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Cytochrome P450 epoxygenases of the 2C family (CYP2C) are highly expressed in the endothelium and metabolize arachidonic acid to different regioisomers of epoxyeicosatrienoic acids (EET). They have a number of roles in the regulation of vascular tone and homeostasis by activating different signal transduction pathways and have recently been reported to be involved in proliferation and angiogenesis. However, the exact mechanisms by which epoxygenases regulate angiogenesis are still unclear. Therefore, the initial aim of the present study was to characterize the relevance of major signalling molecules that are involved in angiogenesis and to investigate possible signalling pathways involved. Initially the effect of CYP2C9 overexpression on expression levels of EphB4, a tyrosine kinase that plays a role in a number of developmental processes, was investigated. EphB4 protein expression was increased in CYP2C9 overexpressing cells without any effects on expression levels of its ligand ephrinB2. To clarify whether EphB4 is a critical determinant of CYP2C9-induced angiogenesis, endothelial cell sprouting was assessed using a collagen gel-based in vitro angiogenesis assay. Following transfection with EphB4 antisense or scrambled oligonucleotides, capillary-like structures were clearly present after 24 hours in cells overexpressing CYP2C9, while EphB4 downregulation abolished CYP2C9-induced sprouting. In addition stimulation of human umbilical vein endothelial cells with VEGF resulted in an increase in CYP2C expression and a subsequent increase of 11,12-EET production; an effect that was abolished by the CYP epoxygenases inhibitor MSPPOH as well as when cells were infected with a dominant negative mutant of AMPK. In vivo 11,12-EET treatment increased EphB4 expression in mesenteric arteries as well as in Matrigel plugs; an effect that was abolished when plugs were impregnated at the same time with small interfering RNA (siRNA) for EphB4. Furthermore, impregnation of Matrigel plugs with VEGF resulted in endothelial cell and smooth muscle cell recruitment into a Matrigel plug and this effect was mediated by CYP2C9-derived EETs as it was prevented by 14,15-EEZE. When infiltration of EET impregnated plugs with endothelial cells and pericytes/smooth muscle cells in vivo was compared to the effects seen in VEGF treated plugs, it was apparent that only EET treatment resulted in the formation of tube like structures that were covered by smooth muscle cells. Therefore, the final aim of the study was to further define the consequences of EET signalling in vivo as well as to characterize its physiological relevance. This hypothesis could be assessed by isolectin injection through the tail-vein where isolectin was taken up only by the EET-impregnated plug. Moreover ultrasound measurements revealed accumulation of contrast agent in EET impregnated plugs compared to control plugs. Taken together our findings emphasize that CYP2C plays a crucial role in the vessel formation process by modulating the effects mediated by two important control elements of the angiogenic response, namely VEGF and EphB4. CYP2C-derived EETs not only participate as second messengers in the angiogenic response, but have the potential to influence much more than angiogenesis by enhancing smooth muscle cell/pericyte recruitment to endothelial cell tubes to promote vascular maturation.
Bei endogenen Retroviren handelt es sich um feste Bestandteile des Genoms. Im Fall von PERV (porzine endogene Retroviren) existieren zusätzlich infektiöse, xenotrope Vertreter. Aufgrund dieser Tatsache ist es notwendig, diese replikationskompetenten Proviren aus dem Genom potentieller Donortiere für die Xenotransplantation zu entfernen. Mit dem Wissen um die chromosomale Lage und der damit verbundenen Möglichkeit des Nachweises per PCR wurde im Rahmen dieser Arbeit gezeigt, dass aufgrund einer polymorphen Verteilung ein Ausschluss dieser funktionellen Proviren, mittels konventioneller Züchtung, möglich ist. Allerdings stellen sowohl die deletierten und mutierten proviralen Sequenzen durch eine Rekombination oder eine Komplementation, als auch ekotrope PERV-C ein Restrisiko im Falle einer Xenotransplantation dar. Es ist eine PERV-A/C Rekombinante beschrieben ex vivo worden, welche eine höhere Infektiösität aufweist als alle bisher untersuchten PERV. Bis auf die Rezeptor-Bindedomäne stellt dieses Virus ein PERV-C dar. Deshalb sollten chromosomal PERV-C identifiziert werden, um bei polymorpher Verteilung im Schweinegenom durch entsprechende Züchtung diese aus dem Genom heraushalten zu können. Im Rahmen dieser Arbeit ist es mit Hilfe einer speziellen PCR gelungen sieben Integrationsorte von PERV-C zu identifizieren. Da das Genom des Schweins bisher noch nicht komplett sequenziert ist, war es noch nicht möglich die gefundenen chromosomalen Bereiche zu kartieren. Dies wäre wiederum die Basis für eine Durchmusterung von Schweinen auf die Anwesenheit der gefundenen Proviren. Des Weiteren ist noch nicht bekannt, ob es sich bei diesen PERV-C um vollständige Proviren handelt, da aufgrund der verwendeten PCR und der sehr hohen Homologie verschiedener PERV untereinander nur provirale 3'Enden mit entsprechenden Flanken identifiziert werden konnten. Zusätzlich wurden in den Proben transgener Schweine PERV-C env spezifische Anteile nachgewiesen. Die Verteilung dieser Sequenzen, welche ebenfalls polymorph ist, gibt zwar keinen Aufschluss über die Anwesenheit eines Volllängen Provirus, jedoch ist aufgrund dieser Verteilung gleichfalls ein Ausschluss dieses Virus durch herkömmliche Züchtung möglich. Auf der anderen Seite besteht ein weiteres Risiko nach einer Xenotransplantation, wenn ein infektiöses PERV durch Komplementation gebildet wird, welches als Erbinformation ein env-deletiertes Provirus trägt. Das komplementierte PERV könnte potentiell, nach erfolgter Xenotransplantation, menschliche Zellen infizieren. Daraufhin wäre es zwar nicht mehr in der Lage infektiöse Partikel zu bilden, jedoch besteht noch das Risiko einer Retrotransposition, welche an sich schon mutagen wirkt. Zusätzlich könnten durch diesen Vorgang Gene zerstört oder Onkogene angeschaltet werden. Um dieses Risiko abschätzen zu können, wurden im Rahmen dieser Arbeit modifizierte Proviren von PERV-B(33) und MoMLV (Positivkontrolle) hergestellt und in einem Retrotranspositions Assay getestet. Die Modifikation der Proviren beinhaltete die Deletion des für die Retrotransposition nicht notwendigen env-Leserahmens, im Austausch gegen eine inserierte Indikatorkassette für die Retrotransposition (neoint). Im Rahmen der in dieser Arbeit durchgeführten Experimente konnte im Fall des Molekularklons PERV-B(33) eine Frequenz der Retrotransposition von maximal 1,2*10-6 pro Zelle und Generation ermittelt werden. Demzufolge stellt eine Retrotransposition von env-deletierten proviralen porzinen Sequenzen nach erfolgter Xenotransplantation ein minimales Risiko dar.
Breaking tolerance to the natural human liver autoantigen cytochrome P450 2D6 by virus infection
(2009)
Autoimmune hepatitis (AIH) is a chronic liver disease of unknown etiology, characterized by a loss of tolerance against hepatocytes leading to the progressive destruction of hepatic parenchyma and cirrhosis. Clinical signs for AIH are interface hepatitis and portal plasma cell infiltration, hypergammaglobulinemia, and autoantibodies. Based on serological markers AIH is defined in subtypes. The hallmark of AIH type 2 are type 1 liver/kidney microsomal autoantibodies (LKM-1), whereas AIH type 1 is characterized by the presence of anti-nuclear (ANA) and/or anti-smooth muscular (SMA) autoantibodies. The major autoantigen recognized specifically by LKM-1 autoantibodies was identified as the 2D6 isoform of the cytochrome P450 enzyme family (CYP2D6). Not much is known about the etiology and pathogenic mechanisms of AIH so far and most animal models available result in only transient hepatic liver damage after a rather complex initiation method. It was the aim of my project to generate a novel animal model for AIH that reflects the chronic and progressive destruction of the liver characteristic for the human disease while using a defined and feasible initiating event to further analyze the pathogenic mechanisms leading to the autoimmune-mediated destruction of the liver. Therefore, mice transgenically expressing the human CYP2D6 in the liver and wild-type mice were infected with a liver-tropic adenovirus expressing the human CYP2D6 (Ad-2D6). Selftolerance to CYP2D6 was broken in Ad-2D6-infected mice, resulting in persistent autoimmune liver damage, apparent by cellular infiltration, hepatic fibrosis and necrosis. Similar to type 2 AIH patients, Ad-2D6-infected mice generated LKM-1-like antibodies recognizing the same immunodominant epitope of CYP2D6. Taken together, we could introduce a new animal model that reflects the persistent autoimmune-mediated liver damage as well as the serological marker characteristic for AIH type 2 and we could demonstrate that chronic autoimmune diseases targeting the liver can be triggered by molecular mimicry occurring in the context of a hepatotropic viral infection.
Die Maillard-Reaktion findet während der Lagerung und thermischen Verarbeitung von Lebensmitteln zwischen den darin enthaltenen Proteinen und reduzierenden Kohlehydraten statt. Als Ergebnis der Reaktion entstehen sogenannte advanced glycation end products (AGEs), Protein-Derivate mit Glykierungs-Strukturen. Da Lebensmittel vor dem Verzehr häufig erhitzt werden, ist der Einfluss von AGEs auf die Pathogenese von Nahrungsmittelallergien von großem Interesse. Die Maillard-Reaktion könnte zur Bildung von neuen, für die Pathogenese der Nahrungsmittelallergie relevanten, Immunepitopen beitragen. Das Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss der Maillard-Reaktion auf die T-Zell-Immunogenität, die Antigenität und die von beiden Eigenschaften abhängige Allergenität von Nahrungsmittelallergenen zu untersuchen. Zunächst wurde der Einfluss der Maillard-Reaktion auf die T-Zell-Immunogenität von Ovalbumin (OVA), einem Allergen des Hühnereiweißes, untersucht. Dafür wurde glykiertes OVA (AGE-OVA) hergestellt indem das Protein zusammen mit Glukose erhitzt wurde. In dieser Arbeit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass ein AGE-Derivat eines Lebensmittelallergens eine höhere T-Zellen-Immunogenität besitzt, als sein natives Gegenstück. Die Aktivierung und Proliferation von CD4+ T-Zellen durch AGE-OVA wurde in vitro durch Co-Kultivierung der T-Zellen mit dendritischen Zellen (DZ) untersucht. DZ sind professionelle Antigen- präsentierende Zellen, welche im Pathomechanismus der Allergie eine wichtige Rolle spielen. Im Vergleich zu nativen OVA und OVA welches ohne Glukose erhitzt wurde, führte die Stimulierung mit AGE-OVA zu einer deutlich erhöhten Aktivierung von OVA-spezifischen CD4+ T-Zellen. Damit DZ T-Zellen aktivieren können, muss das Allergen zunächst durch die DZ aufgenommen werden. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass die Aufnahme von AGE-OVA wesentlich höher war als die der Kontrollen. Außerdem konnte der scavenger receptor class A type I and II (SR-AI/II) als einer der hauptverantwortlichen Rezeptoren für die Aufnahme von AGE-OVA identifiziert werden. Zusammenfassend lässt sich aus den Ergebnissen dieser Arbeit die Hypothese aufstellen, dass die Glykierung von OVA eine erhöhte Assoziation des Allergens mit SR-AI/II ermöglicht, welche zu einer verstärkten Aufnahme des Allergens durch die DZ führt. Dadurch können mehr Peptide des Allergens an MHC II gebunden und auf der Zelloberfläche präsentiert werden. Das wiederum führt zur beobachteten stärkeren OVA-spezifischen CD4+ T-Zell-Aktivierung durch AGE-OVA. Als nächstes wurde die T-Zell-Immunogenität und Antigenität von AGE-OVA in vivo in einem Mausmodel untersucht. Es zeigte sich, dass AGE-OVA auch in vivo im Vergleich zu den nicht glykierten OVA-Formen eine erhöhte T-Zell-Immunogenität besitzt. Des weiteren führte die Immunisierung mit AGE-OVA zu einer erhöhten Produktion von IgE-Antikörpern. Somit wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass AGE-OVA in vivo nicht nur eine erhöhte CD4+ T-Zell-Immunogenität besitzt, sondern auch eine höhere Antigenität hat als natives und ohne Glukose erhitztes OVA. Diese Ergebnisse harmonieren gut miteinander da CD4+ T-Zellen eine zentrale Rolle in der Aktivierung von B-Zellen und der IgE-Produktion durch selbige Zellen spielen. IgE-Antikörper besitzen eine essentielle Funktion beim Auslösen der klinischen Symptomatik der Allergie. Zusammenfassend lässt deshalb sagen, dass die Maillard-Reaktion die Allergenität von OVA erhöhen könnte. Zum Schluss wurden noch die immunstimulatorischen Eigenschaften des Erdnussallergens (AGE)-Ara h 2 untersucht. Da Erdnüsse häufig ernsthafte allergische Reaktionen hervorrufen und selten roh verzehrt werden, war es vom großen Interesse den Einfluss der Maillard-Reaktion auf Immunogenität und Antigenität von rekombinanten Ara h 2 (rAra h 2) zu untersuchen. Es zeigte sich, dass die Glykierung von rAra h 2 durch die Maillard-Reaktion die T-Zellen-Immunogenität, als auch die Antigenität des Allergens reduziert. Abschließend lässt sich sagen, dass die Maillard-Reaktion die allergenen Eigenschaften von Lebensmittelallergenen erheblich beeinflusst indem es die T-Zell-Immunogenität des Allergens verändert. Die Mechanismen welche die T-Zell-Immunogenität beeinflussen wurden hier näher untersucht. Wenn die Glykierung nicht die Bindung der T-Zellen- und/oder B-Zellen-Rezeptoren inhibiert, wird die Allergen-spezifische CD4+ T-Zell-Aktivierung und die davon abhängige IgE-Produktion dadurch erhöht, dass das glykierte Allergen durch DZ verstärkt über SR-AI/II aufgenommen wird. Die vorliegende Arbeit liefert wertvolle Information über die Allergenität von Proteinen die durch die Maillard-Reaktion modifiziert wurden and trägt dazu bei die Mechanismen von Nahrungsmittelallergien besser zu verstehen.
Mit einer Prävalenz von rund 5% bildet das Hereditäre Nonpolypöse Kolorektalkarzinom (HNPCC), auch Lynch Syndrom genannt, die häufigste genetische Disposition unter allen Kolorektalkarzinomen in Deutschland. Das Lynch Syndrom wird autosomal-dominant vererbt und tritt im Schnitt bereits ab dem 44. Lebensalter auf, während die Mehrheit der Kolorektalkarzinome erst mit 63 Jahren diagnostiziert wird. Ein wichtiges Merkmal sind sogenannte HNPCC-assoziierte Malignome, welche sich außerhalb des Dickdarms befinden. Die Diagnose gestaltet sich allerdings relativ schwierig, da bei Lynch Syndrom-Patienten kein eindeutiger klinisch auffälliger Phänotyp vorliegt und die Diagnosestellung nur in Zusammenhang mit einer Familienanamnese des Patienten möglich ist.
Mittlerweile ist bekannt, dass für das charakteristische Auftreten von hochgradigen Mikrosatelliteninstabilitäten im Tumorgewebe ein defektes DNA-Mismatch-Reparatursystem verantwortlich ist. Diese Defekte treten vor allem in den Genen MLH1, MSH2, MSH6 oder PMS2 auf und können über die Keimbahn vererbt werden.
Das Fusionsprotein MLH1•ITGA9 wurde im Jahr 2009 publiziert, nachdem es bei einer Familie aus Französisch-Guyana gehäuft identifiziert wurde. Mehrere Familienmitglieder waren an unterschiedlichen Krebsarten erkrankt, und die Tatsache, dass neben Dickdarmtumoren auch synchrones und metachrones extrakolonisches Tumorwachstum auftrat, ließen den Schluss einer positiven Familienanamnese für das Lynch Syndrom zu. Auffällig war jedoch, dass das Spektrum dieser extrakolonischen Tumoren nicht im Einklang mit den typischen HNPCC-assoziierten Malignomen stand. Daher lag die Vermutung nahe, dass das Fusionsprotein MLH1•ITGA9 für diesen Phänotyp verantwortlich ist.
Das dem zugrundeliegende Fusionsgen MLH1•ITGA9 ist das Resultat einer interstitiellen Deletion auf Chromosom 3p21.3. Es kodiert für den N-Terminus des Mismatch-Reparaturgens MLH1 sowie den C-Terminus des rund 400 kb downstream gelegenen Integrin α9. Aufgrund der fehlenden nukleären Lokalisationssequenz und weiterer wichtiger im C-Terminus gelegenen Domänen des MLH1-Proteins ist davon auszugehen, dass es außer Stande ist, Basenfehlpaarungen zu reparieren; ebenso sollte das Fusionsprotein theoretisch keine Funktionen des Wildtyp Integrin α9 mehr ausüben können.
Diese Annahmen konnten durch diverse Versuche wie Zelladhäsions- und Zellmigrationsassays bestätigt werden; das Fusionsprotein hatte dabei keinerlei Einfluß auf das Adhäsions- oder Migrationsverhalten unterschiedlicher Zelllinien.
Bezüglich der Lokalisation von MLH1•ITGA9 wurde über Fluoreszenzmikroskopie aufgrund der fehlenden nuklären Lokalisationssequenz im MLH1-Proteinteil der Nachweis erbracht, dass sowohl das Fusionsprotein als auch seine Variante MLH1∆ (bestehend aus dem MLH1-Teil) lediglich im Zytoplasma, und nicht wie der Wildtyp auch im Zellkern, zu finden ist.
Desweiteren zeigten Co-Immunopräzipitationsexperimente eine Interaktion zwischen dem Fusionsprotein und MLH1∆ mit dem Tumorsuppressor BRCA1. Die Folgen dieser Interaktion wurden auf translationeller und Proteinebene mit dem Ergebnis untersucht, dass Zellen, welche das Fusionsprotein oder seine trunkierte Variante MLH1∆ exprimieren, nach Etoposidstimulierung teilweise in gravierendem Ausmaß einen negativen Einfluss auf die p53-abhängige DNA-Reparaturmaschinerie aufweisen. Dies zeigte sich besonders deutlich auf transkriptioneller Ebene in einer bis zu 96%igen Herunterregulierung wichtiger Zellzyklus- sowie proapoptotischer Gene. Die durchflusszytometrische Analyse dieser Zellen zeigte außerdem eine höhere Apoptoseresistenz nach Etoposidstimulierung im Vergleich zu Wildtyp-MLH1 exprimierenden Zellen.
Taspase1 ist eine Threonin-Aspartase, die das MLL-Protein an zwei konservierten Erkennungssequenzen (CS1 und CS2) hydrolysiert. Die daraus entstehenden Spaltprodukte, p320N und p180C bilden ein stabiles Heterodimer und fügen sich mit zahlreichen Proteinen zu einem Multiproteinkomplex zusammen, der die epigenetischen Prozesse während der Embryogenese, Zellzyklus und Stammzell-Wachstum steuert. Der MLL-Komplex weist eine spezifische Histon-Methyltransferase-Aktivität für Lysin-4 des Histon 3 Proteins auf (H3K4me3). Diese spezifische Aktivität hält ein Muster der aktiven Gene während der Entwicklung und Zelldifferenzierung aufrecht. Das AF4-MLL Fusionsprotein, welches durch die chromosomale Translokation t(4;11) gebildet wird, ist ebenfalls ein Substrat von Taspase1. Die Hydrolyse dieses Fusionsproteins führt ebenfalls zu Spaltprodukten, die zunächst miteinander ein Heterodimer bilden, um anschliessend einen onkogenen Multiproteinkomplex auszubilden. Dieser Komplex scheint hämatopoietische Stammzellen zu "reprogrammieren" und den Ausbruch einer lymphoblastischen Leukämie auszulösen.
Die Aktivität der Taspase1 selbst wird durch Eigen-Proteolyse reguliert. Es wird zunächst als Proenzym (p50) hergestellt, das anschliessend durch Autoproteolyse in die enzymatisch aktive Form konvertiert wird. Taspase1 ist ein enzymatisch strikt kontrolliertes Enzym mit geringer Substratanzahl. Neben MLL gibt es nur wenige, bekannte Substrate; allerdings scheint Taspase1 in den Zellen solider Tumoren überexprimiert zu sein. Daraus kann postuliert werden, dass Taspase1/MLL-Aktivität für diese Tumorarten von bedeutung ist. Taspase1 ist die einzige bislang bekannte Protease in Säugerzellen, die dazu befähigt ist, das Leukämie-spezifische AF4-MLL proteolytisch zu spalten und damit seine onkogenen Eigenschaften zu aktivieren. Eine spezifische Inhibierung der Taspase1 könnte deshalb eine mögliche Methode zur Therapie von t(4;11)-Leukämie darstellen. Aus diesem Grund war Taspase1 als ein potentielles Wirkstoffziel interessant und wurde im Rahmen dieser Arbeit genauer untersucht.
Um die Funktionsweise von Taspase1 zu untersuchen, wurde die 2005 veröffentlichte Kristallstruktur der Taspase1 als Grundlage für alle weiteren Arbeiten verwendet. Da die Struktur allerdings nur unvollständig aufgelöst war, wurden die unaufgelösten Bereiche mittels bioinformatischer Tools in Kooperation mit Tim Geppert (Arbeitskreis von Prof. Dr. Gisbert Schneider) modelliert. Die Modellierung führte zu einem detaillierteren Modell des Taspase1-Proenzyms, also dem Zustand vor der autokatalytischen Aktivierung.
Taspase1 weist interessanterweise nur Homologien zu L-Asparaginasen-2 (Familie der Hydrolasen), darunter Glycosylasparaginase, auf. Glycosylasparaginase durchläuft ebenfalls einen Autokatalyse-Prozess, allerdings nach einem N-O-Acyl-shift-Mechanismus. Daher wurde Taspase1 zunächst anhand geeigneter Experimente daraufhin überprüft, ob hier ebenso ein solcher Mechanismus für die Autokatalyse in Betracht kommt. Allerdings widerlegten die durchgeführten Experimente diese Vermutung.
Um die molekulare Funktionsweise der Taspase1 zu eruieren, wurde nun das modellierte Taspase1-Proenzym verwendet. Dies erlaubte die Identifizierung von kritischen Aminosäuren. Durch Mutationsanalysen konnte so die Funktion von Taspase1 aufgeklärt werden. So wurde ein intrinsischer Serin-Protease-Mechanismus für den Prozess der Autokatalyse entdeckt. Dabei spielt Serin-291 - unmittelbar in der Nähe des katalytischen Zentrums - eine wesentliche Rolle.
Anhand weiterer Mutationsanalysen konnte dann schrittweise der Aktivierungsmechanismus von Taspase1 aufgeklärt werden. Dabei scheint die Homodimerisierung zweier Taspase1- Proenzyme der wesentliche Schlüssel für die vollständige Aktivierung der Taspase1 zu sein. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Aminosäuren Tryptophan-173, Arginin-262, und Glutaminsäure-295 als kritische Aminosäuren identifiziert.
Weiterhin konnte anhand der funktionellen Analyse aller Mutanten zuletzt eine trans-dominant-negative Taspase1-Variante (C163E-S291A; tdn-TASP1) hergestellt werden. Das proenzymatische Monomer dieser Mutante ist dabei befähigt, mit einem Wildtyp-Taspase1-Monomer zu heterodimerisieren und seine Aktivität vollständig zu inhibieren. Die Funktion dieser trans-dominant-negativen Mutante validierte den in dieser Arbeit postulierten Aktivierungsmechanismus der Taspase1, der nun zukünftig für ein rationales Wirkstoff-Design verwendet werden kann.
The humanized non-depleting anti-CD4 monoclonal antibody Tregalizumab (BT-061) is able to selectively activate the suppressive function of regulatory T cells and has been investigated up to phase 2b in clinical trials in patients suffering from rheumatoid arthritis (RA).
A pharmacokinetic-pharmacodynamic model, which is based on clinical data from RA and healthy subjects, used the cell surface CD4-down-modulation as marker of the antibodies' activity. This model surprisingly revealed a stronger effect of Tregalizumab in healthy subjects compared to RA patients. This thesis presents a series of experiments performed to understand this phenomenon.
To counteract oxidative stress, which is strongly associated with RA pathophysiology, the organism employs the small oxidoreductase thioredoxin-1 (Trx1). Therefore, augmented expression and secretion of Trx1 was seen in many studies the synovial fluid and plasma of RA patients. Moreover, the binding site of Tregalizumab is in close proximity to a disulfide bond in domain 2 (D2) of CD4, which is a known target for a reduction by Trx1. So, this thesis also evaluated the influence of Trx1 on binding of Tregalizumab to its target CD4.
With the experiments reported herein, it was possible to demonstrate that specific reduction of the D2 disulfide bond of CD4 by Trx1 led to diminished binding of Tregalizumab to recombinant human soluble CD4 (rh sCD4) and membrane-bound CD4 on T cells from a human leukemia cell line and peripheral blood mononuclear cells (PBMC). Moreover, the experiments revealed that this caused changes in the Tregalizumab-induced CD4 signalling pathway via the lymphocyte-specific protein tyrosine kinase p56Lck.
In summary, this thesis provides evidence that high Trx1 levels in RA patients compared to healthy subjects are a potential valid reason for diminished binding of Tregalizumab to CD4-positive T cells and offers an explanation for the observed decreased CD4 down-modulation in RA patients in comparison with healthy subjects. It emphasizes that binding of Tregalizumab is impaired in a particular way in RA patients.
Die N- und O-Glykosylierung von Proteinen ist gekennzeichnet durch eine hohe strukturelle und funktionelle Komplexität. Da verschiedene Glykanstrukturen und Glykosylierungsstellen selbst innerhalb eines Proteins unterschiedliche Aufgaben erfüllen können, ist sowohl für die Grundlagenforschung als auch für die Pharma-Industrie eine stellenspezifische Analytik zur Aufklärung der biologischen Bedeutung und bei therapeutischen Proteinen zur Gewährleistung von Sicherheit und gleichbleibenden pharmakologischen Eigenschaften essentiell. Die niedrige Abundanz sowie die hohe Komplexität durch die variablen Glykanzusammensetzungen und Verzweigungsmöglichkeiten sowie der daraus resultierende Mikroheterogenität an jeder einzelnen Stelle stellt jedoch eine besondere Herausforderung an die Analytik dar. In dieser Arbeit wurden deshalb auf verschiedenen Ebenen der Probenvorbereitung, der chromatographischen Separation sowie der MS-Analyse- Methoden und Techniken entwickelt und charakterisiert, um die stellenspezifische Analytik der Proteinglykosylierung zu vereinfachen.
In einem ersten Schritt wurde die hohe Komplexität eines Glykoproteinverdaus reduziert. Es wurden verschiedene Methoden zur Glykopeptidanreicherung miteinander verglichen, wobei sich die HILIC-Festphasenextraktion unter optimierten Bedingungen durch eine sehr hohe Selektivität und Effizienz auszeichnete. Zur Methodenoptimierung wurden verschiedene HILIC-Materialien (Silika, Amino, Mikrokristalline Cellulose, TSKgel Amide-80 und ZIC®-HILIC) eingesetzt und durch eine Variation der Anreicherungsbedingungen die Hauptretentionsmechanismen für jedes Material beschrieben. TSKgel Amide-80 sowie ZIC®-HILIC sind am besten geeignet, da unter optimierten Bedingungen sekundäre Retentionsmechanismen wie elektrostatische Wechselwirkungen deutlich reduziert werden und die hydrophile Verteilung den Hauptretentionsmechanismus darstellt. Des Weiteren wurde gezeigt, dass Parameter wie die Pufferzusammensetzung, Inkubationszeiten und die Volumenverhältnisse zwischen HILIC-Suspension, Binde-, Wasch- und Elutionspuffer entscheidend die Reproduzierbarkeit, Ausbeute und Selektivität beeinflussen. Unter Berücksichtigung dieser Beobachtungen wurde ein Protokoll entwickelt, mit welchem Glykopeptide selektiv und quantitativ, d.h. ohne Präferenz für bestimmte Glykanstrukturen, aus komplexen Proben angereichert werden können. In Kombination mit Titandioxid zur selektiven Anreicherung sialylierter Glykopeptide bei bestimmten Fragestellungen ermöglichten in dieser Arbeit beide Methoden eine detaillierte Charakterisierung sowohl von N- als auch von O-Glykopeptiden. Die Hydrazinchemie erwies sich aufgrund eines zu komplexen Arbeitsschemas und einer unzureichenden Wiederfindung als nicht geeignet.
Da je nach Aminosäuresequenz oft mit einer einzigen Protease (z.B. Trypsin) nicht alle Glykosylierungsstellen aufgrund ihrer Eigenschaften (z.B. Größe, Hydrophobizität) für die Anreicherung und LC-MS-Analyse zugänglich sind, kamen in dieser Arbeit weitere Proteasen zum Einsatz. Durch eine sequentielle Kombination von Trypsin mit Endoproteinase Glu-C bzw. Trypsin mit Chymotrypsin konnten in allen Proteinen sämtliche N-Glykosylierungsstellen nach einer Anreicherung identifiziert werden. Bei der Analyse von O-Glykopeptiden verbesserte zusätzlich die N-Deglykosylierung des intakten Proteins und die Abtrennung der freien N-Glykane mittels Ultrafiltration vor der Anreicherung die Analytik. Neben den bereits für die N-Glykopeptide beschriebenen Enzymkombinationen wurde außerdem Proteinase K eingesetzt, um die O-Glykopeptide z.B. von Fetuin effizient anzureichern und mittels LC-ESI-MS2/MS3 zu charakterisieren. Dies war mit einem Trypsinverdau alleine nicht möglich.
Die Komplexität nach einer Glykopeptidanreicherung ist jedoch aufgrund unterschiedlicher Glykanstrukturen und Glykosylierungsstellen immer noch so hoch, dass bei 1-dimensionalen HPLC-Läufen Koelution von Glykopeptiden zu einer unzureichenden Detektion niedrig-abundanter Formen führen kann. Aus diesem Grund wurden die komplementäre HPLC-Phasen RP18 und ZIC®-HILIC eingesetzt, um sich chromatographisch die differenzierenden Eigenschaften von Peptidgerüst und Glykanrest zunutze zu machen. ZIC®-HILIC ermöglicht die Auftrennung überwiegend nach der Glykanstruktur und RP18e nach Peptidsequenz und Anzahl an Sialinsäuren. Durch die Kombination beider Phasen in 1- und 2-dimensionalen HPLC-Konfigurationen konnten deutlich mehr unterschiedliche Glykoformen nachgewiesen und die Detektion niedrig-abundanter Glykopeptide ermöglicht werden, die bei der Verwendung von nur einer stationären Phase nicht identifiziert werden konnten.
Zusammen mit einer komplementären MS-Analytik, die sowohl ESI als auch MALDI sowie unterschiedliche Fragmentierungstechniken wie CID, ETD, PSD oder CID-MS2/MS3 umfasste, konnten N- und O-Glykopeptide stellenspezifisch und vollständig sowohl mit ihrem Peptid- als auch mit ihrem Glykananteil charakterisiert werden.
Für bestimmte quantitative Fragestellungen wurden außerdem die beschriebenen Anreicherungsmethoden mit dem zur Quantifizierung eingesetzten N-Glycan Mapping kombiniert und ein Arbeitschema entwickelt, mit welchem bei einem mehrfach glykosylierten Protein die Verhältnisse der unterschiedlichen Glykanstrukturen an den einzelnen Glykosylierungsstellen getrennt voneinander quantifiziert werden können.
Mit jeder einzelnen, in dieser Arbeit beschriebenen Methode wird ein beträchtlicher Informationsgewinn erzielt, doch erst durch die Kombination einer effizienten Probenvorbereitung, einer komplementären HPLC-Separation, verschiedener MS/MS-Techniken und Methoden zur Quantifizierung kann die Glykosylierung eines komplexen Proteins stellenspezifisch und detailliert beschrieben werden.
Biopharmazeutika sind heutzutage ein wichtiger Bestandteil des Arzneimittelmarktes. Ihr komplexer Aufbau und ihre Mikroheterogenität erfordern eine genaue strukturelle Charakterisierung auf verschiedenen Ebenen der Moleküle, wobei die Anwendung neuer Methoden von den entsprechenden Richtlinien durchaus erwünscht ist. Die Massenspektrometrie als Analysemethode hat sich in diesem Gebiet bereits fest etabliert. Verschiedenste massenspektrometrische Untersuchungen können an den intakten Biopharmazeutika sowie an größeren und kleineren Bruchstücken derselben durchgeführt werden. Trotzdem wird meist auf wenige, lange etablierte Protokolle zurückgegriffen, die häufig mit langwieriger Probenvorbereitung verbunden sind. Bei der Analyse der Glykosylierung wird immer noch die chromatographische Trennung mit anschließender Detektion durch UV- oder Fluoreszenzmessung bevorzugt.
In dieser Arbeit sollten die Möglichkeiten der Massenspektrometrie bei der Analyse von Biopharmazeutika genauer untersucht werden. Dazu gehört auch, den hohen Informationsgehalt der üblichen chromatographischen Auftrennung von Peptiden aus einem proteolytischen Verdau vollständig zu nutzen. Es wurde gezeigt, dass die manuelle Auswertung der Analyse zusätzliche Ergebnisse bringt, und dass gleichzeitig eine Analyse von posttranslationalen und prozessbedingten Modifikationen möglich ist. Zudem wurde der Verdau mit der Protease Trypsin auf das jeweilige Biopharmazeutikum und auf das Ziel der Analyse optimiert. Da mit Trypsin eine vollständige Sequenzabdeckung nicht erreichbar war, wurden zusätzlich verschiedene weniger spezifische Proteasen angewendet. Alle untersuchten weniger spezifischen Proteasen (Elastase, Chymotrypsin und Thermolysin) waren für eine solche Analyse gut geeignet. Die Komplementarität von MALDI- und ESI-MS-Analysen konnte durch ihre Kombination optimal ausgeschöpft werden. Zudem wurden weitere Methoden zur Erhöhung der Sequenzabdeckung wie die Derivatisierung der Peptide mit TMTzero vorgestellt.
Für die Analyse intakter Biopharmazeutika wurden neben der Größenausschlusschromatograph und gelelektrophoretischen Trennungen sowohl MALDI- als auch ESI-MS-Analysen verwendet. Die Trennung großer Proteinmoleküle in kleinere Untereinheiten erleichterte dabei die massenspektrometrische Analyse maßgeblich. Die Fragmentierung der Biopharmazeutika mittels MALDI-ISD war für die Bestimmung der Protein-N- und C-Termini sehr gut geeignet.
Die Analyse der Glykosylierung wurde an den freien N-Glykanen aus einem PNGaseF-Verdau sowie an Glykopeptiden aus einem Verdau mit Pronase durchgeführt. Die freien N-Glykane konnten zudem für die MALDI-MS-Analyse mit der MALDI-Matrix 3-Aminochinolin direkt auf dem Probenteller derivatisiert werden. Die Derivatisierung und Vermessung der N-Glykane wurde zunächst an verschiedenen Standardoligosacchariden, Humanmilcholigosacchariden und N-Glykanen aus Standardglykoproteinen optimiert. Durch die Fragmentierung der N-Glykane konnten diese sequenziert und isomere Strukturen unterschieden werden.
Bei einem Pronaseverdau wurden Proteine so weit verdaut, dass nur noch einzelne Aminosäuren bzw. Di- oder Tripeptide übrig blieben. Lediglich die Glykosylierungsstellen waren durch die voluminösen Glykanstrukturen vor dem Verdau geschützt und behielten eine kurze Peptidsequenz, die für eine Identifizierung der Glykosylierungsstelle ausreichend war. So konnten die N- und O-Glykopeptide direkt ohne Aufreinigung mittels MALDI-MS aus den Verdauansätzen analysiert werden, ohne dass nicht glykosylierte Peptide störten. Das Verdauprotokoll wurde zunächst an mehreren Standard-N- und -O-Glykoproteinen optimiert und anschließend auf die untersuchten Biopharmazeutika angewendet. N- und O-Glykopeptide konnten sogar nebeneinander analysiert werden. Die hohe Massengenauigkeit des verwendeten MALDI LTQ-Orbitrap Massenspektrometers ließ eine eindeutige Identifizierung der Glykopeptide mit Hilfe eines dafür entwickelten Programms zu. Weiterhin konnte die Identifizierung durch die Fragmentierung der Glykopeptide unterstützt werden.
Somit konnten in dieser Arbeit verschiedene massenspektrometrische Analysen von Biopharmazeutika neu entwickelt, optimiert oder vereinfacht werden. Dabei wurden für jede Strukturebene (intaktes Molekül, größere und kleinere Fragmente) sowohl Ansätze mit MALDI-MS als auch mit ESI-MS verfolgt. Einige Methoden, die in der Proteomforschung bereits Anwendung fanden, konnten erfolgreich auf Biopharmazeutika übertragen werden. Die Arbeit zeigt, dass die Massenspektrometrie ein großes Potential in der Analyse der Biopharmazeutika besitzt, das aber bisher noch nicht vollständig ausgeschöpft wird. Durch die Wahl der richtigen Methoden und der geeigneten Instrumentierung wird eine vollständige strukturelle Charakterisierung ermöglicht.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Charakterisierung des Proteoglykans Biglycan und seiner Funktion als Signalmolekül in inflammatorischen und autoimmunen Prozessen. Die biologische Bedeutung der in vitro gewonnenen Ergebnisse in primären Makrophagen und dendritischen Zellen wurde durch in vivo Modelle der Pathogenvermittelten-und nicht-Pathogen-vermittelten Inflammation und der Autoimmun-Erkrankung Lupus Nephritis bestätigt. In primären Makrophagen und dendritischen Zellen induziert Biglycan die Produktion proinflammatorischer Zytokine und Chemokine durch Interaktion mit Toll-like Rezeptor (TLR) 2 und 4. Mit nucleotide-binding oligomerization like Rezeptorprotein3 (NLRP3)-,apoptosisassociated speck-like protein containing a CARD (ASC)- , Caspase-1- und TLR2/4- defizienten Mäusen und verschiedenen pharmakologischen Inhibitoren war es möglich in primären murinen peritonealen und Knochenmark-Makrophagen nachzuweisen, dass Biglycan die Caspase-1 NLRP3/ASC-abhängig aktivierte und damit die Prozessierung der Proform und Sekretion von reifem IL-1β induzierte. Durch Bindung an TLR2/TLR4 aktivierte Biglycan die NFκB, Erk und p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) Signalwege und stimulierte die Expression von Interleukin-1 beta (IL-1β). Biglycan aktivierte zudem den P2X7 Rezeptor (P2X7R) in Makrophagen und ist somit in der Lage auch ohne zusätzliche Ko-Stimulation, beispielsweise durch ATP, das NLRP3 Inflammasom zu stimulieren und die Prozessierung von aktivem IL-1β anzuregen. In einem Pathogenvermittelten (Lipopolysaccharid (LPS)-induzierte Sepsis) wie auch –nicht-athogenvermittelten (unilaterale Uretherobstruktion, UUO) Mausmodell der Inflammation wurde die biologische Relevanz dieser Prozesses gezeigt. Die Defizienz von Biglycan ging in diesen Modellen mit verminderter Aktivierung des NLRP3/Caspase-1 Inflammasomes, geringeren Spiegeln von reifem IL-1β und geringerer Organschädigung einher. Nachdem aufgezeigt werden konnte, dass die Biglycan-Konzentrationen in Nierenbiopsien und im Plasma von Patienten mit Lupus Nephritis stark erhöht waren, wurde seine Relevanz in Immunitätsreaktionen einschließlich autoinflammatorischen Prozessen genauer untersucht. Die Effekte von Biglycan in verschiedenen Stadien der Erkrankung wurden mit der MRL-Faslpr (kurz MRL/lpr) Maus, einem etablierten Modell der Lupus Nephritis (LN) und einem dafür generierten Modell der Defizienz (Bgn-/- MRL/lpr) und Überexpression von Biglycan (hBGN MRL/lpr) analysiert. In den verschiedenen Stadien der LN nahm die Konzentration von zirkulierendem und renalem Biglycan in MRL/lpr Mäusen zu und korrelierte gleichermaßen mit dem Fortschreiten der Erkrankung. Die Defizienz von Biglycan verminderte hingegen stark die renale Infiltration von Entzündungszellen, insbesondere B1-Zellen, außerdem die Zytokin-, Chemokin- und Immunglobulin-Konzentrationen und minderte die Progredienz der Niereninsuffizienz verglichen mit Lupus Mäusen gleichen Alters. In der Initialphase der Lupus Nephritis induzierte Biglycan in Mäusen, transient transgen für humanes Biglycan (hBGN MRL/lpr), vermehrte renale Zellinfiltration und Albuminurie als Zeichen nephrotischer Dysfunktion. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Produktion des stark proinflammatorischen Zytokines IL-1β in jungen Lupus Nephritis Mäusen NLRP3/Caspase-1-abhängig ist und durch Biglycan verstärkt wurde. Die Mechanismen, durch die endogenes Biglycan die Leukozyteninfiltration in Lupus Mäusen induzierte und somit inflammatorische und autoimmune Vorgänge potenzierte, wurden insbesondere an B-Zellen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass Biglycan die renale Migration von einem besonderen B-Zell Subtyp, B1-Zellen, verantwortlich für die T-Zellenunabhängige Autoimmunglobulinproduktion beim LN, unterhielt. Dabei vermittelte Biglycan die Rekrutierung von B1-Zellen in die Niere durch Regulation der Expression und Synthese der B-Zell C-X-C Chemokin Ligand 13 (CXCL13) in der Niere und in residenten peritonealen Makrophagen. In vitro konnte zudem der Mechanismus aufgeklärt werden, über den Biglycan CXCL13 reguliert. In primären Makrophagen und dendritischen Zellen induziert Biglycan die Expression und Sekretion von CXCL13 über TLR2 und TLR4. Die Daten zeigen auf, dass Biglycan als endogenes Gefahrensignal starke proinflammatorische Reaktionen hervorruft. Über Rezeptoren des angeborenen Immunsystems, TLR2 und TLR4, aktiviert Biglycan des weiteren Zellen des adaptiven Immunsystems und inuziert die Rekrutierung weiterer Lymphozyten. Demnach kann postuliert werden, dass Biglycan als Brückenmolekül das anegborene und adaptive Immunsystem verbindet, und somit ein potenzielles neues „drug target“ in autoinflammatorischen, wie auch autoimmunen Vorgängen darstellt.