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Rolf van Dick und Holger Horz haben in ihrem UniReport-Essay »Bestmögliche Bildung und Ausbildung für alle« gefordert und die Kritik von Hans Peter Klein und Julian Nida-Rümelin am aktuellen Akademisierungswahn scharf zurückgewiesen. Nida-Rümelin und Klein antworten nun im Gespräch gemeinsam auf die zentralen Thesen von van Dick und Horz.
Anfang Februar veröffentlichte die Pressestelle der Goethe-Universität die Meldung „In der Stadt bauen Kaninchen dichter: Große Bauten für die ländliche Großfamilie, kleine Bauten für das städtische Pärchen.“ Die Meldung beruhte auf einem Fachartikel der Arbeitsgruppe Ökologie und Evolution im Journal of Zoology. Rasend schnell verbreitete sich die Meldung in den Medien – wir haben Madlen Ziege, Doktorandin in der Arbeitsgruppe Ökologie und Evolution einmal danach befragt, wie die Forschung mit populären oder besser: popularisierten Meldungen umgeht.
In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals die Interaktion von A. baumannii mit humanem Plasminogen untersucht. Mit dem Translations-Elongationsfaktor TufAb, dem äußeren Membranprotein OmpW sowie dem Lipoprotein p41 konnten insgesamt drei Plasminogen-bindende Proteine von A. baumannii identifiziert werden. Außerdem wurde ein grundlegender Beitrag zur funktionellen Charakterisierung von TufAb sowie p41 von A. baumannii erbracht.
Es konnte nachgewiesen werden, dass gereinigtes TufAb humanes Plasminogen bindet und diese Interaktion teilweise durch Lysin-Reste vermittelt und von der Ionenstärke beeinflusst ist. An TufAb-gebundenes Plasminogen war für den Plasminogen-Aktivator u-PA zugänglich und konnte zu Plasmin aktiviert werden, welches das chromogene Substrat S-2251, das physiologische Substrat Fibrinogen und die zentrale Komplementkomponente C3b proteolytisch spaltete. Schließlich konnte TufAb als „Moonlighting“-Protein auf der Zelloberfläche von A. baumannii identifiziert werden.
Für das Lipoprotein p41 konnte ebenfalls gezeigt werden, dass dieses an Plasminogen bindet. Die Bindung von Plasminogen an p41 erfolgte ebenfalls über Lysin-Reste, zeigte sich allerdings von der Ionenstärke unbeeinflusst. Im Fall von p41 konnte mit Hilfe von C-terminal verkürzten p41-Konstrukten gezeigt werden, dass C-terminale Lysin-Reste an der Bindung von Plasminogen beteiligt sind. Weitere Versuche mit p41-Proteinen, bei welchen vier C-terminale Lysin-Reste durch Alanin-Reste substituiert wurden, ergaben, dass die beiden Lysin-Reste K368 und K369 essentiell für die Bindung von Plasminogen an p41 sind. Zudem konnte gezeigt werden, dass sowohl Kringle-Domäne 1 als auch Kringle-Domäne 4 von Plasminogen bei der Interaktion mit p41 involviert sind. An p41 gebundenes Plasminogen ließ sich durch u-PA zu Plasmin aktivieren, welches Fibrinogen sowie die zentrale Komplementkomponente C3b degradierte. p41 ist außerdem in der Lage, die Komplementkomponenten C3, C3b und C5 zu binden und den alternativen Weg zu inhibieren. Zudem ergaben Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit erste Hinweise darauf, dass zumindest die Plasminogen-bindende Region auf der Zelloberfläche von A. baumannii lokalisiert ist.
Die Inaktivierung des p41-kodierenden Gens führte zu einer signifikanten Abnahme im Überleben von A. baumannii-Zellen in der Gegenwart von NHS. Zudem zeigte die Mutante Δp41 einen Defekt in der Plasmin-abhängigen Transmigration durch einen Endothelzell-Monolayer. Beide Versuche untermauern die physiologische Relevanz für die Interaktion von A. baumannii mit Plasminogen.
Reaktive Sauerstoffspezies lösen molekular Schäden aus und werden als möglicher Auslöser des Alterungsprozesses gesehen. Sie sind allerdings auch wichtige Signalgeber, deren Einfluss in den letzten Jahren immer mehr Beachtung findet. Im der vorliegenden Arbeit wurde die Signalwirkung von ROS auf das Alternsmodell P. anserina untersucht. Dabei konnten folgende Erkenntnisse gewonnen werden.
1. Die H2O2–Konzentration im Extrazellularraum und im Cytoplasma steigt bei PQ-Stress und während des Alterns an.
2. Bei PQ-Stress und während des Alterns treten Ähnlichkeiten der globalen Transkriptregulation auf, die vermutlich durch die angestiegene H2O2-Konzentration ausgelöst werden.
3. Die Transkriptmenge von SODs und die Gesamt-SOD-Aktivität sind bei PQ-Stress leicht herunterreguliert. Transkripte für PaCCP1 und PaCATB treten dagegen bei PQ-Stress vermehrt auf und auch die Gesamt-Katalase-Aktivität steigt an. Dies deutet darauf hin, dass der Fokus des enzymatischen Abbaus von ROS bei PQ-Stress nicht im Abbau von Superoxid-, sondern von Wasserstoffperoxid liegt.
4. Bei PQ-Stress steigt die Transkriptmenge von Schlüsselgenen der Carotinoid-Biosynthese.
5. Transkripte von mitochondrial lokalisierten Proteinen werden bei PQ-Stress stark hochreguliert, die Menge an Mitochondrien nimmt allerdings nicht zu. Dies deutet auf einen verstärkten Abbau mitochondrialer Proteine, gefolgt von einer Neusynthese hin.
6. Bei PQ-Stress sinkt die Expression von Genen, die für den Kupferimport benötig werden. Dies wird höchstwahrscheinlich durch die Inaktivierung des Transkriptionsfaktors GRISEA ausgelöst. Es kommt zu einem Kupfermangel, der eine verstärkte alternative PaAOX-abhängige Atmung auslöst und dafür sorgt, dass kupferabhängige Prozesse, wie die Melanin- und Sterigmatocystin-Synthese transkriptionell herunterreguliert werden. Durch die verringerte Transkriptmenge von Kupferimportern bei PQ-Stress kommt es zu starken Gemeinsamkeiten in der globalen Genregulation von PQ-gestressten Kulturen und der Kupfer-depletierten Mutante grisea.
7. Kupfer und PQ haben einen synergistisch negativen Effekt auf Wuchsrate und Lebensspanne von P. anserina. Bei hohen Kupfer und Superoxid-Konzentrationen kommt es vermutlich zur verstärkten Bildung von Hydroxyl-Radikalen, wodurch molekulare Schäden entstehen. Durch eine verringerte Kupferkonzentration wird der Organismus bei PQ-Stress möglicherweise vor der Bildung von Hydroxyl-Radikalen geschützt.
Insgesamt haben die Untersuchungen gezeigt, dass ROS wichtige Signalmoleküle sind, die einen starken Einfluss auf die Regulation von Transkripten haben. Viele dieser transkriptionellen Regulationen führen zu physiologischen Veränderungen. Der Fokus der Regulationen liegt unter den verwendeten Bedingungen im Schutz vor den schädlichen Effekten von ROS.
Der Pilz Podospora anserina ist seit mehr als fünf Jahrzehnten ein wichtiger Modellorganismus für die Alternsforschung. Insbesondere die Mitochondrien, essentielle eukaryotische Zellorganellen – wegen ihrer Funktion im Energiestoffwechsel häufig auch als „zelluläre Kraftwerke“ bezeichnet, sind Schlüsselfaktoren für den Alterungsprozess dieses Organismus.
Im Rahmen einer vorangegangenen Diplomarbeit wurde daher der Einfluss der mitochondrialen CLPXP-Protease, einem bisher noch wenig erforschten Bestandteil der Proteinqualitätskontrolle in Mitochondrien, auf die Alterung von P. anserina untersucht. Mitochondriale CLPXP-Proteasen sind, wie auch ihre bakteriellen Pendants, aus zwei verschiedenen Untereinheiten aufgebaut: der Protease-Komponente CLPP und der Chaperon-Komponente CLPX. Die Deletion des Gens PaClpP, kodierend für CLPP in P. anserina, führte zu einer überraschenden Verlängerung der gesunden Lebensspanne der Mutante. Darüber hinaus war es möglich, den pilzlichen PaClpP-Deletionsstamm durch Einbringen von CLPP des Menschen zu komplementieren. Dies beweist, dass die Proteasen CLPP des Menschen und von P. anserina funktionell homolog sind. Dadurch eröffnete sich die Perspektive, diesen einfachen Modellorganismus für die Gewinnung potenziell auf den Menschen übertragbarer Erkenntnisse einzusetzen. Bedeutenderweise ist die menschliche CLPXP-Protease wahrscheinlich involviert in die Entstehung verschiedener Krankheiten, darunter das Perrault-Syndrom sowie einige Krebsarten. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind jedoch noch weitestgehend unverstanden.
Ziel des in dieser Dissertation beschriebenen Forschungsprojektes war daher die Gewinnung genauerer Einsichten in die molekulare Funktion und die daraus folgende biologische Rolle der mitochondrialen CLPXP-Protease von P. anserina. Der wohl wichtigste Punkt für das detaillierte Verständnis einer Protease ist die Kenntnis ihres Substratspektrums, d. h. der von ihr abgebauten Proteine. Tatsächlich wurde aber bis heute noch in keinem eukaryotischen Organismus eine umfassende Analyse der Substrate einer mitochondrialen CLPXP-Protease vorgenommen. Um diese Wissenslücke zu füllen, wurde in der vorliegenden Arbeit eine ursprünglich in Bakterien entwickelte Verfahrensweise, der sogenannte CLPP „Substrat-trapping Assay“, in P. anserina implementiert. Dafür mussten zunächst die notwendigen handwerklichen Voraussetzungen für den Assay geschaffen werden, insbesondere die effiziente Affinitätsaufreinigung von Proteinen aus isolierten Mitochondrien – einer bisher in P. anserina noch nicht angewandten Technik. Unter Verwendung verschiedener neu hergestellter Varianten der menschlichen Protease-Komponente CLPP, darunter einer proteolytisch inaktiven Variante zum „Einfangen“ von Substraten, konnte der CLPP „Substrat-trapping Assay“ in P. anserina erfolgreich durchgeführt werden. Insgesamt wurden, in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Julian D. Langer (Max-Planck-Institut für Biophysik; Durchführung von massenspektrometrischen Analysen) nahezu 70 spezifische Proteine erstmalig als potenzielle Substrate oder Interaktionspartner einer mitochondrialen CLPXP-Protease identifiziert. Bei einem Großteil dieser Proteine handelt es sich um Enzyme und Komponenten verschiedener Stoffwechselwege – vor allem um solche, die eine zentrale Rolle im mitochondrialen Energiestoffwechsel spielen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit legen somit folgende Arbeitsthese als Schlussfazit und gleichzeitig Ausganspunkt für zukünftige Untersuchungen nahe:
Die hauptsächliche molekulare Funktion der mitochondrialen CLPXP-Protease in P. anserina ist die Degradation von Stoffwechselenzymen und ihre biologische Rolle demnach die Kontrolle und Aufrechterhaltung des mitochondrialen und zellulären Energiestoffwechsels.
Insgesamt ist die auf Grundlage des CLPP „Substrat-trapping Assay“ in P. anserina anzunehmende Rolle der mitochondrialen CLPXP-Protease als regulatorische Komponente des mitochondrialen Energiestoffwechsels erstaunlich gut mit Beobachtungen in anderen eukaryotischen Organismen, gerade bezüglich der Relevanz der CLPXP-Protease des Menschen für diverse Krankheiten, zu vereinbaren. Somit erscheint es überaus sinnvoll und vielversprechend, dass in dieser Doktorarbeit erstellte und bisher beispiellose Kompendium potenzieller in vivo Substrate und Interaktionspartner dieser Protease auch als Referenz für zukünftige Untersuchungen außerhalb von P. anserina anzuwenden.
Seit mehr als 200 Jahren gibt es durch die Wissenschaftler der Wetterstation auf dem Hohenpeißenberg systematische Wetterbeobachtungen, doch erst seit wenigen Jahren gibt es unter den Klimaforschern einen Konsens, dass sich das Klima durch anthropogene Einflüsse schon verändert hat – und weiter verändern wird. Die bisherigen Auswirkungen, wie zum Beispiel ein globaler Temperaturanstieg von 0,85°C seit Beginn der Industrialisierung, sind heute gut belegbar. Mögliche zukünftige Entwicklungen des Klimas werden heute ebenso erforscht wie die Auswirkungen des Klimawandels auf Mensch und Umwelt. Zu diesen Auswirkungen gehören unter anderem Folgen für die Landwirtschaft. Durch veränderte Niederschläge und den Temperaturanstieg werden sich die Lebensbedingungen von Bodenorganismen und Anbaubedingungen für Pflanzen ändern. Letztendlich ist aufgrund dieser Veränderungen auch ein verstärkter Einsatz von Pestiziden zu erwarten. Allerdings wurde bisher kaum untersucht, ob der Einsatz von Pestiziden in der Landwirtschaft unter den Bedingungen des Klimawandels (konkret durch die Interaktion von klimatischen und chemischen Faktoren) ein erhöhtes Umweltrisiko für Bodenorganismen darstellt. Bisher werden klimatische Faktoren bei den Tests für die Zulassung von Pestiziden nicht berücksichtigt.
Daher wurde diese Fragestellung in der hier vorliegenden Dissertation am Beispiel der Effekte von zwei zugelassenen Pestiziden auf Bodenorganismen unter verschiedenen klimatischen Bedingungen untersucht. Konkret wurden dazu mit Labor- und Halbfreilandversuchen die Wirkung eines Insektizids und eines Fungizids in Interaktion von Temperatur und Bodenfeuchte auf Vertreter zweier Invertebratengruppen (Collembola: zwei Arten; Enchytraeidae: eine Art) untersucht.
In einem modifizierten Standardtest mit Collembolen erhöhte sich die Toxizität des Insektizids Lambda-Cyhalothrin, wenn die Exposition der beiden Arten bei einer erhöhten Bodenfeuchte stattfindet. Die kühl adaptierte Art Folsomia candida reagierte bei erhöhter Testtemperatur am empfindlichsten auf diese Testsubstanz: Die EC50 aus diesem Experiment lag bei 2,84 mg (a.s.)/kg Boden Trockengewicht (dw). Unter Standardbedingungen, wie sie in Tests für die Zulassung von Pestiziden angewandt werden, lag die EC50 von F. candida dagegen bei 8,65 mg a.s./kg dw.
Unter den gleichen Versuchsbedingungen wurde auch das Fungizid Pyrimethanil an Collembolen getestet. Hier erwies sich die Testsubstanz für beide Arten bei
gleichzeitigem Trockenstress und / oder erhöhter Temperatur als toxischer im Vergleich zu den Standard-Testbedingungen. Dabei zeigte F. candida mit einer EC50 von 28,3 mg a.s./kg dw die höchste Empfindlichkeit. Ohne die veränderten klimatischen Faktoren, betrug die EC50 von F. candida 52,3 mg a.s./kg dw.
In Reproduktionstests mit der Enchytraeen-Art Enchytraeus bigeminus wurde die Bodenfeuchte als klimatischer Faktor in Kombination mit jeweils einer Testsubstanz untersucht. Bei beiden Chemikalien reagierte E. bigeminus in trockenem Boden empfindlicher. Die ermittelten EC50 betrugen 1,34 mg a.s./kg dw für Lambda-Cyhalothrin und 437 mg a.s./kg dw für Pyrimethanil. Getestet unter Standardbedingungen lagen die EC50-Werte bei 3,79 bzw. 499 mg a.s./kg dw.
Neben den Laborexperimenten wurden Tests in „Terrestrischen Modellökosystemen“ (TME) mit den gleichen Chemikalien in Kombination mit variierender Bodenfeuchte als klimatischer Faktor vorgenommen. Diese Experimente wurden in Deutschland und in Portugal durchgeführt, um die Reaktion einer zentraleuropäischen und einer mediterranen Artengemeinschaft zu untersuchen. Aus der terrestrischen Lebensgemeinschaft wurden verschiedene Organismengruppen untersucht. Die Effekte auf Enchytraeen aus dem Experiment mit Pyrimethanil waren als Veröffentlichung Teil dieser Dissertation. In der portugiesischen Halbfreilandstudie wurden keine Effekte auf die Enchytraeen durch Pyrimethanil bei umweltrelevanten Konzentrationen festgestellt, jedoch beeinflusste die Bodenfeuchte die Zusammensetzung der Artengemeinschaft. Im deutschen TME-Experiment wurde eine verstärkte Wirkung des Fungizids in trockenem Boden festgestellt, d.h. die jeweiligen Effektkonzentrationen (niedrigste EC50 3,48 mg a.s./kg dw für Fridericia connata in trockenem Boden) lagen deutlich unterhalb der aus den Labortests mit Enchytraeus bigeminus bekannten Werten (499 mg a.s./kg dw).
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass klimatische Faktoren die Effekte von Pflanzenschutzmittel auf Bodenorganismen beeinflussen können. Für Laborversuche ist eine generelle Berücksichtigung von klimatischen Faktoren im Zulassungsverfahren aus heutiger Sicht zu weit gegriffen. Die TME-Versuche zeigten sich als geeignetes Testverfahren, interaktive Effekte von Pestiziden und Klima bzw. multiplen Stressoren generell auf Artengemeinschaften zu untersuchen. Für TME-Experimente wäre unter Beachtung der Vielzahl möglicher Fragestellungen, Endpunkte und moderner statistischer Auswerteverfahren eine internationale Richtlinie wünschenswert.