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Untersuchungen zur Bedeutung von Superoxid-Dismutasen für die Alterung von Podospora anserina
(2012)
Im Rahmen dieser vorliegenden Doktorarbeit sollte die Bedeutung von Superoxid-Dismutasen für das Resistenzverhalten und den Alterungsprozess bei P. anserina untersucht werden. Folgende Befunde aus den Analysen konnten erhalten werden:
1. Lokalisationsstudien der drei PaSods: Aus den biochemischen und fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen der drei verschiedenen PaSODs geht hervor, dass PaSOD1, eine Cu/ZnSOD, überwiegend im Cytosol und zu einem geringen Anteil im mitochondrialen Intermembranraum lokalisiert ist. Eine der beiden MnSODs, PaSOD2, wird vermutlich zur Abwehr von exogenem Superoxid sekretiert. Bei PaSOD3 handelt es sich um eine mitochondriale MnSOD.
2. Generierung von verschiedenen PaSod-Mutanten: Im Rahmen dieser Arbeit wurden von jeder PaSod mindestens drei unabhängige Überexpressionsstämme, ein GFP-Stamm- und ein Deletionsstamm hergestellt. Weiterhin wurden alle möglichen Doppel-Deletionsstämme und die Dreifach-Deletionsmutante erzeugt. Alle Stämme wurden auf DNA-Ebene verifiziert, zusätzlich wurde die Proteinmenge bzw. –Aktivität überprüft.
3. Einfluss der PaSODs auf die ROS-Toleranz: Die Analysen der ROS-Resistenzen haben gezeigt, dass PaSODs eine wichtige Rolle in der Entgiftung von Superoxiden spielt. So ließ sich bei den Deletionsstämmen der PaSods eine gesteigerte Sensitivität gegenüber Paraquat feststellen. Eine Aufsummierung der Sensitivität gegenüber Paraquat ist bei der PaSod-Tripelmutante (ΔPaSod1/2/3) zu erkennen.
Überraschenderweise kann durch die gesteigerten Mengen an aktiver PaSOD in den Überexpressionsstämmen (PaSod1-3_OEx) keine verbesserte Resistenz gegenüber Paraquat erzielt werden. Darüber hinaus führt die Überexpression des Gens für die mitochondriale SOD, PaSOD3, zu massiven negativen Effekten.
4. Einfluss auf die Lebensspanne: Durch eine fehlende Entgiftung von Superoxid in den PaSod-Deletionsmutanten ist eine Verminderung der Lebensspanne nicht festzustellen. Bei PaSod-Mutantenstämme, die eine erhöhte PaSOD-Aktivität und damit eine gesteigerte Abbaurate des Superoxids aufweisen, kann bei den PaSod1- und PaSod2-Überexpressionsstämmen keine verbesserte Lebensspanne unter den gewählten Standardbedingungen erzielt werden. Vielmehr noch ist die Lebensspanne der PaSod3-Überexpressionsstämme stark reduziert.
5. Einfluss der PaSod-Modulation auf andere Komponenten des ROS-Abbausystems: Die PaSOD-Aktivitäten scheinen miteinander co-reguliert zu werden. Des Weiteren scheint es ein Zusammenhang zwischen den beiden sekretierten Enzymen PaSOD2 und PaCATB zu geben. Deutlich wird auch, dass die Modulation der Superoxid-Dismutasen eine weitreichende Auswirkung auf andere Schutzsysteme hat. Beispielweise konnte gezeigt werden, dass Komponenten des mitochondrialen ROS-Schutzsystems und der Protein-Qualitätskontrolle in den PaSod3-Überexpressionsstämmen verändert sind.
Zusammenfassend lassen die Analysen der PaSod-modulierten Stämme den Schluss zu, dass die Superoxid-Dismutase in P. anserina ein wichtiges Enzym zum Abbau des schädlichen Superoxids darstellt, welches aber nur eine untergeordnete Rolle bei der Kontrolle der Lebensspanne unter den gewählten Wachstumsbedingungen im Labor ausübt. Des Weiteren haben die Analysen gezeigt, dass es durch die Modulation der PaSod-Gene zu weitreichenden Änderungen, die das ROS-Schutzsystem (PaSOD, PaCATB und PaPRX1) sowie die Protein-Qualitätskontrolle (PaHSP60, PaLON und PaCLPP) betreffen, kommt. Welche Auswirkung dabei diese Veränderungen in Bezug auf die Lebensspanne hat, kann nur schwer abgeschätzt werden und muss mit weiteren Untersuchungen geklärt werden.
In der Therapie des Diabetes mellitus Typ 2 ist neben Patientenschulung, Fewichtsreduktion und körperlicher Aktivität die Therapie mit oralen Antidiabetika von besonderer Bedeutung, um langfristig die Blutzuckereinstellung zu verbessern und kardiovaskuläre wie andere Folgeerkrankungen zu minimieren. Allerdings sinkt im Verlauf die Effizienz dieser Therapie, so dass die dauerhafte Gabe von Insulin notwendig wird. Dabei können jedoch auch schwerwiegende Nebenwirkungen, wie z.B. Hypoglykämien und eine wiederrum mit einem erhöhten Risiko an kardiovaskulären Erkrankungen verbundene ausgeprägte Gewichtszunahme auftreten. Demgegenüber führte der GLP-1 Rezeptor-Agonist Exenatide in jüngsten Studien zu einer Verbesserung der Blutzuckereinstellung und Reduktion des Körpergewichts und kann somit als eine neuartige Therapiealternative zum bisher verwendeten Insulin angesehen werden. In der hier vorliegenden prospektiven Studie wurde Exenatide mit Insulin bei Typ 2-Diabetes Patienten mit einer unzureichenden Stoffwechseleinstellung unter Metformin in Bezug auf deren Blutzuckereinstellung und das Hypoglykämie-Risiko verglichen. In dieser 26-wöchigen, multizentrischen, kontrollierten, randomisierten und zweiarmigen Phase IIIb-Studie wurden insgesamt 494 Patienten aus ganz Deutschland untersucht. Die Patienten mit einer unzureichenden Metformin- (Primärkollektiv) oder Kombinationstherapie (exploratives Kollektiv: Metformin plus Sulfonylharnstoff) wurden im Verhältnis 3:1 auf zweimal täglich Exenatide oder zweimal täglich Mischinsulin Aspart 30/70 randomisiert. In einem hierarchischen Modell wurde zunächst die Nichtunterlegenheit von Exenatide gegenüber dem Mischinsulin im Hinblick auf das primäre Endziel der Blutzuckereinstellung (in Form des HbA1c-Wertes) untersucht und anschließend die Überlegenheit von Exenatide in Hinblick auf ein geringeres Hypoglykämie-Risiko. Sekundäre Studienziele waren die Häufigkeit von schweren und von nächtlichen Hypoglykämien, die Veränderung des Körpergewichts sowie des Body Mass Index. Ferner wurden 7-Punkt-Blutzuckertagesprofile und Patientenfragebögen in die Auswertung einbezogen. Bei der insgesamt in acht Visiten unterteilten Studie erfolgte nach zwei Wochen die Randomisierung auf die beiden Therapie-Arme. Während die Dosierung des Mischinsulins im Verlauf der gesamten Studiendauer vom Arzt individuell titriert werden konnte, wurde die Dosis von Exenatide nach vier Wochen von 2 x 5 μg/Tag auf 2 x 10 μg/Tag verdoppelt und bis zum Ende der Studie nicht verändert. Die hier vorliegende Arbeit ist die erste Studie, die das Hypoglykämie-Risiko unter Exenatide und Mischinsulin als primären Endpunkt prospektiv und konfirmatorisch vergleichend untersucht. Im Primärkollektiv konnte die Nicht-Unterlegenheit von Exenatide zum Mischinsulin in Bezug auf den HbA1c-Wert festgestellt werden. Bei der Vermeidung von Hypoglykämien war Exenatide dem Mischinsulin statistisch signifikant überlegen. Zusätzlich konnte unter der Exenatide-Behandlung ein signifikanter Gewichtsverlust festgestellt werden, wohingegen die Patienten im Mischinsulin-Arm signifikant an Gewicht zunahmen. Die gleichzeitige Erreichung dieser Therapieziele (HbA1c<7,0%, keine Gewichtszunahme und keine Hypoglykämien) wurde als Triple-Endpoint definiert und im Exenatide-Arm signifikant häufiger als unter der Mischinsulin-Therapie beobachtet. In den 7-Punkt-Blutzuckertagesprofilen konnte neben einer allgemeinen Blutzuckersenkung in beiden Therapiearmen eine zusätzliche postprandiale Senkung zu den Zeiten der morgendlichen und abendlichen Exenatide-Injektion beobachtet werden. Demgegenüber waren die präprandialen Blutzuckerwerte im Mischinsulin-Arm niedriger, so dass insgesamt eine vergleichbare Verbesserung des Flächenintegrals in den Blutzuckertageskurven erzielt wurde, was die vergleichbare HbA1c-Verbesserung erklärt. Entsprechend zum Gewicht nahmen auch BMI und Hüftumfang der Patienten unter Exenatide ab und unter Insulin zu. Das Gesamtcholesterin und die Triglyceride sanken unter beiden Therapien leicht ab, HDL-Cholesterin stieg leicht an, wohingegen nur unter Exenatide das LDL-Cholesterin abnahm. Ebenfalls sanken nur im Exenatide-Arm der systolische und diastolische Blutdruck. Die häufigsten unerwünschten Ereignisse unter Exenatide waren Übelkeit, Erbrechen, Verdauungsstörungen, Durchfall, Kopfschmerzen und Erkältungen, wobei Durchfall, Kopfschmerzen und Erkältungen auch unter Insulin zu beobachten waren. Bei der in den Patientenfragebögen DTSQ und SF-12 dokumentierten subjektiven Empfindung der Nebenwirkungen zeigten sich allerdings eine Kompensation der deutlicheren Nebenwirkungen von Exenatide durch dessen Vorteile, u.a. im Hinblick auf seine einfachere Dosierung und der als angenehm empfundenen Gewichtsreduktion. Insgesamt war in beiden Therapie-Armen eine ausreichende Patientenzufriedenheit festzustellen. Unter denjenigen Patienten, bei denen Antikörper gegen Exenatide festgestellt wurden, nahm die Prävalenz einer Antikörperbildung gegen Exenatide bis zum Ende der Studie ab. Die Ergebnisse der hier vorgelegten Studie lassen die Schlussforderung zu, dass der GLP-1 Agonist Exenatide eine therapeutische Alternative zum Mischinsulin in der Behandlung des Diabetes Mellitus Typ 2 darstellt. Da eine Restfunktion der pankreatischen ß-Zellen eine Voraussetzung für den Therapieerfolg darstellt, sollte Exenatide möglichst früh bei nachlassender Wirkung des oralen Antidiabetikums Metformin eingesetzt werden. Hier wirkt Exenatide durch eine Verbesserung der Blutzuckereinstellung, die zudem mit einem verminderten Hypoglykämie-Risiko und einer Gewichtsreduktion verbunden ist. Die Kombination dieser drei bedeutenden Effekte hat den klinisch relevanten Vorteil, das Risiko an kardiovaskulären Spätfolgen und somit die Morbidität und Mortalität von Typ 2-Diabetikern langfristig zu senken. Dieses sollte in einer prospektiven Langzeitstudie untermauert werden.
Das photoneuroendokrine System der Vertebraten steuert die rhythmische Melatoninsynthese. Melatonin ist ein wichtiges Signal für circadiane und saisonale Rhythmen und für die Synchronisation der Föten mit dem mütterlichen Organismus. Bei Säugetieren besteht das photoneuroendokrine System aus den folgenden Komponenten: der Retina für die circadiane Lichtperzeption, dem endogenen Rhythmusgenerator im Nucleus suprachiasmaticus (SCN) und dem Pinealorgan als neuroendokrinem Effektor. Dieses System vermittelt, durch die nächtliche Abgabe des Hormons Melatonin vom Pinealorgan, Änderungen in den Belichtungsverhältnissen der Umgebung an den Körper. Bei der Synthese von Melatonin im Pinealorgan ist die Arylalkylamin Nacetyltransferase (AANAT) das geschwindigkeitsbestimmende Enzym. Die nächtlich erhöhte Expression von Aanat in Pinealozyten wird vor allem durch die Freisetzung des Neurotransmitter NA aus sympathischen Nervenendigungen angetrieben. NA bindet an adrenerge Rezeptoren in der Pinealozytenmembran und aktiviert den cAMP-Signaltransduktionsweg, der zur CRE-vermittelten gesteigerten Aanat Expression führt. In der Promoterregion von Aanat ist auch ein E-box Promoterelement vorhanden, das durch Uhrenproteine angesteuert werden kann. Bislang jedoch war die Rolle des molekularen Uhrwerkes für die Expression von Aanat noch unklar. Um zu untersuchen, wie sich eine Schwächung des negativen Regulatorkomplexes auf die Expression von Aanat im Pinealorgan und in anderen Geweben auswirkt, wurden Mäuse mit gezielter Deletion des Per1 Gen (Per1 KO) untersucht. Die Expression von Aanat im Pinealorgan von Per1 KO Mäusen, die in der Standardphotoperiode gehalten wurden, zeigte einen circadianen Rhythmus mit ähnlicher Dynamik, aber erhöhter Amplitude im Vergleich zum WT. AANAT Enzymaktivität und Melatoninkonzentration folgen dem gleichen Profil. Eine Verkürzung der Photoperiode hat bei Per1 KO Mäusen starke Auswirkungen auf dieendogene Periodenlänge der Aanat Expression, die sich gegenüber dem WT drastisch verlängert. Bei einer Verlängerung der Photoperiode kommt es zu einer Verzögerung im Rhythmus der Aanat Expression von ca. 8 h gegenüber dem WT. Dies zeigt, dass das molekulare Uhrwerk je nach Photoperiode Amplitude, Periodenlänge und Phasenlage modulieren kann. Um zu untersuchen, ob es sich dabei um Pinealorgan-intrinsische Effekte handelt, wurden in vitro Experimente durchgeführt. Im WT-Pinealorgan gibt es zum Zeitpunkt CT18 ein Sensitivitätsfenster für die NA-induzierte Aanat Expression. Überraschenderweise steigt die Aanat Expression im unstimulierten Per1 KO Pinealorgan in der Nacht signifikant gegenüber dem subjektiven Tag an. Eine weitere Induktion durch NA ist nicht möglich. Dies deutet darauf hin, dass ein abgeschwächter negativer Regulator Komplex (NRC), welcher über das E-box Element wirkt, dieselben Auswirkungen in der Per1 KO Maus hat, wie eine NA-Stimulation im WT. Im WT wird der inhibitorische Effekt des NRC offenbar durch die NA-abhängige Aktivierung von CRE überwunden. Untersuchung zur ektopischen Expression von Aanat zeigten, dass dieses Gen in der Hypophyse einen cicadianen Rhythmus aufweist, der unabhängig von einem intakten molekularen Uhrwerk abläuft. Im Gegensatz dazu findet sich in der Milz von Per1 KO Mäusen eine verstärkte Aanat Expression am subjektiven Tag im Vergleich zum WT. Offenbar hat das molekulare Uhrwerk auch einen Einfluss auf die Gewebespezifität der Aanat Expression. Weiterhin wurde in dieser Arbeit die ontogenetische Entwicklung des molekularen Uhrwerkes im SCN von Melatoninrezeptor1 und 2 defizienten (MT1,2 -/-) Mäusen untersucht. Im Gegensatz zu Mäusen mit intakten Melatoninrezeptoren, zeigen diese Mäuse im Fötalstadium noch keinen Rhythmus in der Anzahl mPER1- und mPER2-Ir Zellen. In diesem Stadium sind die einzelnen SCN-Neurone noch kaum durch Synapsen miteinander gekoppelt. Dies deutet darauf hin, dass das mütterliche Melatonin die rhythmischen Uhrengenexpression in den einzelnen fötalen SCN-Zellen synchronisiert. Erst im juvenilen SCN ist ein Rhythmus der Uhrenproteine identisch mit dem adulten Tier. Zu diesem Stadium sind die intrasuprachiasmatischen Kontakte vermutlich schon soweit ausgebildet, dass kein rhythmisches Eingangssignal für die Synchronisation der SCN-Zellen notwendig ist.
Der hereditäre Fibrinogen-Mangel ist ein seltener Hämostasedefekt, der in einer quantitativen (Hypofibrinogenämie und Afibrinogenämie) oder qualitativen Form (Dysfibrinogenämie) bzw. einer Kombination aus beiden Formen (Hypodysfibrinogenämie) vorliegt. Seltene Ausprägungen wie die Fibrinogen- Amyloidose und die hepatische Speicherkrankheit Endoplasmic Reticulum Storage Disease (ERSD) tragen zum heterogenen klinischen Bild der Erkrankungen bei, das neben einem asymptomatischen Verlauf Blutungen und Thrombosen umfassen kann. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das Spektrum genetischer Veränderungen, deren Auswirkungen auf die klinische Manifestation und gerinnungsphysiologische Ausprägung bei 101 Probanden mit angeborenem Fibrinogen-Mangel sowie bei 41 erstgradig verwandten Familienangehörigen zu untersuchen. Die vorliegende Arbeit stellt das bisher größte zusammenhängend untersuchte und genetisch charakterisierte Patientenkollektiv mit Fibrinogen-Mangel dar. Von den insgesamt 96 nachgewiesenen Sequenz-Varianten wurden 30 erstmals beschrieben. Hierdurch ergibt sich ein Zuwachs von 15 % an der Gesamtzahl der verschiedenen bisher in der Literatur beschriebenen genetischen Defekten. Bei acht nachgewiesenen Mutationen war bisher erst eine Familie mit dieser Sequenz-Variante beschrieben. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bestätigen, dass diese Mutationen kausal für den Phänotyp des Fibrinogen-Mangels sind. Die klinische Präsentation der Patienten umfasste, häufiger als in der Literatur bisher beschrieben, zu 50 % leichte bis moderate Blutungen in Form von Menorrhagien oder verlängerten Nachblutungen nach Verletzungen. Schwere Blutungen traten bei Patienten mit Afibrinogenämie oder selten bei heterozygoten Mutationsträgern in Assoziation mit Operationen, Schwangerschaften und Traumata auf. Probanden mit ERSD erlitten gegensätzlich zu den bisherigen Beschreibungen aus der Literatur sowohl Blutungen als auch Thrombosen. Die Vorhersage des klinischen Phänotyps nach traditioneller Einteilung des Fibrinogen-Mangels anhand laborchemischer Beschreibungen war nicht zuverlässig. Zudem lagen die hierfür erforderlichen Laborparameter häufig nicht vor. Die Mutationsdiagnostik konnte zu einer verbesserten Einschätzung des klinischen Phänotyps beitragen. Spezifische Mutationen wiesen eine Korrelation zu bestimmten klinischen Manifestationen auf. Hierbei zeigte sich eine ausgeprägte Assoziation der Varianten BbArg14Cys und gAsn319-Asp320del mit thromboembolischen Ereignissen. Für weitere Mutationen (AaArg19Gly, BbArg44Cys, gTyr262Cys, gAla327Thr und gLys380Asn) ist ebenfalls eine Assoziation mit Thromboseneigung anzunehmen, konnte jedoch aufgrund kleiner Fallzahlen nicht zweifelsfrei beurteilt werden. Die am häufigsten auftretenden Mutationen an Position AaArg16 waren mit einer moderaten Blutungs- (17 % bis 53 %) und einer nur geringen Thromboserate (3 % bis 13 %) assoziiert, die jedoch für die AaArg16Cys-Variante höher lag im Vergleich zur AaArg16His-Variante. Die Mutationen gGly333Ser und gArg375Trp zeigten eine Korrelation zur hepatischen Speicherkrankheit ERSD und gingen mit einer beeinträchtigten Leberfunktion einher. Die Verdachtsdiagnose des Fibrinogen-Mangels wurde bei einem Großteil der Indexpatienten (42 %) aufgrund pathologischer Gerinnungswerte gestellt. Vor allem „Null“-Mutationen gingen jedoch oftmals mit im Referenzbereich liegenden Fibrinogen-Werten einher, so dass sich neben der mehrmaligen Fibrinogen-Bestimmung die zusätzliche Testung weiterer Laborparameter, wie die Thromboplastinzeit (TPZ), die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aPTT) und die Thrombinzeit (TZ) als hilfreich erwiesen haben. Die Bestimmung des abgeleiteten Fibrinogens (Fib. QD) zeigte sich als nicht geeignet zur Detektion des kongenitalen Fibrinogen-Mangels, da die am häufigsten vorliegenden Mutationen an AaArg16 zu keiner Erniedrigung führten. Die Messung des funktionellen Fibrinogen nach Clauss (Fib. n. Cl.), der Fibrinogen- Konzentration (Fib. Ag) und die daraus resultierende Fibrinogen-Ratio (RaAg) bzw. die Bestimmung von RZ und TZ waren die Grundlage eines in der vorliegenden Arbeit entwickelten Stufenmodells für einer schnelle und kostengünstige Mutations-Detektion. Bei Anwendung der vorgeschlagenen Stufendiagnostik im Vergleich zur herkömmlichen Komplettsequenzierung ist eine Reduktion von Arbeitsaufwand und Kosten um bis zu 64 % zu erwarten.
Im Rahmen dieser Dissertation wurde die spätpleistozäne und holozäne Landschaftsentwicklung im Umfeld der im Tal des Wadis Chuera in Nordsyrien liegenden bronzezeitlichen Siedlung Tell Chuera untersucht. Durch die Kombination von hochgenauen Vermessungen, Satellitenbildauswertungen und Untersuchungen der Wadisedimente konnten mehrere flussgeschichtliche Entwicklungsphasen erarbeitet und in einen chronostratigraphischen Rahmen eingeordnet werden. Über ein grobsandig-kiesiges System eines verzweigten Flusses wurden mindestens bis ins Obere Pleistozän mächtige Kieslagen im Untersuchungsgebiet sedimentiert. Innerhalb einer fossilen Rinne abgelagerte lössähnliche Sedimente, welche die Kiesfolgen partiell überlagern, konnten relativchronologisch ins Obere Pleistozän gestellt werden und dokumentieren vermutlich eine trockene Phase. Durch die mit scharfer Diskordanz über den Kiesen abgelagerten pelitischen Hochflutsedimente wird ein abrupter flussdynamischer Umbruch von dem eines ursprünglich verzweigten Flusses zu dem eines mäandrierenden Flusses mit Hochflutsedimentation nachgewiesen. IRSL-Datierungen stellen den Beginn der Ablagerung der Hochflutsedimente ins letzte Glazial. Der größte Teil der Sedimente wurde jedoch im frühen und mittleren Holozän (ca. 9 und 5 kaBP) abgelagert, so dass zu Beginn der Hauptsiedlungsphase am Tell Chuera (3. Jahrtausend v.Chr.) die Oberfläche der Überschwemmungsebene ihr heutiges Niveau nahezu erreicht hatte. Bis dahin führten großflächige Überschwemmungen zur Hochflutsedimentation in der Aue. Ein erneuter Wechsel der fluvialen Geomorphodynamik und der Sedimentationsverhältnisse zeigt sich darin, dass die letzten ca. 5000 Jahre keine nennenswerte Sedimentation in der Hochflutebene zu verzeichnen war. Es kam zu einer bis heute stattfindenden, lateralen Verlagerung der Mäander des Wadis und damit der Aufarbeitung von Teilen der Kiese und Hochflutsedimente. Siedlungsspuren im Wadiverlauf weisen auf eine Periodizität des Abflusses des Wadis Chuera zwischen etwa 4.7 und 4.2 kaBP hin. Die Theorie einer verstärkten Akkumulation von Kolluvien der Rahmenhöhen im Wadital als direkte Folge eines steigenden Siedlungsdrucks während der Hauptsiedlungsphase konnte widerlegt werden. Vielmehr handelt es sich bei den vermeintlichen Kolluvien um fluvial aufgearbeitete Hochflutsedimente. Anthropogene Eingriffe in den Landschaftshaushalt lassen sich in Form von Kalkkrustensteinbrüchen und einem komplexen Wegenetz nachweisen.
Aktivierende Mutationen der Fms-like tyrosine kinase (FLT3) treten bei 25 % der Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) auf und begünstigen die unkontrollierte Proliferation maligner Blasten. Autophagie ist ein intrazellulärer Prozess, durch den zytoplasmatische Bestandteile lysosomal abgebaut werden und fungiert als intrazellulärer Homöostase-Mechanismus unter Stress-Bedingungen.
Ziel dieser Arbeit war es, herauszufinden, ob FLT3-ITD+-AML-Zellen vulnerabel gegenüber Autophagie-Hemmung sind.
Hierzu wurde zunächst untersucht, wie sich FLT3-ITD-Signaling und Autophagie unter basalen Wachstumsbedingungen gegenseitig beeinflussen. In einem genetischen Modell zeigte sich, dass FLT3-ITD-transformierte wachstumsfaktorunabhängige Zellen während ihrer fortgesetzten Proliferation vermehrt Autophagie betreiben. Lysosomale Autophagie-Inhibitoren zeigten jedoch unter diesen Bedingungen keine erhöhte Wirksamkeit gegenüber FLT3-ITD-positiven Zellen. Humane FLT3-ITD-positive AML-Zellen zeigten nach genetischer Deletion von ULK1 ebenfalls nur transiente und milde Proliferationsdefizite. Unter basalen Wachstumsbedingungen zeigte sich also keine erhöhte Vulnerabilität FLT3-ITD-exprimierender Zellen gegenüber Autophagie-Inhibition.
Daraufhin wurde die Bedeutung von Autophagie während pharmakologischer Hemmung von FLT3 untersucht. FLT3-Inhibition mittels AC220, einem FLT3-spezifischer Tyrosinkinase-Inhibitor, induzierte bzw. steigerte die autophagische Aktivität ähnlich stark wie eine direkte mTOR-Inhibition. Dies ließ sich im Zellmodell therapeutisch ausnutzen: eine Kombinationsbehandlung mit AC220 und einem lysosomalen Autophagie-Inhibitor zeigte eine synergistische antiproliferative Wirkung. Dies stellt möglicherweise einen neuen rationalen Kombinationsbehandlungsansatz für die Therapie FLT3-ITD-positiver AML-Patienten dar.
Die vorliegende Arbeit hat das Ziel, Plasmen koaxialer Beschleuniger in Hinblick auf die Erzeugung hoher Elektronendichten sowie als intensive UV/VUV-Backlighterquelle zu untersuchen. Hierzu wurde zunächst die Geometrie eines einzelnen Beschleunigers charakterisiert und optimiert, um die bestmöglichen Voraussetzungen für die anschließend durchgeführten Untersuchungen zur Kollision und Kompression der erzeugten Plasmen zu schaffen.
Das Funktionsprinzip des verwendeten Plasmabeschleunigers basiert auf einer Lorentzkraft, die aus dem Stromfluss zwischen zwei koaxial angeordneten Elektroden und dem damit verbundenen Magnetfeld resultiert. Da weder Stromdichte noch Magnetfeld homogen sind, wirkt auch die Lorentzkraft inhomogen auf die Plasmaschicht. Unter Einbeziehung von Simulationen wurde der Abstand zwischen den Elektroden auf 2,5 mm gesetzt, sodass die Ausprägung dieser Inhomogenität möglichst gering gehalten wird. Um ein Pinchen des Plasmas am Ende der Elektroden zu vermeiden haben die Elektroden im Gegensatz zu Plasma Focus Devices die gleiche Länge. Der mit 130 nH niederinduktive elektrische Aufbau ermöglicht die zur Ausbildung einer Plasmaschicht erforderlichen Stromanstiegsraten in der Größenordnung von 10^11 A/s.
Die Messung der Geschwindigkeit der Plasmaschicht erfolgte mit einem Array aus sechs Dioden, die gleichzeitig die Geschwindigkeitsabnahme im Rezipienten dokumentieren. Zusätzlich wurden die Messungen mit Kameraaufnahmen verglichen. Bei einer Elektrodenlänge von 100 mm konnten mit dem verwendeten Heliumgas Schichtgeschwindigkeiten von bis zu (79,49 ± 7,98) km/s erreicht werden. Die Untersuchung von Elektroden mit 200 mm Länge verfolgte das Ziel, durch die größere Beschleunigungszeit höhere Geschwindigkeiten und kinetische Energien der austretenden Plasmaschicht zu erreichen. Es zeigte sich jedoch, dass es hierbei zur Ausbildung einer zweiten Entladung und einer damit verbundenen Abbremsung des Initialplasmas kommt. Die Untersuchungen ergaben, dass die optimale Elektrodenlänge dadurch gegeben ist, dass der Austritt des Plasmas aus dem Beschleuniger zum Zeitpunkt des ersten Stromnulldurchgangs erfolgt. Für die Berechnung der optimalen Elektrodenlänge wurde ein Skalierungsgesetz gefunden, die auf experimentellen Ergebnissen und Simulationen basiert.
Mit spektroskopische Messungen der Stark-Verbreiterung der Hβ-Linie konnte die Elektronendichte des Plasmas zeit- und ortsintegriert bestimmt werden. Die hierbei erzielte Maximaldichte von (6,83 ± 0,83) · 10^15 cm^-3 wurde bei 9 kV und 70 mbar gemessen. Die nach der Boltzmann-Methode zeit- und ortsintegriert bestimmten Elektronentemperaturen bewegt sich bei etwa 1 eV.
Nach ausreichender Charakterisierung des Einzelbeschleunigers wurde das Experiment um einen zweiten, baugleichen Plasmabeschleuniger erweitert, um die planare Kollision zweier Plasmen zu untersuchen. Die maximal gemessene Elektronendichte von n max e = (1,36 ± 0,21) · 10^16 cm^-3 bei 9 kV und 70 mbar stellt im Vergleich zum Einzelplasma eine Steigerung um einen Faktor von 2,48 dar und ist mit einer Temperaturerhöhung einhergehend. Diese Elektronendichteerhöhung lässt sich nicht durch einfaches Durchdringen der Schichten erklären. Vielmehr muss es in der Kollisionszone zu Wechselwirkungsprozesse in Form von Kompression, zur Erzeugung neuer Ladungsträger oder der Kombination aus beidem kommen.
Das Spektrum im UV/VUV-Bereich weist Linien von ab 85 nm auf. Dies stellt eine Verbesserung gegenüber dem Einzelbeschleuniger dar, bei dem die hochenergetischste Spektrallinie erst bei 97 nm gemessen wurde. In der Kollisionskonfiguration mit einem Beschleunigerabstand von 30 mm steigt die integrierte Gesamtintensität des Spektrums bis 300 nm zudem um einen Faktor von etwa 5,2.
Als Alternative zur Plasmakollision wurde die Kompression des Plasmas des Einzelbeschleunigers durch unterschiedliche Trichtergeometrien untersucht. Die untersuchten Trichter der ersten und zweiten Generation unterscheiden sich im Wesentlichen im Durchmesser der kleineren Öffnung. Dieser wurde basierend auf Simulationen von 5 mm auf 0,5 mm reduziert. Die Dichtediagnostik der ersten Trichtergeneration erfolgte hierbei über Hα-Linie, da die Verbreiterung der Hβ-Linie zu stark und daher nicht mehr anwendbar war. Die Auswertung der Halbwertsbreiten der Hα-Linie führt zu Elektronendichten in der Größenordnung von bis zu 1018 cm−3 bei Spannungen von 9 kV. Diese Steigerung um 1,5 bis 2,5 Größenordnungen im Vergleich zum Einzelbeschleuniger ist deutlich höher als das Verhältnis der Flächen des initialen Plasmas bzw. dem Ende des Trichters von etwa acht.
Der Trichter mit verringerter Öffnung wurde bei 5 kV und 5 mbar vermessen, um die mechanische Belastung durch den hohen Druck gering zu halten. Die Bestimmung der Elektronendichte erfolgte durch die Verbreiterung der Kupferlinie bei 479,4 nm nach den quadratischen Stark-Effekt. Trotz der im Vergleich zur ersten Trichtergeneration reduzierten Entladungsenergie und verringertem Druck sind die gemessenen Elektronendichten ebenfalls bei bis zu 10^18 cm^-3.
Durch die Kompression des Plasmas weist das Spektrum im UV/VUV-Bereich bereits Linien ab Wellenlängen etwa 53 nm auf, wobei es unter Berücksichtigung der Transmissionsgrenze von Helium bei 50 nm denkbar ist, dass das Plasma noch niedrigere Wellenlängen emittiert.
Aufgrund der gesammelten Ergebnisse lässt sich festhalten, dass sich die Elektronendichte sowohl durch die Kollision zweier Plasmen als auch durch die Kompression in Trichtergeometrien steigern lässt. Der Verdichtungseffekt der Trichterkompression ist hierbei um ein vielfaches höher, als bei der Plasmakollision. Dies spiegelt sich auch im UV/VUV-Spektrum wider. Beide Versuchsanordnungen eignen sich als Linienstrahler, allerdings weist das Spektrum der Trichterkompression Linien deutlich höherer Anregungszustände auf.
In dieser Arbeit werden Projekte beschrieben, in denen das Adsorptionsverhalten von Proteinen und Bakterien an verschiedene Materialoberflächen manipuliert wird.
Durch die Reaktion verschiedener oxidischer Oberflächen mit Glycidol konnten biorepulsive Polyglycerolschichten erzeugt werden. Für die Herstellung dieser Polyglycerolschichten wurden zwei unterschiedliche Verfahren entwickelt und untersucht. Die erste Methode beruht auf der Bildung einer aminoterminierten Monolage auf Silicium-Oberflächen, an der in einem zweiten Schritt die Polymerisation von Glycidol durchgeführt wird. Die Dicke der angebundenen Polyglycerolschicht ist abhängig von der Beschichtungsdauer, wobei die dicksten Schichten bis zu 98% der Bakterienadhäsion unterdrücken können. Das zweite Verfahren ist die direkte Anbindung von stabilen Polyglycerol-Beschichtungen an Silicium-, Aluminium- oder Stahl-Oberflächen. Je größer die abgeschiedene Polyglycerolmenge ist, desto höher ist die Biorepulsivität der Schicht, was durch Adsorptionstests mit Proteinen und ermittelt wurde.
Polyglycerolschichten eignen sich besonders gut für die nachträgliche Modifizierung. So konnten beispielsweise mittels Elektronenstrahlen laterale Strukturierungen der Polyglycerol-beschichteten Oberflächen erfolgreich durchgeführt werden. Sensorisch aktive Moleküle wie Ethylendiamintetraessigsäure oder Biotin konnten im Rahmen dieser Arbeit nachträglich an Polyglycerolschichten angebunden werden. Die Aktivität der Bindungsstellen nach der Anbindung an die Oberfläche konnte dabei durch spezifische Erkennungsereignisse nachgewiesen werden.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden selbstanordnende Monoschichten mit Oligoethylenglycol (OEG)-Kopfgruppen und Thiolat-Ankergruppen verwendet, um lateral strukturierbare, biorepulsive Schichten auf Gold zu erzeugen. Es wurde untersucht, ob derartige OEG-Monolagen kontrolliert durch langwelliges UV-Licht (390 nm) abgebaut werden können, um proteinbindende und proteinrepulsive Bereiche auf einer Substrat-Oberfläche zu generieren. Die Bestrahlung mit UV-Licht bewirkte die Oxidation und Abspaltung der Ethylenglycol-Einheiten, wodurch die unspezifische Adsorption von Proteinen erfolgen kann. Zusätzlich konnten Photooxidations-Reaktionen an der Thiolat-Ankergruppe nachgewiesen werden, welche die Ablösung des SAM-Bausteins zur Folge haben.
Für den Einsatz von Lithographie-Techniken in mikrofluidischen Anlagen wurde das Abbauverhalten der biorepulsiven Monolage bei der Bestrahlung unter Wasser untersucht. In Abwesenheit von molekularem Sauerstoff kommt es hier lediglich zur Spaltung der Etherbindung zwischen den Ethylenglycol-Einheiten. Die Beobachtung, dass die An- bzw. Abwesenheit von molekularem Sauerstoff zu zwei unterschiedlichen Abbaumechanismen führt, kann für die Feinabstimmung der Oberflächenbeschaffenheit und somit der Proteinanlagerung genutzt werden.
Biorepulsive OEG-Monolagen können auch dazu verwendet werden, um gezielt bestimmte Biomoleküle anzulagern. Dazu können die Monolagen mit Erkennungsstellen ausgestattet werden, welche die spezifische Anbindung einer Biomolekül-Spezies ermöglichen. Gerade bei der Detektion von großen Biomolekülen oder Mikroorganismen spielt jedoch nicht nur die chemische Zusammensetzung, sondern auch die Ausrichtung der Bindungsstelle eine entscheidende Rolle. Für die Untersuchung des Orientierungseinflusses wurden Moleküle verwendet, die neben einer Mannose-Einheit als Bindungsstelle für Bakterien auch eine Azobenzol-Gruppe, welche die strahlungsinduzierte reversible Schaltung der Konformation ermöglicht, tragen. Bakterien-Adhäsionstests zeigten, dass sich die Orientierung der Mannose-Einheit auf die Anbindung der Bakterien auswirkt.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden neuartige Methoden zur Herstellung, Charakterisierung und Strukturierung biorepulsiver und biosensorischer Schichten entwickelt. Die dadurch gewonnenen Erkenntnisse sind von bedeutender wissenschaftlicher Relevanz und ermöglichen die potentielle industrielle Anwendung der entwickelten Methoden im Kontext der Material- und Biotechnologie sowie der Nanofabrikation.
Die vorliegende Arbeit setzt sich mit den Auswirkungen der Blutkomponenten (neutrophile Granulozyten und Seren) von mit HLM operierten Patienten auf die interzellulären Kontakte in cerebralen mikrovaskulären Zellverbänden auseinander. Dabei wurden Blutkomponenten sowohl von Patienten mit langen (> 80 min) als auch mit kurzen (< 80 min) HLM-Zeiten isoliert. Das Ziel war herauszufinden, welche der Blutkomponenten für die Veränderungen der Integrität und der Morphologie der Zell-Zell-Kontakte verantwortlich sind und dadurch pathologische Störungen der Blut-Hirn-Schranke verursachen können. Die Untersuchungen wurden mit einem BHS-Modell aus cerebralen mikrovaskulären Endothelzellen [BCEC] vom Schwein durchgeführt. Dabei wurde in vitro nach Behandlung des BHS-Modells mit den entsprechenden Blutkomponenten die Integrität der interzellulären Kontakte durch TEER-Messungen untersucht und die morphologischen Veränderungen sowie die Expression der zellkontaktbildenden Moleküle (VE-Cadherin, β-Catenin und Occludin) beobachtet. Es stellte sich heraus, dass Patientenseren, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Herzoperationen isoliert wurden, keinen Einfluss auf die interzellulären Kontakte der BCEC-Kulturen ausüben. Dagegen führten die Kokultivierungen der BCEC mit den neutrophilen Granulozyten [PMN], die zu den gleichen Operationszeitpunkten isoliert wurden wie die Seren, zu Veränderungen innerhalb der Zell-Zell-Kontakte sowohl auf funktioneller (TEER-Abnahme) als auch auf morphologischer Ebene. Unabhängig von der Dauer der HLM-Zeiten und den PMNEntnahmezeitpunkten wirkte sich die Zugabe von PMN herzchirurgischer Patienten durch die TEER-Reduktion negativ auf die Integrität der BCEC-Kulturen aus, wobei PMN, die während des herzschirurgichen Eingriffes isoliert wurden, zu etwas stärkeren aber nicht signifikanten TEER-Abnahmen führten als die preoperativ (vor Narkose) isolierten. Auf morphologischer Ebene konnte man ebenfalls durch die Zugabe von PMN herzchirurgischer Patienten verschiedene Veränderungen der interzellulären Kontakte in BCEC-Kulturen beobachten. Die Patienten-PMN führten unabhängig von den Operationszeitpunkten, an denen sie isoliert wurden, und der Länge der HLM-Zeiten zu einer Ausstreckung der BCEC und somit zu einer Zellformveränderung sowie zu einer Verminderung des membranassoziierten β-Catenin- und Occludin-Anteils und einer Umwandlung des „zickzack“ Membranmusters in ein glattes, fast linienförmiges Muster. Zusätzlich konnte man mit Hilfe der Western-Blot-Analyse eine Abnahme der β-Catenin-Expression (AJ-Protein) in BCEC-Kulturen feststellen, die mit während und nach HLM-Einsatz isolierten PMN kokultiviert wurden. Dabei stammten die isolierten PMN von herzchirurgischen Patienten mit langen HLM-Zeiten aber auch von älteren (77 und 79 Jahre) mit kurzen HLM-Zeiten, was auf eine Abhängigkeit des durch die Patienten PMN verursachten negativen Expressionseffektes vom Patientenalter und der Dauer der HLM-Einsatzzeit deutete. Einen Einfluss der Patienten PMN auf die Expression von VE-Cadherin und Occludin konnte nicht festgestellt werden. Durch die Charakterisierung der Konzentrationsverläufe von neurologischen Markern in herzchirurgischen Patientenseren konnte eine Korrelation zwischen der Dauer der HLM-Einsätze und der NSE- und S-100B-Konzentration in Patientenseren fesgestellt werden. Pathologische Werte der beiden neurologischen Marker konnten jedoch nur bei Patienten mit HLM-Zeiten von mehr als 80 Minuten gemessen werden. Im tierexperimentellen Modell wurde dann die Modifikation der Blut-Hirn-Schranken-Permeabilität im Rahmen von herzchirurgischen Eingriffen mit HLM untersucht. Durch quantitativen Nachweis im Hirngewebe von intravenös appliziertem Evan's-Blue Farbstoff konnte eine erhöhte Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke bei den mit HLM operierten Tieren festgestellt werden. Eine Hirnödembildung war jedoch 6 Stunden nach Experimentende mit Hilfe von MRT-Untersuchungen in keinem der untersuchten Fällen zu beobachten. Zusätzlich zu den oben genannten Experimenten wurde die stabilisierende Eigenschaft von Interferon-β [FN-β] gegenüber dem Blut-Hirn-Schranke-Modell untersucht. Dabei führte die Behandlung der konfluenten BCEC-Kulturen mit IFN-β verschiedener Konzentrationen zu hohen TEER-Anstiegen, was auf eine Stabilisierung der interzellulären Kontakte und somit der Integrität und der Barriereeigenschaften der konfluenten BCEC-Kulturen hinwies.
Der Pilz Podospora anserina ist seit mehr als fünf Jahrzehnten ein wichtiger Modellorganismus für die Alternsforschung. Insbesondere die Mitochondrien, essentielle eukaryotische Zellorganellen – wegen ihrer Funktion im Energiestoffwechsel häufig auch als „zelluläre Kraftwerke“ bezeichnet, sind Schlüsselfaktoren für den Alterungsprozess dieses Organismus.
Im Rahmen einer vorangegangenen Diplomarbeit wurde daher der Einfluss der mitochondrialen CLPXP-Protease, einem bisher noch wenig erforschten Bestandteil der Proteinqualitätskontrolle in Mitochondrien, auf die Alterung von P. anserina untersucht. Mitochondriale CLPXP-Proteasen sind, wie auch ihre bakteriellen Pendants, aus zwei verschiedenen Untereinheiten aufgebaut: der Protease-Komponente CLPP und der Chaperon-Komponente CLPX. Die Deletion des Gens PaClpP, kodierend für CLPP in P. anserina, führte zu einer überraschenden Verlängerung der gesunden Lebensspanne der Mutante. Darüber hinaus war es möglich, den pilzlichen PaClpP-Deletionsstamm durch Einbringen von CLPP des Menschen zu komplementieren. Dies beweist, dass die Proteasen CLPP des Menschen und von P. anserina funktionell homolog sind. Dadurch eröffnete sich die Perspektive, diesen einfachen Modellorganismus für die Gewinnung potenziell auf den Menschen übertragbarer Erkenntnisse einzusetzen. Bedeutenderweise ist die menschliche CLPXP-Protease wahrscheinlich involviert in die Entstehung verschiedener Krankheiten, darunter das Perrault-Syndrom sowie einige Krebsarten. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind jedoch noch weitestgehend unverstanden.
Ziel des in dieser Dissertation beschriebenen Forschungsprojektes war daher die Gewinnung genauerer Einsichten in die molekulare Funktion und die daraus folgende biologische Rolle der mitochondrialen CLPXP-Protease von P. anserina. Der wohl wichtigste Punkt für das detaillierte Verständnis einer Protease ist die Kenntnis ihres Substratspektrums, d. h. der von ihr abgebauten Proteine. Tatsächlich wurde aber bis heute noch in keinem eukaryotischen Organismus eine umfassende Analyse der Substrate einer mitochondrialen CLPXP-Protease vorgenommen. Um diese Wissenslücke zu füllen, wurde in der vorliegenden Arbeit eine ursprünglich in Bakterien entwickelte Verfahrensweise, der sogenannte CLPP „Substrat-trapping Assay“, in P. anserina implementiert. Dafür mussten zunächst die notwendigen handwerklichen Voraussetzungen für den Assay geschaffen werden, insbesondere die effiziente Affinitätsaufreinigung von Proteinen aus isolierten Mitochondrien – einer bisher in P. anserina noch nicht angewandten Technik. Unter Verwendung verschiedener neu hergestellter Varianten der menschlichen Protease-Komponente CLPP, darunter einer proteolytisch inaktiven Variante zum „Einfangen“ von Substraten, konnte der CLPP „Substrat-trapping Assay“ in P. anserina erfolgreich durchgeführt werden. Insgesamt wurden, in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Julian D. Langer (Max-Planck-Institut für Biophysik; Durchführung von massenspektrometrischen Analysen) nahezu 70 spezifische Proteine erstmalig als potenzielle Substrate oder Interaktionspartner einer mitochondrialen CLPXP-Protease identifiziert. Bei einem Großteil dieser Proteine handelt es sich um Enzyme und Komponenten verschiedener Stoffwechselwege – vor allem um solche, die eine zentrale Rolle im mitochondrialen Energiestoffwechsel spielen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit legen somit folgende Arbeitsthese als Schlussfazit und gleichzeitig Ausganspunkt für zukünftige Untersuchungen nahe:
Die hauptsächliche molekulare Funktion der mitochondrialen CLPXP-Protease in P. anserina ist die Degradation von Stoffwechselenzymen und ihre biologische Rolle demnach die Kontrolle und Aufrechterhaltung des mitochondrialen und zellulären Energiestoffwechsels.
Insgesamt ist die auf Grundlage des CLPP „Substrat-trapping Assay“ in P. anserina anzunehmende Rolle der mitochondrialen CLPXP-Protease als regulatorische Komponente des mitochondrialen Energiestoffwechsels erstaunlich gut mit Beobachtungen in anderen eukaryotischen Organismen, gerade bezüglich der Relevanz der CLPXP-Protease des Menschen für diverse Krankheiten, zu vereinbaren. Somit erscheint es überaus sinnvoll und vielversprechend, dass in dieser Doktorarbeit erstellte und bisher beispiellose Kompendium potenzieller in vivo Substrate und Interaktionspartner dieser Protease auch als Referenz für zukünftige Untersuchungen außerhalb von P. anserina anzuwenden.
Somsanit® (Natrium-γ-Hydroxybutyrat) wird schon seit vielen Jahren zur Langzeitsedierung von Intensivpatienten eingesetzt. Durch das Vorliegen als Natriumsalz, kann bei Langzeitanwendung oft schon nach wenigen Tagen eine Hyperatriämie auftreten, die zum Absetzen des Präparates führen kann. Um diesen Nachteil von Somsanit® zu überwinden, wurde von Dr. F. Köhler Chemie das Natrium-freie GHB-Analogon Butamidol (γ-Hydroxybuttersäure-Ethanolamid) entwickelt. In klinischen Studien zeigte Butamidol eine adäquate Sedierung von Intensivpatienten, besaß aber selbst in hohen Dosierungen keine narkotische Wirkung. GHB, welches auch physiologisch in Gehirn vorkommt, führt konzentrationsabhängig von einer tiefen Sedation bis hin zur Narkose. Aus der Literatur ist bekannt, dass beide GHB-Effekte durch einen Agonismus an GABAB-Rezeptoren ausgelöst werden. Die GHB-Konzentrationen die dafür benötigt werden, können aber nur durch exogen zugeführtes GHB erreicht werden. In physiologischen Konzentrationen bindet GHB an den GHB-Rezeptor, dessen Funktion bisher noch nicht eindeutig aufgeklärt werden konnte. Das Ziel dieser Arbeit war, die Affinität von Butamidol und GHB an den beiden Systemen GABAB- und GHB-Rezeptor zu untersuchen und mögliche Unterschiede aufzuklären. Im Radiorezeptor-Assay zeigte Butamidol eine geringere Affinität zum GABAB-Rezeptor als GHB (Butamidol: Ki = 399.5 mM; GHB: Ki = 10.6 mM) und eine agonistische Wirkung am GABAB-Rezeptor wurde, über die Hemmung spannungsabhängiger Ca2+-Kanäle in Synaptosomen, nur für GHB nachgewiesen. In der nachfolgenden Untersuchung der GABAB-Rezeptor Signaltransduktionskaskade wurden, durch die akute GHB-Gabe, die Phospho-ERK-Level im Hippocampus von Mäusen vermindert. Der gleiche Effekt wurde für die akute Behandlung mit dem GABAB-Agonisten Baclofen erhalten, aber nicht für Butamidol. In Experimenten zur Modulation des GABAergen Systems, durch die subchronische Behandlung von Mäusen mit GHB oder Butamidol, wurde nur nach GHB-Behandlung eine Steigerung des synaptosomalen GABA-Uptakes detektiert. Somit konnte eine Beeinflussung des GABAergen Systems durch Butamidol an mehreren möglichen Angriffspunkten ausgeschlossen werden. Als zweites in Frage kommendes Target für Butamidol wurde das GHB-System untersucht. In Radiorezeptor-Bindungs-Versuchen wurden zur Verdrängung des antagonistischen Radioliganden [3H]NCS-382 höhere Butamidol Konzentrationen benötigt, als zur Verdrängung des Agonisten [3H]GHB (Ki: 1296 vs. 452 μM). Ein vergleichbarer „Shift“ zu höheren Konzentrationen zeigte auch der „kalte“ Agonist GHB und nicht der „kalte“ Antagonist NCS-382 (GHB: Ki 3.10 vs. 1.41 μM; NCS-382: Ki 0.431 vs. 0.447 μM). In einer weiteren subchronischen Behandlungsstudie von Ratten mit Butamidol und GHB wurde für GHB eine Erniedrigung der Gesamt-Rezeptor-Population und für Butamidol eine Erhöhung des Anteils der Agonist-Bindungsstellen an der Gesamt-Rezeptor-Population erhalten. Dieses Ergebnis kann für GHB als Hinweis auf ein agonistisches und für Butamidol als partiell agonistisches Bindungsverhalten am GHB-Rezeptor interpretiert werden. Da im GHB-Radio-Rezeptor-Assay relativ hohe Butamidol Konzentrationen zur Verdrängung der Radioliganden eingesetzt werden mussten, wurden daran anschließend Untersuchungen zur klinischen Relevanz, der für die GHB-Rezeptor Bindung notwendigen Butamidol Konzentrationen, durchgeführt. In Behandlungsstudien von Mäusen, mit anschließender Bestimmung der Butamidol Plasma- und Hirnspiegel, wurde die Hirn/Plasma Ratio ermittelt. Aus der erhaltenen Hirn/Plasma Ratio und den aus klinischen Studien bekannten beim Menschen wirksamen Plasma-Spiegeln, lassen sich für Butamidol Hirnkonzentrationen von 200-350 μM extrapolieren, die im Konzentrationsbereich für die Bindung von Butamidol am GHB-Rezeptor liegen.
In der vorliegenden Arbeit wurde ein neuer optischer Aufbau für das Laserlabor der Abteilung Kristallographie im FB 11 an der Goethe-Universität Frankfurt beschrieben. Mit Hilfe dieses Aufbaus konnten verschiedene spektroskopische Methoden genutzt werden, um die - von Druck und Temperatur abhängige - Phasenstabilität von Calcium- und Eisencarbonaten zu untersuchen. Mit Hilfe von Raman-Spektroskopie konnte das Phasendiagramm von Calciumcarbonat (CaCO3) teilweise neu bestimmt werden. Fluoreszenzuntersuchungen an dotierten CaCO3 Proben ergaben, dass sich Europium-dotierter Calcit zunächst in eine amorphe Form umwandelt, bevor er bei ca. 15 GPa in eine amorphe 'aragonitische' Form umgewandelt wird. Die Umwandlung ist nicht reversibel. Laserheizexperimente bei 18.5 GPa an dotiertem Siderit (FeCO3) führten zur Bildung eines neuen Hochdruck-Hochtemperatur FeCO3 -Polymorphs. Die Strukturlösung erfolgte mit Hilfe von Röntgendaten, die am Deutschen Elektronen-Synchrotron (DESY) in Hamburg gewonnen wurden. Schließlich wurde eine neue Methode zur Bestimmung von Temperaturen in Laserheizexperimenten beschrieben. Sie beruht auf der Abschwächung eines Fluoreszenzsignals durch die Temperatur, welche durch die Wechselwirkung eines Heizlasers mit der Probe erzeugt wird.
1. Das Wachstum und die Fähigkeit zur Butyratproduktion von E. callanderi KIST612 wurde in geschlossenen Batch-Kulturen mit den Substraten Glukose, Methanol, Formiat, H2 + CO2 und CO untersucht. E. callanderi KIST612 zeigte sich nur bei Wachstum auf 20 mM Glukose oder 20 mM Methanol in der Lage, Butyrat in größeren Mengen (3,7 – 4,3 mM) zu produzieren. Das Hauptprodukt bei allen untersuchten Wachstumssubstraten war jedoch Acetat.
2. In bioinformatischen Analysen des Genoms von E. callanderi KIST612 konnte nur eine A1AO-ATP-Synthase gefunden werden, welche eine V-typ c-Untereinheit bestehend aus 4 TMH‘s mit nur einer Na+-Bindestelle aufweist. Diese konnte aus gewaschenen Membranen von E. callanderi durch Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation, Anionenaustausch-Chromatographie (DEAE) sowie einer Größenausschluss-Chromatographie (Superose 6) bis zur apparenten Homogenität gereinigt werden. Nach Produktion einzelner Untereinheiten (A, B, C, D, E, F und H) in E. coli und Generierung von Antikörpern, konnten alle Untereinheiten (A, B, C, D, E, F, H, a sowie c) in der gereinigten Enzympräparation immunologisch oder mittels „Peptide-Mass-Fingerprinting“ nachgewiesen werden. Es konnte somit erstmals eine A1AO-ATP-Synthase aus einem mesophilen Organismus ohne Verlust von Untereinheiten gereinigt werden.
3. Der Gesamtkomplex wies unter nativen Bedingungen eine molekulare Masse von ca. 670 kDa auf. In elektronenmikroskopischen Aufnahmen zeigte sich anhand der hantelförmigen Strukturen, dass die A1AO-ATP-Synthase als intakter Gesamtkomplex gereinigt werden konnte.
4. Die gereinigte A1AO-ATP-Synthase wurde zunächst anhand ihrer ATP-Hydrolyse-Aktivität biochemisch charakterisiert. Die ATP-Hydrolyse-Aktivität hatte ein pH-Optimum von 7 – 7,5 und ein Temperaturoptimum bei 37 °C. Durch Messung der ATPase-Aktivität in Abhängigkeit von verschiedenen Mengen an Na+ konnte die vorhergesagte Na+-Abhängigkeit des Enzyms nachgewiesen werden. Zudem zeigten Hemmstoffexperimente mit DCCD, dass dieser Inhibitor mit Na+ um die gemeinsame Bindestelle in der c-Untereinheit konkurriert. Dies bestätigte nochmals, dass das Enzym funktionell gekoppelt gereinigt werden konnte.
5. Zur weiteren Untersuchung der Ionenspezifität wurde der an die ATP-Hydrolyse gekoppelte Ionentransport durch Rekonstitution des Enzyms in Liposomen und anschließender Messung des Na+- oder H+-Transports gemessen. In den Proteoliposomen konnte mit Hilfe von 22Na+ gezeigt werden, dass das Enzym Natriumionen translozieren kann. Während in Anwesenheit des Natriumionophors ETH 2120 kein 22Na+-Transport beobachtet werden konnte, führte die Anwesenheit des Protonophors TCS zu einer geringfügigen Stimulation der 22Na+-Translokation. Insgesamt konnte ein primärer Na+-Transport nachgewiesen werden, welcher von der A1AO-ATP-Synthase aus E. callanderi katalysiert wird.
6. Durch Rekonstitution der A1AO-ATP-Synthase aus E. callanderi in Liposomen konnte erstmals biochemisch nachgewiesen werden, dass ein solches Enzym trotz seiner V-Typ c-Untereinheit in der Lage ist, ATP zu synthetisieren. Durch die Zugabe von Ionophoren (ETH 2120 und TCS) konnte der elektrochemische Ionengradient aufgehoben werden, wodurch keine ATP-Synthese beobachtet werden konnte. Der erstmalige Nachweis der ATP-Synthese wurde bei einem ΔµNa+ von 270 mV erbracht.
7. Die ATP-Synthese zeigte sich ebenfalls abhängig von der Na+-Konzentration. Der KM-Wert lag bei 1,1 ± 0,4 mM und war vergleichbar mit dem für die ATP-Hydrolyse ermittelten Wert. Ebenso konnte für die ATP-Synthese-Richtung gezeigt werden, dass DCCD mit Na+ um die gemeinsame Bindestelle in der c-Untereinheit konkurriert.
8. Um den biochemischen Nachweis zu erbringen, dass die A1AO-ATP-Synthase auch unter physiologisch relevanten Potentialen zur ATP-Synthese befähigt ist, wurde der energetische Schwellenwert der ATP-Synthese bestimmt. Dieser betrug 87 mV als Triebkraft für ΔpNa, 94 mV als Triebkraft für Δψ und 90 mV als Triebkraft für ΔµNa+. Erstaunlicherweise konnte die ATP-Synthese der A1AO-ATP-Synthase aus E. callanderi KIST612 sowohl durch Δψ als auch ΔpNa angetrieben werden. Unterschiedliche Kombinationen von Δψ und ΔpNa führten zu dem gleichen energetischen Schwellenwert; Δψ und ΔpNa waren im Enzym aus E. callanderi KIST612 äquivalente Triebkräfte.
9. Der energetische Schwellenwert der A1AO-ATP-Synthase aus E. callanderi KIST612 wurde mit dem der F1FO-ATP-Synthasen aus A. woodii, E. coli und P. modestum verglichen. Dazu wurden die Enzyme im ATP-Synthase-defizienten E. coli-Stamm DK8 produziert und anschließend durch Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie gereinigt. Nach Einbau der Enzyme in Liposomen waren alle Enzyme in der Lage, ATP als Reaktion auf ΔµNa+ (A. woodii und P. modestum) oder ΔµH+ (E. coli) zu synthetisieren. Im Vergleich zum Enzym aus E. callanderi zeigten sich zwei auffällige Unterschiede. Erstens war keine der F1FO-ATP-Synthasen in der Lage, ΔpNa/ΔpH als alleinige Triebkraft zu nutzen. Während die ATP-Synthese in den Enzymen aus E. coli und P. modestum nur durch ΔµH+ bzw. ΔµNa+ angetrieben werden konnte, konnte das Enzym aus A. woodii zusätzlich auch durch Δψ als einzige Triebkraft angetrieben werden.
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Das West-Nil-Virus (WNV) gehört zur Gruppe des Japan-Enzephalitis-Serokomplexes der Flaviviren, welches in Afrika, Asien und Mittleren Osten sowie in Süd- und Osteuropa seine Verbreitung findet. Das unerwartete Auftreten des Erregers in den USA (New York, 1999) bedingte eine große Zahl an transfusions- sowie transplantations-assoziierten WNV-Infektionen. Derzeit liegen keine Erkenntnisse über die Verbreitung des WNV in der deutschen Blutspenderpopulation vor. Aus diesem Grund war das Ziel dieser Arbeit die Bestimmung der Prävalenz und Inzidenz des Erregers zur Einschätzung der Gefahr von transfusions-assoziierten WNV-Infektionen. Zunächst wurde zur Bestimmung der Prävalenz des Erregers die Sensitivität und Spezifität verschiedener ELISAs (Panbio, Focus und Euroimmun) für die WNV-Antikörpertestung bestimmt. Es zeigte sich, dass WNV starke Kreuzreaktionen mit dem für unsere Breiten relevanten Frühsommer-Meningoenzephalitis-Virus (FSME) aufweist. Aus diesem Grund wurde zusätzlich ein FSME-ELISA sowie als Bestätigungstest ein Neutralisationstest verwendet und ein Testalgorithmus entwickelt. Für die Bestimmung der Inzidenz wurde auf den Grundlagen von Hadfield eine WNV-Reverse Transkriptase-PCR (RT-PCR) entwickelt und etabliert. Die 95% Nachweisgrenze wurde nach der Entwicklung der RT-PCR auf 54Kop./ml WNV-RNA bezogen auf eine Einzelprobe in einem Minipool bestehend aus acht Blutspenden bestimmt. Das Konfidenzintervall beträgt (CI): 42; 6 - 79; 92 Kopien/ml. Zudem wurde die Sensitivität der automatischen Extraktion mittels des auf magnetischen Festphasen beruhenden Separationsmoduls I mit der WNV-RT-PCR ermittelt. Die 95% Nachweisgrenze lag bei 225Kop./ml WNVRNA((CI): 168; 5 - 314; 3 ) bezogen auf eine Einzelprobe in einem Minipool bestehend aus acht Blutspenden. Aufgrund der etwas schlechteren Sensitivität wurde für die Bestimmung der Inzidenz die manuelle Extraktion durchgeführt. Zudem wurde das kommerzielle WNV Procleix Assay der Firma Chiron verwendet, um alle bisher in Europa aufgetretenen WNV-Stämme zu erfassen. Im Sommer 2004 wurde zunächst die Prävalenz des WNV bestimmt. Hierfür wurden 14:000 aus Hessen stammende Blutspenden von gesunden Spendern untersucht. Initial zeigte sich eine hohe Rate an anti-WNV reaktiven (5; 9 %) Blutspenden, wobei nur 0; 03% der Blutspenden im Neutralisationstest als Anti-WNV positiv bestätigt worden. 0; 15% der bestätigten anti-WNV positiven Blutspenden waren hierbei am ehesten mit Reisen in WNV-Epidemiegebiete assoziiert. Die Bestimmung der Inzidenz erfolgt im darauf folgendem Jahr durch die Untersuchung von 10:976 Blutspenden zusammengefasst in 1:372 Minipools mittels WNV RT-PCR. Von 1:372 Minipools wurden 1:247 Minipools mit dem Procleix WNV Assay untersucht. Beide Untersuchungsmethoden konnten keine WNV-positive Blutspende nachweisen. Insgesamt scheint das WNV -wenn überhaupt- nur in verschwindend geringem Maße in der deutschen Blutspenderpopulation zu exisitieren. Somit besteht derzeit keine Gefahr für transfusions-assoziierte WNV-Infektionen. Dennoch wurden importierte WNV-Infektionen aus Endemiegebieten in Deutschland beschrieben. Durch weitere Veränderungen der klimatischen Gegebenheiten wäre die Einschleppung des WNV nach Deutschland in Zukunft durchaus denkbar. Hierfür steht nun eine für das Spenderscreening taugliche Real-time PCR zür Verfügung, so dass jederzeit ein Blutspenderscreening auf WNV eingeführt werden kann.
Der Verzehr von radioaktiv belasteten Pilzfruchtkörpern stellt ein Gesundheitsrisiko für den Menschen dar und auch fast 35 Jahre nach der Reaktorkatastrophe von Tschernobyl im Jahr 1986 sind Pilze aus Waldökosystemen zum Teil noch stark durch das ausgetretene radioaktive 137Cs belastet. Die Einschätzung der Belastung und somit des Gesundheitsrisikos ist aufgrund einer Vielzahl von Einflussfaktoren, wie z. B. der Pilzart, der Tiefe des Myzels, der Bodenkontamination und der Feuchtigkeit des Bodens, schwierig. Ziel dieser Arbeit war es die Variabilität, den Einfluss verschiedener Faktoren sowie die effektive Halbwertszeit der 137Cs-Aktivität in Pilzfruchtkörpern zu ermitteln. Des Weiteren wurde überprüft, ob die Bodenkontamination für eine Abschätzung der 137Cs-Aktivität von Pilzfruchtkörpern herangezogen werden kann. Für die Untersuchungen wurden über mehrere Jahre Proben von Maronenröhrlingen (Imleria badia) und Steinpilzen (Boletus edulis) aus vier Waldgebieten in Mittel- und Süddeutschland mit unterschiedlichem Aktivitätseintrag nach der Reaktorkatastrophe von Tschernobyl im Jahr 1986 analysiert. Die Gebiete waren Eichenzell, Wülfersreuth, Oberschönenfeld und der Nationalpark Bayerischer Wald. Als Ergänzung dienten zugesendete Proben derselben Pilzarten von Mitgliedern aus Pilzvereinen aus ganz Deutschland. Zusätzlich zu den Pilzproben wurden Bodenproben gemessen, um zum einen die aktuelle Bodenkontamination zu bestimmen und zum anderen zu überprüfen, ob der Großteil des 137Cs weiterhin im Bereich des Pilzmyzels zu finden ist.
Für die Untersuchung der örtlichen Variabilität der 137Cs-Aktivität wurden Maronenröhrlinge (Imleria badia) aus dem Waldgebiet Eichenzell in den Jahren 2017 bis 2019 analysiert. Innerhalb eines Sammeltages variierten die Messwerte verschiedener Proben innerhalb des Waldgebietes teilweise um den Faktor sechs. Dabei ist die Variabilität innerhalb eines Teilgebietes größer als zwischen beiden Teilgebieten des Waldgebietes Eichenzell. Für ein repräsentatives Ergebnis eines Gebietes ist es aufgrund der Variabilität erforderlich, eine ausreichende Menge an Fruchtkörpern zu analysieren.
Um die effektive Halbwertszeit der 137Cs-Aktivität in Maronenröhrlingen (Imleria badia) zu ermitteln, wurden Proben aus drei Waldgebieten über fünf bis neun Jahre analysiert. Die Wahl der drei Waldgebiete erfolgte anhand des 137Cs-Aktivitätseintrags nach der Reaktorkatastrophe von Tschernobyl im Jahr 1986. Die Bodenkontaminationswerte variieren von 3.000 Bq/m² in Eichenzell über 12.500 Bq/m² in Wülfersreuth bis 35.000 Bq/m² in Oberschönenfeld. Die effektiven Halbwerts-zeiten liegen in einem engen Bereich von 5,2 bis 5,8 Jahre mit einem Mittelwert von 5,4 ± 0,3 Jahren. Damit reduziert sich die radioaktive Belastung der Pilzfruchtkörper in etwa fünfmal schneller als durch die rein physikalische Halbwertszeit des 137Cs von 30,08 Jahren. Durch die Hinzunahme von bereits im Jahr 1990 veröffentlichten Daten ergab sich eine längere effektive Halbwertszeit von 7,7 ± 0,6 Jahren.
Für die Untersuchung der zwei Einflussfaktoren Exposition des Sammelgebiets (Hangausrichtung nach Ost oder West) und Höhenlage wurden sowohl Maronenröhrlinge (Imleria badia) als auch Steinpilze (Boletus edulis) hinsichtlich der 137Cs-Aktivität gemessen, um die Auswirkung auf Pilzarten mit unterschiedlichem Akkumulationsvermögen zu analysieren. Als Untersuchungsgebiet diente der Nationalpark Bayerischer Wald, da dieser ein großes Gebiet umfasst und verschiedene Ausprägungen der beiden Faktoren abbildet. Zudem wurde das Gebiet in Folge der Reaktorkatastrophe von Tschernobyl stark kontaminiert und der Park ist ein beliebtes Pilzsammelgebiet. Anhand der 137Cs-Aktivität von Bodenproben konnte das Gebiet in zwei Regionen (Cluster) eingeteilt werden: eine Region mit hohem und eine mit niedrigem Aktivitätseintrag. Im Vergleich wiesen Maronenröhrlinge (Imleria badia) durchschnittlich eine um den Faktor fünf höhere 137Cs-Aktivität als Steinpilze (Boletus edulis) auf. Der Faktor Höhenlage zeigte im Gegensatz zur Exposition einen Einfluss auf die Kontamination der Pilzfruchtkörper. In Bezug auf die Höhenlage war der Einfluss nur im Falle eines hohen Aktivitätseintrags signifikant, wobei die Pilzproben aus der niedrigsten Höhenlage am höchsten belastet waren.
Zur Ermittlung der vertikalen Verteilung des 137Cs im Boden wurden in den Waldgebieten Eichenzell und Nationalpark Bayerischer Wald Proben bis zu einer Tiefe von 24 cm entnommen und anschließend in 2 cm Schichten analysiert. Alle Verteilungen konnten mit einem Gauß-Fit oder einem multiplen Gauß-Fit mit 2 bis 3 Maxima abgebildet werden. Das erste Maximum lag in allen Fällen in den organischen Horizonten oder im Übergangsbereich zum Ah-Horizont. Folglich befindet sich der Großteil des 137Cs fast 35 Jahre nach der Reaktorkatastrophe von Tschernobyl immer noch im Bereich des Pilzmyzels und kann somit von den Pilzen aufgenommen und in den Fruchtkörpern angereichert werden.
Der Vergleich der 137Cs-Aktivität der Pilz- und Bodenproben aus dem Nationalpark Bayerischer Wald ergab sowohl für Maronenröhrlinge (Imleria badia) als auch für Steinpilze (Boletus edulis) eine positive Korrelation. Nach Unterteilung der Proben anhand der Höhenlage zeigte sich eine noch stärkere Korrelation. Dies zeigt, dass neben der Bodenkontamination auch die Höhenlage einen Einfluss auf die 137Cs-Aktivität der Fruchtkörper hat.
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Weltweit stellt das kolorektale Karzinom die dritthäufigste Krebsdiagnose bei Männern und die zweithäufigste bei Frauen dar. Von den bekannten beeinflussbaren Risikofaktoren sind Ernährung, Rauchen und körperliche Aktivität zu nennen, hingegen gelten Alter, familiäre Belastung und männliches Geschlecht als nicht beeinflussbare Risikofaktoren. Neben Genmutationen, welche beispielsweise bei der Familiären Adenomatösen Polyposis coli und beim “Lynch Syndrom” eine wichtige Rolle spielen, kann auch die pathologisch verstärkte Expression von tumorrelevanten Proteinen wie z.B. induzierbare COX-2, Cyclin A, B und D, c-Fos, EGF, MMP-9, VEGF sowie das ubiquitäre RNA-Bindeprotein HuR maßgeblich zur Entstehung des Kolonkarzinoms beitragen. Viele der bislang identifizierten Zielgene des HuRs sind an der Regulation tumorpromovierender Eigenschaften wie Proliferation, Invasion, Metastasierung und Apoptose beteiligt, was HuR zu einem hochattraktiven Target der molekularen Tumortherapie macht. Bislang ist bekannt, dass eine gesteigerte HuR-Bindung an AREs in der 3’UTR vieler Zielgene entweder zur Stabilisierung und/oder
Translationsveränderung von kurzlebigen mRNAs von tumorrelevanten Genprodukten führen kann. Eine pathologisch erhöhte zytosolische HuR Akkumulation, welche bekanntlich oft mit einer ungünstigen Prognose der Tumorpatienten korreliert, wird jedoch im Wesentlichen als Folge eines fehlerhaft regulierten erhöhten Exportes des überwiegend im Zellkern lokalisierten HuR Proteins ins Zytoplasma (sogenanntes “HuR-Shuttling”) betrachtet, während genomische oder epigenetische Mechanismen vermutlich nur eine untergeordnete Rolle spielen. Der Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die Aufklärung der bisher nur wenig bekannten zugrunde liegenden Mechanismen des erhöhten HuR-Shuttlings in der Kolonkarzinom-Zelllinie DLD-1 unter besonderen Berücksichtigung PKCδ-abhängiger Signalwege. Durch Zugabe des pharmakologischen PKCδ-Inhibitors Rottlerin konnte die subzelluläre HuR-Lokalisation in den Kolonkarzinom Zelllinien DLD-1 und SW-620 deutlich reduziert werden, wobei die maximale Wirkung erst nach einer Inhibitionszeit von 16 Stunden erreicht wurde. Diese Beobachtung lässt vermuten, dass Rottlerin die PKCδ Aktivität in DLD-1 Zellen hemmt. Hingegen konnten Inhibitoren von verschiedenen MAPK-Kinasen (SB203580, SP600125, PD98059, Raf-1-Inhibitor) die basale zytoplasmatische HuR Lokalisation nicht beeinflussten, ebensowenig der pharmakologische Inhibitor der Calcium-abhängigen PKCs (PKCα und PKCβ) Gö6976. Auf der anderen Seite bewirkte das Phorbolester PMA eine deutliche Steigerung der PKC-Aktivität. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit nach tumorrelevanten Genen gesucht, deren Expression in humanen Kolonkarzinomzellen posttranskriptionell von HuR und gleichzeitig von PKCδ kontrolliert wird. Mit Hilfe von RNA-Pulldown Experimenten konnte gezeigt werden, dass die Hemmung der PKCδ funktionell zu einer starken Reduktion der an HuR-gebundenen mRNAs wie c-myc, cyclin A und D sowie COX-2 führt. Schließlich haben Aktivitätsmessungen der Gesamt-PKC-Aktivität gezeigt, dass diese in Kolonkarzinom-Zelllinien nachweisbar und damit basal aktiv ist. Die Untersuchungsergebnisse dieser Arbeit können zum besseren Verständnis der pathophysiologischen Bedeutung des ubiquitären RNA-Bindeproteins HuR für die Kolonkarzinogenese sowie der prokarzinogenen Rolle der PKCδ im Kolongewebe beitragen.
CFTR ist ein Chloridkanal, der bei der rezessiven Erbkrankheit Mukoviszidose defekt ist. Es ist bekannt, dass CFTR durch Proteinkinasen aktiviert und seine Aktivität durch Nukleotide reguliert wird. Die Regulation von CFTR wurde unter zwei verschiedenen Gesichtspunkten untersucht. Zum einen wurden Experimente durchgeführt, die Aufschluss über die Beteiligung der Nukleotidbindedomänen beim Öffnen und Schließen des Kanals und über die Notwendigkeit einer ATP-Hydrolyse geben sollten. Zum anderen wurde untersucht, ob neben der durch Proteinkinasen vermittelten Aktivierung von CFTR ein alternativer Prozess existiert. Hierbei wurde ein Regulationsmechanismus entdeckt, der eine Proteinkinase-unabhängige Aktivierung von CFTR durch Phosphatidylinositolphosphate ermöglicht.
Humaner CFTR wurde in Oozyten des Krallenfrosches Xenopus laevis heterolog exprimiert und mit der Patch-Clamp-Methode untersucht. Stationäre und zeitaufgelöste Ströme des CFTR-Wildtyps wurden mit mutierten CFTR-Kanälen verglichen. Das Lysin im Walker AMotiv ist an der Koordinierung des γ-Phosphats von MgATP bei der Hydrolyse beteiligt, so dass Walker A-Mutationen die ATP-Bindung und –Hydrolyse von ATPasen beeinflussen. In dieser Arbeit wurden Walker A-Mutanten untersucht, die eine Substitution des konservierten Lysins innerhalb der Walker A-Sequenz der NBD1 (K464A) oder beider Nukleotidbindedomänen (K464A/K1250A) aufwiesen. Da die Öffnungsgeschwindigkeit der Mutante K464A kaum einen Unterschied zu der des Wildtyps aufzeigte, die Mutante K1250A jedoch das Öffnen stark verlangsamte, wurde gefolgert, dass keine Hydrolyse von ATP an der NBD1 für die Öffnung nötig ist. Während Wildtyp-Kanäle auf eine gleichzeitige Applikation von ATP und AMP-PNP, einem nichthydrolysierbaren ATP-Analogon, mit einem verlängerten Offenhalten der Kanäle („locked open“–Effekt) reagierten, das sich in einem langsamen Schließen der Kanäle äußerte, konnte bei K464A-Mutanten dieser Effekt nicht beobachtet werden. Außerdem erfolgte das Schließen der Doppelmutante K464A/K1250A im Vergleich zur Einzelmutante K1250A nach MgATP-Entzug schneller. Daraus wurde geschlossen, dass die NBD1 auf das durch die NBD2 vermittelte Offenhalten des Kanals, möglicherweise durch eine direkte Interaktion, regulierend einwirkt, bevor letztere den Kanal wieder schließt. Da auch ein Öffnen und Schließen des CFTR-Kanals unter Mg2+-freien Bedingungen zu beobachten war, unter denen keine ATP-Hydrolyse erfolgen kann, konnte die Notwendigkeit einer ATP-Hydrolyse bezüglich des Kanalgatings ausgeschlossen werden. Ein Einwirken der NBD1 auf das Offenhalten der Kanäle durch die NBD2 war unter nicht-hydrolytischen Bedingungen anhand des Vergleichs der Schließkinetiken von WT und Mutante K464A nicht feststellbar, so dass eine direkte Interaktion beider Nukleotidbindedomänen wahrscheinlich ausgeschlossen werden kann.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde der Effekt des Phospholipids Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) auf CFTR-Kanäle untersucht. Die Applikation von PIP2 und MgATP zu unphosphorylierten CFTR-Kanälen zeigte einen deutlichen Stromanstieg, der einem Chloridstrom entsprach. Einzelkanaluntersuchungen ergaben, dass durch PKA induzierte Kanäle und Einzelkanäle, die durch PIP2 aktiviert wurden, dieselbe Leitfähigkeit von ~5 pS besaßen. Somit konnte eine PIP2-induzierte Aktivität endogener Chloridkanäle ausgeschlossen und ein Einfluss des Phospholipids auf CFTR-Chloridkanäle bewiesen werden, der zudem ATP-abhängig war.
Neben PIP2, welches den stärksten Effekt auf die CFTR-Aktivität zeigte, konnten auch Phosphatidylinositol (PI) und Phosphatidylinositol-4-monophosphat (PIP), sowie Arachidonsäure unphosphorylierte CFTR-Kanäle aktivieren. Damit wurde gezeigt, dass der Effekt des Signalanstiegs durch Phosphatidylinositole abhängig von der Struktur des Moleküls war, also von der Anzahl der Phosphatgruppen am Inositolring und der Fettsäurezusammensetzung des Phospholipids.
Experimente, die unter Mg 2+-freien Bedingungen durchgeführt wurden, so dass eine Phosphorylierungsreaktion durch Kinasen ausgeschlossen werden konnte, zeigten dennoch eine PIP2-vermittelte Aktivierung von unphosphorylierten CFTR-Kanälen. Auch eine Substitution des nicht-hydrolysierbaren ATP-Analogons AMP-PNP anstelle von ATP erlaubte die Öffnung unphosphorylierter CFTR-Kanäle. Mit diesen beiden Ergebnissen wurde gezeigt, dass eine PIP2-vermittelte Aktivierung von unphosphorylierten CFTR-Kanälen unabhängig von einer Proteinphosphorylierung ist.
Physiologisch betrachtet könnte man sich vorstellen, dass über die Aktivierung von Lipidkinasen die Synthese von PIP2 über PI und PIP stimuliert wird, so dass das Phospholipid, wie für viele Ionenkanäle und Transporter gezeigt, eine direkte Interaktion mit dem Protein eingeht. Eine ATP-abhängige Synthese von PIP2 in Makropatches an Xenopus-Oozyten durch endogene Lipidkinasen könnte eine mögliche Erklärung für den gezeigten ATP-abhängigen Anstieg des CFTR-Signals sein.
In dieser Arbeit wurde bei CFTR-Kanälen zum ersten Mal ein alternativer Regulationsmechanismus über Phosphatidylinositolphosphate identifiziert, der Proteinkinaseunabhängig ist und der möglicherweise über eine direkte Interaktion zwischen dem Phospholipid und dem Protein vermittelt wird.
Das Ziel dieser Dissertation war es, die biologische Relevanz der F1Fo-ATP-Synthase für den Alterungsprozess des Ascomyceten P. anserina aufzuklären sowie die Funktion der Dimerisierungsuntereinheiten PaATPE und PaATPG genauer zu untersuchen. Folgende Ergebnisse wurden dabei erzielt:
1. Der Verlust einer Dimerisierungsuntereinheit führt in P. anserina zum Verlust der Dimerisierungsfähigkeit der F1Fo-ATP-Synthase. Dieses Ereignis resultiert in einer vorzeitigen Anhäufung von Seneszenzmerkmalen, einer starken Verkürzung der Lebensspanne und einem beschleunigten Alterungsprozess. Der Phänotyp der Stämme ∆PaAtpe und ∆PaAtpg lässt sich erfolgreich revertieren. Dadurch konnte bestätigt werden, dass der beobachtete Phänotyp der Deletionsstämme auf den Verlust der Dimerisierungsgene zurückzuführen ist.
2. Die konstitutive Überexpression des PaAtpe-Gens führt zu einer Verlängerung der Lebensspanne, die allerdings nicht abhängig von einer Erhöhung der Dimer-Menge, sondern auf eine Verlängerung der Mitochondriennetzwerke und eine erhöhte Atmung zurückzuführen ist.
3. Obwohl die Lebensspannen der untersuchten PaAtpg_OEx-Stämme voneinander abweichen, ist der auf den Organismus ausgeübte Effekt der PaAtpg-Überexpression positiv. Dabei lässt sich eine Erhöhung der Dimer-Menge auch in diesen Stämmen nicht nachweisen und eine Veränderung der Mitochondrienmorphologie tritt nur in einem der fünf untersuchten Stämme auf, was hier allerdings mit dem größten Effekt auf die Lebensspanne korreliert.
4. Die gleichzeitige Überexpression der Gene PaAtpe und PaAtpg führt interessanterweise zu einer Aufhebung der durch die PaAtpe-Überexpression hervorgerufenen positiven Effekte. Die generierte Doppelmutante weist somit wildtypische Eigenschaften auf. Eine Erhöhung der Dimer-Menge kann trotz Überexpression beider Gene nicht festgestellt werden.
5. Trotz gleicher Funktion in der Dimerbildung der F1Fo-ATP-Synthase ist das Expressionsniveau der Dimerisierungsgene in P. anserina unterschiedlich. Bereits im Wildtyp wird das PaAtpe-Gen weniger transkribiert als das PaAtpg-Gen. Letzteres wird durch die PaAtpe-Überexpression sowohl in den PaAtpe_OEx-Mutanten als auch in der Doppelmutante herunterreguliert. Auch im Wildtyp kommt es zu einer altersabhängigen Herunterregulierung des PaAtpg-Gens.
6. Im Wildtyp nimmt die Dimer-Menge im Alter ab und es kommt zu einer altersbedingten Änderung der Superkomplexe von S1 zu S0. Dies sind Hinweise auf eine altersabhängige Remodellierung der Cristae-Membran, die möglicherweise zum Seneszenzphänotyp von P. anserina beiträgt. Somit ist die Aufrechterhaltung des Dimers von großer Bedeutung für die Gewährleistung mitochondrialer Funktionen des Organismus.
Die F1Fo-ATP-Synthase spielt in ihrer dimeren Form eine bedeutende Rolle in der Aufrechterhaltung der Mitochondrienfunktion und gewährleistet den Ablauf von lebenswichtigen mitochondrialen Prozessen, die für die Erhaltung der zellulären Homöostase von essentieller Bedeutung sind.
Die Wahrnehmung von Schmerzen ermöglicht es dem Organismus, auf noxische Reize zu reagieren. Der akute nozizeptive Schmerz hat somit eine natürliche Warnfunktion. Bei länger anhaltenden bzw. chronischen Schmerzen oder Nervenschädigungen kann es jedoch zu pathophysiologischen Veränderungen im Nervensystem kommen, die zur Verselbständigung des Schmerzes führen können. Unter diesen Umständen gilt der Schmerz nicht mehr als Warnsignal, sondern als eigenes Krankheitsbild. Die „International Association for the Study of Pain (IASP)“ definiert Schmerz als „ein unangenehmes Sinnes- und Gefühlserlebnis, das mit aktueller oder potenzieller Gewebsschädigung verknüpft ist oder mit Begriffen einer solchen Schädigung beschrieben wird“. Da bisher verfügbare Arzneimittel chronische Schmerzen in vielen Fällen nicht ausreichend reduzieren können und teilweise zu schwerwiegenden Nebenwirkungen führen, ist es unverzichtbar, an der Entwicklung neuer und noch spezifischer wirkenden Analgetika festzuhalten. Um Pharmaka zu entwickeln, die gezielt in den Mechanismus der Schmerzverarbeitung eingreifen können, ist es notwendig, diesen auf molekularer Ebene zu kennen und zu verstehen.
Die soziale Arbeitsteilung bei Honigbienen ist ein komplexes selbstorganisatorisches System, welches auf zwei Ebenen der biologischen Organisation zu verorten ist: dem Individuum und der Kolonie. Die Regulation der Bruttemperatur ist ebenfalls diesen Gesetzmäßigkeiten unterworfen. Die Arbeits-bereitschaft einzelner Bienen bildet die Grundlage für die Temperaturregulierung des kolonialen Brutnestes.
In dieser Arbeit wird dieses Zusammenspiel aus individuellen Beteiligungen der Arbeiterinnen sowie der erbrachten Gesamtleistung der Kolonie während des Brutwärmens untersucht. Dazu wird eine kleine Bienengruppe auf einer Brutwabe einer thermischen Belastung ausgesetzt. Ein speziell für diese Untersuchungen entwickelter Versuchsaufbau integriert erstmals die Infrarot-Thermografie mit den Temperaturmessungen einer Brutfläche. Somit ist es möglich, die Thoraxtemperaturen der einzelnen, am Brutwärmen beteiligten Arbeiterinnen störungsfrei zu messen und gleichzeitig das erzeugte räumliche und zeitliche Temperaturmuster der Brutwabe zu ermitteln. Zusätzlich wird der Temperaturverlauf der Außentemperatur sowie der zellumgebenden Luft untersucht.
Es kann gezeigt werden, dass die Lufttemperatur im Innenraum eines Bienenstocks ein wichtiger Faktor in der Temperaturregulierung des Brutnestes ist, da sie die untere Temperaturgrenze im Bienenstock bildet. Weiterhin wird der Einfluss der brutwärmenden Arbeiterinnen auf die Temperaturentwicklung einer Brutfläche sichtbar. Durch das flexible Verhalten der Arbeiterinnen kann einer Brutfläche bei thermischer Belastung durch lokal wechselndes Brutwärmen optimal Wärme zugeführt werden. Es gibt es Hinweise auf eine zyklische Periodizität im zeitlichen Temperaturverlauf der Brutzellen, welche auf einen Brutwärmrhythmus durch die Bienen schließen lässt. Durch den Einsatz zweier Unterarten (Apis mellifera carnica & Apis mellifera mellifera) wird sichtbar, dass es zwischen den Gruppen Unterschiede in der Aufrechterhaltung der Lufttemperatur über der Wabe gibt.
Die Dissertation betrachtet zunächst die Anatomie der Lautentstehung und die Historie von Untersuchungen zu Sprechtraktakustik (u.a. Ibn Sina, Hook, Mical, Kratzenstein, Kempelen, Faber, Wheatstone, Helmholz, Riesz, Dunn, Chiba, Kajiyama, Kelly, Lochbaum, Saito, Itakura, Burg ) und geht insbesondere auf das Rohrmodell zu Beschreibung der Vokaltraktakustik ein.
Mittels Finiter-Differenzen wird die Aksutik der Sprechens dann dreidimensional beschrieben, und die zuätzlich auftretenden Effekte betrachtet. Fur die sich beim Sprechen schnell bewegende Mundhöhle wird ein Verfahren entwickelt und untersucht, mittels Sprachsignalen durch inverse Filterung und MRT-Aufnahmen die räumliche Konfiguration zu bestimmen. Für den Nasaltrakt wurden dreidimensional abbildende Verfahren aus der medizinischen Diagnostik verglichen (MRT und CT), und anhand eines Computer-Tomographischen Datensatzes die akustischen Vorgänge dreidimensional bestimmt.
Sowohl die Gifte der Kegel- (Conidae) als auch die der Schraubenschnecken (Terebridae) enthalten eine Vielzahl pharmakologisch aktiver Peptide. Vor allem die Conopeptide bzw. Conotoxine aus den Giften der Kegelschnecken werden aufgrund ihrer Selektivität für Ionenkanäle und Rezeptoren seit langem als Werkzeuge in der neuropharmakologischen Forschung eingesetzt. Hier rücken gerade neuronale nikotinische Acetylcholinrezeptoren immer mehr in den Fokus der medizinischen Forschung, da sie vermutlich an der Entwicklung neurodegenerativer Erkrankungen wie Alzheimer, Parkinson, Demenz, Schizophrenie und Epilepsie beteiligt sind. Ziel dieser Dissertation war es daher, neue Inhibitoren in den Giften Kegelschnecken (Conidae) und der Schraubenschnecken (Terebridae) für nikotinische Acetylcholinrezeptoren, vor allem der neuronalen Subtypen, zu identifizieren. Es erfolgte die:
1. Identifizierung neuer αD-Conotoxine
Aus den Giften von Conus capitaneus und C. mustelinus konnten zwei native αDConotoxine (αD-CAP und αD-MUS) isoliert und charakterisiert werden. Beide Toxine sind Homodimere mit Molekulargewichten von 11 kDa und inhibieren nikotinische ACh-Rezeptoren. Sie blockieren die Subtypen α7>α3β2>α4β2, wobei sich αD-MUS als potenter als αD-CAP erweist (IC50-Werte von αD-MUS: α7 0,12 nM, α3β2 1,08 nM, α4β2 4,5 nM; IC50-Werte von αD-CAP α7 0,25 nM, α3β2 2,8 nM, α4β2 28,6 nM). Hingegen haben die αD-Conotoxine auf die Rezeptorsubtypen α3β4, α4β4 und α1β1γδ keinen hemmenden Einfluss. Zusätzlich konnten drei weitere αD-Conotoxine mit Hilfe der cDNA von C. vexillum und C. betulinus identifiziert werden. Eine Besonderheit hierbei war, dass innerhalb der Familie der αD-Conotoxine zwei unterschiedliche Signalsequenzen vorkommen und somit diese Sequenzen nicht stark konserviert sind.
2. Charakterisierung des α-Conotoxins SI aus dem Gift von C. striatus
Im Gift der Kegelschnecke Conus striatus wurde ein Peptid mit inhibierender Wirkung an α7-Rezeptoren nachgewiesen. Molekulare Masse (1.352,5 Da) und Aminosäuresequenz entsprachen dem α-Conotoxin SI, das als Antagonist muskulärer nACh-Rezeptoren bekannt ist. Da die Ergebnisse mehrere Jahre zurück lagen und bisher keine Analysen im Oozytenexpressions-System durchgeführt wurden, wurdeeine mögliche Aktivität sowohl an neuronalen als auch an muskulären nACh-Rezeptoren vermutet. Voltage Clamp-Messungen bestätigten die spezifische Wirkung am Muskeltyp, wodurch die Aktivität am α7-Rezeptorsubtyp einem anderen Conopeptid, zugewiesen werden muss, das als Beiprodukt isoliert wurde.
3. Identifizierung neuer Conotoxine der A-Superfamilie Mit molekularbiologischen Methoden unter Nutzung von cDNA-Bibliotheken gelang es, 27 Conotoxine (17 neue und 10 bekannte) aus der A-Superfamilie zu identifizieren: drei α- und zwei κA-Conotoxine aus Conus striatus, zwei α-Conotoxine aus C. betulinus, zwei α- und zwei κA-Conotoxine aus C. carinatus, drei α-Conotoxine aus C. catus, drei α- und zwei κA-Conotoxine aus C. circumcisus, ein α-Conotoxin aus. C. geographus, zwei aus C. imperialis, jeweils eines aus C. lividus, C. quercinus, C. sponsalis sowie zwei aus C. terebra Die Vielzahl der identifizierten α-Conotoxine belegt die hohe Diversität dieser Toxine in den Giften der Kegelschecken. Anhand von Vergleichen mit bereits bekannten Toxinen werden die möglichen Wirkungsweisen einiger neuer α-Conotoxine diskutiert. Für einen Teil der α-Conotoxine wurden 3D-Strukturmodelle erstellt, die Einblicke in die Bindung der Toxine an den Rezeptor geben können.
4. Untersuchung der Gifte der Terebridae
Die inhibierende Aktivität einiger Gifte (Terebra consobrina, T. argus, Myurella affinis, Acus felina, A. chlorata, A. maculata und Hastulopsis pertusa) an nACh-Rezeptoren (α7, α3β2, α4β2, α3β4, α4β4 und α1β1γδ) wurde erstmals nachgewiesen. An Kalium- und Natriumkanälen zeigten die Giftextrakte keine Wirkung. Die Giftextrakte von Myurella affinis und Acus maculata waren am potentesten und blockierten alle untersuchten nACh-Rezeptoren. Dies ist besonders ungewöhnlich, da diese Terebriden-Arten nach der Literatur (Puillandre & Holford, 2010) keinen Giftapparat besitzen sollen. Eine weitere Auffälligkeit aller Terebriden-Giftextrakte war neben der Selektivität für a7-Rezeptorsubtypen, eine hohe Aktivität gegenüber α4-enthaltenden Rezeptoren. In den Giften und mit Hilfe von cDNA-Bibliotheken von Kegelschnecken konnte eine Vielzahl neuer Inhibitoren für neuronale nikotinische Acetylcholinrezeptoren identifiziert werden. Sie zeigen ein breites Wirkungsspektrum, das die unterschiedlichsten nAChRSubtypen einschließt, was ihre Verwendung als pharmaklogische Werkzeuge begrenzt. Hingegen zeigen die Gifte der Schraubenschnecken ein Selektivitätsspektrum, das die Analyse ihrer Peptide als vielversprechend erscheinen lässt.
Die Ausbreitung von HIV stellt ein kontinuierlich wachsendes Problem dar [132]. Durch Einführung der hochaktiven antiretroviralen Therapie (HAART) konnte die Morbidität und Mortalität der HIV-Infektion deutlich gesenkt werden, jedoch limitieren Resistenzbildungen des Virus und Toxizität der Medikamente den Erfolg. Eine mögliche Therapiealternative bietet die HIV-Gentherapie. Hierbei werden Zellen eines Patienten genetisch modifiziert, so dass sie ein antivirales Genprodukt exprimieren. In der Arbeitsgruppe von Laer (Georg-Speyer-Haus, Frankfurt) wurde der retrovirale Vektor M87o entwickelt, der das antivirale, membranverankerte Peptid maC46 kodiert. Dieses hemmt als Fusionsinhibitor effizient den Viruseintritt von HIV. Als Zielzellen einer HIV-Gentherapie können neben TLymphozyten, den eigentlichen Zielzellen von HIV, auch deren Vorläufer, die hämatopoetischen Stammzellen, verwendet werden. Durch Generierung der gesamten Hämatopoese sollte dies zur Expression des antiviralen Transgens in allen Blutzelllinien führen. Besonders wichtig hierbei ist, dass die Funktion der hämatopoetischen Stammzellen durch die genetische Modifikation möglichst nicht gestört wird. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, toxische Effekte von M87o auf die Repopulierungsfähigkeit hämatopoetischer Stammzellen auszuschließen. Neben den Toxizitätsanalysen sollte auch die Langzeitexpression des retroviralen Vektors nach Transplantation genetisch modifizierter T- und Stammzellen untersucht werden. Eine stabile Expression des Transgens ist vor allem in T-Lymphozyten als Hauptzielzellen von HIV ausschlaggebend für den Erfolg der Gentherapie. Daher war ein weiteres Ziel dieser Arbeit, die Transgenexpression in vivo besonders in T-Lymphozyten im Verlauf zu untersuchen. Hierzu wurden in einem syngenen Mausmodell hämatopoetische Stammzellen mit dem retroviralen Vektor M87o transduziert und in bestrahlte Rag1-defiziente Mäuse transplantiert. Damit mögliche toxische Effekte von M87o auf die Hämatopoese nicht durch den Anteil untransduzierter Zellen im Transplantat maskiert werden, wurde in einer Versuchgruppe der Anteil transduzierter Stammzellen durch MACS-Sortierung auf über 95% angehoben. bAls Kontrollgruppen wurden untransduzierte, aber gleichermaßen kultivierte Stammzellen sowie mit dem Kontrollvektor M87c transduzierte Stammzellen transplantiert. Im folgenden Beobachtungszeitraum von 18-20 Wochen wurde regelmäßig das periphere Blut der Empfängertiere analysiert sowie nach Tötung der Tiere die einzelnen Zellpopulationen der hämatopoetischen Organe Blut, Lymphknoten und Milz charakterisiert. Hierbei konnte keine Toxizität durch M87o nachgewiesen werden. Zwar wurde für M87o-angereicherte Stammzelltransplantate eine verminderte bzw. verzögerte Lymphozytenrepopulierung beobachtet, dies war jedoch wahrscheinlich auf eine eingeschränkte „Fitness“ der Stammzellen durch den Sortierungsprozess und eine geringere Zellzahl im Transplantat zurückzuführen. M87o-transduzierte Stammzellen waren schließlich in der Lage, die komplette Lymphopoese zu generieren. Im Blut, Lymphknoten und Milz der Rezipienten konnten NK-, T- und B-Zellen nachgewiesen werden. Die lymphatische Differenzierung wurde also durch M87o nicht beeinträchtigt. Eine Aussage über die Toxizität von M87o auf die Myelopoese konnte leider nicht getroffen werden. Nach subletaler Bestrahlung der Empfängertiere und damit nur teilweisen Ablation des endogenen Knochenmarks wurden die meisten Zellen der myeloischen Linie durch die Wirts-Stammzellen generiert. Es müssen somit hinsichtlich der Unbedenklichkeit von M87o noch weitere präklinische Untersuchungen erfolgen, bei denen durch letale Bestrahlung der Empfängertiere lediglich die durch Spenderzellen differenzierte Myelopoese analysiert werden kann. Bei den Untersuchungen zur Transgenexpression nach Transplantation genetisch modifizierter Stammzellen konnte eine Langzeitexpression des maC46-Peptids auf allen lymphatischen Zelllinien (T-, B- und NK-Zellen) nachgewiesen werden. Dies zeigt also, dass eine stabile und effiziente Integration des Transgens und somit eine langfristige Expression in vivo möglich ist. Im Verlauf konnten jedoch bei nahezu allen Tieren fallende Anteile M87o-exprimierender Lymphozyten nachgewiesen werden. Dieser beobachtete Expressionsverlust war variabel hinsichtlich des zeitlichen Auftretens sowie zelltypabhängig. Die höchsten Anteile M87o-exprimierender Zellen zeigten sich innerhalb der B-Lymphozyten. Im Rahmen der M87o-Expressionsanalyse nach Transplantation genetisch modifizierter T-Lymphozyten wurden T-Lymphozyten mit unterschiedlicher Transduktionseffizienz in Rag1-defiziente Mäuse transplantiert. Unterschiede in der Langzeitexpression in Abhängigkeit von der ins Genom integrierten Kopienzahl des Vektors konnten hierbei nicht eindeutig gezeigt werden. Bei einigen Tieren konnte eine relativ langfristige in vivo Expression des maC46-Peptids nachgewiesen werden, bei anderen hingegen nachlassende Transgenexpressionen. Insgesamt war die Aussagekraft hier jedoch durch eine nach Transplantation auftretende schwere Kolitis bei den Versuchstieren und somit limitierte Beobachtungszeit stark eingeschränkt.
Durch die weltweite Verbreitung von bakteriellen Resistenzgenen wie der Carbapenemase New-Delhi-Metallo-β-Laktamase (NDM), die nahezu alle Beta-Laktamantibiotika spalten kann, und die langwierige Entwicklung neuer Antibiotika, hat die Erforschung von Resistenzdeterminanten eine hohe Priorität. In der vorliegenden Arbeit wurde die neu entdeckte Variante NDM 16b unter epidemiologischen Gesichtspunkten, mit einem in vivo Infektionsmodell sowie die Interaktion von NDM-Varianten mit dem menschlichen Komplementsystem untersucht.
Im ersten Teil der Arbeit erfolgte eine epidemiologische Datenerhebung für 60 blaNDM tragende Patientenisolate des Zeitraums 2007 - 2017 auf Basis klinikinterner Datenbanken zu multiresistenten Erregern und zudem eine quantitative Empfindlichkeitstestung für 13 (Reserve-)Antibiotika. Es fiel eine kontinuierliche Zunahme an NDM-Isolaten und insbesondere von NDM-Varianten mit der Punktmutation M154L auf, da diese Mutation eine erhöhte Hydrolaseaktivität vermittelt. Deutlich erkennbar war eine Korrelation der M154L-Varianten und E. coli. Im Resistenzprofil der blaNDM-positiven Isolate zeigten sich hohe Resistenzraten (> 94%) gegen alle Beta-Laktam-Antibiotika und Fluorchinolone. Fosfomycin und Colistin waren in über 75% der Fälle noch wirksam.
Im zweiten Teil wurden Infektionsversuche mit dem Modellorganismus Galleria mellonella (Larve der großen Wachsmotte) durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass die NDM-Produktion der injizierten Erreger keinen Einfluss auf die Pathogenität hatte. Zudem konnte in Therapieversuchen mit Imipenem im lebenden Organismus gezeigt werden, dass über die bakterielle NDM-Produktion die Resistenz gegen Imipenem vermittelt wird.
Im dritten Teil der Arbeit wurden die NDM-Varianten NDM 1Δ28, NDM 4Δ28 und NDM 16bΔ28 hinsichtlich ihres inhibitorischen Potentials auf Komplement untersucht. Mit den erzielten Ergebnissen der funktionellen Tests konnte für den klassischen und den Lektinweg eine signifikante Hemmung durch alle drei NDM Varianten nachgewiesen werden. Ein direkter Vergleich der einzelnen NDM-Varianten ergab, dass NDM 1Δ28 die stärkste und NDM 16bΔ28 die schwächste Inhibition auf den klassischen Komplementweg ausübte. Bindungsanalysen mit einzelnen Komplementkomponenten (C3, C3b, C3c, C4 und C4b) ließen auf eine Interaktion von NDM 1Δ28 mit C4b schließen.
Zusammenfassend leistet diese Arbeit einen Beitrag zur Fortführung epidemiologischer Untersuchungen von NDM Varianten und erbringt den in vivo Nachweis für Resistenzvermittlung durch NDM. Weiterhin wurde gezeigt, dass NDM neben der Carbapenemasefunktion auch eine immunmodulierende Wirkung erfüllt, indem der klassische und Lektinweg des Komplementsystems gehemmt wird. Damit liegt die Vermutung nahe, dass die globale Ausbreitung von NDM-produzierenden Erregern nicht nur durch die Vermittlung der Antibiotikaresistenz, sondern auch durch eine Immunevasion bedingt ist. Zukünftig könnte somit die Erforschung des Mechanismus der Immunevasion ebenso interessant sein wie die Suche nach wirksamen Inhibitoren der NDM.
Bei Cryptochromen handelt es sich um Blaulichtrezeptoren der Cryptochrom-Photolyase-Proteinfamilie (CPF). Mitglieder dieser Proteinfamilie sind in allen Domänen des Lebens zu finden und haben eine essentielle Rolle in der Reparatur der DNA sowie der lichtgesteuerten Regulation der Expression. Cryptochrome sind in der Regel keine DNA-reparierenden Proteine. Sie sind regulativ an der Steuerung der inneren Uhr und des Zellzyklus der Organismen beteiligt. In der Kieselalge Phaeodactylum tricornutum konnten bisher sechs phylogenetisch unterschiedliche Mitglieder der CPF identifiziert werden. Bei CryP handelt es sich um das einzige pflanzenähnliche Cryptochrom der photoautotrophen Diatomee. Für das Protein CryP konnte bereits ein blaulichtinduzierter Photozyklus durch die Absorption der Chromophore 5-Methenlytetrahydrofolat (MTHF) und Flavinadenindinukleotid (FAD) gezeigt werden. Außerdem ist eine regulative Wirkung des Proteins auf die Lichtsammelkomplexe (Lhc) der Diatomee bekannt. Für eine weitere Charakterisierung des CryPs wurde in dieser Arbeit zunächst das Absorptionsverhalten unter verschiedenen Wellenlängen beobachtet, um so einen Einblick in eine mögliche Aktivierung und Deaktivierung des Proteins durch Licht unterschiedlicher Wellenlängen zu erlangen. Es zeigte sich hierbei eine mit pflanzlichen Cryptochromen vergleichbare Anreicherung verschiedener Redoxzustände des FADs in Abhängigkeit von der Wellenlänge.
Für eine Aufklärung der Wirkungsweise des CryP-Proteins wurden verschiedene Hypothesen untersucht: Die phylogenetische Nähe und ein ähnliches Absorptionsverhalten des CryPs zu Cryptochromen mit Reparaturfähigkeit für einzelsträngige DNA (Cry-DASH) führte zu einer Untersuchung des Proteins als möglicher Transkriptionsfaktor. Hierfür konnte eine Kernlokalisation des Proteins nachgewiesen werden, was Rückschlüsse auf eine potentielle Regulation der Expression mittels DNA-Bindung zulässt. Außerdem wurde gezeigt, dass CryP DNA-Bindefähigkeit besitzt. Die bisher nachgewiesenen Bindungen waren jedoch unspezifischer Art. Dies konnte auch für die Promotersequenz eines der durch CryP regulierten Gene lhcf1 festgestellt werden. Auf Grund der unspezifischen DNA-Bindung wurde eine zweite Hypothese für CryP untersucht: CryP wirkt regulativ auf die Expression verschiedener Gene durch Protein-Protein-Interaktionen und ist Teil einer Reaktionskaskade zur Signalweiterleitung in P. tricornutum.
Durch die Untersuchung der zweiten Hypothese konnten drei Interaktionspartner für CryP identifiziert und eine Interaktion verifiziert werden. Hierbei handelt es sich um das Protein AAA mit einer bisher unbekannten Funktion und das Protein BolA, welches Teil der zuerst in Escherichia coli identifizierten BolA-like-Proteinfamilie ist. Außerdem konnte eine Interaktion mit dem Cold-Shock-Domänen-Protein CSDP gezeigt werden. Bei den Proteinen BolA und CSDP handelt es sich um potentiell regulierende Faktoren der Transkription und Translation, was Teil einer Reaktionskaskade sein kann. Die aus anderen Organismen bekannten Funktionen des BolA-Proteins überschneiden sich mit den in CryP-Knockdown-Mutanten beobachteten Effekten. Sie zeigen eine erhöhte Sensitivität für Stresssituationen wie abweichende Nährstoffkonzentration, Osmolaritäten und Temperaturen. Diese Beobachtungen stellen einen Zusammenhang der durch einen CryP-Knockdown beobachteten Effekte und der CryP-BolA-Interaktion her. Durch Homologien zu Cold-Shock-Proteinen aus Chlamydomonas reinhardtii gibt die CryP-Interaktion mit dem Protein CSDP Hinweise auf einen potentiellen Mechanismus zur Regulation der Lhc-Proteine, für welche zuvor ein CryP-abhängiger Effekt beschrieben war.
Über die Protein-Protein-Interaktionen hinaus wurde die Phosphorylierung des CryPs als Möglichkeit der Signalweiterleitung untersucht. Es konnte eine reversible Phosphorylierung des heterolog aus E. coli isolierten CryPs gezeigt werden. Diese zeigt Ähnlichkeiten zu bekannten Phosphorylierungen pflanzlicher Cryptochrome und gibt Hinweise auf einen Mechanismus der Signalweiterleitung.
Durch die Untersuchung der CryP-regulierten Transkription mit P. tricornutum CryP-Knockdown-Mutanten durch Next-Generation-Sequencing (NGS) konnte die Hypothese der regulativen Proteinkaskade und der Signalweiterleitung weiter bestätigt werden. Die Auswirkungen des CryPs auf die Transkription erwiesen sich als nicht auf einen Teilbereich des Metabolismus begrenzt, sondern sind in einem großen Teil der funktionellen Gengruppen in P. tricornutum zu sehen. Außerdem konnten drei Klassen CryP-regulierter Gene festgestellt werden. Kategorie 1: die ausschließlich unter Blaulicht regulierten Gene; Kategorie 2: die sowohl unter Blaulicht als auch im Dunkeln regulierten Gene und Kategorie 3: die ausschließlich im Dunkeln regulierten Gene. Ein im Dunkeln und unter Blaulicht jeweils unterschiedlicher regulativer Effekt deutet auf eine Doppelfunktion des CryPs hin. Möglicherweise hat das Cryptochrom unterschiedliche lichtabhängige und lichtunabhängige Funktionen.
Durch die Analyse der CryP-regulierten Genexpression konnte außerdem ein Zusammenhang zwischen CryP und weiteren Photorezeptoren gezeigt werden. Der CryP-Proteingehalt in der Zelle hat einen regulativen Einfluss auf das CPF1-Protein, eine Photolyase mit dualer Funktion aus der gleichen Proteinfamilie. Zusätzlich konnte auch ein Einfluss auf die Lichtsensitivität der Genexpression des Rotlichtrezeptors Phytochrom (DPH) durch CryP gezeigt werden. Vergleichbar mit höheren Pflanzen scheint ein regulatives Netzwerk der Photorezeptoren auch in der Diatomee P. tricornutum vorhanden zu sein.
Wir ermittelten die Geschwindigkeitskonstanten sowie die Arrhenius sehen Aktivierungsenergien und Aktionskonstanten der alkalischen Hydrolyse einer Reihe von Di- und Tripeptiden. Die zur Gewinnung der kinetischen Daten führende quantitative Analyse der Hydrolysate gelang, indem die Peptide vor ihrer Hydrolyse geeignet mit 14C markiert, die Hydrolysate mit Hilfe der Papierchromatographie bzw. der Zonenelektrophorese getrennt und die isolierten Hydrolyseprodukte auf Grund ihrer Radioaktivität quantitativ bestimmt wurden.
Der zeitliche Verlauf der alkalischen Hydrolyse von Di- und Tripeptiden wird durch ein Zeitgesetz 1. Ordnung bezüglich des Peptids und bezüglich der Hydroxylionen dargestellt. Die Abstufungen der Aktivierungsenergien, die den einzelnen Peptidbindungen in Di- und Tripeptiden zugeordnet sind, lassen sich durch die Annahme deuten, daß die Hydrolyse nach dem BAC 2-Mechanismus verläuft. Die Aktionskonstanten wachsen, wenn auch nicht regelmäßig, mit den Aktivierungsenergien.
Das Chronic Care Model (CCM) stellt eine Zusammenfassung evidenzbasierter Erkenntnisse dar, um die Versorgung chronisch Erkrankter zu optimieren. Diverse Messinstrumente sind in den letzten Jahren zur Erfassung des Implementierungserfolges des CCM aus Sicht der Leistungserbringer und der Patienten entwickelt worden. Einen Ansatz zur Erfassung, inwiefern die im CCM beinhalteten Dimensionen angewendet werden, stellt das Patient Assessment of Chronic Illness Care (PACIC- 5A) dar. Dieses Instrument wurde im englischsprachigen Raum entwickelt und primär im amerikanischen Gesundheitssystem eingesetzt. Es besteht in der ursprünglichen Fassung aus 20 Items und erfragt in fünf Subskalen CCM-konkordante Aspekte: Patientenaktivierung, Leistungserbringerstruktur / Entscheidungshilfen, Zielsetzung, Problemlösung / Beratung, Follow-up / Koordination. Die erweiterte Version aus 26 Items erlaubt zusätzlich zur Beurteilung der Erfüllung des CCM die Analyse der Umsetzung im Sinne des 5A-Modells, eines behaviouristischen Ansatzes zur Verhaltensänderung. Ziel dieser Arbeit war es, den Fragebogen in die deutsche Sprache ohne Verlust des semantischen Inhaltes zu übersetzen und an einer primärmedizinischen Population im deutschen Gesundheitssystem zu evaluieren. Eine weitere Zielsetzung war, den Implementierungsgrad des CCM-Konstruktes im spezifischen Fall der Major Depression zu erkunden. Hierzu wurde das übersetzte PACIC-5A im Rahmen der im Institut für Allgemeinmedizin der Universitätsklinik Frankfurt durchgeführten ProMPT-Studie zur Betreuung von Patienten mit Major Depression an insgesamt 509 Patienten erprobt. Hiervon wurden 436 Patienten in die Studie eingeschlossen. Hierauf erfolgte die Überprüfung der psychometrischen Eigenschaften. Die statistischen Messergebnisse, hinsichtlich innerer Konsistenz (Cronbach´s α) und Trennschärfe (korrigierte Item-Skala-Korrelation), ergaben gute und mit der aktuellen Literatur übereinstimmende Resultate. Die konvergente Validität des PACIC-5A wurde anhand des primärmedizinisch validen Fragebogens EUROPEP (European Project on Patient Evaluation of General Practice Care) geprüft. Das Ergebnis zeigte hohe Korrelationen vor allem in den inhaltlich vergleichbaren Skalen, wie z.B. Skala „Patientenaktivierung“ aus dem PACIC-5A und Skala „Information und Unterstützung“ des EUROPEP. Die diskriminierenden Fähigkeiten des Fragebogens wurden durch die geringen korrelativen Eigenschaften mit Skalen des EUROPEP, welche andere Dimensionen erörtern, nachgewiesen. Zusätzlich ermöglichte der Vergleich der Mittelwerte der einzelnen Skalen des PACIC-5A zwischen dem Kontroll- und Interventionsarm eine zusätzliche Beurteilung der diskriminierenden Potenz. Das PACIC-5A ist bis jetzt vorrangig an Patienten mit chronischen Erkrankungen aus dem organischen Formenkreis (z.B. Osteoarthritis, Diabetes Mellitus) angewendet und validiert worden. Die kongruente Anwendung des PACIC-5A auf Erkrankte mit Major Depression ist ein limitierender Aspekt. Hier besteht weiterer Forschungsbedarf. Für eine optimale Patientenversorgung in der Primärmedizin ist es essentiell, primärmedizinisch valide Instrumente den Hausärzten zur Verfügung zu stellen.
Nanoarzneimittel haben in den letzten Jahren in der Therapie verschiedener Erkrankungen immer mehr an Bedeutung gewonnen. Dadurch hat auch die Anzahl zugelassener Arzneimittel mit an Arzneistoffträgern wie Liposomen gebundenen Wirkstoffen zugenommen. Weil für die Zulassung, neben der Wirksamkeit und Unbedenklichkeit, auch die Qualität der neuen Arzneimittel gewährleistet sein muss, spielen die verschiedenen Eigenschaften der Arzneistoffträger eine wichtige Rolle in der Qualitätskontrolle. Neben der Partikelgröße, der Partikelgrößenverteilung und der Oberflächenladung spielt die (Rest-)Kristallinität des Wirkstoffs und die Wirkstofffreisetzung eine wesentliche Rolle für die erfolgreiche in vivo-Performance von Nanoarzneimitteln. Zur Bestimmung der Wirkstofffreisetzung aus kolloidalen Arzneistoffträgern wie Liposomen, Nanopartikeln oder Mizellen gibt es bis heute keine Standardmethoden. In der Forschung und der pharmazeutischen Industrie werden folglich verschiedene Methoden wie Filtration, Zentrifugation oder Dialyse verwendet, um den freigesetzten Wirkstoff zu bestimmen. Dabei ist die Wahl der Separationsmethode auf die Eigenschaften der Arzneistoffträger abzustimmen.
In der vorliegenden Arbeit wurde eine dialysebasierte Apparatur, der Dispersion Releaser (DR), zur Untersuchung der in vitro Wirkstofffreisetzung aus kolloidalen Trägersystemen eingesetzt. Diese kann direkt mit den Apparaturen I/II der Arzneibücher der Europäischen Union (Ph. Eur.) und der Vereinigten Staaten (USP) gekoppelt werden. Zur Untersuchung der Wirkstofffreisetzung wird die Formulierung in das Donorkompartiment gegeben, sodass der freigesetzte Wirkstoff infolge über die Dialysemembran in das Akzeptorkompartiment permeiert. Dort kann dieser mittels HPLC analysiert werden. Besonders hervorzuheben ist das synchrone Rühren in beiden Kompartimenten des DR, worüber andere dialysebasierte Apparaturen nicht verfügen.
Die Entwicklung und Patentierung eines funktionsfähigen Prototyps des DR erfolgte an der Goethe Universität, Frankfurt am Main und wurde im Rahmen dieser Arbeit gemeinsam mit der Pharma Test Apparatebau AG (Hainburg, Deutschland) zu einer kommerziell erwerbbaren Apparatur (Pharma Test Dispersion Releaser, PTDR) weiterentwickelt. Innerhalb dieser Kollaboration wurde der Prototyp des DR unter Einbezug der Anforderungen der pharmazeutischen Industrie rekonstruiert. Eine erleichterte Anwendung für den Nutzer wurde dabei mitberücksichtigt.
Die finale Apparatur wurde zuletzt einer ausgiebigen Validierung unterzogen, bei der Diclofenac und Hydrocortison als Modellarzneistoffe dienten. Neben Untersuchungen zur Hydrodynamik und dem Einfluss der Umdrehungszahl auf die Membranpermeationsrate kM wurde eine Methode mit Gold-Nanopartikeln zur Bestimmung der Dichtigkeit des Systems entwickelt. Hierbei wurden Messungen mit einer UV/Vis-Methode und mit dynamischer Lichtstreuung durchgeführt, um die Abwesenheit der Goldpartikel im Akzeptorkompartiment nachzuweisen. Der Einfluss von Proteinen im Freisetzungsmedium auf die Membran-permeation wurde ebenfalls untersucht.
Der DR wurde ursprünglich zur Untersuchung von parenteralen Nanoformulierungen entwickelt. Aufgrund der bisher noch nicht erfolgten Untersuchung von halbfesten Zubereitungen im DR, wurde die Apparatur im Rahmen dieser Forschungsarbeit für zwei verschiedene Diclofenac-Gele (Voltaren® Emulgel, Olfen® Gel) unter verschiedenen Bedingungen evaluiert. Dabei konnte unter non-sink-Bedingungen der Einfluss der lipophilen Phase des Voltaren® Emulgels (GlaxoSmithKline Consumer Healthcare GmbH & Co. KG, München, Deutschland) gezeigt werden. Im Vergleich zum fettfreien Olfen® Gel (Mepha Pharma AG, Basel, Schweiz) zeigte Voltaren® Emulgel eine vollständige Freisetzung unter den erschwerten Löslichkeitsbedingungen.
Mit Hydrocortison als Modellsubstanz wurden vier verschiedene Proliposomen zur vaginalen An¬wendung formuliert. Neben der Charakterisierung der Partikelgröße und der Verkapselungs¬effizienz wurden Messungen mit dynamischer Differenzkalorimetrie durch-geführt und Aufnahmen zur morphologischen Charakterisierung mittels Transmissions-elektronen¬mikroskopie der Liposomen erstellt. Die Wirkstofffreisetzung des Hydrocortisons aus dem rekonstituierten liposomalen Gel sowie die Permeabilität über eine Zellmonoschicht wurde vergleichend untersucht. Dabei wurden Zelllinien aus humanem Cervixkarzinom beziehungsweise Endometriumkarzinom eingesetzt. Die Unterschiede der Formulierungen konnten vom DR sensitiver erfasst werden und die Verkapselungseffizienz als relevanter Faktor für die in vivo-Performance festgelegt werden.
Weil die tatsächliche Wirkstofffreisetzung durch die Permeation über die Dialysemembran überlagert werden kann, wurde neben der Standardisierung der Konstruktion die Auswertung mit Hilfe eines neuen mathematischen Modells, das auf dem Fick’schen Diffusionsgesetz basiert, verbessert. Das Normalisieren des Freisetzungsprofils mit Hilfe des mathematischen Modells dient dazu, die tatsächliche Wirkstofffreisetzung zu berechnen und den Vergleich verschiedener Freisetzungen ohne den Einfluss der Membranpermeation zu ermöglichen. Im Zuge der Validierung des DR wurde das mathematische Modell ebenfalls erfolgreich validiert.
In der vorliegenden Forschungsarbeit wurde eine neue Konstruktion des DR für die kommerzielle Anwendung entwickelt und validiert. Nebenbei wurde der Auswerteprozess zur Berechnung der diffusionsbereinigten Wirkstofffreisetzung vereinheitlicht und validiert. Zuletzt wurde das Anwendungsgebiet des DR von parenteralen Nanoformulierungen auf halbfeste Arzneiformen erweitert.
Validierung einer neuen Messmethode zur direkten Bestimmung der Heparin-Konzentration im Blut
(2012)
In dieser Arbeit wurde ein neues Verfahren zur Heparin-Bestimmung (LiSA-H, light scattering assay of heparin) evaluiert. Dieses wurde an der Universität Frankfurt a. M. am Institut für Biophysik entwickelt und ermittelt erstmals die direkte Heparin-Konzentration im Blutplasma. Durch die Analyse der Lichtstreuung einer Plasmaprobe wird die Bildung von Nanopartikeln aus Heparin und Protamin verfolgt. Die Lichtstreuintensität ist dabei proportional zu der in der Probe enthaltenen Heparin-Plasmakonzentration (Heparin-PK). Das Antikoagulans Heparin wird bei Herz-OPs mit Einsatz der Herz-Lungen-Maschine (HLM) verwendet und soll perioperativ eine lutgerinnselbildung in der HLM, sowie Thromboembolien im Patienten verhindern. Am OP-Ende wird die Wirkung durch Protamin antagonisiert, um eine suffiziente Gerinnung wieder herzustellen. Das derzeitige Gerinnungsmanagement basiert auf einem indirekten Messverfahren, der ACT (activated clotting time), welches starken Störeinflüssen, wie z.B. der Hypothermie, Hämodilution und bestimmten Medikamenten unterliegt. Durch die mögliche Falschdosierung der beiden Medikamente, steigt die Gefahr einer Blutung und Thrombose. LiSA-H soll in Zukunft eine zuverlässigere und kostengünstige „point of care― Analyse der Gerinnung und hierdurch eine gezielte Dosierung von Heparin und Protamin ermöglichen, die die Komplikationsrate verringert. In der vorliegenden Studie handelt es sich um eine offene, nicht kontrollierte, prospektive Multicenter-Studie, die mit 50 Patienten am Universitätsklinikum Frankfurt a.M. und 30 Patienten am Kinderherzzentrum Gießen durchgeführt wurde. Es wurde gezeigt, dass die durchschnittliche perioperative Heparin-PK bei Erwachsenen und Kindern bei ca. 5,4 I.E./ml liegt. Es wurde nachgewiesen, dass die Heparin-Clearance bei Kindern (~113 Min.) um das zweifache im Vergleich zu Erwachsenen (~254 Min.), erhöht ist. Besonders hervorzuheben ist die hohe Fehlerquote der ACT-Messung, die bei Erwachsenen in bis zu 1,8 % und bei Kindern in bis zu 20 % der Messungen keinen aussagekräftigen Wert lieferte. Das bedeutet, dass bei Kindern während einer OP bis zu zwei und bei Erwachsenen bis zu drei Stunden keine Information über den aktuellen Gerinnungszustand vorlag. Um eine Validierung der Messergebnisse vorzunehmen, wurden Rückstellproben mit dem Standardlaborverfahren PiCT (Prothrombinase induced clotting time) gemessen. Die Daten aus dem PiCT korrelieren mit den Ergebnissen aus der LiSA-H-Messung wesentlich besser (r² = 0,80), als mit der herkömmlichen ACT-Messmethode (r² = 0,57). Die ermittelten Heparin-PK und die ACT-Werte während einer OP wurden in Chronogrammen dargestellt. Es wurde gezeigt, dass in 30 % der OPs bei Erwachsenen und in 60 % bei Kindern die Messdaten aus der ACT und LiSA-H nur unzureichend synchron bei Nachdosierung mit Heparin anstiegen oder entsprechend der Heparin-Clearance im OP-Verlauf abfielen. Dies zeigte sich besonders kritisch während langandauernder, komplikationsreicher OPs, die einen erhöhten Blutverlust oder sogar Rethorakotomien nach sich zogen, in denen der ACT-Wert eine suffiziente Gerinnung nahe legte, die LiSA-HMessung aber eine noch hohe Heparin-PK nachwies. Erfahrungen aus den klinischen Studien zeigten, dass die Kombination aus der Messung der Heparin-PK und einer Gerinnungsanalyse bei einem ATIII-Mangel von Vorteil ist. Erst die Kombination aus einerseits mehrfach niedrig gemessener ACT-Werte, trotz ggf. Nachdosierungen von Heparin und andererseits ausreichend gemessener Heparin-PK im LiSA-H, kann einen ATIII-Mangelzustand aufdecken. Dadurch können Nach- bzw. Überdosierungen vermieden und damit die Wahrscheinlichkeit für postoperative Komplikationen verringert werden. Der wichtigste Einflussfaktor auf die LiSA-H-Messung ist die Hämodilution, die durch Einbeziehung des Patienten-Blutvolumens (z.B. mit der Nadler-Formel) durch mathematische Korrektur berücksichtigt werden kann. Patientenindividuelle Reaktionen auf gleiche Heparin- und Protamin-Dosierungen sowie eine patientenspezifische Heparin-Clearance zeigten in diesen Studien auf, dass das derzeitige Antikoagulationsmanagement mit den Dosierungsempfehlungen (Körpergewichtsbezogene Dosierung, 1:1 Dosierung von Protamin zur initialen Heparin-Dosis oder der summierten Heparin-Dosis, „pauschale― Nachdosierungen von 5.000 oder 10.000 I.E. Heparin bei ACT < 480) für eine optimale Dosierung der Medikamente unzureichend ist. In Outcome-Studien soll mit der LiSA-H-Messung Dosierungsempfehlungen von Heparin und Protamin ausgearbeitet werden. Außerhalb der Herz-Thorax-Chirurgie eröffnen sich weitere Möglichkeiten, wie z.B. in Dialysezentren und in der Neurochirurgie, für die bereits Studien geplant sind.
Die selektive intraarterielle digitale Subtraktionsangiografie (DSA) ist nach wie vor der Goldstandard zur Darstellung und Beurteilung extra- und intrakranieller Stenosen. Im Gegensatz zur extrakraniellen A carotis interna fehlt für die Stenosegradbestimmung der intrakranieller Arterien ein valides Messverfahren. Da Aussagen zur Prognose symptomatischer intrakranieller Stenosen und die Entscheidung über die weitere therapeutische Vorgehensweise jedoch weitgehend vom Stenosegrad abhängen, ist ein standardisiertes Verfahren zur Stenosegradbestimmung in Prozent für die intrakraniellen Gefäße von entscheidender Bedeutung. Die im Rahmen der WASID-Studie vorgeschlagene Methode eines lokalen, proximal der Stenose gelegenen Referenzdurchmessers wurde außerhalb dieser Studie noch kaum weitergehend untersucht. In der vorliegenden Studie wurden die Angiogramme von 102 Patienten mit intrakraniellen Stenosen nach den WASID-Kriterien von 3 Observern jeweils zweimal vermessen und bezüglich der inter- und intraobserver Korrelation untersucht. Die im Rahmen der WASID-Studie vorgeschlagene und für die vorliegende Studie übernommene Methode der Stenosegradberechnung erfolgte anhand eines zunächst proximal der Stenose zu wählenden Referenzdurchmessers. Eine modifizierte Stenosegradberechnung mittels Mittelwertbildung aus proximalem und distalem Referenzdiameter wurde der WASID-Methode gegenübergestellt. Die interobserver Korrelation der WASID-Methode lag bei 89,9% für den ersten Messdurchgang und bei 90,1% für den zweiten Messdurchgang. Die Stenosegradbestimmung nach der Mittelwert-Methode ergab eine geringfügig höhere interobserver Korrelation von 90,9% bzw. 93,2%, allerdings ohne statistische Signifikanz. Die Unterschätzung (im Vergleich zur WASID-Methode) des Stenosegrades durch die Mittelwert-Methode ist jedoch signifikant (am ehesten messverfahrensbedingt). Die vergleichende Untersuchung von proximalem und distalem Referenzdiameter im Rahmen der Mittelwert-Messung ergab bezüglich der Korrelation keinen statistisch signifikanten Vorteil für einen der beiden Messpunkte. Die Analyse der intraobserver Korrelation zeigte ebenfalls keinen eindeutigen Vorteil für die Mittelwert-Methode, allenfalls lässt sich hier ein positiver Trend ausmachen. Somit liegen letztlich die inter- und auch die intraobserver Korrelationen beider Messverfaheren auf vergleichbar hohem Niveau, ein statistisch klarer Vorteil für eine der beiden Vorgehensweisen lässt sich nicht ableiten. Aufgrund der einfacheren Handhabung der WASID-Methode empfiehlt sich dieses Verfahren dennoch für den klinischen Alltag.
Diese Dissertation befasst sich mit Validierungsstrategien von Tests zur Erfassung studentischer Kompetenzen. Kompetenzen von Studierenden werden zu verschiedenen Zwecken erhoben. Dies beginnt beim Eintritt in das Studium durch Zulassungstests und wird im Studium fortgesetzt z.B. durch Tests zur Zertifizierung von Kompetenz (Benotung von Leistung) oder zur Zuteilung auf bestimmte Kurse (Einteilung in Sprachniveaus). Neben diesen internen Tests zur Erfassung studentischer Kompetenzen werden auch externe Tests genutzt um etwa die Lehre zu verbessern (Evaluation von Veranstaltungen). Die mit dem Einsatz von Tests verbundenen Konsequenzen können sowohl für Studierende als auch Lehrpersonen und Entscheidungsträger*innen schwerwiegend sein. Daher sollten Tests wissenschaftlichen Gütekriterien genügen.
Das wichtigste Kriterium für die Beurteilung von wissenschaftlichen Tests ist Validität. In dieser Dissertation wird ein argumentationsbasiertes Validierungsansatz verfolgt. In diesem wird nicht die Validität eines Tests untersucht, sondern die Plausibilität der Interpretation beurteilt, die mit den Testwerten verbunden ist. Bislang fehlt jedoch für viele der wissenschaftlichen Tests für den deutschen Hochschulbereich ein auf die Testwertinterpretation abgestimmtes Validitätskonzept.
In dieser Arbeit wird ein Validierungsschema vorgestellt, in das übliche Testnutzen der Erfassung studentischer Kompetenzen an deutschen Hochschulen eingeordnet werden können. Die Einordnung von Testnutzen in das Schema erlaubt die Ableitung von passenden Validitätsevidenzen. Im Fokus stehen das Verhältnis von Test zu 1) Konstrukt, 2) Lehre und 3) beruflichen Anforderungen.
Das Validierungsschema wird angewandt, um Testwertinterpretationen eines empirischen Forschungsprojektes zur Erfassung von Kompetenz in Nachhaltigkeitsmanagement bei Studierenden zu validieren. Der Schwerpunkt dieser Arbeit liegt auf der Validierung der Interpretation, dass die Testwerte von drei nachhaltigkeitsbezogenen Tests Indikatoren für hochschulisch vermittelte Kompetenz in Nachhaltigkeitsmanagement sind. Die Analysen zur Gewinnung von Validitätsevidenzen konzentrieren sich auf die Grundannahme, dass Lernfortschritte in den nachhaltigkeitsbezogenen Tests vorwiegend hochschulisch vermittelt werden. Dafür wurde ein Messwiederholungsdesign mit zwei Gruppen von Studierenden realisiert. Studierende in der Schwerpunktgruppe besuchten ein Semester lang eine reguläre Lehrveranstaltungen mit Bezug zu Nachhaltigkeitsthemen und Nachhaltigkeitsmanagement, Studierende der Kontrollgruppe besuchten keine solchen Lehrveranstaltung. Die Einteilung in Schwerpunkgruppe und Kontrollgruppe erfolgte über Analyse von Modulhandbüchern und verwendeten Lehrmaterialien. Die Ergebnisse zeigen, dass Studierende aus der Schwerpunktgruppe in zwei der drei Tests höhere Lernfortschritte zeigen als Studierende der Kontrollgruppe. Selbstberichte der Studierenden zu hochschulischen und außerhochschulischen Lerngelegenheiten lassen darauf schließen, dass Studierende der Schwerpunkgruppe auch außerhochschulisch ein höheres Interesse an Nachhaltigkeitsthemen zeigen, dies schlägt sich jedoch nicht in höherem Vorwissen in den verwendeten Tests nieder. Insgesamt wird daher für die zwei Tests mit höheren Lernfortschritten in der Schwerpunktgruppe die Interpretation als plausibel bewertet, dass die Testwerte hochschulisch vermittelte Kompetenz in Nachhaltigkeitsmanagement abbilden.
Die in den letzten Jahrzehnten erfolgten Entwicklungen im Bereich der Informations- und Kommunikationstechnologien (IKT) haben beinahe alle Teilbereiche der Gesellschaft erreicht (OECD, 2000) und so können Alltag, Beruf, aber auch soziale Interaktionen benannt werden (Autor, Levy, & Murnane, 2003). Das technologiebasierte Problemlösen stellt ein relevantes Kompetenzkonstrukt dar, wobei die empirische Validierung der Testwertinterpretation noch aussteht. „Technologiebasiertes Problemlösen ist die Kompetenz, digitale Technologien, Kommunikationshilfen und Netzwerke erfolgreich für die Suche, Vermittlung und Interpretation von Informationen zu nutzen.“(OECD, 2009; zitiert nach Rammstedt, 2013). Ziel einer Konstruktvalidierung ist es theoretische Annahmen – sowie nomologische Netze – mit empirischen Belegen zu prüfen und somit Aussagen über die Gültigkeit der Testwertinterpretationen treffen zu können (vgl. Messick, 1995). Zu diesem Zweck wurden die folgenden fünf Leithypothesen aufgestellt:
1. Im technologiebasierten Problemlösen können Teilsequenzen durch Routinen im Umgang mit IKT bewältigt werden.
Mit dem Ziel der Analyse von Lösungsprozessen wurden Prozessdaten aus dem Feldtest der PIAAC-Studie genutzt und automatisierbare Teilschritte (beispielsweise Schließen eines Popups) analysiert. Eine schnelle Bearbeitung dieser Teilschritte wurde auch mit einer höheren Lösungswahrscheinlichkeit des Problems assoziiert. Die Testwerte des technologiebasierten Problemlösens spiegeln die bildungsbiographischen Lernerfolge wider, die zu einem routinierten Umgang mit IKT führen.
2. Durch die Entstehungsgeschichte von IKT begründet, bestehen Differenzen im technologiebasierten Problemlösen.
Entstehung moderner IKT legt eine Differenzierung von drei Kohorten nahe (orientiert an lernintensiven Phasen der Kindheit und Jugend):
- Erlebten die Entstehung und Verbreitung von Hardware (geboren 1946-1966)
- Begleiteten die Verbreitung von Computersoftware und dessen Nutzung (geboren 1966-1981)
- Nutzung und Gestaltung digitaler Inhalte des Internets (geboren 1981-1995)
Erwartungsgemäß unterscheiden sich die Kohorten im technologiebasierten Problemlösen – genauer in der Nutzung von Routinen im Lösungsprozess und im erreichten Kompetenzniveau. Ältere Kohorten benötigten im Mittel mehr Zeit für Teilschritte, die durch Routinen bearbeitet werden können und sie erreichten im Mittel niedrigere Kompetenzniveaus. Obwohl Lesekompetenzen eine wesentliche Bedeutung im technologiebasierten Lösen von Problemen haben, können sie die Kohortenunterschiede nicht umfassend aufklären. Weil ältere Personenkohorten während ihrer formellen Ausbildungsphasen IKT – wie sie heute verwendet werden – nicht nutzen konnten, haben informelle Lerngelegenheiten eine wesentliche Bedeutung. So profitieren ältere Personen von einem regelmäßigen, beruflichen oder privaten Umgang mit diesen Technologien. Die Testwerte des technologiebasierten Problemlösens spiegeln entstehungsgeschichtlich begründete Kohortenunterschiede wider, welche durch lebenslange, formelle und informelle Lerngelegenheiten minimiert werden können.
3. Der Umgang mit IKT ist – begründet durch deren Entstehungsgeschichte – eher weniger Teil der formellen und schulischen Bildung.
Technologiebasiertes Problemlösen wird weniger in formellen und schulischen Lerngelegenheiten erworben, als andere Kompetenzen wie beispielsweise mathematische und Lesekompetenzen. Folglich wurden für das technologiebasierte Problemlösen kleinere Differenzen zwischen hohen, mittleren oder niedrigen Bildungsabschlüssen erwartet und konnten empirisch anhand der PIAAC-Daten belegt werden. Vorteile von Personen mit einem hohen Bildungsabschluss konnten durch höhere Lesekompetenzen erklärt werden. Die Testwerte des technologiebasierten Problemlösens bilden entstehungsgeschichtlich begründete Unabhängigkeiten des Kompetenzkonstruktes ab, das zumeist nicht schulisch erworben wurde.
4. Technologiebasiertes Problemlösen ist ein eigenständiges Kompetenzkonstrukt, das Parallelen zu mathematischen und Lesekompetenzen aufweist.
Mathematische und Lesekompetenzen stehen in einem Zusammenhang mit dem Umgang mit IKT und somit auch mit dem technologiebasierten Problemlösen. Die Leseanteile am technologiebasierten Problemlösen werden als größer eingeschätzt, als die der mathematischen Kompetenz und stärkere Effekte durch Lesekompetenz konnten empirisch
nachgewiesen werden. Die Annahme der Eigenständigkeit des technologiebasierten Problemlösens wird im Weiteren dadurch gestützt, dass der alltägliche Umgang mit mathematischen und Leseinhalten weniger stark mit ihm assoziiert ist, als der Umgang mit IKT. Nomologische Netze zwischen technologiebasiertem Problemlösen und mathematischen sowie Lesekompetenzen konnten empirisch gestützt werden und die Annahme der Eigenständigkeit des Kompetenzkonstruktes bestärkt.
5. Die Nutzung von IKT – als Lerngelegenheit verstanden – und andere Lerngelegenheiten sowie Indikatoren erfolgreichen Lernens können zum technologiebasierten Problemlösen beitragen.
Lebenslanges Lernen ist ein Teil der menschlichen Natur und in diesem Rahmen dienen verschiedenste formelle und informelle Lerngelegenheiten dem Erwerb von Wissen und Kompetenzen (Dohmen, 2001). So erreichen Personen im technologiebasierten Problemlösen ein höheres Kompetenzniveau, wenn sie regelmäßig privaten oder beruflichen Umgang mit IKT hatten. Neben diesen informellen Lerngelegenheiten steht auch die Teilnahme an Weiterbildungen in einem positiven Zusammenhang mit der technologiebasierten Bewältigung von Problemen. Des Weiteren hat eine positive Einstellung gegenüber dem Lernen neuer Inhalte einen Einfluss auf die technologiebasierte Problemlösekompetenz. Die Testwerte des technologiebasierten Problemlösens spiegeln die Lernerfolge durch das lebenslange Lernen wider, die durch verschiedene bildungsbiographische Merkmale – insbesondere formelle und informelle Lerngelegenheiten – befördert werden.
Das technologiebasierte Problemlösen in der Operationalisierung der PIAAC-Studie lässt eine konstruktrepräsentative Testwertinterpretation zu und ermöglicht somit eine differenzierte Beschreibung von Kompetenzen im Umgang mit IKT.
Die kumulative Dissertation beschäftigt sich mit der atmosphärischen Konzentration von Eiskeimen, einer Unterklasse des atmosphärischen Aerosols, die bei der Eisbildung in Wolken eine zentrale Bedeutung besitzt. Messungen der Eiskeimkonzentration am Taunusobservatorium (Kleiner Feldberg) (nahe Frankfurt am Main) wurden mit dem Verfahren einer Vakuum-Diffusionskammer durchgeführt. Die Arbeit umfasst die Darstellung des angewandten Messverfahrens und die Analyse und Bewertung der Messergebnisse für den Raum Zentraleuropa, anhand von u.a. Rückwärtstrajektorien und Korrelationen zu aerosolphysikalischen Parametern. Ein signifikanter Einfluss von Mineralstaub-Ferntransport aus Wüstengebieten auf die Eiskeimkonzentration in Zentral-Europa wurde ermittelt.
In dieser Arbeit wurden Methoden entwickelt, mit denen das Auflösungsverhalten schwer wasserlöslicher schwacher Säuren verbessert werden kann. Als Modellwirkstoffe wurden drei Vertreter der Sulfonylharnstoff-Gruppe (Glibenclamid, Glipizid und Glimepirid) gewählt. Diese Wirkstoffe, werden zur oralen Standardtherapie des Typ 2 Diabetes eingesetzt. Die Ergebnisse aus den Löslichkeits- und Freisetzungsuntersuchungen der reinen Arzneistoffe bildeten in dieser Arbeit den Ausgangspunkt der Entwicklungsarbeit. Um den Einfluss der galenischen Methoden auf das Freisetzungsverhalten der entwickelten Formulierungen besser zu beurteilen, wurden ebenfalls entsprechende Handelspräparate (Euglucon N 3,5 mg, Luditec 5 mg und Amaryl 4 mg) untersucht. Zunächst wurden mit Glibenclamid und dem natürlichen ?-CD sowie verschieden Cyclodextrin-Derivaten (M-?-CD und HP-?-CD) binäre Komplexe im molaren Verhältnis von 1:2 (Glibenclamid:CD) hergestellt und charakterisiert. Anschließend wurden feste Lösungen aus Glibenclamid und Kollicoat(r) IR bzw. PVP K30 entwickelt. Bei den nachfolgenden Freisetzungsuntersuchungen zeichnete sich im Falle der binären Cyclodextrin-Komplexe ab, dass der Glibenclamid-HP-?-CD-Komplex das beste Freisetzungsverhalten von Glibenclamid in den untersuchten Medien erreichte. Bei den festen Lösungen von Glibenclamid gab es zwischen den beiden untersuchten Polymeren keine signifikanten Unterschiede im Ausmaß der Glibenclamidfreisetzung. Im nächsten Schritt wurden ternäre Komplexe (Glibenclamid-HP-?-CD-Polymer) entwickelt, eine Kombination aus binären CD- Komplexen und festen Lösungen. Als dritte Komponente wurden Kollicoat(r) IR, PVP K30 und PEG 6000 in unterschiedlichen Zusätzen, 5, 10 und 20% bezogen auf den zugrunde liegenden binären Glibenclamid-HP-?-CD-Komplex eingearbeitet. Die Charakterisierung der verschiedenen ternären Komplexe ergab, dass das beste Freisetzungsverhalten bei den Komplexen, welche einen 10%igen Kollicoat(r) IR- bzw. 20%igen PVP K30-Zusatz enthielten, generiert werden konnte. Bei den drei verwendeten Methoden (binäre-, ternäre Komplexe und feste Lösungen) erhielt man während der Freisetzungsuntersuchungen in den Medien mit einem pH-Wert unterhalb des pKs-Wertes von Glibenclamid (5,4) eine übersättigte Wirkstofflösung, was zum Teil innerhalb kürzester Zeit zum Präzipitieren des Wirkstoffes führte. Initiale DSC-Untersuchungen hatten gezeigt, dass Glibenclamid in den beschriebenen Präformulierungen in amorpher Form vorlag, was der Grund für die rasche Freisetzung war. Anschließend wurde versucht, das Präzipitieren zu verlangsamen und im besten Fall zu verhindern. Hierfür wurde HPMC in verschiedenen Formen verwendet. Das einfache Hinzumischen von HPMC in eine Gelatine-Kapsel zu der Glibenclamid-Formulierung führte aufgrund von Agglomeratbildungen zu einer deutlichen Verzögerung der Wirkstofffreisetzung. Pankreatin als Zusatz zum Freisetzungsmedium konnte die Bildung eines Agglomerates nicht verhindern, was darauf schließen ließ, dass dieses nicht durch sogenanntes "Cross-linking" der Gelatine entstanden war. In einem nächsten Schritt wurden HPMC-Kapseln eingesetzt. Die Glibenclamidfreisetzung konnte durch einfaches Austauschen der Gelatine-Kapseln gegen Vcaps(r) Plus-Kapseln in allen untersuchten Medien deutlich gesteigert werden, was auf die durch die Anwesenheit von HPMC verzögerte Präzipitation des Wirkstoffes im Freisetzungsmedium zurückzuführen war. Im nächsten Schritt wurde, die Formulierungsmethode von Glibenclamid, auf Glipizid übertragen. Es wurde analog zu Glibenclamid ein binärer Glipizid-HP-?-CD-Komplex im molaren Verhältnis von 1:2 (Glipizid:HP-?-CD) hergestellt. Dieser Komplex führte zu einer deutlichen Verbesserung des Auflösungsverhaltens von Glipizid, was zu einer annähernd 100%igen Wirkstofffreisetzung in allen untersuchten Medien führte. Weiterhin wurden die mit Glibenclamid entwickelten Methoden auch auf Glimepirid übertragen. Die Formulierung von Glimepirid zu einem binären Glimepirid-HP-?-CD-Komplex führte zu einer höheren Wirkstofffreisetzung, verglichen mit der kristallinen Reinsubstanz und des Handelspräparates. Durch die Verarbeitung von Glimepirid in ternären Komplexen erhöhte sich das Ausmaß der Wirkstofffreisetzung deutlich. Mit Kollicoat(r) IR konnte eine Wirkstofffreisetzung von ca. 60% der Dosis und mit PVP K30 als dritter Komponente sogar ca. 85% Wirkstofffreisetzung in Blank FeSSIF erzielt werden. Das Präzipitieren des Wirkstoffes nach initialer Wirkstofffreisetzung in Blank FeSSIF konnte durch den Einsatz von Vcaps(r) Plus-Kapseln deutlich reduziert werden. Stabilitätsuntersuchungen, welche mit den in dieser Arbeit verwendeten Präformulierungen durchgeführt wurden zeigten, dass der jeweilige Wirkstoff auch nach einem Jahr der Lagerung bei Raumtemperatur und < 30% rel. Luftfeuchte, in amorpher Form in den entsprechenden Präformulierungen vorlag. All diese Untersuchungen zeigten eindrucksvoll, dass sich Cyclodextrin-Derivate in Kombination mit hydrophilen Polymeren, dazu eigneten, die Verfügbarkeit schwer löslicher Wirkstoffe im Dünndarm für deren Resorption zu verbessern. Es wurde gezeigt, dass die Herstellungsmethodik der Cyclodextrin-Komplexe einen wesentlichen Einfluss auf die Wirkstofffreisetzung hatte.
Im Rahmen dieser Dissertation wurden unterschiedliche Aspekte der Verbreitung der Vertreter des Pseudoterranova decipiens Komplexes betrachtet und Fragestellungen zur Ökologie und Humanpathogenität der Parasiten bearbeitet. Sie basiert auf drei (ISI-) Fachartikeln, in denen die Nutzung von Fischparasitengemeinschaften als ökologische Indikatoren für entlegene Ökosysteme des Südpolarmeeres (I), die Modellierung geeigneter Verbreitungsgebiete für Arten mit geringen Vorkommensdaten am Beispiel des P. decipiens Komplexes (II) und das Vorkommen potentiell humanpathogener P. bulbosa in unterschiedlichen Mikrohabitaten in Atlantischem Kabeljau (III) thematisiert wurde.
Die Parasitengemeinschaften der in Studie I untersuchten, nahverwandten Antarktisdorsche (Nototheniinae) Nototheniops larseni (n=40), N. nudifrons (n=40) und Lepidonotothen squamifrons (n=49) unterschieden sich hauptsächlich hinsichtlich seltener Parasitenarten. Pseudoterranova decipiens E zählte zu den häufigsten Parasiten der drei betrachteten Wirtsarten. Die Analyse der Wirtsspektren der auf Artebene bestimmten Parasiten zeigte eine geringe Spezifität antarktischer Fischparasiten im Larven- (z.B. Pseudoterranova decipiens E) und Adultstadium (z.B. Elytrophalloides oatesi). Für eine Nutzung als Bioindikatoren ergibt sich die Empfehlung, nicht auf einzelne Parasitenarten, sondern die Zusammensetzung von Parasitenfaunen zurückzugreifen und Parameter wie Abundanz oder Intensität zu berücksichtigen. Vergleiche mit Literaturdaten legten nahe, dass ein Studiendesign, das den periodischen Vergleich der Parasitierungsmuster von Nototheniinae ermöglichen soll, Standorteffekte berücksichtigen sollte. Da es sich bei der Probennahme demersaler Fische um ein aufwändiges und einschneidendes Verfahren handelt, sollten alternative Samplingmethoden vorangetrieben und eine Datenbasis dafür geschaffen werden.
Um die Belastung von Speisefischen mit potentiell humanpathogenen Parasiten in bestimmten Fanggebieten abzuschätzen, kann anhand von Vorkommens- und Umweltdaten mittels statistischer Modelle die Habitateignung für den Parasiten bestimmt werden. Eine Voraussetzung für eine verlässliche Modellierung bilden die Wahl eines geeigneten Algorithmus und die Qualität der Eingangsdaten. Für die Modellierung geeigneter Verbreitungsgebiete für die sechs Arten des P. decipiens Komplexes wurde im Rahmen von Studie II erstmalig ein biotischer Deskriptor herangezogen. Dem Ansatz lag die Annahme zugrunde, dass das Vorkommen geeigneter Endwirte der entscheidende, limitierende Faktor für die Verbreitung eines Parasiten ist, da nur so der Lebenszyklus geschlossen werden kann. Als Hypothesentest dienten Vergleiche der ökologischen Nischen von Parasiten und ihren spezifischen Endwirten im Nischenraum. Anhand der Endwirtdistanz wurde eine Verbesserung der Modellierungsergebnisse mit MaxEnt, gegenüber der ausschließlich auf abiotischen Prädiktoren basierenden Modellierung, für alle Pseudoterranova Arten, insbesondere jene mit einer geringen Anzahl Fundpunkte, erzielt. Grundsätzlich ist der Ansatz auf marine Parasitenarten, deren spezifische Endwirte verlässliche Vorkommensdaten aufweisen, übertragbar. Die Methode stellt jedoch keinen Ersatz für die Erhebung von Vorkommensdaten dar, weshalb die genetische Bestimmung schwer zu identifizierender Taxa sowie die Angabe von Metadaten in jeder parasitologischen Studie obligatorisch sein sollten.
Die Verteilung potentiell humanpathogener Parasitenstadien in für den menschlichen Verzehr vorgesehenen Fischen kann ein entscheidender Faktor für die Übertragung sein. Im Rahmen von Studie III wurde mit dem Referenztranskriptom von P. bulbosa das erste Transkriptom für eine Art den P. decipiens Komplexes erstellt. Anhand einer differentiellen Genexpressionsanalyse wurde untersucht, was die Verteilung der Parasiten auf unterschiedliche Mikrohabitate beeinflusst haben könnte. Dabei wurden siebzig differentiell exprimierte Gene identifiziert, die in aus Leber (32 Gene) und Viscera (38 Gene) von Atlantischem Kabeljau (Gadus morhua) isolierten Proben von P. bulbosa hochreguliert waren. Eine Erklärung für diesen subtilen Unterschied könnte ein Dauerstadium der P. bulbosa Larven zum Zeitpunkt der Probennahmen sein. Ob sich bestimmte Mikrohabitate innerhalb des Wirtes begünstigend auf den Parasiten auswirken, muss mit Hilfe experimenteller Studien gezeigt werden. Erste in Studie III erhobene Daten zum allergenen Potential von P. bulbosa sollten in serologischen Studien getestet werden. Als Grundlage für die Bewertung des pathogenen Potentials von P. bulbosa, sowie der weiteren Arten des P. decipiens Komplexes, sollten in experimentellen Studien NGS-Daten erhoben werden.
Im Rahmen dieser Dissertation wurde in drei methodisch unterschiedlichen Studien ein Bedarf besserer Referenzdaten aufgezeigt. Bestreben diese Datenlücken zu schließen, um das Potential der Methoden besser ausschöpfen zu können, müssen zukünftig noch weiter verstärkt werden.
Die vorliegende Arbeit diente der Gewinnung neuer Erkenntnisse über die historische Entwicklung und Typisierung von Fragesätzen. Die Analyse basiert auf Materialien verschiedener indogermanischer Sprachen (Griechisch, Armenisch, Gotisch, Altkirchenslavisch, Altrussisch) sowie einer außerindogermanischen kaukasischen Sprache (Altgeorgisch). Primär wurden Bibeltexte aus dem Alten und Neuen Testament anhand von Faksimileausgaben und elektronischen Textcorpora untersucht. Die Arbeit demonstrierte anhand von über 540 Beispielen, welche Kriterien, graphische oder grammatische Mittel, Fragewortstellung oder Satzgliederfolge, in den überlieferten Texten für die Entschlüsselung von Fragesätzen hilfreich waren. Für jede betrachtete Sprache wurde eine möglichst ausführliche Klassifikation der Hauptfragesatztypen vorgelegt. Ferner gehörte zum Untersuchungsobjekt der Arbeit die in den Fragesätzen implizierte Antworterwartung. Für die weitere Analyse dieser Erscheinung wurden die Fragesätze aufgrund ihrer formalen Kennzeichen für Antworterwartung und Bedeutung eingeteilt. Anhand des übereinzelsprachlichen Vergleiches war es möglich, die spezifischen interrogativen Charakteristika aufzuzeigen, die in den einzelnen Sprachen für die jeweiligen schriftlich fixierten Perioden typisch waren. Wenn relevant, wurden auch Daten aus jüngeren Sprachstufen herangezogen. Die zum Schluss vorgestellte Gegenüberstellung von indogermanischen und kaukasischen Sprachen war erforderlich, um nicht nur genetisch bedingte sprachspezifische Charakteristika von Fragesätzen aufzuzeigen, sondern auch allgemeinsprachliche spezifische Merkmale zu eruieren.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine allgemein anwendbare Methode zur Identifizierung und Quantifizierung kleiner Moleküle mittels MALDI-TOF-MS entwickelt. Dabei wurden zahlreiche Analyten, wie unterschiedliche Arzneistoffe, Neurotransmitter und Lebensmittelinhaltsstoffe in verschiedenen Probenmatrizes analysiert. Bei den verwendeten Matrizes wurden mit a-Cyano-4-Hydroxy-Zimtsäure (CHCA) die besten Ergebnisse erzielt. Es zeigte sich jedoch, dass die Probenpräparation wichtiger war als die Wahl der Matrix, da auch mit anderen Matrizes bei optimierter Probenpräparation sensitive Messungen im niedrigen Massenbereich möglich waren. Insbesondere eine schnelle Trocknung des Probenspots, und damit verbunden die Bildung kleiner Kristalle, ist für die Analytik kleiner Moleküle hilfreich. Bei gleichzeitiger Verwendung geringer Matrixkonzentrationen und geringer Laserintensität konnte so der störende Matrixhintergrund minimiert werden. Eine noch stärkere Suppression der Matrixsignale bei gleichzeitiger Anreicherung der Analyten auf dem Probenspot konnte durch eine Dünnschichtpräparation (TLP) mit CHCA und Nitrozellulose erreicht werden. Allerdings war die TLP für eine automatische Quantifizierung kleiner Moleküle nur bedingt geeignet. Die für kleine Moleküle so wichtige Quantifizierung war durch Verwendung einer optimierten schnell trocknenden Dried Droplet Präparation (DDP) möglich. Die Kombination dieser optimierten DDP mit ausreichend aufsummierten Einzelschussspektren bei gleichzeitiger Verwendung eines internen Standards (IS) ermöglichte eine valide Quantifizierung mit guter Präzision, Linearität und Richtigkeit. Dabei erfüllten die quantifizierten Analyten die Vorgaben der FDA für Präzision und Richtigkeit. Diese Quantifizierungsmethode wurde an Mischungen unterschiedlicher Arzneistoffe, sowohl in Standardlösungen als auch in humanem Plasma, erfolgreich durchgeführt. Dabei genügte ein einziger interner Standard, um alle Arzneistoffe der Mischung schnell und sensitiv zu bestimmen (Bestimmungsgrenze 1-5 ng/ml). Weiterhin war es möglich, den Wirkstoff einer pharmazeutischen Tablette ohne aufwändige Probenvorbereitung schnell und genau zu bestimmen. Dass MALDI über eine hohe Salztoleranz verfügt, wurde bei der Bestimmung von Acetylcholin (ACh) und Cholin (Ch) in Mikrodialysaten bestätigt. Trotz des hohen Salzgehalts der Proben (~150 mM) war eine direkte Messung ohne vorherige Aufarbeitung möglich. Dabei lag die Nachweis- und Bestimmungsgrenze für ACh bei 0,3 bzw. 1 fmol/µl und für Ch bei 20 bzw. 100 fmol/µl. Nach den Standardlösungen wurden in-vivo Mikrodialysate aus dem rechten Striatum verschiedener CD1-Mäuse quantifiziert. Durch Verbindung der Dialysesonde mit einem MALDI-Spotter konnte außerdem die zeitliche Auflösung der Dialyse deutlich verbessert werden. Ein weiterer Anwendungsbereich stellte die Bestimmung von Melamin in Milch und Milchpulver dar. Nach einfacher Probenvorbereitung war es möglich, Melamin mit einer Bestimmungsgrenze von 0,25 ppm in Milchpulver bzw. 0,625 ppm in Milch direkt und schnell zu quantifizieren. Damit wurden die geforderten Grenzwerte von 1 ppm für Babynahrung bzw. 2,5 ppm für übrige Lebensmittel leicht erreicht. Als letzte Methode wurden verschiedene Inhaltstoffe in Energy Drinks bestimmt. Bei Verwendung von Theophyllin als IS konnte so neben Koffein auch Niacin und Pyridoxin erfolgreich und ohne Probenvorbereitung schnell quantifiziert werden. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass MALDI auch für die Analytik kleiner Moleküle gut geeignet ist. Neben der Identifizierung der Analyten war auch die Quantifizierung mit guter Linearität, Reproduzierbarkeit und Richtigkeit möglich. Dabei konnten mit der Standardmatrix CHCA verschiedenste niedermolekulare Analyten in unterschiedlichsten Probenmatrizes bestimmt werden. Im direkten Vergleich war die Sensitivität der vorgestellten MALDI-Methoden mindestens vergleichbar, wenn nicht gar besser als bestehende LC-MS-Methoden. Da auf den Einsatz einer LC verzichtet werden kann, ermöglich MALDI einen sehr viel höheren Probendurchsatz. Zudem war keine spezielle Matrix, besondere Geräte oder zeitaufwändige Probenvorbereitung und Präparation notwendig.
Ziel dieser Arbeit war es, eine vergleichende Bewertung der Erkennbarkeit der apikalen Aufhellung in den dreidimensionalen DVT-Aufnahmen und den konventionellen Panoramaschichtaufnahmen im Oberkiefer unter den folgenden Gesichtspunkten vorzunehmen:
Werden die apikalen Aufhellungen sowohl bei zwei- als auch bei dreidimensionalen Aufnahmen gleichermaßen erkannt?
Spielt die Stärke der Kompakta eine Rolle in der radiologischen Diagnose einer apikalen Aufhellung?
Zu diesem Zweck wurden 351 Patienten aus der Datenbank einer privaten Praxis in Stuttgart ausgewählt. Davon erfüllten 199 Patienten die Einschlusskriterien. Es wurden insgesamt 2223 Zähne durch den Untersucher ausgewertet. Es konnten 144 apikale Aufhellungen mittels der DVT diagnostiziert werden, wovon lediglich 23 (15,9 %) mittels der OPT erkannt wurden. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen insgesamt einen signifikanten Unterschied zwischen den DVT- und den OPG-Befunden hinsichtlich der Sichtbarkeit der apikalen Aufhellungen im Oberkiefer. Andere Parameter wie die Tiefe, die Breite und die Länge der apikalen Aufhellungen wurden ebenfalls untersucht. Die Messungen erfolgten mittels der Software i-CatVision 2008 für die DVT-Aufnahmen und mittels DBSWIN von Dürr Dental für die OPG- Aufnahmen. Es ergab sich daraus, dass die apikalen Läsionen, die im OPG und in der DVT sichtbar waren, signifikant größere Breiten hatten als die, die nur in der DVT sichtbar waren. Es zeigte sich hierbei ein signifikanter Unterschied (U- Test, p =0,018). Dies weist daraufhin, dass insbesondere schmale apikale Läsionen nicht sicher in OPG-Aufnahmen diagnostiziert werden, während sie in der DVT nachweisbar sind. Des Weiteren wurde in der Studie die Kompaktadicke gemessen. Es bestand kein signifikanter Zusammenhang zwischen der Sichtbarkeit der apikalen Aufhellung und der Kompaktadicke. Zusammenfassend lässt sich anhand der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit feststellen, dass die Kompaktadicke keine Rolle bei der Sichtbarkeit der apikalen Läsionen spielt und dass die OPT im Nachweis apikaler Läsionen der DVT eindeutig unterlegen ist. Es wurden dadurch nur 19 % der apikalen 64 Aufhellungen diagnostiziert und damit ist eine Unterdiagnose sehr wahrscheinlich.
Schlussfolgernd scheint die DVT ein zuverlässiges diagnostisches Mittel bezüglich des Erkennens der apikalen Läsionen zu sein. Mehrere Studien bezeichnen die DVT als Goldstandard und ziehen sie für die Diagnose der apikalen Aufhellungen den konventionellen Röntgenbildern vor. Dieses Vorgehen widerspricht jedoch dem Bestreben nach einer möglichst geringen Strahlenexposition gemäß dem ALARA-Prinzips. Damit bleibt die DVT derzeit eine Ergänzung zur konventionellen Bildgebung.
Hintergrund: Die kardiale Magnetresonanztomographie (CMR) gilt als Referenzstandard für die Beurteilung der linksventrikulären Funktion und des Volumens des linken Ventrikels (LV). Neuartige Echtzeittechniken versprechen eine schnelle Bildgebung bei freier Atmung mit ähnlicher Qualität. Ziel dieser Studie war es, die Genauigkeit der standardmäßigen Steady-State-Free-Precession (SSFP)-Cine-Bildgebung bei angehaltenem Atem mit der gleichen Sequenz unter Verwendung von drei Signalmittelungen, während freier Atmung sowie mit einer Compressed-Sensing (Cs)- Echtzeittechnik während der freien Atmung zur Beurteilung von LV-Volumen und Masse zu vergleichen.
Methoden: 24 Probanden wurden mit einer Standard-SSFP-Technik bei angehaltenem Atem (BH), mit derselben Technik bei freier Atmung unter Verwendung von drei durchschnittlichen Herzzyklen (SA-FB) sowie mit einem CS-Echtzeitprotokoll bei freier Atmung (CS-FB) untersucht. Verglichen wurden die Erfassungsdauer, die Genauigkeit sowie die Inter- und Intraobserver-Variabilität von LV-Funktion, Volumen und Masse.
Ergebnisse: Die Echtzeit-Bildgebung war erheblich schneller als die freie Atmung mit drei Signalmittelwerten (p<0.001). Die Korrelation zwischen dem Referenzstandard (BH) und den beiden anderen Techniken war ausgezeichnet mit einem r2 für SA-FB vs. BH zwischen 0.74 - 0.89 und einem r2 für CS-FB vs. BH zwischen 0.81 und 0.94. SA-FB ergab mittlere Fehler zwischen 5.9% und 15% für verschiedene LV-Parameter, während CS-FB zu mittleren Fehlern von 6.5%bis 13% führte. Die Inter- und Intraobserver-Variabilität war bei der Echtzeit-Bildgebung ausgezeichnet und bei der SSFP-Bildgebung (SA-FB und BH) gut.
Schlussfolgerung: Sowohl ein Standardprotokoll mit 3 Signalmittelungen, während der freien Atmung als auch die Compressed Sensing liefern genaue und reproduzierbare Messungen des LV, während die Echtzeit-Bildgebung wesentlich schneller ist.
Diese Arbeit hatte das Ziel, die Größe einer DVT-Aufnahme (FOV) mit der Größe der durch die Indikationsstellung definierten Region (ROI) zu vergleichen. Durch eine speziell dafür entwickelte Software sollten Messungen in den Datensätzen ermöglicht werden. Die dazu verwendeten 332 Datensätze wurden zufallsverteilt aus den mit einem Orthophos SL-3D DVT-Gerät der Firma Dentsply Sirona in der Poliklinik für zahnärztliche Chirurgie und Implantologie des ZZMK (Carolinum) in Frankfurt angefertigten Röntgenaufnahmen selektiert.
Es wurde die Auswertungssoftware ExRoi entwickelt, mit der die Werte des axialen Durchmessers, die Höhe (vertikale Dimension) sowie die Distanz der Mittelpunkte von FOV und ROI direkt in den Datensätzen bestimmt werden konnten. Zusätzlich wurde festgehalten, welche rechtfertigenden Indikationen gestellt und welche Auflösungsmodi verwendet wurden.
Die Stichprobe bestand aus Aufnahmen mit einem axialen Durchmesser von 8 cm [VOL 1] (n= 76, entsprechend 46,39%), 5 cm Durchmesser [VOL 2] (n = 102, entsprechend 30,72%) und 11 cm Durchmesser [VOL 3] (n= 154, entsprechend 22,89%). 95,18% der Aufnahmen wurden im HD-Modus mit laut Herstellerangaben vier Mal so vielen Aufnahmen im Vergleich zum SD-Modus angefertigt. Hauptindikationen waren Implantat Planung (45,1%) und Planungen komplizierter Zahn-Extraktionen (25,5%).
Die Messungen zum Vergleich des axialen Durchmessers zeigten, dass bei Verwendung des VOL 2 die ROI im Mittel den größten Anteil der FOV nutzt (78,52 %), den kleinsten Anteil nutzt durchschnittlich VOL 1 (56,04 %). Dazwischen liegt VOL 3 (69,12 %). In der Vertikalen nutzt die ROI von VOL 3 mittelwertig den größten Anteil der FOV (81,87 %), den kleinsten Mittelwert hat VOL 1 (58,76 %). VOL 2 liegt zwischen diesen Werten (64,47 %).
In allen Fällen war das FOV größer als die ROI und die ROI lag im Bereich des gewählten FOV.
Die Mittelpunkte von FOV und ROI lagen im Mittel in der axialen Ebene in Abhängigkeit vom gewählten Volumen um rund 9-13 mm auseinander, in der coronalen und sagittalen Ebene um rund 5-6mm.
Aus diesen Ergebnissen kann für das verwendete Gerät eine gute Trefferquote für die ROI abgeleitet werden. Höhe und Durchmesser des FOV hätten in den meisten Fällen kleiner gewählt werden können, liegen aber angesichts der vorhandenen Auswahl-Optionen des Röntgengeräts zur Dimensionierung der Volumina in einem akzeptablen Bereich.
Hintergrund:
Zur Klärung der klinischen Relevanz einer Milbensensibilisierung bei Kindern und Jugendlichen mit Asthma bronchiale ist die spezifische bronchiale Allergenprovokation (BAP) der Goldstandard. Aufgrund der technischen und personellen Voraussetzungen, sowie der potentiellen Gefahr einer schweren asthmatischen Spätreaktion ist die BAP nur eingeschränkt in spezialisierten Zentren verfügbar. Im Gegensatz dazu zeichnet sich nasale Allergenprovokation (NPT) durch ein hohes Maß an Patientensicherheit aus und kann ambulant durchgeführt werden. In dieser Studie sollte daher ein Vergleich zwischen der BAP vs. NPT erfolgen und klären inwiefern die NPT eine vorteilhafte Alternative im Diagnostikalgorithmus darstellen kann.
Methodik:
Von 157 untersuchten Patienten mit asthmatischen Beschwerden und positivem Pricktest (Dermatophagoides pteronyssinus; Dermatophagoides farinae) erfüllten 74 die Ein- / Ausschlusskriterien in vollem Umfang (Alter MW: 9,1 + 3,1 Jahre). Nach der BAP und der Messung des eNO, erfolgte eine Blutentnahme zur Bestimmung von Blutbild und spezifischem IgE, ggf. konnte Nasensekret gewonnen werden. Im Anschluss wurde innerhalb von 12 Wochen eine NPT mit Milbenallergen in aufsteigender Verdünnung durchgeführt. Hierbei wurde das Ergebnis zum einen mittels Symptomscore nach Lebel evaluiert, sowie die nasale Obstruktion mittels Peak Nasal Inspiratory Flow Meter (PNIF) bestimmt. Zum Abschluss beantworteten die Patienten einen standardisierten Fragebogen zur Lebensqualität mit Rhinokonjunktivitis (RQLQ).
Ergebnisse:
In der BAP konnten 57 Patienten mit einer bronchialen Frühreaktion (FEV1 - Abfall Mean bei 29,2% ± 7,4) identifiziert werden, von diesen wurden 41 mittels Lebelsymptomscore und 19 mittels PNIF erkannt. Während der Symptomscore nach Lebel damit eine ausreichende Sensitivität von 71,9 % und einen positiv prädiktiven Wert (PPV) von 89,1 % erreichte, war die Sensitivität für den PNIF mit 33,3 % ungenügend bei einem PPV von 82,6 %. Die negativ prädiktiven Werte lagen bei 42,8 %, respektive 25,4 %. Sowohl das eNO größer oder gleich 10 ppb (AUC 0,78) als auch das kumulative spez. IgE größer oder gleich 25,5 kU/l (AUC 0,72) erwiesen sich als gute Prädiktoren einer bronchialen Frühreaktion (EAR), eine Korrelation mit dem Symptomscore nach Lebel konnte jedoch nicht festgestellt werden.
Schlussfolgerung:
Unsere Ergebnisse zeigen für den Symptomscore nach Lebel eine hohe Vorhersagekraft zur Detektion einer EAR in der bronchialen Milbenprovokation. Ein negativer Score konnte eine asthmatische Reaktion jedoch nicht ausreichend ausschließen. Für den PNIF fanden wir keine ausreichende Testvalidität. Besonders bei pädiatrischen Patienten ist zu berücksichtigen, dass diese Messung stark von der individuellen Leistungsfähigkeit beeinflusst wird. Zudem weisen die nasale und bronchiale Mukosa lokale Unterschiede auf, sodass eine nasale Reaktion nicht identisch mit einer EAR ist. Bei Kindern und Jugendlichen mit Asthma bronchiale ist die BAP daher nicht vollständig durch die NPT ersetzbar. Besonders im ambulanten Bereich findet die NPT jedoch ihre Berechtigung, durch die deutlich geringeren Testanforderungen bei einem hohen Maß an Patientensicherheit. Darüber hinaus gehen rhinitische Beschwerden häufig einem Asthma bronchiale voraus, sodass auch falsch positive Testergebnisse im Lebel - Score berücksichtigt werden sollten. Neben dem Symptomscore identifizierten wir sowohl das spezifische IgE als auch das eNO als valide Prädiktoren einer EAR, eine direkte Korrelation zum NPT konnte jedoch nicht gefunden werden.
Hintergrund: Die Aortenklappenstenose stellt in Europa und Nordamerika das häufigste Klappenvitium dar und ist vor allem auf eine degenerative Genese zurückzuführen. Da das Auftreten erster Symptome mit einer schlechten Prognose assoziiert ist, ist die transfemorale Aortenklappenimplantation mittels Katheter (TAVI) als minimalinvasive Therapie schon seit längerem eine Alternative zum operativen Ersatz der Aortenklappe und aktuelles Thema der Forschung. Zwar existiert eine Vielzahl an Transkatheterklappen und es werden fortlaufend neue Generationen entwickelt, allerdings liegt bislang noch keine Studie vor, die einen direkten Vergleich der intraannularen Portico-Prothese (Abbott) mit der ebenfalls selbstexpandierbaren, aber supraannularen, Symetis-Prothese (Boston Scientific) präsentiert.
Methoden: Es erfolgte eine retrospektive Analyse von 142 gematchten (nach Alter, BMI, NYHA-Klasse, EuroScore, insulinpflichtiger Diabetes Mellitus, arterielle Hypertonie, COPD, KHK, präinterventionelle eGFR, cAVK, Schlaganfall, TIA in der Vorgeschichte) Patienten je Klappenmodell im medianen Alter von 83 Jahren, die sich mit einer hochgradigen symptomatischen Aortenklappenstenose im Zeitraum vom 12.10.2015 bis zum 07.01.2020 einer transfemoralen TAVI im Universitätsklinikum in Frankfurt am Main unterzogen. Untersucht wurde als primärer Endpunkt die Gesamtmortalität nach 1 Jahr. Darüber hinaus wurden mittels multivariater Cox-Regression unabhängige Risikofaktoren identifiziert. Als sekundäre Endpunkte wurden Komplikationen innerhalb von 30 Tagen gemäß den Definitionen des Valve Academic Research Consortium (VARC) 2 gewählt wie die Implantationen neuer Schrittmacher, paravalvuläre Leckage, Gefäßkomplikationen und akutes Nierenversagen. Analysiert wurden außerdem prozedurale Faktoren, die Symptomatik anhand der NYHA-Klasse sowie einige Laborparameter vor und nach der TAVI.
Ergebnisse: In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die 1-Jahres-Mortalität mit der Portico-Prothese signifikant höher ist als mit der Symetis-Prothese (25,2% vs. 12,2%; p=0,011). Dabei gelten neben der Portico-Prothese eine reduzierte linksventrikuläre Funktion und die NYHA-Klassen III/IV gemäß multivariater Cox-Regressionsanalyse als unabhängige Risikofaktoren. Postinterventionell war in der Portico-Kohorte ein neuer Linksschenkelblock (34,5% vs. 23,2%; p=0,036), die Implantation neuer Schrittmacher (22,6% vs. 11,8%; p=0,011) sowie ein akutes Nierenversagen (25,5% vs. 12,8%; p=0,006) signifikant häufiger. Hinsichtlich prozedurbezogener Faktoren hat sich herausgestellt, dass mit der Symetis-Prothese häufiger nachdilatiert (41,5% vs. 25,3%; p=0,004), mit der Portico-Prothese hingegen häufiger vordilatiert (92,2% vs. 82,3%; p=0,012) wurde. Außerdem wurde in der Portico-Kohorte signifikant mehr Kontrastmittel eingesetzt und das Verfahren mit der Durchleuchtung dauerte signifikant länger. Echokardiographisch resultierte post TAVI mit der Symetis-Prothese eine signifikant andere bzw. günstigere Verteilung der Aortenklappeninsuffizienzgrade. Laborchemisch war der Wert für NT-proBNP als biochemischer Marker für eine Herzinsuffizienz signifikant höher als in der Symetis-Gruppe.
Schlussfolgerung: Diese Arbeit zeigte eine signifikant höhere Mortalität nach 1 Jahr mit der Portico-Prothese im direkten Vergleich mit der Symetis-Prothese. Außerdem ergab der Vergleich signifikant höhere Komplikationsraten in der Portico-Kohorte hinsichtlich Schrittmacherimplantationen, neuem Linksschenkelblock und akutem Nierenversagen. Weitere Studien sollten die beiden Prothesen im längerfristigen Verlauf vergleichend analysieren. Die Ergebnisse dieser Studie können zur Optimierung neuer Klappengenerationen beitragen, indem sie auf potenziell prognosebestimmende Aspekte des Designs und der Implantationstechnik aufmerksam machen. Außerdem sensibilisert die Studie für eine individuell für jeden Patienten angepasste Prothesenauswahl. Möglicherweise sollte bei Vorerkrankungen der Niere oder bei vorbekannten Herzleitungsstörungen die Symetis- gegenüber der Portico-Prothese vorgezogen werden.
Ziel der Studie: Eine psychische Komorbidität spielt im Kontext mit weiteren persönlichen, sozialen und beruflichen Faktoren bei der Ermittlung des spezifischen Rehabilitationsbedarfs der Patienten in Deutschland eine immer bedeutendere Rolle. Um die Zuweisung von Patienten zu einer Rehabilitationsform besser ausdifferenzieren zu können, soll im Rahmen dieser retrospektiven Analyse ermittelt werden, von welchem der beiden untersuchten Rehabilitationskonzepte (OR/VMO) Patienten mit psychischer Komorbidität unter Berücksichtigung von Geschlecht, Erwerbsstatus und orthopädischer Hauptdiagnose stärker profitieren.
Methodik: Mittels der Screening-Fragebögen HADS-A, HADS-D, SIMBO und BPI sowie eines Klinikfragebogens zu Beginn der Rehabilitation wurden Angaben von 913 Probanden (529 m/384 w) ausgewertet. Hiervon wurden 43 % der OR und 57 % der VMO zugewiesen. So wurde die Häufigkeitsverteilung der Faktoren psychische Komorbidität, Geschlecht, Erwerbsstatus und orthopädische Hauptdiagnose festgestellt. Mittels HADS wurde am Ende der Therapie der Benefit durch Vergleich der Scorewert-Mediane ermittelt.
Ergebnisse: Häufigkeitsverteilungen und die Entwicklung der HADS-Scores zeigen, dass die im Vorfeld erfolgte Einteilung gemäß psychischer Komorbidität korrekt war. Frauen waren häufiger von einer psychischen Komorbidität betroffen und erzielten in der VMO größere Erfolge. Bezüglich der orthopädischen Hauptdiagnose ergab sich eine hohe Prävalenz von HWS- und LWS-Beschwerden. Beim Erwerbsstatus (Arbeits(un)fähigkeit, Arbeitslosigkeit, berufliche Problemlage) zeigte sich ein diffuseres Bild, das keine generalisierende Aussage bezüglich der arbeitsweltbezogenen Faktoren zulässt.
Schlussfolgerungen: Das Vorliegen einer psychischen Komorbidität stellt einen zielführenden Indikator dar, der als eines der Hauptzuweisungskriterien zur VMO beizubehalten ist. Auch das weibliche Geschlecht in Verbindung mit dem Vorliegen einer psychischen Komorbidität ist als adäquates Kriterium anzusehen. Bezüglich der orthopädischen Hauptdiagnose können insbesondere HWS-Beschwerden als Zuweisungskriterium geeignet sein. Aufgrund der sehr heterogenen Ergebnisse hinsichtlich der Aspekte des Erwerbsstatus lässt sich festhalten, dass diesbezüglich eine Zuweisung zu einem arbeitsweltbezogenen Therapiekonzept (z. B. MBOR) zielführender erscheint.
Ziel dieser Arbeit war es, zwei Atemtestverfahren in der Diagnostik der bakteriellen Fehlbesiedelung im Dünndarm bei Kindern mit Zystischer Fibrose miteinander zu vergleichen. Der moderne 13C-Xylose-Atemtest wurde dem bisher etablierten H2-Glukose-Atemtest gegenübergestellt. Dabei sollte zusätzlich die Suszeptibilität der CF-Patienten für eine IBF eruiert werden. Die Probanden absolvierten einen kombinierten 13C-Xylose-/H2-Glukose-Atemtest. Retrospektiv wurden zunächst die H2-Ergebnisse der einzelnen Probandengruppen analysiert und dann den maximalen PDR-, cPDR- und den DOB-Werten gegenübergestellt. Die Ergebnisse der aktuellen Studie sprechen für die Prädisposition der CF-Patienten, eine IBF zu entwickeln. Kliniker sollten aber bei der Interpretation der Atemtestergebnisse stets die beeinflussenden Faktoren, die vor allem die Erkrankung der Mukoviszidose mit sich bringt, berücksichtigen und therapeutische Konsequenzen vorsichtig umsetzen. So können die erhöhten Wasserstoffkonzentrationen im H2-Glukose-Atemtest bei CF-Kindern nicht ausschließlich einer IBF zugeschrieben werden. Die hohen Nüchternwerte sind auch Ausdruck der allgemeinen Maldigestion, Malabsorption und der intestinalen Motilitätsstörung, die bei diesen Patienten vorherrschen. Der 13C-Xylose-Atemtest lieferte in den Gruppen der Erwachsenen und Kinder ohne Zystische Fibrose repräsentative Ergebnisse, was für zukünftige Nutzung im Rahmen der Diagnostik einer IBF spricht. Bei heranwachsenden Kindern ist lediglich die altersabhängige endogene CO2-Produktion und orozökale Transitzeit zu berücksichtigen. Für die Diagnostik einer IBF speziell bei Patienten mit Mukoviszidose erscheint uns der 13C-Xylose-Atemtest nicht geeignet, was wir hauptsächlich der krankheitsspezifischen generellen Malassimilation, der Malabsorption und der intestinalen Motilitätsstörung zuschreiben. Wir beführworten daher aktuell weiterhin unter Berücksichtigung der ihn beeinflussenden Faktoren die Anwendung des H2-Glukose-Atemtests in der gastroenterologischen Diagnostik einer IBF wegen der einfachen, preiswerten und nichtinvasiven Anwendbarkeit. Weitere Studien sollen in Zukunft klären, ob der 13C-Xylose-Atemest trotz seiner hohen Kosten regelmäßig mit Nutzen im klinischen Alltag anzuwenden ist. Im Vergleich mit dem Goldstandard des Jejunalaspirates müssen Sensitivität und Spezifität des Isotopen-Atemtests in zukünftigen Studien erarbeitet werden.
Der zweckmäßige Einsatz der Skelettmuskulatur stellt in alltäglichen Bewegungen und im Sport ein zentrales Thema dar. Zur Ausführung unterschiedlicher Bewegungsziele verfügt die Muskulatur über verschiedene Arbeitsweisen, welche wiederum durch einzigartige neuronale Aktivierungsmuster realisiert werden. Bei der negativen Arbeitsweise, der Exzentrik, ist die innere Kraft der Muskulatur kleiner als die äußere Kraft des Widerstandes, wodurch die aktivierte Muskulatur in die Länge gezogen wird. Da hierbei durch das neuromuskuläre System die höchsten Kraftwerte erzielt werden, wird die Muskulatur unter exzentrischen Bedingungen einer sehr hohen Spannung ausgesetzt. Dies stellt eine wesentliche Voraussetzung für die Kraftsteigerung und Muskelhypertrophie dar. Deshalb befürworten Trainer und Autoren vielfach den Einsatz maximaler und supramaximaler exzentrischer Trainingsmethoden, um das Kraftvermögen in verschiedenen leistungssportlichen Disziplinen zu steigern. Ebenso wird diese Form des Trainings in präventiven und rehabilitativen Bereichen eingesetzt, um vor allem das Muskel-Sehnen-System zu kräftigen.
Ziel der vorliegenden Untersuchung war es, die Kontraktionsbedingungen und Effektivität des exzentrischen und konventionellen Krafttrainings zu vergleichen. Gleichermaßen war der Leistungstransfer auf eine funktionale mehrgelenkige Übung von besonderem Interesse. An der dazu durchgeführten Untersuchung nahmen 56 Probanden teil, wovon fünf aufgrund unerwarteter zeitlicher sowie verletzungsbedingter Ausfälle nicht das Ende der Untersuchung erreichten. In die Auswertung gelangten demnach 51 Probanden, davon 19 der exzentrischen Trainingsgruppe (ETG), 17 der konventionellen Trainingsgruppe (KTG) und 15 der Kontrollgruppe (KON). Letztere absolviert lediglich die Ein- und Ausgangstests. Vor, während und nach einem sechswöchigen Trainingszyklus am Beinstrecker wurden die exzentrische und konzentrische Maximalkraft sowie das Dreier-Wiederholungsmaximum an der Beinpresse ermittelt. Zur weiteren Analyse wurden bei diesen Tests die mittlere myoelektrische Aktivität (ARV) und Medianfrequenz (MDF) aus dem Oberflächen-EMG des m. vastus lateralis, m. vastus medialis und des m. rectus femoris aufgezeichnet. Von einer Teilgruppe aller Trainingsgruppen wurden zudem Veränderungen der Sprunghöhen aus Countermovement Jump (CMJ) und Squat Jump (SJ) ermittelt.
Beide Interventionsgruppen trainierten zweimal wöchentlich mit 5 Sätzen zu je 8 Wiederholungen am Beinstrecker. Der ETG wurde das Gewicht manuell angereicht, welches nach erfolgter Übergabe langsam und kontrolliert (maximal 25 °/Sekunde) von der gestreckten in die gebeugte Position geführt werden sollte. Die KTG führte das Gewicht ohne weitere Beschränkungen von der gebeugten in eine vordefinierte gestreckte Position und wieder zurück. Zur statistischen Auswertung wurden die Daten der Kontraktionsbedingungen des Eingangstests mittels t-Test für abhängige Stichproben analysiert. Zum Vergleich der Trainingsanpassungen wurde eine zweifaktorielle Varianzanalyse mit Messwiederholung und bei signifikantem F-Wert der post-hoc Test nach Scheffé durchgeführt. Dabei wurden die Steigerungsraten der Trainingsgruppen an den Veränderungen der KON relativiert. Das Signifikanzniveau wurde auf p ≤ 0,05 gesetzt.
Vor der Trainingsintervention lag die exzentrische Maximalkraft aller Probanden durchschnittlich 35,63 % über der konzentrischen und wurde begleitet von einer geringeren ARV und MDF. Durch beide Trainingsformen wurde die exzentrische Maximalkraft erhöht, jedoch fiel der Anstieg der ETG (35,41 %) signifikant größer aus als jener der KTG (24,48 %). Im Gegensatz dazu konnte die konzentrische Maximalkraft jedoch nur von der KTG signifikant gesteigert werden (19,92 %). Zum Vergleich ETG: 8,10 %. Das Dreier-Wiederholungsmaximum an der Beinpresse wurde in beiden Gruppen im ähnlichen Ausmaß signifikant erhöht (ETG 19,92 % vs. KTG 16,08 %). Die Analyse der Sprungkraftsteigerungen im CMJ (KTG 4,54 % vs. ETG 3,21 %) sowie im SJ (KTG 5,14 % vs. ETG 2,70 %) hingegen erbrachte keine signifikanten Steigerungen oder Unterschiede zwischen den Gruppen. Die festgestellten Entwicklungen der Kraftwerte lassen sich auf Grund der relativ kurzen Interventionsdauer überwiegend auf Anpassungen der intramuskulären Koordination zurückführen, welche durch einen Anstieg der ARV kenntlich wird. Dieser ARV-Anstieg fiel besonders bei der exzentrischen Maximalkraft auf, was auf einen trainingsbedingten Rückgang der Inhibition schließen lässt. Einen signifikanten Rückgang der MDF in allen Tests erzielte lediglich die ETG, dies jedoch nur für den m. rectus femoris. Signifikante Veränderungen der KTG oder Unterschiede zwischen den Trainingsgruppen blieben hier aus.
So führten beide Trainingsprogramme zu spezifischen Anpassungen der Kraft und myoelektrischen Aktivitätsmuster. Bezüglich der kumulierten Kraftsteigerung, des Leistungstransfers und der Veränderung der myoelektrischen Aktivität konnte jedoch keine Überlegenheit der exzentrischen Trainingsform herausgestellt werden. Aus ökonomischer Sicht bietet die exzentrische Methode allein keine genügende Vorbereitung auf primär konzentrische Bewegungsaufgaben. Die Ergebnisse legen jedoch nahe, dass das exzentrische Training zu äußerst spezifischen Anpassungen führt, welche bei der Trainingsplanung zielgerichtet Berücksichtigung finden sollten.
Chronisch-entzündliche Dermatosen sind in Deutschland weit verbreitet und haben einen enormen Einfluss auf die Lebensqualität der Erkrankten. Das umfassende Verständnis der molekularen Prozesse und Signalwege bildet die Basis, um mögliche Beziehungen zwischen den Hauterkrankungen aufzudecken. Der Nachweis von Ähnlichkeit und Übereinstimmung in den Signalwegen bietet die Aussicht, dass etablierte Therapien auch bei anderen Erkrankungen helfen können.
Der Zweck dieser Arbeit ist der Nachweis der Expression von IL-1β, IL-17A, IL-22, IL-23 und TNF-α in drei chronisch-entzündlichen Dermatosen: Acne inversa (AI), Sinus pilondalis (SP) und Perifolliculitis capitis abscedens et suffodiens (PCAS). Bei allen untersuchten Diagnosen handelt es sich um potentiell verwandte Erkrankungen der Haarfollikel, die durch Verlegung der Ausführungsgänge zu ausgedehnten Entzündungsreaktionen mit Bildung von Knoten, Abszessen und Fisteln führen. Bereits nachgewiesen ist, dass IL-1β, IL-17A, IL-22, IL-23 und TNF-α eine wichtige Rolle in der Pathogenese von Acne inversa spielen und Antikörpertherapien an einigen dieser Zielproteine spezifisch angreifen, um den Verlauf der Erkrankung zu verbessern.
Die Expression der Proteine wurde in Läsionen von Patienten mit den drei Indikationen immunhistochemisch an paraffiniertem Gewebe untersucht. Wie erwartet, zeigten sich in der überwiegenden Anzahl der Proben große entzündliche Infiltrate und hier wurde die Expression aller untersuchten Zytokine in unterschiedlicher Intensität nachgewiesen. Vielversprechend war insbesondere die Expression von IL-17A und IL-23 in SP und PCAS. Die Expression von IL-1β war insgesamt eher gering ausgeprägt; bei AI noch etwas höher als in SP und PCAS. Die Färbungen auf IL-22 zeigten sich kräftig in allen untersuchten Dermatosen. Allerdings gibt es bisher keine zugelassene Therapie zur Modulation dieses speziellen Zytokins. IL-22 scheint eine zentrale Rolle in
der Pathogenese der AI zu spielen. Mit TNF-α-Blockern wurden schon gute therapeutische Ergebnisse bei AI und PCAS erzielt. Deshalb ist der Nachweis von TNF-α in den entzündlichen Läsionen zu erwarten gewesen. Auch bei den SP-Proben fanden sich deutlich erhöhte Protein-Level, sodass auch hier eine gezielte Therapie von Vorteil sein könnte. Wegen des geringen Probenumfangs und der Methodik sind weitere gezielte Untersuchungen notwendig. Dennoch konnten viele Gemeinsamkeiten der Zytokinexpression ausgemacht werden, was vielversprechende Hinweise auf mögliche Behandlungsansätze bei AI, SP und PCAS zulässt. Diese Arbeit bietet einen ersten Blick auf den immunologischen Phänotyp der verwandten Dermatosen.
Einführung: In den letzten Jahren wurden mobile Endgeräte in zunehmenden Maße zur Messung biometrischer Daten wie z.B. Herzfrequenz, Blutdruck, Sauerstoffsättigung und EKG Messungen wie z.B. Rhythmusstörungen verwendet. In den meisten Fällen kann bezüglich eines EKG hierbei nur eine einzige Ableitung gemessen werden. Mit Ausnahme von EKG-Brustgürteln sind Messungen nur in Ruhe möglich. Letztere sind häufig nicht als Medizinprodukte zugelassen. Veränderungen in einem vektoriell, aus einer reduzierten Elektrodenzahl, errechneten EKG unter Belastung, welche mit einem mobilen Endgerät gemessen wurden, sind bisher nicht evaluiert worden. Einige Pathologien werden nur unter Stressbedingungen demaskiert, so dass mit den aktuellen Systemen eine diagnostische Lücke im häuslichen Umfeld existiert. Es wurde ein mit einem mobilen Endgerät (Smartphone/Tablet) vektoriell abgeleitetes 4 Elektroden EKG System mit dem aktuellen Goldstandard 12-Kanal EKG sowohl in Ruhe als auch unter Belastung verglichen.
Methoden und Ergebnisse: 428 Patienten wurden während einer fahrradergometrischen Untersuchung simultan mit beiden EKG Systemen untersucht. Das vektorielle EKG wurde als errechnetes 12-Kanal EKG dargestellt und bezüglich EKG-Qualität und diagnostischer Genauigkeit mit dem Standard EKG verglichen. Alle EKGs wurden unabhängig durch 2 verblindete und in der EKG Interpretation versierten Ärzte untersucht. Die EKG Qualität in beiden Verfahren war gut. In Ruhe gab es eine ausgezeichnete Übereinstimmung zwischen beiden EKG Technologien in Hinsicht auf Rhythmus (98%), AV-Überleitung (97%), Wellendauer (90%) und elektrischer Achse (88-97%). Während der Belastung gab es eine Übereinstimmung in 90% der Fälle. Der positiv prädiktive Wert lag bei 48.5% und der negativ prädiktive Wert bei 94%. ST-Deviationen >0.2 mV zeigten eine 97% Übereinstimmung während des Stresstests. Rhythmusstörungen und intraventrikuläre Leitungsstörungen (Links- und Rechtsschenkelblock) konnten in jeweils >90% der Fälle übereinstimmend identifiziert werden.
Schlussfolgerung: Ein mobiles Endgerät kann benutzt werden, um vektoriell errechnete 12-Kanal EKGs unter Alltagsbedingungen zuverlässig darzustellen. Die diagnostische Aussagekraft dieser EKGs in Ruhe und unter Belastung ist gut.
Bei fehlender Milz nach einer totalen Splenektomie kann es unter anderem zum lebensgefährlichen Postsplenektomie-Syndrom (overwhelming postplenectomy infection, OPSI) kommen, weshalb die partielle Splenektomie (PS) zunehmend in den Fokus rückt. Die Reduktion perioperativer Komplikationen erscheint zudem wünschenswert, weswegen der laparoskopische Operationsansatz zunehmende medizinische Resonanz genießt. Letzteren verbinden Chirurgen häufig mit geringeren postoperativen Schmerzen für den Patienten, besseren kosmetischen Ergebnissen und einer Reduktion chirurgischer Komplikationen.
Ziel dieser Studie war es, anhand verschiedener Parameter die perioperativen Ergebnisse zwischen der laparoskopischen partiellen Splenektomie (LPS) und der offenen partiellen Splenektomie (OPS) bei Kindern und Jugendlichen zu vergleichen. Betrachtet wurde ein Zeitraum von etwa zehn Jahren (2008-2018), wobei insgesamt 26 Patienten die Einschlusskriterien erfüllten. 10 Patienten unterzogen sich der LPS, während bei 16 Patienten eine OPS durchgeführt wurde. Anhand der digitalen Patientenakten wurden verschiedene perioperative Parameter erhoben, welche unter anderem die postoperative Schmerzstärke, den Analgetikabedarf, verschiedene hämatologische Variablen sowie die perioperativen Komplikationen umfassten.
Zwischen den beiden Gruppen unterschieden sich das postoperative Schmerzbefinden mit entsprechend analgetischer Therapie, der zeitliche Beginn des oralen Kostaufbaus und der postoperativen Mobilisation sowie die Dauer des stationären Aufenthalts nicht signifikant. Ferner wurden die chirurgischen Komplikationen anhand der Clavien-Dindo-Klassifikation (CDC) in verschiedene Grade eingeteilt und konnten sowohl in der laparoskopischen als auch in der offen-chirurgisch operierten Gruppe zeigen, dass hauptsächlich leichte Komplikationen vorlagen, bei denen ein Großteil der Patienten lediglich eine medikamentöse Therapie (80.8%) für die aufgetretenen Komplikationen (CDC ≤ II) benötigte. Lediglich bei 13% der offen operierten Patienten bedurfte es einer chirurgischen bzw. endoskopischen Intervention (CDC ≥ III).
Die Operationsdauer zwischen den beiden Gruppen unterschied sich jedoch signifikant. Bei der partiellen Splenektomie nahm der laparoskopische Zugangsweg signifikant mehr Zeit in Anspruch als bei der offen-chirurgisch operierten Gruppe. Darüber hinaus wurde der perioperative Blutverlust anhand der Mercuriali-Formel berechnet und zeigte bei der LPS-Gruppe einen signifikant höheren perioperativen Blutverlust als bei der OPS.
Die durch diese Studie erzielten Resultate zeigen anhand verschiedener perioperativer Parameter, dass die LPS im Vergleich zur etablierten OPS trotz signifikanter Unterschiede in der Operationszeit und dem perioperativen Blutverlust beide sichere und praktikable Operationsverfahren sind. Zusammenfassend stellten sich hinsichtlich der weiteren perioperativen Ergebnisse keine signifikanten Unterschiede zwischen beiden Gruppen dar.
Im Rahmen unserer Untersuchung konnte zudem dargestellt werden, dass die postoperativen Rekonvaleszenzvariablen sowie die Scores zur Erfassung der chirurgischen Komplikationen keinen signifikanten Unterschied ergaben. Ebenso wies die postoperativ dokumentierte Schmerzstärke der Patienten und der daraus resultierende Analgetikabedarf keine signifikanten Unterschiede auf.
Historisch betrachtet wurde Krebspatienten durch das behandelnde Personal von physischer Belastungen oftmals abgeraten (Steins Bisschop et al., 2012). Mit der zunehmenden Zahl an Publikationen im Bereich onkologischer Rehabilitation wird deutlich, dass Krebspatienten oftmals eine stark reduzierte kardiorespiratorische Leistungsfähigkeit aufweisen, was wiederum Implikationen für akute wie auch längerfristige krebs-assoziierte Effekte und Outcomes haben kann (Jones et al., 2008). Somit steht dem bisherigen Verhaltens-Dogma der Ruhe und Schonung bei Krebspatienten eine Vielzahl an Evidenz der Effektivität und Notwendigkeit von regelmäßiger körperlicher Bewegung gegenüber (Jones et al., 2008; Klika et al., 2009; Steins Bisschop et al., 2012). Diese Arbeiten bieten fundierte Informationen bezüglich der zu Grunde liegenden Limitationen der Belastungstoleranz. Darauf aufbauend wird dieses Wissen genutzt, um effektive Trainings- und Rehabilitationsprogramme zu entwerfen sowie klinische Resultate zu verbessern (Jones et al., 2009).
Strukturierte und individualisierte Sport- und Bewegungstherapie gilt dabei als ein vielversprechender Ansatz, die nachlassende Fähigkeit der selbständigen Alltagsbewältigung, die krebsassoziierte Müdigkeitssymptomatik (fatigue), aber auch die allgemeine kardiorespiratorische Fitness (KRF) zu verbessern (Schmitz et al., 2010). Für onkologische Patienten von ebenso großer Bedeutung ist die Tatsache, dass durch regelmäßige körperliche Aktivität Begleiterscheinungen der eingesetzten Behandlungsmethoden (Hayes et al., 2009), das psychische Wohlbefinden als auch die Gesamtmortalität positiv beeinflusst werden können (Mishra et al., 2012b; Mishra et al., 2012a). Zusätzlich verspricht regelmäßige körperliche Bewegung, den Funktionsverlust in den drei wichtigsten physiologischen Bereichen (Muskulatur, Herz-Kreislauf-System und kardiopulmonales System) zu verringern oder sogar aufzuhalten (Hayes et al., 2009). Demzufolge nimmt die sporttherapeutische Sekundär- und Tertiärprävention bei Krebserkrankungen eine wichtige Rolle ein, und die Frage nach einer effektiven und zielgerichteten Belastungs- und Trainingssteuerung auf Basis valider und reliabler Messgrößen der körperlichen Leistungsfähigkeit gewinnt zunehmend an Bedeutung (Ulrich et al., 2013; Kirkham et al., 2013).
Aktuelle Empfehlungen zu körperlicher Aktivität bei onkologischen Patienten orientieren sich hinsichtlich der Ausgestaltung in punkto Häufigkeit, Umfang und Intensität im Allgemeinen an Bewegungs-Leitlinien für gesunde Gleichaltrige ohne chronische Erkrankungen. Eine Besonderheit bei onkologischen Patienten stellt jedoch oftmals die Berücksichtigung therapieassoziierter bzw. krankheitsbedingter Nebenwirkungen in der praktischen Umsetzung der Empfehlungen dar. Aktuelle Leitlinien sehen dafür ein aerobes Ausdauertraining an mindestens 3-5 Tagen/Woche bei einem Intensitätsspektrum moderater (150min) oder intensiver (75min) Beanspruchung (MVPA) bei 46-90% der maximalen Sauerstoffaufnahmefähigkeit vor.
Die in der Literatur beschriebenen Probleme einer Vielzahl an Verfahren zur Bestimmung der KRF und der darauf basierenden Ableitung von individualisierten Trainingsempfehlungen haben in den letzten Jahren vermehrt zu Ansätzen basierend auf der individuell physiologischen Belastungsreaktion in der Ausdauertrainingssteuerung und –bewertung geführt (Meyer et al., 2005c; Bentley et al., 2007b; Binder et al., 2008; Hofmann & Tschakert, 2011). Dabei kommen vor allem die in der sportmedizinischen Ausdauerleistungsdiagnostik etablierten Verfahren der Laktat-Leistungsdiagnostik und der spiroergometrischen Ermittlung ventilatorischer Schwellen zum Einsatz.
Kernziel der vorliegenden Arbeit war daher die Untersuchung von Leistungskennwerten an submaximalen Variablen aus Spiroergometrie und der Laktatdiagnostik im Kollektiv der onkologischen Patienten mit unterschiedlichen Krebsentitäten.
Das folgende Kapitel 2 fasst den aktuellen Forschungsstand zu Epidemiologie, Prävalenz sowie die Auswirkungen onkologischer Erkrankungen auf Aspekte der körperlichen Ausdauerleistungsfähigkeit und deren Diagnostik in der Sportmedizin zusammen. Resultierend aus dem Forschungsstand werden daraufhin Zielstellung und –fragen der vorliegenden Arbeit formuliert. Kapitel 4 umfasst die methodische Ablaufbeschreibung des Studiendesigns, die Probandenrekrutierung und -stichprobe, die eingesetzten diagnostischen Messverfahren, sowie die Darstellung der statistischen Auswertung. Nachfolgend auf die Darstellung der Ergebnisse in Kapitel 5 werden diese in Kapitel 6 vor dem Hintergrund des dargestellten Forschungstandes und aktueller relevanter Literatur diskutiert. Abschließend erfolgt eine Praxis-orientierte kritische Beleuchtung der Arbeit sowie ein eine perspektivische Einordnung der Ergebnisse mit Ausblick auf zukünftige Forschungsarbeiten.