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Stechmücken (Dipteren: Culicidae) sind weltweit mit über 3500 Arten und mit Ausnahme der arktischen Regionen ubiquitär vertreten. Die medizinische Relevanz dieser Tiergruppe, begründet durch die hämatophage Lebensweise der Weibchen, erschloss sich bereits Ende des 19. Jh. und hat bis heute Bestand. Jedes Jahr sterben rund 600.000 Menschen an den Folgen der Malaria und fast 100 Mio. Menschen infizieren sich mit dem Denguefieber. Zwar beziehen sich diese Zahlen fast ausschließlich auf die Entwicklungsländer, aber im Zuge des Klimawandels und des immer stärkeren Welthandels kommt es auch in Europa und den USA immer wieder zu Ausbrüchen vorher nicht relevanter Krankheiten. So hat sich das West-Nil- Virus seit 1999 in Nordamerika rasant verbreitet. Im Jahr 2013 gab es dort rund 2500 Fälle, von denen 119 zum Tod führten. In Europa traten hingegen Krankheiten wie das Chikungunyafieber (Italien 2007) oder das Denguefieber (Frankreich 2010/2013) auf. Die Gründe für diese Ausbrüche sind vor allem in der Einschleppung neuer Vektorspezies und Krankheitserreger sowie in den veränderten Wirtspräferenzen einheimischer Stechmückenarten zu suchen. Das Wissen um das Vektorpotential der in Deutschland heimischen Stechmücken konnte vor allem durch die seit 2009 initiierten Monitoring-Programme stetig erweitert werden. Auch die Veränderung der heimischen Fauna durch invasive Arten wie Ochlerotatus japonicus japonicus oder Aedes albopictus wird intensiv erforscht. Dennoch ist hinsichtlich der Biologie, Ökologie sowie Genetik vieler Arten noch immer wenig bekannt.
Die vorliegende Dissertation, welche auf Basis von vier (ISI-) Einzelpublikationen kumulativ angefertigt wurde, beschäftigte sich mit der Analyse der genetischen Variabilität sowie der Zoogeographie der untersuchten Arten und der Etablierung einer schnellen und kostengünstigen Methode zur Artdiagnostik. Besonderes Augenmerk wurde bei den Analysen auf die beiden heimischen Arten Culex pipiens und Culex torrentium sowie die invasive Art Ochlerotatus japonicus japonicus gelegt. Ziel war es, die noch bestehenden Wissenslücken zu füllen, um zukünftige Monitoring-Programme besser koordinieren sowie Analysen zur Vektorkompetenz und Genetik dieser Arten gezielter durchführen zu können.
Es konnte gezeigt werden, dass Cx. pipiens und Cx. torrentium deutliche Unterschiede in ihren Populationsstrukturen aufwiesen welche auf verschiedene evolutive Prozesse hindeuten. Die geringere genetische Variabilität in Cx. pipiens lässt auf positive Selektion durch z.B. Insektizidresistenz im Zuge durchgeführter Bekämpfungsmaßnahmen oder die Infektion mit Wolbachien schließen. Die analysierte Populationsstruktur von Cx. torrentium spricht hingegen für eine geringe Ausbreitung, wodurch der genetische Austausch reduziert wurde und so die untersuchten Populationen genetisch stärker voneinander abwichen. Des Weiteren ließen die Analysen des Cytochrom c Oxidase Untereinheit 1-Fragmentes (cox1) Rückschlüsse auf die Zoogeographie dieser Arten in Deutschland zu - wobei beide Arten über das Untersuchungsgebiet verteilt waren, Cx. torrentium jedoch in den neuen Bundesländern weniger häufig nachgewiesen wurde als in den alten und eine geringere gefangene Individuenzahl aufwies. Basierend auf der ökologischen Nischenmodellierung konnten potentiell neue Verbreitungsgebiete für die Art Ochlerotatus japonicus japonicus identifiziert werden. Als klimatisch besonders günstig zeigten sich dabei Südhessen, das Saarland sowie nördliche Teile Nordrhein-Westfalens. Mit Hilfe der etablierten Methode der direct-PCR wird in Zukunft eine schnellere und kostengünstigere Identifizierung von Stechmücken erfolgen können, welche aufgrund bestimmungsrelevanter Merkmale nicht mehr morphologisch zu identifizieren sind.
Um das Wissen über die Stechmücken in Deutschland fortlaufend zu intensivieren, ist sowohl das Weiterführen der Monitoring-Programme als auch die molekularbiologische Aufarbeitung der Proben nötig. Durch die Anwendung neuer Techniken und weiterer molekularer Marker wird es möglich sein, weitere Krankheitserreger sowie genetische Besonderheiten der heimischen Stechmückenfauna nachzuweisen. Aber auch die Überwachung invasiver Stechmückenarten durch die Modellierung potentieller Verbreitungsgebiete und die Anwendung molekularbiologischer Analysemethoden zum Detektieren der Arten und möglicher Krankheitserreger wird ein wichtiger Bestandteil der weiteren Forschung sein.
Auf den Einsatz von Tieren im Rahmen der (Umwelt-)Risikobewertung von Stoffen kann nach wie vor nicht verzichtet werden. Dabei führen die Überprüfungen einer zunehmenden Anzahl neu entwickelter Stoffe, aber auch die gestiegenen Anforderungen der Gesetzgebungen zu einem hohen Verbrauch von Versuchstieren. Diese Untersuchungen sind wichtig, da viele der in Gebrauch befindlichen und in allen Bereichen genutzten Chemikalien potentiell endokrin wirksam sind, auf unterschiedlichen Wegen in die Umwelt gelangen und sich potentiell negativ auf die Gesundheit von Mensch und Tier auswirken können.
Bei den bisher verwendeten Methoden werden vor allem juvenile oder adulte Tiere, aber auch Tiere zur Untersuchung des kompletten Lebenszyklus über eine oder mehrere Generationen für die Beurteilung von Substanzen eingesetzt. Dabei ist bekannt, dass die Entstehung reproduktiver Störungen in der Embryonalphase der jeweiligen Individuen auftritt. Um den Tierverbrauch zu reduzieren, werden teilweise In-vitro-Testsysteme angewendet. Es zeigt sich aber, dass diese Tests lediglich einen bestimmten Zelltyp in einem bestimmten Entwicklungsstadium abbilden können, was die Aussagekraft über die tatsächliche Wirkung auf ein komplexes Gewebe und dessen Entwicklung, erst Recht für den kompletten Organismus, stark einschränkt. Die Aussagekraft dieser Methoden ist daher in bestimmten eingeschränkten Grenzen zu sehen. In der vorliegenden Arbeit wird eine alternative Ersatzmethode vorgestellt mit dem Ziel einer stärkeren Aussagekraft bei toxikologisch und ökotoxikologisch relevanten Endpunkten. Im Fokus stehen hierbei die Effekte von androgenen und estrogenen Substanzen auf die Geschlechtsentwicklung von Hühnerembryonen (Gallus gallus domesticus) auf Ebene der Expression der mRNA, vereint mit Effekten auf Ebene der Organhistologie und – morphologie, verglichen mit den Normalzuständen unbehandelter Individuen. Die neu entwickelte Methode zur Beurteilung solcher Substanzen kann im Rahmen der human- und umwelttoxikologischen Risikobewertung von Stoffen eingesetzt werden und ist ein geeignetes Werkzeug, um die notwendigen Untersuchungen mit der gefordert hohen Beurteilungsqualität durchzuführen. Gleichzeitig kann mit dieser Tierversuchsersatzmethode bei hoher Aussagekraft auch der Verbrauch an weiter und höher entwickelten Versuchstieren verringert werden, was auch einem gesellschaftlich-ethischen Bedürfnis gerecht wird.
Surface water can contain a complex mixture of organic micropollutants (i.e. residues of pharmaceuticals or biocides). Conventional wastewater treatment plants (WWTPs) do not completely remove a broad range of anthropogenic chemicals and therefore represent a leading point source. To upgrade WWTPs, technical solutions based on oxidative and sorptive processes have been developed and successfully implemented. Acknowledging these substantial advances, this thesis focuses on another key topic and aims to investigate whether improved biological treatment processes likewise effectively remove anthropogenic micropollutants from wastewater. The work conducted on this topic was part of two European research projects (ATHENE, ENDETECH).
The ATHENE project aimed to go beyond the state-of-the-art by developing biological wastewater treatment processes that exploit the full potential of biodegradation. With the objective to explore the potential of complementary strictly anaerobic conditions within the biological wastewater treatment, combinations of aerobic and anaerobic treatments on site of a WWTP were implemented. Based on pre-experiments, two promising treatment combinations were selected for a more comprehensive evaluation. An aerobic treatment was paired with an anaerobic pre-treatment under iron-reducing conditions, and an activated sludge treatment was combined with an anaerobic post-treatment under substrate-limiting conditions. For the evaluation of these processes, an effect-based assessment was applied and combined with chemical data of 31 selected target organic micropollutants as well as ten metabolites. To assess the removal of endocrine disrupting chemicals (EDCs), yeast based reporter gene assays covering seven receptor-mediated mechanisms of action including (anti-)estrogenicity, (anti-) androgenicity, retinoid-like, and dioxin-like activity were conducted. Furthermore, the removal of unspecific toxicity (Microtox assay) and oxidative stress response as a marker for reactive toxicity (AREc32 assay) were analyzed to cover micropollutants acting via a non-specific mechanism of action. Moreover, to assess toxicity of the whole effluent in vivo, standardized in vivo bioassays with four aquatic model species (Desmodesmus subspicatus, Daphnia magna, Lumbriculus variegatus, Potamopyrgus antipodarum) were performed.
The combination of aerobic and anaerobic treatments resulted in a low additional removal of the selected target organic micropollutants (by 14-17%). In contrast, the removal of endocrine and dioxin-like activities (by 17-75%) and non-specific in vitro toxicities (by 27-60%) was significantly enhanced. Compared to technical solutions (i.e. ozonation), the combination with an anaerobic pre-treatment under iron-reducing conditions was likewise effective in removing the estrogenic activity as well as the unspecific toxicity, whereas anti-androgenic activity and dioxin-like activity were less effectively removed. Exposure to effluents of the conventional activated sludge treatment did not induce adverse in vivo effects in the investigated aquatic model species. Accordingly, no further improvement in water quality could be observed. In conclusion, the combination of aerobic and anaerobic treatment processes significantly enhanced the removal of specific and non-specific in vitro toxicities. Thus, an optimization of the biological wastewater treatment can lead to a substantially improved detoxification. These capacities of a treatment technology can only be uncovered by complementary effect-based measurements.
The global objective of the ENDETECH project was to develop a biotechnological solution to eliminate recalcitrant pharmaceuticals in wastewater direct from sites, where high loads are expected (i.e. hospitals). For this purpose, laccase, an enzyme mainly found in wood decaying fungi, was immobilized on ceramic membranes for application in bioreactors. In a proof of principle experiment, the performance of immobilized laccase in removing a mixture of 38 antibiotics without and in combination with a natural mediator (syringaldehyde; SYR) was investigated. For the evaluation of the enzymatic membrane bioreactors, chemical data on the elimination of the selected target antibiotics was combined with the outcomes of two in vitro bioassays. Growth inhibition tests with an antibiotic sensitive Bacillus subtilis strain were conducted to assess the residual antibiotic activity of the effluents, and Microtox assays were performed to detect a potential formation of toxic by-products.
The treatment by laccase without SYR did not reduce the load of antibiotics significantly. In contrast, in combination with a SYR concentration of 10 µmol L-1, 26 out of 38 antibiotics were removed by >50% after 24 h treatment. Moreover, increasing the SYR concentration to 1000 µmol L-1 resulted in a further improvement of the antibiotic removal. 32 out of 38 antibiotics were removed by over 50%, whereby 17 were almost completely eliminated (>90%). However, the treatment with laccase in combination with SYR resulted in a time-dependent increase of unspecific toxicity. While SYR alone did not affect B. subtilis, the combination of laccase with SYR led to a strong time-dependent growth inhibition up to 100%. Similar to that, a time-dependent increase of unspecific toxicity in the Microtox assay was observed. In conclusion, the laccase-mediator process successfully degrades a broad spectrum of antibiotics and thus represents a promising technology to treat wastewater from sites, where high loads are expected. However, further research is required to reduce the formation of unspecific toxicity before an implementation of this technology can be considered.
Biodiversity is threatened worldwide because of ongoing habitat loss and fragmentation, overexploitation, pollution, biological invasions and a changing global climate. Due to the major importance of biological diversity for modern human living, efficient conservation and management strategies are required to protect endangered habitats and species. For this purpose, ambitious multilateral agreements on regional and global scale were declared to prevent biodiversity loss.
Efficient biomonitoring methods are required to adequately implement these biodiversity conventions. Species monitoring as a core activity in biodiversity research is an effective tool to assess the status of species and trends within habitats. Data collection can be obtained with visual, electronic or genetic surveys. Still, these monitoring programs can be expensive, laborious and inefficient for accurate species assessments. New techniques based on environmental DNA (eDNA) allows for the detection of DNA traces in environmental samples (soil, sediment, water and air samples) and open up new possibilities for species monitoring. The eDNA methodology enables detection of single species in a qualitative (presence/absence) or (semi-) quantitative way. eDNA metabarcoding approaches can be an effective community structure assessment method.
This thesis, located at the interface between experimental and applied research, illustrates the suitability of the eDNA methodology in applied biomonitoring using the example of the water-borne crayfish plague pathogen Aphanomyces astaci (Schikora 1906). The obtained results provide new insights into A. astaci sporulation dynamics in natural water courses. A. astaci sporulation is influenced by seasonal variation of water temperatures and life history traits (molting, activity, mating) of infected crayfish. The results also imply a high transmission risk of A. astaci spores during the complete year. This thesis compares two eDNA methods, which are successfully and consistently detecting A. astaci spores. Each approach is suitable for different biomonitoring tasks due to the method-specific requirements. The obtained results also reveal spatial variation in A. astaci occurance in the tested water bodies. A. astaci spore estimates are positively correlated with population density and pathogen loads of captured A. astaci- positive crayfish. eDNA results show a downstream zoospore transport of up to three kilometres distance from a distribution hot spot area of A. astaci-infected crayfish. The eDNA methodology is helpful in gaining reliable information on A. astaci occurrence in large water bodies. This information is urgently needed to initiate efficient management decisions for the conservation of European crayfish species.
eDNA-based methods such as for A. astaci detection are a useful complement for conventional monitoring and should have a strong impact on conservation policy. eDNA methodology will be helpful for the practical implementation of the main aims of key conservation agreements and thus will make important contributions to biodiversity protection.
Die vorliegende kumulative, publikationsbasierte Disserationsschrift zum Thema „Diversität und Zoogeographie metazoischer Fischparasiten aus dem Südpolarmeer“ gibt einen zusammenfassenden Überblick über die von mir verfasseten ausgewählten drei (ISI-)Publiaktionen. Diese sind im Anhang (Kapitel 6) in chronologischer Reihenfolge aufgeführt. Die Verweise zu den Publikationen sind im Text mit den römischen Ziffern I-III (s.u.) gekennzeichnet. Die für die Promotion relevanten Publikationen wurden wie folgt publiziert:
I Münster J, Kochmann J, Klimpel S, Klapper R, Kuhn T (2016) Parasite fauna of Antarctic Macrourus whitsoni (Gadiformes: Macrouridae) in comparison with closely related macrourids. Parasites & Vectors 9:403
II Münster J, Kochmann J, Grigat J, Klimpel S, Kuhn T (2017) Parasite fauna of the Antarctic dragonfish Parachaenichthys charcoti (Perciformes: Bathydraconidae) and closely related Bathydraconidae from the Antarctic Peninsula, Southern Ocean. Parasites & Vectors 10:235
III Kuhn T, Zizka VMA, Münster J, Klapper R, Mattiucci S, Kochmann J, Klimpel S (2018) Lighten up the dark: metazoan parasites as indicators for the ecology of Antarctic crocodile icefish (Channichthyidae) from the north-west Antarctic Peninsula. PeerJ 6, e4638
Diese drei Publikationen sind im Ergebnisteil (Kapitel 2) separat zusammengefasst und folgend im gemeinsamen Kontext diskutiert (Kapitel 3).
Adaptive Radiation und Zoogeographie anisakider Nematoden verschiedener Klimazonen und Ozeane
(2013)
Anisakide Nematoden sind Parasiten aquatischer Organismen und weltweit in marinen Habitaten verbreitet. Ihre Übertragungswege sind tief im marinen Nahrungsnetz verwurzelt und schließen ein breites Spektrum pelagisch/benthischer Invertebraten (z.B. Cephalopoda, Gastropoda, Crustacea, Polychaeta) und Vertebraten (z.B. Teleostei, Elasmobranchia, Cetacea, Pinnipedia, Aves) als Zwischen- bzw. Endwirte ein. Aufgrund der hohen Befallszahlen u.a. in der Muskulatur und Viszera kommerziell intensiv genutzter Fischarten (z.B. Clupea harengus, Gadus morhua, Salmo salar) sowie ihrer Rolle als Auslöser der menschlichen Anisakiasis nehmen die Vertreter der Gattung Anisakis unter den anisakiden Nematoden eine Sonderstellung ein. Anhand der verbesserten Diagnostik und der Etablierung sowie Weiterentwicklung molekularbiologischer Methoden ist es in den letzten zwei Dekaden gelungen, die bestehende Taxonomie und Systematik der Gattung Anisakis zu erweitern bzw. zu revidieren. Aktuelle molekulare Analysen weisen auf die Existenz von insgesamt neun distinkten Arten hin, welche eine hohe genetische Heterogenität und Wirtsspezifität aufweisen, äußerlich jedoch nahezu identisch sind (sog. kryptische Arten). Trotz kontinuierlicher Forschung auf dem Gebiet ist das Wissen über die Biologie von Anisakis immer noch unzureichend.
Die vorliegende Dissertation ist in kumulativer Form verfasst und umfasst drei (ISI-) Einzelpublikationen. Die Zielsetzung der durchgeführten Studien bestand unter anderem darin, unter Verwendung molekularbiologischer und computergestützter Analyseverfahren, Fragestellungen zur Zoogeographie, (Co-)Phylogenie, Artdiagnostik, Lebenszyklus-Ökologie sowie des bioindikatorischen Potentials dieser Gattung zu bearbeiten und bestehende Wissenslücken zu schließen.
Die Verbreitung von Anisakis, welche bisher ausschließlich anhand von biogeographischen Einzelnachweisen abgeschätzt wurde, konnte durch den angewandten Modellierungsansatz erstmalig interpoliert und in Kartenform vergleichend dargestellt werden. Dabei wurde gezeigt, dass die Verbreitung von Anisakis spp. in den Ozeanen und Klimazonen nicht gleichmäßig ist. Die Analysen deuten auf die Existenz spezies-spezifischer horizontaler und vertikaler Verbreitungsmuster hin, welche neben abiotischen Faktoren durch die Verbreitung und Abundanz der jeweiligen Zwischen- und Endwirte sowie deren Tiefenverteilung und Nahrungspräferenzen geprägt sind.
Durch die umfangreiche Zusammenstellung und anschließende Kategorisierung der (mit molekularen Methoden) geführten Zwischenwirtsnachweise konnten indirekte Rückschlüsse über die vertikale Verbreitung von Anisakis spp. entlang der Tiefenhabitate gezogen werden.
Während Anisakis auf Gattungsebene in der gesamten Wassersäule entlang verschiedener Tiefenhabitate abundant ist, wurde für die stenoxene Art Anisakis paggiae ein meso-/bathypelagisch orientierter Lebenszyklus postuliert. Durch den Einbezug eines breiten Spektrums (paratenischer) Zwischen- und Transportwirte aus unterschiedlichen trophischen Ebenen werden Transmissionslücken im Lebenszyklus der Gattung weitestgehend minimiert und der Transmissionserfolg auf den Endwirt, und damit die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Reproduktion, erhöht. Ausgeprägte Wirtspräferenzen sowie phylogenetische Analysen des ribosomalen ITS-Markers stützen eine Theorie zur co-evolutiven Anpassung der Parasiten an ihre Endwirte. Anisakis eignet sich daher unter Einschränkungen als Bioindikator für die vertikale und horizontale Verbreitung und Abundanz der Endwirte und lässt Rückschlüsse auf trophische Interaktionen im Nahrungsnetz zu. Durch die weitere Beprobung von Zwischenwirten aus verschiedenen trophischen Ebenen in zukünftigen Studien, kann eine genauere Bewertung potentiell abweichender Lebenszyklus-Strategien gewährleistet werden. Insbesondere ist die Datenlage zur Prävalenz und Abundanz anisakider Nematoden in Cephalopoda und Crustacea noch unzureichend. Die Probennahme sollte dabei unter besonderer Berücksichtigung bislang wenig oder unbeprobter geographischer Regionen, Tiefenhabitate und Wirtsarten durchgeführt werden.