiency in two relevant settings: (1) control of severe graft-versus-host disease (GvHD) after adoptive immunotherapy with Tlymphocytes, and (2) direct elimination of targeted tumor cells. TK.007 was compared to the broadly used wild-type, splice-corrected scHSVtk and to a codon-optimized HSVtk (coHSVtk) not bearing the above point mutation. (1) For experiments related to the adoptive immunotherapy approach, HSVtkvariants were expressed from a γ-retroviral MP71 vector as a fusion construct with the selection and marker gene tCD34. Expression levels for TK.007 in transduced lymphoid and myeloid cell lines were significantly higher at initial transduction and over a 12 week period compared to the commonly used scHSVtk and coHSVtk indicating reduced toxicity of TK.007. Killing kinetics of transduced cell lines (PM1 and K562) and primary human T cells were significantly faster for TK.007 in comparison to scHSVtk and coHSVtk in vitro. In vivo-functionality of TK.007 was assessed in an allogeneic transplantation model. T cells derived from C57BL/6J.Ly5.1 donor mice were transduced with MP71 vectors expressing scHSVtk or TK.007. Transduced cells were selected and transplanted into Balb/c Rag2-/- γ-/- immune-deficient recipient mice. Acute, severe GvHD occurred and was effectively abrogated in all mice transplanted with TK.007- transduced T cells, and in five out of six mice transplanted with scHSVtk-transduced cells. In a slightly modified quantitative allogeneic transplantation mouse model, significantly faster and more efficient in vivo killing was demonstrated for TK.007 as compared to scHSVtk, especially at low doses of GCV. (2) In order to assess TK.007 functionality in cells derived from solid tumors, HSVtk-variants were expressed from lentiviral gene ontology (LeGO) vectors in combination with an eGFP/neo-opt selection cassette. Transduced and selected tumor cell lines that derived from several tissues were eliminated at significantly lower GCV doses and to higher extents when transduced with TK.007 compared to scHSVtk. Moreover, a significantly stronger bystander effect of TK.007 was demonstrated. The superior in vitro efficiency of TK.007 was confirmed in an in vivo subcutaneous xenograft mouse model for glioblastoma in NOD/SCID mice. Mice transplanted with TK.007 transduced cells stayed tumor-free after treatment with different GCV-doses. On the contrary, mice of the scHSVtk group either demonstrated only transiently reduced tumor growth in the low-dose GCV group (10 mg/kg) compared to the control groups or suffered from relatively fast relapses after initial tumor shrinking in the standarddose (50 mg/kg) GCV group. As a result, all mice in the scHSVtk group died from vigorous tumor growth. In summary, in two different applications for suicide gene therapy the present study has demonstrated superior functional performance of the novel suicide gene TK.007 as compared to the broadly used wild-type scHSVtk. Differences became particularly pronounced at low doses of GCV. It can be concluded that the new TK.007-gene represents a promising alternative to the commonly used scHSVtk for gene therapeutic applications.
Die größte Gruppe der Krebserkrankungen bei Kindern sind die Leukämien. Die größte Untergruppe stellen dabei die Leukämien unter Beteiligung des MLL-Gens auf Chromosom 11q23 dar. Die bei MLL-Translokationen gefundenen Partnergene sind äußerst vielfältig. Der häufigste Partner ist jedoch das AF4-Gen auf Chromosom 4. Die bei der t(4;11)-Translokation entstehenden Fusionsproteine MLL-AF4 und AF4-MLL sind die Auslöser der Leukämie, wobei in unterschiedlichen Forschungsarbeiten beiden Fusionsproteinen eine Transformatorische Wirkung bescheinigt werden konnte. Das Wildtyp MLL-Protein liegt in der Zelle in einem Multiproteinkomplex vor, der durch seine Histon-Methyltransferase-Aktivität an Lysin 4 des Histon H3, zu einer offenen Chromatinstruktur führt und dadurch für die Transkriptionsinitiierung essentiell ist. Eine besondere Rolle kommt den MLL-Protein bei der Aufrechterhaltung von epigenetischen Signaturen beispielsweise bei der Embryogenese oder dem Durchlaufen des Zellzyklus zu. Im Gegensatz dazu nimmt der F4-Multiproteinkomplex eine wichtige Stellung in der Transkriptionselongation ein und ermöglicht der RNA-Polymerase II zusammen mit seinen Komplexpartnern die Elongation der mRNA. Die Taspase1 wurde als das Protein entdeckt, dass für die Prozessierung des MLL-Proteins verantwortlich ist und es an den Schnittstellen CS1 bzw. CS2 proteolytisch spaltet. Die hierbei entstehenden Fragmente N320 und C180 können daraufhin dimerisieren und werden gegenüber einem proteasomalen Abbau stabilisiert. Diese Taspase1-Schnittstellen sind auch in dem Fusionsprotein AF4-MLL enthalten und ermöglichen die Stabilisierung des AF4-MLLs nach proteolytischer Spaltung gegenüber seinem proteasomalen Abbau. Die Taspase1 ist eine Threonin-Aspartase aus der Familie der Typ-2 Asparaginasen zu deren weiteren Vertretern die L-Asparaginase sowie die Glycosylasparaginase zählen. Als einziger Vertreter dieser Gruppe ist die Taspase1 jedoch eine Protease. Gemein ist allen Vertretern der Familie, die autoproteolytische Aktivierung des exprimierten Proenzyms hin zu einer katalytisch aktiven Form. Im Falle der Taspase1 kommt es dabei zu einer Spaltung in die als Heterodimer vorliegenden α- und β-Untereinheiten. Das katalytische Nukleophil der aktiven Taspase1 ist dabei das N-terminale Thr234 der β-Untereinheit. Neben ihrer Rolle als Protease des AF4-MLLs und der damit verbundenen Stabilisierung des Onkogens, wird der Taspase1 auch bei den soliden Tumoren eine Rolle als für die Transformation wichtiges Protein zugewiesen, was sich in ihrer häufigen Überexpression in verschiedenen Tumorarten widerspiegelt. Die Taspase1 ist demnach ein interessantes Ziel für die Wirkstoffentwicklung. Hierfür ist die Generierung eines quantitativen Aktivitätstest besonders wichtig und war Ziel dieser Arbeit. Der entwickelte Aktivitätstest basiert auf einem Reporter bestehend aus den beiden Fluoreszenzproteinen TagBFP sowie TagGFP2, die über eine Taspase1 Schnittstelle verbunden wurden. Dieses FRET-Paar lässt dabei die kontinuierliche Beobachtung der Reaktion zu und ermöglicht eine Auswertung der kinetischen Parameter der Reaktion. Von den beiden FRET-Reportern mit den unterschiedlichen Schnittstellen CS1 und CS2,konnte nur der mit der CS2 Schnittstelle exprimiert werden. Dieser Reporter konnte dann für die Validierung des Aktivitätstests eingesetzt werden und ließ die Bestimmung der kinetischen Parameter der Taspase1 für diese Reaktion zu. Die erhaltenen Parameter bewegen sich in einer ähnlichen Größenordnung wie schon publizierte kinetische Parameter eines Peptid-basierten Aktivitätstests. Ausgehend hiervon wurden die dnTaspase, eine dominant negative Taspase1-Mutante, kinetisch untersucht und ihre Inhibition der Taspase1-Aktivität beschrieben. Der Aktivitätstest ließ die Bestätigung der Konzentrationsabhängigen Inhibition der Taspase1-Aktivität durch die dnTaspase zu. Diese Beobachtung konnte auch in einer Zell-basierten Variante des Aktivitätstests bestätigt werden und zeigte sich ferner auch in einer Wachstumsverlangsamenden Wirkung der dnTaspase in der t(4;11)-Zelllinie SEM, wobei dieser Effekt nicht auf einer Zunahme der Apoptose der Zellen zurückzuführen war. Desweiteren wurde der Aktivitätstest benutzt, um eine Reihe von gegen das aktive Zentrum der Taspase1 gerichtete Substanzen auf ihre inhibitorische Wirksamkeit zu untersuchen.Hierbei gelang es einen Kandidat als Leitsubstanz zu identifizieren, der eine konzentrationsabhängige Inhibition der Taspase1 zeigte. Eine Bindung dieser Substanz an die Taspase1 konnte jedoch durch einen Thermal Shift Assay nicht nachgewiesen werden und ein Einfluss auf die Viabilität von proB-ALL Zelllinien konnte nicht beobachtet werden.
Hematopoietic stem cells (HSCs) have the unique abilities of life-long self-renewal and multi-lineage differentiation. They are routinely used in BM or stem cell transplantations to reconstitute the blood system of patients suffering from malignant or monogenic blood disorders. For an adequate production of each blood cell lineage in homeostasis and under stress conditions, the fate choice of HSCs to either self-renew or to differentiate must be strictly controlled. The incomplete understanding of the molecular mechanisms that control this balance makes it still impossible to maintain or expand undifferentiated HSCs in culture for advanced regenerative medical purposes.
The aim of this thesis was the identification and molecular characterisation of mechanisms that control the decision of HSCs to self-renew or to differentiate, and how they are connected to extrinsic cytokine signaling control. Prior to this thesis, a screening for genes upregulated under self-renewal promoting thrombopoietin (TPO) signaling via the transcription factors STAT5A/B in HSCs was conducted, and Growth arrest and DNA damage inducible 45 gamma (Gadd45g) was one of the regulated genes. GADD45G was described as stress sensor, DNA-damage response and tumor suppressor gene, that is epigenetically silenced in many solid tumors and leukemia. Furthermore, Gadd45g is upregulated in aged HSCs with impaired multi-lineage reconstitution abilities, and it is induced by differentiation promoting cytokines in GM-committed cells. However, the function of GADD45G in LT-HSCs was unknown. All these points warrant further investigation to unravel the function of GADD45G on early cell fate decisions of HSCs in hematopoiesis.
The expression of Gadd45g was stimulated by hematopoietic cytokines TPO, IL3 and IL6 both in HSCs and MPPs, making GADD45G an interesting target to focus on. To simulate the cytokine-induced expression GADD45G was lentivirally transduced in HSCs. Surprisingly, GADD45G did not induce cell cycle arrest or cell death in hematopoietic cells neither in vitro nor in vivo, as reported in many cell lines. Instead GADD45G revealed an enhanced and markedly accelerated differentiation of HSCs into mainly myelomonocytic cells, similar as observed for IL3 and IL6 containing cultures. Also in vivo, GADD45G rapidly initiates the differentiation program in HSCs at the expense of self-renewal and long-term engraftment, as shown by serial HSC transplantation experiments. Along the same line, HSCs from Gadd45g-knock out mice exhibited an increased self-renewal. In vitro, Gadd45g-/- progenitors showed higher and prolonged colony formation potential and slower expansion after cytokine stimulation. The loss of Gadd45g increased HSC self-renewal and improved repopulation in secondary recipients, determined by serial competitive transplantations. Taken together, GADD45G could be identified as molecular link between differentiation-promoting cytokine signaling and rapid differentiation induction in murine LT-HSCs.
As presented in this thesis the differentiation induction of GADD45G was mediated by the activation of the cascade of MAP3K4 – MKK6 –p38 MAPK. Small molecule inhibition of p38, but not JNK, blocked the GADD45G-induced differentiation. GADD45G binds to MAP3K4 and releases its auto-inhibitory loop by a change in confirmation, initiating this cascade. Phosphoflow cytometry demonstrated the activation of p38 and a downstream kinase MK2 by GADD45G expression in MPPs. Furthermore, the expression of constitutive active MAP3K4 and MKK6 were able to phenocopy GADD45G-induced differentiation, which could be blocked by p38 inhibition.
The other two family members GADD45A and B also induced accelerated differentiation in LT-HSCs. Interestingly, only GADD45G suppressed the differentiation into megakaryocyte and erythrocyte (Mek/E) lineage cells suggesting a role of GADD45G in lineage choice. Long-term time-lapse microscopy-based cell tracking of single LT-HSCs and their progeny revealed that, once GADD45G is expressed, the development of LT-HSCs into granulocyte-macrophage-committed progeny occurred within 36 hours, and uncovered a selective lineage choice with a severe reduction in Mek/E cells. Furthermore, no megakaryocytic-erythroid progenitors (MEPs) could develop from HSPCs in BM 2 weeks after transplantation suggesting a very early selection against Mek/E cell fates. In line with these findings, GADD45G-transduced MEPs could not expand or form colonies in vitro, demonstrating that the differentiation program induced by GADD45G is not compatible with Mek/E lineage fate. Gene expression profiling of HSCs indicated that GADD45G promotes myelomonocytic differentiation programs over programs for self-renewal or megakaryo-/ erythropoiesis. The here identified differentiation induction potential of GADD45G is so strong that the expression of GADD45G in primary acute myeloid leukemia (AML) cells inhibited their expansion accompanied by enhanced differentiation and increased apoptosis.
The here presented work shows that IL3 and IL6 induce a differentiation program in HSCs via GADD45G and p38 closing the link of extrinsic cytokine signaling and differentiation induction. Since the loss of Gadd45g increased the self-renewal and slowed HSC differentiation, this may be utilized, i.e. by p38 inhibition, to ex vivo maintain and expand HSCs by preventing cytokine-induced differentiation. Furthermore, Re-expression of GADD45G may overcome the differentiation block in leukemia to eliminate these cells by driving them into terminal differentiation and apoptosis.
The liver as the biggest endocrine gland of the human body plays a central role in many metabolic pathways such as detoxification, storage of carbohydrates and distribution of lipids. As the liver receives blood supply from the gut by the portal vein, liver cells are often challenged with high concentrations of nutrients and components of our commensal microbiota. Therefore, the immune system of the liver induces a tolerant state, meaning no or low inflammatory reactions to those constant stimuli. Yet, as various pathogens target the liver, the hepatic immune system also needs the capability to induce strong immune responses quickly. Chronical damage to the liver, which can be caused by alcohol, pathogens or toxins, might lead to liver cirrhosis, where the amount of functional liver tissue is decreased dramatically. This pathology can worsen and lead to acute-on-chronic liver failure, whose high mortality is due to high inflammation and multi-organ failure. Interleukin-7 is a cytokine known for its pro-survival functions especially in lymphopoiesis. However, it is also very important for maintenance of mature immune cells in the liver. As mouse experiments have demonstrated an induction of Interleukin-7 in the liver as a response to bacterial lipopolysaccharide, we aimed to characterize the role of Interleukin-7 in hepatic immunoregulation in both health and disease.
The experiments were mostly based on in vitro approaches. Induction of Interleukin-7 in liver cells was analyzed using ELISA, quantitative PCR, and Immunoblotting. Knockdown of signal transduction components was performed by siRNA transfection. Primary immune cells isolated from healthy donor buffy coat were studied for their ability to respond to Interleukin-7. Activation of downstream signal transduction was assessed by Immunoblotting. Functional consequences of Interleukin-7 signaling, such as alterations in cellular metabolism, cellular survival and endotoxin tolerance, were studied in monocyte-derived macrophages. Finally, serum concentrations of Interleukin-7 and frequencies of Interleukin-7 receptor positive immune cells were quantified in patients with compensated or decompensated liver cirrhosis or acute-on-chronic liver failure.
Interleukin-7 expression could be observed in human hepatic cell lines and primary hepatic sinusoidal endothelial cells when stimulated with IFNα or IFNγ, but not IFNλ. IRF-1 was identified as a key regulator of Interleukin-7 expression, as its transcription, translation and nuclear translocation were induced and enhanced upon IFNα or IFNγ, but not IFNλ treatment. We identified LPS-primed macrophages as innate immune target cells of Interleukin-7, which responded by an inhibitory phosphorylation of GSK3. This signal transduction led to enhanced production of pro-inflammatory cytokines and abolished endotoxin tolerance. In parallel, cellular fitness was reduced as demonstrated by reduced intracellular ATP concentration and intracellular WST-1 staining. Finally, we could identify components of the in vitro signal transduction also in liver cirrhosis patients. However, Interleukin-7 serum concentrations were significantly in liver cirrhosis patients compared to healthy controls. In addition, the frequencies of Interleukin-7 receptor positive immune cell populations differed in patients and controls.
We identify Interleukin-7 as a pro-inflammatory cytokine in hepatic immunoregulation. It is part of a cascade where its induction is regulated by type I and type II Interferons and mainly restricted by the presence of IRF1. We demonstrate the importance of Interleukin-7 also for innate immune cells, where the abolishment of endotoxin tolerance may provide an interesting strategy of liver cirrhosis patients. In addition, reduced viability of macrophages in response to Interleukin-7 is a striking contrast to the well-described survival functions in lymphocytes. The decrease of serum Interleukin-7 levels and alterations of Interleukin-7 receptor positive immune cell populations suggest an important role for Interleukin-7 also in the diseased liver. Due to the identified mechanisms of action, Interleukin-7 may be an interesting candidate for immunotherapeutic approaches of liver cirrhosis and acute-on-chronic liver failure.
Human MSCs are currently deployed in a wide range of clinical applications and disease models, because of their regenerative and immune modulatory potential. Unfortunately, the fate of MSCs after systemic administration and the related interactions within the blood circulation are still not fully understood. The majority of i.v. or i.a administered MSCs accumulate in the lungs and loose traceability after 3-4 days in vivo144. Since engraftment rate and long term persistence of injected MSCs seems rather low, we tried to improve in vivo kinetics by using hyperosmolaric injection media (HyperHAES) in order to describe the impact on biodistribution, cell morphology and survival rate. In vitro culture related changes in morphology and surface expression patterns were analysed using flow cytometry and brightfield morphology scan in correlation with calibrated microbeads. In vivo tracking of male PKH67 labeled human MSCs in an immunecompetent mouse model were achieved using SRY-gene qRT-PCR analysis and flow cytometry/fluorescence microscopy at different time points. Kinetics, viability and cell-cell interaction of HyperHAES coinjected MSCs in comparison to NaCl 0.9% injection media were assessed with a combination of altering mitochondrial membrane potential (MMP), caspase 3/7-activity, additional survival and surface markers. Incubation of human MSCs in hyperosmolaric injection media (HyperHAES) shortly before i.v. injection decreased average diameter of culture expanded MSCs about 30% (from 48.7±2.29μm to 34.6±2.04μm) and improved viability and retrieval rate of injected MSCs within 24h. HyperHAES decreased significantly the loss of MMP and the signal intensity of the dead cell marker PI in comparison to isotonic control. HyperHAES treated MSCs are detected at higher frequencies in most murine tissues but didn`t result in alterations of interaction with the host immune system or caspase activation. Additionally, HyperHAES seemed to enable MSCs to reach organs with smaller microcirculation like the spleen. Functional impairment of MSC in HyperHAES was analysed with Phalloidin A staining for cytoskeletal activation and showed no signs of disturbed actin polymerization, whereas nuisance of migration and immunemodulatory characteristics were not addressed. PKH67 labeled MSCs decrease in size after i.v. injection in mice, acquire apoptotic and phagocytic cell markers, and accumulate in lungs and liver. This process could be delayed but not reverted by preincubation of MSCs in HyperHAES. Our findings help to explain the rapid loss of traceable MSCs after systemic delivery.
HIV vaccine preclinical testing is difficult because HIV’s only relevant hosts are humans and no correlates of protection are known. To this end, we are working on the humanization of different mouse strains with human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) as well as human hematopoietic stem cells (HSC) to generate a useful small animal model.
We generated immune deficient mice (NOD Scid IL2gc -/- /NOD Rag1-/- IL2gc -/-) expressing human MHC class II (HLA-DQ8) on a mouse class II deficient background (Ab-/-). Here, the human HLA-DQ8 should interact with the matching T cell receptors of transferred matching human PBMCs and therefore could support the functionality of the transferred human CD4+ cells in the mice.
Mice that were adoptively transferred with human HLA-DQ8 PBMCs only showed engraftment of CD3+ T cells. Surprisingly, the presence of HLA class II did not significantly change the repopulation rates in the mice. Also, the presence of HLA class II did not advance B cell engraftment, such that humoral immune responses were undetectable. However, the overall survival of DQ8-expressing mice was significantly prolonged, compared to mice expressing mouse MHC class II molecules, and correlated with an increased time span until onset of GvHD.
To avoid GVHD and to increase and maintain the level of human cell reconstitution over a long period of time, the same mouse strains were reconstituted with human HSC. Compared to PBMC-repopulated mice, HSC-reconstituted mice develop almost all subpopulations of the human immune system detectable at week 12 after HSC transfer. These mice developed adaptive immune responses after Tetanus Toxoide (TT) immunizations. In addition, we are testing the susceptibility of these humanized mice to different HIV strains with a detailed look at immune responses.
Die akute lymphatische Leukämie (ALL) ist eine aggressive Krankheit des hämatopoetischen Systems. Die Gegenwart des Philadelphia - Chromosoms (Ph), das die Translokation t(9;22) kodiert, oder die t(4,11) definieren Hochrisiko - ALL - Patienten mit einer besonders schlechten Prognose (Hoelzer and Gokbuget 2000; Hoelzer et al. 2002; Hoelzer et al. 2002)]. Das Ph Chromosom führt je nach Bruchpunkt der Translokation zur Expression von p185(BCR-ABL) oder p210(BCR-ABL). Die Fusion der Abl-Tyrosin Kinase an Bcr führt zur konstitutiven Aktivierung der Abl-Kinase, die hauptsächlich für die Transformation der Zellen verantwortlich ist. Die Überlebensrate durch aktuelle zytostatische Therapien der Ph+ ALL liegt bei 0-10%, trotz initialer Komplettremission (CR) von 80%, die ähnlich hoch wie die von Ph– Patienten ist. Imatinib (GleevecTM, GlivecTM, früher STI571) ist ein spezifischer Inhibitor der Abl – Kinase mit hoher Effizienz für die Behandlung der Ph+ ALL. Trotz der effektiven Hemmung von BCR-ABL durch Imatinib kommt es beinahe immer zum Rezidiv. Dies verschlechtert weiter die Prognose (Donato et al. 2004). Die Entstehung von Mutationen ist die häufigste Ursache für Resistenz gegen Imatinib, Nilotinib und/oder Dasatinib - Therapie. In dieser Arbeit wurden alternative Therapiestrategien für die Behandlung der ALL untersucht. Dazu wurden zwei Ansätze gewählt, wobei 1.) Gene identifiziert wurden, die zur Imatinib – Resistenz führen, um der Resistenzentwicklung vorzubeugen oder die Resistenz zu überwinden. Weiterhin wurde 2.) versucht die aberrante Transkription leukämischer Zellen zu verhindern. Dazu wurde die Inhibition der Histon – Deazetylierung, die für die aberrante Remodellierung des Chromatins verantwortlich ist, untersucht. ...
"Protein Associated with Myc" (PAM) hat aufgrund seiner enormen Größe von 510 kD und der Vielzahl an Proteinbindungsstellen das Potential viele regulatorische und physiologische Prozesse zu regulieren. Mit der Funktion als E3-Ubiquitinligase und davon unabhängigen Proteininteraktionen reguliert es beispielsweise Prozesse der Synaptogenese und der spinalen Schmerzverarbeitung, wie auch die Regulation des Pteridin Stoffwechsels und des cAMP-Signalweges. Im Gegensatz zur spinalen Schmerzverarbeitung war eine Beteiligung von PAM an der peripheren Nozizeption bisher unbekannt und sollte im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden. Dazu wurden konditionale PAM-Knockout Mäuse generiert und charakterisiert. Zum einen wurde PAM in Vorläuferzellen von Neuronen und Gliazellen und zum anderen in allen nozizeptiven und thermorezeptiven Neuronen der Dorsalganglia und der Ganglia trigeminale deletiert. Der Knockout in Neuronen und Gliazellen führte zu einer pränatalen Letalität und unterstreicht so die Bedeutung von PAM während der Neuronenentwicklung. Mit Hilfe des spezifischen Knockouts in nozizeptiven Neuronen konnte eine Rolle von PAM bei der Regulation der thermischen Hyperalgesie gezeigt werden. Keinen Einfluss hatte die Deletion von PAM auf basale thermische und mechanische Schmerzschwellen, sowie auf Formalin-induzierte akute Schmerzen. Als potentieller Mechanismus wurde der mTOR- und der p38 MAPK-Signalweg untersucht. Dabei konnte eine Vermittlung der S1P-induzierten mTOR-Aktivierung durch PAM nachgewiesen werden und Rheb als eine Komponente dieser Aktivierung ermittelt werden. Der p38 MAPK Signalweg war in Abwesenheit von PAM konstitutiv aktiviert und einige Proteine des Rezeptortraffickings waren verstärkt exprimiert. Als ursächlich für die beobachtete verlängerte Hyperalgesie in PAM-defizienten Mäusen konnte die Unterbindung der Internalisierung des TRPV1-Rezeptors nachgewiesen werden. Dieser Effekt ist spezifisch für TRPV1, da der verwandte Ionenkanal TRPA1 durch die PAM-Deletion nicht beeinträchtigt wurde. In der vorliegenden Arbeit konnte so zum ersten Mal gezeigt werden, dass PAM in peripheren nozizeptiven Neuronen über die p38 MAPK-vermittelte Internalisierung von TRPV1 die Dauer der thermischen Hyperalgesie reguliert.
Der Mangel von Faktor VIII (FVIII) führt zur häufigsten Gerinnungsstörung, der Hämophilie A. Die rekombinante Expression von FVIII für gentherapeutische Ansätze oder zur Herstellung von FVIII ist zwei bis drei Größenordnungen niedriger verglichen mit anderen Proteinen vergleichbarer Größe. Die Ursachen für die geringe Expression liegen zum großen Teil an der ineffizienten Transkription und dem ineffizientem intrazellulären Transport. (1) Im Rahmen der Untersuchung der FVIII-Sekretion, konnte durch Verwendung von FVIII-GFP Fusionsproteinen zum ersten Mal gezeigt werden, wie FVIII in lebenden Zellen transportiert wird. Außerdem wurde anhand von vergleichenden Immunfluoreszensfärbungen, FVIII-Messungen und Westernblotanalysen demonstriert, dass weder bei der B-Domäne deletierten noch bei der Volllängenvariante signifikante Unterschiede zwischen den GFP-fusionierten und Wildtyp-FVIII-Varianten messbar waren. Offensichtlich wird die Funktionalität von FVIII durch die C-terminal fusionierte GFP-Domäne nicht eingeschränkt. In ersten Lebendzellanalysen konnte gezeigt werden, dass sich FVIII in primären Zellen und Zelllinien hauptsächlich im ER befindet und eine für lumenale ER-Proteine charakteristischen Mobilität aufweist. Beim frühen sekretorischen Transport zeigte sich bei Temperaturblock-Experimenten eine verlängerte Dauer der Akkumulation in ER-Exit-Sites und eine vergleichsweise niedrige Frequenz von ER-Golgi-Bewegungen. Es konnte zum ersten Mal der Nachweis von FVIII-Transport durch vesikuläre tubuläre Cluster erbracht werden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass der möglicherweise durch Faltungsprobleme blockierte Austritt aus dem ER das Hauptproblem des ineffizienten FVIII-Transports zu sein scheint und weniger der intrazelluläre Transport an sich. Mittels siRNA-Silencing wurde außerdem die überwiegende Beteiligung von COPI am intrazellulären Transport von FVIII deutlich, dessen Herunterregulierung zu einer 78 prozentigen Reduktion der FVIII-Sekretion im Gegensatz zu 32 Prozent bei COPII führte. Dagegen konnte durch Herunterregulierung der Expression der p24-Cargo-Rezeptor Familienmitglieder p24 und p26 und der Clathrin Adapterproteine µ- und -Adaptin bzw. durch physiologischen Knock-out im Falle von ER-Exit-Rezeptor MCFD2 kein Einfluß auf die FVIII-Sekretion festgestellt werden. (2) Als Alternative zu dem ineffizienten FVIII-Expressionsystem in unphysiologischen Zelllinien, bieten primäre Endothelzellen den Vorteil einer hocheffizienten FVIII-Sekretion. Zur Verwendung bei der rekombinanten Produktion benötigt man allerdings eine kontinuierlich wachsende gut charakterisierte Zelllinie. Zur Immortalisierung wurden aus Nabelschnurblut gewonnene Endothelprogenitorzellen mit der aktiven Untereinheit der humanen Telomerase (hTERT) transduziert. Trotz erfolgreicher Transduktion und langfristiger Expression von hTERT, welche im TRAP-Assay normale Aktivität zeigte, gingen die Zellen nach der natürlichen Teilungsspanne in die Seneszenz über. Möglicherweise wird noch ein weiteres Immortalisierungsgen benötigt oder hTERT ist durch die ektopischen Expression in diesen Endothelzellen nicht funktionell. (3) Der Einsatz hämatopoetischer Stammzellen für gentherapeutische Ansätze zur Expression von humanen FVIII ist bislang aufgrund niedriger Expressionseffizienz der Vektoren limitiert. Es wurden daher die Kombinationen verschiedener transkriptioneller und posttranskriptioneller Elemente in FVIII-Expressionsvektoren ausgetestet. Hierbei zeigte sich, dass die Verwendung einer 5’ untranslatierten Region (5’UTR) des hämatopoetisch exprimierten FXIIIA-Gens die FVIII-Sekretion in verschiedenen Zelllinien und primären Zellen deutlich steigerte. Am stärksten war die Wirkung in primären Monozyten, in denen die FVIII-Expression den 6fachen Wert im Vergleich zum Ursprungsvektor ohne 5’UTR erreichte. Leberzellen stellen weitere attraktive Zielzellen für gentherapeutische Ansätze dar, da Sie den primären physiologischen Ort der FVIII-Synthese darstellen. Die häufig für Gentherapievektoren verwendeten ubiquitär exprimierenden viralen Promotoren bewirken zwar hohe Expression in den transduzierten Zellen, haben allerdings den Nachteil durch ektopische Expression vermehrt Immunantworten auszulösen und durch starke Interaktion mit benachbarten Promotoren der Integrationsstelle im Genom möglicherweise tumorgene Effekte zu verursachen. Bei der Untersuchung verschiedener physiologischer Promotoren im Vergleich zum viralen CMV Promotor in Leberzellen konnte mit dem zum ersten mal getesteten minimalen FVIII-Promoter in einem lentiviralen Vektor der dritten Generation in Leberzelllinien eine vergleichsweise hohe Expression von 0,5 IU/ml FVIII /106 Zellen erzielt werden. Der FVIII-Promoter ist daher geeignet für eine lebergerichtete Expression und minimiert dabei das potentielle Risiko der häufig verwendeten ubiquitären viralen Promotoren.
Ein gen-interner Transkriptionsstart koinzidiert mit einem Rekombinations-Hotspot imhumanen MLL-Gen
(2006)
Chromosomale Veränderungen des humanen MLL-Gens sind für 5-10% der akuten Leu-kämien im Säuglings- und Erwachsenenalter verantwortlich. Davon entstehen wiederum 5-10% der MLL-Aberrationen therapiebedingt. Das auf Bande 11q23 betroffene Gen wird als das Mixed Lineage Leukemia (MLL), Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL-1), Human Homo-log of trithorax (HRX) oder als Human Trithorax 1 (Htrx1) bezeichnet. Mittlerweile sind fast 90 cytogenetische Aberrationen der Bande 11q23 bekannt. Die häufigsten Partnergene des MLL sind AF4 (40%), AF9 (27%), sowie ENL (7%), AF6 (6%), ELL (~5%) und AF10 (4%). Die Bruchpunkte von MLL-Translokationen sind nicht einheitlich über das 92 kb große humane MLL-Gen verteilt, sondern liegen alle in einer ca. 8.3 kb großen Bruchpunkts-clusterregion (bcr). Innerhalb dieser Region sind die Bruchpunkte nicht homogen verteilt. Bruchpunkte von Patienten mit de novo-Leukämien und einem Alter von über einem Jahr sind überwiegend in der 5’-Hälfte der bcr, dem sog. Subcluster I (SCI), lokalisiert. Die Bruchpunkte von Patienten mit therapiebedingten Leukämien sowie Säuglingen (<1 Jahr) liegen dagegen vornehmlich in der 3’-Hälfte der bcr, dem sog. Subcluster II (SCII). Da DNA-Doppelstrangbrüche (DNA-DSB) auf zwei unterschiedlichen Chromosomen eine aus-reichende Voraussetzung für das Entstehen chromosomaler Translokationen sind, stellte sich die Frage, ob aufgrund der inhomogenen Verteilung der Translokationsbruchpunkte innerhalb der MLL bcr, bestimmte Bereiche dieser Region für DNA-DSB besonders anfällig sind. Bisher konnte aufgeklärt werden, dass in SCII, durch Apoptose-auslösende Ereignisse oder cytotoxische Agenzien DNA-DSB sehr leicht induziert werden können. Durch Arbeiten in unserer Gruppe konnte im SCII ein ca. 200 bp großer Bereich um die MLL Intron 11/Exon 12-Grenze lokalisiert werden, in dem sich der größte Teil aller Etoposid-induzierten DNA-Doppelstrangbrüche konzentrierte. Dies galt jedoch nicht für eine perfekte TopoisomeraseII Konsensussequenz im Exon 12, die bisher mit einer Vielzahl Therapie-assoziierter Translokationsbruchpunkte in Verbindung gebracht wurde. Dieser Hotspot kolokalisiert außerdem mit einer scaffold/matrix attachment region (S/MAR), sowie einer DNaseI-hypersensitiven Stelle. Des Weiteren fanden sich in der Literatur Hinweise, dass SCII im Gegensatz zu SCI eine verstärkte Histonacetylierung besitzt. Die potentielle Anwesenheit eines Promotors wurde durch Computeranalysen bestätigt. In einer murinen embryonalen Fibroblasten-Zelllinie, die durch die Insertion einer LacZ/Neo-Kassette in Exon 4 des Mll-Gens einen Transkriptionsstop trug, wurden in anschließenden RT-PCR Experimenten sowohl alle Möglichkeiten des alternativen Spleißens ausge-schlossen, als auch der Start eines Transkripts unmittelbar vor Exon 12 detektiert. Zusätzlich durchgeführte Affymetrix-Chip-Experimente bestätigten die Anwesenheit von Mll-Transkript-signalen in der verwendeten Mll k.o.-Zelllinie. In nachfolgenden Versuchen konnte durch eine weitere Kartierung der Transkriptionsstart auf bis zu +/- 15 bp an der Intron 11/Exon12-Grenze festgelegt werden. Um nun die im Mausmodell gewonnenen Resultate auch im humanen System zu überprüfen, wurden die homologen Regionen des murinen und humanen Mll/MLL-Gens vor ein Luci-ferasereportergen kloniert. Durch RT-PCR konnte der gen-interne Transkriptionsstart im SCII des humanen MLL-Gens ebenfalls lokalisiert werden. Damit wurde gezeigt, dass genetische Instabilität und Transkriptionsinitiation im SCII des humanen MLL-Gens kolokalisieren. Durch die anfangs durchgeführten in silico-Analysen in Maus und Mensch, wurden Deletions-mutanten generiert, mit deren Hilfe die Bedeutung der einzelnen Module dieser Promotor-region ermittelt wurde. Hierbei zeigte sich, dass die Anwesenheit von zwei Retroelementen in der menschlichen Sequenz eine Enhancer-Funktion vermittelt. Dagegen zeigte die homologe murine Sequenz, für die keine erhöhte Anfälligkeit für DNA-DSB bekannt ist, nur schwache Promotoraktivität. Da Histon Modifikationen beim Prozess der Transkription eine entscheidende Rolle spielen, wurde auch die nähere Umgebung des gen-internen Promotors in den murinen k.o.-Zellen untersucht. In der k.o.-Linie zeigte die Region stromaufwärts der putativen Transkriptionsinitiation die Signatur von inaktivem Chromatin (di-methyliertes H3 K9), wohingegen stromabwärts von Mll Exon 12 Chromatinstrukturen nachgewiesen wurden, die aktiv transkribiert werden (tri-methyliertes H3K4), und damit einen weiteren Beweis für die besondere Chromatinstruktur dieser Region lieferten. Durch Western-Blot Experimente wurde das Protein, das durch das Transkript des gen-internen Promotors kodiert wird, nachgewiesen. Das verkürzte murine Mll-Protein wird also, wie sein humanes Pendant, proteolytisch durch die Taspase1 gespalten, so dass sich ein MLL-Mini-Komplex ausbilden kann.
In Deutschland erkranken pro Jahr ~1800 Kinder neu an Krebs, wobei Leukämien mit 33,8 % die häufigste diagnostizierte Krebsform darstellen. Besonders Leukämien mit dem Phänotyp einer akuten lymphatischen Leukämie (ALL) sind mit der Erkrankung im Kindesalter assoziiert. Die häufigsten genetischen Ursachen kindlicher ALLs sind ein hyperdiploider Karyotyp oder chromosomale Translokationen. Unter Säuglingen im Alter von nur wenigen Monaten mit einer ALL treten hier oft reziproke chromosomale Translokationen mit Beteiligung des MLL-Gens auf. Die t(4;11)-assoziierte Leukämie, mit dem AF4-Gen als Translokationspartner, stellt den häufigsten Krankheits-Phänotyp dieser Patientengruppe dar. Die Erkrankung zeichnet sich durch eine stark erhöhte Leukozytenzahl im peripheren Blut bei Diagnose aus. Aufgrund immunphänotyperischer und morphologischer Analysen werden die Leukozyten und auch die Erkrankung durch einen pro B-Zell Phänotyp charakterisiert. Ein weiteres klinisches Merkmal ist das schnell auftretende Rezidiv, welches schlecht auf eine folgende Therapie anspricht und zu sehr geringen Überlebensraten führt, wodurch die t(4;11)-assoziierte Leukämie als Hochrisiko-Leukämie klassifiziert wird. Als genetische Grundlage des Mechanismus der t(4;11)-Leukämogenese wird die Expression der resultierenden Fusionsproteine MLL•AF4 und AF4•MLL angenommen. Durch die Expression beider Fusionsproteine wird die Funktion des Wildtyp MLL-Proteins gehemmt, welches als epigenetischer Regulator für die Hämatopoese und die Ausbildung des Körperbauplans während der Embryogenese essenziell ist. Weiterhin wird auch die Funktion des Wildtyp AF4-Proteins gehemmt, welches einen bedeutenden Bestandteil der zellulären Transkriptionsinitiations- und Elongationsmaschinerie darstellt. Außerdem beeinflussen beide Fusionsproteine zelluläre Mechanismen wie die Proliferation, das Überleben und die Differenzierung, weshalb die Erforschung des Pathomechanismus der Fusionsproteine essenziell für die Rekapitulation und damit für die Therapie und Heilung der Erkrankung ist.
Aktuell rekapitulieren Studien der beiden Fusionsproteine die humane Erkrankung jedoch nur unzureichend. Das MLL•AF4-Protein zeigte bisher eine Blockierung der Apoptose nach unterschiedlichsten Induktionen in zellbasierten Systemen. Allerdings konnte dem Fusionsprotein kein onkogenes Potenzial in vitro nachgewiesen werden und auch in vivo führte die Expression von MLL•AF4 zur Bildung von hauptsächlich myeloischen Neoplasien nach langen Latenzzeiten. Die Expression des reziproken AF4•MLL-Proteins führte in zellbasierten Systemen zu einem verstärkten Metabolismus durch die Steigerung der zellulären Transkription und beeinflusste so die Proliferation. Parallel trat eine hohe Apoptoserate auf, sodass die Proliferation nahezu unverändert schien. Da in vitro jedoch die Kontaktinhibition und Wachstumstransformation von Zellen gezeigt werden konnte und im Mausmodell der humane Phänotyp einer pro B-ALL ausgelöst wurde, scheint das AF4•MLL-Protein das treibende Onkogen der t(4;11)-assoziierten Leukämie zu sein. Allerdings wird die Erkrankung auch in diesem Modell erst nach einer langen Latenzzeit beobachtet und auch die zellulären Mechanismen, in welchen das onkogene Potenzial des reziproken Fusionsproteins entscheidend ist, bleiben weiter zu untersuchen. Deshalb sollten im Rahmen dieser Arbeit hauptsächlich die Auswirkungen der Expression des onkogenen AF4•MLL-Proteins unter verschiedenen Aspekten untersucht, und kooperierende Ereignisse analysiert werden.
Grundlegend sollte die Auswirkung des reziproken Fusionsproteins in humanen Zellen studiert, und auch Effekte des MLL•AF4-Proteins mit früheren Studien verglichen werden, um zellbiologisch relevante Mechanismen aufzudecken. Weiterhin sollte der Einfluss möglicher sekundärer Mutationen und die Wirkung von Koffein als Stimulans untersucht werden, um mögliche Ursachen der langen Latenzzeiten in t(4;11)-assoziierten Mausmodellen zu identifizieren. Da jedoch etwa 20 % aller t(4;11)-Patienten kein AF4•MLL-Protein bilden und als Reziprok oft der solitäre MLL C-Terminus exprimiert wird, sollte zudem der Effekt des MLL•C-Proteins im Mausmodell studiert werden. Insgesamt konnten alle erhobenen Daten mit Resultaten früherer Studien kombiniert werden, wodurch ein spezifisches Modell der t(4;11)-assoziierten Leukämogenese entstand. Das Modell diskutiert die onkogene Funktion des AF4•MLL-Proteins besonders während der hämatopoetischen Differenzierung. Durch die Ergebnisse dieser Arbeit zum klonogenen Wachstum der humanen Zellen nach Expression von AF4•MLL und der Ergebnisse im MLL•C-Mausmodell konnte ein Einfluss des Reziproks auf die Differenzierung von Leukozyten gezeigt werden.
Weiterhin konnte nach AF4•MLL-Expression in humanen Zellen die Steigerung des Metabolismus aber auch die einhergehende vermehrte Apoptose bestätigt werden, welche die lange Latenzzeit im AF4•MLL-Mausmodell begründen könnte. Durch Kooperation mit dem MLL•AF4-Protein, welches anti-apoptotische Effekte zeigt, könnte es jedoch zum frühen Ausbruch der Erkrankung im Säuglingsalter kommen. Allerdings konnte in dieser Arbeit auch eine Steigerung der Proliferation von MLL•AF4-exprimierenden Zellen beobachtet werden, wenn anti-apoptotische Mechanismen des Fusionsproteins inaktiv sind, welche aus der Aktivierung des RAS/RAF/MEK/ERK-Signalwegs resultiert. Werden neben der Translokation zusätzliche RAS-Mutationen aquiriert, die bei 26 % der Kinder mit einer t(4;11)-Leukämie auftreten, wird der Signalweg und somit die Proliferation der leukämischen Blasten zusätzlich stabilisiert. Dadurch kommt es zu höheren Leukozytenzahlen und einem noch früheren Ausbruch der Erkrankung. Weiterhin deckte die Analyse von sekundären Mutationen auch die Beteiligung des FLT3-Signalwegs an der Therapieresistenz durch Quieszenz auf. Ein besonderer Einfluss von Koffein als Stimulans in t(4;11)-Zellen konnte hingegen ausgeschlossen werden. So wurde der Pathomechanismus der t(4;11)-assoziierten Leukämie in dieser Arbeit weiterführend aufgeklärt, wodurch Strategien zur Therapie und Heilung der Erkrankung in Zukunft intensiviert werden können.
Ein weit verbreitetes Merkmal von Leukämien sind genetische Veränderungen, wobei die Entstehung der Leukämie häufig mit reziproken chromosomalen Translokationen assoziiert ist, welche zur Bildung chimärer Genprodukte führen. Eine Vielzahl dieser reziproken Translokationen basieren auf Translokationen des MLL Gens (Mixed Lineage Leukemia), die mit dem Krankheitstyp einer AML oder einer ALL verbunden sind. Die häufigste chromosomale Translokation ist die t(4;11) Translokation. Sie tritt vor allem bei Kleinkindern bzw. auch bei älteren Patienten mit einer Sekundärleukämie auf und resultiert in einer akuten lymphatischen Leukämie. Es handelt sich um eine Hochrisikoleukämie, welche aufgrund ihrer nahezu Therapie-resistenten Blasten mit einer besonders schlechten Prognose assoziiert ist. Der Mechanismus der Leukämieentstehung durch die MLL-Translokationen und der dabei entstehenden Fusionsproteine konnte bis heute nicht ausreichend geklärt werden. Für einige MLL-Translokationen, die mit einer myeloischen Leukämie verknüpft sind, konnte zunächst das onkogene Potenzial der Fusionsproteine im Mausmodell belegt werden. Im Bezug auf die t(4;11) Translokation blieben Ansätze zur Etablierung eines Tiermodells jedoch lang erfolglos. Erst 2006 konnten mittels einer knock-in-Strategie bzw. einem „inverter“-System Mausmodelle für MLL•AF4 entwickelt werden, in denen die Mäuse nach sehr langer Latenzzeit ein disseminiertes B-Zell-Lymphom aufwiesen. Ein neueres konditionales MLL•AF4 knock-in-Modell, in dem MLL•AF4 unter der Kontrolle des endogenen Zellzyklus-abhängigen MLL-Promotors steht, resultierte hingegen in einer ALL oder AML. Im Allgemeinen steht somit bislang das MLL•AF4-Fusionsprotein im Vordergrund der Erforschung des pathomolekularen Mechanismus der t(4;11) Translokation. Aufgrund der Tatsache, dass in der Regel jedoch neben dem MLL•AF4- ebenso ein AF4•MLL-Fusionstranskript nachgewiesen werden kann, befassten sich Studien unserer Arbeitsgruppe mit der Funktion des AF4•MLLFusionsproteins. Diese Untersuchungen zeigten, dass das AF4•MLL-Fusionsprotein in der Zelle akkumuliert und in der Entwicklung onkogener Effekte sowie der Wachstumstransformation der Zelle resultiert. Ergänzend belegten retrovirale Transduktions-/Transplantations-Experimente die Entwicklung einer akuten Leukämie im Mausmodell, wenn zuvor mit AF4•MLL bzw. mit AF4•MLL und MLL•AF4 transduzierte Stammzellen transplantiert wurden. Um nun die Funktion des AF4•MLL-Proteins sowie die molekularen Ursachen der beobachteten Eigenschaften besser verstehen zu können, wurde der AF4•MLL-Proteinkomplex mittels einer Strep-Tag-Affinitätschromatographie erfolgreich gereinigt und ein Molekulargewicht von ca. 2 MDa über Größenausschlusschromatographie bestimmt. Damit nicht nur ein Vergleich mit dem MLL- sondern auch mit dem AF4-Wildtyp- Proteinkomplex möglich war, wurden ebenfalls eine Größenbestimmung und eine Reinigung des AF4-Proteinkomplexes durchgeführt. Die folgenden Analysen der Komplexkomposition über Immunopräzipitationen, Western Blot-Analysen sowie massenspektrometrische Analysen zeigten, dass sich der AF4•MLL-Proteinkomplex aus Mitgliedern der beiden Wildtyp-Proteinkomplexe zusammensetzt; es wurden P-TEFb, HEXIM1, NFKB1, NPM1, DDX6 und das AF4-Wildtypprotein aus dem AF4-Komplex sowie ASH2L, RBBP5, WDR5, CREBBP, HCF-1 und HCF-2 aus dem MLL-Komplex nachgewiesen. Auf diese Weise werden im AF4•MLL-Proteinkomplex Eigenschaften bzw. Funktionen beider Wildtyp-Proteinkomplexe kombiniert. Um einen weiteren Hinweis auf die Funktion zu erhalten, wurde ergänzend ein in vitro Histon-Methyltransferase-Assay etabliert, der für beide gereinigten Proteinkomplexe eine Histonmethyltransferase-Aktivität zeigte. Basierend auf den vorliegenden Daten kann eine Konkurrenzsituation zwischen dem AF4•MLL-Proteinkomplex und den beiden Wildtyp-Proteinkomplexen um die entsprechenden Faktoren angenommen werden, welche die Assemblierung vollständiger und funktioneller Wildtyp-Proteinkomplexe verhindern könnte. Des Weiteren weisen die Ergebnisse auf Funktionen des AF4•MLL-Proteins in transkriptionellen Prozessen, Histonacetylierungen sowie der H3K4-Trimethylierung hin. Die Fehlregulation epigenetischer und transkriptioneller Prozesse durch die Anwesenheit des AF4•MLL-Proteinkomplexes spielt somit vermutlich eine entscheidende Rolle im pathomolekularen Mechanismus der t(4;11) Translokation.
Acute myeloid leukemia (AML) is characterized by the accumulation of a large number of abnormal, immature blast cells. Recently, histone deacetylase inhibitors (HDIs) received considerable interest on the ground of their ability to overcome the differentiation block in these leukemic blasts regardless of the primary genetic alteration, an effect achieved either alone or in combination with differentiating agents, such as all-trans retinoic acid (t-RA). Valproic acid (VPA), a potent HDI, is now under clinical evaluation owing to its potent differentiation effect on transformed hematopoietic progenitor cells and leukemic blasts from AML patients. Conversely, in a clinical study by Bug et al., the favorable effects of the combination treatment with t-RA/VPA in advanced acute myeloid leukemia patients were reported to be most likely due to an enhancement of nonleukemic myelopoiesis and the suppression of malignant hematopoiesis rather than enforced differentiation of the leukemic cells. Based on the hypothesis that VPA influences normal hematopoiesis, the effect of chromatin modeling through VPA on HSCs was investigated with respect to differentiation, proliferation as well as self-renewal in the present study. It has been shown that valproic acid increases both proliferation and self-renewal of HSC. It accelerates cell cycle progression of HSC accompanied by a down-regulation of p21cip-1/waf-1. Furthermore, valproic acid inhibits GSK3B by phosphorylation on Ser9 accompanied by an activation of the Wnt signaling pathway as well as by an up-regulation of HoxB4, a target gene of Wnt signaling. Both are known to directly stimulate the proliferation of HSC and to expand the HSC pool. To sum up, valproic acid, a potent histone deacetylase inhibitor known to induce differentiation and/or apoptosis in leukemic blasts, stimulates the proliferation and self-renewal of hematopoietic stem cells. Therefore, the data reported in this study suggest to reconsider the role of histone deacetylase inhibitors from a differentiation inducer to a coadjuvant factor for increasing the response to conventional therapy in acute myeloid leukemia.
Stem cells capable of self-renewal and differentiation into multiple tissues are important in medicine to reconstitute the hematopoietic system after myelo-ablative chemo- or radiotherapy. In the present situation, adult stem cells such as Mesenchymal stem cells (MSC) and Hematopoietic stem cells (HSC) are used for therapeutic purposes. For tissue regeneration and tissue constitution, engraftment of transplanted stem cells is a necessary feature. However, in many instances, the transplanted stem cells reach the tissues with low efficiency. Considering the three-step model of leukocyte extravasation by Springer et al, the rolling, adhesion and transmigration form the three major steps for the transplanted stem cells to enter the desired tissues. One of the molecular switches reported to be involved in these mechanisms are the Rho family GTPases. The present study investigates the role of Rho GTPases in adhesion and migration of stem and progenitor cells. Chemotactic and chemokinetic migration assays, transendothelial migration assays, migration of cells under shear stress, microinjection, retroviral and lentiviral gene transfer methods, oligonucleotide microarray analysis and pull down assays were employed in this study for the elucidation of Rho GTPase involvement in migration and adhesion of stem and progenitor cells. The transmigration assay used for the migration determination of the adherent cell type, MSC, was optimized for the efficient and effective assessment of the migrating cells. The involvement of Rho was found to be critical for stem and progenitor cell migration where inactivation of Rho by C2I-C3 transferase toxin and/or overexpression of C3 transferase cDNA increased the migration rate of Hematopoietic progenitor cells (HPC) and MSC. Moreover, modulation of Rho caused predictable cytoskeletal and morphological changes in MSC. Assessment of Rho GTPase involvement in the interacting partner, the endothelial cells during stem cell migration, revealed that active Rho expression induced E-selectin expression. The increased levels of E-selectin were functionally confirmed by the increased adhesion of progenitor cells (HPC) to the Human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) layer. Moreover, inhibition of Rac in the migrating endothelial progenitor cells (eEPC) increased their adhesion to HUVEC correlating with the increased percentage expression of cell surface receptor, CD44 in Rac inactivated eEPC. In conclusion, this study shows that Rho GTPases control the adhesion and migration of stem and progenitor cells, HPC and MSC. Rho inhibition drives the cells to migrate in the blood vessels. The substantial increase in the level of active Rho in endothelial layer, manifested by the E-selectin surface expression assists the better adhesion of stem and progenitor cells to the endothelial layer. Serum factors and growth factors in the physiological system influence the Rho GTPase expression in both migrating stem cells and the barrier endothelial cells. Thus, specific modulation of Rho GTPases in the transplanted stem and progenitor cells could be an interesting tool to improve the migration and homing processes of stem cells for cellular therapy in future.
Leukämien sind eine heterogene Gruppe von malignen Erkrankungen der hämatopoetischen Zellen. Die Pathogenese der akuten myeloischen Leukämie (AML) ist durch einen Differenzierungsblock charakterisiert [Gelmetti V MCB 1998, Ruthardt M MCB 1997, Grignani F Cell 1993, Testa U Leukemia 1998]. Die akute Promyelozyten Leukämie (APL) ist eine gut charakterisierte Unterform der AML, die in 95% der Fälle die t(15;17) und in 2% die t(11;17) beinhaltet. Die resultierenden Fusionsproteine PML/RARalpha und PLZF/RARalpha (X-RARalpha) geben in verschiedenen Modellen den leukämischen Phänotyp wieder und induzieren einen Differenzierungsblock. Im Tiermodell induziert die Expression von PML/RARalpha und PLZF/RARalpha eine Leukämie. Die Behandlung mit all-trans-Retinolsäure (t-RA) ist in der Lage den Differenzierungsblock in PML/RARalpha, aber nicht in PLZF/RARalpha positiven Blasten zu überwinden. Diese beiden Fusionsproteine blockieren die Differenzierung durch verschiedene Mechanismen, so z.B. durch die aberrante Rekrutierung von Histon-Deazetylase-Korepressor-Komplexen (HD-NCR) und die Deregulierung differenzierungsspezifischer Transkriptionsfaktoren wie VDR oder c/EBPa [Puccetti E Blood 2004]. Der Vitamin D3 Rezeptor (VDR) ist ein Mitglied der hormoninduzierbaren Transkriptionsfaktoren und bindet direkt an PML/RARalpha, was zur funktionellen Inaktivierung von VDR und Blockierung der VitD3-induzierten Differenzierung führt [Puccetti 2002]. Das Ziel dieser Arbeit war es zunächst, zu untersuchen, ob XRARalpha in der Lage sind andere differenzierungsrelevante Transkriptionsfaktoren, wie PU.1 und GATA-1, zu binden und dadurch funktional zu inaktivieren. GATA-1 und PU.1 sind Schlüsselfaktoren der myeloischen Differenzierung. Kürzlich wurde gezeigt, dass der Knockout dieser beiden Transkriptionsfaktoren zur Leukämogenese beiträgt [Rosenbauer F 2005, Stachura 2005]. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass X-RARalpha sowohl GATA-1, als auch PU.1 direkt binden, ohne ihre Expressionsniveaus zu beeinflussen. Die DNA-Bindungskapazität dieser beiden Transkriptionsfaktoren auf ihre Zielpromotoren war durch X-RARalpha deutlich reduziert. Die Behandlung mit t-RA restorierte die Bindung von GATA-1, aber nicht von PU.1, was darauf schließen lässt, dass die funktionale Inaktivierung von GATA-1 ligandenabhängig, die von PU.1 -unabhängig ist. Die transkriptionelle Aktivität auf künstliche Zielpromotoren war in Gegenwart von X-RARalpha bei PU.1 stark reduziert, auf GATA-1 hatten X-RARalpha in diesem Zusammenhang keinen Einfluss. Die Überexpression dieser Transkriptionsfaktoren in X-RARalpha-positiven hämatopoetischen Stammzellen hat die aberrante Selbsterneuerung leukämischer Stammzellen (LSZ) reprimiert. Während PU.1 Differenzierung erzeugte, tat GATA-1 dies nicht. Die Vermutung liegt nahe, dass die Inhibition von Dissertation von Anita Seshire 2 GATA-1 über seinen Azetylierungsstatus in Gegenwart von X-RARalpha stattfindet, durch die Sequestrierung eines weiteren Proteins der Histon-Azetyltransferase (HAT) CBP/p300, die für die Azetylierung von GATA-1 verantwortlich ist. Zusammengenommen lassen diese Daten darauf schliessen, dass PU.1 durch die Interaktion mit PML/RARalpha seinem Wirkungsort entzogen wird (sequestriert) und das die Inhibition von GATA-1 ein Zusammenspiel aus Sequestrierung und Chromatin-Modellierung durch X-RARalpha ist. Die Fähigkeit von X-RARalpha, den leukämischen Phänotyp zu induzieren ist an ihre Fähigkeit zur Oligomerisierung und zur Formierung sog. Makrokomplexe gekoppelt [Grignani 1996, Minucci 2000, Puccetti 2005]. Um die Zusammensetzung dieser Makrokomplexe zu entschlüsseln, wurde ein Mockkontrollierter TAP-Proteomics-Screen mit PLZF/RARalpha in KG-1 Zellen durchgeführt. Es konnten verschiedene Proteine identifiziert werden, die spezifisch an PLZF/RARalpha binden und vermutlich eine Rolle für die Leukämogenese spielen. Die identifizierten Proteine spielen eine Rolle bei der Migration, den kleinen GTPasen, epigenetischer Regulation und Stammzellselbsterneuerung. Das „adenomatous poliposis coli“ Protein (APC) wurde als spezifischer Interaktionspartner für PLZF/RARalpha identifiziert und ist ein Hauptinhibitor des Wnt-Signalwegs. Die Deregulierung des Wnt-Signalwegs spielt eine bedeutende Rolle in der Leukämogenese durch die aberrante Induktion der Selbsterneuerung leukämischer Stammzellen [Zheng 2004]. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass APC direkt an PLZF/RARalpha, aber nicht PML/RARalpha bindet ß-catenin/TCF vermittelte Transkriptionssignale, die zur Leukämogenese beitragen können, aktiviert. Die Bindung an APC ist abhängig von der Oligomerisierungsfähigkeit des PLZF/RARalpha und daher von der korrekten Konformation der Proteininteraktionsdomäne BTB/POZ, was durch POZ-Punktmutanten nachgewiesen wurde, die auch nicht mehr in der Lage waren ß-catenin/TCF-vermittelte Transkription in derselben Stärke wie PLZF/RARalpha zu aktivieren. Die Überexpression von APC in PLZF/RARalpha-positiven LSZ hat ihre aberrante Selbsterneuerung vollkommen reprimiert. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass die Interaktion von APC, GATA-1 oder PU.1 mit XRARalpha und der konsequente Sequester einen wichtigen Mechanismus zur Leukämogenese stellen. Weiterhin hat sich gezeigt, dass die Überexpression dieser Proteine, die aberrante Selbsterneuerung überwinden kann und teilweise Differenzierung erzeugt. Es konnten der Wnt-Signalweg als valides Ziel für neue Therapieansätze identifiziert werden und die molekularen Mechanismen der Pathogenese der APL weiter aufgeklärt werden.