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Die vorliegende, publikationsbasierte Dissertation, bestehend aus den drei Einzelpublikationen Bayer (2011, 2012) und Bayer und Schönhofer (2012), verfolgte das Ziel, die Spinnenfamilie Psechridae zu revidieren. Weiterhin sollten die phylogenetische Position dieser Familie im System der höheren Webspinnen (Araneomorphae) sowie die phylogenetischen Beziehungen der einzelnen Arten innerhalb der beiden Gattungen der Psechridae untersucht werden. In Form von morphologisch-taxonomischen Bearbeitungen wurden die beiden die Psechridae bildenden Gattungen Psechrus und Fecenia revidiert, wobei sämtliches Typus-Material sowie reichhaltiges, weiteres Material eingehend beschrieben, illustriert und diagnostiziert wurde. Hierbei wurden auch intraspezifische Variabilität sowie die Prä-Epigynen subadulter Weibchen, die in taxonomischen Arbeiten bislang nur eine unwesentliche Rolle gespielt haben, beschrieben, illustriert und taxonomisch ausgewertet. Zudem wurden im Rahmen dieser Untersuchungen bereits Überlegungen über mögliche Verwandtschaftsbeziehungen innerhalb der beiden Gattungen angestellt. ...
Paradoxer Schlaf als Parameter zur Messung der Stressbelastung bei Giraffen (Giraffa camelopardalis)
(2012)
Das Wohlbefinden von Tieren zu schützen ist im Grundgesetz der Bundesrepublik Deutschland festgeschrieben. Das Wohlbefinden eines Tieres wissenschaftlich zu bewerten ist jedoch eine bislang ungelöste Herausforderung. Die Biologie nähert sich dem Problem, subjektive Empfindungen eines Tieres objektiv darzustellen, vorrangig über die Messung der Stressbelastung.
Die Stressantwort eines Organismus setzt sich allgemein aus einer Kombination von vier Systemen zusammen: einer Verhaltensreaktion, einer Antwort des vegetativen Nervensystems, einer neuroendokrinen Antwort und einer Immunantwort. Der in Zoos am häufigsten untersuchte Parameter zur Messung der Stressbelastung ist die Analyse der Cortisolmetaboliten-Konzentration im Kot der Tiere. Da jedoch nicht in jeder Stresssituation das „Stresshormon“ Cortisol ausgeschüttet wird, ist es für eine exakte Bewertung der Stressbelastung notwendig, weitere Systeme der Stressantwort wie beispielsweise das Verhalten zu erfassen. Die Chronoethologie verfolgt diesen Ansatz, indem sie Änderungen des Zeitmusters im Verhalten eines Tieres als Antwort auf Veränderungen in der Umwelt oder eines endogenen Faktors erfasst und diese nach Kriterien der Befindlichkeit bewertet. Hier könnte zukünftig das Schlafverhalten eine herausragende Stellung einnehmen, da es von allen vier Stressantwortsystemen beeinflusst wird. Zudem wird aus der medizinischen Schlafforschung berichtet, dass sich insbesondere die Dauer, die ein Organismus im Paradoxen Schlaf (PS) verbringt, durch Stress verändert. Dennoch fand das Schlafverhalten zur Messung der Stressbelastung bei Zoo- und Wildtieren bislang kaum Beachtung. Ziel dieser Arbeit war es daher, die Anwendbarkeit des PS als Parameter zur Messung der Stressbelastung bei Zoo- und Wildtieren zu erforschen, um letztlich die Beurteilung des Wohlbefindens von Tieren weiter zu objektivieren. Aufgrund ihrer einzigartigen Schlafstellung während des PS sowie ihrer hohen Sensibilität gegenüber Umweltveränderungen wurde die Giraffe (Giraffa camelopardalis) als Modelltier für diesen non-invasiven Forschungsansatz gewählt.
Im Rahmen der Arbeit wurde in 645 Nächten das Schlafverhalten von 17 Giraffen unterschiedlichen Alters und Geschlechts beobachtet und analysiert. Um stressbedingte Veränderungen im PS-Muster erkennen zu können, wurden die Giraffen zunächst unter „Normalbedingungen“ beobachtet, um hieraus Referenzwerte zu generieren. Anschließend wurden unterschiedliche als stressintensiv einzustufende Situationen wie Nahrungsmangel, Transport, Veränderungen in der Herdenstruktur, Auswirkungen einer Geburt auf das Muttertier sowie verschiedene singuläre Ereignisse hinsichtlich ihrer Auswirkungen auf das PS-Muster der Giraffen untersucht und den Referenzwerten gegenübergestellt. Um die Methode der Schlafbeobachtung als Parameter der Stressbelastung zu validieren, wurde zusätzlich ein bei Wiederkäuern etablierter, bereits genannter Stress-Parameter eingesetzt: die Messung der Cortisolmetaboliten-Konzentration im Kot mit Hilfe eines Enzymimmunoassays. Diese Methode wurde hier erstmalig an Giraffen angewendet.
Durchschnittlich hielt eine Giraffe unter Normalbedingungen 27 Minuten pro Nacht paradoxen Schlaf. Dabei war die nächtliche PS-Dauer in hohem Maße vom Alter abhängig. Während juvenile Giraffen im Mittel 63 Minuten PS pro Nacht aufwiesen, verbrachten gealterte Giraffen nur 4,5 Minuten pro Nacht in der PS-Stellung. Infolge eines Stressors veränderte sich die PS-Dauer der Tiere: So zeigten alle vier transportierten Giraffen in den ersten Nächten nach ihrem Transport keinen PS oder stark reduzierte PS-Zeiten. Parallel erhöhte sich nach dem Transport die Cortisolmetaboliten-Konzentration im Kot aller Giraffen für mehrere Tage. Auch die untersuchten Veränderungen in der Herdenstruktur hatten in den meisten Fällen signifikante Veränderungen der PS-Dauer zur Folge. Die stärkste im Rahmen dieser Arbeit beobachtete Veränderung des Schlafverhaltens bewirkte der Tod eines Giraffenbullen: Die adulte Giraffenkuh hielt in der Folge für eine Dauer von 21 Tagen keinen paradoxen Schlaf mehr. Ihre Cortisolmetaboliten-Konzentration im Kot stieg nach dem Tod des Bullen hingegen nicht an. Die beobachteten Giraffenmütter zeigten nach der Geburt ihrer jeweiligen Jungtiere ebenfalls eine reduzierte PS-Dauer. Hingegen hatten neugeborene Giraffen, die an Nahrungsmangel litten und innerhalb weniger Tage verstarben, eine höchst signifikant längere PS-Dauer als gleichalte Jungtiere, die überlebten.
Während bei Nahrungsknappheit eine erhöhte PS-Dauer helfen kann Energie zu sparen, ist eine Reduktion der PS-Dauer als Resultat erhöhter Aufmerksamkeit zu interpretieren, wie sie im Zuge der Feindvermeidung in Stress-Situationen sinnvoll ist.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die PS-Dauer im Gegensatz zur Cortisolmetaboliten-Konzentration von allen beobachteten Stressoren beeinflusst wurde. Dabei veränderte sich die PS-Dauer in Abhängigkeit des jeweiligen Stressors graduell unterschiedlich, was Rückschlüsse auf die Intensität des Stressors ermöglicht.
Der PS ist infolge dieser Ergebnisse hervorragend als Parameter zur Messung der Stressbelastung bei Giraffen geeignet. Die Analyse des PS kann dabei helfen, die Auswirkungen von subjektiv als stressintensiv oder stressarm eingestuften Situationen auf das Wohlbefinden eines Tieres objektiv zu bewerten. Darüber hinaus ermöglicht die kontinuierliche Überwachung des PS-Musters, z.B. mit Hilfe moderner Videosoftware, Beeinträchtigungen des Wohlbefindens, wie sie beispielsweise durch Unterernährung, Verletzung oder Krankheit hervorgerufen werden, frühzeitig zu erkennen, was ein zeitnahes Eingreifen zum Wohle des Tieres möglich macht.
Die nicht-konventionelle Hefe P. ciferrii produziert große Mengen der tetra-acetylierten Sphingoidbase Phytosphingosin (TAPS). Sphingoidbasen sind essentielle Komponenten des stratum corneums, der multilamellaren Barriere der menschlichen Haut, und daher in der Kosmetik-Industrie von großem Interesse. Im Rahmen dieser Arbeit sollte die biotechnologische Produktion der Sphingoidbasen Phytosphingosin, Sphinganin und Sphingosin auf molekularbiologischer Ebene in P. ciferrii charakterisiert und optimiert werden. Die Hefe P. ciferrii konnte durch Etablierung einer einfachen und hoch-effizienten Transformations-Methode auf genetischer Ebene leicht zugänglich gemacht werden. Durch Inaktivierung des für NHEJ essentiellen PcLIG4 Gens konnte die Effizienz zielgerichteter genomischer Integrationen von transformierten DNA-Konstrukten von 1 % auf 87 % erhöht werden. Die Etablierung des Cre-loxP Systems erlaubte das mehrfache Verwenden eines Selektions-Markers wodurch sukzessiv mehrere genomische Integrationen in einem Stamm ermöglicht wurden. Durch diese Errungenschaften konnte das Ziel „Optimierung der Sphingoidbasen-Produktion der nicht-konventionellen Hefe P. ciferrii“ im Folgenden erfolgreich verfolgt werden. Der initiale Schritt der Sphingoidbasen-Biosynthese ist die von der Serin-Palmitoyl-Transferase katalysierte Kondensation von L-Serin und Palmitoyl-CoA. Durch die Deletion von Genen, die am L-Serin-Katabolismus von P. ciferrii beteiligt sind (PcSHM1, PcSHM2und PcCHA1), konnte die de novo Sphingoidbasen-Biosynthese optimiert werden und führte in einem lig4? Stamm zu einer etwa dreifachen Erhöhung der TAPS-Produktion. Weitere Ansätze den (vermutlich durch L-Serin feed back regulierten) L-Serin-Biosyntheseweg bzw. die in vivo L-Serin-Verfügbarkeit zu optimieren, führten nicht zu einer gesteigerten TAPS-Produktion. Durch weitere Deletion und Überexpression von Genen des Sphingolipid-Stoffwechsels konnte die TAPS-Produktion jedoch um ein Vielfaches verbessert werden. So konnte ein Stamm konstruiert werden, der die Gene PcLCB1, PcLCB2 und PcSYR2 überexprimiert und Deletionen der Gene PcSHM1, PcSHM2, PcCHA1, PcLCB4 und PcORM12 trägt. Dieser Stamm (CSS.L4.O.L2.L1.S2) wies eine mehr als fünffach erhöhte maximale spezifische TAPS-Produktbildungsrate (q Pmax ) auf und produzierte mit 2 g * L rund siebenmal mehr TAPS als der lig4? Ausgangsstamm, weshalb ein Einsatz dieses Stammes für die industrielle TAPS-Produktion denkbar wäre. Ausgehend von einem für die TAPS- (und somit Sphingoidbasen-) Produktion optimierten Stamm sollten Stämme mit optimierter TriASa- oder TriASo-Produktion für industrielle Zwecke generiert werden. Es stellte sich allerding heraus, dass erhöhte Mengen dieser Sphingoidbasen wahrscheinlich wachstumshemmend für P. ciferrii sind, weshalb eine weitere Produktions-Optimierung nicht ohne Weiteres möglich ist. In einem Laborstamm gelang es jedoch, durch Konstruktion und anschließende Transformation eines optimierten integrativen Plasmids (trägt die Gene, die für die Produktion von Sphingosin bzw. TriASo nötig sind) eine TriASo-Produktion von bis zu 30 mg * g (BTM) zu erzielen, wobei gleichzeitig die Bildung des Nebenprodukts TriASa auf weniger als 4 mg * g (BTM)reduziert wurde. Weiterhin konnte durch Deletion von PcSCS7 in einem TriASo-Produktionsstamm die TriASa-Produktion mehr als vierfach reduziert werden. Die Bildung eines weiteren von P. ciferrii gebildeten Nebenproduktes [Tri-Acetyl-Sphingadienin (TriASd)] konnte durch Deletion des PcSLD1 Gens unterbunden werden. Nach Inaktivierung von PcSCH9 konnte eine fast 20 %ige Verbesserung der TriASo-Produktion erreicht werden. Es konnten zwei putative Acetyl-Transferasen identifiziert werden (PcAft2 und PcSli1), die an der Acetylierung von Phytosphingosin (zu TAPS), Sphinganin (zu TriASa) und Sphingosin (zu TriASo) beteiligt sind. Die Aufklärung und Optimierung dieser von PcAtf2 und PcSli1 katalysierten Schritte sind vielversprechende Ansatzpunkte die Sphingoidbasen-Produktion in P. ciferrii weiter zu optimieren.
Einfluss des Transkriptionsfaktors Tal1 auf die Osteoklastogenese durch Regulation von DC-STAMP
(2012)
Das menschliche Knochengewebe unterliegt einem ständigen Auf- und Abbau. Der Knochenumbau, die so genannte Knochenremodellierung, findet stetig statt und etwa 10 % des gesamten Knochengewebes werden innerhalb eines Jahres erneuert (Lerner UH, 2006). Während der Knochenremodellierung befindet sich die Zellaktivität der Knochenaufbauenden Osteoblasten und der Knochen-abbauenden Osteoklasten in einem empfindlichen Gleichgewicht (Karsenty G und Wagner EF, 2002; Teitelbaum SL, 2000).
Durch Störung des Gleichgewichts zwischen Osteoblasten und Osteoklasten kann es zu Knochen-assoziierten Krankheiten wie Osteoporose oder Osteopetrose kommen (Helfrich MH, 2003; Sambrook P und Cooper C, 2006). Osteoklasten sind multinukleäre Zellen, die in der Lage sind die Knochenmatrix zu resorbieren (Teitelbaum SL, 2000). Sie entstehen aus pluripotenten, hämatopoetischen Stammzellen durch Differenzierung und Zellfusion von Monozyten/Makrophagen-Vorläuferzellen (Menaa C et al., 2000, Yavropoulou MP und Yovos JG, 2008). Die Osteoklasten-Differenzierung wird hauptsächlich durch die Zytokine M-CSF (macrophage colony stimulating factor) und RANKL (receptor activator of nuclear factor k b ligand) induziert. Sie initiieren ein spezifisches Expressionsmuster Osteoklasten-spezifischer Gene und aktivieren die Zellfusion in Osteoklasten-Vorläuferzellen zur Bildung reifer Osteoklasten (Boyle WJ et al., 2003; Asagiri M und Takayanagi H, 2007). Die RANKL-vermittelte Induktion der Osteoklastogenese beruht auf der Initiierung eines streng regulierten Netzwerks aus Transkriptionsfaktoren (Yang X und Karsenty G, 2002). Einige Transkriptionsfaktoren, die während der Osteoklasten-Differenzierung induziert und exprimiert werden, sind nicht auf Osteoklasten beschränkt. Sie erfüllen auch Aufgaben in anderen hämatopoetischen Differenzierungsprozessen (Engel I und Murre C et al., 1999), so dass vermutlich die Kombination der Transkriptionsfaktoren entscheidend für die Osteoklastogenese ist.
Der basic helix-loop-helix-Transkriptionsfaktor Tal1 (T-cell acute lymphocytic leukemia 1, auch Scl1, stem cell leukemia 1) ist ein entscheidender Faktor in der primitiven und der definitiven Hämatopoese (Bloor AJ et al., 2002; Shivdasani RA et al., 1996). Die Expression von Tal1 konnte bisher in verschiedenen hämatopoetischen Zelllinien gezeigt werden, u.a. in monozytischen Zellen (Elefanty AG et al., 1998; Green AR et al., 1992; Pulford K et al., 1995; Dey S et al., 2010).
In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss des Transkriptionsfaktors Tal1 in Monozyten und reifen Osteoklasten, vor allem in Bezug auf genregulatorische Prozesse während der Osteoklasten-Differenzierung, untersucht. Der Transkriptionsfaktor Tal1 wird in vitro und in vivo in Osteoklasten-Vorläuferzellen und reifen Osteoklasten exprimiert. Die Proteinexpression von Tal1 wird durch die Inkubation der Zellen mit RANKL induziert, jedoch wurde dies in Bezug auf die mRNA-Expression von Tal1 nicht beobachtet, so dass vermutlich eine posttranskriptionelle Regulation von Tal1 vorliegt.
Die Überexpression von Tal1 sorgte für eine Blockade der Differenzierung von Osteoklasten-Vorläuferzellen in reife Osteoklasten. Der Verlust von Tal1 in primären Monozyten/Makrophagen-Zellen führte zur veränderten Expression von über 1200 Genen, wobei jeweils etwa 600 Gene herauf- bzw. herabreguliert waren. Dies verdeutlicht, dass Tal1 sowohl an der Aktivierung als auch an der Reprimierung der Genexpression in Osteoklasten-Vorläuferzellen beteiligt ist. Die Liste der herabregulierten Gene beinhaltete u.a. das Osteoklasten-spezifische Enzym Acp5 (auch TRAP, tartrate resistant acid phosphatase), die Liste der herauf regulierten Gene beinhaltete u.a. DC-STAMP (dendritic cell specific transmembrane protein) und ATP6V0D2 (d2 isoform of vascuolar ATPase V0 domain), beide werden im Zusammenhang mit der Zellfusion während der Osteoklasten-Differenzierung beschrieben (Kim K et al., 2008; Kim T et al., 2010; Yagi M et al., 2005). Der Promotor von DC-STAMP beinhaltet mehrere potentielle Bindestellen für Tal1 und Osteoklastenspezifische Transkriptionsfaktoren. Es konnte gezeigt werden, dass Tal1, PU.1 und MITF im Bereich um 343 bp vor dem Transkriptionsstartpunkt des DC-STAMP-Promotors binden und dass Tal1 mit den Osteoklasten-spezifischen Transkriptionsfaktoren PU.1 und MITF interagiert. Der inhibitorische Effekt von Tal1 auf die Osteoklasten-Differenzierung kommt durch die Reprimierung der Aktivität der Osteoklasten-spezifischen Transkriptionsfaktoren PU.1 und MITF auf dem DC-STAMP-Promotor in Osteoklasten-Vorläuferzellen zustande. Während der Osteoklastogenese kommt es zu einer verringerten Tal1-Bindung auf dem DCSTAMP-Promotor, wodurch die Tal1-vermittelte Inhibierung der Expression aufgehoben wird.
Die Bindung von PU.1 und MITF auf dem Promotor von DC-STAMP nimmt während der Osteoklasten-Differenzierung zu. Die Expression von DC-STAMP wird im Verlauf der Osteoklastogenese induziert, wodurch es zur Zell-Zell-Fusion kommt.
Die Analyse des transkriptionellen Netzwerks, das die Fusion mononukleärer Zellen in reife Osteoklasten reguliert, vertieft das molekulare Verständnis der Osteoklasten-Differenzierung und kann zur Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze beitragen, die in der Behandlung von Osteoporose, Riesenzelltumoren und anderen Osteoklastenassoziierten Krankheiten verwendet werden können.