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To understand neurodegenerative diseases is one of the major challenges of the 21st century. This also includes Alzheimer´s disease (AD), which represents a chronic neurodegenerative disorder, with long preclinical and prodromal phases (approx. 20 years) and an average clinical duration of 8–10 years. In the early phase of this disease, patients show deterioration of memory, difficulties in finding the right words for everyday objects or mood swings. The risk of AD grows exponentially with age, doubling approximately every 5 to 6 years. AD may contribute to 60–70% of all dementia cases, being the most common cause of this disease. Dementia is one of the major causes of disability and dependency among older people worldwide. The causes of the sporadic form of AD with late onset (LOAD) are not yet known, but it seems to be a result of multiple factors. Neuropathological features are extracellular senile plaques, containing beta-amyloid peptides (Aβ) and intracellular neurofibrillary tangles, containing paired helical tau proteins, which have been associated with neuronal loss and atrophy of the cerebral cortex. Thus, misfolded proteins seem to contribute to the pathogenesis, but are not the only players in the disease process. Developing feasible therapies is difficult due to the multifactorial pathology of AD. Currently approved drugs only attenuate symptoms, but do not cure the disease. Research into AD also has had several failures in terms of developing disease-modifying therapies. Thus, new therapeutic targets in order to develop a causal therapy are desperately needed. Since AD starts many years far before the first symptoms occur, new scientific approaches focus on the early stage, which are discussed to be important in aging and the onset of AD. Today, the hypothesis of the advanced mitochondrial cascade becomes more and more the leading model for LOAD, integrating physiological aging as the main risk factor. Thus, new interventions targeting mitochondrial dysfunction are of substantial interest. Accordingly, the efficacy of Dimebon and TRO19622 to ameliorate mitochondrial dysfunction in cellular and murine models of AD were investigated. Dimebon (Latrepirdine) was, originally developed in Russia as an H1-antiallergic drug. It might specifically interfere with mechanisms relevant for the cognitive decline, especially by improving impaired mitochondrial function and/or dynamics in AD. TRO19622 (Olesoxim) has been identified in a phenotypic screening approach to promote the survival of primary motor neurons. Olesoxim is easily absorbed by cells and accumulates in mitochondria. Olesoxim’s mode of action is not fully understood, however it has been shown to modulate mitochondrial membranes and interact with the voltage-dependent anion channel (VDAC) and the translocator protein (TSPO; also known as PBR). Thereby it inhibits mitochondrial permeability transition. In this study, the effects of Aβ overproduction on mitochondrial function were investigated. The effects of Dimebon and Olesoxim were examined, using a HEK cell line stably transfected with the Swedish APP double mutation (HEKsw) and un-transfected control cells (HEKut). Mitochondrial membrane potential, ATP concentrations, and respirometry were measured. Western Blot analysis of marker proteins for fission & fusion, autophagy, mitogenesis and mPTP formation were performed. Confocal laser scanning microscopy was introduced as a novel method to visualize mitochondrial dynamics. Olesoxim was also tested in Thy-1-C57BJ/6-APPSL mice representing a murine model of AD. For the in vivo model mitochondria from brain tissue were isolated and dissociated brain cells were prepared to determine respiration, lipid peroxidation, MMP, and ATP-levels. Both, the in vitro and in vivo models were compared and discussed in relation to human post-mortem data. The research was conducted in frame of the EU-project entitled „MITOTARGET“ (Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases: towards new therapeutics) funded under FP7-Health (http://cordis.europa.eu/result/rcn/54471_en.html). HEKsw cells showed an overall reduction in the mitochondrial respiration, a significant lower MMP, and significantly reduced ATP levels compared to HEKut cells. Mitochondrial mass was equal in both cell lines. In addition most mitochondria in HEKsw cells showed truncated morphology, followed by punctuated mitochondria. Levels of the fission related protein Drp were significantly elevated in HEKsw cells whereas protein levels of fusion related OPA were strongly reduced, leading to a shift in the distribution pattern towards shorter mitochondria. Moreover, HEKsw cells showed reduced mitochondrial density. Protein levels of the translocase of the inner mitochondrial membrane (TIMM50) were strongly diminished in HEKsw cells. The OXPHOS machinery is located in the inner membrane, where the MMP is build up and ATP is generated. Reduced TIMM50 levels in HEKsw indicated a reduction of the inner mitochondrial membrane, which could explain the described deficits in OXPHOS, MMP, ATP and mitochondrial morphology and density. Concentration of both mPTP markers, the voltage-depended anion channel (VDAC) and the peripheral benzodiazepine receptor (PBR), were broadly increased in HEKsw cells. Thy1-APPSL transgenic mice were characterized as in vivo model of AD. Those mice are modified to express the human form of APP, containing both, the Swedish (KM670/671NL) and the London (V717L) double mutations under the murine Thy1 promotor. Beginning at the age of 3 months, Thy1-APPSL mice develop elevated Aβ levels and mitochondrial dysfunction. Mitochondria isolated from brains of Thy-1-C57BJ/6-APPSL mice showed significant impaired respiration, resulting in a reduced MMP. However, ATP levels in dissociated brain cells did not differ compared to controls. Protein levels of FIS were unchanged, whereas Drp levels were significantly increased. Levels of the mitochondrial fusion marker optic atrophie-1 (Opa) protein were significantly reduced. Peroxisome proliferation-activated receptor gamma coactivator 1-alpha (PGC1) is a transcription factor, which represents a master regulator of mitochondrial biogenesis. PGC1 expression was significantly elevated in brains of Thy-1-C57BJ/6-APPSL mice. However, mitochondrial mass seemed to be equal in both mouse lines. Both LC3-Isoforms, the cytosolic and the autophagosomal form, were not changed in brains of Thy-1-C57BJ/6-APPSL mice, which indicates equal mitophagic activity. In brain homogenates, isolated from Thy-1-C57BJ/6-APPSL mice, both mPTP marker, VDAC and PBR, were considerably increased, which is in accordance with the findings in HEKsw cells. In conclusion, both, the cellular (HEKsw) and the animal model of AD (Thy1-APPSL) broadly match pathophysiological features, which have been found in post-mortem samples from AD patients. Thus, HEKsw cells and Thy1-APPSL mice seem to be suitable models to study new treatments against AD. Incubation of HEKsw cells with Dimebon resulted in a remarkable increase in respiratory activity and restored the MMP after impairing the cells with rotenon. Dimebon had no effects on ATP levels in both cell lines, neither after challenging cells with rotenon, nor under basal conditions. By adding Dimebon, citrate synthase (CS) activity in HEKsw cells was increased and mitochondrial morphology was shifted to a tubular shape. Dimebon further enhanced protein levels of Drp and resulted in the compensation of reduced OPA levels. Moreover, Dimebon restored the increased expression levels of the mPTP markers VDAC and PBR. Aβ1-40 levels were significantly decreased in HEKsw cells. However, changes in Aβ1-40 levels seemed to be too small, to solely explain the much larger effects of Dimebon on impaired mitochondrial function. In conclusion, Dimebon treatment restored diverse defects in Aβ overexpressing cells: Aβ levels were reduced, autophagy marker were increased, mitophagy as repair and renewal mechanism was elevated, mitochondrial mass and density were increased, OXPHOS capacity was restored, mitochondrial dynamics were balanced, mitochondrial shape showed a normal distribution, expression levels of the mPTP constituents were reduced, TIMM50 levels augmented to control levels and stress induced MMP and ROS levels were reduced. All these effects were observed after incubation of cells with a rather low concentration of 100 nmol/L. Based on these findings and in addition to already existing literature, Dimebon presents a potential therapeutic option for diseases with accompanied mitochondrial dysfunction. Although, clinical findings published so far are inconsistent. Olesoxim induced a general increase in respiratory activity and enhanced the electron transport (ETS) capacity in HEKsw cells. In addition it normalized the OXPHOS activity almost to control levels. However, incubation using different Olesoxim concentrations led to a dose independent decline in the MMP and decreased ATP levels. Adding Olesoxim caused a dose-dependent change in the length of mitochondria strongly shifting the pattern towards longer mitochondria. In HEKsw cells a reduced mitochondrial density was observed which was reversed by Olesoxim dose-dependently. Olesoxim completely compensated the severely reduced expression levels of TIMM50, but had no effects on TOMM22 levels. An unexpected finding was that 10 µM Olesoxim significantly increased Aβ1-40 levels. Effects of Olesoxim were also tested in vivo. Treatment of Thy-1-C57BJ/6-APPSL mice with Olesoxim restored the impaired MMP in dissociated brain cells, but had no effects on ATP-levels. Olesoxim increased the respiratory activity in isolated brain mitochondria and restored impaired respiration complex activities almost to control levels, without having an effect on CS activity. However, treatment with Olesoxim caused an increase of PGC1 protein levels in brains of Thy-1-C57BJ/6-APPSL mice,beyond basal levels of littermate controls. The mPTP marker proteins voltage-depended anion channel (VDAC) and peripheral benzodiazepine receptor (PBR) were significantly reduced. As well as in the cell models, treatment of Thy-1-C57 BJ/6-APPSL mice with Olesoxim significantly enhanced total human, soluble human and soluble mouse Aβ1-40 levels. Further investigation needs the observation that Olesoxim caused partly negative effects in controls. For instance, Olesoxim reduced the OXPHOS capacity and enhanced protein levels of VADAC and PBR in brains of C57BJ/6 littermate control mice, which could limit the applicability of Olesoxim in further preclinical studies.
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR) sind im Immunsystem essentiell für die Verarbeitung von Signalen, die von Chemokinen, Lipiden und anderen Botenstoffen ausgehen. Ihre Existenz gewährleistet, dass Leukozyten sowohl unter physiologischen als auch unter pathophysiologischen Umständen ihren Funktionen als Immunzellen nachkommen können. Grundlegend wichtig für das angeborene Immunsystem sind die GPCR, die die Weiterleitung ihrer Signale über G-Proteine vom Typ Gi vermitteln. Die Migration, Adhäsion und Differenzierung von Leukozyten wird jedoch auch maßgeblich durch G12/13-gekoppelte Rezeptoren reguliert, wobei die kleine GTPase RhoA als Effektormolekül eine wichtige Rolle spielt. Die Bedeutung der G12/13-gekoppelten Signaltransduktion in Makrophagen ist allerdings weitgehend unverstanden. Mit Hilfe einer Mauslinie, in der speziell und ausschließlich in myeloiden Zellen die beiden G-Protein-Untereinheiten Gα12 und Gα13 durch ein konstitutiv aktives Cre-Rekombinase-System inaktiviert wurden (Lys-Gα12/Gα13-KO), sollte nun die Funktion und der genaue Mechanismus des G12/13-gekoppelten Signalweges in Monozyten und Makrophagen aufgeklärt werden und somit neue Erkenntnisse zur Rolle der GPCR im Immunsystem gewonnen werden.
Eine erste Untersuchung der peripheren Immunzellpopulationen des Lys-Gα12/Gα13-KO ergab, dass residente Gewebemakrophagen, im Speziellen die des Peritoneums, in ihrer Anzahl erhöht sind. In einer vertieften Analyse der residenten peritonealen Makrophagen (rpMP) konnte gezeigt werden, dass der Verlust von Gα12/13 zu Veränderung im Zytoskelett der Makrophagen führt. Die Zellen entwickeln einen Phänotyp mit besonders langen und verzweigten Filopodien und zeigen Ein-schränkungen in ihrer basalen Beweglichkeit.
Über diesen morphologischen Befund hinaus, konnte in einer Studie zur Gen-expression in diesen Zellen festgestellt werden, dass Gα12/13-defiziente Makrophagen verstärkt proinflammatorische Gene wie Nos2, die Cyclooxygenase 2 aber auch verschiedene Chemokine wie Cxcl10 oder Cytokine wie Il-6 oder Tnfα exprimieren. Ein ähnlicher Phänotyp in Bezug auf Morphologie und Genexpression wurde bei der Untersuchung von Makrophagen, die aus Knochenmark des Lys-Gα12/Gα13-KO generiert wurden, beobachtet.
Als vermutlich verantwortlicher G12/13-gekoppelter Rezeptor konnte der S1P-Rezeptor-subtyp 2 (S1P2) identifiziert werden. Mit Hilfe von Inhibitoren für die G12/13-gekoppelte Signaltransduktionskaskade konnte gezeigt werden, dass über die kleine GTPase RhoA die NF-κB-abhängige Genaktivität reguliert werden kann. Vermutlich aktiviert RhoA dazu die Rho Kinase ROCK, die wiederum das untergeordnete Effektormolekül Rac1 hemmen kann. Im Falle des Lys-Gα12/Gα13-KO führt eine reduzierte Aktivierung von RhoA insgesamt zu einer eingeschränkten Hemmung dieses Signalweges und im Folgenden zu einer außer Kontrolle geratenen Induktion entzündungsrelevanter Gene und damit einhergehend auch zu einer Veränderung des Milieus in der Bauchhöhle dieser Tiere.
Obwohl die Immunantwort in diesen Tieren auf klassische Pathogene wie Lipopolylsaccharide (LPS) unverändert ist, konnte ein Anstieg an peritonealen B-Zellen festgestellt werden. Diese B-Zellen, insbesondere B1 B-Zellen, sind als wichtige Produzenten von natürlichen Antikörpern gegen endogene Pathogene bekannt. Die Analyse von Plasma aus Lys-Gα12/Gα13-KO-Mäusen ergab einen erhöhten Titer für natürliche Antikörper wie beispielsweise gegen oxidierte Formen von atherogenen Lipoproteinen. Diese Erkenntnis führte zu der Frage, ob die ursprünglich pro-inflammatorischen Veränderungen der peritonealen Makrophagen einen indirekten, positiven Einfluss auf die Entwicklung einer Atherosklerose haben können. Interessanterweise sind die Tiere des Lys-Gα12/Gα13-KO signifikant vor Atherosklerose geschützt und die Existenz der natürlichen Antikörper in atherosklerotischen Läsionen wird als Hinweis für ihre protektive Rolle im Krankheitsverlauf angesehen. In einem therapeutischen Ansatz mit peritonealen Zellen konnte in Atherosklerose-gefährdeten Tieren die Progression dieser Gefäßerkrankung eingedämmt werden.
Die hier durchgeführte Studie hat durch in vitro und in vivo Versuche mit Lys-Gα12/Gα13-KO-Mäusen dazu beitragen, das Verständnis der Rolle der G12/13-gekoppelten Signaltransduktion im Immunsystem zu verbessern.
Die Komplexität der verschiedenen Funktionen einzelner Effektormoleküle einerseits und die Interaktionen unterschiedlicher Immunzellpopulationen andererseits lassen jedoch vermuten, dass noch weitreichende Untersuchungen an GPCR und G-Proteinen nötig sind, um diese für den Organismus bedeutsamen Informationssysteme voll-ständig zu verstehen und weiter therapeutisch nutzbar zu machen.
In zahlreichen, in der Einleitung bereits näher beschriebenen Studien konnte anxiolytische Wirksamkeit des patentierten ätherischen Öls Silexan sowohl im Tiermodell, als auch am Menschen zur Therapie subsyndromaler und generalisierter Angsterkrankungen demonstriert werden.
Das Ziel der vorliegenden Dissertation war es, den zugrunde liegenden pharmakologischen Wirkmechanismus zu untersuchen. Nach eingehender Analyse der Targets klassischer Anxiolytika, richtete sich der Fokus auf spannungsabhängige Calciumkanäle, die die Bindungsstelle des Gabapentinoids Pregabalin enthalten. Die mögliche Modulation der Kanäle wurde an PC-Zellen, einem Modell neuronaler Vorläuferzellen, murinen Synaptosomen, aber auch in primären Neuronen der für die Genese der Angsterkrankungen relevanten Hirnareale Hippocampus und Cortex untersucht. Die Kanalexpression, sowie - distribution in den unterschiedlichen Geweben wurde charakterisiert und die Frage erörtert, ob Silexan spezifische Modulation eines bestimmten Kanalsubtyps vermittelt oder unspezifisch alle Kanäle dieser Gattung inhibiert. Um dies näher zu beleuchten wurden elektrophysiologische Messungen an transfizierten Zellen durchgeführt, die jeweils nur einen Subtyp der Familie spannungsabhängiger Calciumkanäle exprimieren. Zur weiteren Aufklärung des Wirkmechanismus wurde auch die mögliche Involvierung G-Protein gekoppelter Rezeptoren ermittelt.
Der zweite Teil der vorliegenden Untersuchung widmet sich der Klärung potentieller antidepressiver Wirkungen durch mögliche neurotrophe Effekte. Primäre hippocampale Neurone und PC12-Zellen wurden hierzu u.a. auf prä- und postsynaptische Marker, Ausdifferenzierungsmarker, sowie Neuritenwachstum hin analysiert.
Der ischämische Schlaganfall zählt zu den häufigsten Todesursachen in den Industrienationen und hinterlässt die meisten überlebenden Patienten in einer Pflegebedürftigkeit. Trotz der hohen Inzidenz und der gravierenden Folgen eines Schlaganfalls gibt es bislang keine ausreichende medikamentöse Therapie zum Schutz der Nervenzellen. Die akute Versorgung beschränkt sich auf die Lyse des Thrombus, welcher die betroffene Hirnarterie verschließt, und auf symptomatische Maßnahmen.
In der vorliegenden Dissertation wurden daher das neuroprotektiv wirkende Bilobalid, eine Substanz aus dem Ginkgo biloba Baum, und das anaplerotisch wirksame Triheptanoin auf ihre schützende Wirkung während eines ischämischen Schlaganfalls im Mausmodell untersucht. Zusätzlich wurden in der Bilobalid-Studie Tiere aus zwei verschiedenen Altersgruppen (6-8 Wochen gegen 18-24 Monate) verglichen. Der transiente Schlaganfall wurde in der Maus durch einstündigen Verschluss der mittleren Cerebralarterie (MCAO, middle cerebral artery occlusion) induziert.
Bilobalid wurde prophylaktisch eine Stunde vor Induktion des Schlaganfalls intraperitoneal (10 mg/kg) oder lokal in das betroffene Hirnareal (10 µM) verabreicht. Alle durchgeführten Experimente wiesen auf eine deutliche Neuroprotektion durch die Gabe von Bilobalid hin. Ein Tag nach MCAO war die Infarktfläche durch die Gabe von Bilobalid signifikant vermindert. In den durchgeführten motorischen Verhaltenstests schnitten die Bilobalid-behandelten Tiere wesentlich besser ab als unbehandelte Tiere. Der beobachtete Schutzeffekt von Bilobalid wurde auf mitochondriale Prozesse zurückgeführt: Die nach Ischämie beobachteten Defizite in Komplex I der mitochondrialen Atmungskette wurden durch die Gabe von Bilobalid deutlich vermindert. Bilobalid verringerte außerdem den enormen Anstieg von extrazellulärem Glutamat und das Ausmaß der mitochondrialen Schwellung während MCAO.
In der Altersstudie wurde deutlich, dass sowohl die motorische Aktivität der Tiere als auch einige zelluläre Prozesse wie die mitochondriale Atmung beeinträchtigt sind. Nichtsdestotrotz zeigte Bilobalid auch in gealterten Tieren einen deutlichen protektiven Effekt nach Ischämie.
Das anaplerotisch wirksame Triheptanoin wurde den Mäusen in einer 14-tätigen Fütterungsstudie verabreicht (33 % der Gesamt-Kalorien). Deutliche Schutzeffekte der Triheptanoin-Diät wurden nach Ischämie sowohl in TTC-gefärbten Hirnschnitten als auch in motorischen Verhaltenstests beobachtet. Durch den anaplerotischen Effekt sollte einerseits der Citratcyclus mit Acetyl-CoA und Succinyl-CoA gespeist werden, andererseits könnte Succinat in Komplex II der Atmungskette als direkter Energielieferant dienen. Dieser theoretische Ansatz wurde experimentell bestätigt: Die Fütterung mit Triheptanoin bewirkte eine signifikante Aktivitätssteigerung der mitochondrialen Komplexe II und IV nach MCAO. Die durch Ischämie gesenkten ATP-Spiegel und das Membranpotential wurden durch die anaplerotische Diät ebenfalls deutlich erhöht. Triheptanoin bewirkte zudem eine signifikante Reduktion des extrazellulären Glutamat-Anstiegs wŠhrend der MCAO.
Die Auswirkungen eines Schlaganfalls wurden demnach sowohl durch die prophylaktische Gabe von Bilobalid eine Stunde vor Ischämie als auch durch die 14-tägige Triheptanoin-Diät maßgeblich vermindert. Beide Substanzen zeigten im Mausmodell bemerkenswerte neuroprotektive Effekte und könnten daher auch beim Auftreten eines humanen Schlaganfalls entscheidende Vorteile bringen. Der präventive therapeutische Einsatz von Bilobalid oder Triheptanoin sollte daher in klinischen Studien weiter verfolgt werden.
Zwei flavonoidhaltige Pflanzenextrakte, der neuartige Extrakt WS1261, sowie der standardisierte Ginkgo biloba L.-Extrakt EGb761 wurden auf antidepressive Wirkungsmechanismen untersucht, zusätzlich als chemisch definierte Einzelsubstanz das in beiden enthaltene Flavonoid Isorhamnetin. Methodisch wurden hierzu Effekte auf Transporter und Enzyme des Monoaminstoffwechsels, depressionsrelevante Stresshormone neurotrophe Eigenschaften untersucht.
WS1261 hemmte in höheren Konzentrationen in vitro die (Wieder-) Aufnahmetransportmechanismen von NA und 5-HT. Ex vivo war ein Effekt auf die Aufnahme von NA und 5-HT weder nach 1 h, noch 4 h nach Akutbehandlungen zu sehen, sondern erst nach (14-taegiger) subchronischer Behandlung, und dann auch nur Ufer 5-HT zu messen. Nach subchronischer Behandlung konnte eine ebenfalls in vitro festgestellte Hemmung der MAO-A durch WS1261 ebenfalls ex vivo gezeigt werden.
EGb761 hemmte in vitro die Wiederaufnahme von NA, 5-HT und DA. Ex vivo war dieser Effekt weder 1 h, noch 4 h nach einer Akutgabe, allerdings nach 14-taegiger Dauerbehandlung im Bezug auf eine Hemmung der NA-Aufnahme messbar, ohne dass MAO-A oder MAO-B-Aktivitaet beeinflusst wurden.
WS1261 erhoehte nach 14-taegiger Behandlung konzentrationsabhaengig die Plasma-Corticosteronspiegel. WS1261 war in der Lage, die Ausdifferenzierung von PC12-Zellen konzentrationsabhaengig zu fördern, wodurch auf eine Wirkung ähnlich dem neurotrophen Wachstumsfaktor NGF geschlossen werden kann. Die Konzentration des Wachstumsfaktor BDNF wurde in zwei relevanten Hirnregionen durch WS1261 nicht, in einer jedoch durch Isorhamnetin allein erhoeht.
Zusammengefasst ergaben sich Hinweise darauf, dass eine mögliche antidepressive Wirkung von WS1261 durch eine Wirkung auf eine Beeinflussung des Monoaminstoffwechsels, oder die Erhöhung depressionsrelevanter Stresshormonlevel erklärbar sein koennte, insbesondere nach subchronischer Behandlung. Es ergaben sich ausserdem Hinweise auf wachstumsfaktoraehnliche Wirkungsweisen. Eine Wirkung ueber eine Erhšhung zentraler BDNF-Konzentrationen konnte durch die vorliegende Untersuchung im Beobachtungszeitrum nicht festgestellt werden.
Die literaturbekannte kognitionsverbessernde Wirkung des Ginkgo biloba-Extraktes EGb761 koennte erklärbar sein durch eine nach subchronischer Behandlung feststellbare Hemmung des Noradrenalintransporters NET, da im frontalen Cortex vor allem ueber diesen die synaptische Elimination des hier mit Aufmerksamkeit und Lernprozessen im Zusammenhang stehenden Neurotransmitters Dopamin erfolgt.
Das in beiden Extrakten enthaltene Flavonoid Isorhamnetin kann hšchstens mit einem Teil dieser festgestellten Effekte in Verbindung stehen, da die Extrakte sich in ihrer Wirkungsweise unterschieden, und Isorhamnetin alleine teilweise andere Effekte zeigte, als die isorhamnetinhaltigen Extrakte WS1261 und EGb761. Dies koennte jedoch auch durch die unterschiedlichen in den Extrakten enthaltenen Mengen erklärbar sein.
Over the last years there has been an increasing interest in the involvement of the MVA-pathway and of members of the small GTPases, in the development and progression of AD. Earlier investigations mainly focused on the role of cholesterol in disease pathology. This research was supported by retrospective cohort studies, initially showing beneficial effects of the long-term intake of cholesterol lowering statins, on the incidence of the development of sporadic AD. However, in more recent literature increasing attention has been paid to the isoprenoids, FPP and GGPP, due to their crucial role in the post-translational modifications of members of the superfamily of small GTPases. In AD, these proteins were amongst others shown to be involved in mechanisms affecting APP processing, ROS generation and synaptic plasticity. A major factor impeding the clarification of the role of the MVA-pathway intermediates in these mechanisms was the lack of a sensitive and accurate method to determine FPP and GGPP levels in brain tissue. Hence, a state of the art HPLC-FLD method for the quantification of the isoprenoids FPP and GGPP in brain tissue was successfully developed. After the introduction of a double clean-up step from complex brain matrix samples and the synthesis of an appropriate IS (DNP), the method was fully validated according to the latest FDA guideline for bioanalytical method validation. Furthermore, this method was transferred to a faster and more sensitive, state of the art UHPLC-MS/MS application. Additionally, the method was shown to be applicable for mouse brain tissue and data was generated from an in vivo mouse simvastatin study and for different mouse models. According to the aims of the thesis, the current work describes for the first time absolute isoprenoid concentrations in human frontal cortex white and grey matter. Furthermore, this is the first report of isoprenoid levels in the frontal cortex of human AD brains. Further results were shown from mouse brains originating from different mouse models, including the Thy-1 APP mouse model mimicking AD pathology in terms of Aβ formation or C57Bl/6 mice at different ages. AD prevalence can be clearly correlated with increasing age. Therefore, three different generations of mice were investigated. The study demonstrated constant isoprenoid and cholesterol levels in the first half of their life followed by a significant increase of FPP and GGPP in the second half (between 12 and 24 month of age). Cholesterol levels were also elevated in the aged group, but again the effect was less pronounced than shown for the isoprenoids. These results lead to the tentative conclusion that cerebral isoprenoid levels are elevated during aging and that this accumulation is amplified during AD leading to accelerated neuronal dysfunction. In a different mouse study, using the C57Bl/6 mice, in vivo drug intervention with the HMG-CoA reductase inhibitor simvastatin revealed strong inhibition of the rate limiting step of the mevalonate/isoprenoid/cholesterol pathway and resulted in the first report of significantly reduced FPP and GGPP levels in brain tissue of statin treated mice. These results open for the first time the possibility to monitor drug effects on cerebral isoprenoid levels and correlate these data with a modulation of APP processing, which was shown by our group in previous studies. Interestingly, apart from the isoprenoid reduction following statin treatment the reduction of brain cholesterol was also significant but to a lesser extent. These findings support the notion that isoprenoid levels are more susceptible to statin treatment than cholesterol levels. Furthermore, this suggests a strong cellular dependence on FPP and GGPP, as the pool seems to be easily depleted, which finally could lead to cell death. The first investigations of farnesylated Ras and geranylgeranylated Rac protein levels by means of immuno-blotting, substantiated the notion of a decreased abundance of prenylated small GTPases under statin influence as a consequence of reduced isoprenoid levels. These findings demonstrate for the first time a correlation of FPP and GGPP levels with the abundance of small GTPases. These findings together with the results from the AD study prove that isoprenoid levels are not strictly subject to the same regulation as cholesterol levels. To further understand the physiological regulation in the cell, in vitro experiments with different inhibitors of the mevalonate/isoprenoid/cholesterol pathway were conducted. These results confirmed the isoprenoid and cholesterol reducing effects of statin treatment as observed in the aforementioned in vivo mouse study. Interestingly, cholesterol synthesis inhibition targeted after FPP as the branch point, led to significantly elevated FPP levels. FTase inhibition led to significantly reduced FPP levels, whereas inhibition of the GGTase I did not show a significant change of either isoprenoid levels.
Somsanit® (Natrium-γ-Hydroxybutyrat) wird schon seit vielen Jahren zur Langzeitsedierung von Intensivpatienten eingesetzt. Durch das Vorliegen als Natriumsalz, kann bei Langzeitanwendung oft schon nach wenigen Tagen eine Hyperatriämie auftreten, die zum Absetzen des Präparates führen kann. Um diesen Nachteil von Somsanit® zu überwinden, wurde von Dr. F. Köhler Chemie das Natrium-freie GHB-Analogon Butamidol (γ-Hydroxybuttersäure-Ethanolamid) entwickelt. In klinischen Studien zeigte Butamidol eine adäquate Sedierung von Intensivpatienten, besaß aber selbst in hohen Dosierungen keine narkotische Wirkung. GHB, welches auch physiologisch in Gehirn vorkommt, führt konzentrationsabhängig von einer tiefen Sedation bis hin zur Narkose. Aus der Literatur ist bekannt, dass beide GHB-Effekte durch einen Agonismus an GABAB-Rezeptoren ausgelöst werden. Die GHB-Konzentrationen die dafür benötigt werden, können aber nur durch exogen zugeführtes GHB erreicht werden. In physiologischen Konzentrationen bindet GHB an den GHB-Rezeptor, dessen Funktion bisher noch nicht eindeutig aufgeklärt werden konnte. Das Ziel dieser Arbeit war, die Affinität von Butamidol und GHB an den beiden Systemen GABAB- und GHB-Rezeptor zu untersuchen und mögliche Unterschiede aufzuklären. Im Radiorezeptor-Assay zeigte Butamidol eine geringere Affinität zum GABAB-Rezeptor als GHB (Butamidol: Ki = 399.5 mM; GHB: Ki = 10.6 mM) und eine agonistische Wirkung am GABAB-Rezeptor wurde, über die Hemmung spannungsabhängiger Ca2+-Kanäle in Synaptosomen, nur für GHB nachgewiesen. In der nachfolgenden Untersuchung der GABAB-Rezeptor Signaltransduktionskaskade wurden, durch die akute GHB-Gabe, die Phospho-ERK-Level im Hippocampus von Mäusen vermindert. Der gleiche Effekt wurde für die akute Behandlung mit dem GABAB-Agonisten Baclofen erhalten, aber nicht für Butamidol. In Experimenten zur Modulation des GABAergen Systems, durch die subchronische Behandlung von Mäusen mit GHB oder Butamidol, wurde nur nach GHB-Behandlung eine Steigerung des synaptosomalen GABA-Uptakes detektiert. Somit konnte eine Beeinflussung des GABAergen Systems durch Butamidol an mehreren möglichen Angriffspunkten ausgeschlossen werden. Als zweites in Frage kommendes Target für Butamidol wurde das GHB-System untersucht. In Radiorezeptor-Bindungs-Versuchen wurden zur Verdrängung des antagonistischen Radioliganden [3H]NCS-382 höhere Butamidol Konzentrationen benötigt, als zur Verdrängung des Agonisten [3H]GHB (Ki: 1296 vs. 452 μM). Ein vergleichbarer „Shift“ zu höheren Konzentrationen zeigte auch der „kalte“ Agonist GHB und nicht der „kalte“ Antagonist NCS-382 (GHB: Ki 3.10 vs. 1.41 μM; NCS-382: Ki 0.431 vs. 0.447 μM). In einer weiteren subchronischen Behandlungsstudie von Ratten mit Butamidol und GHB wurde für GHB eine Erniedrigung der Gesamt-Rezeptor-Population und für Butamidol eine Erhöhung des Anteils der Agonist-Bindungsstellen an der Gesamt-Rezeptor-Population erhalten. Dieses Ergebnis kann für GHB als Hinweis auf ein agonistisches und für Butamidol als partiell agonistisches Bindungsverhalten am GHB-Rezeptor interpretiert werden. Da im GHB-Radio-Rezeptor-Assay relativ hohe Butamidol Konzentrationen zur Verdrängung der Radioliganden eingesetzt werden mussten, wurden daran anschließend Untersuchungen zur klinischen Relevanz, der für die GHB-Rezeptor Bindung notwendigen Butamidol Konzentrationen, durchgeführt. In Behandlungsstudien von Mäusen, mit anschließender Bestimmung der Butamidol Plasma- und Hirnspiegel, wurde die Hirn/Plasma Ratio ermittelt. Aus der erhaltenen Hirn/Plasma Ratio und den aus klinischen Studien bekannten beim Menschen wirksamen Plasma-Spiegeln, lassen sich für Butamidol Hirnkonzentrationen von 200-350 μM extrapolieren, die im Konzentrationsbereich für die Bindung von Butamidol am GHB-Rezeptor liegen.
Evaluation der Adhärenz, Compliance und Persistenz bei Patienten unter antihypertensiver Therapie
(2010)
Bei chronischen Erkrankungen ist eine regelmäßige Arzneimitteleinnahme eine der Vo-raussetzungen für den Therapieerfolg. Trotzdem nehmen viele Patienten ihre Arzneimit-tel nicht wie vorgeschrieben ein. Dies kann im Rahmen von kardiovaskulären Erkrankun-gen (z. B. Hypertonie) schwerwiegende Folgen wie Herzinfarkt oder Schlaganfall haben. Es ist bekannt, dass die Therapietreue (Adhärenz bzw. Compliance und Persistenz) bei Hypertonikern nur bei 30 – 55 % liegt. Daher ist es von größter Wichtigkeit, die Therapie-treue und die Gründe für mangelnde Adhärenz zu erfassen, um danach gezielte Interven-tionen zur Verbesserung dieser entwickeln zu können. Allerdings liegen aus Deutschland zu dieser Thematik nur wenige Untersuchungen aus Feldstudien in Apotheken oder Ana-lysen aus Verordnungsdatenbanken vor.
Um die zur Verfügung stehenden Möglichkeiten zur Ermittlung der Therapietreue großflä-chig abzudecken, wurden unterschiedliche Erfassungswege genutzt. Zum einen wurde eine Patientenbefragung in öffentlichen Apotheken zur Erfassung der Adhärenz und Ein-nahmegewohnheiten unter medikamentöser Therapie mit Antihypertensiva durchge-führt. Zum anderen diente die Analyse von Verordnungsdaten der DAPI-Datenbank dazu, die Persistenz und Compliance von Patienten unter antihypertensiver Therapie zu be-stimmen. Als Spezialfall wurde weiterhin betrachtet, ob die Umstellung von einem Origi-nal- auf ein generisches Ramipril-Präparat nach dessen Patentauslauf mit einer vermin-derten Compliance einhergeht.
Die Patientenbefragung wurde sowohl von Patienten wie auch von den 24 teilnehmenden Apotheken gut angenommen. Dies zeigen die Rücklaufquoten der ausgegebenen Frage-bögen (46,8 % für die Befragung per zugesandtem Fragebogen (KF; kurze Form des Frage-bogens) und 32,8 % für das Interview in der Apotheke (LF; lange Form des Fragebogens)) Gemessen anhand des eingesetzten Adhärenz-Scores beschrieben sich 71,9 % der Patien-ten im LF und 58,2 % im KF selbst als adhärent. Der Bedarf für strukturierte, einfach durchführbare Adhärenz-Erfassungsinstrumente für die öffentliche Apotheke wurde sehr deutlich, wie u. a. der Abschlussbericht, welcher von den Apotheken nach Abschluss der Befragung ausgefüllt wurde, zeigte. Demnach hielten die Apotheken die Befragung von Umfang und Verständlichkeit für angemessen. Die Patienten waren bereit, detaillierte
Kapitel V Zusammenfassung V
Dissertation Miriam Ude
Evaluation der Adhärenz, Compliance und Persistenz bei Patienten unter antihypertensiver Therapie 160
Auskünfte über ihre Erkrankung zu geben. Dies zeigten auch die vielen in den Bogen ein-getragenen Anmerkungen seitens der Patienten und Apothekern, in denen individuelle Probleme dokumentiert wurden.
Bei der Analyse von Persistenz und Compliance im Substanzklassenvergleich wurde ein-drücklich gezeigt, dass die Therapietreue unter den First-line-Antihypertensiva (AHT) sub-optimal ist. Patienten unter der Therapie mit β-Blockern (77,3 %) weisen den geringsten non-persistenten Anteil auf, gefolgt von Patienten mit Verordnungen über ACE-Hemmer (78,7 %), AT1-Antagonisten (79,0 %), Calcium-Kanal-Blocker (81,4 %) und Diuretika (83,0 %). Hinsichtlich der Compliance findet sich in der Gruppe der mit AT1-Antagonisten be-handelten Patienten der niedrigste Anteil mit Non-Compliance (52,1 %), gefolgt von ACE-Hemmern (54,1 %), β-Blockern (54,7 %), Calcium-Kanal-Blockern (58,5 %) und Diuretika (63,6 %).
Die primäre Hypothese, dass die Compliance nach Umstellung von einem Ramipril-Original-Präparat nach dessen Patentauslauf auf ein Generikum signifikant abnimmt, konnte nicht bestätigt werden. Die Ergebnisse wurden für Patienten ermittelt, welche mit Ramipril-Monopräparaten, nur mit Fixkombinationen aus Ramipril mit einem Diuretikum, oder mit beidem (duale Therapie) behandelt wurden.
Die Ergebnisse der im Rahmen dieser Dissertation untersuchten Projekte zeigen, dass die medikamentöse Therapietreue bei Patienten unter antihypertensiver Therapie in Deutschland verbesserungswürdig ist, und dass die Ermittlung der Adhärenz, Compliance und Persistenz von immenser Wichtigkeit ist. Trotz der unterschiedlichen gewählten An-sätze kongruieren die Ergebnisse sehr gut. Patienten benötigen Unterstützung in der Durchführung ihrer medikamentösen Therapie mit AHT, um gesteckte Therapieziele zu erreichen, welche dazu beitragen können, Morbidität und Mortalität zu verringern bzw. die Lebensqualität zu verbessern. Ein erster Schritt dazu ist das zielgerichtete Erkennen therapiebezogener Probleme. Da es hierfür in Deutschland bisher keine strukturierten Instrumente gibt, welche flächendeckend in den Apothekenalltag implementiert wurden, könnte das neu entwickelte und auf Machbarkeit getestete Befragungsinstrument ein Ansatz sein, die Patienten gezielt und zeitsparend nach ihren Problemen mit der Arznei-mitteleinnahme zu befragen und frühestmöglich intervenieren zu können.
Tauopathien sind eine Gruppe von neurodegenerativen Erkrankungen zu denen auch die Alzheimer Demenz zählt, die als gemeinsames pathologisches Merkmal die intrazelluläre Akkumulation von neurofibrillären Bündeln (NFTs) aufweisen. Diese bestehen aus hyperphosphoryliertem Tau-Protein, das hierdurch seine physiologische Funktion, die Assemblierung von Mikrotubuli zu fördern und diese zu stabilisieren, verliert. Der genaue Mechanismus, der bei diesen Erkrankungen zur Neurodegeneration führt und mit Demenz, Parkinsonismus und motorischen Störungen einhergehen kann, ist bisher weitgehend ungeklärt. Da mitochondriale Dysfunktion bei vielen neurodegenerativen Erkrankungen eine entscheidende Rolle spielt, wurde in der vorliegenden Arbeit anhand eines Zellmodells zum Einen der Effekt durch die Überexpression von gesundem Wildtyp-Tau (hTau40) und zum Anderen die Auswirkungen der P301L-Mutation, wie sie auch bei der frontotemporalen Demenz mit Parkinsonismus (FTDP-17) auftritt, auf die mitochondriale Morphologie und Funktion untersucht. Die grundlegende Charakterisierung deckte eine weitreichende Einflussnahme von Tau auf den Energiestoffwechsel der Zellen auf. Die Überexpression von Tau führt zu einer verminderten Expression der Komplexe I, II und IV sowie einer veränderten Aktivität der mitochondrialen Atmungskettenkomplexe I-III. Zudem weist die verminderte Aktivität der Citrat-Synthase auf eine Beeinträchtigung des Citratzyklus hin. Der maßgebliche Unterschied zwischen den Tau überexprimierenden Zellen besteht in dem deutlich erniedrigtem Gehalt (NADH:HAR-Aktivität) und der drastisch erniedrigten Aktivität (NADH:DBQ-Aktivität) von Komplex I in den TauP301L-Zellen, wohingegen die hTau40-Zellen trotz eines vermindertem Gehalts im Vergleich zu den Kontroll-Zellen eine deutlich erhöhte Aktivität (DBQ/HAR-Aktivität) aufweisen. Diese gegensätzliche Aktivität von Komplex I führt zu weitreichenden Veränderungen der Zellphysiologie, was sich am deutlichsten in der daraus resultierenden metabolischen Aktivität (NADH-Spiegeln), den ATP-Spiegeln und dem mitochondrialen Membranpotential zeigt. Diese Parameter sind in den hTau40-Zellen aufgrund der hohen Komplex I-Aktivität erhöht und in den TauP301L-Zellen entsprechend erniedrigt. Ebenso spiegeln sich diese funktionellen Parameter in der veränderten Morphologie, Dynamik sowie der Ultrastruktur der Mitochondrien wieder. Die Cristae-Struktur sowie die Dichte der Matrix lassen eindeutige Rückschlüsse auf die aus den unterschiedlichen Komplex I-Aktivitäten resultierenden ATP-Spiegel zu. Weiterhin gibt es in der Literatur Hinweise, dass zum Einen die Transportrichtung der Mitochondrien von der Affinität der Motormoleküle von dem ATP-Gehalt der Mitochondrien abhängig zu sein scheint und zum Anderen, dass die Hemmung von Komplex I zu einem retrograden Transport und perinukleären Morphologie der Mitochondrien führt. Dies konnte ebenfall in den TauP301L-Zellen gezeigt werden. Zusätzlich sind hier die mitochondriale Bewegung sowie die Dynamik (Fusion und Fission) verringert. Interessanterweise spiegeln viele der funktionellen und strukturellen Veränderungen der TauP301L-Zellen den Alterungsprozess wieder, da es im Alter zu einer erhöhten Rate an oxidativen mtDNA-Schäden, einer verminderten Aktivität von Komplex I sowie zu einer verringerten Effektivität und Kapazität der oxidativen Phosphorylierung kommt, die in niedrigeren ATP-Spiegeln resultiert. Anhaltspunkte aus der Literatur bringen auch die morphologischen und dynamischen Veränderungen der Mitochondrien mit dem Alterungsprozess in Verbindung, wodurch das in dieser Arbeit verwendete Zellmodell anscheinend den Alterungsprozess widerspiegelt, der bei vielen neurodegenerativen Erkrankungen den Hauptrisikofaktor für die Erkrankung darstellt. Die Mutation P301L führt weiterhin dazu, dass die Zellen eine erhöhte Vulnerabilität gegenüber sekundären Insulten aufweisen. Obwohl die Toxizität der einzelnen Stimuli – seien es nun Inhibitoren der einzelnen Atmungskettenkomplexe oder oxidativer sowie nitrosativer Stress – sich unterschiedlich auf die gemessenen physiologischen Parameter der Zellen auswirkte, so zeigt sich durchgängig bei den TauP301L-Zellen ein stärkerer Abfall der metabolischen Aktivität und der ATP-Spiegel. Zudem führte die Überexpression von hTau40 zu einer geringeren Vulnerabilität gegenüber den sekundären Insulten. Trotz der geringen Auswirkungen von oligomerem und fibrillärem Aß1-42 auf die mitochondriale Funktion der SH-SY5Y Zellen kann nicht ausgeschlossen werden, dass in vivo nicht doch ein Teufelskreislauf besteht, sodass sich die Toxizität von Aß und Tau potenziert. Insgesamt machen die Ergebnisse dieser Arbeit deutlich, dass mitochondriale Dysfunktion auch bei Tauopathien eine entscheidende Rolle in der Pathogenese spielt und sich hierdurch neue Aspekte zur therapeutischen Intervention ergeben.
The utilization of Ginkgo biloba in medicinal practice dates back to 1505 A.D. Ironically, the mechanisms of action of Ginkgo are not fully clarified till now. Nowadays, Ginkgo biloba leaf extracts are mainly indicated for mild to moderate cerebrovascular insufficiency and different forms of dementia. The fact that it is an herbal extract composed of several different components indeed adds to the intricacy of finding its mechanisms of actions. Indisputably, many scientists tried to elucidate the mechanisms of actions of Ginkgo. The first step to achieve this goal was to standardize the leaf extract. The standardized Ginkgo leaf extract contains 22-27 % flavonol glycosides, 2.8-3.4 % of ginkgolide A, B and C, as well as approximately 2.6-3.2 % bilobalide and below 5 ppm ginkgolic acids. A widespread standardized Ginkgo extract is the EGb 761, which was utilized in the current work. One of the earliest proposed mechanisms is the ability of the Ginkgo extract to act as an anti-oxidant, which could be explained by its high flavonoid contents. However, without doubt EGb 761 encompasses other characteristics which distinguish it from other herbal extracts that are also rich in flavonoids. Since free radicals and reactive oxygen species are highly associated with the mitochondrial functions, examination of the effect of EGb 761 on mitochondrial functions was lately addressed. Moreover, this was encouraged as the link between Alzheimer’s disease [AD] and the mitochondria started to emerge. Previously, our group observed mitochondrial protective actions of EGb 761 on cell culture in vitro. Furthermore, anti-apoptotic effects were previously described for EGb 761. However, only very few studies addressed the single constituents and their effect on mitochondrial functions. Flavonoids were studied in several other plant extracts and their radical scavenging activity is unquestionable, but EGb 761 has anti-apoptotic actions which may be attributed to its terpenoid fraction. Exclusively found in the Ginkgo plant, are the ginkgolides and therefore their actions are not yet fully elucidated. Moreover, those who attempted to address these constituents concentrated on one or two candidates, for example bilobalide or ginkgolide B and ignored the rest. Unfortunately, this led to incomplete results, and one couldn’t compare the relative activities of all EGb 761 components in order to state whether all the components are effective or not. ...