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Modellierung der klimatischen Habitateignung verschiedener krankheitsübertragender Vektorarten
(2018)
Der Klimawandel hat einen starken Einfluss auf die Verbreitungsgebiete von Arten. Infolgedessen kann sich das Verbreitungsgebiet von Arten verschieben, einschränken oder ausweiten. Bei thermophilen Arten wird vermutet, dass sie von den klimatischen Änderungen profitieren und sie sich wahrscheinlich ausbreiten werden. Eine solche Ausbreitung, wozu auch die Einwanderung von gebietsfremden Arten zählt, hätte nicht nur zahlreiche Konsequenzen für diese Ökosysteme, sondern könnte sich auch zu einem ernsten Gesundheitsrisiko entwickeln, wenn es sich bei den einwandernden Neobiota um Vektorarten handelt.
Stechmücken und Sandmücken, als blutsaugende Insekten, zählen zu den bekanntesten Vektorarten. Sie sind in der Lage, eine Vielzahl von Infektionskrankheiten wie das Denguefieber oder das Gelbfieber, aber auch protozoische Parasiten wie "Leishmania"-Arten zu übertragen. Als thermophile Arten sind viele dieser Vektoren aktuell in ihrer Verbreitung weitgehend auf tropische und subtropische Gebiete beschränkt. Eine Einwanderung in gemäßigtere Gebiete kann zu einer Einschleppung der durch sie übertragenden Erreger führen und damit zum Ausbruch von Infektionskrankheiten. Aufgrund der medizinischen Relevanz dieser Arten ist es essentiell, die räumliche Verbreitung, sowie die abiotischen Ansprüche der Vektorarten zu kennen, um deren mögliche Ausbreitung nachzuvollziehen.
Vor diesem Hintergrund beschäftigte sich die vorliegende kumulative Dissertation mit den klimawandelinduzierten Änderungen der Habitateignung verschiedener medizinisch relevanter Vektorarten. Dabei wurden die zwei invasiven Stechmückenarten "Aedes albopictus" (I-III) und "Aedes japonicus" (III), sowie zehn in Europa bereits vorkommende Sandmückenarten der Gattung "Phlebotomus" (IV), untersucht. Die Arbeit basiert auf vier (ISI-) Publikationen. Unter Verwendung ökologischer Nischenmodellierung wurden geeignete Gebiete unter aktuellen und zukünftigen Klimabedingungen bestimmt. Um dabei sowohl räumliche als auch zeitliche Aspekte zu berücksichtigen, wurden mehrere räumliche Skalen (Deutschland und Europa), sowie Zeitperioden (2030, 2050 und 2070) betrachtet. Des Weiteren wurden verschiedene Ansätze (einzelne Algorithmen und Ensemble-Modelle) zur Modellierung der Habitateignung verwendet.
Die Ergebnisse dieser Dissertation zeigen eine zukünftige klimawandelbedingte Ausweitung der geeigneten Gebiete für viele der betrachteten Vektorarten. So konnte gezeigt werden, dass die Habitateignung für "Aedes albopictus" in Deutschland (I) und in Europa (III) zukünftig deutlich zunimmt. Auch für die Sandmückenarten "Phlebotomus alexandri", "Phlebotomus neglectus", "Phlebotomus papatasi", "Phlebotomus perfiliewi" und "Phlebotomus tobbi" konnte eine deutliche Zunahme der klimatisch geeigneten Gebieten projiziert werden (IV).
Lediglich Arten, wie die Asiatische Buschmücke "Aedes japonicus" (III) und auch kältetolerantere Sandmücken, wie "Phlebotomus ariasi" und "Phlebotomus mascittii" (IV) scheinen weniger von diesen klimatischen Veränderungen zu profitieren und könnten in Zukunft sogar aktuell geeignete Gebiete verlieren (klimawandelinduzierte Arealverkleinerung). Bei "Aedes japonicus" konnte dies auf eine engeren Nische mit einem Optimum bei vergleichsweise niedrigen Temperaturen zurückgeführt werden (III).
Am Beispiel von "Aedes albopictus" wurden ferner Umweltfaktoren identifiziert, die die Verbreitung der Art limitieren (II). Als wärmeliebende Art spielen bei "Aedes albopictus" in Mitteleuropa insbesondere die niedrigen Temperaturen eine Rolle, während in Zukunft die Sommertrockenheit in Südeuropa zunehmend eine Rolle spielen könnte.
Nischenmodellierung stellt trotz ihrer vereinfachenden Annahmen und Unsicherheiten, eine hilfreiche Methode zur Untersuchung klimawandelinduzierter Arealverschiebungen dar. Mit Hilfe der Modellierungsergebnisse konnten Gebiete mit einem hohen Etablierungsrisiko für die Vektorarten identifiziert werden, welche daher im Fokus künftiger Überwachungsprogramme stehen sollten. In Zukunft könnten mehr Vektorarten geeignete Bedingungen in Mitteleuropa finden, wodurch die Vektordiversität zunehmen wird. Dadurch könnte auch das Risiko für einen Ausbruch der durch die Vektoren übertragenen Krankheiten steigen.
Auch wenn das Vorhandensein eines kompetenten Vektors eine unerlässliche Voraussetzung für den Ausbruch einer Infektionskrankheit darstellt, gibt es noch weitere Faktoren, wie das Vorhandensein des Erregers. In Bezug auf die Risikoabschätzung vektorassoziierter Krankheiten sollten neben der Verbreitung des Vektors und des Erregers auch die abiotischen Bedingungen für die Entwicklung des Erregers berücksichtigt werden. Neben neu eingewanderten Arten sollten zudem auch die heimischen Arten in Bezug auf ihre Vektorkompetenz untersucht werden, da diese ebenfalls als potentielle Vektoren dienen und somit das Gesundheitsrisiko weiter erhöhen könnten.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden sRNAs des halophilen Archaeons Haloferax volcanii hinsichtlich ihrer biologischen und ihrer regulatorischen Funktion charakterisiert.
Um einen Überblick über die biologischen Funktionen archaealer sRNAs zu erhalten, wurde eine umfassende phänotypische Charakterisierung von 27 sRNA-Deletionsmutanten im Vergleich zum Wildtyp ausgewertet. Im Zuge dieser phänotypischen Charakterisierungen wurden zehn verschiedene Wachstumsbedingungen, morphologische Unterschiede und Veränderungen in der Zellmotilität untersucht. Hierbei zeigten nahezu alle Deletionsmutanten unter mindestens einer der getesteten Bedingungen phänotypische Unterschiede. Durch den Verlust von sRNAs wurden sowohl sogenannte Gain-of-function als auch Loss-of-function Phänotypen beobachtet. Haloarchaeale sRNAs spielen eine wichtige Rolle beim Wachstum mit verschiedenen Salzkonzentrationen, mit verschiedenen Kohlenstoffquellen und beim Schwärmverhalten, sind jedoch weniger in die Adaptation an diverse Stressbedingungen involviert.
Zur näheren Charakterisierung der regulatorischen Funktion archaealer sRNAs wurden sRNA362, sRNAhtsf468 und sRNA479 mittels molekulargenetischer Methoden wie Northern Blot-Analyse und DNA-Mikroarray sowie bioinformatischer in silico-Analyse untersucht. Das Expressionslevel von sRNA362 konnte bestimmt und potentielle Zielgene für sRNAhtsf468 und sRNA479 identifiziert werden.
Eine vorangegangene Studie zeigte den Einfluss von sRNA30 unter Hitzestress und führte zur Identifikation differentiell produzierter Proteine in Abwesenheit der sRNA. In dieser Arbeit wurde mittels Northern Blot-Analysen die Expression der sRNA30 charakterisiert. Das Wachstum in An- und Abwesenheit von sRNA30 wurde bei 42°C und 51°C phänotypisch charakterisiert und der regulatorische Einfluss der sRNA auf die mRNA differentiell regulierter Proteine durch Northern Blot-Analyse überprüft. Eine Transkriptomanalyse mittels DNA-Mikroarray nach Hitzeschock-Induktion führte zur Identifikation differentiell regulierter Gene involviert in Transportprozesse, Metabolismus, Transkriptionsregulation und die Expression anderer sRNAs. Die differentielle Regulation des Proteoms nach Hitzeschockinduktion in An- und Abwesenheit von sRNA30 konnte bestätigt werden.
Desweiteren wurde in dieser Arbeit sRNA132 und deren phosphatabhängige Regulation der Ziel-mRNA HVO_A0477-80 näher charakterisiert. Eine Induktionskinetik nach Phosphatentzug bestätigte die Bedeutung von sRNA132 für die verstärkte Expression des Operons HVO_A0477-80 unter Phosphatmangel-Bedingungen und verwies auf die Existenz weiterer Regulationsmechanismen. Während vor und nach Phosphatentzug kein Unterschied bezüglich der Zellmorphologie von Wildtyp und Deletionsmutante zu erkennen war, führte das Wachstum mit einem starken Phosphatüberschuss von 5 mM zu einer Zellverlängerung der Deletionsmutante. Die Kompetition der nativen 3‘-UTR des Operons HVO_A0477-80 mit einer Vektor-kodierten artifiziellen 3‘-UTR legt eine Regulation über die Bindung von sRNA132 an die 3‘-UTR nahe. Der Transkriptomvergleich nach Phosphatentzug in An- und Abwesenheit von sRNA132 führte zur Identifikation des Phosphoregulons der sRNA. Zu diesem Phosphoregulon gehören unter anderem zwei Glycerinphosphat-Dehydrogenasen, Transkriptionsregulatoren, eine Polyphosphatkinase und eine Glycerolphosphodiesterase. Zudem waren die Transkriptlevel der beiden ABC-Transporter HVO_A0477-80 und HVO_2375-8 für anorganisches Phosphat und des Transporters HVO_B0292-5 für Glycerinaldehyd-3-Phosphat in Abwesenheit der sRNA verringert. Die beiden ABC-Transportsysteme für anorganisches Phosphat wurden im Rahmen dieser Arbeit deletiert und weiter charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass das ABC-Transportsystem HVO_2375-8 bei geringen Phosphatkonzentrationen leicht induziert wird und das Transkriptlevel in Anwesenheit von sRNA132 erhöht ist. Wachstumsversuche der jeweiligen Deletionsmutante in direkter Konkurrenz mit dem Wildtyp zeigten, dass keiner der beiden ABC-Transporter den anderen vollständig ersetzen kann und der Wildtyp mit beiden intakten ABC-Transportern unter phosphatlimitierenden Bedingungen einen Wachstumsvorteil besitzt. In silico-Analysen der Promotorbereiche von sRNA und ABC-Transporter legen zudem die Existenz von P-Boxen nahe.
Im Kindes- und Jugendalter gehoert das Rhabdomyosarkom zu den haeufigsten Weichteilsarkomen. Bisher belaeuft sich das Therapieverfahren auf chirurgische Entfernung, gefolgt von Chemotherapie, bzw. bei nicht-operablen Faellen auf Radiotherapie und Chemotherapie, jedoch haben sich die Ueberlebenschancen fuer Patienten mit einer Erkrankung in metastasiertem oder rezidiviertem Stadium trotz intensiver Forschung ueber mehrere Jahrzehnte hinweg kaum gebessert und bleiben bei unter 30%. Neue therapeutische Strategien versuchen das Immunsystem des Patienten zu modulieren und dieses gezielter oder aggressiver gegen Tumorzellen zu machen. Nebst direkter Injektion von Zytokinen oder Antikoerpern bietet die adoptive Immunzelltherapie einen vielversprechenden Ansatz. In der vorliegenden Arbeit lag der Fokus auf Natuerlichen Killer- (NK) Zellen, da diese ein hohes zytotoxisches Potential gegenueber Tumorzellen aufweisen. Eine der groessten Herausforderungen der NK-Zellforschung ist die Breitstellung ausreichender Mengen an NK-Zellen mit optimaler antitumoraler Funktion fuer den klinischen Einsatz. Viele aktuell erprobte NK-Zellexpansionsstrategien basieren auf der Verwendung von Hilfs- oder Feeder-Zellen (Versorgerzellen), die jedoch vor der Applikation in Patienten aus dem finalen Produkt entfernt werden muessen. In der vorliegenden Arbeit sollten Feeder-zellfreie NK-Zellexpansionsprotokolle unter Verwendung von Gammakettenzytokinen getestet werden.
Interleukin (IL-) 15 erwies sich dabei vor allem fuer die Vermehrung der NK-Zellen als besonders foerderlich. Im Vergleich dazu fielen die Expansionsraten mit IL-2 oder IL-21 geringer aus. Interessanterweise wurde der expansionsfoerdernde Effekt von IL-15 durch dauerhafte Anwesenheit von IL-21 im Kulturmedium gehemmt. Ein kurzer, dreitaegiger IL-21-Boost am Ende der Expansionsphase wirkte sich wiederum positiv auf die NK-Zellexpansionsraten aus. Zudem zeigte sich durch IL-21 ein vermehrtes Auftreten von NK-Zellen des reiferen CD16posCD56dim Phaenotyps, der die zytotoxische Funktion vermittelt. Bei Degranulationsuntersuchungen wurden eine IL-21-induzierte Exozytoseaktivitaet und die vermehrte Ausschuettung von Perforin und Granzym B, welche Apoptose in den Zielzellen ausloesen, beobachtet. Vor allem der dreitaegige Boost mit IL-21 bewirkte eine gesteigerte Zytotoxizitaet gegenueber Tumorzellen, insbesondere gegenueber Rhabdomyosarkomzellen.
Auf dieser Grundlage bot es sich an fuer die NK-Zellexpansion ein Zwei-Phasen-Protokoll anzuwenden, bestehend aus einer initialen Proliferationsphase mit IL-15 und einem anschliessendem IL-21-Boost, durch den die antitumorale Funktionalitaet der NK-Zellen gesteigert wurde. Dieses IL-15+21boost-Protokoll wurde mit anderen Kombinationen aus den Gammakettenzytokinen IL-2, IL-15 und IL-21 verglichen und stellte sich hinsichtlich der NK-Zellexpansionsraten, der Degranulationskapazitaet und der damit verbundenen Zytotoxizitaet als den anderen Protokollen ueberlegen heraus.
Zytokinexpandierte NK-Zellen zeigten eine hoehere Rezeptorexpression an ihren Oberflaechen als unstimulierte Zellen. Die Expansion mit dem IL-15+21boost-Protokoll bewirkte die hoechste Dichte des Todesrezeptors TRAIL, jedoch auch der inhibitorischen KIR2D-Rezeptorfamilie. Fuer andere Oberflaechenmarker ergab sich jeweils eine mittlere Expressionsdichte verglichen mit dem IL-15- bzw. dem IL-15+21-Expansionsprotokoll. Die Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen wie Interferon-gamma (IFN-g) und Tumor-Nekrose-Faktor-alpha (TNF-a) wurde zudem verstaerkt durch IL-21 angeregt, aber ebenso die Sekretion des immunsupprimierenden IL-10.
Weiter wurden die zytoinexpandierten NK-Zellen zur UEberpruefung ihrer in vivo Funktionalitaet anhand eines praeklinischen Xenograftmodells unter Verwendung von NOD SCID IL-2-Rgamma-/- (NSG) Maeusen und der Technologie der in-vivo-Biolumineszenzbildgebung getestet. Dabei konnte beobachtet werden, dass die NK-Zellen das Wachstum luciferaseexprimierender humaner Rhabdomyosarkome verlangsamten. Die Wirksamkeit der IL-15+21boost-expandierten NK-Zellen zeigte sich vor allem in einem kombinierten Ansatz, bei dem die Tumore zunaechst mit ionisierender Strahlung behandelt wurden und residuale Rhabdomyosarkomzellen anschliessend durch den adoptiven Transfer von humanen NK-Zellen in ihrem Wachstum gehemmt waren, solange die NK-Zelltherapie andauerte. Somit stellte sich die Kombination aus Bestrahlung und NK-Zelltransfer als wirksamer im Einsatz gegen Rhabdomyosarkome heraus als die alleinige Behandlung der Tumore durch Radiotherapie.
Zusammengefasst konnte in dieser Arbeit ein NK-Zellexpansionsprotokoll entwickelt werden, dass durch den ausschliesslichen Einsatz von Gammakettenzytokinen zu einem funktionalen NK-Zellprodukt fuehrte, welches auch in vivo lytische Aktivitaet gegenueber Rhabdomyosarkomzellen aufwies.
In der vorliegenden dreiteiligen Studie werden Mongolische Wüstenrennmäuse untersucht, deren Hörspektren im tieffrequenten Bereich und deren Unterscheidungsfähigkeiten von Kommunikationsrufen denen des Menschen ähneln. Die extrazelluläre Aktivität im primären auditorischen Kortex (AI) der narkotisierten Versuchstiere, evoziert durch Reintöne und arteigene Kommunikationsrufe, wird in der linken (LH) und rechten Gehirnhemisphäre (RH) aufgenommen. Es werden Multikanalelektroden (16 Eingangskanäle) verwendet, welche eine simultane Aufnahme der neuronalen Aktivitäten aller kortikalen Schichten ermöglichen. Zur Analyse der neuronalen Mechanismen werden Wellenformen einzelner Elektrodenkanäle und Aktivitätsprofile, bestehend aus den Wellenformen aller Elektrodenkanäle in einem Zeitfenster von 600 ms, auf Ebene von Aktionspotentialen (MUA), lokalen Feldpotentialen (LFP) und Current-source-density (CSD) Analysen, untersucht. Während MUAs die neuronalen Aktionspotentiale im Nahfeld der Elektrode reflektieren, umfassen die LFPs die summierten Potentiale (inhibitorisch und exzitatorisch) von Neuronen eines größeren Areals. Die CSDs hingegen werden durch die Integration von LFP-Wellenformen benachbarter, linear angeordneter Elektrodenkanäle berechnet und ermöglichen so eine Lokalisation der Ursprünge geräuschspezifischer Aktivitätsflüsse.
Im ersten Teilprojekt werden CSD-Profile in Antwort auf unterschiedliche Reintöne untersucht, um die Aktivitätskomponenten, die so genannten Sinks, für weiterführende Analysen zu quantifizieren. Es können zwei primäre (s1 und s2), drei mittlere (s3-s5) und vier späte (s6-s9) Sinks in einem Zeitfenster von 600 ms definiert werden. Eine Veränderung der Stimulusfrequenz eine Oktave über und unter der charakteristischen Frequenz (CF), beziehungsweise des Lautstärkepegels = 24 dB über der minimalen Schwelle, führt zu qualitativen Veränderungen in der CSD-Profilstruktur. Die Sink s7 wird durch Stimuli mit niedrigem Lautstärkepegel weniger verlässlich evoziert, wohingegen die Sink s9 bei Stimuli eine Oktave über der CF verlässlicher evoziert wird. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass im AI die spektralen Informationen eine Oktave über und unter der CF asymmetrisch integriert werden.
Auf Einzelschichtebene konnte bereits gezeigt werden, dass spektrotemporale Eigenschaften von Stimuli durch MUAs schlechter reflektiert wurden als durch LFPs, was vermutlich eine direkte Konsequenz der unterschiedlichen Ursprünge der Signaltypen ist. Daher werden im zweiten Teilprojekt die spezifischen Unterschiede der MUA-, LFP- und CSD-Antworten auf Ebene kortikaler Schichten und kompletter laminarer Profile untersucht, um die Unterschiede und den Informationsgehalt der drei Signaltypen zu charakterisieren. Signifikante Unterschiede, welche durch zwei Reintöne und sieben Kommunikationssignale evoziert werden, können verstärkt im mittleren und späten Latenzbereich und in granulären und infragranulären Schichten vorgefunden werden. Der Grad der Rufspezifizität ist in LFP und CSD-Antworten im Vergleich zu demjenigen in MUA-Antworten größer. Die Segregationsleistung ist im Vergleich zu einzelnen kortikalen Schichten in den von kortikalen Kolumnen abgeleiteten laminaren Profilen um den Faktor 1,8-2,6 erhöht. Die Neuronenpopulationen einzelner kortikaler Kolumnen sind vermutlich wichtig für die Kodierung von Geräuschen, welche sich in ihren spektrotemporalen Eigenschaften unterscheiden.
Viele vorangegangene Studien konnten zeigen, dass die Gehirnhemisphären akustische Signale asymmetrisch verarbeiten. Daher werden im dritten Hauptteil die laminaren Profile der LH und RH quantitativ und statistisch verglichen. Die MUA-, CSD-Profile und im geringeren Maße auch die LFP-Profile zeigen systematische Unterschiede auf signifikantem Niveau in der Dauer, Onset Latenz und vertikalen Ausdehnung bestimmter Aktivitäten. Kommunikationsrufe evozieren in der LH, welche beim Menschen auf Sprachstimuli spezialisiert ist, im Vergleich zur RH komplexere CSD-Profile. Die neuronale MUA-, LFP- und CSD-Aktivitätsstärke ist in der RH für weniger komplexe Stimuli teilweise signifikant erhöht. Die Asymmetrie in der Auftrittsverlässlichkeit der Sink s6 lässt vermuten, dass sich die intrakolumnäre Vernetzung in Schicht VIa zwischen der LH und RH unterscheidet. Die wenigen, signifikanten und nicht systematischen Unterschiede zwischen den Sink-Parametern der LH und RH nach kortikaler Ausschaltung mit dem GABAA-Rezeptor Agonist Muscimol weisen darauf hin, dass die Hemisphärenasymmetrie durch Prozesse des ipsilateralen Kortex maßgeblich beeinflusst wird.
Ziel dieser Dissertation war es, die biologische Rolle der Autophagie für die Entwicklung, Alterung und mitochondriale Qualitätskontrolle in dem Ascomyceten Podospora anserina zu untersuchen. Folgende Ergebnisse wurden dabei erzielt:
1. Der Verlust einer funktionalen Autophagie-Maschinerie ist in P. anserina mit einem Defekt der Sporen-Entwicklung bzw. -Keimung charakterisiert.
2. Es konnten drei Methoden zur Untersuchung der Autophagie in P. anserina etabliert werden: 1) Die Verwendung eines Gfp::PaAtg8-Stamms ermöglicht die Fluoreszenzmikroskopische Bestimmung der Autophagosomen-Anzahl; 2) Die phänotypische Charakterisierung des PaAtg1-Deletionsstamms unter verschiedenen Stressbedingungen (z. B. Stickstoffmangel, Rapamycin) liefert Hinweise auf eine mögliche Autophagie-abhängige Stressadaption; 3) Die Verwendung des „GFPcleavage assays“ ermöglicht einen quantitativen Nachweis genereller und selektiver Autophagie (hier: Mitophagie).
3. In zwei voneinander unabhängigen Experimenten wurde ein altersabhängiger Anstieg der Autophagie für P. anserina demonstriert: Das Autophagie-Niveau nimmt in gealterten P. anserina-Kulturen zu. Gleichzeitig resultiert der Verlust der Autophagie in ∆PaAtg1 in eine reduzierte Lebensspanne. Unter Stressbedingungen (hier: Stickstoffmangel) wird dieser positive Einfluss der Autophagie auf die Lebensspanne im Wildtyp sogar noch verstärkt.
4. Der unerwartet „gesunde“ Phänotyp der PaSod3-Deletionsmutante ist abhängig von einer funktionalen Autophagie-Maschinerie. Der Mitophagie wurde eine besondere Rolle als Kompensationsmechanismus für den Verlust von PaSOD3 zugeteilt, da das Mitophagie-Niveau in dieser Mutante erhöht ist. Am Beispiel dieser Mutante, für die ein erhöhter Superoxid-Ausstoß nachgewiesen wurde, konnte eine Dosis-abhängige Wirkung von ROS in P. anserina identifiziert werden. Eine geringe zelluläre ROSMenge verursacht eine mitohormetische Reaktion, die eine Induktion der Mitophagie zur Folge hat und sich positiv auf den Organismus auswirkt. Übersteigt die zelluläre ROS-Dosis einen kritischen Punkt, kommt es zur Induktion des autophagischen Zelltods und damit zum vorzeitigen Tod des Individuums.
5. Der Verlust der PaCLPXP-Protease führt zu Beeinträchtigungen in der Funktion und Zusammensetzung der mitochondrialen Atmungskette. Dieses Defizit im Energiemetabolismus wird über eine Induktion der AOX, vor allem aber über eine ZUSAMMENFASSUNG 127 gesteigerte Autophagie kompensiert. Die deutlich verlängerte Lebensspanne der verschiedenen PaClpXP-Deletionsmutanten (∆PaClpX, ∆PaClpP und ∆PaClpXP) ist abhängig von einer funktionalen Autophagie-Maschinerie. Interessanterweise konnte keine kompensatorische Funktion der Autophagie oder Mitophagie für den Verlust der mitochondrialen i-AAA-Protease PaIAP in P. anserina nachgewiesen werden.
Autophagie/Mitophagie stellt einen übergeordneten Qualitätskontrollmechanismus in P. anserina dar, der den Organismus sehr effektiv vor zellulären Schäden und Dysfunktionen bewahrt und einen positiven Einfluss auf die Alterung, Entwicklung und Energieversorgung einnimmt.
Die mitochondriale Innenmembran (IM) besteht aus zwei Subkompartimenten. Der
Cristae Membran (CM) und der inneren Grenzmembran (IBM), welche durch die runden und
schlitzartige Strukturen der Christa Junctions (CJs) verbunden werden Der MICOS-Komplex
ist an den CJs lokalisiert und besteht aus mindestens 6 Komponenten, Mic60, Mic27, Mic26,
Mic19, Mic12 und Mic10. Es ist bekannt, dass der MICOS-Komplex essentiell für die Stabilität der CJs ist. Die in dieser Arbeit gezeigten Ergebnisse, geben Aufschluss darüber, wie sich
einzelne MICOS-Komponenten auf die Stabilität von Cristae und CJs im Modellsystem Hefe (S
cerevisiae) auswirken. Zu Beginn dieser Arbeit war zum einen bekannt, dass die MICOSKomponente
Mic60 essentiell für die Bildung von CJs ist. Zum Anderen wurden im Vorfeld
dieser Arbeit Interaktionen von Mic60 mit Proteinen in der mitochondrialen Außenmembran,
vor allem Proteinkomplexe mit ȕ-barrel-Proteinen identifiziert. Diese Interaktionen werden
über den evolutionär, konservierten C-Terminus von Mic60 vermittelt.
ȕ-barrel Proteine besitzen eine charakteristische Peptidsequenz, die ȕ-Sequenz. Diese
dient nach dem Import der ȕ-barrel Proteine in die Mitochondrien als Signalpeptid für den
SAM-/TOB-Komplex, welcher daraufhin die Proteine in die Außenmembran insertiert. In
dieser Arbeit wurde ebenfalls eine ȕ-Sequenz im C-Terminus von Mic60 identifiziert, diese
zeigte einen Einfluss auf die Cristae-Stabilität. Zellen die eine Mic60-Variante mit einer
Deletion oder Punktmutation der ȕ- Domäne exprimieren, zeigten eine reduzierte Anzahl an
CJs. Auch das Verkürzen des C-Terminus von Mic60 hatte diesen Effekt auf die mitochondriale
Ultrastruktur. So konnte gezeigt werden, dass die ȕ-Domäne und die Integrität des C-Terminus
essentiell für die Stabilität von CJs sind.
Der Fokus dieser Arbeit lag in der Charakterisierung der MICOS-Komponenten Mic26
und Mic27. Es konnte bewiesen werden, dass beide Proteine genetisch mit der MICOSKernkomponente
Mic60 interagieren. Die Untersuchung der mitochondrialen Ultrastruktur von
Δmicβ6- und Δmicβ7-Zellen zeigte, dass eine Deletion vom Mic26 keinen Einfluss auf die
Organisation der mitochondrialen Innenmembran hat. Im Gegensatz dazu, ist im Vergleich zum
Wildtyp die Anzahl an CJs in Δmicβ7-Zellen um zwei Drittel reduziert. Auch die
Innenmembranoberfläche ist in diesen Zellen stark vergrößert. Die Untersuchung der
Morphologie der mitochondrialen Innenmembran in Zellen ohne Mic27 durch KryoElektronentomographie
isolierter Mitochondrien, veranschaulichte die Struktur der CJs in
diesen Zellen genauer. Es zeigten sich hier breitere CJs, und der Übergang von der
Cristaemembran in den Bereich der inneren Grenzmembran ist sehr flach und undefiniert. In
Wildtyp-Mitochondrien waren die CJs schmal und schlitzartig und haben einen scharfkantigen
Übergang von der Cristaemembran zur inneren Grenzmembran. Des Weiteren wies die
Cristaemembran in Δmicβ7-Zellen unregelmäßige zackige Strukturelemente auf, was auf eine
Anhäufung an Dimeren der F1FO-ATP Synthase hinweist.
Diese Beobachtungen in den Kryo-Tomogrammen, wurde durch Analysen des sich deutlich weniger höhere Oligomere und vermehrt Dimere. So kann aus diesen Befunden
geschlossen werden, dass Mic27 die Oligomere der F1FO-ATP Synthase stabilisiert.
Um zu untersuchen, wie der MICOS-Komplex mit der F1FO-ATP Synthase in
Verbindung steht, wurde mittels 2D-BNE-Analysen und einem Complexome Profiling die
Komplexierung der nativen Komplexe in Wildtyp- und Δmicβ7-Mitochondrien analysiert. Zum
einen konnte durch diese Untersuchungen gezeigt werden, dass Mic27 neben der F1FO-ATP
Synthase auch stabilisierend auf den MICOS-Komplex wirkt. Die Komplexe im
hochmolekularen Bereich der MICOS-Komponenten zerfielen in Δmicβ7-Zellen, was darauf
hinweist, dass die anderen MICOS-Komponenten hier nicht mehr assemblieren können. Mic10
war die einzige MICOS-Komponente die in Δmicβ7-Zellen noch stabile Komplexe im hohen
Massenbereich ausbildete. Mic10 findet sich zudem nicht nur in Klustern mit anderen MICOSKomponenten
sondern auch mit der F1FO-ATP Synthase.
Die Interaktion von Mic10 und der F1FO-ATP Synthase wurde auch biochemisch,
mittels chemischer Quervernetzern und Ko-Immunpräzipitationsexperimenten bestätigt. Dies
legt nahe, dass Mic10 die CJs mit hoher Wahrscheinlichkeit, durch die Verbindung mit der
F1FO-ATP Synthase, mit der Cristaemembran verbindet und so stabilisiert.
Aufgrund der Erkenntnisse dieser Arbeit konnte ein neuartiges Modell postuliert
werden. Die MICOS-Komponente Mic60 stabilisiert die CJs durch eine Interaktion seines CTerminus
mit Proteinen in der Außenmembran. Mic27 vermittelt über Mic10 die Interaktion
zur F1FO-ATP Synthase. Somit ist diese neu identifizierte Interaktion des MICOS-Komplex zur
F1FO-ATP Synthase essentiell für die Stabilität von CJs ist, indem es den MICOS-Komplex mit
den Oligomeren der F1FO-ATP Synthase verbindet.
Oligomerisierungszustands der F1FO-ATP Synthase in Δmicβ7-Zellen, bestätigt. Hier fanden
sich deutlich weniger höhere Oligomere und vermehrt Dimere. So kann aus diesen Befunden
geschlossen werden, dass Mic27 die Oligomere der F1FO-ATP Synthase stabilisiert.
Um zu untersuchen, wie der MICOS-Komplex mit der F1FO-ATP Synthase in
Verbindung steht, wurde mittels 2D-BNE-Analysen und einem Complexome Profiling die
Komplexierung der nativen Komplexe in Wildtyp- und Δmicβ7-Mitochondrien analysiert. Zum
einen konnte durch diese Untersuchungen gezeigt werden, dass Mic27 neben der F1FO-ATP
Synthase auch stabilisierend auf den MICOS-Komplex wirkt. Die Komplexe im
hochmolekularen Bereich der MICOS-Komponenten zerfielen in Δmicβ7-Zellen, was darauf
hinweist, dass die anderen MICOS-Komponenten hier nicht mehr assemblieren können. Mic10
war die einzige MICOS-Komponente die in Δmicβ7-Zellen noch stabile Komplexe im hohen
Massenbereich ausbildete. Mic10 findet sich zudem nicht nur in Klustern mit anderen MICOSKomponenten
sondern auch mit der F1FO-ATP Synthase.
Die Interaktion von Mic10 und der F1FO-ATP Synthase wurde auch biochemisch,
mittels chemischer Quervernetzern und Ko-Immunpräzipitationsexperimenten bestätigt. Dies
legt nahe, dass Mic10 die CJs mit hoher Wahrscheinlichkeit, durch die Verbindung mit der
F1FO-ATP Synthase, mit der Cristaemembran verbindet und so stabilisiert.
Aufgrund der Erkenntnisse dieser Arbeit konnte ein neuartiges Modell postuliert
werden. Die MICOS-Komponente Mic60 stabilisiert die CJs durch eine Interaktion seines CTerminus
mit Proteinen in der Außenmembran. Mic27 vermittelt über Mic10 die Interaktion
zur F1FO-ATP Synthase. Somit ist diese neu identifizierte Interaktion des MICOS-Komplex zur
F1FO-ATP Synthase essentiell für die Stabilität von CJs ist, indem es den MICOS-Komplex mit
den Oligomeren der F1FO-ATP Synthase verbindet.
Die Psoriasis vulgaris (PsV) ist eine immunvermittelte entzündliche Erkrankung der Haut mit einer Prävalenzrate von 2-3 %, sodass etwa zwei Millionen Menschen in Deutschland an dieser erkrankt sind. Charakteristisch für die PsV sind veränderte Hautareale (Plaques), die im Rahmen der der entzündungsbedingten Durchblutungssteigerung gerötet erscheinen und eine silbrig-weiße Schuppung als Resultat einer vermehrten Abschilferung abgestorbener Keratinozyten aus der hyperproliferativen Epidermis aufweisen.
In dieser Arbeit wurde die Bedeutung des proinflammatorischen Zytokins granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) in der Pathogenese einer modellhaften Experimentalerkrankung der PsV untersucht. GM-CSF wird unter anderem von Interleukin (IL-) 17 produzierenden T-Helferzellen (Th17-Zellen) sezerniert, deren pathogenetische Bedeutung für die PsV gut etabliert ist. Die pathogene Wirkung von GM-CSF als Effektorzytokin konnte bereits in Tiermodellen anderer Th17-vermittelter Autoimmunerkrankungen wie der multiplen Sklerose und der rheumatoiden Arthritis (RA) gezeigt und die therapeutische Wirkung von GM-CSF-neutralisierenden Antikörpern in klinischen Studien an RA-Patienten demonstriert werden.
Das in dieser Arbeit angewendete murine Krankheitsmodell der Imiquimod (IMQ-) induzierten psoriasiformen Dermatitis wird durch die topische Anwendung des Medikaments Aldara®, dessen Wirkstoff IMQ ist, ausgelöst und führt zu einer Entzündung der Haut, die in vielen Aspekten dem humanen Krankheitsbild einer PsV ähnelt. Die pathogenetische Bedeutung von GM-CSF für die IMQ-induzierte psoriasiforme Dermatitis wurde über zwei unterschiedliche experimentelle Ansätze untersucht. So wurde GM-CSF in C57Bl/6J Mäusen mittels eines spezifischen, rekombinanten murinen Antikörpers in der Induktionsphase des Krankheitsmodells neutralisiert und zeitgleich der modifizierte Psoriasis Area Severity Index (PASI-)Score als Parameter des Schweregrades der klinischen Manifestationen ermittelt. Des Weiteren wurde am Versuchsende die Infiltration von Immunzellen in das entzündete Gewebeareal untersucht. Diese Ergebnisse wurden mit den Daten einer Behandlungsgruppe, nach Applikation eines IgG-Isotyp identischen Kontrollantikörpers verglichen. Dabei zeigte die Neutralisierung des Zytokins einen therapeutischen Effekt, der in einem signifikant niedrigeren PASI-Score, einer verringerten Tnfa mRNA Expression und einer reduzierten Infiltration mit neutrophilen Granulozyten resultierte.
Parallel zu diesen Versuchen wurde die Modellerkrankung auch in einer GM-CSF-defizienten C57Bl/6J Mauslinien (GM-CSF-/-) studiert. Die funktionelle Inaktivität des GM-CSF-kodierenden Csf2 Gens wurde 1994 durch gezielte genetische Manipulation etabliert. Unter den experimentellen Bedingungen war der Schweregrad der IMQ-induzierten psoriasiformen Dermatitis in GM-CSF-/- Mäusen nicht signifikant different von dem der wildtypischen (Wt) Mäuse und zeigte somit im Gegensatz zu den Ergebnissen aus den Versuchsreihen der Antikörper vermittelten Zytokinneutralisierung keinen offensichtlichen Hinweis auf eine GM-CSF-Abhängigkeit. In den GM-CSF-defizienten Tieren war jedoch nach IMQ-Induktion eine signifikant höhere Il6 und Il22 mRNA Expression am Entzündungsort im Vergleich zu den Wt Mäusen auffällig. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde der Phänotyp der GM-CSF-defizienten Mäuse genauer untersucht und eine vermehrte Anzahl plasmazytoider dendritischen Zellen (pDCs) in Milz und Lymphknoten nachgewiesen. Diese Zellen werden im Rahmen ihrer Differenzierung aus Vorläuferzellen durch GM-CSF suppressiv reguliert und sind sowohl in die Entwicklung der PsV im Menschen als auch die Pathogenese der IMQ-induzierten psoriasiformen Dermatitis involviert. Aufgrund des in den sekundären lymphatischen Organen GM-CSF-defizienter Mäuse expandierten pDC-Kompartiments wurde die Beteiligung dieser Zellen in der Initiationsphase des Modells analysiert. Im Vergleich mit GM-CSF-suffizienten C57Bl/6J Mäusen weisen die Tiere der GM-CSF-defizienten Mauslinie zu diesen Zeitpunkten eine verstärkte Infiltration von pDCs in die Haut auf. Für pDCs ist bekannt, dass sie über die Produktion von IL-6 und TNF die Effektorzelldifferenzierung aktivierter, naiver T-Lymphozyten in Richtung Th22-Zellen polarisieren können. Dieser Mechanismus liefert ein hypothetisches Konzept, das die Ergebnisse zur gesteigerten IL-6-Produktion und Differenzierung IL-22-produzierender T-Zellen in IMQ-behandelten GM-CSF-/- Mäusen im Kontext der nachweisbaren Expansion von pDCs, erklären könnte. Dieser in den GM-CSF-/- Mäusen nachweisbare alternative Pathogenesemechanismus, ist offenbar geeignet die proinflammatorische Wirkung des genetisch fehlenden Zytokins zu kompensieren, aber hinsichtlich seiner Etablierung über ein verändertes pDC-Kompartiment von Dauer und Ausmaß der GM-CSF-Defizienz abhängig. So erklärt sich, warum die zeitlich limitierte Antikörper vermittelte GM-CSF-Neutralisierung in GM-CSF-suffizienten-Mäusen zu keiner pDC-Expansion und Steigerung von IL-6 und IL-22 Expression nach IMQ-Induktion führt.
Die GM-CSF-Neutralisierung durch einen rekombinanten murinen Antikörper reduziert deutlich die Krankheitsschwere der IMQ-induzierten psoriasiformen Dermatitis und belegt damit das therapeutische Potenzial dieses Therapieansatzes für die Humanerkrankung der PsV. Die unter angeborener GM-CSF-Defizienz in den Studien darüber hinaus aufgedeckten Veränderungen des pDC-Kompartiments sind von potenzieller Relevanz für zukünftige therapeutische Anwendungen dieses Prinzips, da unter einer dauerhaften GM-CSF-Neutralisierung mit therapeutischen Antikörpern ein Monitoring dieser Zellpopulation empfehlenswert erscheint z.B. über veränderte Interferonsignaturen durch pDCs, um mögliche Wirkverluste, aber auch unerwünschte Effekte zu erkennen.
RNA-Aptamere sind kurze einzelsträngige Oligonukleotide, die ein Zielmolekül spezifisch erkennen und über ihre 3D-Struktur binden. Die Identifizierung von Aptameren erfolgt mittels in vitro Selektion nach dem Kriterium einer hohen Bindungsaffinität und/oder -spezifität. Das Tetracyclin-bindende Aptamer gehört zu den Aptameren mit der höchsten bekannten Liganden-Affinität. Darüber hinaus gehört es zu den wenigen RNA-Aptameren, die in vivo als artifizieller Riboswitch zur Modulation der Genexpression eingesetzt werden können. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde das Tetracyclin-bindende Aptamer mittels NMR-spektroskopischer und biophysikalischer Methoden im ligandfreien sowie im ligandgebundenen Zustand untersucht, um neben der bereits bekannten Kristallstruktur des RNA-Tetracyclin-Komplexes Aufschlüsse über den dynamischen Ligandenbindungsprozess und die damit verbundene genregulatorische Aktivität des Aptamers zu erhalten. Hierfür wurde der Einfluss von Mg2+-Ionen auf die globale und lokale Strukturausbildung des ligandfreien Aptamers analysiert. Durch die Bindung von Mg2+-Ionen an die RNA wird eine kompakte RNA-Struktur stabilisiert, die neben zahlreichen komplexen Tertiärinteraktionen eine starre Bindungstasche ausbildet, in der der Ligand nach einem „Schlüssel-Schloss-Prinzip“ bindet. Die Ligandbindung zieht nur noch kleinere strukturelle Änderungen nach sich. Mittels der Stopped-Flow-Technik wurden die kinetischen Aspekte der Ligandbindung in Abhängigkeit der Mg2+-Konzentration untersucht. Diese Methode ermöglichte die Analyse der Zusammenhänge zwischen RNA-Faltung und anschließender Komplexbildung in Echtzeit. Die Analyse der Stopped-Flow-Messungen ergab, dass die Geschwindigkeit des Ligandbindungsprozesses wesentlich von der Mg2+-induzierten Strukturausbildung abhängig ist. Die Mg2+-vermittelte globale Organisation der RNA-Struktur ist somit der geschwindigkeitsbestimmende Schritt des Ligandbindungsprozesses. Die RNA-Mg2+-Interaktionen bestimmen also nicht nur die 3D-Struktur des Tetracyclin-bindenden Aptamers, sondern auch die Kinetik des Ligandbindungsprozesses. Der detaillierte Vergleich des Tetracyclin-Aptamers in seiner ligandfreien und ligandgebundenen Form ergab, dass trotz der stark ausgeprägten strukturellen Ähnlichkeit, lediglich die ligandgebundene Form in einer thermisch stabilen Konformation vorliegt. Die signifikante Erhöhung der Thermostabilität durch die Ligandbindung ist die essentielle Voraussetzung für die genregulatorische Funktion des Aptamers. Basierend auf diesen Ergebnissen ist also nicht die Struktur, sondern die strukturelle Stabilität ausschlaggebend für die regulatorische Aktivität des Tetracyclin-bindenden Aptamers.
Ein weiterer Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Charakterisierung des Bindungsmodus von GTP an die GTP-bindenden Aptamere 9-4, 10-10, Klasse II und Klasse V. Durch den direkten NMR-spektroskopischen Nachweis von Wasserstoffbrückenbindungen konnte eine intermolekulare G:C-Watson-Crick-Basenpaarung zwischen GTP und den GTP-bindenden Aptameren 9-4, 10-10 und Klasse II gezeigt werden. Basierend auf diesen Ergebnissen konnte durch eine C zu U Mutation die Bindungsspezifität des Aptamers Klasse II von GTP zu 2-Amino-ATP verändert werden.
Weiterhin konnte im Rahmen dieser Arbeit ein intermolekularer G-Quadruplex als Ligandbindungsmodus zwischen GTP und dem GTP-bindenden Aptamer Klasse V beschrieben werden. Hierbei bildet GTP mit sieben Guanin-Basen der RNA eine intermolekulare G-Quadruplexstruktur, bestehend aus zwei übereinanderliegenden Guanin-Tetraden, aus. Durch den Einsatz von 15N-markiertem NH4+ konnte eine spezifische Kaliumbindungsstelle im Zentrum der Quadruplexstruktur lokalisiert werden, die zur Stabilisierung des RNA-Ligand-Komplexes dient. Die beobachteten NOE-Kreuzsignale zwischen den Protonen des gebundenen NH4+ und den Protonen der RNA bestätigten dabei die Ausbildung eines intermolekularen G-Quadruplexes. Zusätzlich ergab die Analyse der NMR-Spektren, dass die G-Quadruplexstruktur erst im Zuge der Ligandbindung ausgebildet wird. Die Bildung eines G-Quadruplexes, in der der Ligand einen integralen Bestandteil der Quadruplexstruktur darstellt, ist ein bislang unbeschriebener Bindungsmechanismus.
Die Verarbeitung während des Hörprozesses von Säugetieren verläuft von der Kochlea mit den inneren und äußeren Haarsinneszellen (äHZ) über afferente Nervenbahnen bis zum auditorischen Kortex (AK). Die daran beteiligten Schaltstationen und deren Funktion sind überwiegend aufgeklärt. Die Hörbahn ist zudem in besonderer Weise durch efferente Rückkopplungen gekennzeichnet, die interne Modulationen sowie sekundäre Reaktionen auf den Reiz ermöglichen. Anatomisch betrachtet verlaufen efferente Projektionen vom AK zu sämtlichen am Hörprozess beteiligten Kerngebieten. Vom Olivenkomplex erfolgt über mediale und laterale Fasern eine Innervation der äHZ bzw. des Hörnervs. Trotz der gut beschriebenen Anatomie ist die funktionelle Beziehung zwischen dem AK und der Peripherie weitgehend ungeklärt. In der vorliegenden Arbeit wurde der funktionelle Zusammenhang vom AK zu den äHZ in der mongolischen Wüstenrennmaus untersucht. Dafür wurde entweder eine pharmakologische Blockierung der Kortexaktivität durch den Natriumkanalblocker Lidocain erzeugt oder eine Aktivierung der Kortexaktivität durch die Anwendung elektrischer Reize ausgelöst. Der Einfluss der Manipulationen wurde in der Kochlea mittels Messungen von Distorsionsprodukt-otoakustischen Emissionen (DPOAE) erfasst. Diese entstehen durch die nichtlineare Verstärkung leiser Schallsignale durch die äHZ zur Erzielung hoher Sensitivität und Frequenzauflösung. Die DPOAE treten als kubische (z. B. 2f1-f2) und quadratische (z. B. f2-f1) Verzerrungen auf und geben Aufschluss über unterschiedliche Parameter der äHZ-Verstärkungsfunktion.
Die Lidocainversuche wurden entweder kontra- oder ipsilateral zur DPOAE-Messung durchgeführt. In beiden Konstellationen traten nach der Lidocaininjektion Erhöhungen und Verringerungen der DPOAE-Pegel im Vergleich zur Basismessung oder unveränderte DPOAE-Pegel auf. Im Mittel lagen die Pegeländerungen bei ca. 11 dB, in Einzelfällen betrugen sie bis zu 44,8 dB. In den Gesamtdaten waren die Effekte nach kontralateraler Injektion oft signifikant größer als nach ipsilateraler Injektion. Ebenso waren die Effekte in der 2f1-f2 Emission meist signifikant größer als in der f2-f1 Emission. Zudem wurde beobachtet, dass signifikant größere Effekte bei einer Stimulation mit Pegeln von 60/50 dB SPL im Vergleich zu 40/30 dB SPL erreicht wurden. Grundsätzlich trat in allen Datensätzen eine Reversibilität der DPOAE-Pegel mit zunehmender Versuchsdauer auf. Die Effekte waren direkt nach der Injektion am größten und erreichten je nach Stimuluspegel und Emissionstyp nach 28-100 min die Basispegel. In keinem der Datensätze lag eine Abhängigkeit der im Kortex gereizten charakteristischen Frequenz (CF) zum betroffenen Frequenzbereich in der Kochlea vor. Die Effekte waren über den gesamten gemessenen Frequenzbereich von 1-40 kHz nachweisbar. Allerdings waren die Frequenzbereiche von 1-10 kHz und 30,5-40 kHz besonders stark von der Lidocaininjektion betroffen.
Auch nach der elektrischen Reizung wurden die drei oben beschriebenen Effekttypen definiert. Mit 54,6 % war der Prozentsatz unveränderter DPOAE-Pegel allerdings sehr hoch. In den anderen beiden Kategorien konnten zusätzlich Differenzierungen im zeitlichen Verhalten der DPOAE-Pegel vorgenommen werden. In 21,6 % bzw. 16,5 % der Datensätze waren die Verringerungen bzw. Erhöhungen bis zum letzten gemessenen Zeitpunkt nach der elektrischen Reizung irreversibel und nur in jeweils 2,8 % der Datensätze war eine Reversibilität zu verzeichnen. In diesen Fällen war die Effektdauer mit im Mittel 31 bzw. 25 min kürzer als in den Lidocainversuchen. Auch die Effektstärken waren mit maximal 23,9 dB und je nach Effekttyp im Mittel 5,1-13,7 dB geringer als nach der Lidocaininjektion. Die größten Effekte traten in einem mittleren Stimuluspegelbereich von 45-55 dB SPL auf. Wiederum konnte keine Abhängigkeit des betroffenen Frequenzbereichs von der kortikal gereizten CF nachgewiesen werden. In Einzelfällen waren auf DPOAE-Ebene nur die Frequenzen ober- und unterhalb der kortikalen CF beeinflusst, wohingegen bei der CF selbst keine Effekte auftraten.
Durch Kontrollexperimente (Salineinjektion bzw. Einführen der Elektrode ohne elektrische Reizung) konnte nachgewiesen werden, dass die Effekte durch die Manipulation der Kortexaktivität hervorgerufen wurden. Somit liegt eine funktionelle Beziehung zwischen dem AK und der Peripherie vor, die langanhaltende massive Ausmaße annehmen kann. Die Effektrichtung ist vermutlich durch die exzitatorisch oder inhibitorisch wirkenden Neurone vom Colliculus inferior zum Olivenkomplex bedingt. Die größeren Effekte in der kontralateralen Konfiguration lassen sich durch die Diskrepanz in der Anzahl der gekreuzten (2/3) und ungekreuzten (1/3) medialen Efferenzen erklären. Die kubischen Komponenten der äHZ-Verstärkungsfunktion scheinen stärker beeinflusst zu sein als die quadratischen Komponenten, was in größeren Pegeländerungen in der 2f1-f2 Emission resultiert. Die teils großen Effektstärken sowie die nicht vorhandene Frequenzabhängigkeit zwischen AK und Kochlea sind vermutlich auf den großen Kortexbereich zurückzuführen, der von den gewählten Injektionsvolumina bzw. elektrischen Reizstärken betroffen war. Die großen Effekte im mittleren Stimuluspegelbereich lassen sich sowohl mit einer möglichen Schutzfunktion der Efferenzen vor zu lauten Schallereignissen als auch mit einer Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses zur erleichterten Detektion akustischer Signale in Einklang bringen. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die Aktivität des AK einen starken Einfluss auf periphere auditorische Mechanismen hat, wodurch die kochleäre Verarbeitung akustischer Signale je nach kortikalem Verarbeitungsstatus massiv modifiziert werden kann.
Fossile Rohstoffe dienen in unserer heutigen Gesellschaft als Energiequelle und als Rohstofflieferant für Grund-, Feinchemikalien und Pharmazeutika. Sie tragen jedoch zum Klimawandel und Umweltverschmutzung bei. Lignocellulosische Biomasse ist eine erneuerbare und nachhaltige Alternative, die durch biotechnologische Prozesse erschlossen werden kann. Die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae ist ein sehr gut untersuchter Modellorganismus, für den es zahlreiche genetische Werkzeuge und Analysemethoden gibt. Zudem wird S. cerevisiae häufig in biotechnologischen Prozessen eingesetzt, da diese Hefe robust gegenüber industriellen Bedingungen wie niedrigen pH-Werten, toxischen Chemikalien, osmotischem und mechanischem Stress ist. Die Pentose D-Xylose ist ein wesentlicher Bestandteil von lignocellulosischer Biomasse, die aber nicht natürlicherweise von der Bäckerhefe verwerten werden kann. Für eine kommerzielle Herstellung von Produkten aus lignocellulosischer Biomasse muss S. cerevisiae D-Xylose effektiv verwerten. Für die Bäckerhefe konnten heterologe Stoffwechselwege etabliert werden, damit diese D-Xylose verwerten kann. Für eine effiziente Xyloseverwertung bleiben dennoch zahlreiche Herausforderungen bestehen. Unter anderem nehmen die Zellen D-Xylose über ihre endogenen Hexosetransporter nur langsam auf. Die heterologe Xylose-Isomerase (XI) besitzt in S. cerevisiae eine geringe Aktivität für die Isomerisierung von D-Xylose. Unspezifische Aldosereduktasen konkurrieren mit der Xylose-Isomerase um das gleiche Substrat und produzieren Xylitol, ein starker Inhibitor der Xylose-Isomerase. Eine Möglichkeit die Umsatzrate von Enzymen zu steigern und Substrate vor Nebenreaktionen zu schützen, ist die Anwendung von Substrate Channeling Strategien. Bei Substrate Channeling befinden sich die beteiligten Enzyme in einem Komplex, wodurch die Substrate lokal angereichert werden und von einem aktiven Zentrum zum nächsten weitergeleitet werden, ohne Diffusion in den restlichen Reaktionsraum. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob ein Komplex zwischen einem membranständigen Transporter und einem löslichen Enzym konstruiert werden kann, um durch Substrate Channeling eine verbesserte Substrat-Verwertung zu erreichen. Die Xylose-Isomerase aus C. phytofermentans und die endogene Hexose-Permease Gal2 sollten in dieser Arbeit als Modellproteine in S. cerevisiae-Zellen mit Hilfe von Protein-Protein-Interaktionsmodulen (PPIM) in räumliche Nähe zueinander gebracht werden.
Die Expression verschiedener PPIM konnte in S. cerevisiae mittels Western Blot nachgewiesen werden. Auch Fusionsproteine aus unterschiedlichen PPIM wurden in dieser Hefe exprimiert. Die PPIM binden komplementäre PPIM oder kurze Peptidliganden, welche an die Xylose-Isomerase und an den Gal2-Transporter fusioniert wurden. Die Funktionalität beider Proteine wurde mittels in vivo und in vitro Tests untersucht. Die Xylose-Isomerase mit N-terminalen Liganden des WH1-Protein-Protein-Interaktionsmoduls (WH1L-XI) und der Gal2-Transporter mit N-terminalen SYNZIP2-Protein-Protein-Interaktionsmodul (SZ2-Gal2) erwiesen sich als geeignete Kandidaten für weitere Untersuchungen. Mittels indirekter Immunfluoreszenz konnte die Ko-Lokalisierung von SZ2-Gal2 und WH1L-XI, die einander über ein Scaffold-Protein binden, nachgewiesen werden.
Transformanten, in denen ein Komplex aus Transporter, Scaffold-Protein und Xylose-Isomerase gebildet wurde, zeigten bessere Fermentationseigenschaften gegenüber der Scaffold-freien Kontrolle und dem Wildtyp: Sie verwerteten Xylose schneller, bildeten weniger vom unerwünschten Nebenprodukt Xylitol, produzierten mehr Ethanol und wiesen eine höhere Ethanolausbeute auf. Der beobachtete Substrate Channeling Effekt kompensierte die geringere Enzymaktivität der WH1L-XI im Vergleich zum Wildtyp-Protein. Die Wirksamkeit des Substrate Channeling wurde verringert, wenn die Bildung des Komplexes aus Transporter, Scaffold-Protein und Xylose-Isomerase gestört wurde, indem ein getaggtes GFP mit dem Scaffold-Protein um die Bindungsstelle an Gal2 konkurrierte. Dies zeigt, dass die positive Wirkung auf die Komplex-Bildung zwischen XI und Gal2 zurück zu führen ist. Die Fermentationseigenschaften konnten gesteigert werden, indem der zuvor zwischen SZ2-Zipper und Gal2-Transporter verwendete Linker, der aus zehn Aminosäuren von Glycin, Arginin und Prolin (GRP10) bestand, durch einen aus Glycin und Alanin (GA10) ersetzt wurde. Die verbesserten Fermentationseigenschaften beruhten auf einem Substrate Channeling Effekt und einer gesteigerten Aufnahmerate des SZ2-GA10-Gal2-Transporters. Ein Vergleich der Strukturvorhersagen von SZ2-GRP10-Gal2 und SZ2-GA10-Gal2 zeigte, dass der GRP10-Linker einen unstrukturierten, flexiblen Linker ausbildet, während der GA10-Linker eine starre α-Helix ausbildet. Die Struktur und der Transportprozess von Gal2 sind nicht aufgeklärt. Bei verwandten Transportern geht man davon aus, dass Substrate durch Konformationsänderungen ins Innere der Zelle transportiert werden, indem die beiden Domänen gegeneinander klappen. Die α-Helix könnte die Geschwindigkeit der Konformationsänderungen begünstigen.
Durch Kontrollexperimente konnte ausgeschlossen werden, dass die gesteigerten Fermentationseigenschaften eine Folge der Stabilisierung der XI- und Gal2-Fusionsproteine durch das Anfügen des Liganden oder durch Komplexbildung mit dem Scaffold-Protein waren. Substrate Channeling zwischen Gal2 und XI entsteht durch die Komplexbildung mit dem Scaffold-Protein, wodurch sich Gal2 und XI in räumlicher Nähe zueinander befinden. Dieser Effekt beruht möglicherweise zusätzlich aufgrund einer hohen örtlichen Ansammlung dieser Proteine, da die tetramere XI weitere Scaffold-Proteine binden könnte, welche weitere Gal2-Transporter binden könnte. Darüber hinaus sammeln sich Transporter an bestimmten Orten der Membran an und Transporter mit ähnlicher oder gleicher Transmembransequenz tendieren dazu zu ko-lokalisieren. Hierdurch könnten Gal2-XI-Agglomerate entstehen und Xylose wird mit hoher Wahrscheinlichkeit von einer der vielen Xylose-Isomerasen umgesetzt.