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"Stellen Sie sich vor, wir könnten einzelne Zellen mit einer Art Fernbedienung von außen steuern", träumt Ralph Wieneke, Juniorgruppenleiter in der Zellulären Biochemie. Licht als Steuerungsquelle habe entscheidende Vorteile, schildert Institutsleiter Robert Tampé: "Es schadet Zellen nicht und kann schnell und sehr genau reguliert werden." Von ihrem Ziel ist die Arbeitsgruppe gar nicht so weit entfernt.
Um das komplizierte Geschehen in der Zelle entschlüsseln zu können, blockieren Forscher oft bestimmte Proteine oder Gene. Eine moderne und elegante Methode besteht darin, Lichtaktivierbare Moleküle als "Schalter" zu verwenden. Die Gruppe von Alexander Heckel entwickelt maßgeschneiderte Moleküle für Biologen, Biochemiker oder Mediziner.
"Mehr Licht!" – so lauteten, glaubt man seinem Arzt Carl Vogel, die letzten Worte des größten deutschen Dichters und Denkers Johann Wolfgang Goethe. Aus der Sicht der Fluoreszenzmikroskopie ist das kein guter Grundsatz. Die Kernidee der Lichtscheiben-Fluoreszenzmikroskopie (LSFM) liegt in der Macht der dunklen Seite. Anders gesagt: Sie folgt dem Prinzip, dass weniger manchmal viel mehr sein kann. Die schonende Beleuchtung empfindlicher Proben bei der LSFM birgt großes Potenzial für die moderne Zell- und Entwicklungsbiologie.
Die Endometriose ist eine gynäkologische Erkrankung, bei der epitheliale und stromale Zellen des Endometriums Läsionen außerhalb des Uterus bilden, die in ihrem Aufbau dem Endometrium gleichen. Diese Läsionen, sowie deren zyklische Proliferation, führen zu Schmerzen bei betroffenen Frauen. In isolierten, invasiven Epithelzellen (EEC145T) einer Endometriose-Läsion konnte die Expression von Shrew-1 gezeigt werden. Auch in anderen zellulären Zusammenhängen fördert die Expression von Shrew-1 den invasiven Phänotyp. Shrew-1 ist ein Transmembranprotein, das in Epithelzellen mit den Adhärenzverbindungen assoziiert ist und Interaktionen mit β-Catenin und E-Cadherin eingeht. In MCF7-Zellen fördert die Expression von Shrew-1 die EGF-induzierte Internalisierung von E-Cadherin, welche zur Verminderung der Zell-Zell-Adhäsion führt. In 12Z- und HT1080-Zellen konnte eine Interaktion mit CD147 gezeigt werden. CD147 fördert die Aktivität von MMPs und in Shrew-1-überexprimierenden HT1080-Zellen konnte eine erhöhte Aktivität der MMP9 gezeigt werden. Shrew-1 wirkt somit auf die Invasivität von Zellen und ist gleichzeitig Teil der Adhärenzverbindung. Aus diesem Grund wird Shrew-1 eine modulatorische Rolle in diesem Kontext zugeschrieben.
In immunhistologischen Färbungen von Shrew-1 und E-Cadherin konnte in Adenomyose-Läsionen eine inverse Expression der beiden Proteine in einigen epithelialen Zellen gezeigt werden, die im Endometrium nicht detektiert werden konnten. In den epithelialen Endometriose-Zelllinien 12Z und 49Z, die kein E-Cadherin exprimieren und äquivalent zu der Zelllinie EEC145T sind, führte die Herunterregulation von Shrew-1 (Shrew-1 KD) zur Reexpression von E-Cadherin. E-Cadherin ist in den 12Z Shrew-1 KD-Zellen an der Plasmamembran lokalisiert und interagiert mit β-Catenin, wodurch seine Assoziation mit den Adhärenzverbindungen wahrscheinlich ist. Die Herunterregulation von Shrew-1 führt zu einer verminderten Motilität und Invasivität der 12Z-Zellen, wobei die reduzierte Invasivität nicht alleine auf die Reexpression von E-Cadherin zurückgeführt werden kann. Es ist zu vermuten, dass das verminderte invasive Verhalten mit der ausbleibenden Interaktion von Shrew-1 mit CD147 zusammenhängt, welches die Aktivität von MMPs fördert.
Da Shrew-1 eine direkte Interaktion mit β-Catenin eingehen kann, ist es möglich, dass die Herunterregulation von Shrew-1 zu Veränderungen in der Lokalisation von β-Catenin und weiteren Proteinen, die mit den Adhärenzverbindungen assoziiert sind (p120 Catenin und Aktin), führen. Dies konnte jedoch nicht beobachtet werden. Eine verstärkte Lokalisation von Vinculin an den Enden von Aktin-Stressfasern sowohl in Zellausstülpungen als auch an Zell-Zell-Kontakten konnte in 12Z-Zellen nach der Herunterregulation von Shrew-1 beobachtet werden. Dies könnte eine Folge der E-Cadherin-Reexpression oder entscheidend für die Lokalisation von E-Cadherin an der Membran sein.
Die Reexpression von E-Cadherin, die in den 12Z Shrew-1 KD-Zellen auf mRNA- und Protein-Ebene nachgewiesen werden kann, erfolgt in den 12Z-Zellen vermutlich hauptsächlich über Veränderungen von Histon-Acetylierungen, da die Behandlung mit dem HDAC-Inhibitor TSA die Expression von E-Cadherin in den 12Z-Zellen induziert. Eine verstärkte H3K9-Acetylierung am CDH1-Promotor konnte in ChIP-Analysen in den 12Z Shrew-1 KD-Zellen gezeigt werden. Die gesteigerte Acetylierung resultiert vermutlich aus der verminderten Assoziation von HDAC1 und HDAC2 mit dem CDH1-Promotor in diesen Zellen. Eine Beteiligung der Repressoren Snail, Slug, Twist und ZEB1 an der Reexpression von E-Cadherin in den 12Z Shrew-1 KD-Zellen konnte nicht gezeigt werden. Ebenso scheinen Veränderungen am Methylierungsstatus des CDH1-Promotors nach der Herunterregulation von Shrew-1 nicht zu erfolgen.
TSA induziert auch in weiteren epithelialen Endometriose-Zelllinien (10Z und 49Z) die Expression von E-Cadherin. In stromalen Zellen führt hingegen weder TSA noch die Herunterregulation von Shrew-1 zur Expression von E-Cadherin (17B, 18B und 22B). Dies weist darauf hin, dass die Herunterregulation von Shrew-1 über die Veränderungen von Histon-Acetylierungen wirkt und dass dieser Mechanismus in epithelialen Endometriose-Zellen entscheidend ist. In den stromalen Zellen muss die Expression von E-Cadherin über einen anderen und/oder weitere Mechanismen blockiert sein.
Auch der Wnt-Signalweg scheint an der Reexpression von E-Cadherin in 12Z-Zellen beteiligt zu sein. Die Inhibierung der GSK3β (LiCl und SB216763) führt zur Expression von geringen Mengen an E-Cadherin. In 12Z Shrew-1 KD-Zellen führt die Stabilisierung von Axin (XAV939) zur verminderten Expression von E-Cadherin. Dies lässt darauf schließen, dass Shrew-1 auch einen Einfluss auf den Wnt-Signalweg hat, was vor allem durch dessen Interaktion mit β-Catenin wahrscheinlich ist.
Terrestrische Säugetiere werden von unterschiedlichen Parasiten als Wirte genutzt. Dabei kann ihre Parasitenfauna je nach Art, Lebensweise, Verbreitung, Gesundheitszustand und Reproduktionsstatus des Wirts abweichen. Ein weiterer bestimmender Faktor, ist der Einfluss des Menschen in Form von Regulierungsmaßnahmen und Schaffung urbaner Lebensräume. Domestizierte Haustiere bzw. Nutztiere weisen daher in der Regel andere Parasiten auf als ihre wildlebenden Artgenossen. Gleichzeitig können sich sowohl Wildtiere als auch domestizierte Tiere und Menschen gegenseitig Parasitenarten teilen und wechselseitig aufeinander übertragen. Daraus resultierende Krankheiten werden als Zoonosen bezeichnet.
Insbesondere Fledermäuse (Unterordnung Microchiroptera) zeigen weltweit eine enorme Parasitendiversität, die noch weitgehend unerforscht ist. Ebenfalls Forschungsbedarf besteht für die Sandfloh-Gattung Tunga in Süd- und Mittelamerika in Hinblick auf ihr Wirtsspektrum, welches auch Menschen einschließt. Die Art Tunga penetrans und zahlreiche weitere Parasitenarten, parasitieren gleichzeitig auch bei Hunden. Daher stellen diese Wirte eine direkte Gesundheitsgefahr für Menschen in ihrer unmittelbaren Umgebung dar.
Die vorliegende Dissertation ist in kumulativer Form zusammengefasst und beinhaltet drei Einzelpublikationen sowie einen Reviewartikel.
Ziel war es, die Parasitendiversität von Hunden aus urbanen tropischen Gebieten und die Parasitendiversität des Großen Ameisenbären (Myrmecophaga tridactyla) mit Hilfe morphologischer und molekularbiologischer Methoden zu analysieren. Die jeweiligen Parasitenfaunen wurden in Hinblick auf die soziale bzw. solitäre Lebensweise der beiden Wirtsarten verglichen und ihr zoonotisches Potenzial bewertet.
Ein weiteres Ziel war die Zusammenfassung der Ektoparasitennachweise süd- und mittelamerikanischer Microchiroptera und für die europäischen Arten der Fledermaus-Gattung Myotis (hier Endo- und Ektoparasiten) auf Basis der verfügbaren Literatur. Des Weiteren sollten eigene Parasitennachweise aus Bolivien bzw. Deutschland erfolgen. Für die Nachweise aus Deutschland wurden M. myotis untersucht, deren Artzugehörigkeit vorher bestimmt wurde. Zusätzlich wurden diese Individuen auf humanpathogene Lyssaviren untersucht.
Die Nachweise erfolgten über molekularbiologische und morphologische Methoden.
Bei Untersuchungen HBV-positiver Zellen konnte zunächst, anders als für HCV, eine deutlich gesteigerte Menge an TIP47 im Western Blot nachgewiesen werden. Da außerdem auch die zellulären mRNA-Spiegel von TIP47 erhöht waren, wurde in Promotorstudien der genaue Regulationsmechanismus untersucht. Für HBV sind zwei wichtige Faktoren bekannt, welche diverse zelluläre Signalkaskaden, wie z. B. die c-Raf/MAP-Kinase-Kaskade, modulieren, die PreS2-Aktivatordomäne des LHBsAg und das HBx-Protein [360]. Diese regulieren via c-Raf die Expression der unterschiedlichsten Gene. Nach eingehenden Analysen lässt sich dazu auch TIP47 zählen, dessen Expression durch HBx und LHBs gesteigert werden kann. Außerdem konnte in CLSM-Analysen eine partielle Colokalisation von LHBs und TIP47 beobachtet werden. Durch Modulation der TIP47-Expression in HBV-positiven Zellen konnte anschließend die Relevanz für die Virus-Sekretion untersucht werden. Durch gezielten knockdown von TIP47 durch spezifische siRNAs wurde die Freisetzung von viralen Partikeln gestört, wohingegen die Menge an freigesetzten subviralen Partikeln erhöht war. Die Überexpression von TIP47 hingegen konnte die Virus-Sekretion steigern, während das Niveau der subviralen Partikel nahezu gleich blieb. Des Weiteren konnte auch für HBV die Rab9-Bindung an TIP47 als essentielle Funktion Charakterisiert werden, da eine Inhibition dieser Interaktion eine Hemmung der Sekretion viraler Partikel zur Folge hatte. Auch hier konnte kein Einfluss auf die subviralen Partikel beobachtet werden. In Studien wurde a-Taxilin als neuer Bindungspartner von Proteinen der Syntaxin-Familie entdeckt. Es spielt daher eine wichtige Rolle im intrazellulären Vesikeltransport. Vor allem die Interaktion mit Syntaxin-4 ist gut untersucht [132]. Es wird vermutet, dass a-Taxilin durch die Bindung an freies Syntaxin-4 die v-SNARE-Bildung verhindert und so einen inhibitorischen Effekt auf den vesikulären Transport ausübt. Des Weiteren konnten Untersuchungen beim Hepatitis-B-Virus demonstrieren, dass die Expression von a-Taxilin durch die Virus-Replikation drastisch erhöht ist und die Sekretion der subviralen Partikel, welche mittels Vesikeln aus der Zelle transportiert werden, negativ beeinflusst. Andererseits interagiert a-Taxilin mit dem großen viralen Oberflächenprotein LHBs und dient so als Adapter zwischen LHBs und tsg101 beim ESCRT-vermittelten Export des Virus via MVBs - einem Zusammenschluss aus vielen späten Endosomen [126].Anders als für HBV, welches aktiv die Menge an intrazellulärem a-Taxilin erhöht, konnte in früheren RNA-Expressionsexperimenten mit transgenen Mäusen, welche Leberspezifisch das regulatorische HCV-Protein NS5A produzieren, eine deutlich verminderte Expression von a-Taxilin beobachtet werden [140]. Durch Analysen von Leberzelllysaten im Western Blot konnte dieser Effekt auch auf Proteinebene bestätigt werden. Dieanschließende Analyse HCV-replizierender Zellen in vitro ergab ebenfalls eine verminderte a-Taxilin-Expression und in der Folge eine reduzierte Proteinmenge. Weiterhin konnte diese Arbeit klären, dass HCV via NS5A den a-Taxilin-Promotor negativ beeinflusst und dafür den bereits für NS5A beschriebenen Mechanismus der c-Raf-Modulation nutzt [234]. Darüber hinaus wird a-Taxilin durch HCV destabilisiert, da in HCV-replizierenden Zellen die Proteinhalbwertszeit von a-Taxilin in etwa halbiert war. Der genaue Mechanismus hierfür muss jedoch noch genauer untersucht werden. Es kann aber aufgrund von anderen aktuellen Studien davon ausgegangen werden, dass a-Taxilin höchstwahrscheinlich durch HCV-Strukturproteine abgefangen wird, welche nicht am Aufbau neuer Virionen beteiligt sind. Diese werden dann, zusammen mit dem gebundenen a-Taxilin, im autophagosomalen Kompartiment recycelt. Gestützt wird diese Hypothese durch die Beobachtungen in CLSM-Analysen, dass die HCV- Strukturproteine E1, E2 und Core partiell mit a-Taxilin colokalisieren und auch durch Co-Immunpräzipitationen sowie yeast-2-hybrid-Analysen eine direkte Interaktion nachgewiesen werden konnte. Dabei konnten vor allem für das Core-Protein zwei unterschiedliche Fraktionen nachgewiesen werden, von denen nur die zytoplasmatisch lokalisierte Fraktion mit a-Taxilin colokalisierte, nicht aber mit dem an den lipid droplets gebundenen Core. Neben der Untersuchung der funktionellen Zusammenhänge wurde außerdem die Relevanz von a-Taxilin für den HCV-Lebenszyklus charakterisiert. Dabei wurde die Expression von a-Taxilin moduliert und der Einfluss auf die Freisetzung infektiöser HCV-Partikel untersucht. Durch die Überexpression von a-Taxilin konnte die Sekretion von Virionen verhindert werden, wohingegen die weitere Reduktion der a-Taxilin-Menge mittels spezifischer siRNA zu einer verstärkten Virus-Freisetzung führte. In einem parallel durchgeführten Projekt konnten durch die Modulation von Syntaxin-4 genau gegenteilige Beobachtungen gemacht werden. Demnach verstärkte eine Überexpression von Syntaxin-4 die HCV-Sekretion, während der knockdown zur Inhibition des Prozesses führte. Abschließend lässt sich festhalten, dass im Rahmen dieser Arbeit zwei zelluläre Proteine in Bezug auf die Morphogenese und Sekretion von HBV und HCV näher Charakterisiert wurden, denen zuvor für das jeweils andere Virus eine entscheidende Rolle im viralen Lebenszyklus zugeordnet werden konnte. TIP47 wurde somit als positiver Regulator für die HBV-Sekretion identifiziert, auch wenn die genaue funktionelle Relevanz bzw. der Funktionsmechanismus bisher noch nicht eindeutig geklärt werden konnte. So liegt jedoch der Schluss nahe, dass es nur die Freisetzung der viralen Partikel via MVBs beeinflusst und nicht an der Sekretion der subviralen Partikel beteiligt ist. Für HCV konnte mit a-Taxilin erstmals ein viraler Restriktionsfaktor beschrieben werden, da es entscheidend die Sekretion infektiöser Viruspartikel verhindert. Im Gegenzug hat HCV, durch die Deregulation des Promotors und durch das Abfangen von a-Taxilin, Mechanismen entwickelt, welche diesem restriktiven Effekt entgegen wirken.
Die Substitution von klassischen, mit der Nahrungsmittelproduktion in Konkurrenz stehenden, Substraten wie Glukose durch alternative Kohlenstoffquellen in der Biotechnologie ist sowohl aus ethischer, als auch aus ökonomischer Sicht erstrebenswert. Diese Arbeit beschreibt die Synthese von Bulkchemikalien in Form zweier Dicarboxylsäuren und einer Feinchemikalie in Form eines Sesquiterpens aus dem alternativen Substrat Methanol mit Hilfe genetisch veränderter Stämme des methylotrophen α-Proteobakteriums Methylobacterium extorquens.
Mesacon- und (2S)-Methylsuccinsäure sind Dicarboxylsäurederivate der CoA-Ester Mesaconyl- und (2S)-Methylsuccinyl-CoA, die als Intermediate im Ethylmalonyl-CoA- Weg (EMCP) vorkommen. M. extorquens nutzt den EMCP für die Regeneration von Glyoxylat, das für das Wachstum auf C1-Substraten wie Methanol obligatorisch ist. In dieser Arbeit konnte erstmals Mesacon- und (2S)-Methylsuccinsäure de novo durch die Expression einer für die Vorstufen Mesaconyl- und (2S)-Methylsuccinyl-CoA aktiven Thioesterase produziert werden. Ein kobaltlimitiertes Wachstum von M. extorquens führte aufgrund mangelnder Cofaktorversorgung zweier Vitamin-B12-abhäniger Mutasen im EMCP zu einer Akkumulation der beiden CoA-Ester-Vorstufen, womit eine Produktion von 0.65 g/l Mesacon- und (2S)-Methylsuccinsäure erreicht wurde. Weitergehende Untersuchungen belegten außerdem einen positiven Effekt eines ausgeschalteten PHB-Zyklusses auf die Produktion der beiden EMCP- Dicarboxylsäurederivate.
Diese Arbeit beinhaltet zusätzlich grundlagenwissenschaftliche Untersuchungen zur Substitution der EMCP-katalysierten Glyoxylatregeneration durch einen heterologen Glyoxylatzyklus in EMCP-negativen M. extorquens-Stämmen. Dabei konnte erstmals ein methanolverwertendes, methylotrophes Bakterium identifiziert werden, das einen Serin-Zyklus in Kombination mit dem Glyoxylat-Zyklus zur Kohlenstoffassimilation verwendet, ohne dabei zusätzliche Stoffwechselwege zur CO2-Fixierung wie den EMCP, RuMP oder CBB-Zyklus zu verwenden.
Die Präsenz einer nativen C30-Carotinoidbiosynthese, ausgehend von der Vorstufe Farnesylpyrophosphat (FPP), empfiehlt M. extorquens als Produktionsorganismus für (Sesqui-)Terpene. In dieser Arbeit wurde mit Hilfe einer induzierbar gesteuerten Expression einer Terpensynthase in Form einer α-Humulen-Synthase, einer FPP-Synthase und eines prokaryontischen Mevalonatweges, erstmals die de novo Synthese eines Terpens aus Methanol am Beispiel des α-Humulens etabliert. Durch optimierte Expressionen der Terpensynthase, FPPS und einzelner MVA-Gene mit Hilfe angepasster Translationsinitiationsraten der jeweiligen ribosomalen Bindestellen und der Verwendung eines in der nativen Carotinoidbiosynthese inhibierten M. extorquens-Stammes wurden finale Produkttiter von bis zu 1.65 g/l α-Humulen in Fed-Batch-Fermentationen erreicht.
Diese kumulative Dissertation beinhaltet außerdem einen Reviewartikel, in dem der verwendete Mikroorganismus M. extorquens in mikrobiologischer, genetischer, biochemischer und auch biotechnologischer Hinsicht ausführlich beschrieben wird. Zudem gibt ein Buchkapitel eine Übersicht über die Verwendung von Methanol in der Biotechnologie.
In der vorliegenden Doktorarbeit zur Untersuchung der Rolle der Superoxid-Dismutasen in P. anserina lieferten die durchgeführten Analysen folgende Ergebnisse:
1)Sowohl in P. anserina als auch in S. cerevisiae wurde eine gemeinsame Regulation von SODs nachgewiesen: Stämme, die die mitochondriale MnSod (PaSod3 bzw. ScSod2) überexprimieren zeigen eine erhöhte Cu/ZnSOD-Aktivität (PaSOD1 bzw. ScSOD1).
2)Es konnte keine SOD-Aktivität für die putativen SODs Pa_1_10620, Pa_1_10630 und Pa_1_6300 detektiert werden. Für Pa_1_10620, dessen Überexpression unter Standardbedingungen zu einer Lebensverlängerung führt, wird eine Funktion als mitochondriales ribosomales Protein angenommen.
3)Der ∆PaSod3-Stamm weist keinen Unterschied im Phänotyp, der Wuchsrate und der Lebensspanne unter Standardbedingungen zum Wildtyp auf. Paraquat-Stress führt allerdings zu einer Kurzlebigkeit des ∆PaSod3-Stammes, wohingegen diese Mutante eine höhere Resistenz gegenüber Wasserstoffperoxid aufweist als der Wildtyp.
4)Transkriptomanalysen des Wildtyps und der ∆PaSod3-Mutante lassen vermuten, dass eine Hochregulation von Detoxifizierungs- und Energie-abhängigen Prozessen die durch den Verlust der mitochondrialen PaSOD3 vermuteten negativen Auswirkungen kompensieren.
5)PaSod3_OEx-Stämme weisen unter Standardbedingungen aufgrund der erhöhten intrazellulären Wasserstoffperoxid-Menge, bedingt durch die vermehrte Umsetzung von Superoxid, diverse negative Auswirkungen auf: Eine reduzierte Wuchsrate, verkürzte Lebensspanne, geringere Fertilität, stärkere Pigmentierung, vermehrt fragmentierte Mitochondrien, mehr unprozessierte mitochondriale Proteine und weniger Komplex IV der Atmungskette als der Wildtyp. Zusätzlich wird vermehrt über die alternative Oxidase geatmet, um die ROS-Generierung zu reduzieren.
6)Oxidativer Stress in Form von Paraquat führt in PaSod3_OEx-Stämmen zu einer weiteren Verkürzung der medianen Lebensspanne, während die maximale Lebensspanne von PaSod3_OEx3-Stämmen im Vergleich zum Wildtyp sogar verlängert ist. Wasserstoff-peroxid resultiert in stark verringerten medianen und maximalen Lebensspannen beider PaSod3-überexprimierenden Stämme.
7)Die Anzucht auf Medium mit zusätzlichem Mangan (80 µM MnSO4) kann die beobachteten Defekte der PaSod3_OEx-Stämme fast vollständig auf Wildtyp-Niveau revertieren: Die Wuchsrate, die Lebensspanne, der Phänotyp, die Mitochondrien-morphologie, die Prozessierung mitochondrialer Proteine und die Atmung entsprechen dem Wildtyp. Lediglich die Fertilität erreicht nicht das Wildtyp-Niveau. Diese positiven Effekte von Mangan werden erzielt, da die erhöhte Wasserstoffperoxid-Menge in PaSod3_OEx-Stämmen entsprechend ihrer Entstehung detoxifiziert wird, denn Mangan führt zu einer gesteigerten Transkription bzw. Aktivität von Katalasen und Peroxidasen sowie zu einer erhöhten Peroxiredoxin-Menge.
8)Die Anzucht des Wildtyps unter Wasserstoffperoxid-Stress resultiert in einer Lebens-spannenverkürzung. Diese kann durch Supplementation mit Mangan revertiert werden. Unter diesen Bedingungen weisen u. a. Peroxidasen eine erhöhte Aktivität auf.
Insgesamt ließen die gewonnenen Daten den Schluss zu, dass das Genom von P. anserina für drei aktive SODs kodiert. Ein Verlust der einzigen mitochondrial lokalisierten SOD kann durch die Induktion von Energie-abhängigen Prozessen sowie von Detoxifizierungsprozessen kompensiert werden. Ferner weisen die durchgeführten Studien darauf hin, dass PaSod3_OEx-Stämme als Modell für erhöhte intrazelluläre Wasserstoffperoxid-Mengen in P. anserina verwendet werden können. Darüber hinaus wurde ein Zusammenhang zwischen Mangan und dem Detoxifizierungs-netzwerk in P. anserina nachgewiesen. Dabei können zwei Mechanismen zur Reduktion der Wasserstoffperoxid-Mengen unterschieden werden: Bei Vorhandensein ausreichender Mengen Mangan kommt es zu einer stärkeren Detoxifizierung von Wasserstoffperoxid. Ist Mangan allerdings limitiert und die Detoxifizierung kann nicht gesteigert werden, wird eine Umstellung der Atmung eingeleitet, um die neu entstehende ROS-Menge zu minimieren.
Stechmücken (Dipteren: Culicidae) sind weltweit mit über 3500 Arten und mit Ausnahme der arktischen Regionen ubiquitär vertreten. Die medizinische Relevanz dieser Tiergruppe, begründet durch die hämatophage Lebensweise der Weibchen, erschloss sich bereits Ende des 19. Jh. und hat bis heute Bestand. Jedes Jahr sterben rund 600.000 Menschen an den Folgen der Malaria und fast 100 Mio. Menschen infizieren sich mit dem Denguefieber. Zwar beziehen sich diese Zahlen fast ausschließlich auf die Entwicklungsländer, aber im Zuge des Klimawandels und des immer stärkeren Welthandels kommt es auch in Europa und den USA immer wieder zu Ausbrüchen vorher nicht relevanter Krankheiten. So hat sich das West-Nil- Virus seit 1999 in Nordamerika rasant verbreitet. Im Jahr 2013 gab es dort rund 2500 Fälle, von denen 119 zum Tod führten. In Europa traten hingegen Krankheiten wie das Chikungunyafieber (Italien 2007) oder das Denguefieber (Frankreich 2010/2013) auf. Die Gründe für diese Ausbrüche sind vor allem in der Einschleppung neuer Vektorspezies und Krankheitserreger sowie in den veränderten Wirtspräferenzen einheimischer Stechmückenarten zu suchen. Das Wissen um das Vektorpotential der in Deutschland heimischen Stechmücken konnte vor allem durch die seit 2009 initiierten Monitoring-Programme stetig erweitert werden. Auch die Veränderung der heimischen Fauna durch invasive Arten wie Ochlerotatus japonicus japonicus oder Aedes albopictus wird intensiv erforscht. Dennoch ist hinsichtlich der Biologie, Ökologie sowie Genetik vieler Arten noch immer wenig bekannt.
Die vorliegende Dissertation, welche auf Basis von vier (ISI-) Einzelpublikationen kumulativ angefertigt wurde, beschäftigte sich mit der Analyse der genetischen Variabilität sowie der Zoogeographie der untersuchten Arten und der Etablierung einer schnellen und kostengünstigen Methode zur Artdiagnostik. Besonderes Augenmerk wurde bei den Analysen auf die beiden heimischen Arten Culex pipiens und Culex torrentium sowie die invasive Art Ochlerotatus japonicus japonicus gelegt. Ziel war es, die noch bestehenden Wissenslücken zu füllen, um zukünftige Monitoring-Programme besser koordinieren sowie Analysen zur Vektorkompetenz und Genetik dieser Arten gezielter durchführen zu können.
Es konnte gezeigt werden, dass Cx. pipiens und Cx. torrentium deutliche Unterschiede in ihren Populationsstrukturen aufwiesen welche auf verschiedene evolutive Prozesse hindeuten. Die geringere genetische Variabilität in Cx. pipiens lässt auf positive Selektion durch z.B. Insektizidresistenz im Zuge durchgeführter Bekämpfungsmaßnahmen oder die Infektion mit Wolbachien schließen. Die analysierte Populationsstruktur von Cx. torrentium spricht hingegen für eine geringe Ausbreitung, wodurch der genetische Austausch reduziert wurde und so die untersuchten Populationen genetisch stärker voneinander abwichen. Des Weiteren ließen die Analysen des Cytochrom c Oxidase Untereinheit 1-Fragmentes (cox1) Rückschlüsse auf die Zoogeographie dieser Arten in Deutschland zu - wobei beide Arten über das Untersuchungsgebiet verteilt waren, Cx. torrentium jedoch in den neuen Bundesländern weniger häufig nachgewiesen wurde als in den alten und eine geringere gefangene Individuenzahl aufwies. Basierend auf der ökologischen Nischenmodellierung konnten potentiell neue Verbreitungsgebiete für die Art Ochlerotatus japonicus japonicus identifiziert werden. Als klimatisch besonders günstig zeigten sich dabei Südhessen, das Saarland sowie nördliche Teile Nordrhein-Westfalens. Mit Hilfe der etablierten Methode der direct-PCR wird in Zukunft eine schnellere und kostengünstigere Identifizierung von Stechmücken erfolgen können, welche aufgrund bestimmungsrelevanter Merkmale nicht mehr morphologisch zu identifizieren sind.
Um das Wissen über die Stechmücken in Deutschland fortlaufend zu intensivieren, ist sowohl das Weiterführen der Monitoring-Programme als auch die molekularbiologische Aufarbeitung der Proben nötig. Durch die Anwendung neuer Techniken und weiterer molekularer Marker wird es möglich sein, weitere Krankheitserreger sowie genetische Besonderheiten der heimischen Stechmückenfauna nachzuweisen. Aber auch die Überwachung invasiver Stechmückenarten durch die Modellierung potentieller Verbreitungsgebiete und die Anwendung molekularbiologischer Analysemethoden zum Detektieren der Arten und möglicher Krankheitserreger wird ein wichtiger Bestandteil der weiteren Forschung sein.
Die rheumatoide Arthritis (RA) ist eine idiopathische chronisch-entzündliche Systemerkrankung, mit primärer Gelenkmanifestation. Die fortschreitende Gelenkentzündung ist die Folge einer immunologischen Fehlerkennung von Gelenkstrukturen durch dysregulierte B- und T-Lymphozyten. So lassen sich in bis zu 70% der entzündeten Gelenke von RA-Patienten IgG-Autoantikörper gegen das knorpelspezifische Kollagen Typ II (CII) nachweisen.
In dieser Arbeit wurde die CII-Epitop-spezifische humorale Autoimmunantwort in der Pathogenese der RA auf molekularer Ebene analysiert. Im Mittelpunkt stehen hierbei bereits gut charakterisierte B-Zell-Epitope auf dem CII, die über die Speziesbarrieren hinweg evolutionär konserviert sind und sowohl in der humanen RA als auch in der murinen Experimentalerkrankung des CIA-Modell (Collagen-Induced-Arthritis) immundominante Strukturen der humoralen arthritogenen Autoimmunität darstellen.
Ein Teilaspekt der Arbeit war die Aufklärung des molekularen Mechanismus, der den katabolen Effekten des murinen arthritogenen CII-Autoantikörper (UL-1) auf den chondrozytären Matrixmetabolismus zugrunde liegt, gewidmet. Der gegen ein immundominantes Epitop (U1-Epitop) auf dem CII gerichtete monoklonale Antikörper kann unabhängig von seinen Fc-vermittelten inflammatorischen Effektorfunktionen, eine direkte Schädigung der Knorpelmatrix über eine Modulation des Chondrozytenmetabolismus im CIA-Modell bewirken. Basierend auf der Analyse von Sequenzhomologien des U1-Epitopes konnte eine immunologische Kreuzreaktivität mit dem LIF (Leukemia-Inhibitory-Factor)-Rezeptor auf Chondrozyten nachgewiesen werden. Weitergehende funktionelle Studien haben jedoch gezeigt, dass die Rezeptorbindung durch den Antikörper keine intrazellulären Signalwege aktiviert, die an der aus der Literatur bekannten Proteoglykan-depletierenden Wirkung des Zytokins LIF beteiligt sind. Während somit eine UL-1 abhängige Aktivierung des LIF-Rezeptors als Erklärungsmodell der katabolen Antikörperwirkung ausscheidet, konnten die funktionellen in vitro Studien eine spezifische UL-1 Antikörper abhängige Src-Kinaseaktivierung in den humanen Chondrozyten als Ansatzpunkt für zukünftige Studien nachweisen.
In der RA-Pathogenese wird die Bedeutung posttranslationaler Modifikationen, insbesondere der Deiminierung von Argininresten unter Bildung von Citrullin für die Neoepitopgenerierung diskutiert. Autoantikörper gegen citrullinierte Peptide (ACPA, anti-citrullinated-peptides-antibody) gelten als diagnostische und verlaufsprädiktive Marker der RA. Zielstrukturen für ACPAs sind nicht nur einige ubiquitär exprimierte Proteine, sondern auch das knorpelspezifische CII. In dieser Arbeit konnte erstmals die in vitro Bindung CII-spezifischer ACPAs an Knorpelgewebe von RA-Patienten, das als asserviertes Biomaterial aus Synovektomie- bzw. Gelenkersatzoperationen zur Verfügung stand, nachgewiesen werden. Darüber hinaus gelang der erstmalige Nachweis einer chondrozytären Expression der für die posttranslationale Modifikation verantwortlichen Peptidylarginin-Deiminasen (PAD) PAD2 und PAD4 im Knorpelgewebe und ihre Hochregulation in den Chondrozyten unter oxidativem und genotoxischem Stress. Diese Stressoren sind an degenerativen Knorpel-veränderungen in der Pathogenese der Osteoarthrose (OA) beteiligt, sodass die Ergebnisse dieser Arbeit die Hypothese stützen, dass Degenerationsprozesse des alternden Knorpels zur Expression kollagenmodifiziernder PAD-Enzyme führen und damit die immunologische Selbsttoleranz des Knorpelgewebes durch Neoepitop-Generation in der Knorpelmatrix schwächen können.
Ein zentraler Aspekt der Arbeit galt der Analyse der CII-spezifischen humoralen Immunantwort im Blut und in der entzündlich veränderten Synovialmembran von RA-Patienten über die vergleichenden Analyse der rearrangierten Immunglobulingene in epitopspezifisch über biotinylierte CII-Peptide markierten B- und Plasmazellen. Die Isolation der markierten Zellen erfolgte mittels Laser-Mikrodissektion aus dem Gewebe und durchflusszytometrisch aus dem peripheren Blut. Die anschließende Sequenzanalyse der mittels semi-nested Einzelzell-PCR amplifizierten, für die variable Region der leichten und schweren Antikörperkette kodierenden V-Gene, ergab für die Erkennung des immundominanten CIIC1-Epitopes eine präferentielle V-Genverwendung. Darüber hinaus spricht der Nachweis höherer Mutationsraten in synovialen Plasmazellen im Vergleich zu CII-spezifischen B-Zellen im Blut für eine lokale synoviale Affinitätsreifung der Antikörperantwort. Die Klonierung der amplifizierten V-Gene in einen eukaryotischen Expressionsvektor ermöglicht die Expression rekombinanter Antikörper und deren Validierung im ELISA. Zukünftige Affinitätsbestimmungen und Kristallstrukturanalysen dienen dem verbesserten molekularen Verständnis der CII-Antikörpererkennung und murine Antikörper-transferexperimente der Evaluation der Arthritogenität der humanen CII-Antikörperantwort. Fernziel ist die Entwicklung einer auf der CII-Antigenspezifität beruhenden immunmodularischen Therapie der RA.
Die Interaktion zwischen der Kannenpflanze Nepenthes bicalcarata und der mit ihr assoziierten Camponotus schmitzi stand im Zentrum der Arbeit. Dabei wurden vier Themenbereiche zur genaueren Bearbeitung ausgewählt. Drei davon (Kapitel 3, 5 und 6) sind in vier Artikeln bereits in Fachzeitschriften publiziert worden (siehe Kapitel 14.1.2). Die Untersuchungen aus Kapitel 4 sind noch unveröffentlicht. Entsprechend den sich entwickenden Ergebnissen wurden zudem auch vergleichende Untersuchungen zu anderen mehr oder minder im gleichen Habitat vorkommenden Nepenthes Arten, N. gracilis, N. ampullaria, N. mirabilis var echinostoma, N. rafflesiana und N. albomarginata durchgeführt.
Die im Mittelhirn lokalisierten dopaminergen (DA) Neurone sind in einer Vielzahl von Hirnfunktionen involviert und werden aufgrund von anatomischen, molekularen sowie funktionellen Unterschieden in mehrere Subpopulationen aufgeteilt. DA Neurone, die in der Substantia nigra (SN) pars compacta lokalisiert sind, spielen durch ihre Projektion in das dorsale Striatum eine Rolle in der Steuerung der Willkürmotorik. Die Area tegmentalis ventralis (VTA) enthält DA Neurone, die in den präfrontalen Cortex, die basolateralen Amygdala sowie den Nucleus accumbens projizieren und in höheren kognitiven Funktionen, wie dem Arbeitsgedächtnis, der Motivation sowie belohnungsassoziierten Lernvorgängen involviert sind.
In dieser Arbeit wurden die differentiellen Eigenschaften des transienten A-Typ Kaliumstroms sowie dessen Funktion für die intrinsische elektrische Aktivität und die Integration von synaptischen Eingängen in Subpopulationen von DA Neuronen untersucht. Dieser spannungsgesteuerte Strom ist an der Kontrolle der Schrittmacheraktivität beteiligt, beeinflusst die Form und Dauer von Aktionspotentialen und moduliert die Erregbarkeit des somatodendritischen Kompartiments. Der A-Typ Kaliumkanal besteht in DA Neuronen aus einem Tetramer von porenbildenden KV4.3 α-Untereinheiten. Die Koexpression von akzessorischen β-Untereinheiten moduliert maßgeblich die biophysikalischen Parameter des A-Stroms, wie z. B. die Kinetik der Inaktivierung sowie die Spannungsabhängigkeit der Aktivierung und Inaktivierung. Zu diesen β-Untereinheiten gehören die cytoplasmatischen Kaliumkanal-interagierenden Proteine (KChIPs) sowie die transmembranären Dipeptidylpeptidase-ähnlichen Proteine (DPPLs). Während in DA SN Neuronen vor allem KChIP3 exprimiert wird und einen schnell inaktivierenden A-Strom gewährleistet, sind DA VTA Neurone durch die zusätzliche Expression der KChIP4a Splice-Variante charakterisiert, welche durch Inhibition der schnellen Inaktivierung in einem langsam inaktivierenden A-Strom resultiert. Die Bedeutung der differentiellen KChIP4a-Expression für DA Mittelhirnneurone wurde mit Hilfe von KChIP4-Knock-Out (KO)-Mäusen untersucht. Alle Versuche wurden in vitro an akuten Hirnschnitten adulter Wildtyp (WT)- und KChIP4-KO-Tiere durchgeführt und die DA neurochemische Identität sowie die Lage der gemessenen Zellen im Anschluss immunhistochemisch bestätigt. Die biophysikalischen Eigenschaften des A-Stroms wurden mit der Patch-Clamp Technik in der nucleated outside-out Konfiguration untersucht, welche optimale Bedingungen für Voltage-Clamp Experimente gewährleistet. Der A-Strom in DA VTA Neuronen aus KChIP4-KO-Tieren wies dabei eine siebenfach schnellere Inaktivierungskinetik als in vergleichbaren Neuronen aus WT-Tieren auf, während die Inaktivierungskinetik in DA SN Neuronen aus KChIP4-KO-Tieren lediglich um den Faktor zwei schneller war. Außerdem wurde festgestellt, dass selektiv in DA VTA Neuronen das halbmaximale Aktivierungspotential ebenfalls von der KChIP4-Expression abhängig war. Somit konnte gezeigt werden, dass die Expression von KChIP4 für die charakteristischen A-Strom-Eigenschaften von DA VTA Neuronen verantwortlich ist.
Die funktionelle Rolle des KChIP4-vermittelten langsamen A-Stroms wurde mit Hilfe von Current-Clamp Messungen in Ganzzellableitungen untersucht. Dabei wurde deutlich, dass die Expression von KChIP4 die Spontanaktivität von DA SN und VTA Neuronen nicht beeinflusst. Das für DA VTA Neuronen charakteristische verzögerte Wiedereintreten der Spontanaktivität nach einer Inhibition zeigte allerdings eine Abhängigkeit von der KChIP4-Expression, da der sog. rebound delay in DA VTA Neuronen aus KChIP4-KO-Tieren signifikant kürzer war, als in Zellen aus WT-Tieren. Dies konnte sowohl durch Strominjektionen, die in ihrer Kinetik GABAergen synaptischen Eingängen ähnelten, als auch nach direkter Aktivierung von GABA-Rezeptoren durch iontophoretische GABA-Applikation bestätigt werden. KChIP4 könnte somit einen internen Verzögerungsmechanismus nach einer transienten Inhibition von DA Neuronen gewährleisten, die z.B. bei Präsentation von aversiven Stimuli sowie beim Ausbleiben von erwarteten Belohnungen auftritt. Somit könnte die physiologische Relevanz des KChIP4-gesteuerten A-Stroms in der Integration von inhibitorischen synaptischen Eingängen im Kontext von belohnungsgesteuerten Lernprozessen liegen.
Mit dem Namen Gerhard Quinkert verbindet man in Frankfurt vor allem die Öffnung der Chemie für die Biologie. Das war damals ein außergewöhnlicher Schritt, der dank einer gezielten Berufungspolitik realisiert wurde. Der Organische Chemiker hat das "Frankfurter Modell" Ende der 1970er Jahre entwickelt.
Jetzt, nach Beendigung vieler Jahre der Lehre und Forschung an der Goethe-Universität, kann ich diese Zeit mit einem Abstand überdenken. Der Freiraum für solch nicht zweckgerichtetes Verhalten ist während der praktischen Tätigkeit an der Universität äußerst gering und muss hart erkämpft werden, wie jedes Stück Freiheit. Rückblickend sehe ich, dass der Wunsch, über das Detailwissen hinaus ganzheitliche Zusammenhänge zu betrachten und über die eigene Fachgrenze hinauszugehen, meinen Weg geprägt hat.
Die soziale Arbeitsteilung bei Honigbienen ist ein komplexes selbstorganisatorisches System, welches auf zwei Ebenen der biologischen Organisation zu verorten ist: dem Individuum und der Kolonie. Die Regulation der Bruttemperatur ist ebenfalls diesen Gesetzmäßigkeiten unterworfen. Die Arbeits-bereitschaft einzelner Bienen bildet die Grundlage für die Temperaturregulierung des kolonialen Brutnestes.
In dieser Arbeit wird dieses Zusammenspiel aus individuellen Beteiligungen der Arbeiterinnen sowie der erbrachten Gesamtleistung der Kolonie während des Brutwärmens untersucht. Dazu wird eine kleine Bienengruppe auf einer Brutwabe einer thermischen Belastung ausgesetzt. Ein speziell für diese Untersuchungen entwickelter Versuchsaufbau integriert erstmals die Infrarot-Thermografie mit den Temperaturmessungen einer Brutfläche. Somit ist es möglich, die Thoraxtemperaturen der einzelnen, am Brutwärmen beteiligten Arbeiterinnen störungsfrei zu messen und gleichzeitig das erzeugte räumliche und zeitliche Temperaturmuster der Brutwabe zu ermitteln. Zusätzlich wird der Temperaturverlauf der Außentemperatur sowie der zellumgebenden Luft untersucht.
Es kann gezeigt werden, dass die Lufttemperatur im Innenraum eines Bienenstocks ein wichtiger Faktor in der Temperaturregulierung des Brutnestes ist, da sie die untere Temperaturgrenze im Bienenstock bildet. Weiterhin wird der Einfluss der brutwärmenden Arbeiterinnen auf die Temperaturentwicklung einer Brutfläche sichtbar. Durch das flexible Verhalten der Arbeiterinnen kann einer Brutfläche bei thermischer Belastung durch lokal wechselndes Brutwärmen optimal Wärme zugeführt werden. Es gibt es Hinweise auf eine zyklische Periodizität im zeitlichen Temperaturverlauf der Brutzellen, welche auf einen Brutwärmrhythmus durch die Bienen schließen lässt. Durch den Einsatz zweier Unterarten (Apis mellifera carnica & Apis mellifera mellifera) wird sichtbar, dass es zwischen den Gruppen Unterschiede in der Aufrechterhaltung der Lufttemperatur über der Wabe gibt.
In den vergangenen Jahren haben ökologische Fragen in der Naturstoffforschung mehr und mehr an Bedeutung gewonnen. Naturstoffe bilden dabei einen wichtigen Aspekt in der Aufrechterhaltung symbiotischer Systeme.
Symbiosen stellen eine der treibenden Kräfte der Evolution dar. Diese artenübergreifende Interaktion zweier Organismen ermöglicht die Evolution in wechselseitiger Anpassung, wobei per Definition in die Kategorien Mutualismus, Kommensalismus und Parasitismus unterschieden wird. Teilweise führt die obligatorische Abhängigkeit eines Organismus zum partiellen Merkmals- und Stoffwechselwegverlust, der durch seinen Symbiose-Partner kompensiert wird. In den meisten Fällen stellt Symbiose ein komplexes Netzwerk aus mehr als zwei Lebewesen dar.
Diese Arbeit beschreibt die Anwendung der Klonierungsmethode ExRec ("overlap extension PCR-yeast homologous recombination") für die vereinfachte Bereitstellung von Naturstoffen. Es konnte ein 45 kb großes Gencluster erfolgreich kloniert und zwei neue Peptide Ambactin und Xenolindicin aus Xenorhabdus charakterisieren werden, wobei letztgenanntes von einem stillen Gencluster stammt. ExRec stellt eine sehr effiziente und wichtige Methode für die Klonierung großer Gencluster als auch für die Klonierung aus Metagenombibliotheken und RNA Pools dar...
Wie andere Vögel auch, verfügen Hühner über zwei verschiedene Magnetfeldrezeptoren. In der vorliegenden Arbeit werden diese beiden Rezeptoren, vor allem unter dem Aspekt Verhaltensontogenie eingehender untersucht. Meine Ergebnisse werden durch histologische Untersuchungen gestützt. Ich untersuchte zwei Hühnerrassen, einen braunen und einen weißen Legehuhn Stamm. Mit der Standardmethode konnte ich die Befunde der Literatur bestätigen. Zur Untersuchung des Magnetkompasses im Auge, habe ich Hühner darauf trainiert einen roten Tischtennisball, auf den sie geprägt wurden, in einer bestimmten magnetischen Richtung zu suchen. Im unbelohnten“ Test ist das Magnetfeld um 90 Grad gedreht, so dass der magnetische Norden nun im geographischen Osten liegt. Die braunen Hühner benutzen den Magnetkompass zum Lösen der gestellten Aufgabe, die weißen Hühner wählen zufällig eine Richtung. Eine Veränderung der Trainingsmethode, ein Training im gedrehten Magnetfeld und eine „Bestrafung“, haben das Ergebnis verändert. Die weißen Hühner sind nun in der Lage, die magnetisch richtige Richtung zu finden, die braunen Hühner reagieren verängstigt und wählen nur zufällig eine Richtung. Beide Hühnerrassen können also - unter verschiedenen Voraussetzungen - einen magnetischen Kompass für die Orientierung benutzen.
Die Funktion der äußeren Haarsinneszellen geht weit über die normale Rezeptoreigenschaft der Kategorie Mechanorezeptor hinaus. Äußere Haarzellen mit ihrer reichhaltigen efferenten Innervierung sind nicht nur für die sensorische Aufnahme mechanischer Bewegung zuständig, sondern ermöglichen aufgrund ihrer motorischen Funktionen die mechanische Verstärkung der Wanderwelle in der Cochlea. Äußere Haarzellen sind eine maßgebliche Komponente des ´cochleären Verstärkers` und ihr Ausfall führt zur Schwerhörigkeit. Beiprodukte des cochleä-ren Verstärkers sind otoakustische Emissionen, deren Messung Aufschluss über aktive mechanische Prozesse im Innenohr gibt.
Die äußeren Haarsinneszellen bilden Synapsen mit dem olivo-cochleären efferenten System, welches im Zentrum der vorliegenden Untersuchung steht. Es vermittelt den Einfluss des Zentralnervensystems auf das Corti-Organ des Innenohrs. Über die akustische Reizung des olivo-cochleären Reflexbogens ist man in der Lage, das efferente System zu aktivieren und gleichzeitig die Antworteigenschaften der Cochlea zu verändern. Efferente Modulationen des cochleären Verstärkers können sich z. B. in einer Veränderung des Emissionspegels bemerk-bar machen. Die Fledermausspezies Carollia perspicillata ist aufgrund ihres Echoortungs-systems mit einem sehr sensitiven und hochauflösenden Hörvermögen ausgestattet und eignet sich hervorragend als Modelltier in der Hörforschung, insbesondere auch deshalb, da oto-akustische Emissionen sehr gut messbar sind.
Das efferente System von C. perspicillata wurde in dieser Untersuchung durch akustische Stimulation der kontralateralen Cochlea angeregt. Die Stimuli, die nicht nur in ihrem Pegel sondern auch in ihrer Bandbreite und in der Mittelfrequenz in Relation zu den ipsilateralen Stimulusfrequenzen variierten, beeinflussten dabei die Generierung der otoakustischen Emis-sionen (DPOAE, engl: distortion product otoacoustic emissions) im ipsilateralen Ohr: akustische Stimulation der kontralateralen Cochlea bewirkte zuverlässig eine Änderung der DPOAE- Amplitude im kontralateralen Ohr. Vor allem eine Suppression des cochleären Verstärkers in Form von DPOAE-Pegelverminderungen wurde beobachtet. Die supprimieren-den Effekte erreichten trotz leiser bis moderater kontralateraler Rauschpegel (bis maximal 54 dB SPL) Werte von bis zu 14, 17.1 und 13.9 dB SPL (bei f2 = 20, 40 und 60 kHz und effek-tivstem kontralateralen Rauschstimulus) und waren damit deutlich größer als in vorangegang-enen Studien an anderen Spezies. Die DPOAE-Pegelverminderungen waren positiv mit dem x Pegel der kontralateralen akustischen Stimulation, ebenso wie seiner Bandbreite und der Mittelfrequenzen in Relation zu den ipsilateralen Stimulusfrequenzen korreliert. Es gab keinen absoluten Frequenzbereich, in dem die efferenten Effekte am größten gewesen wären. Vielmehr traten maximale Effekte immer durch etwas oberhalb der ipsilateralen Stimulusfre-quenzen gelegene kontralaterale Rauschstimuli auf. Die Effekte waren auch abhängig von der Bandbreite des kontralateralen Rauschstimulus und maximal bei einer relativen Bandbreite von 1.5 Oktaven. Die Verschiebung des efferenten Effekts hin zu hohen Frequenzen und die Bandbreitenabhängigkeit sind vereinbar mit den anatomischen Eigenschaften der Projektio-nen der medialen olivo-cochleären Efferenzen in der Säugetiercochlea. Kontralaterale akusti-sche Reizung bewirkte auch eine Verschiebung der Wachstumsfunktionen der 2f1-f2 -DPOAE in einen unsensitiven Bereich und außerdem eine Verformung der Wachstumsfunktion. Bei-des könnte durch Beeinträchtigung des cochleären Verstärkers verursacht sein. Eine Beteili-gung des Mittelohrmuskels an den Effekten kann nahezu ausgeschlossen werden und die beobachteten Effekte sind höchstwahrscheinlich dem olivo-cochleären System zuzuschreiben.
Funktionell ist denkbar, dass bei C. perspicillata das mediale olivo-cochleäre System im Kontext einer Frequenzverschärfung bei der cochleären Verstärkung der Basilarmembranbe-wegung aktiv wird. Aus diesem Grund wurden ipsilateral sogenannte DPOAE-Suppressions- Abstimmkurven gemessen, welche die mechanische Abstimmschärfe im Innenohr beschrei-ben. Während und nach kontralateraler Reizung kam es zu Veränderungen der Abstimmkur-ven. Signifikante Effekte konnten allerdings nicht festgestellt werden, da die Veränderungen der Suppressions-Abstimmkurven variabel und schlecht kategorisierbar war.
Die vorliegenden Ergebnisse unterstützen weit verbreitete Hypothesen zur Funktion der medialen olivo-cochleären Effernzen in Bezug auf mechanische Suppression, Verbesserung des cochleären Signal-Rauschverhältnisses und einer generellen frequenzspezifischen Wirkung.
Die X-chromosomal gebundene chronische Granulomatose (X-CGD) ist eine seltene Erbkrankheit, bei der die NADPH-Oxidase der Phagozyten nicht funktionell ist. Der Grund hierfür liegt meist in Mutationen in der GP91phox Untereinheit der Phagozyten-Oxidase. Hierdurch treten lebensbedrohliche Bakterien- und Pilzinfektionen bei Patienten auf, was neben einer geringen Lebensqualität zu einer erheblich verkürzten Lebenserwartung führt. Eine Stammzelltransplantation eines gesunden Spenders ist bislang der einzige heilende Therapieansatz. Für X-CGD-Patienten, die keinen passen-den Spender zur Verfügung haben, stellt die genetische Modifikation autologer hämato-poetischer Stammzellen eine alternative Form der Therapie dar. Im Jahr 2004 wurden daher in einer präklinischen Phase I/II Studie in Frankfurt zwei X-CGD-Patienten gentherapeutisch behandelt. Hierbei wurden CD34+ Stammzellen ex vivo mit einem γ-retroviralen Vektor transduziert, der eine LTR-getriebene Expressionskassette für GP91phox trägt. Nach einer nicht-myeloablativen Konditionierung wurden die genetisch modifizierten Zellen der Patienten retransplantiert. Beide behandelten Patienten zeigten schon kurz nach Therapiebeginn eine deutliche Verminderung der Infektionsanfälligkeit und somit eine stark verbesserte Lebensqualität. Auf zellulärer Ebene konnte ein gutes Engraftment der modifizierten hämatopoetischen Stammzellen im Knochenmark beobachtet werden. In funktionellen Tests konnte die Bildung superoxidproduzierender Phagozyten für die Immunabwehr gezeigt werden. Das molekulare Monitoring beider Patienten hat jedoch über die Zeit eine Verringerung der Enzymaktivität in den Phagozyten (Superoxidproduktion) gezeigt, obwohl der Anteil genetisch modifizierter Zellen nicht geringer wurde. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte durch quantitative RT-PCR-Analysen proviraler mRNA-Transkripte, eine Korrelation zwischen dem Verlust der Enzymaktivität und reduzierter Transgen-expression gezeigt werden. Durch DNA-Analysen peripherer Blutproben beider Patienten konnte eine verstärkte Methylierung an der Promotor-CpG-Insel, welche die Transgen-expression reguliert, als Ursache identifiziert werden. Weiterführende klonale Untersuchungen genmodifizierter Kolonien aus dem Knochenmark der Patienten offenbarten einen direkten Zusammenhang zwischen der Abwesenheit von Transkription bzw. Superoxidbildung und der Methylierung dieser CpG-Insel im proviralen Promotor-bereich. Somit konnte zum ersten Mal ein epigenetisches Silencing bei Patienten nach einer Behandlung mit Gentherapie nachgewiesen werden. In weiteren Versuchen konnte die vollständig ausgebildete, spezifische Methylierung des SFFV-Promotors in transduzierten Knochenmarkzellen eines Patienten durch in vitro Behandlung mit einem Methyltransferase-Inhibitor (Aza-D) in Kombination mit einem Histondeacetylase-Inhibitor (TSA) bis zu 30% reduziert werden. Dieser Teilerfolg zeigt, dass eine klinisch relevante Reaktivierung der Transgenexpression, durch Umkehrung des Silencings am SFFV-Promotor, prinzipiell möglich ist. Das Phänomen der Abschaltung der Genexpression des γ-retroviralen Vektors in der Frankfurter Gentherapiestudie, hat ein Testsytem zur Evaluierung zukünftiger Gentherapie-Vektoren erfordert. Durch Monitoring proviraler Parameter (Kopien, Transgenexpression, Proteinexpression und Promotor-CpG-Methylierung), in der murinen embryonalen Stammzelllinie P19 konnte in dieser Arbeit ein prädiktiver Silencing-Assay erfolgreich etabliert werden. Mit Hilfe dieses Systems wurden vielversprechende Silencing-resistente Vektoren mit dem UCOE (Ubiquitous Chromatin Opening Element) identifiziert. Hierdurch wurden wichtige Grundlagen geschaffen, um zukünftige virale Vektorsysteme in Bezug auf ihre Langzeitexpression testen zu können. Zusätzlich zu der Inaktivierung der transduzierten Expressionskassette konnte in beiden Patienten ein klonales Auswachsen von Subklonen beobachtet werden, das letztendlich zu einem myelodisplastischen Syndrom bei beiden Patienten führte. Der virale Enhancer war im Gegensatz zum viralen Promotor niemals methyliert, wodurch seine transaktivierenden Eigenschaften unbeeinflusst blieben. Diese enhancervermittelte Aktivierung proliferationsfördernder Gene (Mds1-Evi1-Genlokus) konnte durch RT-PCR-Analysen zunächst in Mischpopulationen aus peripherem Blut der Patienten nach-gewiesen werden. Weiterführende klonale Analysen in Knochenmarkzellen zeigten den direkten Zusammenhang zwischen der transkriptionellen Aktivierung des Mds1-Evi1-Genlokus und den proviralen Insertionen. Somit konnte die Ursache für die therapie-assoziierte, klonale Dominanz in beiden X-CGD-Patienten aufgeklärt werden. In der Frankfurter Gentherapiestudie wurde erstmals ein klinischer Erfolg für X-CGD-Patienten erzielt. Durch intensives molekulares Monitoring konnte im Rahmen dieser Arbeit aufgedeckt werden, dass der eingesetzte γ-retrovirale Vektor über das Phänomen der Insertionsmutagenese hinaus, auch in Bezug auf die epigenetische Abschaltung der Transkription (Silencing), für zukünftige Studien modifiziert werden muss. Sicherheits-verbesserte Vektoren mit einer Resistenz gegenüber Silencing in murinen embryonalen Stammzellen konnten in dieser Arbeit charakterisiert werden. Mit diesen Genfähren könnte der angestrebte Langzeittherapieerfolg in Zukunft möglich werden.
Autophagie ist ein evolutionär stark konservierter Degradationsmechanismus für geschädigte Proteine bis hin zu ganzen Organellen eukaryotischer Zellen. Dabei umhüllt eine Doppelmembran, bisher unbekannten Ursprungs, das zu degradierende Material und bildet das Autophagosom. Dies fusioniert später mit Lysosomen, wodurch dessen Inhalt proteolytisch zersetzt und die Bestandteile der Zelle wieder zur Verfügung gestellt werden kann.
In dieser Abeit wurde der Fokus auf den mitochondrialen Abbau über Autophagie (Mitophagie) und dessen Funktion als ein mitochondrialer Qualitätsmechanismus gesetzt. Als Zellmodell wurden primäre humane Endothelzellen der Nabelschnurvene (HUVEC) verwendet. Diese zeichenen sich durch einen Übergang von einer mitotischen, jungen in eine lange postmitotische, seneszente Phase während der Kultiverungszeit aus. Dabei durchlaufen sie einer zelluläre und mitochondriale Morphologieänderung. , wodurch sich die Möglichkeit bot , die Autophagie unter verschiedenen Parametern zu betrachten.
So wird generell eine Abnahme des autophagosomalen / lysosomalen Weges mit dem Alter beschrieben und die Abhängigkeit der Mitophagie von der mitochondrialen Länge.
Mitophagie ist unter normalen Kultivierungsbedingungen ein mikroskopisch selten zu beobachtender Vorgang. Daher wurde ein mitochondriales Schädigungsystem etabliert, welches die photosensibiliesierende Wirkung des Farbstoffs MitoTracker Red Cmx Ros (MTR) nutzt, um Mitochondrien gezielt oxidativ zu schädigen und die Mitophagie zu aktivieren.
Mitotische HUVEC zeigten 2 h – 8 h nach oxidativer Schädigung eine mitochondriale Fragmentierung größtenteils begleitet von einem Verlust des Membranpotentials. Über einen Zeitraum von 72h-120h kam es zur Regeneration des mitochondrialen Netzwerks durch Neusynthese mitochondrialer Biomoleküle. Entgegen der rescue Hypothese konnten oxidativ geschädigte Mitochondrien nicht durch eine Fusion mit funktional intakten Mitochondrien gerettet werden und wurden über den autophagosomalen / lysosomalen Weg abgebaut, gekennzeichnet durch die Ubiquitin-Ligase Parkin vermittelte Markierung und finaler Kolokalisation mit den autophagosomalen und lysosomalen Markerproteinen LC3B und LAMP-2A. Auf mRNA- und Proteinebene zeigte sich in diesem Zeitraum eine erhöhte Expression autophagie-relevanter Gene (ATGs) ATG5, ATG12 und LC3B.
Der Vergleich von mitotischen mit postmitotischen HUVEC nach oxidativer Schädigung wies zwei grundlegende Unterschiede auf.
Zum einem behielten, in Gegensatz zu jungen Zellen, die Mitochondrien alter HUVEC ihre Morphologie und ihr Membranpotential bei. Diese erhöhte Widerstandfähigkeit gegenüber oxidativem Stress konnte auf die erhöhte Expression der mitochondrial lokalisierten Serin / Threonin Kinase PINK1 zurückgeführt werden, ein Schlüsselgen in Parkinson.
Die PINK1-Transkription stand invers zu der Expression der mitochondrialen Teilungsfaktoren Fis1- und Drp1, welche in postmitotischen HUVEC stark vermindert war.
Andererseits wiesen alte Zellen eine verminderte Degradationsfähigkeit geschädigter Mitochondrien auf. Dieser Umstand war durch eine verminderte lysosomale Azidität bedingt. Eine externe ATP-Zugabe förderte die Azidität der Lysosomen alter Zellen und die Fusion mit Autophagosomen, wodurch Mitochondrien und ihre geringere ATP-Produktion im Alter als ein Faktor der Autophagie ermittelt weden konnte.
Die Autophagierate steht in Verbindung mit der Lebensspanne von Zellen bis hin zu ganzen Organismen. Durch die Überexpression autophagie-relevanter GFP-Fusions-Proteine ATG5, ATG12 und LC3B, welche nach oxidativer Schädigung in ihrer Expression verstärkt wurden, förderten die Mitophagie und wurden stabil in junge HUVEC exprimiert. Diese Überexpressionen bewirkten eine verbesserte mitochondriale Qualität, veranschaulicht durch ein erhöhtes Membranpotential und die ATP-Bereitstellung, einer besseren mtDNA Integrität und sie verlängerten die Lebensspanne signifikant, wobei die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezien (ROS), entgegen der von Harman aufgestellten Alterungstheorie, keine Verminderung zeigte. Dennoch wiesen sie einen erhöhten Gehalt oxidativ modifizierter Proteine auf, welche letztendlich auf die erhöhten Autophagosomenanzahl zurückgeführt werden konnte, in denen höchstwahrscheinlich das oxidativ geschädigte Material gelagert wird.
In dieser Arbeit kann gezeigt werden, dass Mitochondrien nach oxidativer Schädigung eine Teilung vollziehen und geschädigte Mitochondrien selektiv über Autophagie abgebaut werden. Dabei fungiert Mitophagie als ein mitochondrialer Qualitätmechanismus und steht unmittelbar mit der Lebensspanne in Verbindung.
In dieser Arbeit werden erstmals Mutationsraten von Mikrosatelliten von Daphnia-Taxa aus der Klasse der Crustaceen vorgestellt. Es wurden zwölf Loci bei 27 Individuen über einen Zeitraum von 240 Generationen getestet, von denen 267 Klon/Locus-Kombinationen informativ waren und in denen an drei solcher Kombinationen Mutation beobachtet wurde. Gemittelt über alle Taxa und Loci wurde eine Rate von 2,34 * 10-5 Mutationen pro Allel und Generation gefunden. Der Vergleich mit Mutationsraten anderer Organismen zeigt, dass die gefundene Rate durchaus in deren Größenordnung liegt. Am nächsten kommen sie den Raten, die bei Schweinen und Fruchtfliegen gefunden wurden.
BMPs control postnatal dendrite growth and complexity in sympathetic neurons / von Afsaneh Majdazari
(2012)
The vertebrate nervous system is a complex network of billions of neurons connected by dendrites and axons, integrated to functional circuits and areas/organs in the central and peripheral nervous system. The cells of the nervous system origin from common progenitors, which take on different cell fates based on intrinsic and extrinsic factors. These factors determine general neuronal traits, but also the morphology and the type of connections made to other cells. Mechanisms underlying axonal and dendritic growth are well described in contrast to the initiation of neurite growth, which remains to be fully elucidated, especially concerning dendrite formation. Recently BMPs have been identified as candidate dendrite inducing factors in sympathetic, cortical and hippocampal neurons. Here we focus on the in vivo role of BMPs on dendrite growth in sympathetic neurons as their development and differentiation processes have been analyzed in detail.
Prokaryotische Organismen werden in ihrer natürlichen Umgebung mit schwankenden Umwelteinflüssen konfrontiert oder müssen gegebenenfalls extremen Bedingungen standhalten. Um sich an derartige Veränderungen anpassen zu können und damit ein weiteres Überleben zu sichern, ist es wichtig neue genetische Informationen zu akquirieren. Die molekulare Basis dieser Anpassung sind Genmutationen, Genverlust, intramolekulare Rekombination und/oder horizontaler Gentransfer. Der vorliegende Selektionsdruck der Umwelt begünstigt schlussendlich die Spezialisierung und damit die Erschließung neuer Standorte aufgrund des Erwerbs neuer metabolischer Eigenschaften, Resistenzgene oder Pathogenitätsfaktoren. Vergleichende Analysen bakterieller Genome, welche auf Analysen der GC-Gehalte, der Codon- und Aminosäurenutzung und der Genlokalisation beruhen, zeigten, dass bei diesem evolutiven Prozess bzw. der Weiterentwicklung der bakteriellen Genome der horizontale Gentransfer als treibende Kraft eine entscheidende Rolle spielt. So indizieren Genomstudien, dass 0-22% der gesamten bakteriellen und 5-15% der archaeellen Gene horizontal erworben wurden, wobei der DNA-Transfer nicht ausschließlich zwischen Vertretern einer Domäne, sondern ebenfalls zwischen Organismen unterschiedlicher Domänen stattgefunden hat. So sind z.B. 24 bzw. 16% der Gene von Genomen hyperthermophiler Organismen wie Thermotoga maritima oder Aquifex aeolicus archaeellen Ursprungs. Ebenso finden sich Gene für Chaperone und DNA-Reparaturenzyme im Genom des thermophilen Bakteriums Thermus thermophilus wieder, welche wahrscheinlich ebenfalls durch horizontalen Gentransfer aus hyperthermophilen und archaeellen Genomen erworben wurden um eine Anpassung an extreme Standorte zu ermöglichen. Durch vergleichende Genomstudien wurde ebenfalls festgestellt, dass die durch horizontalen Gentransfer erworbenen Gene oftmals zu einer Neuorganisation von Transkriptionseinheiten und zu einer veränderten Genomorganisation führten. Dennoch finden sich immer wieder Beispiele von horizontal erworbenen Operonen in den verschiedenen Organismen. Gut charakterisierte Vertreter horizontal übertragener Operone sind dabei z.B. das archaeelle H+-ATPase-Operon, das Operon der Na+-translozierenden NADH:Ubichitonoxidoreduktase oder das Nitratreduktase-Operon.
Man unterscheidet bei dem horizontalen Gentransfer zwischen drei Mechanismen der DNAAufnahme: Konjugation, Transduktion und Transformation. Die DNA-Übertragung durch Konjugation ist durch einen spezifischen Zell-Zell-Kontakt definiert, der durch einen von der Donorzelle ausgehenden, sogenannten F-Pilus hergestellt wird. Die Donorzelle überträgt schließlich Plasmid-kodierte genetische Informationen und oftmals Eigenschaften für die eigenständige Konjugation auf eine Rezipientenzelle. Die Transduktion hingegen beschreibt die DNA-Übertragung von Bakteriophagen auf eine Wirtszelle, wobei hier eine hohe Wirtsspezifität Voraussetzung ist. Die Übertragung der DNA von einer Bakterienzelle in eine andere erfolgt dabei ohne Kontakt der Zellen. Die natürliche Transformation ist definiert als Transfer von freier DNA und ermöglicht damit im Gegensatz zu den beiden ersten spezifischen Mechanismen der DNA-Übertragung ein größeres Spektrum der Verbreitung genetischer Informationen. Freie DNA, welche entweder durch Zelllyse oder Typ-IVSekretion ausgeschieden wird und aufgrund von Adsorption an mineralische Oberflächen über längere Zeiträume stabil in der Umgebung vorliegen kann, kann unter der Voraussetzung der Existenz eines speziellen Aufnahmesystems von Bakterien aufgenommen werden. Mittlerweile sind über 44 Bakterien aus unterschiedlichen taxonomischen Gruppen beschrieben, die eine natürliche Kompetenz ausbilden können. Die bekanntesten Beispiele für natürlich transformierbare Gram-negative Bakterien sind Heliobacter pylori, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas stutzeri, Haemophilus influenzae, T. thermophilus und Acinetobacter baylyi. Auch unter den Gram-positiven Bakterien finden sich einige Vertreter, die natürlich kompetent sind, wie Deinococcus radiodurans, Bacillus subtilis und Streptococcus pneumoniae. Ungeachtet der relevanten Rolle der Transformation im horizontalen Gentransfer, ist über die Struktur und Funktion der komplexen DNA-Aufnahmesysteme wenig bekannt.
Struktur-Funktionsbeziehungen des Verpackungschaperons Gsf2 in der Hefe Saccharomyces cerevisiae
(2007)
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion des in der Membran des Endoplasmatischen Retikulum lokalisierten Proteins Gsf2 der Hefe Saccharomyces cerevisiae näher charakterisiert. Gsf2 ist ein 46 kDa großes ER-Transmembranprotein mit zwei membrandurchspannenden Domänen, wobei C- und N-Terminus cytosolisch orientiert sind. Zudem besitzt Gsf2 C-terminal ein klassisches Dilysin-Motiv. Eine Deletion des GSF2-Gens resultiert in einer Retention der Hexosetransporter Hxt1, Hxt3 und Gal2 im ER, so dass es sich bei Gsf2 möglicherweise um ein Hexosetransporterspezifisches Verpackungschaperon handelt.
Um Sequenzbereiche zu determinieren, die für die Funktion des Verpackungschaperons bezüglich der Reifung und des ER-Transportes von Hxt1 notwendig sind, wurden verkürzte Versionen des Gsf2-Proteins hergestellt. Die funktionelle Analyse zahlreicher verkürzter Versionen ergab die Lokalisation eines essentiellen Sequenzbereiches in den hinteren 40 Aminosäuren der carboxyterminalen Domäne des Gsf2-Proteins.
Vorläufige genetische und biochemische Untersuchungen hatten ergeben, dass Gsf2 mit Komponenten der Ribosomen, des Sec61-Translokationsapparates und mit Proteinen der COPII-Vesikel interagiert.
Mit Hilfe des Split-Ubiquitin Systems konnte in der vorliegenden Arbeit eine direkte Interaktion zwischen Gsf2 und dem Sec61-Translokations-Komplex und den Komponenten des sekretorischen Weges Sec12 und Sar1 bestimmt werden. Sec12 ist ein Sar1-spezifischer Guanin-Nucleotid-Austausch-Faktor, der für die Aktivierung von Sar1 benötigt wird. Sar1 ist ein kleines G-Protein, welches für die Initiation der COPII-Vesikelbildung benötigt wird. Sar1 ist aber auch für die Erkennung di-basische ER-Exportsignale spezifischer Cargo-Proteine zuständig. Diese Interaktion weist daraufhin, dass Gsf2 über solch ein Motiv verfügt und somit die Verpackung von Hxt1 in COPII-Vesikel gewährleisten könnte.
Postuliert wird ein Modell, wonach Gsf2 bereits eine wichtige Funktion bei der Translokation des Hexosetransporter Hxt1 in die ER-Membran übernimmt. Dabei interagiert Gsf2 mit dem Sec61-Translokon, um den Reifungsprozess der naszierenden Polypeptidkette des Metabolittransporters zu ermöglichen. Anschließend rekrutiert Gsf2 das gefaltete Proteine an Exit-Sites des Endoplasmatischen Retikulums. Es interagiert dort mit Sec12 und Sar1, so dass Gsf2 zusammen mit dem Hexosetransporter in die COPII-Vesikel verpackt und zum Golgi-Apparat transportiert wird. Aufgrund des ERRetentionssignals wird Gsf2 über COPI-Vesikel recycelt.
Dieses Modell impliziert, dass Hxt1 über kein ER-Exportsignal verfügt und daher Gsf2 als guide eine ausschlaggebende Funktion bei dessen Translokation übernimmt.
Die Hefe Saccharomyces cerevisiae hat sich wie kaum ein anderer Organismus auf die Verwertung von Glukose spezialisiert. Die Aufnahme dieser Hexose stellt dabei den ersten Schritt der Metabolisierung dar. Saccharomyces cerevisiae besitzt hierfür eine große Zahl an Hexosetransportern und eignet sich daher gut zur Untersuchung der Wirkungsweise und Regulation dieser Transporter, sowie deren Translokation zur Plasmamembran.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Funktion des in der Membran des Endoplasmatischen Retikulums lokalisierten Proteins Gsf2 der Hefe Saccharomyces cerevisiae näher zu charakterisieren. Gsf2 ist an der Translokation der Hexosetransporter Hxt1, Hxt3 und Gal2 zur Plasmamembran beteiligt. Die Deletion von GSF2 führt zur Akkumulation dieser Transporter in der Membran des Endoplasmatischen Retikulums. Interaktionen von Gsf2 mit ribosomalen Proteinen, Komponenten der Translokationsmaschinerie und COPII-Hüllproteinen deuten auf eine multifunktionelle Hexosetransporterspezifische Funktion des Verpackungschaperons Gsf2 hin.
Mit Hilfe des „Synthetic Genetic Arrays“ wurde nach synthetisch letalen und synthetisch kranken Interaktionspartnern von GSF2 gesucht, die zur Aufklärung der Funktion von GSF2 beitragen beziehungsweise bisherige Forschungsergebnisse verifizieren sollten. Unter den nicht-essentiellen Genen der Hefe konnte allerdings kein synthetisch letaler oder synthetisch kranker Interaktionspartner von GSF2 ermittelt werden.
Im zweiten Projekt sollten Multicopy-Suppressoren aus einer Genbank identifiziert werden, die in der Lage sind die Deletion von GSF2 und damit verbundene Retention von Hxt1 in der Membran des Endoplasmatischen Retikulums zu komplementieren. Mit Hilfe dieses Screenings konnten einzig GSF2-kodierende Plasmide identifiziert werden.
Die Ergebnisse der beiden genetischen Screening-Verfahren belegen, dass Gsf2 eine herausragende Rolle innerhalb des Translokationsprozesses von Hxt1 einnimmt.
Daphnien sind ein wichtiger Bestandteil des Süßwasserzooplanktons und in einer Vielzahl von biologischen Disziplinen als Modellorganismus etabliert. Ihr zyklisch parthenogenetischer Lebenszyklus und die hohen Raten von interspezischer Hybridisierung mancher Artkomplexe machen sie zu einem interessanten Forschungsobjekt. Die vorliegende Arbeit bietet Einblicke in die Populationsstruktur einer dieser Komplexe, des D. longispina-Artkomplexes, und testete ein neu entwickeltes Markersystem bei diesen Tieren auf gesamteuropäischer Ebene (33 Sammelorte, 1155 Individuen). Es wurden dazu molekulare Analysetechniken mit zwölf polymorphen Mikrosatelliten-Markern mit etablierten ITS-RFLP-Analysen verglichen.
Durch statistische Auswertemethoden mit den Programmen NewHybrids und Structure konnten Elternarten gut zugeordnet werden. Die Betrachtung der Kullback-Leibler Divergenzen in den Analysen durch NewHybrids deuten sogar darauf hin, dass die Anzahl der Mikrosatellitenmarker auf wenige besoders informative Loci reduziert werden kann, was bei Fragestellungen zur Art- und Hybrididentifizierung Zeit und Kosten spart. Ein Protokoll zur Vorgehensweise bei der Art- und Hybrididentifizierung wurde entwickelt.
Die Arten und Populationen selbst waren hoch differenziert. Zwischen den drei untersuchten Arten wurde ein FST von 0,29 gefunden. Ergebnisse aus einer AMOVA zeigten sogar, dass die Differenzierung zwischen den Populationen innerhalb der Arten leicht über dieser interspezifischen Differenzierung liegt (D galeata 0,40; D. longispina 0,52 und D. cucullata 0,42). Da auch keine isolation by distance gefunden wurde, lassen die Ergebnisse meiner Analysen auf „Provinzialismus“ schließen – ein Konzept, das genau dieses Muster voraussagt. Erklärt wird dieser Provinzialismus durch die Monopolisierungshypothese. Die Beobachtung, dass in der Regel in den untersuchten Populationen ein Heterozygotendefizit vorliegt, obwohl klonale Vermehrung oft zu einem Heterozygotenüberschuss führt (Meselson-Effekt), zeigt häufig vorkommende sexuelle Vermehrung an. Das Heterozygotendefizit deutet ebenfalls auf einen Wahlund-Effekt hin.
Es wurde weiterhin getestet, ob das Vorkommen von introgressiver, interspezifischer Hybridisierung in bestimmten Lokalitäten im Vergleich mit Lokalitäten, in denen ein Taxon allopatrisch lebt, einen Einfluss auf die Populationsstruktur hat. Die klonale Diversität sowie die beobachtete Heterozygotie standen dabei im Mittelpunkt der Analysen. Es wurde kein statistisch signifikanter Einfluss der Hybridisierung auf die Diversität gefunden.
Es ist wohl unumstritten, dass das Leben, wie wir es kennen, ohne die sauerstoffproduzierenden Organismen unserer Erde nicht möglich wäre. Zu ihnen gehören nicht nur die Landpflanzen, deren mannigfaltige Nutzung wichtiger Bestandteil unseres Alltags ist. Auch mikroskopisch kleine Algenarten leisten einen entscheidenden Beitrag zu den Stoffwechselkreisläufen dieser Welt. Unter ihnen befinden sich die Kieselalgen (Diatomeen), die mit einer Varietät von bis zu 10000 Spezies etwa 40 % der marinen Primärproduktion verantworten. Der Ursprung der heutigen zur oxygenen Photosynthese befähigten Eukaryoten geht auf Endosymbioseereignisse zurück, von denen aus sich diese Organismen ausgesprochen vielfältig entwickelt haben. Diese Vielfalt wird dabei nicht nur anhand ihrer äußeren Morphologie, sondern auch auf subzellulärer Ebene, deutlich. So zum Beispiel durch die unterschiedlichen Strukturen der Thyakoidmembranen, die sich in Kieselalgen wie Cyclotella meneghiniana in dreilagigen Bändern arrangieren. In Pflanzen wie Nicotiana tabacum (Tabak) hingegen bilden sie große, stapelartige Bereich aus, die zur räumlichen Separation der in den Thylakoiden eingebetteten Photosystemen beitragen. Auch die an die Photosysteme (PS) gebundenen Lichtsammelproteine (Lhcs) haben sich in Tabak und Cyclotella unterschiedlich entwickelt. Gemäß ihrem Namen zeichnen sie sich zwar allesamt durch die Sammlung und Weiterleitung der Lichtenergie an die Photosysteme aus, grenzen sich aber in Hinblick auf Proteingröße und Pigmentierung voneinander ab.
Die Lhcs der höheren Pflanzen werden entsprechend ihrer Zuordnung zu den Photosystemen in den aus zwei Heterodimeren bestehenden LHCI des PSI und die Lhcb-Antennenproteine des PSII unterschieden. Zu letzteren gehören der trimere Hauptantennenkomplex LHCII und die monomeren, minoren Antennenproteine. Die Lhcs binden die zur Lichtsammlung benötigten Pigmente, vor allem Chlorophyll a und Chlorophyll b, aber auch primäre Carotinoide wie Violaxanthin, Lutein und Neoxanthin, in unterschiedlichen Stöchiometrien. Es ist bereits bekannt, dass die Pigmentierung entscheidend zur Stabilität der Lichtsammelproteine beiträgt, wenngleich zum Teil auch eine gewisse Flexibilität in Bezug auf die Art der gebundenen Pigmente an den entsprechenden Bindestellen der Proteine besteht.
Im Rahmen dieser Arbeit liegt der Fokus auf der Fragestellung inwieweit die in der Regel nicht in Pflanzen vorkommenden Ketocarotinoide die Struktur und Funktion des LHCII aus einer Ketocarotinoide produzierenden N. tabacum - Transformante (bkt-Linie) beeinflussen und welche Auswirkungen sie auf dessen Photosyntheseapparat im Allgemeinen haben. Die bkt-Linie bildet dabei zum Teil auf Kosten ihrer primären Carotinoide sowohl das als antioxidativ und als anti-kanzerogen beschriebene Astaxanthin, als auch dessen Vorstufe Canthaxanthin und einige Derivate dieser Pigmente, die, nach vergleichenden HPLC-Analysen von Blättern und Thylakoidfraktionen, zu einem großen Teil mit der Thylakoidmembran assoziiert sind. Durch spektroskopische Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass diese Ketocarotinoide in Hinblick auf die Energieweiterleitung zum Chlorophyll a nicht funktionell an den LHCII binden, ihre Produktion aber die Trimerisierung dieses Lichtsammelkomplexes in N. tabacum nachhaltig beeinträchtigt. Auch die Assemblierung der PSII-LHCII-Superkomplexe wird dadurch maßgeblich gestört. Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Chloroplasten der bkt-Linie verdeutlichten zudem die Beeinträchtigung der Granathylakoid-Stapelung: Sie fällt ungeordneter aus als im Wildtyp, was durch den Mangel an intakten LHCII-Trimeren begründet sein kann.
In funktioneller Hinsicht stören die Ketocarotinoide die Energieweiterleitung innerhalb des PSII und bewirken die Reduktion der photoprotektorischen, nicht-photochemischen Fluoreszenzlöschung des Wirtsorganismus nachhaltig. Zeitgleich reduzieren sie durch einen abschirmenden Effekt auf Grund ihrer Assoziation mit der Thylakoidmembran und/oder durch einen eventuellen S1-S1-Energietransfer von Chl a auf die Ketocarotinoide aber auch die Menge der Lichtenergie, die über die Lhcs an die Photosysteme weitergeleitet wird. Dadurch kommt ihnen neben dem nachhaltig störenden Einfluss auf die Intaktheit des Photosyntheseapparats zugleich auch eine schützende Wirkung vor einem Übermaß an Lichtenergie zu.
Aus Cyclotella meneghiniana sind zwei Hauptantennenkomplexe bekannt: FCPa und FCPb. Im Gegensatz zu den Lhcs der Chl a/b-haltigen Organismen binden die Lichtsammelproteine der Diatomeen das Xanthophyll Fucoxanthin anstelle des Luteins, und Chlorophyll c anstelle des Chlorophyll b. Im Gegensatz zu der bereits sehr detailliert aufgeklärten Struktur des trimeren LHCII in höheren Pflanzen, existieren für den Aufbau des FCPb in C. meneghiniana bisher nur fundierte Modellvorschläge. Diese postulieren eine homotrimere Grundstruktur für den FCPb, die zu höheren Oligomeren assembliert.
In der vorliegenden Arbeit konnte anhand elektronenmikroskopischer Aufnahmen und der anschließenden Einzelpartikelanalyse nun erstmalig die Struktur des etwa 6-7 nm großen, trimeren FCPb gezeigt und die Richtigkeit der bisher postulierten Modellvorschläge in Hinblick auf die Struktur des Trimers bewiesen werden. Nach den hier dargelegten Erkenntnissen gleicht die Anordnung der Untereinheiten des FCPb-Trimers der des LHCII. Zudem ergibt sich aus dem Zusammenhang der hier erhobenen Daten und den in der Fachliteratur veröffentlichten Ergebnissen zum Thema FCPb ein klares Bild über die Anordnung der höheren Oligomere in Form von Nonameren. Auch diese Erkenntnisse unterstützen das ursprünglich von C. Büchel vorgeschlagene Modell für die oligomere Struktur des FCPb in C. meneghiniana.
Adaptive Radiation und Zoogeographie anisakider Nematoden verschiedener Klimazonen und Ozeane
(2013)
Anisakide Nematoden sind Parasiten aquatischer Organismen und weltweit in marinen Habitaten verbreitet. Ihre Übertragungswege sind tief im marinen Nahrungsnetz verwurzelt und schließen ein breites Spektrum pelagisch/benthischer Invertebraten (z.B. Cephalopoda, Gastropoda, Crustacea, Polychaeta) und Vertebraten (z.B. Teleostei, Elasmobranchia, Cetacea, Pinnipedia, Aves) als Zwischen- bzw. Endwirte ein. Aufgrund der hohen Befallszahlen u.a. in der Muskulatur und Viszera kommerziell intensiv genutzter Fischarten (z.B. Clupea harengus, Gadus morhua, Salmo salar) sowie ihrer Rolle als Auslöser der menschlichen Anisakiasis nehmen die Vertreter der Gattung Anisakis unter den anisakiden Nematoden eine Sonderstellung ein. Anhand der verbesserten Diagnostik und der Etablierung sowie Weiterentwicklung molekularbiologischer Methoden ist es in den letzten zwei Dekaden gelungen, die bestehende Taxonomie und Systematik der Gattung Anisakis zu erweitern bzw. zu revidieren. Aktuelle molekulare Analysen weisen auf die Existenz von insgesamt neun distinkten Arten hin, welche eine hohe genetische Heterogenität und Wirtsspezifität aufweisen, äußerlich jedoch nahezu identisch sind (sog. kryptische Arten). Trotz kontinuierlicher Forschung auf dem Gebiet ist das Wissen über die Biologie von Anisakis immer noch unzureichend.
Die vorliegende Dissertation ist in kumulativer Form verfasst und umfasst drei (ISI-) Einzelpublikationen. Die Zielsetzung der durchgeführten Studien bestand unter anderem darin, unter Verwendung molekularbiologischer und computergestützter Analyseverfahren, Fragestellungen zur Zoogeographie, (Co-)Phylogenie, Artdiagnostik, Lebenszyklus-Ökologie sowie des bioindikatorischen Potentials dieser Gattung zu bearbeiten und bestehende Wissenslücken zu schließen.
Die Verbreitung von Anisakis, welche bisher ausschließlich anhand von biogeographischen Einzelnachweisen abgeschätzt wurde, konnte durch den angewandten Modellierungsansatz erstmalig interpoliert und in Kartenform vergleichend dargestellt werden. Dabei wurde gezeigt, dass die Verbreitung von Anisakis spp. in den Ozeanen und Klimazonen nicht gleichmäßig ist. Die Analysen deuten auf die Existenz spezies-spezifischer horizontaler und vertikaler Verbreitungsmuster hin, welche neben abiotischen Faktoren durch die Verbreitung und Abundanz der jeweiligen Zwischen- und Endwirte sowie deren Tiefenverteilung und Nahrungspräferenzen geprägt sind.
Durch die umfangreiche Zusammenstellung und anschließende Kategorisierung der (mit molekularen Methoden) geführten Zwischenwirtsnachweise konnten indirekte Rückschlüsse über die vertikale Verbreitung von Anisakis spp. entlang der Tiefenhabitate gezogen werden.
Während Anisakis auf Gattungsebene in der gesamten Wassersäule entlang verschiedener Tiefenhabitate abundant ist, wurde für die stenoxene Art Anisakis paggiae ein meso-/bathypelagisch orientierter Lebenszyklus postuliert. Durch den Einbezug eines breiten Spektrums (paratenischer) Zwischen- und Transportwirte aus unterschiedlichen trophischen Ebenen werden Transmissionslücken im Lebenszyklus der Gattung weitestgehend minimiert und der Transmissionserfolg auf den Endwirt, und damit die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Reproduktion, erhöht. Ausgeprägte Wirtspräferenzen sowie phylogenetische Analysen des ribosomalen ITS-Markers stützen eine Theorie zur co-evolutiven Anpassung der Parasiten an ihre Endwirte. Anisakis eignet sich daher unter Einschränkungen als Bioindikator für die vertikale und horizontale Verbreitung und Abundanz der Endwirte und lässt Rückschlüsse auf trophische Interaktionen im Nahrungsnetz zu. Durch die weitere Beprobung von Zwischenwirten aus verschiedenen trophischen Ebenen in zukünftigen Studien, kann eine genauere Bewertung potentiell abweichender Lebenszyklus-Strategien gewährleistet werden. Insbesondere ist die Datenlage zur Prävalenz und Abundanz anisakider Nematoden in Cephalopoda und Crustacea noch unzureichend. Die Probennahme sollte dabei unter besonderer Berücksichtigung bislang wenig oder unbeprobter geographischer Regionen, Tiefenhabitate und Wirtsarten durchgeführt werden.
Es gibt für die Orientierung von Vögel ein allgemeingültiges Konzept, das Karte-Kompass-Prinzip (Kramer 1953, 1957): Der Karten-Schritt besteht darin, den eigenen Standort zu ermitteln und mit dem Ziel in Beziehung zu setzten. Damit wird die geografische Richtung bestimmt, die im Kompass-Schritt in eine konkrete Richtung umgesetzt wird. Für Beides nutzen Vögel auch das Magnetfeld der Erde; in der Karte als einen Faktor den Verlauf der Intensität, im Magnetkompass die Achse der Feldlinien. Der Magnetrezeptor, der die Karte mit Informationen versorgt, ist im Schnabel lokalisiert, der des Kompasses im Auge. Ich habe mich in meiner Arbeit darauf konzentriert, die zwei potenziellen Magnetrezeptoren der Vögel feinstrukturell und immunhistologisch weiter zu charakterisieren.
Für den Magnetkompass wird auf Grund des Radikalpaar-Modells angenommen, dass Cryptochrome die Rezeptormoleküle sein könnten (Ritz et al. 2000). Bei Vögeln sind vier Cryptochrome bekannt, allerdings muss das Rezeptormolekül des Magnetkompasses auch in seiner Lokalisation bestimmte Kriterien erfüllen. Die für meine Arbeit bedeutsamen Kriterien sind: (1) die gleiche Ausrichtung der Proteine in einer Rezeptorzelle und (2), dass die einzelnen Rezeptorzellen alle Raumrichtungen abdecken. Ich habe in meiner Arbeit Cryptochrom 1a (Cry1a) und Cryptochrom 1b (Cry1b) auf ihr Vorkommen in der Retina von Rotkehlchen (Erithacus rubecula) und Hühnern (Gallus gallus) untersucht. Cry1b befindet sich bei Rotkehlchen während der Zugzeit in den Ganglienzellen, in denen es teilweise an Membranen gebunden vorliegt, die jedoch keine bevorzugte Richtung haben. Somit erscheint mir Cry1b als Rezeptormolekül für den Magnetkompass als eher ungeeignet. Cry1b könnte, wie viele Cryptochrome, an der Steuerung von circadianen Rhythmen beteiligt sein. Cry1a hingegen ist bei beiden untersuchten Vogelarten in den UV/V-Zapfen an die Diskmembranen gebunden, was eine Ausrichtung ermöglicht. Die UV/V-Zapfen sind über die gesamte Retina gleichmäßig verteilt, und durch die sphärische Form des Auges decken die einzelnen Rezeptoren jede Raumrichtung ab. Somit erfüllt Cry1a die Bedingungen des Radikalpaar-Modells, und ich schließe daraus, dass es sich hierbei um das Rezeptormolekül des Magnetkompasses handeln könnte. Cry1a ändert nach Lichtabsorption wie viele Cryptochrome seine Konformation. Der von mir verwendete Antikörper bindet nur die lichtaktivierte Form des Proteins. In Versuchen, in denen Hühner verschiedenen monochromatischen Lichtern ausgesetzt wurden, zeigt sich, dass sich Cry1a in UV bis Gelb in lichtaktiviertem Zustand befindet. Dies stimmt sowohl mit der spektralen Empfindlichkeit des Magnetkompasses der Vögel als auch mit der des Flavins, des lichtsensitiven Teils des Cryptochroms, überein. Versuche mit grünem Licht lassen vorsichtige Rückschlüsse auf das für den Magnetkompass relevante Radikalpaar zu: so ist das Flavin erst im zweiten Oxidationsschritt grünlicht-sensitiv, und Cry1a ist nur nachweisbar, also lichtaktiviert, wenn der erste Schritt bereits im Hellen abgelaufen ist. Versuche in denen die Tiere vorab im Dunkeln waren, führen nicht zur erneuten Lichtaktivierung unter grünem Licht. Dies macht nur eines der beiden im Flavinzyklus entstehenden Radikalpaare wahrscheinlich, nämlich das in der Reoxidation entstehende, da das Radikalpaar im ersten Schritt der Oxidation unter Grün nicht entsteht.
In Bezug auf den Magnetrezeptor im Schnabel konnte bereits bei Tauben eine detaillierte Struktur beschrieben werden, die als Magnetrezeptor geeignet ist, nämlich Magnetit- bzw. Maghemit-Teilchen in Dendriten der Nerven (Fleissner et al. 2003). Auch Hühner haben eisenhaltige Strukturen im Oberschnabel, die in ihrer Eisenoxid-Zusammensetzung denen der Tauben entsprechen (Falkenberg et al. 2010). Ich konnte in meiner Arbeit zeigen, dass die eisenhaltigen Strukturen im Oberschnabel der adulten Hühner an oder in Nervenfasern liegen. Elektronenoptisch bestehen diese eisenhaltigen Strukturen im Nervengewebe bei Hühnern, wie bei Tauben beschrieben, aus einem 3-5 µm großen Vesikel, der von eisenhaltigen ‘Schuppen’ besetzt ist, aus circa 1 µm langen Plättchen und Kugeln mit einem Durchmesser von etwa 1 µm. Sie sind in Feldern angeordnet, in denen diese Zellstrukturen gleich ausgerichtet sind. In der Anzahl und Lokalisation der Felder der eisenhaltigen Dendriten gibt es Unterschiede zwischen Hühnern und Tauben, allerdings ist unklar, inwie¬weit dies zu Unterschieden in der Verarbeitung im Gehirn führt. Die Entwicklung der eisenhaltigen Dendriten der Hühner beginnt erst nach dem Schlupf, am Tag des Schlupfes haben Küken noch keine eisenhaltigen Strukturen, abgesehen von roten Blutkörperchen. In den ersten 5 Tagen werden eisenhaltige Makrophagen im frontalen Bereich des Schnabels gebildet, die anschließend wieder reduziert werden. Bei 12 Tage alten Hühnern werden diese auch im lateralen Bereich des Oberschnabels angelegt und ebenfalls dort bis Tag 21 wieder reduziert. 21 Tage alte Hühner haben nur noch wenige eisenhaltige Makrophagen, allerdings ein erstes Feld von eisenhaltigen Dendriten. Die Röntgenabsorption zeigt einen Unterschied in der Eisenoxid-Zusammensetzung zwischen eisenhaltigen Makrophagen und eisenhaltigen Dendriten. Es könnte sein, dass die eisenhaltigen Makrophagen an der Synthese der eisenhaltigen Dendriten beteiligt sind, da sie Eisen aufnehmen, aber auch wieder abgeben können und in demselben Zeitraum reduziert werden, wie die eisenhaltigen Dendriten aufgebaut werden.
Sowohl Tauben als auch Rotkehlchen haben sich phylogenetisch bereits vor 95 Millionen Jahren von den Hühnern abgespalten. Es gibt sowohl in der Lokalisation von Cry1a als auch in der Struktur der einzelnen eisenhaltigen Dendriten keine Unterschiede, so dass es sich bei den beiden Magnetrezeptoren der Vögel vermutlich um sehr alte Mechanismen handelt, die sich in der Evolution kaum verändert haben. Vermutlich sind sie vogelspezifisch, da es in dieser Hinsicht keine erkennbare Gemeinsamkeit mit anderen Wirbeltieren gibt.
Die phylogenetisch hochkonservierte Jak/Stat‐Signaltransduktionskaskade repräsentiert eines der zentralen Säulen zellulärer Signalübertragung eukaryotischer Organismen. Ubiquitär im Organismus exprimiert und über eine Vielzahl von Zytokinen, Hormonen und Wachstumsfaktoren aktiviert, sind Stat‐Transkriptionsfaktoren maßgeblich an dem Erhalt der Physiologie und Homöostase von Organen und Geweben beteiligt. So sind die Mitglieder Stat5A und Stat5B (als homologe Proteine im Verbund als Stat5 bezeichnet) entscheidende Regulatoren des Immunsystems und der Hämatopoese, der Funktion und Entwicklung des Prostata‐ und Brustdrüsengewebes (Mammogenese) oder bestimmter Funktionen der Leber. Wie auch Stat3, konnten Stat5 Proteine in aberrant aktiver Form in verschiedensten Typen und Stadien humaner Tumore nachgewiesen werden, wo sie über die Expression ihrer Zielgene sowie über weitere nicht‐kanonische Funktionen im Zytoplasma und im Zellkern einer fortschreitend malignen Entartung entscheidend beitragen. Als Folge der Unterstützung essentieller Tumorgenese‐
Mechanismen, wie gesteigertes Zellwachstum, Apoptosehemmung, Migration und Metastasierung, Sauerstoff‐unabhängiger Energiestoffwechsel, Angiogenese oder Umgehung der Immunabwehr, entwickeln Tumore häufig eine Abhängigkeit gegenüber der gesteigerten Aktivität dieser Vertreter der Stat‐Proteinfamilie und reagieren mit einem Wachstumsstopp und Apoptoseinduktion auf ihre Inhibierung. Perspektivisch stellt die gezielte Interferenz mit aberranten, Tumortyp‐spezifischen Stat5‐Aktivitäten einen relevanten Ansatz in der personalisierten Therapie Stat5‐abhängiger Tumore, vorrangig leukämischen Ursprungs, dar. ...
Im Rahmen der vorliegenden Diplomarbeit wurde die Rolle der putativen mitochondrialen Kinase PINK1 untersucht. Die Mutationen in diesem Gen sind für die PARK6 Form von Morbus Parkinson ursächlich. Dies ist eine neurodegenerative Erkrankung, welche die Lebensqualität der Betroffenen weitgehend beeinträchtigt. Sie wird mit Dopamin-Ersatzmitteln und DBS (Deep Brain Stimulation) behandelt, beide nicht frei von Nebenwirkungen. Levodopa können bekannterweise zu schweren Fällen von Dyskinesie führen. Die Aufklärung der physiologischen Rolle von PINK1 würde den Wissenschaftlern auf dem Weg zur Früherkennung und anderen Therapiemöglichkeiten verhelfen. Die PARK6 Form der Parkinson Erkrankung wird derzeit anhand von verschiedenen Modellorganismen (M. musculus, D. melanogaster, D. rerio, C. elegans), sowie von verschiedenen Zellmodellen (HeLa, PC12, Fibroblasten aus PARK6 Patienten) untersucht. Als neuronale Zelllinie eignen sich die SH-SY5Y Zellen besonders gut für die Forschung an der durch den Verlust von dopaminergen Neuronen gekennzeichneten Parkinson-Erkrankung und sind diesbezüglich als ein relevantes Zellmodell breit akzeptiert (Xie et al.2010). In der vorliegenden Diplomarbeit wurden mit einem adenoviralen Konstrukt generierte PINK1 knockdown SH-SY5Y Zellen (M. Klinkenberg) als ein potentielles Zellmodell für die PARK6 Form von M. Parkinson analysiert. Als Kontrolle für die PINK1- abhängigen Effekte wurden NT (non target) Zellen herangezogen. Ausschlaggebend für die Wahl dieses Zellmodells war die Beobachtung, dass die PINK1 KD SH-SY5Y Zellen bei einer Reduktion des Serumgehaltes im Medium wesentlich langsamer wachsen als die NT Zellen (M. Jendrach). Die Serumdeprivation schien also der notwendige Stressfaktor zu sein, welcher zur Auslösung eines PINK1-abhängigen Phänotyps führen könnte. Daraus ergab sich die Frage, welche anderen PINK1-abhängigen Veränderungen unter Serumentzug zur Ausprägung kommen. Im Rahmen dieser Diplomarbeit wurde zunächst die relative Genexpression der PINK1 KD SH-SY5Y Zellen in Bezug auf die NT Zellen untersucht. Es zeigte sich, dass der PINK1 KD bei reduziertem Serumgehalt zur Herunterregulation weiterer Parkinsonrelevanter Gene führt, deren Produkte an verschiedenen zellulären Prozessen beteiligt sind. Die Effekte traten nur bei stabil transfizierten Zellen auf und waren durch einen transienten PINK1 KD nicht reproduzierbar. Viele dieser Gene sind für die Aufrechterhaltung der mitochondrialen Homöostase bedeutsam und deshalb wurde die mitochondriale Funktion und Erscheinung in den PINK1 KD SH-SY5Y Zellen genauer erforscht. Im Gegensatz zu früheren Befunden (Mai et al. 2010) wurde eine Herunterregulation des für die mitochondriale Teilung zuständigen Fis1-Proteins ermittelt, darüber hinaus aber keine Änderung der mitochondrialen Morphologie auch nach induziertem Zellstress beobachtet (Dagda et al. 2009, Lutz et al. 2009). Ein Defizit in der mitochondrialen Atmung wurde festgestellt, nachdem die Zellen bei 1g/L Glucose kultiviert und für 24h auf ein Galaktose-haltiges Medium transferiert wurden. Außerdem wurde ähnlich zu Amo et. 2010 al eine leicht verminderte Energieladung der betreffenden Zellen gefunden. Keine Beeinträchtigung der mtDNA-Integrität oder der Überlebensrate bei H2O2-induziertem oxidativen Stress wurde beobachtet. Weiterhin wurde untersucht, inwiefern die in den PINK1 KD SH-SY5Y Zellen beobachteten Veränderungen in der Genexpression auf weitere Zellmodelle (PINK1 KD HeLa, kortikale Neurone aus PINK1 KO und PINK1 KO / A53T alpha Synuclein überexprimierenden Mäusen) übertragbar sind. Dabei wurden einige Gemeinsamkeiten zwischen den PINK1 KD SH-SY5Y Zellen und den PINK1 KO /A53T α Synuclein überexprimierenden kortikalen Neuronen ermittelt. Angesichts des Verlustes von dopaminergen Neuronen in M. Parkinson wäre es bedeutsam nachzuvollziehen, ob und wie die verminderte Expression Parkinson-relevanter Gene in diesen PINK1 KD Zellmodellen kompensiert wird, so dass die Zellen trotz der genetischen Einschränkung bei idealisierten in vitro Bedingungen gut überleben können. Hier ist es vorstellbar, dass zusätzlicher Zellstress die Gemeinsamkeiten zwischen den PINK1 KD SH-SY5Y Zellen und den PINK1 KO / A53T SNCA überexprimierenden Neuronen erweitern könnte. Diesbezüglich wäre es auch relevant zu erforschen, unter welchen Umständen die potentiellen Kompensationsmechanismen versagen, so dass das Zellüberleben nicht mehr gewährleistet wird. Im Licht des altersbedingten Ausbruchs der Symptome bei M. Parkinson würden diese neuen Erkenntnisse dazu beitragen, die möglichen auslösenden Faktoren zu erfassen und so ein tieferes Verständnis der molekularen Mechanismen dieser schwerwiegenden Erkrankung zu erhalten.
Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Rolle der i-AAA Protease in P. anserina, besonders während des Alterns des Ascomyceten. Die dazu durchgeführten Untersuchungen führten zu folgenden Ergebnissen:
1. Unter Standardbedingungen ist der PaIap-Deletionsstamm langlebiger als der Wildstamm, ohne feststellbare physiologische Beeinträchtigungen aufzuweisen. Dass dies auf den Verlust von PaIap zurückzuführen ist, bestätigen die PaIap-Revertantenstämme, in denen das Gen wieder eingeführt wurde, wodurch deren Lebensspanne wieder Wildtyp-artig ist. Dies zeigt, dass PaIAP zelluläre Prozesse beeinflusst, die die Lebensspanne kontrollieren.
2. Bei Hitzestress weist der PaIap-Deletionsstamm dagegen eine höhere Hitzesensitivität auf als der Wildstamm, was sich in einer verkürzten Lebensspanne und der Störung vitaler Funktionen äußert. Dies deutet auf eine mögliche Rolle von PaIAP bei der Hitzestressantwort hin.
3. Im Einklang mit dem hitzesensitiven Phänotyp des PaIap-Deletionsstamms konnte in mitochondrialen Extrakten des Wildtyps gezeigt werden, dass die Proteinmenge von PaIAP durch Hitzestress signifikant zunimmt. Gleichzeitig weisen mitochondriale Proteinextrakte von PaIap-Deletionsstämmen nach Hitzestress signifikant geringere Mengen an PaHSP60 und PaCLPP auf, zwei weiteren Komponenten der mitochondrialen Proteinqualitätskontrolle. Dies unterstreicht die Beteiligung von PaIAP an der Hitzestressantwort von P. anserina.
4. Darüber hinaus beeinflusst der Verlust von PaIap die Zusammensetzung der mitochondrialen Atmungskette und führt bei 27°C zu einer vermehrten Organisation der Komplexe in stabilere Superkomplexe. Dieser Mechanismus wird beim Wildstamm erst nach Hitzestress beobachtet, wogegen der PaIap-Deletionsstamm die Superkomplexmenge nicht mehr weiter steigern kann.
5. Die Genexpression von proteolytisch inaktiven Varianten von PaIAP (PaIAPE540Q bzw. PaIAPE540QG) kann den Phänotyp des PaIap-Deletionsstamms bei 27°C nicht komplementieren und führt ebenfalls zu einer Verlängerung der Lebensspanne von P. anserina. Dies liefert wichtige Informationen über den Mechanismus wie PaIAP die Lebensspanne von P. anserina beeinflusst, da dazu die proteolytische Aktivität von PaIAP benötigt wird.
6. Darüber hinaus zeigt die Analyse des PaIap/PaClpP-Deletionsstamms, dass sich die Mechanismen, wie PaIAP und PaCLPP die Lebensspanne von P. anserina beeinflussen, unterscheiden. Die unterschiedlichen zellulären Aufgaben werden auch bei Hitzestress deutlich, wovon der PaIap/PaClpP-Deletionsstamm noch stärker betroffen ist als durch die Deletion von PaIap bzw. PaClpP. Dies verdeutlicht, dass sich die Effekte der Deletionen der beiden Gene addieren.
Insgesamt konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die i-AAA Protease PaIAP auch bei P. anserina wichtige zelluläre Funktionen besitzt, die sich auf den Alterungsprozess des Ascomyceten auswirken. Dabei war es möglich verschiedene neue Mechanismen zu identifizieren, wie die i-AAA Protease diese Funktionen ausübt. Dazu gehören z.B. der Einfluss der proteolytischen Aktivität auf die Lebensspanne, die durch die Abwesenheit der i-AAA Protease ausgelöste Reorganisation der Atmungskettenkomplexe in stabile Superkomplexe, und die Induktion der Hitzestressantwort durch PaIAP. Diese Befunde tragen zum besseren Verständnis der zellulären Funktion der i-AAA Protease bei und stellen einen entscheidenden Ausgangspunkt für weiterführende Analysen der bislang wenig verstandenen Aufgaben der Protease dar.
Typ I Interferone sind bekannt für die durch sie vermittelten immunaktivierenden bzw. antiviralen Effekte. Nach ihrer Induktion, im Rahmen der angeborenen Immunantwort, vermitteln Interferone nicht nur einen systemischen anti-viralen Status, sondern können auch wichtige Effektormechanismen der adaptiven Immunität dahingehend beeinflussen, dass sie diese verstärken bzw. ermöglichen. Im Allgemeinen kann diese Eigenschaft als pro-inflammatorische Aktivität der Interferone bezeichnet werden. Allerdings gehört es ebenfalls zu den Eigenschaften der Interferone eine Verminderung der adaptiven Immunität bewirken zu können, was als anti-inflammatorische Aktivität verstanden werden kann. Insgesamt kann man die durch Interferone induzierten Effekte also als ambivalent bezeichnen.
Die Leber als Immunorgan besitzt, ähnlich wie die Interferone, eine zentrale Rolle in der Immunität und sollte in ihrer Funktion als Vermittler zwischen Immunaktivierung und Immuntoleranz nicht unterschätzt werden. Die Aufgaben der Leber können ebenfalls als ambivalent bezeichnet werden, da sie zum einen eine unnötige Aktivierung des Immunsystems verhindern muss um eine Schädigung der Leberzellen zu vermeiden (Immuntoleranz). Zum anderen muss auch in der Leber eine Immunaktivierung stattfinden können, um den Schutz vor Pathogenen zu gewährleisten.
In einem Leberschadenmodell, das künstliche Doppelstrang-RNA (poly(I:C)) zur Induktion von Typ I Interferonen verwendet, sollen im Rahmen der vorliegenden Arbeit Immunmodulationen, insbesondere in der Leber, untersucht werden. Hierbei liegt das Hauptaugenmerk auf den Interferon-vermittelten Effekten, die eine Schädigung der Leber verhindern.
Werden Interferonrezeptor-defiziente Tiere (IFNAR-/-) intraperitoneal mit poly(I:C) behandelt kann eine ausgeprägte Schädigung der Leber sowie Hepatitis in diesen Tieren beobachtet werden. Wildtyp (WT) Mäuse zeigen hingegen keinerlei Schädigungen der Leber, was für einen protektiven bzw. anti-inflammatorischen Effekt spricht, der über den IFNAR und damit über Typ I Interferone vermittelt wird. Unter Verwendung von Mäusen, die eine selektive Deletion des IFNAR auf bestimmten Immunzellen tragen (alle anderen Zellen der Maus exprimieren jedoch weiterhin den IFNAR), konnte der Immunzelltyp ermittelt werden, der beim IFNAR-vermittelten Schutz der Leber eine Schlüsselrolle übernimmt. Aus diesen Experimenten wird deutlich, dass es myeloide Zellen sind, die über den IFNAR durch Typ I Interferone stimuliert werden müssen, um im poly(I:C)-induzierten Leberschadenmodell einen Schutz der Leber zu bewirken. Ergänzend dazu konnte gezeigt werden, dass CD11b- und F4/80-doppelt positive Makrophagen nach poly(I:C)-Behandlung in die Leber von WT Mäusen infiltrieren. Zudem wurde in Experimenten mit Interferon-Reporter Mäusen deutlich, dass diese infiltrierenden Makrophagen über den IFNAR durch Typ I Interferone stimuliert sind. Nach poly(I:C)-Behandlung konnte gezeigt werden, dass Leber-infiltrierende Zellen in WT Mäusen anti-inflammatorischen Interleukin-1 Rezeptor Antagonisten (IL-1RA) sekretieren. In Abwesenheit eines funktionalen Interferonsystems hingegen (in IFNAR-/- Mäusen) konnte eine gestörte IL-1beta- und IL-1RA-Balance festgestellt werden. Für diese Zytokine, die sich gegenseitig regulieren, indem der anti-inflammatorische IL-1RA mit dem pro-inflammatorischen IL-1beta um die Bindung an den IL-1 Rezeptor konkurriert, konnte gezeigt werden, dass ihre Expression in der Leber Interferon-abhängig reguliert wird. In IFNAR-/- Mäusen und in Mäusen, deren IFNAR selektiv auf myeloiden Zellen deletiert war, konnte keine IL-1RA-Expression durch infiltrierende Zellen detektiert werden. Da in diesen Tieren nach poly(I:C)-Behandlung massive Leberschäden beobachtet wurden, kann vermutet werden, dass das Vorhandensein des anti-inflammatorischen IL-1RA unerlässlich für den Schutz der Leber ist.
Abschließend kann zusammengefasst werden, dass die Interferon-vermittelten Effekte, die eine Schädigung der Leber verhindern, zum einen auf der Stimulation und Rekrutierung von Makrophagen beruhen. Zum anderen beruhen diese Effekte auf der Induktion des anti-inflammatorischen Zytokins IL-1RA, und der dadurch blockierten Wirkung des pro-inflammatorischen IL-1beta.
Durch diese Ergebnisse werden neue Einblicke in die Interferon-vermittelte Hemmung von Virus- und Autoimmun-induzierten Erkrankungen der Leber ermöglicht. Genutzt werden könnten diese für die Optimierung IFN-basierter Therapien. Beispielsweise kann durch die gezielte Induktion anti-inflammatorischer Zytokine über IFNAR-induzierte Signalwege oder die direkte Gabe anti-inflammatorischer Zytokine (z.B. IL-1RA) eine Therapie entwickelt werden, die neben den vorteilhaften Eigenschaften der Zytokine eine verbesserte Aktivierung von Immunzellen ermöglicht.
In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass bestimmte neuronale microRNAs im Rückenmark und in den Spinalganglien konstitutiv exprimiert und nach peripherer Entzündung mit Formalin oder Zymosan differenziell reguliert werden. Bei der SNI-induzierten Neuropathie konnte indessen keine signifikante Regulation der untersuchten microRNAs nachgewiesen werden. Aufgrund der Lokalisation in den Neuronen der Schmerz-verarbeitenden Laminae I und II des Dorsalhorns des Rückenmarks und angesichts der Regulation in entzündlich stimulierten Neuronen und Mikroglia wurde der Fokus der Arbeit auf die Untersuchung von microRNA-124a gelegt. Anhand von Expressionsanalysen konnte gezeigt werden, dass eine periphere entzündliche Stimulation mit Formalin oder Zymosan microRNA-124a im Rückenmark inhibiert, die Expression pro-inflammatorischer und pro-nozizeptiver Gene hiernach ermöglicht und ein vermehrtes Schmerzverhalten bewirkt. Die funktionelle Relevanz von microRNA-124a wurde in vivo mittels intravenöser Applikation von microRNA-124a-Modulatoren bei einem Modell für entzündliche Schmerzen, dem Formalin-Modell untersucht. Dabei führte die Hemmung von microRNA-124a zu einem verstärkten Schmerzverhalten, welches mit einer Hochregulation verschiedener Entzündungsmarker einherging. Die Überexpression von microRNA-124a dagegen antagonisierte die Hochregulation entzündlicher Mediatoren und führte zu einer Schmerzhemmung. Darüber hinaus konnte in der vorliegenden Arbeit der antinozizeptive Effekt von microRNA-124a mit der Regulation der Epigenetik-regulierenden Targets MeCP2, HDAC5 und MYST2 assoziiert werden und u.a. über die Hemmung des neuromodulierenden, pro-inflammatorischen Peptids BDNF verifiziert werden. Die spezielle Darreichung von microRNA-124a könnte demzufolge einen vielversprechenden Ansatz zur Therapie chronisch-entzündlicher Schmerzen liefern. Zukünftig werden weitere Studien notwendig sein um die eindeutige Funktion, die individuelle Wirkung sowie die therapeutische Relevanz von microRNA-124a zu analysieren. Darüber hinaus müssten Dosis-Wirkungs-Beziehungen und Nebenwirkungsprofile für microRNA-124a erstellt werden, um potenzielle Risiken, Chancen und Vorteile der microRNA-Modulation hinsichtlich einer humanen Schmerztherapie bewerten zu können.
Es gibt viele Theorien, die sich mit der Auswirkung einer zunehmenden carnivoren Ernährung von Homininen auf Carnivorengilden beschäftigen. Aussterbeereignisse in der Carnivorengilde werden oft mit carnivoren Homininen in Verbindung gebracht. Um zu prüfen, ob solche Theorien überhaupt zutreffen, benötigt man zunächst ein Modell, das Effekte von Konkurrenzbeziehungen innerhalb von Carnivorengilden quantifiziert darstellt.
In dieser Arbeit ist daher ein Modell entwickelt worden, das die Konkurrenz um Beute innerhalb einer Carnivorengilde darstellt und ermöglicht Veränderungen durch das Eintreten neuer Mitglieder in die Gilde zu modellieren. Dieses Modell wurde zur Analyse der rezenten Großcarnivorengilden der Serengeti, des Krüger-National-Parks und des Bandipur-Biosphärenreservat verwendet. Ebenso ist es zur Analyse pleistozäner Großcarnivorengilden Javas eingesetzt worden.
In dem Modell wird die verfügbare Beutemasse als limitierende Ressource für die Carnivorengilde betrachtet. Im ersten Schritt wird die Beute kategorisiert – in dieser Arbeit nach ihrer Körpermasse – und geprüft, welche Mitglieder dieselben Beutekategorien nutzen und welche für sie essentiell sind. Im zweiten Schritt wird die konkurrenzfreie Kapazität der Gildenmitglieder berechnet. Hierzu wird die für die gesamte Gilde verfügbare Beutemasse unter der Annahme verwendet, sie stehe einem Gildenmitglied allein zur Verfügung. Die konkurrenzfreie Kapazität ist daher die Populationsgröße, die ein Gildenmitglied mit dieser Beutemasse erreichen kann und stellt einen Referenzwert dar. Basierend auf diesem Referenzwert und der tatsächlichen Populationsgröße kann nun berechnet werden, zu welchem Anteil ein Mitglied diese Kapazität ausschöpft. Ist der Konsum an Beutemasse der übrigen Mitglieder in den essentiellen Beutekategorien bekannt, kann berechnet werden, zu welchem Anteil ein Mitglied durch ein anderes Mitglied von dieser Kapazität verliert. Dieser Verlust an Kapazität wird als Konkurrenzeffekt bezeichnet.
Dieses Modell ist sowohl auf rezente als auch fossile Gilden anwendbar. Um mit dem Modell die Konkurrenzeffekte zu berechnen, werden die Häufigkeit bzw. Populationsgröße, das Beutemassenspektrum sowie der tägliche Bedarf an Beutemasse benötigt.
Diese Größen können bei der Strukturanalyse von rezenten Gilden aus Freilandstudien entnommen werden. Im Falle fossiler Gilden müssen diese Größen erst rekonstruiert werden. Dafür sind in dieser Arbeit vorhandene Rekonstruktionsmethoden ergänzt, aber auch entwickelt worden, mit denen man basierend auf der Körpermasse fossiler Carnivora die benötigten Parameter rekonstruieren kann. Hierzu sind verschiedene Regressionen berechnet worden, die einen Zusammenhang zwischen verschiedenen Zahnparametern und der Körpermasse darstellen. Weiterhin sind Muster der Beutemassenspektren rezenter Carnivora untersucht worden und Regressionen berechnet worden, die zur Rekonstruktion der mittleren Beutemasse eines Carnivoren verwendet werden.
Die benötigten Daten der javanischen Gilden werden mit den eben genannten Regressionen rekonstruiert. Anschließend wird eine Strukturanalyse der genannten rezenten und fossilen Großcarnivorengilden durchgeführt.
Bei den drei rezenten Gilden ist eine generelle sich wiederholende Struktur erkennbar. Die erfolgreichsten Mitglieder schöpfen ihre Kapazität zu ca. 60 % aus und verfolgen eine soziale Lebensweise.
Dennoch werden die erfolgreichsten Mitglieder der Gilden von unterschiedlichen Arten repräsentiert. So sind dies der Löwe im Krüger-Nationalpark, die Tüpfelhyäne in der Serengeti oder der Rothund in Bandipur.
Bei den fossilen Gilden war diese Struktur allerdings nicht erkennbar. Hier schöpft der Tiger seine Kapazität in allen Gilden am stärksten aus und hat extrem hohe Konkurrenzeffekte (bis zu ca. 98 %) auf die übrigen Gildenmitglieder.
Diese Unterschiede können mit Isolationsbedingungen Javas als Insel zusammenhängen, die sich grundsätzlich auf Strukturen der Säugergemeinschaften auswirken.
Vermutlich konnte der Tiger durch Veränderungen der Körpermasse seine konkurrenzstarke Position in der Großcarnivorengilde Javas halten.
Das entwickelte Modell ermöglicht auch eine Modellierung von Szenarien, die verschiedene Möglichkeiten berücksichtigt. Diese sind vor allem Veränderungen der Populationsgrößen, aber auch Veränderungen der Körpermasse und daraus resultierende Verschiebungen der Beutemassenspektren.
In Beispielen der Trinil-Gilde wird gezeigt, dass die Rolle eines hyper- bzw. hypocarnivoren Homo erectus in der Gilde mit dem entwickelten Modell dargestellt werden kann. Auch lassen sich Szenarien modellieren, in denen ein hyper- bzw. hypocarnivorer Homo erectus in die Gilde eindringt und so die übrigen Mitglieder von bei ihrer Kapazitätsausschöpfung Einbuße hinnehmen müssen.
In dem Szenarium von Trinil wird erkennbar, dass nur ein hypercarnivorer Homo erectus einen starken Effekt auf die Gildenmitglieder hatte. Geht man von einem omnivoren Homo erectus aus, ist der Konkurrenzeffekt geringer und es sind keine Aussterbeereignisse zu erwarten.
Das Modell kann in weiteren Studien zur Testung von Hypothesen zu Aussterbeereignissen Aufklärung bieten. Durch Einbeziehung weiterer Faktoren wie Kleptoparasitismus und interspezifische Tötungen kann es noch erweitert werden. Auch eine Dynamisierung des Modells, die eine kontinuierlich zeitliche Veränderung der Gilden modellieren kann, ist in zukünftigen Studien möglich.
Untersuchungen zur Bedeutung von Superoxid-Dismutasen für die Alterung von Podospora anserina
(2012)
Im Rahmen dieser vorliegenden Doktorarbeit sollte die Bedeutung von Superoxid-Dismutasen für das Resistenzverhalten und den Alterungsprozess bei P. anserina untersucht werden. Folgende Befunde aus den Analysen konnten erhalten werden:
1. Lokalisationsstudien der drei PaSods: Aus den biochemischen und fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen der drei verschiedenen PaSODs geht hervor, dass PaSOD1, eine Cu/ZnSOD, überwiegend im Cytosol und zu einem geringen Anteil im mitochondrialen Intermembranraum lokalisiert ist. Eine der beiden MnSODs, PaSOD2, wird vermutlich zur Abwehr von exogenem Superoxid sekretiert. Bei PaSOD3 handelt es sich um eine mitochondriale MnSOD.
2. Generierung von verschiedenen PaSod-Mutanten: Im Rahmen dieser Arbeit wurden von jeder PaSod mindestens drei unabhängige Überexpressionsstämme, ein GFP-Stamm- und ein Deletionsstamm hergestellt. Weiterhin wurden alle möglichen Doppel-Deletionsstämme und die Dreifach-Deletionsmutante erzeugt. Alle Stämme wurden auf DNA-Ebene verifiziert, zusätzlich wurde die Proteinmenge bzw. –Aktivität überprüft.
3. Einfluss der PaSODs auf die ROS-Toleranz: Die Analysen der ROS-Resistenzen haben gezeigt, dass PaSODs eine wichtige Rolle in der Entgiftung von Superoxiden spielt. So ließ sich bei den Deletionsstämmen der PaSods eine gesteigerte Sensitivität gegenüber Paraquat feststellen. Eine Aufsummierung der Sensitivität gegenüber Paraquat ist bei der PaSod-Tripelmutante (ΔPaSod1/2/3) zu erkennen.
Überraschenderweise kann durch die gesteigerten Mengen an aktiver PaSOD in den Überexpressionsstämmen (PaSod1-3_OEx) keine verbesserte Resistenz gegenüber Paraquat erzielt werden. Darüber hinaus führt die Überexpression des Gens für die mitochondriale SOD, PaSOD3, zu massiven negativen Effekten.
4. Einfluss auf die Lebensspanne: Durch eine fehlende Entgiftung von Superoxid in den PaSod-Deletionsmutanten ist eine Verminderung der Lebensspanne nicht festzustellen. Bei PaSod-Mutantenstämme, die eine erhöhte PaSOD-Aktivität und damit eine gesteigerte Abbaurate des Superoxids aufweisen, kann bei den PaSod1- und PaSod2-Überexpressionsstämmen keine verbesserte Lebensspanne unter den gewählten Standardbedingungen erzielt werden. Vielmehr noch ist die Lebensspanne der PaSod3-Überexpressionsstämme stark reduziert.
5. Einfluss der PaSod-Modulation auf andere Komponenten des ROS-Abbausystems: Die PaSOD-Aktivitäten scheinen miteinander co-reguliert zu werden. Des Weiteren scheint es ein Zusammenhang zwischen den beiden sekretierten Enzymen PaSOD2 und PaCATB zu geben. Deutlich wird auch, dass die Modulation der Superoxid-Dismutasen eine weitreichende Auswirkung auf andere Schutzsysteme hat. Beispielweise konnte gezeigt werden, dass Komponenten des mitochondrialen ROS-Schutzsystems und der Protein-Qualitätskontrolle in den PaSod3-Überexpressionsstämmen verändert sind.
Zusammenfassend lassen die Analysen der PaSod-modulierten Stämme den Schluss zu, dass die Superoxid-Dismutase in P. anserina ein wichtiges Enzym zum Abbau des schädlichen Superoxids darstellt, welches aber nur eine untergeordnete Rolle bei der Kontrolle der Lebensspanne unter den gewählten Wachstumsbedingungen im Labor ausübt. Des Weiteren haben die Analysen gezeigt, dass es durch die Modulation der PaSod-Gene zu weitreichenden Änderungen, die das ROS-Schutzsystem (PaSOD, PaCATB und PaPRX1) sowie die Protein-Qualitätskontrolle (PaHSP60, PaLON und PaCLPP) betreffen, kommt. Welche Auswirkung dabei diese Veränderungen in Bezug auf die Lebensspanne hat, kann nur schwer abgeschätzt werden und muss mit weiteren Untersuchungen geklärt werden.
Ziel dieser Arbeit war es erstmals durch eine Kombination aus chemischer Mutagenese und gezielter genetischer Modifikation (hier: „metabolic engineering“) einen Phaffia-Stamm herzustellen, welcher über die Mutagenese hinaus über eine weiter verstärkte Astaxanthin-Synthese verfügt.
Die von „DSM Nutritional Products“ bereitgestellten chemischen Mutanten wurden analysiert und über einen Selektionsprozess auf Pigmentstabilität und Wachstum hin optimiert, da die Stämme aus cryogenisierter Dauerkultur starke Pigmentinstabilitäten und ein verzögertes Wachstum aufwiesen.
Über eine exploratorische Phase wurde die Carotinoidsynthese analysiert und festgestellt, dass in den Mutanten keine Einzelreaktionen betroffen sind, welche für die Heraufregulierung der Carotinoidsynthese in den Mutanten verantwortlich sind. Hierbei wurden Limitierungen identifiziert und diese durch Transformation von Expressionsplasmiden mit geeigneten Genen aufgehoben, um damit eine noch effizientere Metabolisierung von Astaxanthin-Vorstufen hin zu Astaxanthin zu erreichen. Eine Überexpression der Phytoensynthase/Lycopinzyklase crtYB resultierte in einem gesteigerten Carotinoidgehalt bei gleichbleibendem Astaxanthin- Anteil. Durch eine zweite Transformation mit einer Expressionskassette für die Astaxanthin-Synthase asy konnte der Carotinoidgehalt weiter gesteigert und zusätzlich eine Limitierung der Metabolisierung von Astaxanthin-Vorstufen behoben werden, sodass die Transformante nahezu alle Intermediate der Astaxanthinsynthese zu Astaxanthin metabolisieren konnte (Gassel et al. 2013). Es konnte gezeigt werden, dass auch in den Mutanten, aus Experimenten mit dem Wildtyp bekannte, Limitierungen identifiziert und ausgeglichen werden konnten.
In dieser Arbeit wurde die physiologische Funktion der Klasse I Methyltransferase Rrp8 bei der Ribosomen-Biogenese der Hefe Saccharomyces cerevisiae untersucht. Ziel war es, die Bedeutung des Proteins für die rRNA-Prozessierungsschritte besser zu verstehen und das Substratmolekül zu identifizieren, das durch die katalytische Aktivität von Rrp8p modifiziert wird.
In einer rrp8-ΔC Mutante, bei der die für die C-terminale Methyltransferase-Domäne codierende Sequenz deletiert vorlag, konnte eine leichte Mengenreduktion der 40S Untereinheit gefunden werden, was für eine Beteiligung von Rrp8p an der Biogenese der kleinen Untereinheit sprach. Unter Anwendung eines artifiziellen Tetrazyklin-Aptamer-Systems, das die Regulation der Expression eines spezifischen Gens erlaubt, wurde eine bereits vorher bekannte synthetische Interaktion mit der essentiellen 90SKomponente Nep1p bestätigt. Mit Hilfe dieses Expressionssystems konnte auch für eine reduzierte Expression von Nop14p, einem Interaktionspartner des Nep1-Proteins, eine synthetisch kranke Beziehung mit rrp8-ΔC festgestellt werden. Zusammen mit der Untersuchung des Sedimentationsverhaltens eines markierten Rrp8-Proteins und bekannten Daten aus der Literatur wiesen die genetischen Analysen darauf hin, dass Rrp8p neben dem Einfluss auf späte Reifungsschritte des 90S prä-Ribosoms auch für die frühen Reifungsschritte der 60S Untereinheit wichtig ist. Weitere Interaktionen mit Faktoren, die an der Translation beteiligt sind (TIF4631, DOM34) und die Messung der Translationsaktivität zeigten, dass der Ausfall von Rrp8p nicht nur die Biogenese verzögert, sondern gleichfalls die Funktionsfähigkeit des Ribosoms beeinflusst.
Die in dieser Arbeit durchgeführte phänotypische Analyse einer rrp8-ΔC tc-GAR1 Doppelmutante unterstützte die Vermutung, dass Rrp8p auch frühe Reifungsschritte der 60S Untereinheit beeinflusst. Mit einem in vitro Experiment konnte die Bindung von SAM an Rrp8p gezeigt werden und RP-HPLC Analysen der 25S rRNA verdeutlichten, dass Rrp8p neben dem Einfluss auf die Prozessierungsstelle A2 für die m1A645 Modifikation in Helix 25.1 verantwortlich ist. Die phänotypische Untersuchung einer von P. Kötter und S. Lamberth angefertigten rRNA Mutante (A645U) zeigte, dass die Sequenzveränderung innerhalb der Helix 25.1 der 25S rRNA, die zugleich zum Verlust der Modifikation führt, eine deutliche Auswirkung auf das Zellwachstum und auf das Polysomenprofil hat. Ähnliche Polysomenprofile wurden in den Mutanten rrp8-G209R und rrp8-G209A beobachtet, die ein punktmutiertes Rrp8-Protein exprimieren. Eine reduzierte SAM-Bindungsaktivität des mutierten Proteins führte ebenfalls zu einer reduzierten Menge an m1A645 modifizierter 25S rRNA. Eine im Unterschied zur rrp8-ΔC Mutante auftretende Reduktion der 60S Untereinheit in den Punktmutanten spricht für einen bisher noch unbekannten Einfluss von Rrp8p auf die Biogenese der 60S Untereinheit.
In Zusammenarbeit mit S. Sharma durchgeführte 2D-DIGE Experimente und quantitative Messungen von Transkriptmengen zeigten, dass im Vergleich zu einem Wildtyp-Stamm in einer rrp8-ΔC Mutante einige glykolytische Enzyme in geringerem Maße exprimiert werden, was in Zusammenhang mit einer in höheren Eukaryoten bekannten nukleolären Stressantwort gebracht werden kann. Dies verdeutlicht die komplexe Wechselwirkung zwischen der Ribosomenfunktion und dem Energiemetabolismus.