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Das Glykoprotein AICL gehört zur Familie der C-Typ Lektin-ähnlichen Rezeptoren und wird nach Aktivierung humaner NK Zellen und Makrophagen auf deren Oberfläche exprimiert. Die Bindung von AICL an den genetisch gekoppelten, aktivierenden NKRezeptor NKp80, der auf allen reifen humanen NK Zellen exprimiert ist, induziert Effektorfunktionen von NK Zellen, wie Zytotoxizität und Zytokinsekretion. AICL Glykoproteine werden in ruhenden NK Zellen intrazellulär zurückgehalten und gelangen erst nach Zellaktivierung an die Oberfläche (Klimosch et al. 2013). Der Mechanismus dieser Regulation ist bisher unbekannt und sollte im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden, um weitere Einblicke in die Funktion des NKp80-AICL Rezeptor-Ligand-Paares im Rahmen einer Immunantwort zu ermöglichen.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass nach der Aktivierung von NK Zellen sowohl präformierte im Golgi-Komplex zurückgehaltene als auch de novo synthetisierte AICL Glykoproteine an die Zelloberfläche gelangen. Bei der intrazellulären Retention von AICL handelt es sich um eine intrinsische Eigenschaft von AICL, die auch im ektopen Kontext von Insektenzellen auftritt. Mechanistisch konnte gezeigt werden, dass die N-Glykosylierungen von AICL differentiell die AICLOberflächenexpression bestimmen. Die AICL Ektodomäne wird an einer nichtkonventionellen (N-X-C) und an drei konventionellen (N-X-S/T) N-Glykosylierungsstellen glykosyliert, wobei die Glykosylierung an ersterer ineffizient ist, sodass stets zwei Glykoisoformen vorhanden sind. Während die Glykosylierung zumindest einer konventionellen Stelle essenziell für die AICL-Oberflächenexpression ist, und diese mit zunehmender Glykosylierung konventioneller Stellen zunimmt, vermindert die nichtkonventionelle Glykosylierungsstelle die AICL-Oberflächenexpression. Für eine effiziente Oberflächenexpression ist auch die Ausbildung einer nicht-konservierten Disulfidbrücke erforderlich, die im membran-distalen Bereich der C-Typ Lektindomäne AICL-Homodimere miteinander verknüpft. Das Fehlen dieser Disulfidbrücke führt auch zu dem Verlust der NKp80-Bindung. Die intrazelluläre Reifung von AICL Glykoproteinen ist, im Gegensatz zu dem verwandten Glykoprotein KACL, in besonderem Maße abhängig von der Interaktion mit den ER-ständigen Proteinen der Proteinqualitätskontrolle. Insbesondere konnte mit Hilfe massenspektrometrischer Analysen eine starke Interaktion von AICL mit dem ER Chaperone Calnexin gezeigt werden. Entsprechend ist die zelluläre Expression von AICL in Abwesenheit von Calnexin stark reduziert. Massenspektrometrisch konnte auch eine spezifische Interaktion von AICL mit dem Protein ITM2A gezeigt werden, wobei allerdings eine funktionelle Relevanz in Folgeversuchen nicht bestätigt werden konnte. Schließlich konnte eine zusätzliche Regulation der AICL-Oberflächenexpression durch proteasomale Degradation nachgewiesen werden, die über zwei Lysine im kurzen zytoplasmatischen Bereich von AICL bestimmt wird.
Frühere Untersuchungen hatten eine Bindung von sowohl AICL- als auch NKp80-Ektodomänen an K562 Zellen, eine Erythroleukämie-zelllinie, ergeben. Da K562 Zellen weder NKp80 noch AICL exprimieren, handelt es sich bei der gebundenen Struktur um einen potenziellen weiteren Liganden des NKp80-AICL Rezeptor-Ligand-Paares. Hier konnte gezeigt werden, dass es sich bei der Bindestruktur um ein Oberflächenprotein der K562 Zellen handelt, das allerdings nicht identifiziert werden konnte.
Insgesamt konnten im Rahmen dieser Arbeit mehrere AICL-spezifische, molekulare Mechanismen identifiziert und charakterisiert werden, die die aktivierungsabhängige Oberflächenexpression von AICL regulieren. Offensichtlich unterliegt diese einer strikten Kontrolle auf mehreren Ebenen, was vermutlich mit der Funktion von AICL als Ligand für einen aktivierenden Immunrezeptor auf zytotoxischen NK Zellen erklärbar ist. Weitere Untersuchungen zur AICL-Expressionsregulation und zur Funktion des NKp80-AICL Rezeptor-Ligand-Paares in vivo sind erforderlich, um ein besseres Verständnis der Immunbiologie von NK Zellen zu erreichen.
Auswirkung der Chemisorption von Organothiolaten auf den elektrischen Widerstand dünner Goldfilme
(2018)
Hochgeordnete Monolagen von Organothiolaten auf Goldoberflächen bilden sich bei Kontakt einer Goldoberfläche mit einer Lösung eines Thiols oder Thioacetats spontan aus. Die Adsorption auf dünnen Metallfilmen mit Schichtdicken im Bereich von 25 - 100 nm führt zu einer Änderung des elektrischen Widerstandes des Films, die an Goldfilmen mit Schichtdicken von 25 - 40 nm über eine einfache Zweipunktmessung verfolgt wurde. Die Proportionalität der Widerstandsänderung mit der Menge an adsorbiertem Material konnte für die in dieser Arbeit verwendeten Dünnschichtsensoren bestätigt werden. Zu diesem Zweck wurden gleichzeitig Widerstands- und Oberflächenplasmonenresonanzmessungen an 40 nm starken Goldfilmen durchgeführt. In diesen Experimenten zeigt sich die Widerstandsmessung zur Beobachtung der Adsorptionskinetik als die überlegene Technologie.
Die durch Mikrokontaktdrucken und Freiätzen der gedruckten Strukturen hergestellten Sensoren zeigen eine individuelle Signalintensität. Die Normierung auf die maximale, durch Belegung mit Hexadecanthiol (HDT) oder Dodecanthiol erreichte, Signalstärke ermöglichte den Vergleich der maximalen Signalstärke von Thiolatmonolagen, die durch Belegung mit n-Alkanthiolen (CH_3(CH_2)_(n-1)-SH mit n = 12, 16, 19, 22 und 33, Cn), 11-Mercaptoundecyl-hexaethylenglycol (HSC11EG6OH), Adamantan-1-thiol (AdaSH), Triptycenthiol (TrpSH), Anthracen-2-thiol (Ant-0SH), Anthracen-2-alkanthiolen (Ant-(CH_2)_n-SH mit n = 1 - 5 und 10, Ant-nSH), p-Terphenyl-4-thiol (TP0SH), p-Terphenyl-4-alkanthiolen (TP-(CH_2)_n-SH mit n = 1 - 4, TPnSH) und p-Terphenyl-4-ethanthioacetat (TP2SAc) erzeugt wurden. Die Größe der Widerstandsänderung zeigt eine deutliche Abhängigkeit vom organischen Rest des Oberflächenadsorbats. Für die Verstärkung des Signals wurde die folgende Reihenfolge gefunden: Trp > Ada > Ant-0 > Ant-1 > TP0 > TP1 > Ant-2 > TP2 > Cn (n = 12 - 33) = C11EG6OH = Ant-n (n = 3 - 11) = TPn (n = 3, 4). Bei bekannter Verstärkung des Signals durch ein Adsorbat kann unabhängig von der Oberflächenrauigkeit die Oberflächenbedeckung durch Chemisorbate in einer Güte bestimmt werden, die der durch STM- und TEM-Messungen erreichten vergleichbar ist. Die Methode wurde angewendet, um Schichten von TP2SH und TP2SAc, die bei 20 und 60 °C aus ethanolischer Lösung abgeschieden wurden, zu vergleichen. Die Unterschiede in der Oberflächendichte, die durch eine Erhöhung der Abscheidungstemperatur zu beobachten sind, können durch eine Beschleunigung der Reaktion nach Arrhenius erklärt werden. Auch die Temperaturabhängigkeit der Abscheidungsgeschwindigkeit von HDT aus ethanolischer Lösung an Goldoberflächen, die in einem Bereich von -10 °C bis +30 °C betrachtet wurde, ist mit dem Arrhenius'schen Ansatz konform. Die Aktivierungsenergie der Adsorption von HDT auf Gold wurde auf E_a = 23 +-6 kJ/mol bestimmt.
Die Konzentrationsabhängigkeit der Abscheidung aus ethanolischer Lösung an Goldoberflächen wurde für HDT, AdaSH, TP2SH und TP2SAc untersucht. Um eine Präadsorption der Thiole vor dem eigentlichen Start der Messung zu verhindern, wurde eine Apparatur mit einem Diaphragma aus Aluminium entwickelt, das beim Start der Messung mit dem Sensor durchstoßen wird. Mit Ausnahme von TP2SH zeigen alle Adsorptive ein Adsorptions-Desorptions-Gleichgewicht. Die Adsorptionsisothermen bei 20 °C lassen sich am besten durch die Freundlich-Isotherme beschreiben. Während die Reaktionsordnung im Adsorbat für die Adsorption der Thiole nahe an 1 liegt, hat sie für die Adsorption von TP2SAc einen Wert von ca. 1/4. Damit ergibt sich für die Geschwindigkeitskonstante der Adsorption k_a(HDT) = (2,3 +-0,2) 10^4 L/(mol s), k_a(AdaSH) = (6,1 +-0,2) 10^4 L/(mol s), k_a(TP2SH) = (7,3 +-0,4) 10^3 L/(mol s) und k_a(TP2SAc) = (8 +-3) 10^-2 L^(1/4)/(mol^(1/4) s). Die Adsorptionskurven der Thiole weisen bei Konzentrationen unterhalb von 5 10^-5 mol/L einen linearen Bereich auf, der einer zwischenzeitlichen Diffusionskontrolle zugeordnet wird.
An die aufgenommenen Adsorptionskurven der Thiole wurden literaturbekannte Modelle numerisch angepasst und teilweise weiterentwickelt. Die Anpassung konnte durch die Einführung einer vor der Oberfläche gelagerten Diffusionsgrenzschicht, in welcher der zeitabhängige Verlauf der Analytkonzentration in einem System von 10 Schichten berechnet wurde, deutlich verbessert werden. Von allen getesteten Modellen zeigt nur die Adsorption mit Ausschlussmuster keine Konzentrationsabhängigkeit der Geschwindigkeitskonstante der Desorption. Dieses Modell bezieht den Verlust von Adsorptionsplätzen mit ein, die einem besetzten Adsorptionsplatz benachbart sind und durch das adsorbierte Teilchen verdeckt werden. Der daraus resultierende Zusammenhang zwischen der Konzentration freier Adsorptionsplätze und dem Bedeckungsgrad der Oberfläche Theta_F(Theta) ist abhängig vom Verhältnis der Stoßfrequenz zwischen den Teilchen und der Oberfläche zur Platzwechselfrequenz der Teilchen auf der Oberfläche. Zur Bestimmung von Theta_F(Theta) für die numerische Anpassung der Adsorptionskurven von HDT und TP2SH wurde die Oberflächenbesetzung in einem Monte-Carlo-Verfahren für eine Konzentrationsreihe in Zehnerpotenzschritten simuliert.
Stickstoff (NO), Kohlenmonoxid (CO) und Schwefelwasserstoff (H2S) gehören zur Gruppe der Gasotransmitter. Dabei handelt es sich um kleine gasförmige Signalmoleküle, welche innerhalb des Körpers gebildet werden und dort wichtige physiologische Funktionen bei der Regulation der Apoptose, der Proliferation, der Entzündungsreaktion und der Genexpression übernehmen. Aufgrund ihrer Membranpermeabilität ist die Wirkung der Gasotransmitter nicht an die Interaktion mit spezifischen membranständigen Rezeptoren gebundenen. Je nach Organ, Gewebe und Konzentration können diese Mediatoren unterschiedliche Prozesse beeinflussen und teils sogar gegenteilige Wirkungen hervorrufen.H2S beispielsweise kann im Verlauf der Leukozytenadhäsion im Epithelium anti-inflammatorisch, bei Brandwunden oder rheumatischen Erkrankungen jedoch pro-inflammatorisch wirken. Im Kreislaufsystem hingegen bewirkt H2S durch die Aktivierung von ATP-abhängigen K+-Kanälen und die damit zusammenhängende Vasorelaxion der glatten Muskelzellen einen eindeutig protektiven Effekt.
H2S kann je nach Substrat und Zelltyp durch eines von 3 Enzymen gebildet werden. Die Cystathionin-γ-Lyase (CSE) und die Cystathionin-β-Synthase (CBS) nutzen L-Cystein als Substrat für die Synthese von H2S. Das dritte H2S-bildende Enzym, die 3-Mercaptopyruvate Sulfurtransferase (3-MST) verwendet α-Ketoglutarat als Substrat, welches zuvor von der Cystein-Aminotransferse (CAT) aus L-Cystein synthetisiert wurde. Während die beiden Enzyme CSE und CBS im Zytosol der Zelle zu finden sind, ist die 3-MST hauptsächlich in den Mitochondrien der Zelle zu finden. Im Gegensatz zur CBS, welche eher ein konstitutiv exprimiertes Protein ist, wird die Expression der CSE auf der Transkriptionsebene durch u.a. Entzündungsmediatoren wie TNF-α oder Wachstumsfaktoren wie PDGF-BB induziert.
Ein Ziel der Arbeit war es, die Wirkung von H2S bei der Wundheilung, bei entzündlichen glomerulären Erkrankungen der Niere und beim Schlaganfall zu untersuchen. Für diesephänotypische Analysen stand ein Knockoutmodell für die CSE zur Verfügung.
Zudem wurden in dieser Arbeit Untersuchungen mit einem Knockoutmodell für das zytoskeletäre Protein durchgeführt. Bei Clp36 (PDLIM1) handelt es sich um ein PDLIM-Protein (PDZ and LIM domain protein),welches durch die Gasotransmitter NO und H2S auf transkriptioneller und translationaler Ebene reguliert wird ist und aufgrund seiner Assoziation mit dem Zytoskelett dynamische Vorgänge der Zelle moduliert. Es ist bereits bekannt, dass Clp36 ein negativer Regulator des Glykoprotein VI (GPVI), welches eine wichtige Rolle bei der Aktivierung von Thrombozyten spielt, ist.
Beide Knockoutmodelle wurden in murinen Mesangiumzellen der Niere und in Krankheitsmodellen der Haut (kutane Wundheilung)und des Gehirns (Schlaganfall mit dem MCAO-Modell) analysiert.
Neben nicht signifikanten Effekten im MCAO-Modell, konnten sowohl Effekte des CSE-, als auch des CLP36-KOs auf die Migration und Proliferation und im Falle der CSE auch auf die Adhäsion der murinen Mesangiumzellen beobachtet werden. Die Depletion von Clp36 führte zu einer Verringerung der Migrations- und einer Erhöhung der Proliferationsrate, wohingegen die Depletion der CSE zu einer Erhöhung der Migrations-, Proliferations- und Adhäsionsrate führte. Die vielversprechendsten Ergebnisse konnten im Tiermodell der kutanen Wundheilung generiert werden. Untersucht wurde die Expression der H2S-produzierenden Enzyme CSE, CBS und 3-MST. Alle drei Enzyme zeigten im Tiermodell keine transkriptionelle Regulation und blieben auch während der akuten Entzündungsphase und der proliferativen Phase der Wundheilung unverändert. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass die Expression der CSE in der späten Phase der Wundheilung signifikant anstieg, wenn die Proliferation innerhalb des Granulationsgewebes und der Neoepidermis geringer wurde. Die Vermutung, dass H2S in dieser Phase eine wichtige Rolle spielt, konnte durch die Analyse der CSE-KO Mäuse bekräftigt werden, da dort der Verlust der CSE offenbar durch die CBS kompensiert wurde.
In immunhistochemischen Untersuchungen konnten insbesondere follikuläre Keratinozyten der Neo-Epidemis als Quelle der CSE-Expression identifiziert werden. Durch in-vitro Studien auf mRNA und Proteinebene in HaCaT Zellen wurde gezeigt, dass H2S die Keratinozyten-Differenzierung beeinflusst. Der langsam freisetzendeH2S-Donor GYY4137 konnte in humanen Keratinozyten zu einer signifikanten Erhöhung der Ca2+- induzierten Expression der frühen Keratinozyten-Differenzierungsmarker Cytokeratin 10 (CK10) und Involucrin (IVN) beitragen.
Im Laufe dieser Arbeit konnte der molekulare Mechanismus hinter diesen Beobachtungen noch nicht geklärt werden.
Durch weitere Versuche meiner Arbeitsgruppe konnte jedoch gezeigt werden, dass die GYY4137-abhängige Induktion der CK10-Expression durch eine verstärkte Bindung der RNA-Polymerase II an den CK10 Promotor zustande kommt.
Im Forschungsgebiet der Proteomik hat sich die Massenspektrometrie als essenzielles Werkzeug etabliert. Zur Probengewinnung und deren Präparation für die chromatogra-phische Trennung und massenspektrometrische Analyse existieren eine Vielzahl von Protokollen, deren Verwendung jedoch unterschiedlichste Vor- und Nachteile mitbringt. Im Idealfall wäre ein solches Protokoll schnell und kostengünstig durchführbar, würde mit hoher Robustheit die Proteine aus den Ausgangszellmaterial quantitativ extrahieren und Probenverluste auf ein Minimum beschränken. Ziel dieser Arbeit war es, in einem strukturierten Ansatz sich diesem Ideal zu nähern und mögliche Kompatibilitaten mit anderen Methoden wie dem Arg-C analogen Proteinverdau zu untersuchen. Als Maß-stäbe dienen hierbei die aktuellen Standardprotokolle: die Acetonfällung der Proteine mit anschließender Solublisieung und das FASP-Protokoll, bei dem die zur Proteinpro-zessierung notwendigen Arbeitsschritte auf einer Größenausschlussmembran stattfinden. Dazu wurde zunächst das Adsorptionsverhalten von Proteinen auf den Silica-Oberflächen paramagnetischer Beads untersucht und dabei insbesondere der Einfluss von Chemikalien zur Zell-Lyse und den im Anschluss verwendeten Reduktions- und Alkylierungsreagenzien analysiert. Dabei wurde festgestellt, dass die Proteine aus dem Totalzelllysat sehr effektiv an die Silicaoberfläche binden und dass der Prozess der Re-duktion von Disulfidbrücken mit nachfolgender Carbamidomethylierung positiv zur Adsorption beiträgt und negative Einflüsse auf die Immobilisierung negieren kann. Dar-aus wurde ein Protokoll zur kombinierten Lyse, Aufreinigung, Modifikation und Proteo-lyse (abgekürzt: ABP) entwickelt. Parallel dazu konnte die Kompatibilität des Protokolls mit dem ArgC-analogen Verdau gezeigt werden und in der Folge konnte die Komple-mentarität der Methoden erfolgreich getestet werden. Mit frischen Zell-Lysaten wurde der Einfluss der Lysisreagentien unter Einschluss einer kommerziellen Variante ("Bug-buster" Lysis-Puffer) bestimmt und Harnstoff konnte als Mittel der Wahl definiert wer-den, da mit diesem höhere Identifikationszahlen erreicht wurden, lipophile Proteine vermehrt in der Probe erhalten blieben und größere Ionscores ermittelt werden konnten. Das Potential von ABP wurde im Direktvergleich mit FASP und dem Verdau in Lösung anhand eines humanen Proteoms genauestens untersucht, wobei eine konsequente Ver-besserung gegenüber beiden Methoden festgestellt werden konnte, insbesondere im Hinblick auf Praktikabilität und die Zahl der erforderlichen Arbeitsschritte, Reprodu-zierbarkeit und Zahl der identifizierten Peptide. Ein Bias des ABP zugunsten spezieller Proteineigenschaften konnte nach ausführlicher Analyse der identifizierten Proteine und Peptide nicht festgestellt werden. Eine vermehrt auftretende Oxidation von Methionin wurde identifiziert, allerdings zeigten sich keine negativen Auswirkungen auf die Pro-teinidentifizierungen. Zur Unterdrückung potentieller und unerwünschter Nebenpro-dukte in Form von Methylierungen, die als Folge des ursprünglichen ArgC-analogen Verdaus36 auftreten, wurde mit Verwendung von Acetonitril eine Alternative erfolg-reich getestet. Ein humanes Proteom wurde mittels des formulierten Protokolls sowohl tryptisch als auch mit ArgC-analogen Verdau (mit Acetonitril bzw. Methanol) analysiert. In diesem Zusammenhang wurde die Vollständigkeit der Modifikation der Lysine unter Verwendung von ACN mit zufriedenstellenden 99% bestätigt und die unerwünschte Carbamylierung der Aminosäure durch Harnstoff als Lysisreagenz konnte ausgeschlos-sen werden. Beide Ansätze zum ArgC-analogen Verdau erwiesen sich zudem gegenüber der tryptischen Variante als überlegen, was sich in einer Erhöhung der Identifikations-zahlen des humanen Proteoms widerspiegelt. Insbesondere wenig abundante Proteine, Histone und membranassoziierte Proteine bildeten den Großteil der zusätzlich identifi-zierten Proteine. Zusätzlich konnte eine günstigeres Fragmentierungsverhalten beobach-tet werden. Die effektiven Grenzen des ABP im Hinblick auf die erforderliche Protein-menge wurden untersucht und beschrieben. Der zu erwartende Zusammenhang zwi-schen abnehmender Proteinmenge und Identifikationszahlen niedrig abundanter Protei-ne wurde bestätigt und ein effektiver Grenzwert von 5µg Ausgangsmenge humanen Proteoms ermittelt. Abschließend wurden Dauer und Aufwand der Probenvorbereitung durch Etablierung paralleler Reduktion, Carbamidomethylierung und Propionylierung minimiert und damit zusätzlich Probenverluste reduziert. Die dadurch erreichte Erhö-hung der Identifikationszahlen ergab sich wiederum aus der höheren Repräsentanz nied-rig abundanter Proteine.
Im Rückblick ist es überraschend, dass die Verwendung der Adsorptionstendenzen von Proteinen bisher keine größere Rolle in der Probenvorbereitung proteomischer Analysen eingenommen hat. Die symbiotisch wirkende, aktive Denaturierung als Resultat der durchgeführten Derivatisierung zur Analysenpräparation macht die Adsorption auf Sili-ca-Oberflächen zum prädestinierten Mittel der Probengewinnung und schafft die Vo-raussetzung für die erreichte Verkürzung der Arbeitsabläufe und Verbesserung der Ergebnisse.
Ein wichtiges Teilgebiet der Organokatalyse stellt die Wasserstoffbrücken-vermittelte Katalyse dar. Als erfolgreiche katalytische Einheiten haben sich dabei diejenigen Systeme ausgezeichnet, die in der Lage sind mindestens zwei Wasserstoffbrücken zeitgleich auszubilden. Zu den bekanntesten Vertretern zählen hierbei sicher (Thio-) Harnstoffe sowie Guanidinium- und Amidinium-Ionen.
Im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit wurden drei Katalysatortypen mit Amidin- und Guanidingrundgerüst synthetisiert. Zum Einen wurde ein neues axial-chirale Amidin mit zusätzlicher Thioharnstoff-Funktion synthetisiert. Hierfür wurden drei aromatische Fragmente mittels zweier Suzuki-Kupplungen verknüpft und im Nachhinein mit einem chiralen Aminoalkohol über eine Williamson-Ethersynthese kondensiert. Die basenvermittelte, diastereoselektive Makrocyclisierung lieferte das axial chirale Amidin und stellte den Schlüsselschritt der Synthese dar. Schließich konnte durch Addition des erhaltenen Anilin-Derivats an ein Aryl-Isothiocyanat die Thioharnstoff-Funktionalität eingeführt werden.
Zum Anderen wurde eine Reihe an C2-symmetrischer Bisamidine hergestellt. Sie wurden in einer N-Acetylcystein-katalysierten Reaktion zwischen Phthalonitril und den entsprechenden chiralen, vicinalen Diaminen hergestellt. Die erhaltenen Ausbeuten der Bisamidine wurden unmittelbar durch den sterischen Anspruch der Substituenten des jeweils eingesetzten Diamins bestimmt. Auf der einen Seite konnten bei Verwendung 1- und 2-Naphthyl-substituierter Diamine nur mäßige Ausbeuten erzielt werden. Auf der anderen Seite konnte man durch den Einsatz kleinerer Reste wie Phenyl nahezu quantitative Ausbeuten erzielen. Die Herstellung chiraler, vicinaler Diamine wurde über eine Diaza-Cope-Umlagerung realisiert.
Schließlich wurde ein C2-symmetrisches bicyclisches Guanidin hergestellt. Die Synthese begann mit einer Knoevenagel-artigen Kondensationsreaktion und anschließender Veresterung der erhaltenen Carbonsäure. Kinetische Racematspaltung des racemischen Esters unter Verwendung einer Lipase lieferte enantiomerenreines (S)-β-Phenylalanin, welches als Ausgangverbindung der überwiegend linearen Synthese diente. Das im Zuge der Synthese hergestellte chirale Triamin wurde schließlich mithilfe von Dimethyltrithiocarbonat zum Guanidin cyclisiert.
Alle drei Katalysatortypen wurden für die enantioselektive Steuerung diverser Reaktionen eingesetzt, u. A. der Diels-Alder-, Morita-Baylis-Hillman-, Friedel-Crafts-Reaktion und dem Schlüsselschritt der Quinkert-Dane-Estron-Synthese. Bei Letzterem handelt es sich um eine Diels-Alder-Reaktion, um den C-Ring eines Steroidgerüsts aufzubauen, welches durch wenige chemische Transformationen in das bedeutende weibliche Sexualhormon Estron überführt werden kann.
In der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen an zwei verschiedenen Retinalproteinen durchgeführt. Das erste analysierte Retinalprotein, Channelrhodopsin 2, wurde hauptsächlich auf die Beziehung zwischen Retinalisomerisierung und Photozyklus bzw. Funktionalität untersucht. Hierfür wurde das Chromophor all-trans Retinal durch verschiedene, sterisch anspruchsvolle, Retinalanaloga ersetzt. Das 9,12-Phenylretinal wurde bereits in BR erfolgreich eingesetzt, um die Isomerisierung des all-trans Retinals zum 13-cis Retinal in der Bindetasche zu verhindern und die Funktionalität des Proteins zu stoppen. In ChR2 hingegen kann das Phenylretinal nach Lichtanregung isomerisieren und ein Photoprodukt bilden, welches anschließend einen modifizierten Photozyklus durchläuft. In diesen Photozyklus zerfällt das erste Photoprodukt P1' sehr schnell und bildet ein zusätzliches Intermediat, Px, welches zeitlich zwischen dem P1' und P2' Intermediat liegt und eine grundzustandsähnliche Absorptionsbande besitzt. Im Vergleich zum Wildtyp läuft der modifizierte Photozyklus schneller ab als im Wildtyp und das Protein behält seine Funktion. Ein weiteres Retinalanalogon ist das trans-locked Retinal, welches sich als schwierig in das Protein einzubauen erwies. Dies resultierte in zwei verschiedenen Absorptionsbanden, wobei nicht klar war, welche die mit dem korrekt eingebauten Retinal war. Beide Banden wurden in Ultrakurzzeitexperimenten angeregt, hierbei stellte sich heraus, dass die bathochrom verschobene Spezies das korrekt eingebaute Retinal besitzt, da diese auch eine Schwingungsfeinstruktur, wie auch der Wildtyp, zeigt. Das trans-locked Retinal kann ChR2 erfolgreich an der Isomerisierung hindern und zeigt nach dem Zerfall des angeregten Zustandes keine Photoprodukt-Bildung.
Bei dem zweiten Retinalprotein, welches in dieser Arbeit untersucht wurde, handelt es sich um Krokinobacter eikaustus rhodopsin 2. Zuerst wird in dieser Arbeit die Primärreaktion des Proteins untersucht. Diese wurde unter verschiedenen Salzbedingungen, welche wichtig für die spätere Funktion des Proteins sind, jedoch auch Einfluss auf die Ultrakurzzeitdynamik des Proteins nehmen, analysiert. Der angeregte Zustand des Proteins zerfällt biexponentiell, wobei die erste Komponente den reaktiven Pfad und die langsamere Komponente den nicht-reaktiven Pfad beschreibt. Der reaktive Pfad bildet innerhalb einiger hundert Femtosekunden das bathochrom verschobene, isomerisierte J Intermediat, welches durch Kühlprozesse auf der unteren Pikosekundenzeitskala in das K Intermediat übergeht. Beim nicht-reaktiven Pfad zerfällt der angeregte Zustand innerhalb einiger Pikosekunden und geht in den Grundzustand über, ohne dass eine Isomerisierung des Retinals stattfindet. Sind Na+ oder K+ Ionen in der Lösung anwesend, sind diese Prozesse gleich schnell. In Abwesenheit dieser Ionen wird der nicht-reaktive Pfad stärker populiert und zerfällt langsamer. Das gleiche salzabhängige Verhalten konnte mit der Mutante H30A gezeigt werden. Die Aminosäure H30 sitzt im Interface zweier Oligomere in der Nähe der extrazellulären Na+ Bindestelle. Durch die Mutation von Histidin zu Alanin, wird das Protein fast ausschließlich zu einer Na+-Pumpe und pumpt kaum noch Protonen. Die Ultrakurzzeitdynamik bleibt jedoch unbeeinflusst davon und unterscheidet sich nicht vom Wildtyp. Neben dem normalen all-trans Retinal wurden auch hier, wie schon für Channelrhodopsin 2, Retinalanaloga im Wildtyp untersucht, hier hauptsächlich unter dem Aspekt der Farbanpassung. Die hier verwendeten Analoga waren das A2 Retinal und das MMA Retinal (MMAR), die beide durch die Erweiterung des -Systems zum Grundzustand rotverschobene Absorptionsspektren aufweisen. Das A2 Retinal besitzt eine weitere Doppelbindung und das MMAR zwei weitere Doppelbindungen im -Jonen Ring im Vergleich zum Retinal. Das MMAR hat zusätzlich noch eine weitere Methylamino-Gruppe. Durch das größere -System hat das MMAR auch die größere Rotverschiebung im Spektrum. Beide Retinalanaloga zeigen sehr breite ESA Banden und isomerisieren nur zu einem geringen Prozentsatz, die Hauptpopulation der angeregten Moleküle geht über den nicht-reaktiven Pfad zurück in den Grundzustand.
Der Photozyklus von KR2 wurde ebenfalls untersucht. Hierbei wird unter anderem das Verhalten des Proteins unter verschiedenen pH- und Salzbedingungen analysiert. Hierbei konnte festgestellt werden, dass die Dynamik des Natrium-Pump-Zyklus unabhängig vom pH Wert ist. In einem pH Bereich zwischen 6 und 9.5 ändern sich die Lebenszeiten des Zyklus nicht signifikant, jedoch wird die Amplitude des O Intermediats, welches als Indikator für den (nicht Protonen) Ionentransport genutzt wird, bei niedrigem pH Wert geringer. Die geringere Amplitude weist auf einen geringeren Na+-Transport hin. Dies liegt an der Kompetition der zu transportierenden Ionen, in diesem Fall Na+ und H+. Ist die H+ Konzentration viel höher als die Na+ Konzentration, so fängt das Protein an H+ zu pumpen. Unter physiologischen Bedingungen handelt es sich bei KR2 jedoch um eine reine Na+-Pumpe. Sind Kalium-Ionen bei pH 9.5 anwesend, so zeigt das Protein wie auch beim Natrium-Pump-Zyklus ein starkes O Intermediat, was darauf hindeutet, dass auch K+ transportiert werden kann. Dies konnte von Dr. Janina Sörmann (Arbeitsgruppe Bamberg, MPI für Biophysik Frankfurt) auch in elektrophysiologischen Messungen gezeigt werden. Bisher wurde in der Literatur davon ausgegangen, dass K+ vom Wildtyp nicht transportiert werden kann. Um die Photozyklusdynamik des Natrium-Pumpzyklus besser verstehen zu können, wurde die Temperaturabhängigkeit des Photozkylus mit Hilfe der Target Analysis untersucht. Hierbei stellte sich heraus, dass das simple sequentielle Modell K -> L -> M -> O -> GS die besten Fitresultate liefert, obwohl viele verschiedene Modelle mit Verzweigungen oder Rückraten ebenfalls getestet wurden. Resultat der Target Analysis sind unter anderem die Evolution Associated Difference Spectra (EADS). Diese beinhalten die Differenzspektren der einzelnen Zustände, welche um das Grundzustandsbleichen korrigiert werden können, um die Evolution Associated Spectra (EAS) zu bilden. Durch Entfaltung dieser EAS (auf der Energieskala) konnten die Reinspektren der einzelnen Photointermediate K, L, M und O berechnet werden. Auffällig hierbei war, dass das M Intermediat eine geringere Blauverschiebung als erwartet aufwies, was höchstwahrscheinlich an der Elektrostatik in der Retinal-Bindetasche liegt. Durch die Entfaltung der Spektren konnten ebenfalls die Gleichgewichte, welche zu schnell sind, um in der Target Analysis aufgelöst zu werden, bestimmt werden. Die K, L und M Intermediate stehen, je nach Temperatur, in verschiedenen Gleichgewichten zueinander, während das O Intermediat, keine Gleichgewichte eingeht und nur separiert von den anderen Intermediaten auftaucht. Dies bedeutet, dass sich zwischen M und O Intermediat ein unidirektionaler Schritt im Photozyklus befinden muss. Dieser hängt wahrscheinlich mit dem Na+-Transport zusammen, da das Ion beim Übergang vom M zum O aufgenommen und an der Schiffbase vorbei transportiert werden muss.
Um den Photozyklus besser untersuchen zu können, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Anlage zur transienten Blitzlichtphotolyse aufgebaut und die bestehende Breitband-Blitzlichtphotolyse automatisiert und verbessert. Hierfür wurden mithilfe von MATLAB und LABVIEW verschiedene Programme zur Datenakquisition, -verarbeitung und -analyse geschrieben. Für die transiente Blitzlichtphotolyse musste ein Datenreduzierungsprogramm entwickelt werden, um die mehrere Gigabyte großen Datensätze auf eine verarbeitbare Größe, mit gleichzeitiger Verbesserung des Signal-zu-Rausch-Verhältnisses, zu bringen. In der Breitband-Blitzlichtphotolyse konnte ein Pulsverzögerungsgenerator als zentrale Steuereinheit aller Komponenten der Breitband-Blitzlichtphotolyse eingesetzt und programmiert werden, um das Messverfahren zu automatisieren. Anschließend musste noch ein neues Datenverarbeitungsprogramm geschrieben werden, welches die Daten für die anschließende Analyse zusammenstellt und vorbereitet. Die neuen Programme gewähren einen reibungslosen Anschluss an die Analysesoftware OPTIMUS, welche in der Arbeitsgruppe genutzt wird.
Lange ging man davon aus, dass die Physiologie der Thyroidhormone weitestgehend erforscht ist und nahm an, dass sämtliche Thyroidhormon-Wirkungen auf einer Bildung von L-Thyroxin (T4) und einer anschließenden Deiodierung zu Triiodthyronin (T3) beruhen, welches an die nukleären Thyroidhormon Rezeptoren (THRs) bindet. Über die THRs werden genomische Signalwege vermittelt, die während der Wachstums- und Entwicklungsphase essentiell sind. Beim Erwachsenen werden zudem vorwiegend katabole Stoffwechsel-Prozesse induziert. Jedoch zeigte sich in den letzten 20 Jahren, dass die Signalwege der Thyroidhormone komplexer sind als bisher angenommen. Vor allem die Metabolite des in der Schilddrüse gebildeten T4s, zeigen ein breites Interaktions-Profil mit anderen molekularen Zielstrukturen. Thyronamine, die decarboxylierten Thyroidhormon-Metabolite, binden beispielsweise den G-Protein-gekoppelten Trace Amine Associated Receptor 1 (TAAR1). Wird dieser Rezeptor aktiviert, kommt es innerhalb kürzester Zeit zu einem rapiden Abfall der Köpertemperatur, sowie zu einer akuten Bradykardie. Die durch oxidative Deaminierung gebildeten Iodthyroacetate Tetraiodthyroacetat (TETRAC) und Triiodthyroacetat (TRIAC) sind Antagonisten des Membran-Rezeptors Integrin αVβ3 und besitzen antiproliferative und pro-apoptotische Eigenschaften.
In dieser Arbeit sollte die Hypothese untersucht werden, ob Thyroidhormone neben diesen neuen zumeist nicht-genomischen Signalwegen, auch THR-unabhängige genomische Wirkmechanismen besitzen.
Mit Hilfe eines Gal4-Luciferase-Reportergen-Assays wurde in einem Screening die Aktivität einiger Thyroidhormone und Thyroidhormon-Metabolite an elf THR-ähnlichen Rezeptoren und den drei Retinoid X Rezeptor (RXR)-Subtypen untersucht. Es konnte detektiert werden, dass Thyroidhormone, vor allem TETRAC, potente Peroxisom-Proliferator-aktivierter Rezeptor (PPAR)γ-Agonisten sind, die zum Teil zusätzlich dessen Heterodimer-Partner RXR aktivieren können. Diese PPARγ- und RXR-Aktivität wurde zunächst mit Hilfe eines Coaktivator-Rekrutierungs-Assays, einer Isothermen Titrationskalorimetrie (ITC) und einer Kristallstrukturanalyse genauer charakterisiert. Zum einen konnte nachgewiesen werden, dass sowohl PPARγ, als auch RXR in artifizielleren Testsystemen durch Thyroidhormone aktiviert werden. Zum anderen konnte die für permissive Heterodimere, wie das PPARγ/RXR-Heterodimer, typische additive Transaktivierungs-Effizienz nach Bindung beider Heterodimer-Partner bestätigt werden. Außerdem zeigte die Untersuchung der Kristallstruktur von TETRAC und PPARγ, dass Thyroidhormone einen abweichenden Bindungsmodus im Vergleich zu anderen PPARγ Agonisten, wie den Glitazonen und entsprechende Fettsäuren oder Fettsäuremimetika, besitzen.
Die Evaluation der biologischen Relevanz der PPARγ/RXR-Heterodimer-Aktivierung ergab zudem, dass TETRAC, als potentester PPARγ-Agonist, in der Lage ist die Differenzierung von Präadipocyten zu Adipocyten zu induzieren. Außerdem wurde die mRNA-Expression wichtiger PPARγ-regulierter Gene in Hepatozyten trotz knockdown beider THR-Isoformen signifikant durch Thyroidhormone induziert.
Für eine erste Abschätzung einer möglichen physiologischen Relevanz der PPARγ/RXR-Aktivierung durch Thyroidhormone, wurde die Bildung von TETRAC nach Inkubation von Hepatozyten mit T4 quantifiziert. Es konnte festgestellt werden, dass ausreichend TETRAC in den Hepatozyten gebildet werden kann, um PPARγ zu aktivieren. Auch in einem in vivo-Experiment, bei dem Mäusen ein mit Brom substituiertes T4-Analog (Br-T4) appliziert wurde, um Interferenzen mit der endogenen Thyroidhormon-Produktion zu verhindern, konnte gezeigt werden, dass die PPARγ-regulierte Genexpression in den Lebern der Tiere induziert wurde. Dies deutete auf eine physiologisch relevante Bildung von Br-TETRAC hin, da Br-TETRAC analog zu TETRAC eine hohe Bindungs-Aktivität an PPARγ besaß, während Br-T4 keine Aktivität an diesem Rezeptor aufwies.
Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass Thyroidhormone neben den THR-vermittelten Effekten auch andere genomische Wirkmechanismen besitzen, indem sie das PPARγ/RXR-Heterodimer aktivieren. Diese biologische Aktivität könnte sowohl eine physiologische als auch eine pharmakologische Relevanz besitzen. Die beiden T4-Metabolite T3 und TETRAC sind in der Lage komplementäre Signalwege zu induzieren. Wird T4 deiodiert kommt es zur Bildung von T3, welches den THR aktiviert. Durch oxidative Deaminierung des T4s bildet sich TETRAC, das wiederum PPARγ bindet und aktiviert. Durch die vermehrte Bildung von TETRAC und anschließende Aktivierung von PPARγ könnte die katabole Wirkung der THR-Signalwege abgeschwächt werden und so eine Art negative Rückkopplung gewährleistet werden. Die physiologische Bedeutung der Interaktion von Thyroidhormonen mit PPARγ/RXR muss jedoch noch genauer untersucht werden.
Aber auch pharmakologisch könnte die Iodthyroacetat-Aktivität an PPARγ eine Rolle spielen. TETRAC könnte durch seinen individuellen Bindungsmodus als Leitstruktur für neue PPARγ-Partialagonisten mit verbessertem Nebenwirkungs-Profil dienen. Außerdem wird das Thyroidhormon-Derivat TRIAC schon jetzt als Leitstruktur für die Entwicklung von Thyroidhormon-Analoga mit THRβ-Selektivität verwendet. Durch die zusätzliche PPARγ-Aktivität könnte zukünftig ein dualer THRβ/PPARγ-Agonist bei Erkrankungen, die mit einer Insulinresistenz einhergehen, Verwendung finden.
Zusammenfassend stellt die Entdeckung der Aktivität von Thyroidhormonen an PPARγ und RXR einen weiteren Baustein im komplexen System der Thyroidhormone dar.
Die vorliegende Dissertation gliedert sich in 2 Abschnitte: Im 1. Abschnitt wurden die Auswirkungen des Naturstoffs Phytol auf den Krankheitsverlauf des murinen EAE-Modells charakterisiert, während im 2. Abschnitt die immunmodulierenden Eigenschaften der neuartigen Leitsubstanzen Silvestrol sowie Steroid Substanz 1o untersucht wurden.
Vorarbeiten zeigten einen positiven Einfluss von Phytol auf den Krankheitsverlauf im murinen EAE-Modell für Multiple Sklerose, eine verringerte Proliferationsfähigkeit von Splenozyten sowie eine Regulation der NOX2 mRNA-Expression (Blum et al., 2018b).
In der vorliegenden Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass die Gabe von Phytol den Prozess der Demyelinisierung im lumbalen Rückenmark deutlich reduzierte und die Anzahl der Immunzellen in den inguinalen Lymphknoten sowie im lumbalen Rückenmark signifikant verringerte. Weiterhin konnte eine Regulation der spezifischen T-Zell Transkriptionsfaktoren T Bet sowie Foxp3 nachgewiesen werden. Es zeigte sich, dass Phytansäure, nicht jedoch Pristansäure, die beiden Metaboliten von Phytol, die Proliferationsfähigkeit der T-Zellen signifikant verringerte. Beide Metaboliten zeigten zusätzlich unterschiedlichen Einfluss auf die T-Zell Subtypen. Hultqvist et al. konnten eine verstärkte Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) durch Phytol nachweisen (Hultqvist et al., 2006). Vorarbeiten zeigten eine Steigerung der mRNA-Expression des ROS-produzierenden Enzymkomplex NOX2 im Verlauf des EAE-Modells sowie eine Regulation der NOX2-Expression im lumbalen Rückenmark und in den inguinalen Lymphknoten durch Phytol (Blum et al., 2018b). Deshalb wurde die Rolle von NOX2 an den Phytol-vermittelten Effekten weiter charakterisiert. Dabei zeigte sich, dass die gesteigerte NOX2-Expression im lumbalen Rückenmark auf die eingewanderten Immunzellen zurückzuführen war. Die von NOX2 im zentralen Nervensystem (ZNS) gebildeten ROS, welche zur Schädigung der Myelinschicht beitragen können, wurden durch die Gabe von Phytol im lumbalen Rückenmark verringert. Untersuchungen in NOX2KO-Mäusen zeigten, dass die beobachteten ex vivo Effekte von Phytol sowie dessen Metaboliten nur teilweise NOX2-abhängig waren. Im murinen EAE-Modell mit NOX2KO-Mäusen zeigte Phytol weiterhin einen positiven Einfluss auf die klinischen Symptome. Auffällig war dabei, dass NOX2KO-Tiere grundsätzlich weniger klinische Scores zeigten als Wildtyp Tiere. In NOX2-Chimären hatte Phytol keinen signifikanten Einfluss auf den Krankheitsverlauf. Grund dafür könnte eine Beschädigung der Blut-Hirn-Schranke bei der Generierung der Chimären und eine damit verbundene verstärkte Infiltration von Immunzellen in das ZNS gewesen sein. Weiterhin konnte Phytol möglicherweise über die geschädigte Blut-Hirn-Schranke verstärkt in das ZNS eindringen und dort über eine gesteigerte ROS-Produktion zu schädigenden Effekten führen.
Die in vivo Daten weisen auf einen überwiegend NOX2-unabhängigen Wirkmechanismus von Phytol hin. Dennoch scheint NOX2 bei einigen Effekten zumindest beteiligt zu sein. Zusammenfassend zeigte die Gabe von Phytol einen überwiegend positiven Einfluss auf den Krankheitsverlauf im murinen EAE-Modell, dennoch ist die Phytol-vermittelte Induktion von NOX2 und die Bildung von ROS kritisch zu sehen, da diese sowohl positive als auch negative Effekte vermitteln und stark von der Quantität sowie der Lokalisation der Bildung abhängig sind.
Im 2. Teilprojekt wurden die immunmodulierenden Auswirkungen der neuartigen Leitsubstanzen Silvestrol sowie Steroid Substanz 1o charakterisiert. Der anti-viral wirksame Naturstoff Silvestrol zeigte dabei diverse Auswirkungen auf die Differenzierung sowie Polarisierung von humanen Makrophagen. Während der Differenzierung inhibierte Silvestrol das anti-inflammatorische bzw. resolutionsfördernde Potential der Makrophagen durch eine Reduktion der resolutionsfördernden Oberflächenmarker CD206 und TREM2. Weiterhin wurde die Sezernierung der anti-inflammatorischen Zyto- bzw. Chemokine IL-10 und CCL18 verringert. Der pro-inflammatorische Phänotyp von M1-Makrophagen wurde weiterhin durch die vermehrte Bildung von TNF-α unterstützt, während bei M2-Makrophagen der anti-inflammatorische bzw. resolutionsfördernde Phänotyp verstärkt wurde. In Dendritischen Zellen schien Silvestrol sowohl die Differenzierung als auch die Aktivierung zu inhibieren, da zahlreiche Oberflächenmarker und sezernierte Zytokine signifikant verringert wurden. Die Stoffwechselwege der oxidativen Phosphorylierung und der Glykolyse wurden sowohl in Makrophagen als auch in Dendritischen Zellen signifikant reduziert. Demnach ist unklar, ob in der Summe die pro- oder anti-inflammatorischen Aspekte von Silvestrol überwiegen und ob der Einfluss auf den Stoffwechsel die Immunantwort beeinträchtigt.
Der anti-parasitäre Wirkstoff Steroid Substanz 1o zeigte keinen negativen Einfluss auf die Viabilität in primären humanen Immunzellen bis zu einer Konzentration von 50 µM und verstärkte das pro-inflammatorische Profil von M1-Makrophagen. Weiterhin wurde der anti-inflammatorische bzw. resolutionsfördernde Phänotyp von M2-Makrophagen unterdrückt und stattdessen die pro-inflammatorischen Aspekte verstärkt. Diese Beobachtungen der veränderten Oberflächenmarker sowie der sezernierten Zytokine wurden weiterhin durch die Veränderung des zellulären Stoffwechsels gestützt. Dabei steigerte Steroid Substanz 1o die Glykolyse in M2-Makrophagen, welche eigentlich für M1-Makrophagen charakteristisch ist. Dadurch kann die Verschiebung der M2-Makrophagen zu einem M1-Phänotyp erklärt werden. Weiterhin beeinträchtigte Steroid Substanz 1o die Differenzierung und Aktivierung von Dendritischen Zellen. Zusammenfassend verstärkte Steroid Substanz 1o überwiegend die pro-inflammatorischen Aspekte der Immunreaktion durch eine Aktivierung der M1-Makrophagen. Bei der möglichen Anwendung als Therapeutikum für Malaria sowie Schistosomiasis kann somit das Immunsystem bei der initialen Abwehr der Parasiten unterstützt werden.
In der vorliegenden Arbeit konnte die Entwicklung und Evaluierung einer neuen Apparatur zur Untersuchung der Freisetzungseigenschaften von kolloidalen Arzneiträgern erfolgreich umgesetzt werden. Verschiedene Prototypen und Versionen des Dispersion Releasers konnten entwickelt und mit Hilfe der Werkstatt des Fachbereiches 14 umgesetzt werden. Dabei ermöglicht die letzte Optimierung (Version 3) den Einsatz beider relevanter Dialysemembranen. Sowohl regenerierte Cellulose als auch Celluloseacetat konnten zur Freisetzungsuntersuchung eingesetzt werden. Vorteilhaft ist diese Optionalität vor allem, da auf diese Weise Partikelsysteme und Wirkstoffe mit unterschiedlichen physiko-chemischen Eigenschaften in der gleichen Apparatur auf das Freigabeverhalten untersucht werden können. Darüber hinaus hat der Dispersion Releaser das Potential, sich im Bereich der Freisetzungsuntersuchungen kolloidaler Arzneiträger über den Arbeitskreis von Dr. Wacker hinaus zu einem bevorzugten Testsystem zu entwickeln. In diesem speziellen Gebiet der Freisetzungsuntersuchung von kolloidalen Arzneiträgern wie Nanopartikeln oder Liposomen existiert bisher keine Apparatur, die als sogenannter Gold-Standard angesehen werden kann. Untersuchungen mittels der Durchflusszelle, dem A4D oder Sample & Separate Methoden im Labormaßstab unterliegen kaum standardisierbaren Bedingungen und diversen Limitierungen. Der Dispersion Releaser ist einfach zu handhaben und mit wenig Aufwand in die Freisetzungsapparatur 2 nach Ph. Eur. einzubauen. Zu den zahlreichen Vorteilen gehören außerdem die Kontrolle der Rührgeschwindigkeit sowie der Temperatur und der mögliche Probenzug in beiden Kompartimenten der Dialysezelle. Würden mehr Freisetzungsuntersuchungen von kolloidalen Arzneiträgern mit der gleichen, im besten Falle standardisierten, Apparatur durchgeführt, so würde dies die Vergleichbarkeit der Resultate erheblich verbessern.
Die präparierten Modellarzneiformen der beiden Arzneistoffe mTHPC und Flurbiprofen konnten die Funktionalität des Dispersion Releasers mittels der erhobenen Freisetzungsprofile belegen. Es konnten sowohl schnell als auch langsamer freisetzende kolloidale Formulierungen produziert und identifiziert werden. Als Standard-Freisetzungsmedium diente ein 10 mM Phosphatpuffer versetzt mit Natrium- und Kaliumchlorid bei pH 7,4. Dieser im Hinblick auf pH-Wert, Osmolalität und Pufferkapazität dem Blut angepasste Puffer lieferte reproduzierbare Freisetzungsprofile für alle untersuchten Partikelsysteme. Der Zusatz von Plasmaproteinen erfolge durch Zufügen von FBS zu diesem Standardpuffersystem oder durch Verwendung des im Ph. Eur. gelisteten Phosphatpuffers pH 7,2 mit Rinderalbumin. Der Effekt der im Plasma natürlicherweise enthaltenen Komponenten, insbesondere der Plasmaproteine, auf das Freisetzungsprofil zeigt in dieser Arbeit, dass -wie erwartet- die Freisetzungseigenschaften in komplexen, bzw. physiologischen Medien deutlich von denen in einfachen Puffersystemen abweichen können. Die Anwesenheit von Plasmaproteinen führte zu einer veränderten Freisetzungsrate, sowohl im Falle von Flurbiprofen als auch im Falle von mTHPC. Für mTHPC konnte außerdem der Zusatz von lösungsvermittelndem Methyl-ß-cyclodextrin zum Freisetzungsmedium etabliert werden. Gegenüber üblicherweise eingesetzten Tensiden verändert dieses cyclische Zuckermolekül die Oberflächenspannung des Mediums und damit die Benetzbarkeit der Partikel nicht.
Die mittels Dispersion Releaser und Dialysesack erhobenen Freisetzungsdaten des Wirkstoffes Flurbiprofen wurden in Zusammenarbeit mit Frau Dr. Li Kirsamer einer mathematischen Auswertung unterzogen. Auf diese Weise konnte zunächst das Freisetzungsprofil beider Kompartimente der Dialyse dargestellt werden, wodurch weitere Erkenntnisse der Qualität des kolloidalen Trägers und seiner Eignung für den jeweiligen Arzneistoff abgeleitet werden können. Die Auswertung an Hand dieses Modells berücksichtigt zwar die Fraktion des freigesetzten Wirkstoffes in beiden Kompartimenten, ermittelt jedoch keine theoretische Freisetzungsrate welche ohne Membrankinetik messbar wäre. Dies wäre in der Auswertung von Freisetzungsdaten ebenfalls von Interesse, konnte jedoch im Rahmen dieser Arbeit nicht näher untersucht werden. Berechnungen wie diese können in weiterführenden Arbeiten möglicherweise dazu dienen, in vitro Freisetzungsdaten mit Plasmaprofilen zu korrelieren. Mit dem Erwerb der Rechte an dem Dispersion Releaser durch die Firma Pharma Test Apparatebau AG im Jahr 2016 wurde der Weg für eine mögliche breite und auch kommerzielle Nutzung der neuartigen Apparatur eingeleitet. Diese Transaktion und die andauernde Kooperation zwischen Pharmatest und dem Arbeitskreis von Herrn Prof. Dr. Wacker soll die erfolgreiche Beantwortung der Fragestellungen innerhalb der vorliegenden Arbeit mit dem Titel „Entwicklung einer Apparatur zur in vitro Testung der Wirkstofffreisetzung aus kolloidalen Arzneistoffträgern“ hervorheben.
Eukaryotische Zellen sind durch, aus Lipiddoppelschichten bestehenden, Membranen in Kompartimente mit unterschiedlichen Funktionen eingeteilt. Um einen Transport von Molekülen über die Membranen hinweg zu gewährleisten, werden Kanälen und Transporter benötigt. Eine Familie von Transportern sind die ATP-binding cassette (ABC) Transporter, die in allen Lebewesen, von Bakterien bis zum Menschen, vorkommen. Ein Mitglied dieser Familie ist der transporter associated with antigen processing-like (TAPL oder ABCB9). TAPL ist ein lysosomaler Polypeptidtransporter der per ATP-Hydrolyse Peptide von 6 – 59 Aminosäuren Länge vom Zytosol in das Lumen der Lysosomen transportiert. Hierbei kann TAPL, das ein Homodimer ist, in zwei funktionale Domänen geteilt werden. Der Teil des Komplexes, der für den Transport zuständig ist, wird als coreTAPL bezeichnet. Dieser beinhaltet die zytosolischen nucleotide binding domains (NBDs), die ATP binden und hydrolysieren können, und die Transmembrandomänen (TMDs), die Peptide binden und sie durch konformationelle Änderungen auf der anderen Membranseite freilassen. Die zweite Domäne ist eine N-terminale TMD, die als TMD0 bezeichnet wird. Dieser, aus vier Transmembranhelices (TMHs) bestehende Teil des Proteins, ist für die Lokalisation von TAPL in der lysosomalen Membran verantwortlich, sowie für die Interaktion mit den dort lokalisierten Membranproteinen LAMP-1 und LAMP-2. CoreTAPL ohne die TMD0s erreicht nicht die Lysosomen, sondern liegt in der Plasmamembran (PM) der Zelle vor. Die TMD0 hingegen benötigt coreTAPL nicht um korrekt in der lysosomalen Membran lokalisiert zu sein.
Die korrekte Lokalisation in der Zelle ist ein kritischer Punkt für ein Protein, um seine Funktion ausüben zu können. Die Transportprozesse vom Ort der Synthese des Proteins, dem Endoplasmatischem Reticulum (ER), zum Organell wo es seine Funktion ausüben soll, umfassen dutzende Proteine und Proteinkomplexe und ein komplexes Zusammenspiel zwischen Proteinen und den einzigartigen Lipidzusammensetzungen der Membranen verschiedener Organellen. Auf das Einfachste heruntergebrochen benötigt ein Transmembranprotein eine kurze Aminosäuresequenz auf der zytosolischen Seite, die Signalsequenz. Diese Sequenz wird von sogenannten Adapterproteinen erkannt, die wiederum andere Bestandteile der zellulären Maschinerie rekrutieren, die letztlich Vesikelbildung, Transport und Fusion mit der Zielorganelle vermitteln. Allerdings weisen nicht alle lysosomalen Transmembranproteine eine solche Signalsequenz auf, sondern besitzen unkonventionelle Zieldeterminanten, wie posttranslationale Modifikationen, oder sie interagieren mit anderen Proteinen, die wiederum die Interaktion mit den Adapterproteinen vermitteln.
Der Fokus der vorliegenden Arbeit liegt in der erfolgreichen Entwicklung von vier neuen Methoden zur Darstellung von Sulfonen und von einer neuen Methode zur Synthese von N-Aminosulfonamiden. Dabei sollen die Strukturmotive von Sulfonen und Sulfonamiden aus stabilen Startmaterialien in einer einfachen Durchführung, vorzugsweise in einer Eintopf-Synthese oder Multikomponenten-Reaktion, aufgebaut und der Reaktionsmechanismus weitestgehend experimentell aufgeklärt werden. In diesem Rahmen konnte die Lücke einer Nickel-katalysierten Darstellung von Diarylsulfonen sowohl unter thermischen als auch unter photochemischen Bedingungen gefüllt werden. Zusätzlich konnten im Bereich der SO2-Fixierung Sulfonylradikale mittels Diaryliodoniumsalzen und sichtbaren Licht erzeugt werden, die mit dem entsprechenden Quencher zum Sulfonamid oder Sulfon weiter reagieren konnten.
Die Kenntnis der Struktur von Biomolekülen und der biologischen Abläufe, in welche diese involviert sind, ist grundlegend für die Entwicklung von medizinischen Behandlungen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Systeme zur Untersuchung von Biomolekülen, insbesondere Proteinen, hergestellt. Im Mittelpunkt stand die Entwicklung von Materialien, welche neue Möglichkeiten zur Präparation von Proteinen zur Untersuchung derer Struktur mittels Kryo-Transmissionselektronenmikroskopie (Kryo-TEM) eröffnen. In zwei weiteren Projekten wurden biomimetische Systeme aufgebaut, welche die Oberfläche eines Biomoleküls oder biologischen Ensembles nachahmen und hierdurch deren Untersuchung ermöglichen. Hier wurden Systeme zur einfachen Nachbildung biologischer Membranen oder Proteinoberflächen betrachtet.
Eine wichtige Methode zur Untersuchung der dreidimensionalen Struktur von Biomolekülen ist die Kryo-TEM. Zur Mikroskopie werden die Biomoleküle in wenige Mikrometer großen Löchern eines amorphen Kohlenstofflochfilms mittels einer wenige Nanometer dicken Schicht aus amorphem Eis fixiert. Hierfür wird ein dünner Film einer wässrigen Probe auf den Kohlenstofflochfilm aufgebracht und gefroren. Insbesondere für Membranproteine ist die Herstellung derartiger Proben schwierig, da die Proteinpartikel zur Aggregation und Adsorption an dem Kohlenstofflochfilm neigen, wodurch keine Partikel in den Löchern des Kohlenstofffilmes auftreten, welche mikroskopiert werden können.
In dieser Arbeit wurden Materialien zur Verbesserung der Präparation von Proteinen für die Kryo-TEM entwickelt. Es wurden hierfür verschiedene biorepulsive Materialien, auch solche, welche eine spezifische Anbindung der Biomoleküle erlauben, untersucht. Da in der TEM die Probe durchstrahlt wird, eignen sich Nanometer dünne Membranen dieser Materialien als Trägermaterial für die Biomoleküle, da sie nur zu einem geringen Hintergrund führen. Zum einen wurden Nanomembranen durch die chemische Quervernetzung von Nanometer dicken Hydrogelfilmen mit verschiedenen quervernetzenden Molekülen hergestellt. Zum anderen wurden Trägerfilme, wie amorphe Kohlenstofffilme oder Kohlenstoffnanomembranen (engl. carbon nanomembranes, CNM) biorepulsiv funktionalisiert. Darüber hinaus wurde eine Nitrilotriessigsäure(NTA)-funktionalisierte Hydrogel-beschichtete Nanomembran entwickelt, welche markierte Proteine selektiv über einen His-Tag bindet.
Neben der Entwicklung von Materialien zur Untersuchung von Proteinen mittels Kryo-TEM wurden Beschichtungen hergestellt, welche die Oberfläche eines Biomoleküls oder eines Ensembles von Biomolekülen nachahmen. Diese Modelloberflächen sollten ebenfalls die Untersuchung von Eigenschaften der biologischen Systeme ermöglichen. Biologische Membranen bestehen aus einem Ensemble von Biomolekülen. Eine Vielzahl verschiedener Biomolekülen tritt in einer komplexen Anordnung in diesen dünnen Membranen auf. Es wurde versucht, strukturierte Membranen mit lokalen Variationen der physikalischen und chemischen Eigenschaften, jedoch weitaus weniger komplexen Aufbau, herzustellen. Die hergestellten Membranen mit biologisch relevanten Strukturen im Mikrometer- bis Zentimeterbereich, können nach weiterer Forschung als einfache Modellsysteme zur Nachahmung ihrer komplexen biologischen Vorbilder dienen.
In einem weiteren Projekt wurde eine Modelloberfläche für die Bindungstasche des Proteins FimH, welches eine wichtige Rolle in der bakteriellen Adhäsion spielt, entwickelt. In dem Kooperationsprojekt mit der Arbeitsgruppe Lindhorst wurde ein Modellsystem entwickelt, welches dazu dient, herauszufinden, inwiefern eine Funktionalisierung einer Aminosäurevon FimH über eine vorgeschlagenen Ligationsstrategie möglich ist. Das Modellsystem besteht aus einer biorepulsiven Hydrogel-Matrix, aus welcher die Seitenkette der Aminosäure Tyrosin in die Lösung exponiert ist. Die Substrat-katalysierte Reaktion der Aminosäuren-Seitenkette mit dem Photoschalter wurde mithilfe eines Bakterienadhäsionstests untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass sich die vorgeschlagene Ligationsstrategie unter Berücksichtigung von Nebenreaktionen zur Modifizierung des Proteins eignet.
Es konnten vier neuartige Systeme, welche die Probenpräparation zur Untersuchung von Proteinen mittels Kryo-TEM vereinfachen, entwickelt werden. Die Ergebnisse sind von wissenschaftlicher Relevanz, da sie die Strukturbestimmung vieler Proteine deutlich vereinfachen und hierdurch beschleunigen können. Außerdem wurden biomimetische Beschichtungen entwickelt, welche entweder Proteinoberflächen oder Biomembranen nachahmen. Die entwickelten Modellsysteme erweitern das Spektrum an Möglichkeiten, Biomoleküle oder biologische Ensembles zu untersuchen.
Die in der vorliegenden Arbeit gewonnenen Erkenntnisse zur Reaktivität zweifach reduzierter 9,10-Dihydro-9,10-diboraanthracene [A]2– erweitern das Einsatzspektrum von Hauptgruppenverbindungen im Hinblick auf die Aktivierung kleiner Moleküle. Komplementär zu Übergangsmetallkomplexen und FLPs ermöglichen die Salze M2[A] (M+ = Li+, Na+, K+) die Entwicklung neuartiger Synthesestrategien. Als besondere Herausforderung gilt die Aktivierung des stabilen H2-Moleküls, dessen Bindung die Dianionen [A]2– homolytisch in einer konzertierten Reaktion spalten.
Untersuchungen zur Kinetik der H2-Addition an M2[A] stellten die Abhängigkeit dieses Reaktionsschritts vom borgebundenen Substituenten und vom Kation heraus. Eine geringe sterische Abschirmung der Boratome durch kleine borgebundene Substituenten (C≡CtBu, Me, H) begünstigt die H2-Aufnahme gegenüber großen Substituenten (pTol, Xyl, Et). Die maximale Ausbeute an M2[A-H2] wird für M+ = Li+ erst nach mehreren Tagen bei 100 °C erhalten, während einige Stunden bei nur 50 °C für die quantitative Bildung von K2[A-H2] ausreichen.
Unter den Salzen M2[A] eignet sich Li2[68] mit borgebundenen Me-Substituenten besonders gut für den Einsatz als Hydrierungskatalysator. Mit Li2[68] konnten das Imin Ph(H)C=NtBu, das terminale Alken Ph2C=CH2 und Anthracen erfolgreich im NMR-Maßstab hydriert werden (Katalysatorladung 37 mol%, THF-d8, 1 atm H2-Initialdruck, 100 °C, 16 h). Im Reaktionsautoklaven war für die Hydrierung von Ph(H)C=NtBu eine Verringerung der Katalysatorladung auf 10 mol% Li2[68] möglich (THF, 7 atm H2-Initialdruck, 100 °C, 18 h). Konkurrenzreaktionen begründen Einschränkungen in Bezug auf die Substratpalette, da M2[68] (M+ = Li+, Na+) mit elektronenarmen ungesättigten Verbindungen, die C=C-, C≡C-, C=O- oder C=N-Bindungen enthalten, [4+2]-Cycloadditionsprodukte bilden können. Die Reversibilität dieser Reaktion entscheidet, ob Li2[68] als Katalysator fungiert oder irreversibel in den Strukturen gebunden bleibt.
Vielseitiger sind die H2-Aktivierungsprodukte M2[A-H2] als H–-Donoren geeignet: Na2[68-H2] ersetzt Halogenid- durch H–-Substituenten in Bromethan, sowie in Chlorsilanen und PCl3; CO2 wird in Natriumformiat überführt. Unabhängig von der Anzahl der Chlorliganden werden die Produkte immer vollständig hydriert. Eine erneute Reduktion von 68 kann wieder Na2[68] bereitstellen, das H2 aufnimmt und Na2[68-H2] regeneriert, welches für neue H–-Abgaben zur Verfügung steht. Bei der experimentellen Umsetzung des Kreislaufs ist es wichtig, die beschriebenen Reaktionsschritte nacheinander auszuführen und jeweils nur stöchiometrische Mengen des Elektrophils zuzugeben. Bei Abweichungen vom schrittweisen Syntheseprotokoll finden formale nukleophile Substitutionen mit M2[68] statt und monoanionische Spezies entstehen, z. B. wenn Et3SiBr als Elektrophil anwesend ist.
Gegenüber CO2 zeigt Li2[68] eine hohe Reaktivität, durch die selektiv CO und [CO3]2– gebildet werden. Wie zuvor bei den H–-Transferreaktionen ermöglicht die Reduktion der Neutralverbindung 68 die Regeneration von Li2[68].
Die Dianionen [A]2– stechen unter anderen cyclischen Borverbindungen in niedrigen Oxidationsstufen heraus, da mit [A]2– nicht nur die Aktivierung von H2 oder CO2 gelang, sondern erstmalig über die Einbindung der Additionsprodukte in zum Teil katalytische Folgereaktionen berichtet werden konnte.
Die CXCR4-CXCL12-Signalachse gilt als eines der bislang am besten studierten Signalsysteme in der Hämatopoese. Allerdings stammt unser Wissen über diesen kritischen Signalweg maßgeblich aus subtraktiven Studien, wie z.B. knock-out Modellen oder pharmakologischer Inaktivierung. Zwar können aus diesen Modellen wichtige Erkenntnisse über die physiologische Rolle dieses Signalwegs abgeleitet werden, aber dennoch bleiben einige Phänomene ungeklärt. So konnte gezeigt werden, dass es sowohl bei CXCR4-Defizienz als auch bei Patienten mit dem WHIM-Syndrom (ausgelöst durch eine überaktive CXCR4-Mutante) zu einer ausgeprägten B-Zellaplasie kommt. Dies scheint intuitiv nicht vereinbar. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit ein Modell mit einer überaktiven CXCR4- Mutante (CXCR41013/1013) hinsichtlich der (un)reifen Hämatopoese systematisch untersucht.
Zunächst wurden hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPC) hinsichtlich der aberranten CXCR4-Signalweiterleitung ex vivo analysiert. Die CXCR4-Überaktivierung konnte sowohl in frühen Effekten nach Aktivierung des Rezeptors (F-Aktinpolymerisierung, Aktivierung des MAPK- Signalweges), als auch in späten, zellfunktionellen Effekten (Migrationsassay) nachgewiesen werden. Die veränderte CXCR4 Signalintegration hatte auch bereits in der Homöostase organismische Konsequenzen im Mausmodell. So konnte eine massiv vergrößerte HSPC-Population in der Milz von CXCR41013/1013-Tieren detektiert werden, im Sinne einer extramedullären Hämatopoese. Knochenmarks-HSPC aus CXCR41013/1013-Tiere zeigten ein massiv eingeschränktes (serielles) Repopulationspotenzial. Kombiniert mit der oben genannten ausgeprägten extramedullären Hämatopoese in diesen Tiere interpretieren wir diese Beobachtung als starken Hinweis auf eine dysfunktionelle Interaktion der Stammzellen mit der hämatopoetischen Stammzellnische im Knochenmark. In diesem Zusammenhang besonders interessant ist die Tatsache, dass auch ein Kompetitorknochenmark das Überleben einer Sekundärtransplantation nicht sichert. Dabei ist zu diskutieren, ob dieser Effekt durch eine effizientere Besetzung von Stammzellnischen durch CXCR41013/1013-Zellen, eine Akkumulation von CXCL12 in der Knochenmarkflüssigkeit (siehe unten) oder eventuell sogar ein vesikelabhänginger Transport von mutiertem CXCR4 in Kompetitorzellen ausgelöst wird. Ein weiteres Merkmal dieser Dysfunktion könnte ebenfalls die gezeigte Akkumulation von CXCL12 in der Knochenmarkflüssigkeit von CXCR41013/1013-Tiere darstellen. Diese Akkumulation könnte die Suppression co-transplantierter wildtypischer Hämatopoese sowie die verminderte Effizienz der G-CSF-induzierten Stammzellmobilisierung funktionell erklären. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die Mobilisierung von Stammzellen aus dem Knochenmark durch einen CXCR4- Inhibitor in CXCR41013/1013-Tieren ebenfalls erheblich hinter der in Wildtypmäusen zurückbleibt.
Analog zu Patienten mit WHIM-Syndrom zeichnen sich CXCR41013/1013-Mäuse weiterhin durch eine ausgeprägte Leukopenie, insbesondere durch einen schweren B-Zell-Mangel, aus. Aus diesem Grund wurde die B-Lymphopoese und humorale Immunfunktion genauer analysiert. Eine grundsätzliche humorale Immunkompetenz von CXCR41013/1013-Tieren konnte nachgewiesen werden, jedoch ist die B-Memory-Funktion erheblich eingeschränkt. Durchflusszytometrisch und funktionell konnte eine reduzierte preB/pro-B Population im Knochenmark bei einer gleichzeitig vergrößerten preB/pro-B Population in der Milz (vgl. extramedulläre Hämatopoese) nachgewiesen werden. Ebenfalls konnten wir in dieser Zellpopulation eine stark erhöhte CXCR4-Oberflächenexpression im Vergleich zu wildtypischen Zellen nachweisen. Da diese unreifen B-Zellen keine verstärke Apoptoserate aufweisen, gehen wir derzeit davon aus, dass der Differenzierungsstopp nicht durch selektiven Zelltod, sondern durch aberrante Retention der preB/proB-Zellen in einer primitiven B-Vorläufer- Nische im Knochenmark zustande kommt, beziehungsweise durch eine gestörte Migration in differenzierende Nischen im Knochenmark. Alternativ könnte die Überdosis CXCR4-Signal differenzierenden Signalen entgegenstehen. Beide Hypothesen können das eingangs erwähnte Paradoxon bezüglich einer B-Zellaplasie in CXCR4-defizienten und CXCR4-überaktiven Zellen hinreichend erklären.
FPP und GGPP sind Intermediate des Mevalonat-Weges und fungieren als post-translationale Modifikation kleiner GTPasen. Die Prenylierung kleiner GTPasen erfolgt katalysiert von spezifischen Prenyltransferasen und ist notwendig um die kleinen GTPasen in Membranen zu verankern, wo ihre Aktivierung stattfindet. Zu den intrazellulären Funktionen der GTPasen gehören unter anderem der Aufbau des Cytoskeletts, das neuronale Zellwachstum, die Leitung und Ausläuferbildung von Axonen, das Dendritenwachstum, die Synapsenformation, die synaptische Plastizität und die Apoptose. Diese Funktionen spielen in der Gehirnalterung sowie in neurodegenerativen Erkrankungen wie der Alzheimer Demenz (AD) und auch bei der Glioblastoma multiforme (GBM) eine wichtige Rolle.
Im Zuge einer in vivo Studie an C57BL/6 Mäusen konnten in der vorliegenden Arbeit altersbedingte Veränderungen der Lokalisation verschiedener Rho- und Rab-GTPasen in Membran- und Cytosol-Präparationen sowie der GGTase-I in Gehirnen gealterter Tiere gezeigt werden. Die zelluläre Lokalisation der Rho GTPasen Rac1, RhoA und Cdc42 verschiebt sich im Alter zu reduzierten Membran-gebundenen und erhöhten cytosolischen Gehalten. Dies ist mit einer Reduktion der Protein- und mRNA- Gehalte des Enzyms GGTase-Iβ assoziiert, der Untereinheit der GGTase-I, die die Bindung des Isoprenoids GGPP an die Rho-GTPasen reguliert. Diese wiederum korrelieren direkt mit der altersbedingten Reduktion der relativen GGTase-Aktivität. Die in vitro Inhibition der GGTase-I mittels GGTI-2133 an SH-SY5Y Zellen erwies sich als Modell, welches die gleichen Effekte wie die gealterten Gehirne in vivo zeigt.
7, 8-Dihydroxyflavon (7, 8-DHF) ist ein natürlich vorkommendes Flavon, welches als hoch affiner selektiver TrkB-Rezeptor-Agonist fungiert und hierdurch wie das Neurotrophin BDNF das Überleben von Neuronen, deren Differenzierung, synaptische Plastizität und Neurogenese vermittelt. In vivo verursacht die orale Gabe von 7, 8-Dihydroxyflavon in Gehirnen alter Tiere eine Abnahme des Isoprenoids GGPP, die Zunahme der prenylierten Membran-gebundenen GTPase Rac1 und eine Reduktion des Gehaltes an Membran-gebundenem Rab3A auf das Niveau der Gehalte in den Gehirnen der jungen Kontroll-Tiere. Das Neurotrophin BDNF interagiert mit dem TrkB-Rezeptor und ist in der Lage direkt an den Rac1-spezifischen GEF Tiam1 zu binden, wodurch dieser aktiviert wird und Veränderungen der zellulären Morphologie der betroffenen Neurone induziert. Während das Alter und die orale Gabe von 7, 8-Dihydroxyflavon in vivo keine Effekte auf die Proteingehalte von BDNF und TrkB in der Tierstudie aufzeigten, konnte eine alterbedingte Reduktion von Tiam1 im Hirngewebe detektiert werden, die wiederum durch 7, 8-Dihydroxyflavon aufgehoben werden konnte.
Die Isoprenoide FPP und GGPP, sowie die Regulation kleiner GTPasen spielen auch eine wichtige Rolle im Zusammenhang mit Veränderungen der APP-Prozessierung in der molekularen Pathogenese der AD. Bei der APP-Prozessierung sind die beiden Sekretasen β- und γ-Sekretase für die Bildung des β-Amyloid-Peptids verantwortlich. In vitro Studien mit dem β-Sekretase-Inhibitor IV und dem γ-Sekretase-Inhibitor DAPT an untransfizierten und APP-transfizierten HEK293 Zellen (HEK293-APP695wt und HEK293-APPsw Zellen) konnten zeigen, dass sowohl die β- als auch die γ-Sekretase an der Regulation der Isoprenoide FPP und GGPP beteiligt sind. FPP und GGPP liegen in APP-transfizierten HEK293 Zellen erhöht vor. Die Inhibition der β-Sekretase führt zur Reduktion von FPP und GGPP. Durch die Inhibition der γ-Sekretase wird ausschließlich FPP reduziert. Weiterhin liegen in APP-transfizierten HEK293 Zellen die Membran-gebundenen prenylierten Rho-GTPasen Rac1, Cdc42 und RhoA erhöht vor. Das Membran-gebundene prenylierte H-Ras kommt jedoch in APP-transfizierten Zellen im Vergleich zu untransfizierten HEK293 Zellen in deutlich niedrigeren Mengen vor. Die Inhibition der β-Sekretase bedingt die Reduktion von Membran-gebundenem prenylierten Rac1 und auch von Membran-gebundenem H-Ras in HEK293-APPsw Zellen.
Veränderungen von Signaltransduktionswegen, die durch kleine GTPasen vermittelt werden, haben sich auch bei der GBM als zentraler Teil der molekularen Pathogenese herausgestellt. Hierbei ist die Prenylierung durch FPP und GGPP die Voraussetzung für die Membran-Insertion und onkogenen Funktion der Ras- und Rho-Proteine über die Stimulierung des Ras-Raf-MEK-ERK Signalweges. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der HMG-CoA-Reduktase Inhibitor Lovastatin die Bildung der beiden Isoprenoide FPP und GGPP in U87 und U343 Glioblastoma Zellen verringert und hierdurch die Isoprenylierung von H-Ras und Rac1 reduziert. Das natürlich vorkommende Monoterpen Perrilylalkohol hingegen inhibiert die Prenyltransferasen FTase und GGTase und verändert dadurch die post-translationale Prenylierung der GTPasen Rac1 und H-Ras in U87 und U343 Zellen ohne die Isoprenoide FPP und GGPP signifikant zu beeinflussen. Jedoch bewirkt Perillylalkohol in U343 Zellen eine Erhöhung des GGPPs. Beide Substanzen bewirkten die Reduktion der ERK-Phosphorylierung und der Migration, Invasion und Proliferation der untersuchten U87 und U343 Glioblastoma Zellen.
Viele Studien konnten in den letzten Jahren aufzeigen, dass Stickstoffmonoxid (NO)/cGMP-Signaling eine wichtige Rolle in der Verarbeitung chronischer Schmerzprozesse einnimmt. Bei Verletzung peripherer Nerven oder Entzündung im Gewebe wird NO gebildet, das durch Stimulation der NO-sensitiven Guanylatzyklase (NO-GC) die cGMP-Bildung katalysiert. Seit einigen Jahren ist bekannt, dass zwei Isoformen dieses Enzyms existieren, NO-GC1 und NO-GC2. Das Expressionsmuster der beiden Isoformen im nozizeptiven System und der jeweilige Einfluss auf die Schmerzverarbeitung ist jedoch bisher völlig unbekannt. In dieser Arbeit wurde die Expression der NO-GC1 und NO-GC2 in den Spinalganglien (DRGs) und im Rückenmark von Mäusen charakterisiert und das Verhalten von NO-GC1 und NO-GC2 Knockout (KO)-Mäusen in verschiedenen Schmerzmodellen untersucht. Mit Immunfluoreszenzfärbungen und In-situ-Hybridisierungen wurde in dieser Arbeit dargestellt, dass die zwei Isoformen in Interneuronen des Rückenmarks lokalisiert sind, wobei die NO-GC1 vorwiegend in inhibitorischen Interneuronen exprimiert wird. In den DRGs konnte die Expression in nicht-neuronalen Zellen nachgewiesen werden, wobei nur die NO-GC2 in Satellitenzellen detektiert werden konnte. Die NO-GC1 KO-Mäuse zeigten eine verringerte mechanische Hypersensitivität in neuropathischen Schmerzmodellen, aber ein normales Verhalten in Modellen inflammatorischer Schmerzen. Im Gegensatz zu diesen Ergebnissen zeigten die NO-GC2 KO-Mäuse ein erhöhtes Schmerzverhalten in Entzündungsmodellen, aber kein verändertes Verhalten in Modellen neuropathischer Schmerzen. Die gezielte Deletion der NO-GC1 und NO-GC2 in Interneuronen des Rückenmarks führte in den entsprechenden Tieren zu Verhaltensänderungen in der Schmerzwahrnehmung, die den Phänotypen der globalen NO-GC KO-Tieren in Schmerzmodellen ähnelte. Zusammengefasst zeigen die Daten dieser Arbeit, dass die NO-GC1- oder NO-GC2-vermittelte cGMP-Produktion in Interneuronen des Rückenmarks sehr wichtige, und teilweise gegensätzliche Funktionen bei der Verarbeitung chronischer Schmerzsignale einnimmt.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte der tonische BZR-Signalweg im Burkitt Lymphom näher untersucht werden. Ziel war die Identifizierung von Zielstrukturen, die für die Zellen essentiell für die Aufrechterhaltung des tonischen Signalwegs sind und gleichzeitig die Viabilität der Zellen fördern. Durch die Identifizierung noch unbekannter Zielstrukturen wäre man in der Lage, neue Behandlungsstrategien zu entwickeln oder bereits bestehende zu optimieren. Des Weiteren sollte die Signaltransduktion in der B-ALL, die über einen Vorläufer des BZRs, dem prä-BZR vermittelt wird, hinsichtlich eines tonischen Überlebenssignals untersucht werden.
Durch massenspektrometrische Analysen der tonischen BZR-Signaltransduktion im Burkitt Lymphom, die für die Viabilität der Zellen essentiell ist und die Ergebnisse eines Inhibitorscreens konnte HSP90 als potenzielle neue Zielstruktur im Burkitt Lymphom identifiziert werden.
So konnte gezeigt werden, dass Burkitt-Lymphom-Zellen nach Inhibition der Chaperonfunktion von HSP90 durch zwei auf dem Markt bereits verfügbare Inhibitoren einen Zellzyklusarrest erfahren, der letztlich zur Apoptose der Zellen führt. Dieser Effekt wurde auf einen Verlust des (tonischen) BZR-Signals zurückgeführt, der überwiegend durch den aktiven lysosomalen Abbau von SYK nach HSP90-Inhibition zustande kommt. Demnach führte die Überexpression einer HSP90-resistenten Variante von SYK (TEL-SYK) zu einer Aufhebung der apoptotischen Effekte nach HSP90-Inhibition. Zudem wurde SYK als Interaktionspartner von HSP90 (HSP90-Klientprotein) im Burkitt Lymphom und die für die Interaktion essentielle Phosphorylierungsstelle (pY197 in HSP90α bzw. pY192 in HSP90β) identifiziert bzw. validiert.
Das therapeutische Potenzial der HSP90-Inhibitoren im Burkitt Lymphom offenbarte sich ferner durch den Vergleich der Wirkungseffektivität in gesunden B-Zellen mit der in Tumorzellen. So zeigten HSP90-Inhibitoren eine erhöhte Affinität zu Tumorzellen. Bei verwendeten Konzentrationen der Inhibitoren, die bereits eine apoptotische Wirkung in Tumorzellen hervorriefen, waren gesunde B-Zellen resistent.
In der B-ALL konnte durch den Knockdown von CD79a und der Inhibition von SYK eine tonische Antigenrezeptor-Signalleitung identifiziert werden, die wie im Burkitt Lymphom über den PI3K/AKT-Signalweg vermittelt wird. Durch die Kombination der im Rahmen dieser Arbeit gewonnen Erkenntnisse und weiterführende Analysen (wie zum Beispiel durch Inhibitor- oder CRISPR/Cas-Screens) kann so eine Identifizierung von potenziellen Zielstrukturen mit therapeutischem Nutzen in der B-ALL erfolgen.
Zur Behandlung von chronisch entzündlichen Erkrankungen besteht nach wie vor ein dringendes medizinisches Bedürfnis, da die bisher eingesetzten Medikamente gerade in der Langzeittherapie zu schwerwiegenden Nebenwirkungen führen können. Um chronisch entzündliche Erkrankungen in Zukunft adäquat therapieren zu können, sind bereits verschiedene neuartige Ansätze in klinischer bzw. präklinischer Entwicklung. Ein möglicher Ansatz besteht in einer dualen Hemmung der mikrosomalen Prostaglandin E2 Synthase-1 (mPGES-1) und der 5-Lipoxygenase (5-LO). Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Struktur-Wirkungs-Beziehungen (SAR) von zwei verschiedenen Leitstrukturen an der 5 LO und der mPGES 1 untersucht. Die erste Leitstruktur entstammt aus den Arbeiten von Waltenberger et al. und besitzt im Grundgerüst eine Sulfonamidstruktur. In dieser Arbeit ist es gelungen, durch eine gezielte Untersuchung der Struktur-Wirkungsbeziehungen, die Leitstruktur I an der 5 LO und der mPGES-1 in ihrer Potenz zu optimieren. Die Leitstruktur (IC50: 5-LO (zellfrei) = 5.7 µM, IC50: 5 LO (PMNL) = 3.7 µM, IC50: mPGES-1 = 4.5 µM) konnte durch Variation in allen drei Positionen modifiziert werden, so dass die optimierte Struktur 170 (IC50: 5-LO (zellfrei) = 2.3 µM, IC50: 5-LO (PMNL) = 0.4 µM, IC50: mPGES-1 = 0.7 µM) entstanden ist. Für die Verbindung 170 wurden die pharmakokinetischen Eigenschaften, wie Löslichkeit und metabolische Stabilität, sowie der Wirkmechanismus auf molekularer Ebene bestimmt. Ebenso konnte für Verbindung 170 auch in vivo anti-entzündliche Eigenschaften festgestellt werden.
Die zweite Leitstruktur stammt ebenfalls aus den Arbeiten von Waltenberger et al. und besitzt im Grundgerüst eine Mercaptobenzothiazol-Grundstruktur. Aufgrund der Ähnlichkeit zu den bekannten Pirinixinsäurederivaten wurde auch hier für die Untersuchung der Struktur-Wirkungs-Beziehungen zunächst eine Kettenverlängerung an der Alkylkette vorgenommen. Es ließ sich auch hier durch eine gezielte SAR, die Leitstruktur bis hin zum submikromolaren Bereich in Verbindung 219 optimieren. Gleichzeitig ist es gelungen in Verbindung 219 einer der am potentesten dual ausgeglichensten dualen 5 LO/mPGES-1 Inhibitoren zu identifizieren.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in dieser Arbeit es gelungen ist durch gezielte Untersuchungen der Struktur-Wirkungs-Beziehungen zwei verschiedene Substanzklassen zu dualen 5-LO/mPGES-1 Inhibitoren zu optimieren. Ebenso konnte für Substanz 170 auch in vivo anti-entzündliche Eigenschaften festgestellt werden. Diese Arbeit soll dazu beitragen, das therapeutische Potential von dualen 5-LO/mPGES-1 Inhibitoren als anti-entzündliche Wirkstoffe in Zukunft besser einschätzen zu können.
Die eingereichte Dissertation liefert fundamentale Erkenntnisse zur Chemie nucleophiler Borzentren, die unter B•B-, B–B- und B=B-Bindungsbildungen reagieren. Zusammen mit den aufgedeckten Prinzipien zu (e–)-induzierten Umlagerungen des 9-Borafluorengrundgerüsts und Übertragungen von Hydridionen liegt nun ein umfassendes mechanistisches Wissen vor, das die effiziente Synthese neuartiger Moleküle ermöglicht. Im Folgenden ist eine Übersicht über bearbeitete Teilprojekte gegeben.
Durch Reduktion des Bis(9-borafluorenyl)methans 7 wurde über [7•]– (B•B-Einelektron-Zweizentrenbindung) und [7]2– (B–B-Zweielektronen-Zweizentrenbindung) das Tetraanion [7]4– dargestellt, das bei Zugabe von Elektrophilen unter Oxidation reagiert.
Die Injektion von Elektronen in das B(µ-H)2B dotierte Dibenzo[g,p]chrysen 12 führt in Abhängigkeit der Natur und der Stöchiometrie des eingesetzten Reduktionsmittels zu unterschiedlichen Hauptprodukten (bordotierte Dibenzo[g,p]chrysen- oder 9,9‘-Bifluorenylgrundkörper) mit verschiedenen Bindungsmodi (B–B-, B=B- oder (µ-H)B-B-Bindungen), deren Entstehung mechanistisch über Gerüstumlagerungen und Hydridübertragungen dargelegt wurde.
Durch die Zugabe etherischer HCl kann die B=B-Bindung in [37]2– quantitativ zu [116]– [(µ-H)B–B] oder 12 (B(µ-H)2B) protoniert werden. Umgekehrt lässt sich das scheinbar hydridische Diboran 12 durch sterisch anspruchsvolle Basen selektiv zu [116]– deprotonieren. Die kleine Base H3CLi führt neben der Deprotonierung von 12 auch zu einem Bis(9-borafluorenyl)methan, das ein verbrückendes Hydridion trägt ([125]–). Der Mechanismus wurde detailliert untersucht (z. B. wurde eine C–H-Aktivierung aufgeklärt), was u. a. genutzt werden konnte, um einen atomökonomischen Pfad von [37]2– zu [125]– zu etablieren.
Die Intermediate [132Cn,X]– (formale Addukte eines 9-Borafluorenyl-Anions an borständig substituierte 9-Borafluorene), gebildet durch die Zugabe von Halogenalkanen zu [37]2–, reagieren in Abhängigkeit der borständigen Alkylkette unter: (i) intramolekularer C–H-Aktivierung, (ii) intramolekularer Substitutionen oder (iii) intermolekularer Substitution.
Die Reduktion des 9-Borafluorens 6∙THF mit Lithium erzeugt das B=B-gebundene Dibenzo[g,p]chrysen-Dianion [37]2–, das 9-Borafluoren-Dianion [6]2–, das 9,9-Dihydroboratafluoren [34]– und das tetraanionische Bis(9-borafluorenyl) [146]4–.
Das 9-Borafluoren-Dianion [6]2–, das durch Reduktion von 6∙THF bei –78 °C mit Alkalimetallen selektiv dargestellt wurde, reagiert als formales Nucleophil. Über eine Reaktionskaskade gelang die selektive Synthese unterschiedlicher Produkte, die bei der literaturbekannten Reduktion des unsymmetrischen 9-Borafluoren-Dimers (6)2 mit Lithium in Toluol in Gegenwart von Et3SiBr beschrieben wurden. Hierüber konnte u. a. die Bildung eines organischen Derivats von [B3H8]– erklärt werden.
Die moderne Hauptgruppenchemie ermöglicht es Siliciumverbindungen in unterschiedlichen Oxidationsstufen und mit ungewöhnlichen Koordinations- umgebungen zu realisieren: Silane, Silylene, Disilene, Disiline und molekularer Sand (SiO2) können soweit stabilisiert werden, dass eine Charakterisierung gelingt. Ein Verständnis für die Eigenschaften und Reaktivitäten dieser Verbindungen eröffnet Perspektiven zur gezielten Synthese verschiedener Siliciumverbindungen. Industriell sind im wesentlichen zwei Substanzklassen interessant: Perchlorierte Silane, die als Vorstufen für die Abscheidung elementaren Siliciums als Halbleitermaterial Verwendung finden und Organo(Chlor)silane, die wichtige Bausteine für den Aufbau von Silikonen und für Hydrosilylierungsreaktionen darstellen. Im Rahmen dieser Dissertationsschrift wurden mittels quantenchemischer Rechnungen Schlüssel-intermediate für den Aufbau solcher Verbindungen identifiziert und durch Einblicke in den Reaktionsmechanismus das Fundament für ein tiefergehendes Verständnis der dynamischen kovalenten Chemie der Oligosilane gelegt. Dies geschah in enger Zusammenarbeit mit den experimentellen Arbeitsgruppen von Prof. Wagner und Prof. Auner.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Hochtemperatur-Komproportionierungsreaktion von gasförmigem Siliciumtetrachlorid und elementarem Silicium untersucht (Chem. Eur. J. 2017, 23, 12399). In einer Gasphasenreaktion entsteht dabei ein perchloriertes Polysilan (PCS) unbekannter Zusammensetzung. Im Ergebnis konnten wir zeigen, dass PCS eine komplexe Mischung verschiedener molekularer perchlorierter Silane darstellt, von denen lediglich cyc-Si5Cl10 experimentell eindeutig charakterisiert werden kann. Ausgehend von Dichlorsilylen als reaktive Spezies in der Gasphase zeigten DFT-Berechnungen, dass durch Silylendimerisierung, Silyleninsertion und eine Reihe von Isomerisierungsreaktionen der Aufbau cyclischer Perchlorsilane mit unterschiedlichem Silylierungsgrad gegenüber dem entsprechenden Aufbau acyclischer Perchlorsilane aus nicht umgesetzten Siliciumtetrachlorid bevorzugt stattfindet. PCS liefert ein 29Si-NMR- Spektrum mit einer verwirrenden Vielzahl verschiedener Signale, die auch anhand quantenchemisch berechneter 29Si-NMR-chemischer Verschiebungen nicht eindeutig zugeordnet werden konnten. Dennoch war eine Einteilung der berechneten Verschiebungen in Bereiche möglich, in denen Verschiebungen für Siliciumatome cyclischer und acyclischer Perchlorsilane mit einer bestimmten formalen Oxidationsstufe zu erwarten sind.
Weiterhin wurde der Chlorid-induzierte Aufbau perchlorierter Silane aus Si2Cl6 untersucht: Der Bildungsmechanismus für die durch Tillmann röntgen- kristallographisch charakterisierten perchlorierten Silikate und dianionischen (silylsubstituierten) Cyclohexasilane wurde in einer DFT-Studie untersucht und Schlüsselintermediate sowie stabile Zwischenstufen identifiziert (Chem. Eur. J. 2014, 20, 9234). Wir konnten zeigen, dass SiCl3– als reaktives Intermediat für die Si–Si Bindungsknüpfung verantwortlich ist. Die experimentell nachgewiesenen Silikate sind, mit einer Ausnahme für die ein anderes Konformer gefunden wurde, identisch mit den theoretisch vorhergesagten lokalen Minima. Sie entstehen durch eine Reihe von reversiblen Additions- und Isomerisierungsreaktionen. Dabei sind die acyclischen Silikate über Gleichgewichtsreaktionen miteinander verknüpft, wobei die berechneten Aktivierungsbarrieren für die Rückreaktion immer etwas höher sind als die Barrieren für den nächsten Aufbauschritt. Im Rahmen dieser Gleichgewichtsreaktionen entsteht nicht nur SiCl3–, sondern es können auch höhere Silanide eliminiert werden, die ab einer Größe von drei Siliciumatomen zu Cyclohexasilanen dimerisieren. Mit der head- to-tail Dimerisierung des bevorzugt gebildeten Silanids erklärt sich zwanglos das Substitutionsmuster aller röntgenkristallographisch charakterisierten zweifach silylsubstituierten Cyclohexasilane. Weiterhin ist es gelungen, den Reaktions- mechanismus für den Chlorid-induzierten Aufbau des dianionischen inversen Sandwichkomplexes [Si6Cl12*2Cl]2– aus HSiCl3 aufzuklären, in dem ebenfalls SiCl3– das Schlüsselintermediat darstellt. Letzteres entsteht durch die Eliminierung von HCl aus dem Chloridaddukt von HSiCl3. Der Reaktionsmechanismus beinhaltet Chlorid- abstraktionen, Hydridabstraktionen, Deprotonierungen, Silanid-Additionen, sowie Silanid-Eliminierungen, die nahezu gleichberechtigt nebeneinander vorkommen. Alle identifizierten Reaktionsschritte münden immer wieder in die Pfade, die bereits für den Aufbau aus Si2Cl6 gefunden wurden.
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