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On demand treatment and home therapy of hereditary angioedema in Germany - the Frankfurt experience
(2010)
Background: Manifestation of acute edema in hereditary angioedema (HAE) is characterized by interindividual and intraindividual variability in symptom expression over time. Flexible therapy options are needed. Methods: We describe and report on the outcomes of the highly individualized approach to HAE therapy practiced at our HAE center in Frankfurt (Germany). Results: The HAE center at the Frankfurt University Hospital currently treats 450 adults with HAE or AAE and 107 pediatric HAE patients with highly individualized therapeutic approaches. 73.9% of the adult patients treat HAE attacks by on-demand therapy with pasteurized pd C1-INH concentrate, 9.8% use additional prophylaxis with attenuated androgens, 1% of the total patient population in Frankfurt has been treated with Icatibant up to now. In addition adult and selected pediatric patients with a high frequency of severe attacks are instructed to apply individual replacement therapy (IRT) with pasteurized pd C1-INH concentrate. Improvement on Quality of Life items was shown for these patients compared to previous long-term danazol prophylaxis. Home treatment of HAE patients was developed in the Frankfurt HAE center in line with experiences in hemophilia therapy and has so far been implemented over a period of 28 years. At present 248 (55%) of the adult patients and 26 (24%) of the pediatric patients are practicing home treatment either as on demand or IRT treatment. Conclusions: In conclusion, the individualized home therapies provided by our HAE center, aim to limit the disruption to normal daily activities that occurs for many HAE patients. Furthermore, we seek to optimize the economic burden of the disease while offering a maximum quality of life to our patients.
Background We published the Canadian 2003 International Consensus Algorithm for the Diagnosis, Therapy, and Management of Hereditary Angioedema (HAE; C1 inhibitor [C1-INH] deficiency) and updated this as Hereditary angioedema: a current state-of-the-art review: Canadian Hungarian 2007 International Consensus Algorithm for the Diagnosis, Therapy, and Management of Hereditary Angioedema. Objective To update the International Consensus Algorithm for the Diagnosis, Therapy and Management of Hereditary Angioedema (circa 2010). Methods The Canadian Hereditary Angioedema Network (CHAEN)/Reseau Canadien d'angioedeme hereditaire (RCAH) (www.haecanada.com) and cosponsors University of Calgary and the Canadian Society of Allergy and Clinical Immunology (with an unrestricted educational grant from CSL Behring) held our third Conference May 15th to 16th, 2010 in Toronto Canada to update our consensus approach. The Consensus document was reviewed at the meeting and then circulated for review. Results This manuscript is the 2010 International Consensus Algorithm for the Diagnosis, Therapy and Management of Hereditary Angioedema that resulted from that conference. Conclusions Consensus approach is only an interim guide to a complex disorder such as HAE and should be replaced as soon as possible with large phase III and IV clinical trials, meta analyses, and using data base registry validation of approaches including quality of life and cost benefit analyses, followed by large head-to-head clinical trials and then evidence-based guidelines and standards for HAE disease management.
To date it is not clear at which stage of differentiation mature T cell leukaemia/lymphoma is initiated. Previous studies in our group showed that mature T cells are relatively resistant to transformation. We wanted to further investigate the transformation potential of NPM-ALK, p21SNFT and the viral oncoprotein Tax on mature T cells. First, we analyzed the effects on T cell growth in vitro after transducing human T cell lines with gammaretroviral vectors encoding these genes. No growth or proliferation promoting effect of all three genes was observed. In the second part of the project, we transduced murine, mature T cells and/or haematopoietic stem cells (HPCs/HSCs) and transplanted these cells into Rag-1 deficient recipients. All mice transplanted with NPM-ALK transduced monoclonal mature T cells (OT-1) developed leukaemia/lymphoma. In contrast, only few NPM-ALK transduced polyclonal T cell and HPC/HSC transplanted mice developed leukaemia/lymphoma. From the p21SNFT group, only two mice transplanted with transduced OT-1 T cells developed leukaemia/lymphoma, which showed high eGFP and interestingly CD19 expression. No malignancies were observed in Tax transplanted animals so far. Furthermore, the recipients do not show any eGFP marking in the periphery. In conclusion, our results show that compared to polyclonal T cells, monoclonal T cells are transformable after gammaretroviral transfer of NPM-ALK and p21SNFT.
Die vorliegende Dissertationsschrift im Fachgebiet Musikpädagogik widmet sich dem heutigen Stand des Instrumentalunterrichts auf Blechblasinstrumenten und dessen möglicher Weiterentwicklung unter besonderer Berücksichtigung neuer methodischer Ansätze. Hierbei stehen interdisziplinäre Übungskonzepte zur Förderung einer ganzheitlichen Instrumentalpädagogik im Vordergrund, insbesondere unter systematischer Miteinbeziehung spezieller mundmotorischer logopädischer Übungen. Mit der Zielsetzung, gängige Unterrichtskonzepte zu untersuchen und potenziell innovative Methoden aufzuzeigen, war zunächst grundlegende Forschungstätigkeit notwendig, da musikpädagogische Forschung im deutschen Sprachraum bisher die Blechblasinstrumente so gut wie nicht mit einbezogen hat (Suppan, 1994: 431; Bastian, 1992: 128ff). Nach entsprechender Recherche und dem Erstellen eines ersten Studiendesigns erwies sich eine Eingrenzung der Untersuchung auf die Instrumentalpädagogik von Trompete, Horn und Posaune als sinnvoll. Entsprechend dem Untertitel dieser Studie zu Theorie, Empirie und Didaktik modernen Instrumentalunterrichts gliedert sich diese Schrift in drei Hauptteile. Der theoretische Teil der Arbeit erläutert die sogenannte Ansatzphysiognomie und stellt diese ausführlich dar. Hierbei werden auf die didaktische Vermittlung des Bläseransatzes, dessen Anatomie sowie die Elemente des orofazialen Systems in Bezug zu deren Funktion beim Spielen eines Blechblasinstruments eingegangen. Ebenso werden Pathologien und ihre Konsequenzen für das Erlernen eines Blechblasinstruments erörtert. Nach einer Betrachtung des Mundes als Quelle sensorischer-integrativer Funktion, erfolgt eine Einführung in die orofaziale Muskelfunktionstherapie mit ihren „myofunktionellen Übungen“. Für die klare bildliche Darstellung der Anatomie wurde ein separater, auch für „Nicht-Anatomen“ verständlicher, Bildband (Band 2 dieser Dissertationsschrift) verfasst. Der didaktische Teil dieser Arbeit widmet sich den aktuellen Lehrplänen und Lehrmitteln für den Instrumentalunterricht bei Trompete, Horn und Posaune. Hierfür wurde in einem ersten Schritt zunächst der Verbreitungsgrad von Anfänger-Instrumentalschulen für diese Blechbläser ermittelt. Für eine systematische und einheitliche Bewertung dieser Schulen war es dann in einem zweiten Schritt erforderlich, ein entsprechendes Bewertungsinstrument zu entwickeln, welches als der „Frankfurter Analysebogen für Instrumentalschulen (FAI)“ vorgestellt wird. Mit diesem Fragebogen wurden insgesamt 40 Instrumentalschulen für Trompete, Horn und Posaune analysiert und evaluiert (Band 3 dieser Dissertationsschrift). Zum Abschluss des Kapitels erfolgt eine Betrachtung der aktuellen VdM-Lehrpläne sowie des Jugendmusiker-Leistungsabzeichens der BDB-Bläserjugend. Im empirischen Teil werden im Wesentlichen die Ergebnisse und Implikationen der Studie "Moderner Instrumentalunterricht auf Blechblasinstrumenten" aus Sicht der Lehrkräfte sowie der Schülerinnen und Schüler dargestellt. Die Befragung von 140 Lehrkräften und 853 Schülerinnen und Schüler soll hierbei Antworten auf grundlegende Fragen der Didaktik im gegenwärtigen Blechbläserunterricht geben. Die interdisziplinäre Evaluationsstudie "Zur musikpädagogischen Bedeutung von myofunktionellen Übungen" eröffnet aufgrund ihrer Ergebnisse die Möglichkeit einer Weiterentwicklung der Methodik im Bereich der Blechbläserpädagogik.
Die Hodgkin/Reed-Sternberg Zellen des klassischen Hodgkin Lymphoms stammen von Keimzentrums-B-Zellen ab. Dennoch prägen sie fast keine B-Zell-spezifischen Gene aus, stattdessen ko-exprimieren sie Marker anderer hämatopoetischer Linien. Die Ursache für den Verlust des B-Zell-Phänotyps ist weitestgehend unbekannt, da die Transkriptionsfaktoren E2A und PAX5, die in reifen B-Zellen zur Aufrechterhaltung der Expression B-Zell-spezifischer Gene essentiell sind, von primären HRS Zellen ausgeprägt werden. Allerdings wird PAX5 im Vergleich zu normalen B-Zellen deutlich schwächer exprimiert. E2A wird durch direkte Interaktion mit dem inhibitor of DNA binding, ID2, negativ reguliert. ID2 besitzt eine bHLH-Struktur und dimerisiert mit Transkriptionsfaktoren. Da ihm jedoch die DNA-bindende Domäne fehlt, wird die Bindung der Heterodimere an die DNA verhindert und die Transkriptionsfaktoren somit inaktiviert. In hämatopoetischen Zellen scheint die ID2-Expression die B-Zell-Entwicklung und auch die Expression B-Zell-spezifischer Gene zu unterdrücken und stattdessen die Ausprägung von Genen anderer Linien zu unterstützen. In reifen B-Zellen wird ID2 während der Plasmazellentwicklung bei gleichzeitigem Verlust der Expression B-Zell-spezifischer Gene stark exprimiert. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass ID2, das in normalen B-Zellen nicht detektiert werden konnte, dagegen in allen HL-Fällen nicht nur auf RNA-Ebene, sondern auch auf Proteinebene stark exprimiert wird. Ko-Immunopräzipitation des E2A mit ID2 aus HL-Zelllinien zeigte die Interaktion und somit vermutlich auch die transkriptionelle Inaktivierung des E2A durch ID2, wodurch es zum Verlust der Expression B-Zell-spezifischer Gene kommt. Darüber hinaus wird PAX5 zusammen mit EBF durch E2A induziert. So führt die ID2-vermittelte E2A-Inaktivierung im HL vermutlich dazu, dass ID2 via EBF auch die Regulation von PAX5 beeinflusst. PAX5 spielt bei der Differenzierung eine duale Rolle, denn es aktiviert nicht nur B-Zell-spezifische Gene, sondern es unterdrückt auch die Gene anderer Linien. Demnach könnte ID2 auch an der Expression der nicht-B-Zell-spezifischen Gene im HL beteiligt sein. Darüber hinaus ist ID2 im HL durch die E2A-Inaktivierung via EBF auch möglicherweise an der schwächeren Expression des PAX5 im Vergleich zu normalen B-Zellen beteiligt. Obwohl das ID2-Protein in den HL-Zelllinien durch RNA-Interferenz erfolgreich reduziert werden konnte, zeigte sich allerdings weder eine Änderung der Proteinexpression der B-Zell-spezifischen Gene CD19 und CD79A noch der Gene anderer hämatopoetischer Linien GATA-3 und M-CSF-R. Unabhängig von seiner möglichen Beteiligung an der Dedifferenzierung der HRS Zellen im HL, spielt ID2 vermutlich auch eine weitere Rolle in der Pathogenese des HL. Verschiedene Interaktionen weisen darauf hin, dass ID2 auch an der Regulation des Zellzyklus beteiligt ist. Zum einen konnte in dieser Arbeit die Interaktion des ID2 mit dem HLH-Protein HEF1 zumindest in einer der HL-Zelllinien gezeigt werden. HEF1 ist ein Aktivator der Aurora Kinase 1, welche nach Aktivierung Gene phosphoryliert, die den Ablauf der Mitose begünstigen. Zum anderen konnte der negative Zellzyklusregulator p21Cip1 in HL-Zelllinien durch RNAi-vermittelte Reduktion des ID2-Proteins als ID2-Target-Gen identifiziert werden. Auch wenn die Interaktion mit RB, dem zur Familie der Pocket-Proteine gehörenden Schlüsselregulator des Zellzyklusverlaufs, in HL-Zelllinien nicht nachgewiesen werden konnte, zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass die aberrante ID2-Expression offenbar an der Veränderung des Zellzyklus im HL beteiligt ist. Sie lassen jedoch noch keinen endgültigen Schluss zu. Wie in dieser Arbeit gezeigt wurde, wird ID2 ebenfalls im analplastisch großzelligen T-Zell-Lymphom aberrant exprimiert. Auch eine Interaktion mit E2A, das auch in der T-Zell-Entwicklung eine Rolle spielt, konnte gezeigt werden. Nicht zuletzt scheint demnach ID2 auch in der Dedifferenzierung des ALCL ein wichtiger Faktor zu sein. ID2 wird im HL aberrant exprimiert und es konnte die Interaktion mit E2A in den HL-Zelllinien nachgewiesen werden, wodurch die transkriptionelle Aktivität des E2A vermutlich inhibiert wird. Auch wenn in Folge der RNAi-vermittelten Herunterregulation von ID2 in den HL-Linien weder eine Re-Expression B-Zell-spezifischer Gene noch eine Beeinflussung der Expression Marker andere hämatopoetischer Linien gefunden werden konnte, spielt ID2 vermutlich dennoch eine wichtige Rolle in der Dedifferenzierung der HRS Zellen im HL. Unabhängig davon konnte der negative Zellzyklusregulator p21Cip1 als ID2-Target-Gen identifiziert und eine Interaktion mit HEF1 gezeigt werden. Demnach ist ID2 möglicherweise nicht nur an der Dedifferenzierung, sondern auch an der Dysregulation des Zellzyklus im HL beteiligt und somit ein wichtiger Faktor in der Pathogenese des HL.
Diese Dissertation befasst sich mit der massenspektrometrischen Analytik von Membranproteinen. Diese gestaltet sich aufgrund der hydrophoben Natur der Proteine und der damit verbundenen schlechten Löslichkeit in wässrigen Puffersystemen als deutlich schwieriger als die Untersuchung löslicher Proteine. Einige weitere Probleme entstehen durch die konsequente Verwendung der Referenzprotease Trypsin zur Hydrolyse der Proteine. Sie spaltet ausschließlich Peptidbindungen nach basischen Aminosäuren, die naturgemäß in den unpolaren Helixbereichen der Membranproteine nur vereinzelt anzutreffen sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurden auf weniger spezifischen Proteasen basierende Protokolle zur Analyse von ganzen Membranproteomen entwickelt, welche einige der ursprünglichen Probleme umgehen oder zumindest vermindern. Die Proteolysereaktion fand in Anwesenheit von Methanol statt, welcher die Membranstruktur destabilisiert und so die Zugänglichkeit der in die Membran eingebetteten Proteinteile für das Enzym erhöht. Zusätzlich erhöhte sich dadurch die Löslichkeit gebildeter hydrophober Peptide im Puffer. Das neue Protokoll wurde an Bacteriorhodopsin, einem geläufigen Modellsystem für α helikale Membranproteine, erfolgreich etabliert. Bei Verwendung der Proteasen Elastase und Pepsin konnten nach nLC-Trennung und MALDI-MS/MS deutlich mehr Peptide des Membranproteins signifikant identifiziert werden, als es mit Trypsin möglich gewesen ist. Auch qualitativ ergaben sich Unterschiede zwischen beiden Enzymen. Mit den alternativen Enzymen ließen sich nicht nur die hydrophilen peripheren Proteinabschnitte nachweisen, sondern auch zahlreiche Peptide aus den hydrophoben Transmembranbereichen. Das am Modellprotein etablierte Elastase-Protokoll konnte problemlos auf die Analyse des komplexeren Membranproteoms von Corynebacterium glutamicum transferiert werden. So konnten ca. 150 verschiedene Proteine identifiziert werden, darunter auch zahlreiche Membranproteine. Die erzeugten Peptidmischungen wurden nicht nur mittels nLC-MALDI-TOF/TOF sondern auch mit einer nLC-ESI-Orbitrap-Plattform analysiert. Anhand einer detaillierten Analyse der physikochemischen Eigenschaften der entstandenen Peptide konnte gezeigt werden, dass der dabei beobachtete Vorteil des ESI-Instrumentes zu großen Teilen auf die bessere Detektion aliphatischer Neutralpeptide zurückzuführen war. Diese werden bei der MALDI vornehmlich aufgrund der schlechteren Ionisation bei Verwendung der Standardmatrix α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure diskriminiert. Ein weiterer Vorteil des verwendeten ESI-Gerätes ist seine bessere Massengenauigkeit durch den hochauflösenden Orbitrap-Massenanlysator. Wurden die MALDI-TOF/TOF-Fragmentierungsdaten durch, auf einem zweiten Instrument gemessene, genaue MALDI-Orbitrap-Vorläufermassen supplementiert, konnten über 30% mehr Peptide signifikant identifiziert werden. Die gesammelten Daten konnten zur Erhebung einiger Statistiken über Elastase und Pepsin herangezogen werden. Erstmals wurde eine umfassende Untersuchung der Spaltspezifität von Elastase vorgenommen. Das Enzym hydrolysiert in ca. 82% der Fälle nach den kleinen hydrophoben Aminosäuren Ala, Val, Ile, Leu, Ser und Thr. Diese Spezifität ist für proteolytische Schnitte innerhalb der hydrophoben Helixbereiche von Membranproteinen äußerst vorteilhaft. Sie reicht aus, um Peptide Mass Fingerprinting an Einzelproteinen durchzuführen, wie exemplarisch am Modellprotein Bacteriorhodopsin gezeigt wurde. Die für Pepsin erhaltene Spezifität ist hingegen zu undifferenziert für solche Experimente, weshalb hier MS/MS-basierte Strategien vorzuziehen sind. Weitergehende Verbesserungen für Datenbanksuchen mit weniger spezifischen Proteasen wurden vorgeschlagen. Hierzu wurde erstmals eine größere Fragmentierungsstatistik eines nichttryptischen Datensatzes auf einem MALDI-Instrument erstellt, deren Aussage zur Verifizierung von Suchergebnissen in die Algorithmen implementiert werden kann. Beim Einsatz weniger spezifischer Proteasen erhöht sich im Vergleich zu Trypsin die entstehende Peptidkomplexität. Zur Kompensation dessen wurde eine Fraktionierung mittels Off-gel IEF vor der nLC-MALDI-Analyse etabliert. Zwecks direkter Kompatibilität zur nLC wurde ein Off-gel IEF-Protokoll ohne die Probeninjektion störendes Glycerol entwickelt. So ließ sich die dreifache Menge an Peptiden nachweisen, als mit ausschließlich eindimensionaler nLC-Trennung. In Verbindung mit den durch Trypsin erzielbaren Resultaten lassen sich mit den weniger spezifischen Enzymen viele Membranproteine umfassender charakterisieren, da zusätzlich die hydrophoben Transmembranbereiche und somit mehr Informationen für die Analytik zugänglich sind. Der gezielte Einsatz von alternativen Enzymen verbessert die momentane Situation in der Membranproteom-Analytik deutlich und führt diese einen weiteren Schritt an die Analytik löslicher Proteine heran.
Als Teil der Atmungskette des hyperthermophilen Bakteriums Aquifex aeolicus besteht die NADH:Ubichinon-Oxidoreduktase aus 13 Untereinheiten, die durch 24 unterschiedliche Gene codiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde für den massenspektrometrischen Nachweis dieser Untereinheiten nach der Aufreinigung des Komplexes eine SDS-PAGE durchgeführt, an die sich eine tryptische Proteolyse und eine Messung per MALDI MS und MS/MS anschlossen. Mit dieser analytischen Strategie war es möglich, jede nicht-homologe Untereinheit nachzuweisen und 20 von 24 genombasierten Isoformen eindeutig zu identifizieren. Selbst kleine bzw. sehr hydrophobe Untereinheiten mit vielen Transmembranhelices konnten mit Hilfe dieser Methode analysiert werden. Die hohe Anzahl an präsenten, unterschiedlichen Isoformen und die vorherrschenden Verunreinigungen durch Fremdproteine (z.B. ATP-Synthase) könnten Indizien dafür sein, dass bis jetzt keine hinreichend stabile und reproduzierbare Enzympräparation gelungen ist, um eine Kristallstrukturanalyse durchzuführen. Im Allgemeinen kann der Ablauf eines solchen Proteomics-Experiments in drei Teile gegliedert werden: die Auftrennung eines Protein- oder Peptidgemischs zur Verringerung der Probenkomplexität, die Identifikation des Proteins per Massenspektrometrie und die damit verbundene bioinformatische Datenanalyse. Neben chromatographischen Methoden ist die Elektrophorese in Polyacrylamidgelen immer noch das am häufigsten angewandte Trennverfahren im Proteomics-Bereich. Vor der MS-Messung werden die aufgetrennten Proteine in der Regel direkt in der Gelmatrix verdaut. Die Qualität der Ergebnisse wird stark durch Proteinmenge und die auftretenden Probenverluste beeinflusst. Diese werden beispielsweise durch eine unzureichende Peptidextraktion aus dem Gel hervorgerufen. Im Rahmen dieser Dissertation wurde ein neues Gelsystem entwickelt, dass vor allem für die Proteolyseeffizienz, die Peptidextraktion und somit auch für die anschließende massenspektrometrische Messung von Vorteil ist. Das Monomer Acrylamid wird hierzu mit den beiden Quervernetzern N,N-Methylenbisacrylamid (MBA) und Ethylenglykoldiacrylat (EDA) polymerisiert. Es entsteht ein Gel, dessen Poren durch die basische Hydrolyse der Esterbindungen des EDAs vergrößert werden können, ohne die dreidimensionale Grundstruktur des Gels zu zerstören.   Die gemischten Gele mit MBA und EDA als Crosslinkern sind sowohl für Tris-Glycin- als auch Tris-Tricin-Puffersysteme einsetzbar. Die Evaluierung der Daten erfolgte meist gegen ein Standardgel mit T= 14% und C= 2,6%. Durch eine experimentell ermittelte Anpassung der Mischgele auf T+10% und C+45% mit einem MBA/EDA-Verhältnis von 0,5 verhalten sich die beiden Gelsysteme empirisch gleich und zeigen eine übereinstimmende elektrophoretische Trennung und Auflösung. Es gibt keine wesentlichen Nachteile in Bezug auf die Handhabung, die elektrophoretische Trennung und die anschließenden Analysen und Techniken, solange diese in sauren bis leicht basischen pH-Bereichen durchgeführt werden. So wurde das gemischte Gelsystem sowohl bei einer 2D IEF/SDS-PAGE als auch bei einem Western Blot-Experiment angewendet und für vollständig kompatibel befunden. Die gemessenen MS-Daten profitieren im Fall von Trypsin und Elastase erheblich von der besseren Zugänglichkeit des Enzyms zum Substratprotein und der verbesserten Peptidextraktion. Die Gelaufweitung führt zu signifikant besseren Ergebnissen, die größtenteils auf höhere S/N-Werte zurückzuführen sind. Die Signalintensitäten der Peptide sind um den Faktor 5 besser als die des Referenzgels. Der Nachweis von je 1 pmol der Proteine BSA, Serotransferrin und Alkoholdehydrogenase profitiert stark von den zusätzlich erhaltenen Daten, da die Zunahme an identifizierten Peptiden bei der PMF-Suche im Bereich von 40 bis 80% liegt. Auch bei geringen Proteinmengen wie 250 bzw. 50 fmol BSA ist die Anzahl der zugeordneten Signale um den Faktor 2-3 besser. Der in-Gel Verdau von 1 pmol Bacteriorhodopsin mit Elastase zeigt ebenfalls einen Anstieg der Peptidsignale um 60% im Vergleich zum Referenzgel. Da die Proteine im Gel alle mit kolloidalem Coomassie Brilliant Blue angefärbt wurden, kann davon ausgegangen werden, dass sich die guten MS-Ergebnisse auf jede mit diesem Farbstoff visualisierte Probe übertragen lassen. Für den Fluoreszenzfarbstoff RuPBS trifft dies ebenso zu, insgesamt wurden aber weniger Peptide als bei kolloidaler Coomassie Brilliant Blue-Färbung detektiert. Dementsprechend handelt es sich bei Acrylamidgelen mit MBA/EDA-Vernetzung um ein vielversprechendes alternatives Gelsystem, dass auf eine Vielzahl anderer Methoden angewendet werden kann.
5-Lipoxygenase (5-LO) katalysiert die ersten beiden Schritte in der Biosynthese der Leukotriene, die an Reaktionen des Immunsystems beteiligt sind. Die 5-LO-Aktivität wird durch verschiedene Faktoren wie Ca2+, Phospholipide und den zellulären Redoxstatus beeinflusst. Die 5-LO besteht aus einer katalytischen und einer N-terminalen, C2-ähnlichen Domäne. Durch Oxidation des Eisens im aktiven Zentrum zur Fe3+-Form wird das Enzym aktiv. Die C2-ähnliche Domäne bindet Ca2+ und PC und ist für die Membranbindung der 5-LO verantwortlich. In der vorliegenden Arbeit wurde die Aktivierung der 5-LO durch das Diacylglycerid OAG untersucht. Bekannt war die Stimulation der Agonist-induzierten 5-LO-Aktivität in intakten Zellen durch OAG, die nicht auf den bekannten Aktivierungswegen wie Translokation, Phosphorylierung oder Ca2+-Mobilisierung beruht. Hier kann nun die direkte Aktivierung des 5-LO-Enzyms durch OAG in vitro gezeigt werden. Untersucht man den Einfluss von OAG auf die 5-LO-Aktivität in Anwesenheit von 1 mM Ca2+, lässt sich weder an Homogenat, S100 noch am partiell aufgereinigten Enzym aus PMNL ein Effekt beobachten. Entfernt man dagegen Ca2+ aus den Versuchsansätzen, induziert OAG (30 µM) bei Substratkonzentrationen unter 20 µM AA die 5-LO-Aktivität im S100 und am partiell aufgereinigten Enzym. Auch andere Glyceride wie DOG, OG und EAG aktivieren die 5-LO, nicht jedoch SAG. OAG stabilisiert die 5-LO-Aktivität vor der Hemmung durch die Glutathionperoxidase (GPx), dies vermögen ebenfalls andere Glyceride. Damit ähnelt der Einfluss von OAG auf die 5-LO dem bereits bekannten Effekt von Ca2+: es ist in der Lage, vor allem bei niedrigen Substratkonzentrationen die 5-LO-Produktmenge direkt zu erhöhen und kann die 5-LO-Aktivität gegen den inhibitorischen Effekt der Glutathionperoxidase (GPx) stabilisieren. Ähnlich wie Ca2+ scheint OAG die Affinität der 5-LO für das Substrat AA zu erhöhen und das Bedürfnis für aktivierende Hydroperoxide zu erniedrigen. Durch Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit kann eine Beteiligung der Ca2+-Bindungsstelle an der Interaktion zwischen 5-LO und OAG ausgeschlossen werden, da OAG auch an der loop2 mut-5LO die Aktivität zu steigern vermag. Der Anstieg der 5-LO-Produktbildung durch OAG in S100 und am partiell aufgereinigten 5-LO-Enzym lässt sich durch die Zugabe von PC und anderen Phospholipiden unterbinden. Damit erklärt sich gleichzeitig, weshalb OAG am Homogenat aus PMNL keine Effekte zeigt, da hier noch Zellmembran-Bestandteile enthalten sind. Der OAG-Effekt wird wohl über die drei Tryptophan-Reste Trp-13,-75 und -102 der Phospholipid-Bindungsstelle auf der C2-ähnlichen Domäne der 5-LO vermittelt. Dies zeigen auch Untersuchungen an der 3W mut-5LO, bei der die drei Tryptophan-Reste zu Alanin-Resten mutiert sind. Die Aktivität dieser Mutante lässt sich durch OAG unter den bereits beschriebenen Versuchsbedingungen nicht steigern. Ein weiterer Hinweis auf die Phospholipid-Bindungsstelle ist die Interaktion zwischen OAG und dem 5-LO-Inhibitor Hyperforin. Hyperforin selbst hemmt die 5-LO über diese Bindungsstelle, durch OAG wird der IC50-Wert von Hyperforin deutlich erhöht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Lipid Protein Overlay Assay für 5-LO ausgearbeitet, ein direkter Nachweis der Bindung zwischen OAG und 5-LO ist aber bisher nicht gelungen. OAG steigert nicht die Aktivität des 5-LO-Enzyms aus serumfrei kultivierten MM6-Zellen, BL41-E95-A Zellen und transfizierten HeLa-Zellen, auch die Produktmenge der Sojabohnen-LO kann nicht durch OAG beeinflusst werden. Untersucht man die Interaktion von OAG mit aufgereinigter regulatorischer Domäne (MBP-Fusionsprotein, MBP-5LO1-128), so zeigt sich eine weitere Steigerung der durch OAG-induzierten 5-LO-Aktivität, obwohl MBP-5LO1-128 bei höheren Konzentrationen eine Hemmung der 5-LO-Aktivität durch Reduktion der gebildeten 5-HPETE verursacht. Diese Ergebnisse lassen sich damit erklären, dass OAG das Bedürfnis der 5-LO für Hydroperoxide senkt und damit geringere Mengen an 5-HPETE zur Aktivierung der 5-LO ausreichen. Betrachtet man das 5-HETE/5-HPETE-Verhältnis, führt die Zugabe OAG in Abwesenheit von Ca2+ und bei 10 µg MBP-5LO1-128 zu einer geringen Abnahme des 5-HETE-Anteils. Im zweiten Teil der Arbeit wurden neue 5-LO-Inhibitoren identifiziert. Aus der Reihe der Pirinixinsäure-Derivate konnte durch entsprechende Modifikationen der potente 5-LO-Inhibitor LP 119 mit einem IC50-Wert von 0,6 µM in intakten PMNL-Zellen identifiziert werden. Durch systematisches Durchsuchen virtueller Datenbanken konnten mindestens zwei Substanzen gefunden werden, die sowohl an intakten Zellen wie auch am partiell aufgereinigten Enzym die 5-LO-Aktivität hemmen, weitere Untersuchungen ergaben, dass es sich wohl zumindest bei einer Strukturklasse um einen direkten 5-LO-Inhibitor handelt.
Die vorliegende Arbeit bietet zunächst einen weiteren Beweis für die Existenz des neutralen Heliumdimers. Darüber hinaus konnten zwei verschiedene Prozesse identifiziert werden, über die die Absorbtion eines Photons zur Ionisation beider Atome des Dimers über sehr große Abstände führen kann. Oberhalb einer Photonenenergie von 65,4 eV konnte ein ICD Prozess beobachtet werden, der über Photoionisation mit gleichzeitiger Anregung von einem der beiden Atome realisiert wird. Bei 77,86 eV konnte ICD über elektronisch angeregte Zustände bis n=6 nachgewiesen werden. In der KER-Verteilung konnten zudem Strukturen gefunden werden, die auf Vibrationsanregungen im Zwischenzustand des Dimer-Ions schließen lassen. Eine vollständig quantenmechanische Rechnung von Sisourat et al. konnte dies schließlich hervorragend bestätigen. Es konnte also ein direkter Blick auf die Vibrationswellenfunktionen des Systems erlangt werden. In anderen Systemen ist dies in der Regel nicht möglich, da sich alle Zustände üblicherweise zu einer strukturlosen Verteilung überlagern. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass sich die Winkelverteilungen von ICD- und Photoelektronen in verschiedenen Bereichen des KER mitunter stark voneinander unterscheiden. Dies konnte auf die unterschiedliche Besetzung von verschiedenen Potentialkurven zurückgeführt werden. Unterhalb der Photonenenergieschwelle zur Anregung und Ionisation eines Heliumatoms konnte ein weiterer, zweistufiger Ionisationsmechanismus gefunden werden. Hier wird zunächst durch Photoionisation ein Elektron aus einem der beiden Atome im Dimer freigesetzt. Dieses Photoelektron kann nun am neutralen Atom gestreut werden und dabei ausreichend viel Energie übertragen, um dieses ebenfalls zu ionisieren. Es konnte gezeigt werden, dass der Prozess einer Abhängigkeit von der Polarisation der Synchrotronstrahlung unterliegt, die man für Photoionisation erwarten würde. Die Energie- und Winkelverteilungen der Elektronen konnten daher mit vorangegangenen Elektronenstoß-Experimenten verglichen werden. Die gute Übereinstimmung mit diesen Daten rechtfertigt eine anschauliche Sichtweise des Prozesses als Analogon zum klassischen Billiard-Stoß. Der Two-Step-Prozess wurde bisher zwar schon in vielen Systemen als theoretisches Modell zur Doppelionisation beschrieben, allerdings konnten die einzelnen Unterprozesse bisher nicht gesondert gemessen werden. Die großen Abstände im Heliumdimer ermöglichen erstmals eine deutliche Trennung in Photoionisation an einem Atom und Elektronenstoß (e,2e) am Nachbaratom. Der Two-Step-Prozess konnte außerdem dazu verwendet werden, die ungewöhnliche Grundzustandswellenfunktion des Heliumdimers zu experimentell zu bestätigen. Eine Analyse des gemessenen KER konnte dabei deutliche Abweichungen zu einer klassischen Theorie aufzeigen. Erst eine vollständig quantenmechanische Rechnung des Übergangs von Sisourat et al. konnte die Messdaten beschreiben.