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Das Myc-Bindeprotein 2 (MYCBP2) könnte aufgrund seiner enormen Größe, seiner multiplen funktionalen Domänen und seiner ubiquitären Expression in die verschiedensten Signaltransduktionswege involviert sein. Bisher wurde überwiegend die Funktion der C-terminalen RING-Finger-Domäne untersucht, die die E3-Ubiquitinligase-Aktivität des MycBP2 bedingt. Über die Interaktion mit verschiedenen Signalwegen, wie den p38-Signalweg oder die mTOR-Aktivierung, kann MycBP2 über Ubiquitylierung und anschließendem proteosomalen Abbau diverse Prozesse der Synaptogenese und der spinalen Schmerzverarbeitung, aber auch der peripheren Nozizeption regulieren. Über die Funktionen der N-terminalen RCC1-ähnlichen Domäne ist dagegen weniger bekannt. Bisher konnte eine direkte Protein-Protein-Interaktion mit dem neuronenspezifischen elektroneutralen Kalium- und Chlorid-Ionen Co-Transporter KCC2 und mit der Adenylylcyclase nachgewiesen werden. Bindet MycBP2 oder seine RCC1-ähnliche Domäne an membranständiges KCC2 führt dies einem verstärkten Transporteraktivität, während die Bindung an die Adenylylcyclase in deren Hemmung resultiert. In der vorliegenden Arbeit sollten nun auf Basis eines Antikörperarrays neue Interaktionspartner des MycBP2 und deren Funktion bestimmt werden.
Der Antikörperarray vergleicht die Expression diverser Proteine in DRG-Lysat von SNS-Cre positiven und SNS-Cre-negativen MycBP2lox/lox Mäusen und weist Unterschiede im Vorkommen von SUMO1 auf. Durch Analyse mittels Western Blot zeigte sich ein verstärktes Signal für ein 85 kDa-Protein. Mittels Immunpräzipitation sowohl aus HeLa-Zellen als auch aus DRG-Neuronen wurde das Protein als SUMOyliertes RanGAP1 identifiziert. Durch CO-Immunpräzipitationen konnte eine direkte Protein-Protein Interaktion nachgewiesen werden, die während einer Zymosan-induzierten Hyperalgesie zu einer MycBP2-abhängig Regulation der RanGAP1 Expression und SUMOylierung führt. Die erhöhte RanGAP1 Menge in Abwesenheit von MycBP2 ist dabei nicht auf eine MycBP2-abhängige Ubiquitinierung des RanGAP1 zurückzuführen. Dagegen konnte eine Hemmung der Ubiquitinligaseaktivität des MycBP2 in Anwesenheit von SUMOyliertem RanGAP1 festgestellt werden, die sowohl bei der Autoubiquitylierung als auch beim proteosomalen Abbau von TSC2 nachgewiesen werden konnte. Weitere Untersuchungen zeigen eine durch SUMOyliertes RanGAP1-vermittelte Translokation des MycBP2 an den Zellkern, die durch Transfektion mit RanGAP1 siRNA sowohl in HeLa-Zellen als auch in primären DRG-Kulturen gehemmt werden kann.
Im nächsten Schritt wurde die mögliche Interaktion von MycBP2 mit Ran untersucht. Es zeigte sich, dass die Ranexpression in DRGs von Cre-positiven MycBP2lox/lox Mäusen im Gegensatz zu Cre-negativen MycBP2lox/lox Mäusen signifikant gesteigert ist und auch hier eine MycBP2-abhängige Expressionsregulation während der Zymosan-induzierten Hyperalgesie vorliegt. Ein 3D-Modell von primären DRG-Kulturen nach Immunfärbung weist eine Kolokalisation von MycBP2 und Ran sowohl im Cytosol als auch im Zellkern auf. Immunfärbungen von DRG-Schnitten zeigten außerdem, dass Ran in Abwesenheit von MycBP2 verstärkt im Zellkern vorliegt, was auf eine direkte Interaktion von MycBP2 mit Ran hindeutet. Auf Grund des stationären GTPase Assays konnte eine Integration des MycBP2 in den RanGTPase Zyklus belegt werden, da die Anwesenheit von MycBP2 zu einer gesteigerten GTP-Hydrolyse führte. Anhand des Ein-Zyklus-GAP-Assay wurde daher der Einfluss des MycBP2 auf die GAP-Aktivität des RanGAP1 überprüft, wodurch sich zeigte, dass MycBP2 die GAP-Aktivität des RanGAP1 hemmt. Damit bedingt die MycBP2/RanGAP1-Interaktion eine gegenseitige Hemmung der Enzymaktivität der beteiligten Proteine. Weitere Untersuchungen durch 35S-GTP-Bindeassays deckten eine konzentrationsabhängige GEF-Aktivität des MycBP2 für Ran auf, wobei die GEF-Aktivität von der RCC1-ähnlichen Domäne des MycBP2 vermittelt wird. Des Weiteren zeigte sich anhand von Versuchen mit der konstitutiv aktiven Ran-Mutante Q69L und der inaktiven Ran-Mutante T24N, dass MycBP2 verstärkt die inaktive Form des Ran, also RanGDP bindet.
In dieser Arbeit konnte so zum ersten Mal eine Integration des MycBP2 in den RanGTPase-Zyklus gezeigt werden, die es MycBP2 ermöglicht, sowohl in die nukleare Import/Export-Maschinerie, in den Aufbau der mitotischen Spindel und die Bildung der Kernmembran einzugreifen.
In der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen an zwei verschiedenen Retinalproteinen durchgeführt. Das erste analysierte Retinalprotein, Channelrhodopsin 2, wurde hauptsächlich auf die Beziehung zwischen Retinalisomerisierung und Photozyklus bzw. Funktionalität untersucht. Hierfür wurde das Chromophor all-trans Retinal durch verschiedene, sterisch anspruchsvolle, Retinalanaloga ersetzt. Das 9,12-Phenylretinal wurde bereits in BR erfolgreich eingesetzt, um die Isomerisierung des all-trans Retinals zum 13-cis Retinal in der Bindetasche zu verhindern und die Funktionalität des Proteins zu stoppen. In ChR2 hingegen kann das Phenylretinal nach Lichtanregung isomerisieren und ein Photoprodukt bilden, welches anschließend einen modifizierten Photozyklus durchläuft. In diesen Photozyklus zerfällt das erste Photoprodukt P1' sehr schnell und bildet ein zusätzliches Intermediat, Px, welches zeitlich zwischen dem P1' und P2' Intermediat liegt und eine grundzustandsähnliche Absorptionsbande besitzt. Im Vergleich zum Wildtyp läuft der modifizierte Photozyklus schneller ab als im Wildtyp und das Protein behält seine Funktion. Ein weiteres Retinalanalogon ist das trans-locked Retinal, welches sich als schwierig in das Protein einzubauen erwies. Dies resultierte in zwei verschiedenen Absorptionsbanden, wobei nicht klar war, welche die mit dem korrekt eingebauten Retinal war. Beide Banden wurden in Ultrakurzzeitexperimenten angeregt, hierbei stellte sich heraus, dass die bathochrom verschobene Spezies das korrekt eingebaute Retinal besitzt, da diese auch eine Schwingungsfeinstruktur, wie auch der Wildtyp, zeigt. Das trans-locked Retinal kann ChR2 erfolgreich an der Isomerisierung hindern und zeigt nach dem Zerfall des angeregten Zustandes keine Photoprodukt-Bildung.
Bei dem zweiten Retinalprotein, welches in dieser Arbeit untersucht wurde, handelt es sich um Krokinobacter eikaustus rhodopsin 2. Zuerst wird in dieser Arbeit die Primärreaktion des Proteins untersucht. Diese wurde unter verschiedenen Salzbedingungen, welche wichtig für die spätere Funktion des Proteins sind, jedoch auch Einfluss auf die Ultrakurzzeitdynamik des Proteins nehmen, analysiert. Der angeregte Zustand des Proteins zerfällt biexponentiell, wobei die erste Komponente den reaktiven Pfad und die langsamere Komponente den nicht-reaktiven Pfad beschreibt. Der reaktive Pfad bildet innerhalb einiger hundert Femtosekunden das bathochrom verschobene, isomerisierte J Intermediat, welches durch Kühlprozesse auf der unteren Pikosekundenzeitskala in das K Intermediat übergeht. Beim nicht-reaktiven Pfad zerfällt der angeregte Zustand innerhalb einiger Pikosekunden und geht in den Grundzustand über, ohne dass eine Isomerisierung des Retinals stattfindet. Sind Na+ oder K+ Ionen in der Lösung anwesend, sind diese Prozesse gleich schnell. In Abwesenheit dieser Ionen wird der nicht-reaktive Pfad stärker populiert und zerfällt langsamer. Das gleiche salzabhängige Verhalten konnte mit der Mutante H30A gezeigt werden. Die Aminosäure H30 sitzt im Interface zweier Oligomere in der Nähe der extrazellulären Na+ Bindestelle. Durch die Mutation von Histidin zu Alanin, wird das Protein fast ausschließlich zu einer Na+-Pumpe und pumpt kaum noch Protonen. Die Ultrakurzzeitdynamik bleibt jedoch unbeeinflusst davon und unterscheidet sich nicht vom Wildtyp. Neben dem normalen all-trans Retinal wurden auch hier, wie schon für Channelrhodopsin 2, Retinalanaloga im Wildtyp untersucht, hier hauptsächlich unter dem Aspekt der Farbanpassung. Die hier verwendeten Analoga waren das A2 Retinal und das MMA Retinal (MMAR), die beide durch die Erweiterung des -Systems zum Grundzustand rotverschobene Absorptionsspektren aufweisen. Das A2 Retinal besitzt eine weitere Doppelbindung und das MMAR zwei weitere Doppelbindungen im -Jonen Ring im Vergleich zum Retinal. Das MMAR hat zusätzlich noch eine weitere Methylamino-Gruppe. Durch das größere -System hat das MMAR auch die größere Rotverschiebung im Spektrum. Beide Retinalanaloga zeigen sehr breite ESA Banden und isomerisieren nur zu einem geringen Prozentsatz, die Hauptpopulation der angeregten Moleküle geht über den nicht-reaktiven Pfad zurück in den Grundzustand.
Der Photozyklus von KR2 wurde ebenfalls untersucht. Hierbei wird unter anderem das Verhalten des Proteins unter verschiedenen pH- und Salzbedingungen analysiert. Hierbei konnte festgestellt werden, dass die Dynamik des Natrium-Pump-Zyklus unabhängig vom pH Wert ist. In einem pH Bereich zwischen 6 und 9.5 ändern sich die Lebenszeiten des Zyklus nicht signifikant, jedoch wird die Amplitude des O Intermediats, welches als Indikator für den (nicht Protonen) Ionentransport genutzt wird, bei niedrigem pH Wert geringer. Die geringere Amplitude weist auf einen geringeren Na+-Transport hin. Dies liegt an der Kompetition der zu transportierenden Ionen, in diesem Fall Na+ und H+. Ist die H+ Konzentration viel höher als die Na+ Konzentration, so fängt das Protein an H+ zu pumpen. Unter physiologischen Bedingungen handelt es sich bei KR2 jedoch um eine reine Na+-Pumpe. Sind Kalium-Ionen bei pH 9.5 anwesend, so zeigt das Protein wie auch beim Natrium-Pump-Zyklus ein starkes O Intermediat, was darauf hindeutet, dass auch K+ transportiert werden kann. Dies konnte von Dr. Janina Sörmann (Arbeitsgruppe Bamberg, MPI für Biophysik Frankfurt) auch in elektrophysiologischen Messungen gezeigt werden. Bisher wurde in der Literatur davon ausgegangen, dass K+ vom Wildtyp nicht transportiert werden kann. Um die Photozyklusdynamik des Natrium-Pumpzyklus besser verstehen zu können, wurde die Temperaturabhängigkeit des Photozkylus mit Hilfe der Target Analysis untersucht. Hierbei stellte sich heraus, dass das simple sequentielle Modell K -> L -> M -> O -> GS die besten Fitresultate liefert, obwohl viele verschiedene Modelle mit Verzweigungen oder Rückraten ebenfalls getestet wurden. Resultat der Target Analysis sind unter anderem die Evolution Associated Difference Spectra (EADS). Diese beinhalten die Differenzspektren der einzelnen Zustände, welche um das Grundzustandsbleichen korrigiert werden können, um die Evolution Associated Spectra (EAS) zu bilden. Durch Entfaltung dieser EAS (auf der Energieskala) konnten die Reinspektren der einzelnen Photointermediate K, L, M und O berechnet werden. Auffällig hierbei war, dass das M Intermediat eine geringere Blauverschiebung als erwartet aufwies, was höchstwahrscheinlich an der Elektrostatik in der Retinal-Bindetasche liegt. Durch die Entfaltung der Spektren konnten ebenfalls die Gleichgewichte, welche zu schnell sind, um in der Target Analysis aufgelöst zu werden, bestimmt werden. Die K, L und M Intermediate stehen, je nach Temperatur, in verschiedenen Gleichgewichten zueinander, während das O Intermediat, keine Gleichgewichte eingeht und nur separiert von den anderen Intermediaten auftaucht. Dies bedeutet, dass sich zwischen M und O Intermediat ein unidirektionaler Schritt im Photozyklus befinden muss. Dieser hängt wahrscheinlich mit dem Na+-Transport zusammen, da das Ion beim Übergang vom M zum O aufgenommen und an der Schiffbase vorbei transportiert werden muss.
Um den Photozyklus besser untersuchen zu können, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Anlage zur transienten Blitzlichtphotolyse aufgebaut und die bestehende Breitband-Blitzlichtphotolyse automatisiert und verbessert. Hierfür wurden mithilfe von MATLAB und LABVIEW verschiedene Programme zur Datenakquisition, -verarbeitung und -analyse geschrieben. Für die transiente Blitzlichtphotolyse musste ein Datenreduzierungsprogramm entwickelt werden, um die mehrere Gigabyte großen Datensätze auf eine verarbeitbare Größe, mit gleichzeitiger Verbesserung des Signal-zu-Rausch-Verhältnisses, zu bringen. In der Breitband-Blitzlichtphotolyse konnte ein Pulsverzögerungsgenerator als zentrale Steuereinheit aller Komponenten der Breitband-Blitzlichtphotolyse eingesetzt und programmiert werden, um das Messverfahren zu automatisieren. Anschließend musste noch ein neues Datenverarbeitungsprogramm geschrieben werden, welches die Daten für die anschließende Analyse zusammenstellt und vorbereitet. Die neuen Programme gewähren einen reibungslosen Anschluss an die Analysesoftware OPTIMUS, welche in der Arbeitsgruppe genutzt wird.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Dynamik zweier grundlegend verschiedener, deaktivierender Mechanismen von Retinalproteinen untersucht. In einem dritten Projekt wurde die Photodynamik einer Dreifachmutante von visuellem Rhodopsin erforscht, von der eine Mutation zu kongenitaler (angeborener) Nachtblindheit führt und zwei andere Mutationen das Protein über eine Disulfidbrücke stabilisieren. Die Ergebnisse dieser drei Projekte sind im Folgenden zusammengefasst.
Die Aktivität des mikrobiellen Proteorhodopsins als lichtgetriebene Protonenpumpe kann photoinduziert unterbunden werden. Dies erfolgt durch die Absorption von blauem Licht durch das Retinal bei deprotonierter Schiff‘schen Base. Vor dieser Arbeit war allerdings nur wenig über den Mechanismus und die Kinetik dieses Effekts bekannt. Das einzige Retinalprotein, an dem diese Deaktivierungsdynamik auf molekularer Ebene zeitaufgelöst untersucht wurde, ist Bakteriorhodopsin. Doch auch an diesem System wurde die ultraschnelle Primärreaktion in der photoinduzierten Deaktivierungsdynamik - die Photoisomerisierung des 13-cis-Retinals - bisher nicht zeitaufgelöst gemessen.
In dieser Arbeit wurde ein Weg gefunden, diesen Prozess auf einer Sub-Pikosekundenzeitskala zu detektieren. Dazu wurde eine Proteorhodopsinmutante genutzt, in der der primäre Protonendonor E108 durch Glutamin ersetzt ist. Diese Mutante weist eine signifikante Erhöhung der Lebensdauer des M-Intermediats auf. Im photostationären Gleichgewicht führt diese veränderte Kinetik zu einer erheblich erhöhten Akkumulation des Proteins im M-Zustand, die ausreicht, um photoinduzierte Absorptionsänderungen der Deaktivierungsdynamik sowohl im sichtbaren als auch im mittleren Infrarotbereich auf ultrakurzer Zeitskala zu detektieren. Dieses Projekt erfolgte in Kooperation mit dem Arbeitskreis Glaubitz (Goethe-Universität Frankfurt am Main).
Es zeigte sich, dass die Anregung des Retinals von Proteorhodopsin im M-Zustand zur Isomerisierung von 13-cis zu all-trans führt, die nach wenigen Pikosekunden abgeschlossen ist. Der zweite und abschließende Schritt ist die Reprotonierung der Schiff'schen Base. Es stellte sich heraus, dass dieser Prozess auf einer Nanosekundenzeitskala abläuft und über einen Protonentransfer vom primären Protonenakzeptor D97 zur Schiff'schen Base ermöglicht ist.
Die in dieser Arbeit vorgestellte Methodik zur Untersuchung der deaktivierenden Photodynamik von Proteorhodopsin auf ultraschneller Zeitskala, könnte in Zukunft auf weitere mikrobielle Rhodopsine angewandt werden. So ist die Studie der Deaktivierungsdynamik von Channelrhodopsinen von großem Interesse für optogenetische Anwendungen. Eine lichtgesteuerte Kontrolle der Ionenkanalöffnung und -schließung sollte die Präzision in der Regulierung ionischer Permeation erheblich verbessern.
Die Proteorhodopsinmutante E108Q wurde außerdem in ihrer primären Photodynamik sowohl bei grünem als auch blauem Anregungslicht untersucht. Es zeigte sich in beiden Fällen eine Dynamik, die der des Wildtyps sehr ähnlich ist. Eine Beobachtung unterscheidet sich jedoch wesentlich vom Wildtyp. Das K-Intermediat der E108Q-Mutante scheint nach einigen hundert Pikosekunden zumindest partiell zu zerfallen, woraufhin sich eine Signatur im blauen Spektralbereich bildet. Blitzlichtphotolysemessungen lassen vermuten, dass diese blau absorbierende Species im zwei- bis dreistelligen Nanosekundenbereich wieder zerfallen sein muss.
Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit dem Photozerfall von visuellem Rhodopsin. Es ist bekannt, dass die Signaltransduktion durch Wechselwirkung zwischen aktiviertem Rhodopsin und Arrestin unterbunden wird. Im ersten Abschnitt wurde der Einfluss der Arrestin-1-Variante p44 auf die Photodynamik visuellen, bovinen Rhodopsins untersucht. In einer Kooperation mit dem Arbeitskreis Schwalbe (Goethe-Universität Frankfurt am Main) konnte gezeigt werden, dass Arrestin erheblichen Einfluss auf die Zerfallsdynamik von Meta II und Meta III hat. Es wurde festgestellt, dass die Wechselwirkung von p44 mit photoaktiviertem Rhodopsin eine erhöhte Population des Intermediats Meta III bewirkt, mit der Folge einer zweifach langsameren Freisetzungskinetik des all-trans-Retinals. Diese Beobachtung weist auf eine physiologische Rolle des Zustands Meta III in der Retinalhomöostase hin.
Gegenstand einer zweiten Studie mit dem Arbeitskreis Schwalbe ist zum einen die Rhodopsinmutation G90D, die mit kongenitaler (angeborener) stationärer Nachtblindheit zusammenhängt, und zum anderen die Doppelmutation N2C und D282C, die zur Ausbildung einer stabilisierenden Disulfidbrücke zwischen den im extrazellulären Bereich eingeführten Cysteinen führt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Photodynamik des Wildtyps, der Doppelmutante und der stabilisierten G90D-Mutante (Mutationen G90D, N2C und D282C) sowohl auf einer ultrakurzen Zeitskala als auch auf einer Minutenskala untersucht.
Den photoaktivierbaren Schutzgruppen PPGs wurde als wichtige Werkzeuge, um z. B. biologische Prozesse zu untersuchen, in den letzten Jahren eine beachtliche Aufmerksamkeit zuteil. Der Einsatz von PPGs weist gegenüber chemischen Schutzgruppen wertvolle Vorteile auf, was deren Einsatz für biologische Konzepte attraktiv macht. Insbesondere, da keine weiteren Reagenzien außer Licht als Mittel für die Photolyse benötigt werden. Darüber hinaus ist es möglich, durch Einsatz moderner Lasertechnik, eine homogene Bestrahlung des Reaktionsvolumens mit einer hohen Lichtdosis auf einer, im Vergleich zu klassischen Lichtquellen, kürzeren Zeitskala zu gewährleisten.
Die Diversität der einsetzbaren photosensitiven Schutzgruppen, kommt einerseits der Vielfalt der anwachsenden biochemischen Fragestellungen insofern zugute, als dass die ausgewählten PPGs auf verschiedenste Anforderungen der zu untersuchenden Systeme zugeschnitten werden können. Anderseits kann die, durch einige Problemstellungen, erforderte chromatische Orthogonalität der eingesetzten Schutzgruppen, gewährleistet
werden, deren Umsetzung sich in den letzten Jahren in zahlreichen Studien als erfolgsversprechend erwies. Beide Aspekte sind unter anderem Gegenstand der vorliegenden Arbeit.
Zum einen sollte das Photocaged Puromycin als photolabiles Antibiotikum Derivat, mithilfe der Cumarinylmethyl-Schutzgruppe (DEACM-Puromycin) optimiert werden und mit dem vorherigen Nitrobenzyl-geschützten NVOC-Puromycin mittels spektroskopischer und biochemischer Methoden verglichen werden. Zum anderen sollte eine neue Strategie etabliert werden, mit deren Hilfe das photolytisch entschützte Puromycin erneut deaktiviert werden kann.
DEACM-Puromycin konnte mithilfe eines fünfstufigen Syntheseweges hergestellt werden. Ausgehend von 7-Amino-4-methylcumarin, dessen allylische Methylgruppe durch die Riley-Reaktion mit Selendioxid Se2O zum entsprechenden DEACM-Aldehyd oxidiert wurde und anschließende Reduzierung in Anwesenheit von NaBH4 zum Cumarinalkohol DEACM-OH. Eine nicht toxische Variante, bei welcher Selendioxid umgangen wurde, zeichnete sich ebenso als zielführend aus. DEACM-OH und Puromycin konnten im Anschluss über ein Carbonat-Intermediat miteinander als Carbamat verknüpft und mithilfe von HPLC aufgetrennt werden.
Die Vorrangigkeit des neuen photolabilen Puromycin Derivates (DEACM-Puromycin), wurde zuerst mithilfe der Laser-NMR-Spektroskopie sowie HPLC Verfahren erfasst. Spektroskopische Analysen im Rahmen einer Kollaboration mit dem AK von Professor Wachtveitl bestätigten, dass DEACM-Puromycin für biologische Anwendungen geeignetere photolytische Eigenschaften, wie z. B. einen höheren Extinktionskoeffizienten, eine bathochrome Verschiebung des Absorptionsmaximums, sowie eine höhere Quantenausbeute und Uncaging Effizienz der Photolyse, aufwies. Basierend auf einer vergleichbaren HOMO-LUMO Differenz beider Verbindungen (DEACM-OH und DEACM-Puromycin), konnte die Spaltung der Schutzgruppe mithilfe der Differenz der Fluoreszenzslebensdauern mit einer Rate von 0,71*108 s-1 charakterisiert werden. Dies war im Vergleich zum vorherigen NVOC-Puromycin um eine Größenordnung höher. Weitere durchgeführte spektroskopische Methoden wurden mittels quantenchemischer Rechnungen unterstützt, um wichtige Erkenntnisse der kinetischen und dynamischen Abläufe der Photolyse des geschützten Puromycins anzueignen, z. B.:
• Der zur Photolyse von DEACM-Puromycin konkurrierende Fluoreszenzprozess, kann durch protische Medien unterdrückt werden. Dies und die somit ermöglichten Wasserstoffbrückenbindungen, welche die entstehenden ionischen Intermediate während der Photolyse stabilisieren, könnten sich für die Erhöhung der Quantenausbeute der photolytischen Abspaltung von DEACM-Puromycin zu Nutze gemacht werden.
• Anhand von Experimenten auf der ultrakurzen Zeitskala wurde die Population eines angeregten S1-ICT-Zustandes detektiert. Bei diesem findet, in Anwesenheit von polarem Lösungsmittel, einen Ladungstransfer der Diethylaminoreste auf den Cumarinring statt.
• Polare Lösungsmittel bewirken ebenfalls den Übergang zu einem TICT Zustand, welcher als nichtstrahlende Relaxation die Fluoreszenz des DEACM-Puromycins reduziert. Die Auswahl von Substituenten sowie polaren und protischen Lösungsmitteln zur Begünstigung der ICT- sowie TICT- Zustände, könnte zukünftig zur Optimierung der Photolyse Effizienz herangezogen werden.
Die gelungene Optimierung des geschützten Puromycins als ein photosensitives Antibiotikum, durch die DEACM-Schutzgruppe, konnte mittels eines XTT-Zellviabilität-Experimentes mit sf9-Insektenzellen nachgewiesen werden. Zusätzlich konnte die lichtkontrollierte Puromycylierung zur Visualisierung neu synthetisierter Proteine als weitere Funktion des optimierten photoaktivierbaren Puromycins in Zusammenarbeit mit dem AK. Schumann (MPI für
Hirnforschung, Frankfurt am Main) nachgeprüft werden. Obwohl beide photocaged Verbindungen, DEACM- sowie das vorherige NVOC-Puromycin, eine vergleichbare Zellpermeabilität zu den präparierten Neurozellen aufwiesen, zeigte DEACM-Puromycin unter gleichen Bedingungen nach der Belichtung ein signifikant intensiveres Puromycylierungsignal als NVOC-Puromycin. Unter der Annahme, dass sich mehr NVOC- als DEACM-Puromycin in
den Zellen befand, bestätigt diese Beobachtung die Vorrangigkeit des DEACM-Derivates, aufgrund seiner bereits optimierten photochemischen Eigenschaften. Durch den Einsatz eines Zwei-Photonen-Lasers, konnte die Eignung von DEACM-Puromycin für die raumselektive Steuerung der Detektion von neu exprimierten Proteinen, mit größerer Auflösung auf subzellularem Level, nachgewiesen werden.
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Die vorliegende Dissertationsarbeit behandelt eine umfangreiche Studie des nukleären Rezeptors (NR) TLX (engl. tailless homolog, TLX). Als ligandenaktivierbarer Transkriptionsfaktor ist TLX in Differenzierungs- und Proliferationsprozessen involviert und übernimmt somit eine tragende regulatorische Rolle in der Neurogenese von neuronalen Stammzellen87,88. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass eine fehlgesteuerte TLX-Expression mit gravierenden kognitiven, visuellen und neurodegenerativen sowie tumorigenen Erkrankungen assoziiert ist, sodass TLX ein vielversprechendes Wirkstofftarget mit hohem therapeutischem Potential darstellt94,95,99,100 105. Die pharmakologische Validierung von TLX als neues Wirkstofftarget befindet sich allerdings aufgrund limitierter Verfügbarkeit von validierten und potenten synthetischen und natürlichen kleinen organischen Molekülen in einer frühen Phase. Daher ist das Interesse sehr groß neuartige und wünschenswerterweise selektive TLX-Modulatoren zu generieren109,119-121.
Im Rahmen dieser Dissertationsarbeit wurden zu diesem Zweck mehrere Reportergenassays eingeführt, die die in vitro Aktivitätsstudie von TLX sowohl im Gal4-Hybridformat in Kombination mit Gal4-VP16 als starken Transkriptionsaktivator als auch als TLX-Volllängenprotein in HEK293T-Zellen (engl. human embryonic kidney, HEK293T) erlaubten. Zusätzlich wurde Gal4-TLX in Kombination mit VP16-RXRα untersucht, um bisherige unbekannte potentielle Heterodimer-vermittelte Effekte zu studieren. In einem primären Screeningansatz im Gal4-Format unter Verwendung einer kommerziell erhältlichen Wirkstofffragmentbibliothek und ausgewählter strukturähnlicher Wirkstoffe wurden mehrere Wirkstofffragmentkandidaten identifiziert (30, 34, 39, 45 und 47), die einen attraktiven Ausgangspunkt zur Darstellung von TLX-Modulatoren darstellten. Insgesamt wurden in vier Projekten vier strukturdiverse Chemotypen anhand von Struktur-Wirkungs-Beziehungs-Studien anhand der Aktivität an TLX untersucht. Ausgehend von Fragment 34 beinhaltete das erste Projekt die Identifizierung und Charakterisierung von Xanthinderivaten als inverse TLX-Agonisten. Eine systematische Struktur-Wirkungs-Beziehungs-Studie lieferte mehrere hochpotente Derivate, die auf das Grundgerüst von 8-Phenyltheophyllin (97) basierten. Parallel konnte Istradefyllin (116), welches aktuell zur Behandlung der Parkinson-Erkrankung in den USA und Japan Anwendung findet, als potenter inverser TLX-Agonist identifiziert werden. Mehrere orthogonale zelluläre und zellfreie Experimente klassifizierten die Xanthine als neue erste TLX-Modulatoren. Das zweite Projekt umfasste die Identifizierung und Charakterisierung des unselektiven β-Adrenorezeptorblockers Propranolol (54) ausgehend vom Wirkstofffragment 30. Durch eine vorläufige systematische Struktur-Wirkungs-Beziehungs-Untersuchung der aliphatischen Aminoalkoholseitenkette von 54 konnte die sekundäre Aminogruppe als determinierendes Strukturmotiv für eine Aktivität an TLX bestimmt werden. Weitere Migrations- und Zellviabilitätsexperimente demonstrierten erste phänotypische Effekte in T98G-Glioblastomzellen seitens 54, die TLX-vermittelt sein könnten. Das dritte Projekt behandelte die Darstellung eines potenten neuartigen TLX-Agonisten mit Hilfe eines ligandenbasierten Pharmakophormodells. Das verwendete Pharmakophormodell wurde hierbei unter Verwendung des publizierten Referenzliganden ccrp2 (2) und dem identifizierten Wirkstofffragment 45 aus dem vorherigen Screeningansatz generiert. Durch eine anschließende rationale Fragmentfusion von 45 mit weiteren TLX-Agonisten aus dem Wirkstofffragmentscreening konnte der neuartige potente TLX-Agonist 137h synthetisiert werden, welcher eine verbesserte mikrosomale Stabilität im Vergleich zu 45 und 2 aufwies. Das vierte Projekt beinhaltete die Darstellung neuartiger TLX-Modulatoren mit Hilfe eines Scaffold Hopping Ansatzes. Hierbei wurden essentielle Strukturmotive aus der Xanthin-Struktur-Wirkungs-Beziehung (erstes Projekt) auf weitere Wirkstofffragmente übertragen. Die Validierung dieses Scaffold Hoppings anhand der Verbindung 156 führte anhand eines darauf folgenden kombinatorisch-chemischen Ansatzes zur Darstellung einer Substanzbibliothek (255 Amidrohprodukte). Ein Aktivitätsscreening der Amidrohprodukte deutete in den Reportergenassays auf drei aktive TLX-Modulatoren hin (582, 611 und 629), welche nachträglich gezielt synthetisiert, isoliert und erneut auf Aktivität an TLX validiert wurden. Hierbei hob sich besonders 629 hervor, welches in drei orthogonalen zellulären Reportergenassays TLX-vermittelte Effekte aufwies und zusätzlich einen Bindungseffekt an rekombinanter exprimierter TLX-Ligandenbindedomäne zeigte.
Mit dieser Arbeit konnte mit Hilfe der Einführung diverser TLX-basierter Reportergenassays zur Aktivitätsstudie von TLX mehrere strukturdiverse Liganden als potentielle tool compounds identifiziert und charakterisiert werden. Alle abgeleiteten TLX-Modulatoren können somit als wertvolle neue Startpunkte zur Derivatisierung neuartiger potenter Liganden und somit zu einem Fortschritt in der pharmakologischen Validierung von TLX als Wirkstofftarget dienen.
In Vorarbeiten wurde gezeigt, dass der Kaliumkanal Slack an der Verarbeitung neuropathischer Schmerzen funktionell beteiligt ist und dass das klassische Neuroleptikum Loxapin Slack-abhängig neuropathisches Schmerzverhalten im Mausmodell lindert (Lu et al. 2015).
Ausgehend von Loxapin als Leitstruktur wurden in der vorliegenden Arbeit im FluxOR™ Kaliumkanal-Assay an Slack-transfizierten HEK-Zellen insgesamt 68 neue Loxapin-Derivate gescreent. Hierbei wurden 23 Substanzen mit Slack-aktivierenden Eigenschaften identifiziert, von denen VHP93, VH408 und VH425 weiter in vivo untersucht wurden. Dabei zeigten Mäuse nach systemischer Gabe von VHP93 ein reduziertes Verhalten in einem Modell für neuropathische Schmerzen. Dem gegenüber wurde durch VH408 das Verhalten im neuropathischen Schmerzmodell nicht beeinflusst.
Des Weiteren konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass durch eine Slack-Aktivierung nicht nur neuropathisches Schmerzverhalten gehemmt wird, sondern auch die Kratzreaktionen im Chloroquin-Modell des Histamin-unabhängigen Juckreizes reduziert werden können.
Neben Slack wurde in dieser Arbeit auch die Gewebsexpression und funktionelle Bedeutung des eng mit Slack verwandten Kaliumkanals Slick charakterisiert. Expressionsanalysen ergaben, dass Slick überwiegend in dünn myelinisierten A-delta-Fasern und inhibitorischen Interneuronen im Dorsalhorn des Rückenmarks lokalisiert ist. Tierexperimentelle Untersuchungen zeigten, dass Slick-Knockout-Mäuse ein erhöhtes Schmerzverhalten nach thermischer Stimulation aufwiesen. Außerdem wurde bei Slick-Knockout-Mäusen in der späten Phase des Capsaicin- und Formalin-Tests ein signifikant erhöhtes Leckverhalten verzeichnet. Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern somit Hinweise auf eine funktionelle Beteiligung von Slick bei der Detektion von Hitzeschmerzen und bei der TRPV1- und TRPA1-vermittelten Schmerzantwort. Zusammengefasst zeigen diese Daten, dass Slick vorrangig an der Verarbeitung thermischer und chemischer Noxen beteiligt ist und dabei eine antinozizeptive Funktion ausübt.
Das Zusammenspiel von experimentellen mit quantenchemischen Methoden ermoeglicht eine detaillierte Untersuchung der ablaufenden Mechanismen einer chemischen Reaktion auf molekularer Ebene. Insbesondere für quantenchemische Rechnungen zu molekularen Uebergangsmetall-Verbindungen haben sich die Methoden der Dichtefunktionaltheorie (DFT) als aeusserst leistungsfaehiges Forschungswerkzeug herausgestellt. Im Rahmen der DFT fehlt es allerdings prinzipiell an der Möglichkeit zur systematischen Verbesserung der erzielten Ergebnisse und DFT-Rechnungen zeigen eine hohe Abhängigkeit von der Natur der untersuchten molekularen Verbindungsklasse. Daher muss vor jeder mechanistischen Untersuchung ein jeweils optimaler DFT-Ansatz durch Vergleich mit hochgenauen Referenzrechnungen oder mit experimentellen Referenzdaten für relevante Vergleichssysteme identifiziert und gegebenenfalls kalibriert werden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit werden quantenchemische Rechnungen zur Reaktivität von Übergangsmetall-Verbindungen anhand von fünf Forschungsprojekten vorgestellt. Im ersten Kapitel werden die Ergebnisse für die Aktivierung kleiner Moleküle (Alkohole, Sauerstoff und Stickstoff) durch bifunktionelle Übergangsmetall-Pincer-Komplexe dargestellt. Das zweite Kapitel befasst sich mit der bioanorganischen Chemie von dinuklearen Kupfer-Sauerstoff-Komplexen. Die Auswahl einer geeigneten DFT-Methodik erfolgte in allen Fällen durch den Vergleich zu experimentellen Referenzdaten.
In Kooperation mit der Arbeitsgruppe Schneider wurden Eisen-Komplexe für die katalytische (De)hydrogenierung von Alkoholen entwickelt, eine wichtige Reaktion zur Funktionalisierung von Alkoholen zu Carbonylverbindungen. Durch DFT-Rechnungen konnte der ablaufende Katalysezyklus der (De)hydrogenierung des Modell-Substrats Methanol aufgeklärt und der geschwindigkeitsbestimmende Schritt identifiziert werden. Ebenfalls in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Schneider wurde die selektive Reduktion von Sauerstoff zu Wasser, vermittelt durch einen dihydridischen Iridium-Komplex, untersucht. Da durch die beiden Hydrid-Liganden insgesamt vier Elektronen für die Reduktion von Sauerstoff zu Wasser bereitgestellt werden, sollte prinzipiell ein monomolekularer Reaktionsverlauf möglich sein. Detaillierte DFT-Rechnungen in Kombination mit experimentellen Kinetikmessungen ergeben starke Hinweise auf einen derartigen Reaktionspfad mit geschwindigkeitsbestimmender Sauerstoff-Aktivierung. Zuletzt wird ein weiteres Kooperationsprojekt mit derselben Arbeitsgruppe vorgestellt. Die protoneninduzierte
übergangsmetallvermittelte Spaltung von Stickstoff in zwei Metall-Nitrid-Komplexe stellt ein neuartiges synthetisches Konzept dar. Durch die Protonierung eines dinuklearen Molybdän-Stickstoff-Komplexes erfolgt die Spaltung in die entsprechenden Mo-Nitrid-Komplexe. Der Grund für die ungewöhnliche Änderung der Spin-Multiplizität bei der Protonierung der Molybdän-Komplexe konnte durch detaillierte quantenchemische Analysen identifiziert werden.
Im zweiten Kapitel werden Untersuchungen zur bioanorganischen Chemie von dinuklearen Kupfer-Sauerstoff-Komplexen vorgestellt. In der Natur werden viele (bio)chemisch relevante Prozesse durch übergangsmetallhaltige Enzyme unter moderaten Reaktionsbedingungen vermittelt. Kupferhaltige Enzyme sind unter Anderem für die hochselektive Oxidation organischer Substrate zuständig. Der Ansatz der Bioanorganik befasst sich mit der Übertragung der enzymatischen Struktur und/oder Funktion auf synthetische Modell-Verbindungen. Da die akkurate Beschreibung der Energien von dinuklearen Kupfer-Sauerstoff-Komplexen höchste Anforderungen an die angewandten quantenchemischen Methoden stellt, wurde eine geeignete DFT-Methode in aufwändigen Voruntersuchungen durch den Vergleich mit experimentellen Ergebnissen identifiziert. Mit Hilfe des so kalibrierten BLYP-D3-Ansatzes wurde in Kooperation mit der Arbeitsgruppe Meyer ein neuartiges Konzept für die baseninduzierte Isomerisierung des reaktiven Kerns etabliert. In einer weiteren Arbeit wurde die regio- und stereoselektive Hydroxylierung von nicht-aktivierten aliphatischen C-H-Bindungen in Steroid-Substraten mit Hilfe von mechanistischen DFT-Rechnungen untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass die stereochemische Anordnung des Liganden um den reaktiven Kupfer-Sauerstoff-Kern die Selektivität der Hydroxylierung bestimmt.
Lange ging man davon aus, dass die Physiologie der Thyroidhormone weitestgehend erforscht ist und nahm an, dass sämtliche Thyroidhormon-Wirkungen auf einer Bildung von L-Thyroxin (T4) und einer anschließenden Deiodierung zu Triiodthyronin (T3) beruhen, welches an die nukleären Thyroidhormon Rezeptoren (THRs) bindet. Über die THRs werden genomische Signalwege vermittelt, die während der Wachstums- und Entwicklungsphase essentiell sind. Beim Erwachsenen werden zudem vorwiegend katabole Stoffwechsel-Prozesse induziert. Jedoch zeigte sich in den letzten 20 Jahren, dass die Signalwege der Thyroidhormone komplexer sind als bisher angenommen. Vor allem die Metabolite des in der Schilddrüse gebildeten T4s, zeigen ein breites Interaktions-Profil mit anderen molekularen Zielstrukturen. Thyronamine, die decarboxylierten Thyroidhormon-Metabolite, binden beispielsweise den G-Protein-gekoppelten Trace Amine Associated Receptor 1 (TAAR1). Wird dieser Rezeptor aktiviert, kommt es innerhalb kürzester Zeit zu einem rapiden Abfall der Köpertemperatur, sowie zu einer akuten Bradykardie. Die durch oxidative Deaminierung gebildeten Iodthyroacetate Tetraiodthyroacetat (TETRAC) und Triiodthyroacetat (TRIAC) sind Antagonisten des Membran-Rezeptors Integrin αVβ3 und besitzen antiproliferative und pro-apoptotische Eigenschaften.
In dieser Arbeit sollte die Hypothese untersucht werden, ob Thyroidhormone neben diesen neuen zumeist nicht-genomischen Signalwegen, auch THR-unabhängige genomische Wirkmechanismen besitzen.
Mit Hilfe eines Gal4-Luciferase-Reportergen-Assays wurde in einem Screening die Aktivität einiger Thyroidhormone und Thyroidhormon-Metabolite an elf THR-ähnlichen Rezeptoren und den drei Retinoid X Rezeptor (RXR)-Subtypen untersucht. Es konnte detektiert werden, dass Thyroidhormone, vor allem TETRAC, potente Peroxisom-Proliferator-aktivierter Rezeptor (PPAR)γ-Agonisten sind, die zum Teil zusätzlich dessen Heterodimer-Partner RXR aktivieren können. Diese PPARγ- und RXR-Aktivität wurde zunächst mit Hilfe eines Coaktivator-Rekrutierungs-Assays, einer Isothermen Titrationskalorimetrie (ITC) und einer Kristallstrukturanalyse genauer charakterisiert. Zum einen konnte nachgewiesen werden, dass sowohl PPARγ, als auch RXR in artifizielleren Testsystemen durch Thyroidhormone aktiviert werden. Zum anderen konnte die für permissive Heterodimere, wie das PPARγ/RXR-Heterodimer, typische additive Transaktivierungs-Effizienz nach Bindung beider Heterodimer-Partner bestätigt werden. Außerdem zeigte die Untersuchung der Kristallstruktur von TETRAC und PPARγ, dass Thyroidhormone einen abweichenden Bindungsmodus im Vergleich zu anderen PPARγ Agonisten, wie den Glitazonen und entsprechende Fettsäuren oder Fettsäuremimetika, besitzen.
Die Evaluation der biologischen Relevanz der PPARγ/RXR-Heterodimer-Aktivierung ergab zudem, dass TETRAC, als potentester PPARγ-Agonist, in der Lage ist die Differenzierung von Präadipocyten zu Adipocyten zu induzieren. Außerdem wurde die mRNA-Expression wichtiger PPARγ-regulierter Gene in Hepatozyten trotz knockdown beider THR-Isoformen signifikant durch Thyroidhormone induziert.
Für eine erste Abschätzung einer möglichen physiologischen Relevanz der PPARγ/RXR-Aktivierung durch Thyroidhormone, wurde die Bildung von TETRAC nach Inkubation von Hepatozyten mit T4 quantifiziert. Es konnte festgestellt werden, dass ausreichend TETRAC in den Hepatozyten gebildet werden kann, um PPARγ zu aktivieren. Auch in einem in vivo-Experiment, bei dem Mäusen ein mit Brom substituiertes T4-Analog (Br-T4) appliziert wurde, um Interferenzen mit der endogenen Thyroidhormon-Produktion zu verhindern, konnte gezeigt werden, dass die PPARγ-regulierte Genexpression in den Lebern der Tiere induziert wurde. Dies deutete auf eine physiologisch relevante Bildung von Br-TETRAC hin, da Br-TETRAC analog zu TETRAC eine hohe Bindungs-Aktivität an PPARγ besaß, während Br-T4 keine Aktivität an diesem Rezeptor aufwies.
Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass Thyroidhormone neben den THR-vermittelten Effekten auch andere genomische Wirkmechanismen besitzen, indem sie das PPARγ/RXR-Heterodimer aktivieren. Diese biologische Aktivität könnte sowohl eine physiologische als auch eine pharmakologische Relevanz besitzen. Die beiden T4-Metabolite T3 und TETRAC sind in der Lage komplementäre Signalwege zu induzieren. Wird T4 deiodiert kommt es zur Bildung von T3, welches den THR aktiviert. Durch oxidative Deaminierung des T4s bildet sich TETRAC, das wiederum PPARγ bindet und aktiviert. Durch die vermehrte Bildung von TETRAC und anschließende Aktivierung von PPARγ könnte die katabole Wirkung der THR-Signalwege abgeschwächt werden und so eine Art negative Rückkopplung gewährleistet werden. Die physiologische Bedeutung der Interaktion von Thyroidhormonen mit PPARγ/RXR muss jedoch noch genauer untersucht werden.
Aber auch pharmakologisch könnte die Iodthyroacetat-Aktivität an PPARγ eine Rolle spielen. TETRAC könnte durch seinen individuellen Bindungsmodus als Leitstruktur für neue PPARγ-Partialagonisten mit verbessertem Nebenwirkungs-Profil dienen. Außerdem wird das Thyroidhormon-Derivat TRIAC schon jetzt als Leitstruktur für die Entwicklung von Thyroidhormon-Analoga mit THRβ-Selektivität verwendet. Durch die zusätzliche PPARγ-Aktivität könnte zukünftig ein dualer THRβ/PPARγ-Agonist bei Erkrankungen, die mit einer Insulinresistenz einhergehen, Verwendung finden.
Zusammenfassend stellt die Entdeckung der Aktivität von Thyroidhormonen an PPARγ und RXR einen weiteren Baustein im komplexen System der Thyroidhormone dar.
Nukleinsäuren besitzen neben der Speicherung und Übertragung der genetischen Information weitere vielfältige Funktionen in einem komplexen und dynamischen Netzwerk von gleichzeitig ablaufenden Prozessen in der Zelle. Die gezielte Kontrolle bestimmter Nukleinsäuren kann helfen, die jeweiligen Prozesse zu studieren oder auch zu manipulieren. Photoaktive Verbindungen, wie photolabile Schutzgruppen oder Photoschalter, sind ideal dazu geeignet die Struktur und Funktion von Nukleinsäuren zu studieren. Photolabile Schutzgruppen werden dazu meistens auf die Nukleobase installiert und stören die Watson-Crick Basenpaarung. Dies verhindert die Ausbildung einer Sekundärstruktur oder die Möglichkeit einen stabilen Doppelstrang zu bilden. Licht ist ein nicht-invasives Trigger-signal und kann mit hoher Orts- und Zeitauflösung angewendet werden, um selektiv die temporär geschützten Nukleinsäuren in der Zelle zu aktivieren.
Das erste Projekt dieser Arbeit ist eine Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Erin Schuman (MPI für Hirnforschung) und beschäftigt sich mit der lichtgesteuerten Regulation der miR-181a Aktivität in hippocampalen Neuronen von Ratten. Die Langzeitpotenzierung (LTP) ist der primäre Mechanismus von synaptischer Plastizität und somit essentiell für Lernen und Gedächtnis. Die langfristige Aufrechterhaltung von LTP erfordert eine gesteigerte (lokale) Proteinbiosynthese, ein Prozess, der noch nicht vollständig aufgeklärt ist. Die miR-181a reguliert die Genexpression von zwei für synaptische Plastizität wichtigen Proteinen, GluA2 und CaMKIIα. Mit einem lichtaktivierbaren AntimiR sollte der Einfluss der miR-181a auf die lokale Proteinsynthese von CaMKIIα und GluA2 untersucht werden. Photolabile Schutzgruppen sollen eine ortsaufgelöste Aktivierung des AntimiRs in den Dendriten ermöglichen. Ein Tracking-Fluorophor sollte die Lokalisierung des AntimiRs und eine gezielte Lichtaktivierung ermöglichen. Die Bindung der miRNA sollte fluoreszent visualisiert werden können, um eine Korrelation zwischen der inhibierten Menge an miR-181a und den neu synthetisierten CaMKIIα-Molekülen zu untersuchen. In diesem Projekt wurden drei Konzepte zur Synthese von lichtregulierbaren AntimiR-Sonden verglichen: Das erste Konzept verwendete eine Thiazolorange-basierte Hybridisierungssonde nach Seitz et al. Allerdings war mit diesem Konzept der Fluoreszenzanstieg zur Visualisierung der Hybridisierung zu gering. Im zweiten Konzept wurde ein dual-Fluorophor markierter Molecular Beacon entwickelt, bei dem die photolabilen Schutzgruppen in der Schleifen-Region die Hybridisierung der miR-181a vor Belichtung verhinderten. Nach Optimierung der Stammlänge, Anzahl und Position der photolabilen Schutzgruppen, sowie Auswahl des idealen Fluorophor-Quencher Paars, konnte nach UV-Bestrahlung in Anwesenheit der miR-181a ein signifikanter Anstieg des Hybridisierungsreporter-Fluorophors gemessen werden. Das dritte Konzept untersuchte lichtaktivierbare Hairpin-Sonden, bei denen ein Gegenstrang (Blockierstrang) über einen photospaltbaren Linker mit dem AntimiR verknüpft wurde. Dabei musste die optimale Länge des Blockierstrangs und die Anzahl der photo-spaltbaren Linker im Blockierstrang ermittelt werden, sodass die miR-181a erst nach Photoaktivierung das AntimiR binden und den Quencher-markierten Strang verdrängen konnte. Die in vitro Experimente vom Arbeitskreis Schuman waren zu dem Zeitpunkt des Einreichens dieser Arbeit noch nicht abgeschlossen. Erste Ergebnisse zeigten, dass der mRNA und Protein-Level von CaMKIIα eines gesamten hippocampalen Neurons durch ein nicht-lichtaktivierbare AntimiR um den Faktor ~1,5 gesteigert werden konnte. Zudem konnte durch die lokale Bestrahlung einer lichtaktivierbaren Hairpin-Sonde die lokale Gen-expression von CaMKIIα in einem Dendriten deutlich gesteigert werden.
Das zweite Projekt dieser Arbeit beschäftigte sich mit der reversiblen Lichtregulation von DNA und RNA durch Azobenzol Photoschalter. Azobenzole eignen sich ideal für die Regulation der Duplexstabilität, denn das planare trans-Azobenzol kann zwischen die Basen interkalieren und somit einen Doppelstrang stabilisieren. UV-Licht überführt das trans-Isomer in das cis-Isomer. Dies ist gewinkelt, benötigt mehr Platz und stört dadurch die Stabilität eines Nukleinsäuredoppelstrangs. Entscheidend für die Effizienz der Regulation der Duplexstabilität ist der Linker, der das Azobenzol mit der Nukleinsäure verknüpft. Während vorangegange Studien von Asanuma et al. unnatürliche Linker (D-Threoninol, tAzo) verwendeten, wurde in dieser Studie das Azobenzol mit der C1‘-Position von (Desoxy-)Ribose C-Nukleoside verknüpft, um Azobenzol (pAzo und mAzo) zu erhalten. Der Riboselinker sollte die helikale Natur der Nukleinsäure optimal nachahmen und möglichst wenig Störung des Ribose-Phosphat-Rückgrats bewirken. Thermische Stabilitätsstudien zeigten, dass UV-Licht induzierte trans-zu-cis Isomerisierung den Schmelzpunkt eines RNA- und DNA-Duplexes um 5,9 und 4,6 °C erniedrigte. Dabei führte der Austausch eines Nukleotids gegen pAzo oder mAzo zu einer effektiveren Regulation der Duplexstabilität als der zusätzliche Einbau eines Azobenzol C-Nukleosids in die Sequenz. Ein Vergleich mit dem in der Literatur etablierten System, tAzo, zeigte, dass pAzo und mAzo teilweise einen stärkeren Duplexdestabilisierungseffekt nach UV-Bestrahlung bewirkten.
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Ein wichtiges Teilgebiet der Organokatalyse stellt die Wasserstoffbrücken-vermittelte Katalyse dar. Als erfolgreiche katalytische Einheiten haben sich dabei diejenigen Systeme ausgezeichnet, die in der Lage sind mindestens zwei Wasserstoffbrücken zeitgleich auszubilden. Zu den bekanntesten Vertretern zählen hierbei sicher (Thio-) Harnstoffe sowie Guanidinium- und Amidinium-Ionen.
Im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit wurden drei Katalysatortypen mit Amidin- und Guanidingrundgerüst synthetisiert. Zum Einen wurde ein neues axial-chirale Amidin mit zusätzlicher Thioharnstoff-Funktion synthetisiert. Hierfür wurden drei aromatische Fragmente mittels zweier Suzuki-Kupplungen verknüpft und im Nachhinein mit einem chiralen Aminoalkohol über eine Williamson-Ethersynthese kondensiert. Die basenvermittelte, diastereoselektive Makrocyclisierung lieferte das axial chirale Amidin und stellte den Schlüsselschritt der Synthese dar. Schließich konnte durch Addition des erhaltenen Anilin-Derivats an ein Aryl-Isothiocyanat die Thioharnstoff-Funktionalität eingeführt werden.
Zum Anderen wurde eine Reihe an C2-symmetrischer Bisamidine hergestellt. Sie wurden in einer N-Acetylcystein-katalysierten Reaktion zwischen Phthalonitril und den entsprechenden chiralen, vicinalen Diaminen hergestellt. Die erhaltenen Ausbeuten der Bisamidine wurden unmittelbar durch den sterischen Anspruch der Substituenten des jeweils eingesetzten Diamins bestimmt. Auf der einen Seite konnten bei Verwendung 1- und 2-Naphthyl-substituierter Diamine nur mäßige Ausbeuten erzielt werden. Auf der anderen Seite konnte man durch den Einsatz kleinerer Reste wie Phenyl nahezu quantitative Ausbeuten erzielen. Die Herstellung chiraler, vicinaler Diamine wurde über eine Diaza-Cope-Umlagerung realisiert.
Schließlich wurde ein C2-symmetrisches bicyclisches Guanidin hergestellt. Die Synthese begann mit einer Knoevenagel-artigen Kondensationsreaktion und anschließender Veresterung der erhaltenen Carbonsäure. Kinetische Racematspaltung des racemischen Esters unter Verwendung einer Lipase lieferte enantiomerenreines (S)-β-Phenylalanin, welches als Ausgangverbindung der überwiegend linearen Synthese diente. Das im Zuge der Synthese hergestellte chirale Triamin wurde schließlich mithilfe von Dimethyltrithiocarbonat zum Guanidin cyclisiert.
Alle drei Katalysatortypen wurden für die enantioselektive Steuerung diverser Reaktionen eingesetzt, u. A. der Diels-Alder-, Morita-Baylis-Hillman-, Friedel-Crafts-Reaktion und dem Schlüsselschritt der Quinkert-Dane-Estron-Synthese. Bei Letzterem handelt es sich um eine Diels-Alder-Reaktion, um den C-Ring eines Steroidgerüsts aufzubauen, welches durch wenige chemische Transformationen in das bedeutende weibliche Sexualhormon Estron überführt werden kann.