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Die Autophagie ist ein in Eukaryonten evolutionär konservierter Prozess, bei dem es zu einem lysosomalen Abbau von cytosolischen Bestandteilen kommt. Die dabei entstehenden biochemischen Bausteine stehen anschließend erneut zum Aufbau benötigter Strukturen zur Verfügung. Verschiedene Stimuli, wie beispielsweise Nährstoffmangel, können die Aktivität der Autophagie erhöhen und ermöglicht Zellen dadurch die Aufrechterhaltung der Zellhomöostase, selbst unter Stressbedingungen. Im Verlauf der Autophagie bildet sich eine tassenförmige Doppelmembran-Struktur, das sogenannte Phagophor. Dieses wächst, um das abzubauende Material zu umschließen und wird dabei von sogenannten Atg-Proteinen (autophagy-related genes) prozessiert. Nach der Schließung spricht man vom Autophagosom, welches letztlich mit einem Lysosom verschmilzt und das Autophagolysosom bildet, welches wiederum die eingeschlossenen Bestandteile zerlegt und die recycelten Bausteine freigibt. Die einzelnen Schritte während der Autophagie sind hochgradig durch die Atg-Proteine reguliert. Eines dieser Atg-Proteine, das Atg8, ist an einigen entscheidenden Schritten wie dem Phagophor-Wachstum, der Autophagosom-Reifung sowie der Schließung beteiligt. Während es in Hefen nur ein einziges Atg8-Protein gibt, so zeigt sich in höheren Eukaryonten meist eine gewisse Diversität. So codiert beispielsweise das humane Genom mindestens sechs Atg8-Homologe. Neben den drei Proteinen der LC3-Familie (A, B, C) zählen auch GABARAP, GABARAPL1 und GABARAPL2 dazu. Die Gründe für diese Diversität sind noch nicht vollständig aufgeklärt, weshalb es wichtig ist, möglichst selektive Modulatoren zu entwickeln, um so die Aufgaben der einzelnen Homologen entschlüsseln zu können. Eine weitere wichtige Aufgabe übernimmt Atg8 beim Binden des abzubauenden Materials über sogenannte Autophagie-Rezeptoren, wie beispielsweise p62. Der Bindevorgang beruht dabei auf der Interaktion von p62 mit ubiquitinierten Zellbestandteilen auf der einen Seite und der Interaktion zwischen p62 und LC3 auf der anderen Seite. Letztgenannte beruht auf dem Binden des LIR-Motivs (LC3-interagierende Region) von p62 an die LDS (LIR-docking site) des LC3-Proteins. Das LIR-Motiv zeichnet sich durch Aminosäure-Sequenz D-D-D-W/F/Y-X1-X2-L/I/V aus. Währende die aromatische Seitenkette (W/F/Y) die hydrophobe Tasche 1 (HP1) der LDS besetzt, ragt die aliphatische Seitenkette (L/I/V) in die HP2 hinein. Damit sollte es möglich sein, die LIR-LC3-Interaktion, durch das Besetzen der LDS zu stören bzw. zu inhibieren. Solche Inhibitoren könnten zum einen der weiteren Aufklärung der Prozesse, an denen die Autophagie beteiligt ist, dienen, zum anderen jedoch auch die Untersuchung fehlerhafter Autophagie ermöglichen. Ausgangspunkt für diese Arbeit stellt die Verbindung Novobiocin dar, die im Rahmen eines Mitteldurchsatz-Screenings als potenzieller Inhibitor der LIR-LC3-Interaktion identifiziert und mittels ITC, TSA und 1H-15N-HSQC verifiziert werden konnte. Die Struktur des Novobiocins setzt sich aus dem 3-Amino-4-hydroxy-8-methylcoumarin-Kern, der über eine Amidbindung an 3-iso-Prenyl-4-Hydroxybenzoesäure gebunden ist, sowie einer O-glykosidischen Bindung in Position C7 des Coumarins mit L-Noviose zusammen. Da es sich bei Novobiocin (XL6) um ein verhältnismäßig komplexes Molekül handelt, wurde der Einfluss einzelner funktionellen Gruppen des Moleküls auf die Bindungsaffinität hin untersucht. Hierfür wurden Synthesestrategien sowohl für die Coumarin-Gerüste als auch verschiedene Benzoesäuren entwickelt. Die erhaltenen Verbindungen wurden mittels ITC und TSA untersucht. Dabei wurde die Verbindung MH507 als geeigneter Ausgangspunkt für die Untersuchung der Struktur-Aktivitätsbeziehungen (SAR) bezüglich der Benzamid-Seite identifiziert. Im Rahmen einer ersten SAR-Untersuchung wurden neben verschiedenen 3-Alkyl-benzoesäuren, auch verschiedene divalente Isostere (-O-, -S-, -NHSO2-) der benzylischen Methylengruppe synthetisiert. Diese, sowie kommerzielle Aminosäuren, wurden mit 3-Amino-4,7-dihydroxycoumarin zu den entsprechenden Endverbindungen gekuppelt. Ergänzend dazu wurden auch eine Verbindung mit umgekehrter Konstitution der Amidbindung dargestellt, um den Einfluss der Reihenfolge zu verifizieren. In einer weiteren SAR-Studie wurden Derivate synthetisiert, die zusätzlich eine Funktionalisierung am C7 des Coumarin-Gerüstes über Amidkupplung, Sulfonamid-Bildung bzw. Suzuki-Reaktion erlauben und somit eine Interaktion mit der HP1 ermöglichen könnten. Dafür wurde eine weitere Synthesestrategie zur Darstellung von 7-Nitro- bzw. 7-Brom-3-amino-4-hydroxycoumarinen ausgearbeitet und eine Reihe von Endverbindungen dargestellt. Neben den Coumarin-Derivaten wurden auch vier Peptidomimetika synthetisierten. Hierfür wurde, basierend auf den Interaktionen zwischen dem LIR-Motiv und der LC3 Proteinoberfläche, ein Pharmakophor-Modell erstellt. Neben einem Pentapeptid wurden auch drei Verbindungen dargestellt, die ein 5-Amino 2-methoxybenzohydrazid-Gerüst besitzen. Um die synthetisierten Verbindungen auf ihre inhibitorische Aktivität auf LC3A bzw. LC3B gegenüber dem LIR-Motiv von p62 hin untersuchen zu können, wurde ein HTRF-basierter Verdrängungsassay entwickelt. Dabei diente ein mit dem LIR-Motiv modifiziertes sGFP als FRET-Akzeptor, während das jeweilige Terbium-Kryptat-gelabelte SNAP-LC3-Fusionsprotein als FRET-Donor fungierte. Neben den Titrationsexperimenten zur Bestimmung der IC50-Werte wurden auch die jeweiligen Dissoziationskonstanten (Kd) von LC3A und LC3B gegenüber dem LIR-sGFP-Fusionsprotein bestimmt, um die IC50-Werte in inhibitorische Konstanten (Ki) zu überführen, da diese untereinander besser vergleichbar sind.
Die Verbindung MH209 zeigte die höchste Aktivität auf LC3A bzw. LC3B und besitzt aufgrund der Noviose-Einheit eine gute Wasserlöslichkeit, weshalb sie für die weiteren Untersuchungen ausgewählt wurde. Im Zuge von Kristallisationsexperimenten gelang die Isolierung und Vermessung eines Co-Kristalls von LC3A mit Verbindung MH209. Durch die Kristallstruktur wurden wichtige Einblicke in die intermolekularen Wechselwirkungen der 4-Hydroxycoumarine mit der LC3A- bzw. LC3B-Proteinoberfläche gewonnen und die Bindungsmode aufgeklärt. Diese Erkenntnisse passen gut zu den Ergebnissen aus den durchgeführten TSA-, ITC- und HTRF-Assays, wie beispielsweise der korrekten Konstitution der Amidbindung am C3 des Coumarin-Gerüstes. Mittels ITC wurde die Verbindung MH209 auf ihre Bindungsaffinität gegenüber den anderen humanen Homologen der Atg8-Proteinfamilie hin untersucht. Dabei zeigte sich, dass MH209 abgesehen von LC3A und LC3B keinerlei Aktivität auf den humanen Atg8-Homologen besitzt. Diese Selektivität ist nützlich, um die biologische Bedeutung der Diversität von Atg8-Homologen in höheren Eukaryonten zu untersuchen und Prozesse, in die diese involviert sind, aufzuklären.
Ziel dieser Doktorarbeit war es, die Bedeutung der Kristallstrukturbestimmung aus Pulverdaten (SDPD) herauszuarbeiten und etwaige Grenzen durch neue Methodenentwicklungen zu erweitern, insbesondere bei Analyse der Paarverteilungsfunktion (PDF).
Die Effizienz der SDPD konnte anhand der erfolgreich gelösten Kristallstruktur von Carmustin (1,3 Bis-2-chlorethyl-1-nitrosoharnstoff, C5H9Cl2N3O2) aufgezeigt werden. [CS01]
Die Grenzen der SDPD wurden ausgelotet und erfolgreich erweitert. Nach weit verbreiteter kristallographischer Meinung ist die Strukturlösung mittels des simulierten Temperns (simulated annealing, SA) bei mehr als 25 zu bestimmenden Parametern problematisch oder unmöglich. Die pharmazeutischen Salze Lamivudin-Camphersulfonat (LC) und Aminogluthethimid-Camphersulfonat (AC) konnten, trotz ihrer hohen Anzahl an Freiheitsgraden von 31 für LC bzw. 37 für AC erfolgreich bestimmt werden. Die Strukturlösung von AC war herausfordernd und nicht direkt bei Anwendung der SA-Methode möglich. Nach einer intensiven Fehleranalyse stellte sich heraus, dass nicht die Grenzen der SA-Methode ausschlaggebend für das anfängliche Scheitern der Strukturlösung waren, sondern falsch extrahierte Intensitäten des vorangegangenen Pawley-Fits. Nach Behebung dieser Fehlerquelle war die Strukturlösung von AC problemlos. [CS02]
Mittels SDPD kann die absolute Konfiguration chiraler Verbindungen nicht direkt bestimmt werden. Durch Kristallisation der zu bestimmenden chiralen Verbindung mit einem chiralen Gegenion bekannter Konformation in einer simplen Säure-Base-Reaktion zu einem diastereomeren Salz und nachfolgender SDPD konnte eine neue Methode entwickelt werden, um die Konfigurationsbestimmung aus Pulverdaten zu ermöglichen. Diese Methode wurde anhand der drei pharmazeutischen Salze (R)-Flurbiprofen-(R)-Chinin (FQ), (2R5S)-Lamivudin-(R)-Camphersulfonat (LC) und (R)-Aminogluthethimid-(R)-Camphersulfonat (AC) aufgezeigt: In allen drei Fällen konnte die korrekte Konfiguration des pharmazeutischen Wirkstoffes mit den hierfür entwickelten Kriterien erfolgreich bestimmt werden. [CS03, CS04]
Durch Kombination der klassischen SDPD mit neuen methodischen Ansätzen konnten die Kristallstrukturen der schlecht kristallinen organischen Pigmente 2-Monomethylchinacridon (MMC, C21H14N2O2) und 4,11-Difluorchinacridon (DFC, C20H10N2O2F2) bestimmt werden, obwohl aufgrund ihrer geringen Kristallqualität keine sinnvolle Indizierung möglich war.
Für die Kristallstrukturbestimmung von DFC lieferte der neu entwickelte Global-Fit des Programms FIDEL mögliche Strukturmodelle mit ähnlich guter Übereinstimmung an das experimentelle Pulverdiagramm. Die Rietveld-Verfeinerung der Strukturmodelle in Kombination mit der Anpassung der Kristallstruktur an die PDF-Daten und kraftfeldbasierter Gitterenergieminimierung konnte einen geeigneten Strukturrepräsentanten von DFC liefern. [CS05, CS06]
Im Fall von MMC war eine Kombination der Methoden von Rietveld-Verfeinerung, Verfeinerung an die PDF-Daten und Gitterenergieminimierung zielführend zur Bestimmung der Orientierungs-Fehlordnung von MMC im Kristall. MMC ist hierbei die erste organische Verbindung, deren Fehlordnung durch Anpassung an die PDF bestimmt werden konnte. [CS07]
Große Erfolge konnten bei der Methodenentwicklung der PDF-Analyse erzielt werden. Die Bestimmung von Kristallstruktur organischer Verbindungen durch Anpassung an die PDF ohne vorherige Kenntnis der Gitterparameter oder Raumgruppe wurde durch die Entwicklung des PDF-Global-Fits erreicht. Lediglich die PDF-Kurve und eine Molekülstruktur werden als Input benötigt. Die Strukturlösung beruht auf einem globalen Optimierungs-Ansatz, bei welchem in ausgewählten Raumgruppen Zufallsstrukturen erzeugt werden. Die Zufallsstrukturen werden mit den experi¬mentellen Daten verglichen und entsprechend ihres Ähnlichkeitsindexes, basierend auf der Kreuz-Korrelation, sortiert. [CS08, CS09] Die vielversprechendsten Kandidaten werden in einem einge¬schränkten simulierten annealing-Ansatz an die experimentelle PDF angepasst. Eine nachfolgende Strukturverfeinerung der besten Strukturmodelle liefert die korrekte Kristallstruktur. Der Erfolg des PDF-Global-Fits wurde am Beispiel der Barbitursäure aufgezeigt: Ausgehend von 300 000 Zufallsstrukturen konnte die korrekte Kristallstruktur von Barbitursäure bestimmt werden. Barbitursäure ist hierdurch die erste organische Verbindung, deren Lokalstruktur durch Anpassung an die PDF bestimmt wurde, ohne Input oder Vorgabe von Gitterparametern oder Raumgruppe.[CS10]
Im Rahmen dieser kumulativen Dissertation konnte eine Methode mitentwickelt werden, die die Bestimmung der absoluten Konfiguration pharmazeutischer Verbindungen aus Röntgenpulverbeugungsdaten ermöglicht. Die Methode basiert auf der Bildung von Salzen. Die notwendige Herstellung dieser Salze mit Salzbildnern bekannter Konfiguration wurde hinsichtlich einer minimalen Ansatzgröße optimiert und erlaubt ein Arbeiten mit Mengen von unter zehn Mikrogramm. Die Kristallisation konnte sogar direkt in den Kapillaren für die Aufnahme der Pulverdiagramme durchgeführt werden. Die absolute Konfiguration einiger als Testfälle gewählter pharmazeutischer Wirkstoffe konnte auf diese Art erfolgreich bestimmt werden. Dies stellt eine erfolgreiche Erweiterung bisher verfügbarer Methoden dar.
1,1,3,3-Tetraethyl-5-nitroisoindolin (TENI) und 1,1,3,3-Tetraethyl-5-nitroisoindolin-2-oxyl (TENO) sind Zwischenstufen in der Synthese von RNS-Spinlabeln für die EPR-Spektroskopie. Die Kristallstrukturen beider Verbindungen konnten aus Einkristallbeugungsdaten bestimmt werden. TENI hat einen Schmelzpunkt nahe der Raumtemperatur. TENO hat dagegen einen wesentlich höheren Schmelzpunkt, obwohl das Molekül nur ein Sauerstoffatom zusätzlich hat. Die Kristallstruktur liefert die Erklärung für dieses Phänomen: In der Kristallstruktur von TENI findet sich als stärkste intermolekulare Wechselwirkung eine einzelne schwache, sehr lange Wasserstoffbrückenbindung.
6-Amino-2-iminiumyl-4-oxo-1,2,3,4-tetrahydropyrimidin-5-aminiumsulfat, ein Edukt der Synthese von Leukopterin konnte als Hydrat erhalten werden. Die Kristallstruktur dieses Monohydrats konnte problemlos bestimmt werden, ebenso wie die von synthetisiertem 4-Amino-2,6-dimethylpyrimidin.
Natriumethanolat wurde nach einer 180 Jahre alten Vorschrift von Liebig synthetisiert. Wie die Röntgenpulverdiagramme zeigen, bilden sich dabei jedoch Gemische von verschiedenen Phasen. Die Kristallstruktur von reinem NaOEt konnte aus Pulverdaten bestimmt werden. Ebenfalls wurden ein Diethanolsolvat sowie zwei weitere Phasen identifiziert. Vom Diethanolsolvat NaOEt · 2 HOEt konnten Einkristalle hergestellt und die Kristallstruktur aus diesen bestimmt werden. Die Kristallstrukturen von Natrium-n-propanolat (NaOnPr), Natrium-n-butanolat (NaOnBu) und Natrium-n-amylat (NaOnAm) konnten ebenfalls aus Pulverdaten aufgeklärt werden. Sie weisen ein ähnliches Na-O-Gitter wie Natriumethanolat auf, allerdings kristallisieren sie in der Raumgruppe P 4/n m m. Die abweichende Raumgruppe des NaOEt (P -4 21 m) liegt am sterischen Anspruch der Ethylgruppe. Die längeren Alkylgruppen sind hochgradig fehlgeordnet und somit im Mittel zylinderförmig. Die Ethylgruppe dagegen hat einen weniger symmetrischen Raumbedarf. Die Solvate der Alkalialkoholate wurden mit zunehmender Länge der Alkylketten instabiler. Nichtsdestotrotz konnten drei verschiedene Solvate hergestellt werden: NaOnPr · 2 HOnPr, NaOiPr · 5 HOiPr und NaOtAm · HOtAm. Ihre Kristallstrukturen konnten aus Einkristallbeugungsdaten bestimmt werden. In diesen Strukturen zeigen sich sehr unterschiedliche Strukturmotive, die teilweise die mögliche Existenz weiterer Solvatstufen andeuten.
Die industriellen Rotpigmente Pigment Red 52 und Pigment Red 48 wurden im Labor unter verschiedenen Bedingungen synthetisiert. Dabei wurden neben den kommerziell verfügbaren Phasen einige neue Phasen identifiziert. Erstmals konnten Kristallstrukturen von P.R.52 und P.R.48 bestimmt werden. Von Pigment Red 52 konnte ein bisher unbekanntes Mononatriumsalz hergestellt werden. Von diesem Salz konnte ein DMSO-Solvat-Monohydrat kristallisiert werden. Aus erhaltenen Einkristallen konnte die Struktur bestimmt werden. Von Pigment Red 48 konnte ebenfalls ein bisher nicht literaturbekanntes Mononatriumsalz isoliert werden. Von zwei Hydratstufen dieser Verbindung konnten Einkristalle hergestellt und ihre Kristallstrukturen bestimmt werden. Eine weitere Phase wurde als Anhydrat identifiziert. Vom Di-Natriumsalz des P.R.52 sowie von seinem Calciumsalz wurden insgesamt fünf verschiedene Hydratstufen gefunden. Die Kristallstrukturen dieser Hydrate konnten aus Röntgenpulverbeugungsdaten bestimmt werden. Von einer Hydratstufe konnte ebenfalls ein Einkristall erhalten und die Struktur bestätigt werden. Eine Veröffentlichung ist in Vorbereitung.
Die Isomere des Orangepigments Perinon werden nach gemeinsamer Synthese industriell durch Überführung in „Trennsalze“ getrennt. Weder die Molekülkonstitution der Trennsalz-Ionen, noch die chemische Zusammensetzung der Feststoffe, noch deren Kristallstrukturen waren bisher bekannt. Die industrielle Form des „trans-Trennsalzes“ konnte im Labor hergestellt werden. Eine weitere Phase des trans-Perinontrennsalzes konnte hergestellt und identifiziert werden. Durch die nachfolgende Einkristallstrukturanalyse zeigte sich, dass die Trennsalze eine völlig andere Molekülkonstitution haben, als in der Literatur beschrieben war: Statt eines planaren Perinongerüsts enthält das Trennsalz ein verdrehtes Bis(benzimidazolat)naphthalindicarboxylat-tetraanion, dessen Ladung durch Kalium-Kationen kompensiert wird. Das bisher nie als Feststoff beschriebene cis-Perinontrennsalz wurde hergestellt und kristallisiert. Es konnten Einkristalle hergestellt und die Kristallstruktur aus diesen bestimmt werden. Alle Perinontrennsalze enthalten im Kristallgitter eine beträchtliche Anzahl Wasser- und Ethanolmoleküle. Durch Festkörper-NMR-Spektroskopie konnte gezeigt werden, dass das Wasser-Ethanol-Netzwerk stark dynamisch ist. Bei der Hydrolyse der Trennsalze entstehen wieder die ursprünglichen, wasser- und lösungsmittelfreien Perinonpigmente.
Viele Studien konnten nachweisen, dass die Produktion von cGMP eine entscheidende Funktion im nozizeptiven System einnimmt. Hierbei wurde vor allem die cGMP-Produktion über lösliche Guanylatzyklasen untersucht. Welche Rolle die partikulären Guanlyatzyklasen bei der Entstehung von Schmerzen haben ist weitgehend ungeklärt. Die vorliegende Arbeit zeigte, dass die partikuläre Guanylatzyklase NPR2 stark in DRG-Neuronen exprimiert wird und dort mit cGKI-alpha sowie CRP4 colokalisiert ist. Aktiviert wird NPR2 über den Peptidliganden CNP. Hervorzuheben ist, dass CNP nicht in primär afferenten Neuronen, dafür jedoch vermehrt im Dorsalhorn des Rückenmarks gebildet wird. Tierexperimentelle Untersuchungen zeigten, dass SNS-Npr2-/--Mäuse ein verringertes Schmerzverhalten bei thermischer Stimulation aufwiesen. Während sie im Capsaicin-Test keinen Phänotyp zeigten, wiesen sie in Phase II des Formalin-Modells ein signifikant reduziertes Leckverhalten auf. Diese Ergebnisse liefern Hinweise für eine Beteiligung des CNP/NPR2/cGKI Signalwegs an der Detektion von Hitzeschmerz und an der TRPA1-vermittelten Schmerzantwort. Dabei scheint NPR2 eine pronozizeptive Funktion zu besitzen. CRP4 als Zielprotein scheint hingegen eine antinozizeptive Wirkung zu haben. Zudem kann die Hypothese aufgestellt werden, dass CNP über einen retrograden Transport aus dem Rückenmark die Aktivierung von NPR2 auslösen könnte. Zusammengefasst zeigen die Daten dieser Arbeit, dass eine cGMP-abhängige Aktivierung durch NPR2 primär für die Detektion thermischer Reize zuständig ist, während die Literatur Hinweise darauf gibt, dass lösliche Guanylatzyklasen vor allem an inflammatorischen und neuropathischen Prozessen beteiligt sind. Daher scheinen partikuläre und lösliche Guanylatzyklasen unterschiedliche Eigenschaften im nozizeptiven System zu besitzen.
Die Synthese und Charakterisierung von neuartigen metallorganischen Koordinationsverbindungen hat in den vergangenen Jahrzehnten einen wahren Aufschwung erlebt. Aufgrund ihrer außerordentlichen strukturellen Vielfalt eröffnen sich zahlreiche Anwendungsmöglichkeiten über alle naturwissenschaftlich-technischen Domänen hinweg. Daher besteht ein allgemeines Interesse nicht nur in der Entwicklung neuer Verbindungen und Untersuchungen von Struktur-Eigenschafts-Beziehungen, sondern auch in einer Verbesserung ihrer Darstellungsmethoden.
Diese Dissertation beschäftigt sich mit Koordinationspolymeren und -netzwerken, die aus zweiwertigen 3d-Übergangsmetallhalogeniden (MX2, wie bspw. MnCl2 oder FeBr2) und Pyridin (py) bzw. Pyridinderivaten (CNpy, wie bspw. 3-Cyanopyridin) aufgebaut sind. Die Darstellung der Koordinationsverbindungen erfolgte in erster Linie über gewöhnliche Kristallisationsexperimente in alkoholischer Lösung, bei denen Phasen der Stöchiometrie [MX2(CNpy)4] oder [MX2(CNpy)2]n anfielen. Diese wurden anschließend systematisch erhitzt (“getempert“), was in der Regel zu einer stufenweisen und irreversiblen Abgabe eines Teils der Liganden führte, also bspw. von [MX2(CNpy)2]n zu [MX2(CNpy)1]n. Für diesen sog. „thermischen Abbau“ hat sich die Verwendung eines DTA-TG-Gerätes bewährt. Da die Zielverbindungen als mikrokristalline Pulver anfielen, erfolgte die Bestimmung ihrer Kristallstrukturen auf Basis von Röntgenpulverdaten.
Insgesamt wurden im Rahmen dieser Arbeit 41 neue Phasen synthetisiert und deren Kristallstrukturen aus Röntgenpulverdaten bestimmt. Zusammenfassend ist für die verschiedenen Pyridinderivate folgendes zu konstatieren:
3-Cyanopyridin
Im Falle der MBr2-Serie wurden für M = Mn, Fe, Co und Ni Koordinationsverbindungen der Stöchiometrie [MBr2(3-CNpy)4] erhalten, deren Kristallstrukturen aus diskreten Komplexmolekülen bestehen. Derart ligandenreiche Verbindungen konnten bei keiner der übrigen Serien erhalten werden. Alle Kristallstrukturen der Zusammensetzung [MX2(3-CNpy)2]n zeigen bei M = Mn, Fe, Co, Ni und Cu eine Kettenstruktur, in der die Halogenatome als µ2-Brückenliganden fungieren. Die Ketten weisen eine Fischgrät-Anordnung auf. Im Falle von [ZnX2(3-CNpy)2] werden ausschließlich diskrete Komplexmoleküle beobachtet. In allen Kristallstrukturen der [MCl2(3-CNpy)1]n-Serie liegen Doppelketten mit µ2- und µ3-verbrückenden Cl-Atomen vor. Hingegen weisen die Verbindungen der [MBr2(3-CNpy)1]n-Serie Netzwerkstrukturen auf, in denen, zusätzlich zu µ2-Cl-Atomen, über NCN-Atome gebrückt wird.
3,5-Dicyanopyridin
Aufgrund der umfassenden Erkenntnislage bei [NiCl2(CNpy)x]n und [NiCl(py)x]n- Verbindungen wurde NiCl2 für erste Experimente mit 3,5-Dicyanopyridin als neuem, bifunktionalem Liganden ausgewählt. Erwartungsgemäß führte deren Umsetzung zur Bildung von [NiCl2(3,5-CNpy)2]n, dessen Kristallstruktur das hinlänglich bekannte charakteristische Kettenmotiv aufweist. Thermischer Abbau von [NiCl2(3,5-CNpy)2]n führt indes nicht zur Bildung von [NiCl2(3,5-CNpy)1]n (bzw. grundsätzlich zu [NiCl2(3,5-CNpy)x<2]n (mit bi- oder gar tridentatem Liganden), sondern unmittelbar zur vollständigen Zersetzung in NiCl2 und 3,5-CNpy. Daher sollten weitere Experimente mit NiBr2 als Edukt durchgeführt werden, da in [NiBr2(CNpy)1]n neben Npy auch NCN an Ni-Atome zu koordinieren vermag, wodurch ja deren Netzwerkstrukturen resultieren.
4-Cyanopyridin
Alle Kristallstrukturen der Zusammensetzung [MX2(4-CNpy)2]n zeigen bei M = Mn, Fe, Co, Ni und Cu ebenfalls eine Kettenstruktur, in der die Halogenatome als µ2-Brückenliganden fungieren. Auch in diesen Kristallstrukturen liegt eine Fischgrät-Anordnung der Ketten vor. Im Falle von [ZnX2(4-CNpy)2] werden ausschließlich diskrete Komplexmoleküle beobachtet. In allen Kristallstrukturen der [MX2(4-CNpy)1]n-Serie liegen Netzwerkstrukturen vor, in denen die Metallatome über µ2-Halogenatome und NCN-Atome verbrückt werden. Alle Kristallstrukturen der [MBr2(4-CNpy)1]n-Serie sind charakteristisch fehlgeordnet, da die Orientierung der 4-CNpy-Liganden invertiert wird („Kopf-Schwanz“-Fehlordnung).
Entzündungen sind eine Gegenreaktion des Körpers auf einen schädlichen Stimulus. Eine akute Entzündung zeichnet sich durch typische Zeichen wie Schwellung, Rötung, Überwärmung, Schmerz und eingeschränkter Funktionsfähigkeit aus.Findet die Auflösung der Entzündung nur sehr langsam oder nicht statt, entsteht eine chronische Entzündung. Eine chronische Entzündung kann Auslöser vieler schwerwiegender Krankheiten, wie Diabetes mellitus, Krebs oder kardiovaskulärer Erkrankungen sein. Die symptomatische Behandlung einer chronischen Entzündung erfolgt unter anderem durch NSAIDs. Diese haben bei einer Langzeiteinnahme schwere Nebenwirkungen wie gastrointestinale Blutungen oder nephrotoxische Eigenschaften.NSAIDs greifen in den Metabolismus der Arachidonsäure-Kaskade ein. Die Arachidonsäure wird über mehrere Enzyme metabolisiert, die drei Hauptmetabolismuswege erfolgen über die Cyclooxygenase- (COX), 5-Lipoxygenase- (5-LOX) und Cytochrom P450-Enzyme (CYP450). Studien ergaben, dass die Inhibition eines Metabolismusweges eine Verschiebung der Lipidwerte innerhalb des Arachidonsäurestoffwechsels verursacht. Viele dieser Nebenwirkungen bei einer Langzeitmedikation kommen vermutlich durch die Verschiebung der Metabolite zustande.8 Diese Problematik könnte möglicherweise durch eine Inhibition mehrerer Metabolismuswege umgangen werden. Tierstudien belegen eine bessere Wirksamkeit dualer Inhibitoren gegenüber der Einzelverabreichung von „selektiven“ Inhibitoren und zudem wird ein erhöhtes Sicherheitsprofil für duale Inhibitoren postuliert.9,10 Im Rahmen dieser Arbeit wurden einerseits duale Inhibitoren der löslichen Epoxidhydrolase (sEH) und Leukotrien-A4-Hydrolase (LTA4H) und anderseits der sEH und der 5-Lipoxygenase entworfen, synthetisiert und in vitro gegenüber den betreffenden Enzymen in einem Aktivitätsassay evaluiert.
Es ist gelungen, duale Inhibitoren der sEH und LTA4H mit IC50-Wert im submikromolaren Bereich zu synthetisieren. Dies wurde durch die Erweiterung des Fragments 3-(4-(Benzyloxy)phenyl)propan-1-ol, welches Amano et al. publizierten, bewerkstelligt.11 Die synthetisierten Inhibitoren wurden analytisch charakterisiert und in vitro auf ihr inhibitorisches Potential untersucht. Des Weiteren konnte die Kristallstruktur eines dualen Inhibitors in der Bindetasche der sEH gelöst werden und damit weitere Erkenntnisse über den Bindungsmodus des Inhibitors gewonnen werden. Es konnten auch duale Inhibitoren der sEH und 5-LOX synthetisiert werden und jene auf ihr inhibitorisches Potential untersucht werden. Es wurden einige Inhibitoren mit submikromolaren bis nanomolaren IC50-Werten gegenüber beiden Zielproteinen entworfen, synthetisiert und analytisch charakterisiert. Da mehrere Inhibitoren zwei stereogene Zentren aufweisen, wurde ein Inhibitor mit definierten Stereozentren durch eine asymmetrische Synthese generiert. Ein stereogenes Zentrum wurde über drei Schritte synthetisiert und zum Nachweis der Reinheit des Enantiomeres zum Diastereomer gekuppelt. Per NMR-Spektroskopie wurde das Verhältnis (dr 9:1) der Diastereomere zueinander bestimmt. Das andere stereogene Zentrum wurde mit Hilfe eines Evans-Auxiliar über eine achtstufige Synthese dargestellt und mit dem Enantiomer aus der dreistufigen Synthese verknüpft. Per HPLC konnte ein dr-Verhältnis von 99:1 für den Inhibitor HK330 bestimmt werden. Das andere Diastereomer wurde mittels HPLC aus dem Recemat isoliert. Eine in vitro Evaluation zeigte, dass der Einfluss des stereogenen Zentrums auf das Inhibitionsvermögen marginal ist.
Nach einer Evaluation des Inhibitionsvermögens, der Löslichkeit, der Zelltoxizität, der metabolischen Stabilität und der synthetischen Zugänglichkeit, wurde der Inhibitor HK330 weiter untersucht. In einem Zellassay konnte jener die 5-LOX-Aktivität senken, die 12- und 15-LOX wurde jedoch nicht inhibiert. Des Weiteren wurde der Inhibitor in einer pharmakokinetischen Studie untersucht und erreichte Plasmawerte, die bis zu 4 h in der aktiven Konzentration des Inhibitors lagen. LC-MS/MS Untersuchungen der Plasmaproben ergaben ein erhöhtes EETs/DHETs-Verhältnis, welches die in vivo Inhibition der sEH bestätigt. Die Verbindung HK330 besitzt vielversprechende Eigenschaften und deshalb soll die Wirksamkeit des Inhibitors in einem Tiermodell getestet werden. Geeignete Tiermodelle wie die unilaterale Harnleiterobstruktion (unilateral ureteral obstruction, UUO) in Mäusen könnten Aufschlüsse über die Wirksamkeit von HK330 geben. Denn sowohl die Inhibition der 5-LOX als auch der sEH sind renoprotektiv.12,13 Die profibrinolytischen und anti-inflammatorischen Eigenschaften eines sEH-Inhibitors könnten auch in einem Tiermodell zur gestörten Wundheilung untersucht werden. In einem murinen Ohrwundmodell wurde gezeigt, dass eine Behandlung mit Epoxyeicosatriensäuren (EETs) die Wundheilung signifikant beschleunigte.15 Ramalho et al. zeigten, dass die Leukotriene des 5-LOX-Metabolisimusweges eine verminderte Wundheilung in diabetischen Mäusen (Typ 1) bewirkten.
Funktionelle und strukturelle Charakterisierung von SLC-Transportern in eukaryotischen Systemen
(2018)
Die evolutionäre Voraussetzung für die Entwicklung komplexer, differenzierter Organismen bildet die Separierung der Zelle in Reaktionsräume, die so genannte Kompartimentierung. Das Prinzip der Kompartimentierung ermöglicht zahlreiche lebensnotwendige, biochemische Prozesse, wie die Konservierung von Energie durch Protonengradienten in der Atmungskette oder parallele, gegenläufige Stoffwechselwege. Zelluläre Kompartimente werden häufig durch Biomembranen gebildet, welche aus einer zweilagigen Lipidschicht bestehen. Lipidmoleküle in einer Zelle sind meistens amphipathisch, das bedeutet, sie bestehen aus einer polaren, hydrophilen Kopfgruppe und einem unpolaren, hydrophopen Ende (Abbildung 1). Die Lipidzusammensetzung in einer Biomembran ist sehr divers und unterscheidet sich in verschiedenen Organismen und Organellen. Phosphoglyceride bilden den Hauptbestandteil der Lipidschicht. Phosphoglyceride besteht aus einem Glycerin Rückgrat, welches an dem C1- und C2-Atom mit zwei Fettsäuren verestert und an dem C3-Atom mit einem Phosphorsäurediester verbunden ist. ...
RNA ist vor allem als Vermittler von Erbinformationen bekannt. Doch neben der Translation in Proteine ist sie auch maßgeblich an regulatorischen Prozessen in der Zelle beteiligt. So kommen in vielen Organismen Argonautenproteine vor, die zusammen mit microRNA einen Komplex bilden, der in der Lage ist, mRNA zu spalten oder auf andere Weise deren Translation zu unterdrücken. Da die Deregulierung von microRNA bei verschiedenen Krankheiten wie Krebs, Parkinson oder Alzheimer auftritt, wurden in dieser Arbeit Alkylanzien entwickelt, die zur besseren Inhibierung von microRNA beitragen sollen.
Als Alkylierungsmittel wurden ortho-Chinonmethide verwendet, die zunächst in geschützter Form synthetisiert wurden und nach Aktivierung mit einer Nukleobase reagieren können. Für die Erkennung der miRNA-Sequenz wurden diese zu einem Konjugat mit Peptid-Nukleinsäuren (PNAs) verbunden. Es wurden zwei Arten von Chinonmethid-Präkursoren hergestellt: Mit o Nitrobenzyl photolabil geschützte, die sich mit Licht der Wellenlänge 365 nm aktivieren lassen, und über ein Disulfid geschützte, die mithilfe eines Reduktionsmittels aktiviert werden. Die photolabil geschützten Derivate lassen sich damit gezielt örtlich und zeitlich aktivieren. Vom reduktiv aktivierbaren Präkursor wurden drei Derivate mit sterisch unterschiedlichen Resten am Disulfid (Benzyl-, Isopropyl- oder tert-Butyl-Rest) hergestellt, die einen Einfluss auf die Kinetik der Entschützung haben. Diese Derivate können nach Eintritt in eine Zelle durch die dort vorherrschende hohe Glutathion-Konzentration aktiviert werden, während sie extrazellulär unreaktiv sind.
Zunächst wurde die Kinetik eines photolabil geschützten Konjugats ohne RNA untersucht. Hier kommt es nach Bestrahlung zur Selbstalkylierung, bei der die Nukleobasen der PNA angegriffen werden. Bei 37 °C erfolgte dies mit einer Halbwertszeit von 0.43 h unter Annahme einer Reaktion 1. Ordnung. Die Kinetik der Alkylierung der komplementären RNA ließ sich durch zwei parallel ablaufende Reaktionen 1. Ordnung abbilden. Die Schnelle hatte eine Halbwertszeit von 0.42 h und die Langsame 11 h mit einer Ausbeute von 73 % nach 168 h. Bei Bestrahlung des Konjugats und erst anschließender Zugabe der RNA wurde ebenfalls eine Halbwertszeit von 11 h bei einer einzelnen Reaktionen 1. Ordnung erhalten. Dies lässt sich mit der Reversibilität mancher Reaktionsprodukte erklären. Die schnelle Reaktion entspricht der direkten Reaktion des Chinonmethids mit der RNA, die langsame entsteht durch Umlagerung von reversiblen Addukten.
Die Analyse der RNA-Alkylierung erfolgte mithilfe von denaturierender Polyacrylamid-Gelelektrophorese, bei der in Abhängigkeit der Gel-Temperatur scheinbar unterschiedliche Kinetiken gemessen wurden. Dies ist ebenfalls eine Folge der Reversibilität. Bei 57 °C kann ein Teil der Bindungen zwischen RNA und den Konjugaten brechen und es wird am Anfang der Reaktion eine geringere Ausbeute gemessen als bei 25 °C Geltemperatur. Die Ausbeute nach 168 h änderte sich jedoch nicht, da im Verlauf der Reaktion die reversiblen Addukte in irreversible umgewandelt werden.
Mit miRNA-20a als Ziel wurden mit einem 10mer Konjugat zunächst nur 13 % Ausbeute nach 72 h und mit einem 15mer Konjugat 41 % nach 75 h erreicht. Durch internen Einbau des Chinonmethid-Präkursors in die PNA, sodass es einem Adenosin der RNA gegenübersteht, konnte die Ausbeute auf 75 % nach 72 h gesteigert werden, da Adenosin bevorzugt alkyliert wird.
Bei den reduktiv aktivierbaren Chinonmethid-Präkursoren waren alle synthetisierten Konjugate in Puffer ohne Glutathion (GSH) stabil. Die Reihenfolge der Reaktionsgeschwindigkeit der Disulfidspaltung war bei 0.5 mM und 10 mM GSH: Benzyl > Isopropyl > tert-Butyl. Die Halbwertszeit bei 10 mM GSH betrug weniger als 5 min (Benzyl-Konjugat) bis 2 h (t Butyl Konjugat). Jedoch bildeten sich mit allen Konjugaten bei 10 mM GSH auch Addukte mit GSH.
Die Reaktivitätsreihenfolge blieb bei der Alkylierung von RNA erhalten. Allein das Benzyl-Konjugat erreichte bei einer GSH-Konzentration von 0.5 mM schon die gleiche Reaktionsgeschwindigkeit wie das photolabil geschützte Chinonmethid. Bei 10 mM GSH erreichten die Derivate zwar nach wenigen Stunden ihre maximale Ausbeute, diese betrug jedoch nur 23 % (tert-Butyl-Konjugat) bis 43 % (Benzyl-Konjugat), da die Chinonmethide auch durch GSH als Nukleophil abgefangen werden.
Mit einem Konjugat, das ein photolabiles Chinonmethid sowie Biotin trägt, wurde ein Fluoreszenzpulldown mit Cy5-markierter RNA durchgeführt. Hier zeigte die bestrahlte Probe eine deutlich höhere Fluoreszenz (6.8x), als eine unbestrahlte Vergleichsprobe. Bei einem Pulldown-Versuch mit miRNA-20a bzw. mit RISCs aus HeLa-Zelllysat konnte das Argonautenprotein jedoch nicht eindeutig mittels Westernblot nachgewiesen werden.
Anhand des reduktiv aktivierbaren Benzyl-Konjugats konnte gezeigt werden, dass sich das Konjugat in Zelllysat zersetzt und nur ein Teil zu Addukten mit Nukleobasen reagiert. Die Ursache wurde in der hydrolyselabilen Abgangsgruppe gesehen, sodass weitere photolabil geschützte Derivate mit Dimethylamino-, Trimethylammonium-, Pivaloylester- und Benzoylestergruppe synthetisiert wurden. Von diesen war nur das Benzoylester-Konjugat in der Lage, RNA mit 72 % Ausbeute nach 48 Stunden zu alkylieren. Zudem war es für mindestens 1 h in Zelllysat stabil.