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Prokaryotische Organismen werden in ihrer natürlichen Umgebung mit schwankenden Umwelteinflüssen konfrontiert oder müssen gegebenenfalls extremen Bedingungen standhalten. Um sich an derartige Veränderungen anpassen zu können und damit ein weiteres Überleben zu sichern, ist es wichtig neue genetische Informationen zu akquirieren. Die molekulare Basis dieser Anpassung sind Genmutationen, Genverlust, intramolekulare Rekombination und/oder horizontaler Gentransfer. Der vorliegende Selektionsdruck der Umwelt begünstigt schlussendlich die Spezialisierung und damit die Erschließung neuer Standorte aufgrund des Erwerbs neuer metabolischer Eigenschaften, Resistenzgene oder Pathogenitätsfaktoren. Vergleichende Analysen bakterieller Genome, welche auf Analysen der GC-Gehalte, der Codon- und Aminosäurenutzung und der Genlokalisation beruhen, zeigten, dass bei diesem evolutiven Prozess bzw. der Weiterentwicklung der bakteriellen Genome der horizontale Gentransfer als treibende Kraft eine entscheidende Rolle spielt. So indizieren Genomstudien, dass 0-22% der gesamten bakteriellen und 5-15% der archaeellen Gene horizontal erworben wurden, wobei der DNA-Transfer nicht ausschließlich zwischen Vertretern einer Domäne, sondern ebenfalls zwischen Organismen unterschiedlicher Domänen stattgefunden hat. So sind z.B. 24 bzw. 16% der Gene von Genomen hyperthermophiler Organismen wie Thermotoga maritima oder Aquifex aeolicus archaeellen Ursprungs. Ebenso finden sich Gene für Chaperone und DNA-Reparaturenzyme im Genom des thermophilen Bakteriums Thermus thermophilus wieder, welche wahrscheinlich ebenfalls durch horizontalen Gentransfer aus hyperthermophilen und archaeellen Genomen erworben wurden um eine Anpassung an extreme Standorte zu ermöglichen. Durch vergleichende Genomstudien wurde ebenfalls festgestellt, dass die durch horizontalen Gentransfer erworbenen Gene oftmals zu einer Neuorganisation von Transkriptionseinheiten und zu einer veränderten Genomorganisation führten. Dennoch finden sich immer wieder Beispiele von horizontal erworbenen Operonen in den verschiedenen Organismen. Gut charakterisierte Vertreter horizontal übertragener Operone sind dabei z.B. das archaeelle H+-ATPase-Operon, das Operon der Na+-translozierenden NADH:Ubichitonoxidoreduktase oder das Nitratreduktase-Operon.
Man unterscheidet bei dem horizontalen Gentransfer zwischen drei Mechanismen der DNAAufnahme: Konjugation, Transduktion und Transformation. Die DNA-Übertragung durch Konjugation ist durch einen spezifischen Zell-Zell-Kontakt definiert, der durch einen von der Donorzelle ausgehenden, sogenannten F-Pilus hergestellt wird. Die Donorzelle überträgt schließlich Plasmid-kodierte genetische Informationen und oftmals Eigenschaften für die eigenständige Konjugation auf eine Rezipientenzelle. Die Transduktion hingegen beschreibt die DNA-Übertragung von Bakteriophagen auf eine Wirtszelle, wobei hier eine hohe Wirtsspezifität Voraussetzung ist. Die Übertragung der DNA von einer Bakterienzelle in eine andere erfolgt dabei ohne Kontakt der Zellen. Die natürliche Transformation ist definiert als Transfer von freier DNA und ermöglicht damit im Gegensatz zu den beiden ersten spezifischen Mechanismen der DNA-Übertragung ein größeres Spektrum der Verbreitung genetischer Informationen. Freie DNA, welche entweder durch Zelllyse oder Typ-IVSekretion ausgeschieden wird und aufgrund von Adsorption an mineralische Oberflächen über längere Zeiträume stabil in der Umgebung vorliegen kann, kann unter der Voraussetzung der Existenz eines speziellen Aufnahmesystems von Bakterien aufgenommen werden. Mittlerweile sind über 44 Bakterien aus unterschiedlichen taxonomischen Gruppen beschrieben, die eine natürliche Kompetenz ausbilden können. Die bekanntesten Beispiele für natürlich transformierbare Gram-negative Bakterien sind Heliobacter pylori, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas stutzeri, Haemophilus influenzae, T. thermophilus und Acinetobacter baylyi. Auch unter den Gram-positiven Bakterien finden sich einige Vertreter, die natürlich kompetent sind, wie Deinococcus radiodurans, Bacillus subtilis und Streptococcus pneumoniae. Ungeachtet der relevanten Rolle der Transformation im horizontalen Gentransfer, ist über die Struktur und Funktion der komplexen DNA-Aufnahmesysteme wenig bekannt.
Im Rahmen der vorliegenden Diplomarbeit wurde die Rolle der putativen mitochondrialen Kinase PINK1 untersucht. Die Mutationen in diesem Gen sind für die PARK6 Form von Morbus Parkinson ursächlich. Dies ist eine neurodegenerative Erkrankung, welche die Lebensqualität der Betroffenen weitgehend beeinträchtigt. Sie wird mit Dopamin-Ersatzmitteln und DBS (Deep Brain Stimulation) behandelt, beide nicht frei von Nebenwirkungen. Levodopa können bekannterweise zu schweren Fällen von Dyskinesie führen. Die Aufklärung der physiologischen Rolle von PINK1 würde den Wissenschaftlern auf dem Weg zur Früherkennung und anderen Therapiemöglichkeiten verhelfen. Die PARK6 Form der Parkinson Erkrankung wird derzeit anhand von verschiedenen Modellorganismen (M. musculus, D. melanogaster, D. rerio, C. elegans), sowie von verschiedenen Zellmodellen (HeLa, PC12, Fibroblasten aus PARK6 Patienten) untersucht. Als neuronale Zelllinie eignen sich die SH-SY5Y Zellen besonders gut für die Forschung an der durch den Verlust von dopaminergen Neuronen gekennzeichneten Parkinson-Erkrankung und sind diesbezüglich als ein relevantes Zellmodell breit akzeptiert (Xie et al.2010). In der vorliegenden Diplomarbeit wurden mit einem adenoviralen Konstrukt generierte PINK1 knockdown SH-SY5Y Zellen (M. Klinkenberg) als ein potentielles Zellmodell für die PARK6 Form von M. Parkinson analysiert. Als Kontrolle für die PINK1- abhängigen Effekte wurden NT (non target) Zellen herangezogen. Ausschlaggebend für die Wahl dieses Zellmodells war die Beobachtung, dass die PINK1 KD SH-SY5Y Zellen bei einer Reduktion des Serumgehaltes im Medium wesentlich langsamer wachsen als die NT Zellen (M. Jendrach). Die Serumdeprivation schien also der notwendige Stressfaktor zu sein, welcher zur Auslösung eines PINK1-abhängigen Phänotyps führen könnte. Daraus ergab sich die Frage, welche anderen PINK1-abhängigen Veränderungen unter Serumentzug zur Ausprägung kommen. Im Rahmen dieser Diplomarbeit wurde zunächst die relative Genexpression der PINK1 KD SH-SY5Y Zellen in Bezug auf die NT Zellen untersucht. Es zeigte sich, dass der PINK1 KD bei reduziertem Serumgehalt zur Herunterregulation weiterer Parkinsonrelevanter Gene führt, deren Produkte an verschiedenen zellulären Prozessen beteiligt sind. Die Effekte traten nur bei stabil transfizierten Zellen auf und waren durch einen transienten PINK1 KD nicht reproduzierbar. Viele dieser Gene sind für die Aufrechterhaltung der mitochondrialen Homöostase bedeutsam und deshalb wurde die mitochondriale Funktion und Erscheinung in den PINK1 KD SH-SY5Y Zellen genauer erforscht. Im Gegensatz zu früheren Befunden (Mai et al. 2010) wurde eine Herunterregulation des für die mitochondriale Teilung zuständigen Fis1-Proteins ermittelt, darüber hinaus aber keine Änderung der mitochondrialen Morphologie auch nach induziertem Zellstress beobachtet (Dagda et al. 2009, Lutz et al. 2009). Ein Defizit in der mitochondrialen Atmung wurde festgestellt, nachdem die Zellen bei 1g/L Glucose kultiviert und für 24h auf ein Galaktose-haltiges Medium transferiert wurden. Außerdem wurde ähnlich zu Amo et. 2010 al eine leicht verminderte Energieladung der betreffenden Zellen gefunden. Keine Beeinträchtigung der mtDNA-Integrität oder der Überlebensrate bei H2O2-induziertem oxidativen Stress wurde beobachtet. Weiterhin wurde untersucht, inwiefern die in den PINK1 KD SH-SY5Y Zellen beobachteten Veränderungen in der Genexpression auf weitere Zellmodelle (PINK1 KD HeLa, kortikale Neurone aus PINK1 KO und PINK1 KO / A53T alpha Synuclein überexprimierenden Mäusen) übertragbar sind. Dabei wurden einige Gemeinsamkeiten zwischen den PINK1 KD SH-SY5Y Zellen und den PINK1 KO /A53T α Synuclein überexprimierenden kortikalen Neuronen ermittelt. Angesichts des Verlustes von dopaminergen Neuronen in M. Parkinson wäre es bedeutsam nachzuvollziehen, ob und wie die verminderte Expression Parkinson-relevanter Gene in diesen PINK1 KD Zellmodellen kompensiert wird, so dass die Zellen trotz der genetischen Einschränkung bei idealisierten in vitro Bedingungen gut überleben können. Hier ist es vorstellbar, dass zusätzlicher Zellstress die Gemeinsamkeiten zwischen den PINK1 KD SH-SY5Y Zellen und den PINK1 KO / A53T SNCA überexprimierenden Neuronen erweitern könnte. Diesbezüglich wäre es auch relevant zu erforschen, unter welchen Umständen die potentiellen Kompensationsmechanismen versagen, so dass das Zellüberleben nicht mehr gewährleistet wird. Im Licht des altersbedingten Ausbruchs der Symptome bei M. Parkinson würden diese neuen Erkenntnisse dazu beitragen, die möglichen auslösenden Faktoren zu erfassen und so ein tieferes Verständnis der molekularen Mechanismen dieser schwerwiegenden Erkrankung zu erhalten.
Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen führten zu folgenden Ergebnissen:
1. In-silico Analysen von putativen Apoptose-Faktoren im Genom von P. anserina
Es konnten mehrere Gene, die in einer Apoptose-Maschinerie involviert sein könnten, im Genom von P. anserina identifiziert werden. Diese Homologen wurden in zwei Ka-tegorien unterteilt: (i) die nicht-mitochondrialen Proteine PaMCA1, PaMCA2 und PaPARP und (ii) die Homologen des Apoptose-induzierenden Faktors AIF.
2. Einfluss der Metacaspase-Aktivität auf programmierte Zelltodprozesse
Mithilfe von Aktivitätsmessungen konnte eine Arginin-spezifische Aktivität der Meta-caspasen nachgewiesen werden. Diese Metacaspase-Aktivität nimmt in seneszenten Kulturen und nach H2O2-Behandlung signifikant zu. Diese Ergebnisse unterstützen die Hypothese eines programmierten, ROS-induzierten Zelltods im letzten Entwicklungs-stadium des Alternsmodell P. anserina.
3. Die Rolle von AIF-Homologen in der Entwicklung von P. anserina
GFP-Fusionsproteine identifizierten eine mitochondriale Lokalisation der AIF-Homologen PaAIF2, PaAMID2 und PaPRG3. Desweiteren konnte eine altersabhängige PaAIF2-Translokation von den Mitochondrien zum Zellkern gezeigt werden, ähnlich der Apoptose-induzierenden Translokation von humanem AIF. Die Deletion von PaAif2 und PaAmid2 führte zu einer signifikanten Resistenz gegenüber oxidativem Stress und zu einer Verlängerung der Lebensspanne. Diese Befunde weisen auf einen ROS-induzierten, AIF-vermittelten Zelltod hin, der an der Lebensspannen-Kontrolle von P. anserina beteiligt ist.
4. Die Funktion des Proteins PaCYPD bei Seneszenz und programmiertem Zelltod
Membranpotential-Messungen konnten einen Rückgang des mitochondrialen Memb-ranpotentials von 21 % bei den PaCYPD-Überexpressionsstämmen nachweisen. Durch die Behandlung mit dem spezifischen PaCYPD-Inhibitor CSA konnte das Membranpo-tential wieder normalisiert werden. Zusammen mit dem detektierten Verlust von
7 Zusammenfassung
125
Cytochrom c in den Mitochondrien der Überexpressionsstämme wird durch diese Studi-en die Vermutung einer PaCYPD-abhängigen Öffnung der mPTP untermauert. Die Pa-PaCypD-Deletion führte zu einer signifikanten Resistenz gegenüber mitochondrial-abhängigem, oxidativem Stress und gegenüber verschiedenen Apoptose-Induktoren. Die Überexpression von PaCypD hingegen führte zu einem beschleunigten Alterungspro-zess (Präseneszenz), einem verschlechterten Resistenzverhalten gegenüber Stress- und Apoptose-Induktoren und zu einer massiven Verkürzung der Lebensspanne. Die Le-bensspanne konnte aber durch die Behandlung mit CSA wieder auf Wildtyp-Niveau verbessert werden. Dies weist auf einen PaCYPD-vermittelte Zelltod hin. Interessan-terweise konnte durch das Wachstum auf CSA-haltigem Medium auch die Lebensspanne des Wildtyps verlängert werden. Um die hier nachgewiesene, lebensver-längernde Wirkung von CSA zu verifizieren, könnte diese Studie leicht auf andere Modellorganismen übertragen werden.
Strukturelle Organisation und Mobilisierung des Primaten-spezifischen Non-LTR-Retrotransposons SVA
(2011)
SVA-Elemente repraesentieren die juengste Familie der Non-LTR-Retrotransposons,
welche das humane Genom fortwaehrend modifizieren. SVA-Elemente zeichnen sich
durch ihre Organisation aus zusammengesetzten repetitiven Elementen aus. Um
Rueckschluesse auf den Assemblierungsprozess, der zur gegenwaertigen Organisation der
SVA-Elemente fuehrte, und ueber transkriptionelle Regulation dieser Elemente zu ziehen,
wurden Unterschiede in der Struktur der 116 SVA-Elemente, die auf humanem
Chromosom 19 lokalisiert sind, detailliert untersucht.
SVA-Elemente konnten in sieben unterschiedliche Strukturvarianten eingeteilt werden,
einschliesslich neuer Varianten wie SVA2, 3`-verkuerzte Elemente und Elemente mit 5`-
flankierenden Transduktionen. Ich habe auch eine extrem erfolgreiche human-spezifische
5`-Transduktionsgruppe identifiziert, SVA_F1, die trotz ihres jungen evolutionaeren Alters
ca. 32% aller Mitglieder der SVA-Subfamilie SVA_F umfasst. Die transkriptionelle
Kontrolle einer retrotransponierten und 5`-verkuerzten SVA_F-Kopie durch den Promotor
des MAST2-Gens diente als urspruengliches Source-Element dieser umfangreichen 5`-
Transduktionsgruppe, die mindestens 84 Elemente einschliesst. Die zusaetzlichen 5`-
sowie 3`-Transduktionsereignisse der vollstaendigen Alu-Sequenzen bei Mitgliedern der
SVA_F1-Transduktionsgruppe 4 weisen auf ihre wichtige Rolle in der erfolgreichen
Expansion im humanen Genom hin. Diese nachtraeglich erworbenen Alu-Sequenzen
machen SVA_F1-Familienmitglieder offensichtlich zum besseren Substrat fuer die Trans-
Mobilisierung durch die L1-Proteinmaschinerie. Die unterschiedlichen konsekutiven 5`-
Tansduktionsereignisse der SVA_F1-Familienmitglieder deuten auf transkriptionelle
Kontrolle ihrer Source-Elemente durch eine Vielzahl externer zellulaerer Promotoren hin,
die im Laufe der Evolution in Keimzellen aktiv waren. Ausserdem zeigt die Existenz von
5`-Transduktionen, dass SVA-Elemente sich die 5`-flankierenden Sequenzen aneignen
koennen. Die Daten zeigen auch, dass SVA-vermittelte 5-Tansduktionsereignisse
alternatives RNA-Spleissen an putativen Spleissstellen involvieren. Aus der EST-
Datenbankanalyse ist ersichtlich, dass Mitglieder der SVA_F1-Subfamilie auch
gegenwaertig transkribiert werden.
SVA-Elemente sind hoch aktiv im humanen Genom, aber der Mechanismus ihrer
Retrotransposition wurde bislang nicht aufgeklaert. Vorangehende Analysen genomischer
SVA-Kopien liessen auf eine L1-vermittelte Mobilisierung schliessen; allerdings wurde
der experimentelle Beweis dieser Hypothese bislang nicht geliefert. Mit Hilfe der
Zellkultur-basierten Trans-Mobilisierungsassays wurde in dieser Arbeit zum ersten Mal
experimentell bewiesen, dass SVA-Elemente tatsaechlich durch die L1-kodierten Proteine
in trans mobilisiert werden. Zu diesem Zweck wurden HeLa-Zellen mit einem
vollstaendigen oder mit einem 5`-verkuerzten SVA-Retrotranspositionsreporterkonstrukt
sowie mit einem L1-Expressionsplasmid bzw. Leervektor kotransfiziert und dann die
jeweiligen Raten der SVA-Retrotransposition anhand Neo-resistenter Kolonien, die
mindestens ein de novo-Retrotranspositionsereignis widerspiegeln, bestimmt. Die
Experimente zeigen, dass die Entstehung der Neo-resistenten Kolonien von der
Koexpression L1-kodierter Proteine abhaengig ist. Ich konnte auch zeigen, dass das
vollstaendige SVA-Testkonstrukt - im Gegensatz zum 5`-verkuerzten SVA-Konstrukt -
mit einer signifikant hoeheren Retrotranspositionsrate als die Kontrollkonstrukte, die zur
Generierung der prozessierten Pseudogenformation eingesetzt wurden, trans-mobilisiert
wird. Die Ergebnisse der Trans-Mobilisierungsassays belegen, dass SVA-Elemente ein
bevorzugtes Substrat fuer die L1-Proteinmaschinerie darstellen, und ihre 5`-Region
einschliesslich der Alu-homologen Sequenz fuer die hohe Retrotranspositionsrate essentiell
ist. Die elf analysierten SVA de novo-Integrationsereignisse weisen Merkmale der L1-
vermittelten Retrotransposition auf, wie Poly(A)-Enden, L1-EN-spezifische Konsensus-
Zielsequenz (NNAUNA), Zielsequenz-Verdoppelungen (TSDs), Mikrohomologien und
zusaetzliche Guanosin-Nukleotide am 5`-UEbergang.
Zusammenfassend demonstrieren die Ergebnisse dieser Studien, dass ein signifikanter Teil
der Mitglieder der human-spezifischen SVA-Subfamilie aus transkriptioneller Kontrolle
ihrer Source-Elemente durch externe Promotoren hervorgeht. Durch die in dieser Arbeit
durchgefuehrten in silico-Analysen wurde auch gezeigt, dass SVA-vermittelte 5`-
Transduktionsereignisse zur strukturellen Vielfalt der SVA-Elemente fuehren, und eine
neue Art von genomischen Umstrukturierungen darstellen, die zur Plastizitaet des
humanen Genoms beitragen. Ausserdem bestaetigen die Ergebnisse der Trans-
Mobilisierungsassays die Hypothese, dass SVA-Elemente tatsaechlich durch die L1-
kodierte Proteinmaschinerie trans-mobilisiert werden. Dabei sind Module am 5`-Ende der
SVA-Elemente fuer diesen Prozess hoechst relevant.
Die Ergebnisse der Dualen-Luciferase-Reportergen-Assays unterstuetzen die Hypothese,
dass innerhalb der SINE-R-Sequenz von SVA H19_27 cis-aktive Elemente vorhanden
sind, die auf aehnliche Weise wie die cis-aktiven Elemente innerhalb der 5`LTR von
HERV-K reguliert werden.
Ausserdem wurde in dieser Arbeit die Existenz interner reguatorischer Sequenzen
innerhalb der SVA-Sequenz bestaetigt. Mit Hilfe der Dualen-Luciferase-Reportergen-
Assays konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass SVA-Elemente cis-aktive Elemente
enthalten, die hauptsaechlich in der SINE-R-Region lokalisiert sind. Diese cis-aktiven
Elemente werden auf aehnliche Weise wie die cis-aktiven Elemente innerhalb der 5`LTR
von HERV-K reguliert. Die starke transkriptionelle Aktivitaet des vollstaendigen SVA-
Testelements und des L1RP-Promotors in den Teratokarzinom-Zelllinien bekraeftigen die
Annahme, dass haeufige SVA-Mobilisierung in Keimzellen durch die gleichzeitig
hochregulierte SVA- und L1-Transkription bedingt sein koennte.
Es konnte gezeigt werden, dass SVA-Elemente cis-aktive Elemente enthalten, die
hauptsaechlich in der SINE-R-Region lokalisiert sind, und auf aehnliche Weise wie die cis-
aktiven Elemente innerhalb der 5`LTR von HERV-K reguliert werden. Die starke
transkriptionelle Aktivitaet des vollstaendigen SVA-Testelements und des L1RP-Promotors
in Teratokarzinom-Zelllinien bestaetigen die Annahme, dass haeufige SVA-
Retrotransposition in Keimzellen durch die gleichzeitig hochregulierte SVA- und L1-
Transkription bedingt sein koennte.
Im Zuge des hessischen Wiederansiedlungsprojektes für die Europäische Sumpfschildkröte (Emys orbicularis) konnten in den Jahren 2002-2007 insgesamt 79 juvenile Sumpfschildkröten an vier Standorten (NSG „Hölle von Rockenberg“, NSG „Reinheimer Teich“, NSG „Nachtweid von Dauernheim“ und NSG „Nidderauen von Stockheim“) in Hessen ausgewildert werden. Ziel der vorliegenden Untersuchung war es, hinreichende Kenntnisse zur Biologie, Physiologie und Ökologie der ausgesetzten Jungtiere zu erhalten. Die generellen Erfolgsaussichten eines solchen Langzeitprojektes, das Verhalten der ausgesetzten Jungtiere und deren Gesundheitszustand standen hierbei im Vordergrund der Arbeit. Anhand verschiedener Methoden (direkte Beobachtung, Radiotelemetrie, Fang-Wiederfang) wurde die Ansiedlung über einen Zeitraum von fünf Jahren überwacht. Radiotelemetrische Studien sowie eine direkte Beobachtung erbrachten hierbei Informationen zur Raum- und Habitatnutzung der Jungtiere und den daraus resultierenden Lebensraumansprüchen. Durch dieses Wissen konnten weitere, sowie bereits bestehende, Wiederansiedlungsgebiete in dieser Region durch individuelle Maßnahmen optimiert werden. Des Weiteren konnte mit temperatursensitiven Messmethoden ein Überblick über das tägliche und saisonale Körpertemperaturspektrum der Art in Hessen ermittelt werden. Vor der Wiederansiedlung sowie im weiteren Verlauf der Untersuchung wurden in den jeweiligen Gebieten diverse Biotopsmaßnahmen durchgeführt. So z.B. das Ausbringen von zusätzlichen Sonnenmöglichkeiten in Form von Stämmen, das Anlegen von permanenten und temporären Flachwasserteichen, verschiedenste Biotopspflegemaßnahmen (Entschlammen, Entbuschen) und die Offenhaltung potentieller Eiablageplätze. Diese Maßnahmen zeigten im Laufe der Untersuchung nicht nur einen positiven Effekt für die Zielart Emys orbicularis, sondern auch für weitere, bestandsbedrohte Begleitarten (z.B. die Wechselkröte Bufo viridis). Die ausgesetzten Jungtiere hatten ein mittleres Alter von 3,44 ± 1,29 Jahren (2-6 Jahre) bei einer mittlere Masse von 197,1 ± 110,2 g (66-619 g) und einer mittleren Carapaxlänge von 9,91 ± 1,77 cm (6,71-14,87 cm). Alle Tiere wurden vor dem Aussetzen durch einen Mikrotransponder und eine individuelle Farbmarkierung auf dem Panzer gekennzeichnet.
Mit Hilfe der Radiotelemetrie wurden die Aufenthaltsbereiche sowie das Wanderverhalten der Sumpfschildkröten in den Gebieten NSG „Hölle von Rockenberg“, NSG „Reinheimer Teich“ und NSG „Nachtweid von Dauernheim“ dokumentiert. Zusätzlich zu den herkömmlichen Radiotelemetriesendern konnten temperatursensitive Radiotelemetriesender verwendet werden, die sowohl über den Standort des Tieres als auch seine momentane Körpertemperatur Auskunft gaben. Es wurden hierbei insgesamt 34 Telemetriesender (9 ohne, 25 mit Temperaturfunktion) für eine Besenderung von 27 Individuen verwendet. Das entspricht einer Besenderungsquote von 42,3 %. Die durchschnittliche Masse der Sumpfschildkröten bei der Erstbesenderung betrug 238,6 ± 68,2 g bei einer Carapaxlänge von 10,80 ± 1,07 cm. Um einen Überblick über das Körpertemperaturspektrum der Art in Hessen zu erhalten, wurden temperatursensitive Radiotelemetriesender und ergänzend Temperaturdatenlogger (iButtons®) verwendet. Es zeigten sich sowohl individuelle als auch stark saisonal geprägte Temperaturmuster. Erwartungsgemäß konnten die höchsten Körpertemperaturen im Sommer (bis zu 44 °C) und die niedrigsten im Winter (bis zu -0,8 °C) dokumentiert werden. Der bevorzugte Temperaturbereich von Emys orbicularis wird aufgrund der vorliegenden Daten bei 25-32 °C vermutet. Die Aktivitätsperiode von Emys orbicularis in Hessen lässt sich von Mitte/Ende März bis Mitte Oktober, mit einem Aktivitätsmaximum in den Monaten Mai und Juni, angeben. Eine Erhöhung bzw. Erniedrigung der Körpertemperatur wurde durch Verhaltensweisen, wie Sonnenbaden oder das Aufsuchen von Wasser, erreicht. Sonnenbadende Sumpfschildkröten konnten in der Zeit von 07:15 bis 19:45 Uhr direkt beobachtet werden, die Hauptsonnenaktivität lag zwischen 09:00-15:00 Uhr. Hierbei konnte eine Tagesrhythmik des Sonnenbadens dokumentiert werden, die im Normalfall einen einphasigen Verlauf hatte. Die Schildkröten erschienen im Laufe des Vormittags auf dem Sonnenplatz und verblieben dort, unterbrochen von kurzzeitigem Aufsuchen des Wassers, bis in den Nachmittag hinein. Die bevorzugten Aufenthaltsbereiche und Strukturen unterlagen sowohl saisonalen als auch individuellen Präferenzen. Die Tiere nutzten zu 69,9 % Baumstämme als Sonnenplatz. Es wurden sowohl größere als auch kleinere Gewässer als Aufenthaltsbereich genutzt. Charakteristisch waren hier vor allem ausgedehnte Unterwasser- und Schwimmblatt-Gesellschaften in den Randbereichen, wie z.B. die „Untergetauchte Laichkrautgesellschaft“.
Die Störanfälligkeit der beobachteten Sumpfschildkröten war sehr stark individuell ausgeprägt. Es konnte aber auch beobachtet werden, dass Tiere, die gerade das Wasser verließen, und noch nicht getrocknet waren, schneller auf eine Störung reagierten, als Tiere, die schon vollständig getrocknet waren. Es ist anzunehmen, dass dieses Verhalten mit der Thermoregulation der Tiere in Zusammenhang steht. Die besenderten Tiere verblieben in den Aussetzgebieten und es konnten nur geringe Wanderbewegungen (bis max. 250 m) notiert werden. Der hierbei ermittelte Aktionsraum („home range“) variierte sowohl individuell als auch in den einzelnen Gebieten. So konnte in dem kleineren Gebiet „Hölle von Rockenberg“ (13 ha) eine zehnmal geringere Aktionsraumgröße notiert werden als in dem weitaus größeren Gebiet „Reinheimer Teich“ (75 ha). Sie betrug in Rockenberg 0,21 ± 0,03 ha (0,19 bis 0,32 ha) und in Reinheim 2,00 ± 1,58 ha (0,24 ha bis 4,71 ha). In der Phase der Überwinterung konnte keinerlei Mortalität dokumentiert werden. Als Überwinterungsplatz nutzten die Tiere in der Regel schilfbewachsene Uferbereiche mit einer Wassertiefe von 50 cm. Im Gebiet „Hölle von Rockenberg“ konnten einige Tiere mehrmalig in der Überwinterung beobachtet werden und es zeigten sich hierbei individuelle Standortpräferenzen. Die Überwinterungsplätze wurden zu 50 % wiederholt aufgesucht. In den Wintermonaten Dezember-Februar betrug die mittlere Körpertemperatur 3,09 ± 1,59 °C. Die verwendeten Fangmethoden (Sonnenfalle, Reusenfalle, Handfang) konnten nur im Gebiet „Hölle von Rockenberg“ erfolgreich eingesetzt werden. Im Gebiet „Reinheimer Teich“ konnte nur einmalig eine Schildkröte wiedergefangen werden. Die wiederangesiedelten Tiere nahmen sowohl an Masse als auch an Größe zu. Die durchschnittliche Massenzunahme betrug im Gebiet „Hölle von Rockenberg“ 40,33 ± 7,20 g (29,38-48,40 g) bei einem Wachstum des Carapax von 0,61 ± 0,08 cm (0,52-0,75 cm). Es konnten keinerlei Krankheiten oder Verhaltensauffälligkeiten dokumentiert werden. Im gesamten Untersuchungszeitraum wurde nur einmalig der Verlust eines Tieres detektiert.
Diese Massen- und Größenzunahmen sowie die Überlebensrate sprechen für die verwendeten Aufzuchtsmethoden und die ausgewählten Wiederansiedlungsgebiete. Es zeigt, dass sich die Methode des „headstarting“ bei Emys orbicularis sehr gut eignet und kann somit für solche Wiederansiedlungsprojekte durchaus empfohlen werden. Eine Stützung der Bestände durch das Auswildern „headstarted“ Emys orbicularis (aufgezogenen unter den hier vorgestellten Bedingungen) wird daher für weitere Projekte empfohlen Basierend auf den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit lassen sich die Lebensraumansprüche der Art in Hessen benennen. Ausgehend von diesen speziellen Ansprüchen lässt sich ein optimales Emys orbicularis Habitat (für nördliche Vertreter der Art) definieren.
Zusammenfassende Grundlagen eines idealen Emys orbicularis Habitats:
- begleitendes (natürliches) Fließgewässer
- ausreichend Kleingewässer, auch als Trittsteine zum Fließgewässer
- mind. ein großes Hauptgewässer (mind. 2000 m2) mit einer Tiefe von mind. 1,50 m
- flach abfallendes Gewässerprofil mit sich schnell erwärmenden Flachwasserzonen
- ausreichend Wasser-/Unterwasservegetation
- ausreichend, ganztägig besonnte Sonnenplätze in Form von ins Wasser ragenden Stämmen und Ästen
- breiter, südexponierter Schilfgürtel zur Überwinterung
- geringer Fischbesatz zur Sicherung der Nahrungsgrundlage (Konkurrenz)
- möglichst keine fremdländischen Schildkröten (Konkurrenz)
- südexponierte, xerotherme offene Hanglage mit Magerrasencharakter zur Eiablage (im Bedarfsfall sichergestellt durch Beweidung und/oder Mahd) - keinerlei oder nur eingeschränkte freizeitliche Nutzung in Randbereichen - keine Zerschneidung der Gewässer und Wanderwege durch Straßen.
Die vorliegende Arbeit bestätigt den bisher getätigten Bemühungen zum Schutz der Europäischen Sumpfschildkröte gute Erfolgsaussichten für eine weitere Etablierung der Art in Hessen. Da die untersuchten Tiere noch nicht geschlechtsreif waren und somit noch keine Reproduktion im Freiland dokumentiert werden konnte, lässt sich der langfristige Erfolg noch nicht abschließend beurteilen. Aufgrund der bisher getätigten Untersuchungen lässt sich ein Reproduktionserfolg aber in den nächsten Jahren vermuten. Ein wichtiger Schritt zum Schutz der Europäischen Sumpfschildkröte in Hessen ist mit dem hier vorgestellten Projekt und den verwendeten Aufzuchts- und Wiederansiedlungsmethoden getan.
Die aktuellen HIV Medikamente basieren sich zum größten Teil auf Substanzen, die gegen virale Proteine gerichtet sind. Ein großer Nachteil dieser Medikamente besteht darin, dass das HI-Virus durch Mutationen Resistenzen gegen diese Substanzen entwickeln kann. Zelluläre Co-Faktoren als antivirales Ziel in der HIV-Therapie zu nutzen, könnte ein neuer Lösungsansatz sein, da das menschliche Genom stabiler ist als das virale. Der Schwerpunkt dieser Arbeit konzentriert sich auf die RNA Helikase DDX3, welche als zellulärer Co-Faktor für die HIV-1 Replikation identifiziert wurde.
Im Rahmen der Dissertation wurde die RNA-Helikase DDX3 durch biochemische Untersuchungen von DDX3Wt und DDX3-Mutanten näher charakterisiert. Die Versuche zeigten, dass die konservierten Motive V und VI bei DDX3Wt für die Bindung und Hydrolyse von ATP essentiell sind. Die spezifische DDX3 Insertion wies ebenfalls eine mutmaßliche Rolle bei der ATP-Bindung und bei Ausbildung der ATP-Bindestelle auf. Ferner konnte für die spezifische Insertion von DDX3 eine Funktion bei der Bindung von viraler RNA Bindungsnachweise nachgewiesen werden. Daher bietet diese Insertion von DDX3 ein mögliches Ziel für die spezifische Modulation bzw. Manipulation der Interaktion von DDX3Wt und viralen Interaktionspartnern sein, ohne weitere RNA Helikasen zu beeinflussen.
Zusätzlich wurden weitere Eigenschaften von DDX3Wt entdeckt. Die ATPase-Aktivität von DDX3Wt konnte durch die Zugabe von ssDNA deutlicher stimuliert werden, als durch die Zugabe ssRNA. Das DDX3Wt eine höhere katalytische Effizienz durch DNA aufweist ist neu, da die meisten DEAD-box Helikasen eine Präferenz für RNA als Co-Faktor für die ATPase-Aktivität besitzen. Des Weiteren konnte erstmalig nachgewiesen werden, dass DDX3 neben der ATPase-Aktivität auch eine Exonuklease-Aktivität besitzt. Die Versuche zeigten, dass DDX3Wt in der Lage war, ssDNA und dsDNA effizient zu spalten. In der DDX3Wt AS-Sequenz wurden fünf Aminosäuresequenz-Motive, sogenannte Exonuklease-Boxen identifiziert, die mit der Exonukleaseaktivität in Verbindung gebracht werden. Die Untersuchung der Bindungseigenschaften von DDX3Wt zeigte auf, dass DDX3Wt auch ohne den zellulären Co-Faktor XPO1 in der Lage ist, virale HIV-1 RNA und DNA direkt zu binden. Diese Erkenntnisse tragen dazu bei, die Funktionen von DDX3Wt im zellulären System besser zu verstehen. Eine genaue Analyse ist Voraussetzung für die Entwicklung von spezifischen Inhibitoren, die die Interaktion von HIV-1 und DDX3Wt hemmen sollen ohne dabei zelluläre Prozesse negativ zu beeinflussen.
Durch Lokalisationsstudien konnte ein neuer relevanter Angriffspunkt für die Inhibition der HIV-1 Replikation identifiziert werden. Denn entgegen den Literaturangaben spielt das putative Leucin-reiche Exportsignal im N-Terminus von DDX3Wt eine wichtige Rolle beim Export aus dem Zellkern und somit auch für die Interaktion mit XPO1.
Mithilfe der Phagen-Display-Technologie konnte im Rahmen dieser Arbeit ein Sequenz-spezifischer Peptid-Ligand für die Insertion von DDX3 identifiziert werden, der eine Aminosäurehomologie zu dem zellulären Co-Faktor XPO1 zeigt. Das identifizierte Peptid DDX3-INS1 wurde für weitere Untersuchungen in Verbindung mit einer Proteintransduktionsdomäne synthetisiert. Das Peptid DDX3-INS1 ist in HIV-1 infizierten Zellen funktionell aktiv und inhibiert die Produktion von HI-Viren ab einer Konzentration von 20 µM ohne dabei toxische oder virolytische Effekte auszuüben. Weitere funktionelle Untersuchungen werden zeigen, ob das selektionierte Peptid DDX3-INS1 als therapeutisches Medikament für die Inhibition von HIV-1 geeignet ist.
Das maligne Gliom, auch Glioblastom multiforme (GBM) genannt, ist der häufigste und gleichzeitig auch bösartigste hirneigene Tumor und macht rund 2% aller Krebsneuerkrankungen aus. Die Weltgesundheitsorganisation (world health organisation, WHO) stuft das GBM als Grad IV Tumor ein, was es als hochmalignen Tumor auszeichnet der infiltrativ in das umliegende Hirnparenchym einwandert und mit den gegenwärtigen Behandlungsmethoden, bestehend aus Resektion des Tumors, Chemotherapie und Strahlentherapie nicht kuriert werden kann. Das aggressive Wachstum und die ausgeprägte Resistenz dieses astrozytären Tumors gegenüber den verfügbaren Therapien der Bestrahlung und Chemotherapie sind Hauptgründe für die schlechte Prognose für Patienten mit Glioblastomen, deren medianes Überleben immer noch unter der Zwei-Jahres-Grenze liegt. Daher ist es von Nöten neue therapeutische Strategien auf Grundlage der Chemotherapie zu entwickeln, die selektiv wichtige, deregulierte Signalwege der Krebszelle angreifen. Einer dieser Signalwege in Gliomen ist der Stat3-Signalweg (signal transducer and activator of transcription). Stat3, ein latenter zytoplasmatischer Transkriptionsfaktor liegt in Gliomen oftmals konstitutiv aktiv vor. Diese Deregulation des Signalweges führt zur dauerhaften Transkription proonkogener Zielgene die in transformierten Zellen zu Proliferation, Apoptoseresistenz, Neoangiogenese und Immunsupprimierung führen können. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, inwiefern eine pharmakologische oder gentechnische Inhibierung von Stat3 molekulare und zelluläre Charakteristika von Gliomen beeinflusst. Dazu wurde für die in-vivo Versuche ein syngenes, murines Gliom-Transplantationsmodell verwendet dessen Pathologie der eines humanen Glioms gleicht und den Vorteil besitzt keine immunsupprimierten Tiere verwenden zu müssen. Die murinen Gliomzelllinien, gewonnen aus spontanen Gliomen von GFAP-v-Src überexprimierenden Mäusen, wurden vorher in-vitro und auch exvivo bezüglich ihres Verhaltens auf die pharmakologische oder gentechnische Inhibierung von Stat3 charakterisiert. Für die pharmakologische Inhibierung wurde Kurkumin gewählt, der biologische aktive Wirkstoff der Pflanze Curcuma longa. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine Behandlung mit Kurkumin konzentrationsabhängig die Phosphorylierung von Stat3 in drei murinen Gliomzelllinien hemmt. Des Weiteren zeigte sich, dass auch die Proliferation der untersuchten transformierten Zellen sowie ihre Fähigkeit zur Invasion und Migration konzentrationsabhängig durch den Einsatz von Kurkumin inhibiert werden konnte, ohne dabei allerdings die Proliferation von primären Astrozyten im gleichen Maße zu hemmen. Kurkumin induziert zusätzlich in den überaus aopotoseresistenten Gliomzellen einen G2/M Zellzyklusarrest. Diese beobachteten Effekte stehen im Zusammenhang mit der konzentrationsabhängigen transkriptionellen Beeinflussung Kurkumins der tumorpromotenden Stat3- Zielgene. Durch Einsatz einer Stat3-Mutante, Stat3C, die ohne Phosphorylierung konstitutiv aktiv in der Zelle vorliegt, konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass Kurkumin seinen Einfluss auf die Invasion und Migration der murinen Gliomzelllinien auch über den Stat3-Signalweg vermittelt, zeigte sich, dass durch Einbringung dieser Mutante trotz Kurkuminbehandlung die Migrations- und Invasionsfähigkeit partiell retabliert werden konnte. Durch dietätische Gabe von Kurkumin konnte in tumortragenden Mäusen gezeigt werden, dass die invitro ermittelten Effekte an einem längeren Überleben jener Mäuse beteiligt waren, deren Futter das Kurkumin enthielt. Die Administration des Kurkumins wurde entsprechend einer für die Klinik bevorzugten Darreichugsform gewählt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde Stat3 in den murinen Gliomzelllinien durch Transduktion mit shRNA gerichtet gegen die Stat3-mRNA stabil depletiert um im Folgenden untersuchen zu können, welche zellulären und molekularen Konsequenzen konstitutiv aktives Stat3 für die Gliomzellen hat. Es zeigte sich, dass der Wegfall von Stat3 das Migrations- und Invasionspotential signifikant verringerte und die Expression tumorfördernder Zielgene ebenfalls in den Stat3-defizienten Zellen auf Protein- und mRNA-Ebene signifikant reduziert war. Der Einfluss von Stat3 auf die Hif1α-Expression, ein Transkriptionsfaktor der die Anpassung der Gliomzellen an ein hypoxisches Milieu und damit verbunden auch Migration und Invasion induziert kann, macht deutlich, dass konstitutiv aktives Stat3 unter normoxischen sowie auch hypoxischen Bedingungen upstream entscheidender Transkriptionsfaktoren liegt und sich somit als Zielmolekül für eine therapeutische Intervention anbietet. Eine ex-vivo Applikation auf organotypischen Schnittkulturen zeigte, dass durch den Wegfall von Stat3 in den murinen Gliomzellen die Einzelzellinvasion unterbunden werden konnte was entscheidend für das klinisch hochrelevante Problem der Rezidive sein könnte. Transplantierte man nun Kontroll- und Stat3-defiziente Zellen orthotrop in die immunkompetenten Mäuse zeigte die Kaplan-Meier-Kurve, dass der Krankheitsbeginn so wie das mediane Überleben in den Mäusen mit Stat3-defizientem Tumor zeitlich deutlich nach hinten verschoben war. Neben den invitro und ex-vivo ermittelten Effekte des Stat3-Wegfalls ist anzunehmen, dass das verlängerte Überleben dieser Mäuse auch mit der fehlenden Immunsupprimierung der Stat3-defizienten Tumore zusammenhängt. Es zeigte sich, dass eine Intervention gegen Stat3, ob nun pharmakologisch oder gentechnisch, die malignen Charakteristika des Glioblastoms positiv beeinflussen kann. Stat3, bestätigt als onkogener Transkriptionsfaktor, stellt damit eine lohnenden Zielstruktur in Gliomen dar.
Die Diatomee C. meneghiniana reagiert sowohl auf Veränderung der Lichtintensität während des Wachstums, als auch auf Veränderungen der Eisenkonzentration im Medium. Die Erhöhung der Lichtintensität respektive die Erniedrigung der Eisenkonzentration im Medium wurden als Stresssituationen für C. meneghiniana definiert. Unter Stressbedingungen findet zunächst eine generelle Erhöhung der Zellzahl statt, wobei das Volumen der einzelnen Zellen unter Eisenmangelbedingungen stark reduziert wird. Aus diesem Grund findet man schließlich unabhängig von der Lichtintensität in den Eisenmangelkulturen niedrigere Werte für die Biovolumina als in den Kulturen mit Eisensättigung.
Es konnten je nach Kulturbedingung kleine Unterschiede in der äußeren Morphologie der Silikatschalen festgestellt werden, die sich jedoch im Rahmen der normalen Variationsbreite bewegen und daher nicht signifikant sind. In allen Kulturen konnten auf Grund der schonenden Präparationsmethode die für C. meneghiniana als typisch beschriebenen Schwebfäden aus Chitin beobachtet werden.
Die Größe der Phäoplasten ist in den Eisenmangelkulturen und in de Starklichtkulturen deutlich geringer, weshalb auch die Anzahl der Thylakoidbänder sinkt. Die für Diatomeen typische Dreifachbänderung der Thylakoide bleibt jedoch immer erhalten. Zudem zeigen die Phäoplasten der LL 12 – und HL 12 – Zellen Ansammlungen eines Stoffs, der zwar nicht näher identifiziert wurde, wobei es sich aber höchstwahrscheinlich weder um Lipid-Globuli noch um das als Speicherstoff bei Diatomeen vorkommende -1,3-Glucan Chrysolaminarin handelt.
Die Färbung der Kulturen zeigt bereits eine Veränderung in der Pigmentierung der Zellen in Abhängigkeit von der Kulturbedingung. Der Chlorophyllgehalt pro Zellen wird vor allem unter Eisenmangel reduziert, während es in Zellen der HL – Kulturen zu einer Verdoppellung des Gehalts an XC – Pigmenten kommt. Die Kombination beider Effekte führt dazu, dass die HL 12 und der LL 1 – Kultur gleichermaßen hellbraun gefärbt sind, die Färbung der HL 1 – Kultur jedoch beinahe gelb ist. Die hellere Färbung der Eisenmangelkulturen ist wahrscheinlich als Chlorose anzusehen und eine klassische Folge von Eisenmangel bei Diatomeen. Die zugehörigen DEORs der ganzen Zellen sind in den HL – Kulturen anfangs sehr hoch und sinken später.
Die Ursache ist vermutlich in der hohen Lichtintensität und der durch Erhöhung der Zellzahl im Verlauf der Anzucht entstehenden gegenseitigen Beschattung der Zellen zu sehen. Hierfür spricht auch die parallel stattfindende Abnahme der XC – Pigmente – Konzentration.
Die Ermittlung der PS I : PS II – Stöchiometrien zeigt, dass sich offenbar auch die innere Architektur der Thylakoidmembran verändert. So liegt das relative, berechnete Verhältnis von PS II zu PS I nur in der LL 12 – und der HL 1 – Kultur bei 2 : 1. Dieses Verhältnis wird üblicherweise für küstennahe unter den den Anzuchtbedingungen vergleichbaren Lichtverhältnissen lebende Spezies angenommen. Die HL 12 - und die LL 1 – Zellen hingegen weisen ein Verhältnis von 1 : 1 auf. Da es nicht möglich ist, die Veränderung in beiden Kulturen entweder mit Eisenmangel oder Starklichtstress zu erklären, muss hier von unterschiedlichen Ursachen ausgegangen werden.
Die Reoxidationskinetiken weisen darauf hin, dass die Übertragung der Energie von QA an QB je nach Kultur unterschiedlich schnellen Kinetiken folgt. Dies ist wiederum durch die Bindungsart des QB, bzw. seine Verfügbarkeit als Akzeptor bedingt.
In den O-J-I-P-Messungen zeigt sich zunächst, dass die F0 – Werte der Eisenmangelkulturen niedriger liegen. Als Ursache hierfür wird eine Verkleinerung der Antenne des PS II, die sich durch den unter Eisenmangel deutlich erniedrigten Chlorophyllgehalt pro Zelle erklären lässt, und die dadurch bedingte Verringerung der Fluoreszenz angenommen. Deutlich ist zudem, dass die Energie in den HL – Kulturen deutlich schlechter von QA an QB weitergegeben wird, weshalb auch die daraus resultierenden Fv/FM – Werte deutlich niedriger sind. Als Erklärung hierfür kommt der unter HL stark erhöhte XC – Pool in Frage, der bekanntermaßen am nichtphotochemischen Quenching beteiligt ist, das wiederum vor allem unter Lichtstress auftritt.
Mittels Anionenaustauscherchromatografie ist es möglich in den Thylakoiden der Zellen jeder Kulturbedingung mindestens fünf unterscheidbare Fraktionen zu isolieren. Fraktion I enthält ungebundenes Protein und Pigment, Fraktion II, die in bis zu drei Fraktionen untergliedert sein kann, enthält PS I, Fraktion III entspricht dem FCPa, Fraktion IV enthält ebenfalls ein Photosystem, wobei es sich hier um das bislang aus C. meneghiniana noch nicht isolierte PS II handeln könnte, und Fraktion V entspricht dem FCPb. Es fällt auf, dass die Größe der Fläche unter der 437 nm –Mittels Anionenaustauscherchromatografie ist es möglich in den Thylakoiden der Zellen jeder Kulturbedingung mindestens fünf unterscheidbare Fraktionen zu isolieren. Fraktion I enthält ungebundenes Protein und Pigment, Fraktion II, die in bis zu drei Fraktionen untergliedert sein kann, enthält PS I, Fraktion III entspricht dem FCPa, Fraktion IV enthält ebenfalls ein Photosystem, wobei es sich hier um das bislang aus C. meneghiniana noch nicht isolierte PS II handeln könnte, und Fraktion V entspricht dem FCPb. Es fällt auf, dass die Größe der Fläche unter der 437 nm – Absorption bei, Fraktion II und IV mit der Auswertung der Slotblotsignale für die Photosysteme korreliert.
Die endgültige Aufreinigung der FCPs wurde letztlich mit diskontinuierlichen Saccharosegradienten durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass alle FCP – Fraktionen nach der Anionenaustauscherchromatografie einen mehr oder weniger großen Anteil an Verunreinigungen durch Photosysteme enthalten, die auf diese Weise abgetrennt werden konnten.
Die Kulturbedingungen haben zwar keinen Einfluss auf den Oligomerisierungsgrad von FCPa, bzw. FCPb, allerdings konnten Unterschiede in der Stabilität der Komplexe festgestellt werden. FCPa scheint unter LL weniger stabil zu sein, während der FCPb unter Eisenmangelbedingungen einen Teil seiner Stabilität einbüßt. Weiterhin kann in der Gelfiltration des FCPa kann nur eine Schulter beobachtet werden und im FCPb sieht man teilweise sogar zwei Schultern. Da sich die Schulter mit der längeren Retentionszeit auf Höhe der Monomerschulter des FCPa befindet, und die Retentionszeit der anderen Schulter beinahe der des FCPa-Trimers entspricht, könnte dies die Hypothese unterstützen, dass der FCPb ebenfalls aus Trimeren aufgebaut ist. Kleine Verschiebungen in der Retentionszeit wären durch das unterschiedliche Molekulargewicht der Monomere erklärbar.
Die SDS – PAGE zeigt zunächst keine Veränderungen in der Zusammensetzung der FCPs unterschiedlicher Kulturbedingungen. Einzig die beiden HL –FCPb – Proben weisen eine hochmolekulare Bande bei ca. 62 kDa auf, die nicht näher identifiziert werden konnte. Auf Grund der Größe kann jedoch ausgeschlossen werden, dass es sich um Kopurifikation des unter Eisenstress bei Diatomeen häufig als Ersatz für Ferredoxin vorkommenden Flavodoxins oder einen Eisentransporter handelt. Die Inkubation mit spezifischen Antikörpern gegen einzelne fcp – Proteine zeigt, dass die 18 kDa – Bande des FCPa fcp2 enthält und die 19 kDa – Bande fcp6. Die 19 kDa – Bande des FCPb reagiert jedoch nicht mit dem fcp6 – Antikörper. Da aus C. cryptica nur noch zwei weitere fcp – Proteine mit einem ungefähren Molekulargewicht von 19 kDa bekannt sind und fcp7 auf Aminosäureniveau eine sehr hohe Ähnlichkeit mit dem fcp6 aufweist, kann man vermuten, dass es das entsprechende Protein im FCPb der fcp5 ist.
Prion-Erkrankungen sind neurodegenerative Erkrankungen, die durch die Fehlfaltung des zellulären Prion Proteins (PrPC) in seine pathogene Isoform PrPSc verursacht werden. Welche zellulären Mechanismen an dieser Fehlfaltung oder der Pathogenese beteiligt sind, ist bis heute nur teilweise geklärt. Einerseits wird vermutet, dass z.B. eine toxische cytosolische Form des PrPC aufgrund einer Störung des Proteasoms akkumulieren könnte und spontan in PrPSc umgewandelt wird. Andererseits konnte gezeigt werden, dass viele Signalwege, wie die MAPK-Signalwege am Prozess der Neurodegeneration beteiligt sein könnten.
Ziel dieser Arbeit war daher zum einen die Untersuchung der morphologischen Veränderung einer Zelllinie, die cytosolisches PrP exprimiert, und zum anderen die Identifikation weiterer Signalwege, die an der Prionpathogenese beteiligt sein könnten, was mittels Analysen des (Phospho)proteoms Prion-infizierter Zellen und Mäusegehirne durchgeführt werden sollte.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurden murine Neuroblastoma Zellen charakterisiert, die eine cytosolische Form des Prion Proteins (CyPrP) exprimierten. Diese Zellen zeigten zwar keine cytotoxischen Merkmale, jedoch wiesen sie dramatische morphologische Veränderungen auf. Weiterhin wurde herausgefunden, dass diese Zellen vermutlich eine Isoform des cytosolischen PrP (CyPrPmod) exprimierten, die sowohl glykosyliert als auch auf der Zelloberfläche verankert war und somit Eigenschaften des Volllängen-PrP aufwies. Die Glykosylierung des CyPrPs wurde in Western Blots nachgewiesen, während die Verankerung des CyPrPs in der Plasmamembran anhand der Durchflusszytometrie untersucht wurde. Der vermutete Zusammenhang zwischen der CyPrPmod-Expression und der morphologischen Veränderung der Zellen wurde mittels Herunterregulation von CyPrP untersucht. Jedoch resultierte dies nicht in der erwarteten Reversion der morphologischen Effekte. Die Wiederholung der stabilen Transfektion in den parentalen N2a Zellen und anderen Zelllinien führte außerdem weder zu einer veränderten Morphologie noch zur Expression von CyPrPmod. Somit sind diese Veränderungen auf unspezifische Prozesse während der ersten stabilen Transfektion der N2a Zellen mit CyPrP zurückzuführen.
Um neue Therapien oder Biomarker bei Prion-Erkrankungen zu entwickeln, ist die Untersuchung von Signalwegen, die die Prionpathogenese beeinflussen können, wichtig. Oft werden zelluläre Signalwege über die Phosphorylierung von Proteinen gesteuert, allerdings gab es bisher in der Prionenforschung keine Untersuchungen des Phosphoproteoms von Prion-infizierten Zellen in vivo oder in vitro. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde daher das Phosphoproteom eines Prionen-replizierenden Zellkultursystems näher untersucht. In einer SILAC-Analyse von nicht infizierten und Prion-infizierten Zellen wurden über 100 Phosphoproteine identifiziert und quantifiziert, von denen drei in Western Blots validiert wurden. Die Phosphorylierung von Stathmin und Cdc2 an spezifischen Phosphorylierungsstellen war in den Prion-infizerten Zellen vermindert, während Cofilin eine erhöhte Phosphorylierung aufwies. Diese Proteine sind an der Regulation des Zellzyklus und des Zytoskeletts beteiligt und könnten eine Rolle in der Prionpathogenese spielen. Außerdem wurde nach 2D-Analysen des Proteoms Prion-infizierter Mäusegehirne eine Hochregulation des antioxidativen Proteins Peroxiredoxin 6 (PRDX6) festgestellt. Auch im Prionen-replizierenden Zellkultursystem konnte dieses Protein in erhöhten Mengen nachgewiesen werden. Experimente zur Unterdrückung bzw. Überexpression von PRDX6 ergaben, dass seine Phospholipase A2-Aktivität Signalkaskaden beeinflussen könnte, die vermutlich die Expression von PrPC und somit die Prion-Replikation regulieren können. Weitere Untersuchungen der PRDX6-abhängigen Signalwege in der Prionpathogenese sowie Inokulationen PRDX6-defizienter Mäuse mit Prionen, könnten erste Ansätze für die Entwicklung neuer Therapien bei Prion-Erkrankungen sein.
Die noradrenergen Neurone der sympathischen Ganglien und die cholinergen Neurone der parasympathischen Ziliarganglien gehen aus den NLZ hervor. BMP-Signale induzieren die Differenzierung beider Neuronentypen, die mit der Expression von Ascl1 und Phox2a/b beginnt. Im Fall der sympathischen Ganglien werden dann Hand2 und GATA2/3 exprimiert, was wiederum zur Expression der noradrenergen Marker TH und DBH führt, die auch in differenzierten Neuronen weiterhin vorhanden sind. Im Gegensatz dazu werden während der Entwicklung der parasympathischen Ziliarneurone sowohl Hand2 als auch TH/DBH nur transient exprimiert, die differenzierten Neurone besitzen zum Großteil einen cholinergen Phänotyp (Goridis und Rohrer, 2002; Müller und Rohrer, 2002).
Thema dieser Arbeit war die Untersuchung der Rolle der Hox-Gene bei der Differenzierung des PNS. 14 der analysierten Hox-Gene werden in den sympathischen Ganglien exprimiert, wobei wir uns bei der näheren Analyse auf das HoxB-Cluster beschränkt haben. HoxB5, HoxB6, HoxB7, HoxB8 und HoxB9 werden zwischen E4 und E7 in den sympathischen und sensorischen Ganglien exprimiert, wobei nur HoxB8 und HoxB9 eine deutliche Expression in den sympathischen Ganglien zeigen. Die HoxB-Gene könnten dem Expressionsmuster nach also eine Rolle bei der frühen Entwicklung und auch bei der Aufrechterhaltung des noradrenergen Phänotyps der sympathischen Ganglien spielen.
Die differenzielle Expression der HoxB-Gene in den sympathischen Neuronen und den Ziliarneuronen und ihre mögliche Beteiligung bei der Aufrechterhaltung des noradrenergen Charakters waren Ausgangspunkt für die ektopische Expression eines Vertreters des HoxB-Clusters, HoxB8, in den Ziliarganglien. In der Normalentwicklung wird die Expression von Hand2, TH und DBH nach E4 in den Ziliarneuronen stark reduziert (Abb. 22A). Wird HoxB8 in den Vorläuferzellen der Ziliarneurone in vivo überexprimiert, wird die Hand2-, TH- und DBH-Expression weit über E4 hinaus, bis mindestens E8 auf einem signifikant höheren Niveau gehalten (Abb. 22B). HoxB8 kann diesen Effekt allerdings nur ausüben, wenn es in den noch undifferenzierten Vorläuferzellen exprimiert wird. Die HoxB8-Überexpression in Primärkulturen von Ziliarneuronen an E5 oder E8 führt nur noch zu einem Anstieg der Hand2-Expression, hat aber keinen Einfluss mehr auf die noradrenerge Genexpression (Abb. 22B).
HoxB8 zeigt zusätzlich im Vergleich mit den anderen analysierten Hox-Genen einen spezifischen Effekt auf die Hand2-, TH- und DBH-Expression, denn sowohl das paraloge Hox-Gen HoxC8 als auch das anterior-exprimierte HoxB-Gen HoxB1 erreichen nur an E5 eine signifikante Expression der drei Gene. Weder HoxC8 noch HoxB1 können die Expression von Hand2 und TH/DBH über E5 hinaus aufrechterhalten (Abb. 22C), während HoxB8 deren Expression auch noch an E8 auf einem hohen Niveau halten kann.
Die HoxB8-vermittelte Aufrechterhaltung der TH- und DBH-Expression in den Ziliarneuronen konnte allerdings nicht in einen direkten Zusammenhang mit der erhöhten Hand2-Expression gebracht werden, da die Überexpression von Hand2 nicht zu einer Aufrechterhaltung von TH und DBH an E5 und E6 führt (Abb. 22C).
Die Effekte von HoxB8 auf die Entwicklung der Ziliarneurone, die durch HoxB8 z.T. noradrenerge, sympathische Eigenschaften annehmen, unterstützen die Vorstellung, dass HoxB8 bei der Differenzierung und Ausbildung des noradrenergen Phänotyps in sympathischen Ganglien eine Rolle spielt. Es konnte also erstmals einem Vertreter der Hox-Gen-Familie eine mögliche Funktion bei der Differenzierung autonomer Neurone zugeordnet werden.
1. Das Genom von A. woodii konnte sequenziert und annotiert werden. Der Organismus besitzt ein Chromosom von 4050521 Bp und keine Plasmide. Es sind 3495 ORFs kodiert. 2. Die Gene, die die Enzyme des Wood-Ljungdahl-Weges kodieren, konnten identifiziert werden. Sie sind hauptsächlich in drei Clustern organisiert, wobei für Cluster II gezeigt werden konnte, dass es ein Operon bildet und dort ungewöhnlicherweise ein RnfC-ähnliches Protein kodiert ist. 3. Gene für Proteine der Hexose-Verwertung konnten ebenfalls identifiziert werden. A. woodii besitzt sowohl PTS-Systeme als auch einen Na+/Zucker-Symporter zur Aufnahme von Hexosen. Die Enzyme der Glykolyse sind vollständig im Genom vorhanden und liegen im gesamten Genom verstreut vor. 4. Neben den Genen für die bereits charakterisierte Hydrogenase existieren im Genom weitere Gene, die potentielle Hydrogenasen oder Untereinheiten dieser kodieren. 5. Lange wurde für Methyltransferasen in A. woodii vermutet, dass es sich um energiekonservierende Enzyme handelt. Die Genomsequenz zeigte, dass das Genom Gene für 20 Methyltransferasen 1, 10 Methyltransferasen 2 und 22 Corrinoid-Proteine enthält. Die Methyltransferase und das Corrinoid-Protein des Wood-Ljungdahl-Weges konnten identifiziert werden. Allerdings konnte für keines der korrespondierenden Proteine eine Membranständigkeit vorhergesagt werden, was eine Beteiligung der Methyltransferasen an der Energiekonservierung ausschließt. Die Vielzahl der Methyltransferasen passt aber zu der Vielzahl von methylierten Verbindungen, die der Organismus verstoffwechseln kann. 6. Neben den gut charakterisierten etf-Genen aus dem car-Operon, das bei der Caffeat-Reduktion eine wichtige Rolle spielt, gibt es ein weiteres etf-Paar, welches mit den Genen für eine Laktat-Dehydrogenase und eine Laktat-Permease kolokalisiert ist. Welche Rolle die Proteine spielen bleibt noch aufzuklären. 7. Außer den Genen für die gut charakterisierte F1F0-ATP-Synthase finden sich Gene für eine V-Typ ATPase. Diese Gene bilden ein Operon. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass die Untereinheit VatA auch produziert wird. Die physiologische Rolle konnte allerdings noch nicht geklärt werden. 8. Basierend auf den genomischen Daten konnte ein Modell des Flagellums erstellt werden. Desweiteren wurde eine Vielzahl von Genen für chemotaktische Proteine identifiziert. Zur Verarbeitung von Umweltsignalen besitzt A. woodii Komponenten des Che-Systems, die zum einen aus E. coli und zum anderen aus B. subtilis bekannt sind. 9. In Proteomanalysen konnte festgestellt werden, dass die Enzyme des Wood- Ljungdahl-Weges beim Wachstum auf H2 + CO2 im Vergleich zum Wachstum auf Fruktose induziert werden, die Enzyme der Glykolyse werden dagegen reprimiert. Desweiteren ist die Hydrogenase (HydAB) auf H2 + CO2 induziert. Das am stärksten induzierte Protein ist eine Alanin-Dehydrogenase, deren Rolle im Stoffwechsel unbekannt ist. 10. Die Untersuchung des genomischen Kontextes der für die Na+-translozierende Ferredoxin:NAD+-Oxidoreduktase (Fno/Rnf) kodierenden Gene rnfCDGEAB ergab keine weiteren Gene, die mit Rnf in Verbindung stehen. Experimentelle Befunde zeigen, dass die Gene rnfCDGEAB ein Operon bilden. 11. Nach der Generierung von Antikörpern gegen die Untereinheiten des Rnf-Komplexes, die große lösliche Anteile besitzen, konnte nachgewiesen werden, dass RnfB, C und G in der Membran lokalisiert sind. Desweiteren wurde nachgewiesen, dass deren Produktion unabhängig von der An- oder Abwesenheit von Caffeat und den getesteten C-Quellen ist. 12. RnfG konnte in E. coli überproduziert und anschließend gereinigt werden, allerdings fehlte der vorhergesagte, kovalent gebundene Flavin-Cofaktor. 13. RnfC konnte ebenfalls in E. coli überproduziert und anschließend gereinigt werden. Nach Rekonstitution mit Eisen und Schwefel konnte ein Fe-Gehalt von 8 nmol/ nmol Protein und ein Schwefel-Gehalt von 5 nmol/nmol Protein bestimmt werden. Die im UV/Vis-Spektrum sichtbaren Maxima wiesen auf die Anwesenheit von FeS-Zentren hin. EPR-Analysen deuten darauf hin, dass die FeS-Zentren nur unvollständig assembliert sind. 14. Im Genom von A. woodii ist ein Cluster von Genen, das Proteine zur Umsetzung von 1,2-Propandiol kodiert, zu finden. Elektronenmikroskopisch konnte nachgewiesen werden, dass der Organismus in Gegenwart von 1,2-Propandiol Mikrokompartimente bildet. 15. In Zellsuspensionsversuchen konnte nachgewiesen werden, dass 1,2-Propandiol nicht zu Propionat und Acetat, sondern zu 1-Propanol und Propionat über das Intermediat Propionaldehyd umgesetzt wird. 16. Rohextrakte 1,2-Propandiol-gezogener Zellen katalysierten die Reduktion von NAD+ mit Propionaldehyd als Reduktant. Die Reaktion benötigte CoA, NAD+ (Km 0,35 mM) und Propionaldehyd (Km 1,3 mM). Das Temperaturoptimum betrug 30°C und das pH-Optimum lag zwischen pH 8 und 10. 17. Ein Antikörper gegen die Propionaldehyd-Dehydrogenase (PduP) aus S. enterica reagierte mit einem ca. 50 kDa-Protein 1,2-Propandiol-gezogener Zellen. Dies zeigt, dass PduP aus A. woodii und PduP aus S. enterica immunologisch verwandt sind. Western-Blot-Analysen zeigten, dass PduP nur in 1,2-Propandiol-, 2,3-Butandioloder Ethylenglykol-gezogenen Zellen nachweisbar war, aber nicht in Zellen die auf Fruktose, Ethanol oder H2 + CO2 gezogen waren. 18. Die Aktivität der Propionaldehyd-Dehydrogenase war in Zellen gezogen auf 1,2-Propandiol am höchsten. Nach Wachstum auf Fruktose oder H2 + CO2 war die Aktivität sehr niedrig. Genau gegensätzlich verhielten sich die Aktivitäten der Formiat-Dehydrogenase, einem Enzym des Wood-Ljungdahl-Weges, der ATPHydrolyse und des Rnf-Komplexes. 19. In Gegenwart von Caffeat und 1,2-Propandiol konnte A. woodii nicht wachsen. Das Wachstum auf 2,3-Butandiol oder Ethylenglykol in Gegenwart von Caffeat war möglich.
Eine verzögerte und mitunter unvollständige Immunrekonstitution nach allogener Stammzelltransplantation (SZT) birgt ein erhöhtes Risiko für Infektionen und das Auftreten eines Rezidivs. Adoptive Immuntherapien können dazu beitragen, die Immunrekonstitution zu beschleunigen. Die Indikation hierzu ist jedoch streng geregelt, da eine zusätzliche Immuntherapie mit Risiken, wie z.B. dem Auftreten einer Graft-versus-Host-Disease (GvHD), verbunden ist. Im Mittelpunkt dieser Arbeit steht die Untersuchung der Immunrekonstitution im Hinblick auf das Auftreten von Komplikationen und das Überleben nach SZT. Dazu wurde ein multivariates Normwertmodell entwickelt, das die Beurteilung der Rekonstitution verschiedener Leukozytensubpopulationen ermöglicht. Der Einfluss der Regeneration spezifischer Immunzellen wie Cytomegalievirus-spezifischer T-Zellen (CMV-CTLs) und regulatorischer T-Zellen (Tregs) auf den Verlauf nach SZT wurde insbesondere hinsichtlich CMV-bedingter Komplikationen, GvHD und Rezidiv untersucht.
Integrin a2ß1 ist ein Adhäsionsrezeptor, der verschiedene Kollagentypen bindet. Als solcher spielt es eine bedeutende Rolle für Zellfunktionen wie Migration und die Regulation des Zytoskeletts, Zellteilung, Apoptose und Differenzierung. Integrin a2ß1 übernimmt deshalb eine tragende Funktion in Prozessen wie Wundheilung, Angiogenese und der Progression und Metastasierung von Krebs. Rhodocetin ist ein Antagonist des Integrins a2ß1. Es ist ein C-Typ-Lektin-artiges Protein das im Schlangengift der Malaiischen Grubenotter (Calloselasma rhodostoma) entdeckt wurde. Rhodocetin besteht aus vier Untereinheiten a, ß, ? und d, die zwei Dimere formen (aß und ?d), welche wiederum eine kreuzförmige heterotetramere Quartiärstruktur bilden, die bislang nur für Rhodocetin beschrieben wurde. Rhodocetin bindet an die Integrin-a2A-Domäne der a-Untereinheit des Integrins a2ß1. Rhodocetin unterbindet damit die Bindung von Kollagen und die Aktivierung des Integrins. Der genaue Interaktionsmechanismus von Rhodocetin mit der Integrin-a2A-Domäne ist noch unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden mittels Hybridomtechnik monoklonale Antikörper gegen Rhodocetin generiert. Es wurden sechs Fusionen von Lymphozyten mit Myelomazellen durchgeführt, für die sowohl Mäuse als auch Ratten mit Rhodocetin immunisiert wurden. Die erzeugten Hybridomaklone wurden zunächst im ELISA auf ihre Fähigkeit getestet, Rhodocetin zu binden. Positiv getestete Klone wurden selektiert und die monoklonalen Antikörper aus den Zellüberständen aufgereinigt. Es konnten 14 monoklonale Antikörper etabliert werden. Die Antikörper wurden zunächst in ihren Bindungseigenschaften charakterisiert. Hierzu wurden verschiedene ELISAs, Immunblot und Immunpräzipitation genutzt. In der Duchflusszytometrie wurde getestet, ob die Antikörper an Integrin a2ß1 gebundenes Rhodocetin detektieren. Die Antikörper lassen sich hinsichtlich ihr Bindungseigenschaften und der Lage ihrer Bindungsepitope auf den verschiedenen Rhodocetin-Heterodimeren in unterschiedliche Klassen unterteilen. Es wurde nachgewiesen, dass Rhodocetin Konformationsänderungen unterliegt, die durch die Bindung einiger der generierten Antikörper induziert werden. Um den Einfluss divalenter Kationen auf die Konformation von Rhodocetin sowie den Interaktionsmechanismus von Rhodocetin mit der Integrin-a2A-Domäne zu untersuchen, wurde die analytische Gelfiltrationschromatographie genutzt. Es konnte gezeigt werden, dass die Bindung divalenter Kationen die Konformation von Rhodocetin beeinflusst. Um die Interaktionsstudien von Rhodocetin mit der a2A-Domäne auszuwerten wurde ein Sandwich-ELISA etabliert. Dieser ermöglichte es, im Anschluss an die Gelfiltration, die beiden Rhodocetin-Heterodimere unabhängig voneinander im Eluat nachzuweisen und zu quantifizieren. Es wurde nachgewiesen, dass das Rhodocetin-Heterotetramer während der Interaktion mit der Integrin-a2A-Domäne dissoziiert und nur das ?d-Dimer einen stabilen Komplex mit der a2A-Domäne bildet, während das aß-Dimer freigesetzt und unabhängig von diesem Komplex eluiert wird. Die pharmakologischen Eigenschaften von Rhodocetin wurden in einem Tumor-Xenograft-Modell untersucht, für das immundefizienten Mäusen HT1080 Fibrosarkomzellen implantiert wurden. Rhodocetin wurde den Mäusen intravenös appliziert und die Auswirkungen auf die Tumoren sowie der Verbleib von Rhodocetin im Körper analysiert. Die Entwicklung der Serumkonzentration von Rhodocetin wurde mit dem etablierten Sandwich-ELISA untersucht, welches hierzu mit einer Standardreihe kalibriert wurde. Die Elimination von Rhodocetin folgt einer Kinetik erster Ordnung. Die Exkretion von Rhodocetin erfolgt über die Niere. Es zeigte sich, dass etwa zwei Drittel des applizierten Rhodocetins unmittelbar nach Injektion von Integrin a2ß1-exprimierenden Zellen des Blutes gebunden werden. Die immunhistologische Auswertung von Tumoren und Kontrollgeweben ergab, dass Rhodocetin an Endothelzellen innerhalb der Nierenglomeruli sowie der Leber bindet. Rhodocetin konnte auch auf Endothelzellen der Tumorvaskulatur nachgewiesen werden. Innerhalb der Tumoren wurde Rhodocetin auch außerhalb von Blutgefäßen gefunden, wo es an HT1080 Tumorzellen bindet. Die Behandlung mit Rhodocetin beeinträchtigte die Integrität der Blutgefäße innerhalb der Tumoren und führte zu Hämorrhagien. Um die Auswirkungen von Rhodocetin auf die Tumoren genauer zu untersuchen und zu quantifizieren, wurde dynamische Magnetresonanztomographie genutzt. Es zeigte sich, dass Rhodocetin die Durchlässigkeit der Blutgefäße in Tumoren signifikant erhöht.
RNA hat neben der Rolle als Informationsüberträger wichtige Aufgaben in regulatorischen Prozessen. Sie kann komplexe Strukturen ausbilden und ähnlich wie Proteine Liganden binden oder enzymatische Reaktionen katalysieren. Im Rahmen dieser Arbeit sollten zwei Beispiele von RNA-Liganden-Interaktionen untersucht werden. Im ersten Abschnitt wurde die Interaktion des TetR-bindenden Aptamers 12-1 mit dem Tetracyclin-Repressorprotein (TetR) biochemisch charakterisiert. Über Gelverzögerungs- experimente wurde gezeigt, dass das Aptamer 12-1K delta A TetR mit hoher Affinität und Spezifität bindet. Es wurde ein KD von 22 nM bestimmt. Die Bindung ist dabei ebenso stark wie die Bindung von TetR an die Operatorsequenz tetO. In Anwesenheit von Tetracyclin (Tc) nimmt die Affinität des TetR/Aptamer-Komplexes um das sechsfache ab. Des Weiteren konnten die Bindeepitope des Aptamers durch eine Analyse von verschiedenen TetR-Mutanten im DNA-Bindebereich bestimmt werden. Die Aminosäuren T27, N47 und K48 sind dabei essentiell für die RNA-Bindung und führen bei einem Austausch zum Verlust der RNA-Bindung. Der Bindebereich des Aptamers überlappt mit Aminosäureresten, die für die tetO-Bindung essentiell sind. Die Stöchiometrie der TetR/Aptamer-Bindung wurde durch LILBID-Messungen auf eine molare Verteilung von 2:1 festgelegt. Ein TetR-Dimer bindet dabei ein Aptamermolekül. Durch die umfassende biochemische Analyse der TetR/Aptamer-Bindung kann das Aptamer 12-1 nun als Expressionssonde für RNAs in bakteriellen Zellen genutzt werden. Des Weiteren kann das Aptamer als alternativer, artifizieller Transkriptionsregulator im tet on / tet off-System verwendet werden. Im zweiten Teil der Arbeit sollten miRNAs identifiziert werden, die an der posttrans- kriptionellen Regulation der 5-Lipoxygenase (5-LO) und der Cyclooxygenase-2 (COX-2) beteiligt sind. Mit bioinformatischen Vorhersageprogrammen wurden die 3’-UTR- Bereiche von 5-LO und COX-2 nach putativen Bindestellen abgesucht. Im Fall der 5-LO wurden durch eine zusätzliche Microarray-Expressionsanalyse miRNAs ausgewählt, welche in 5-LO positiven Zellen hoch exprimiert sind und Bindestellen im 3’-UTR aufweisen. Es konnten verschiedene miRNAs detektiert werden, jedoch keine Regulation der 5-LO Aktivität beobachtet werden. Für COX-2 wurde neben der Suche nach putativen miRNA-Bindestellen zudem die Stabilität des 3’-UTR untersucht. Mit Hilfe des auf Perl basierenden Programms SignificanceScoreAssignment (Florian Groher, Diplomarbeit 2011) konnte der 3’-UTR von COX-2 als generell destabilisierend analysiert werden. In Colonkarzinom- spezifischen HT-29-Zellen wurden miRNAs untersucht, welche Bindestellen im 3’-UTR von COX-2 aufweisen. In diesem Kontext sollte der Einfluss einer Interaktion von HT- 29-Zellen mit aktivierten Thrombozyten sowie daraus isolierten Bestandteilen wie Mikropartikeln und PDGF analysiert werden. MiR-16, miR-26b, miR-199a und miR- 199a* konnten in HT-29-Zellen nachgewiesen werden. Bei einer Stimulation von HT-29- Zellen mit PDGF-BB werden miR-16 und miR-26b konzentrationsabhängig stärker exprimiert, während die Expression von miR-199a und miR-199a* signifikant abnimmt. Eine direkte Regulation von COX-2 durch die untersuchten miRNAs konnte durch Überexpressions- und Reportergenanalysen jedoch nicht festgestellt werden. Die Analysen der 5-LO- und COX-2-Regulation durch miRNAs stellen Vorarbeiten dar. Die etablierten Methoden können nun für eine detaillierte Betrachtung weiterer miRNAs verwendet werden.