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Random constraint satisfaction problems have been on the agenda of various sciences such as discrete mathematics, computer science, statistical physics and a whole series of additional areas of application since the 1990s at least. The objective is to find a state of a system, for instance an assignment of a set of variables, satisfying a bunch of constraints. To understand the computational hardness as well as the underlying random discrete structures of these problems analytically and to develop efficient algorithms that find optimal solutions has triggered a huge amount of work on random constraint satisfaction problems up to this day. Referring to this context in this thesis we present three results for two random constraint satisfaction problems. ...
Hintergrund: Die Delegation ärztlicher Leistungen an nichtärztliches medizinisches Fachpersonal wird in Deutschland vor dem Hintergrund eines absehbaren Hausärztemangels bei gleichzeitig wachsendem Bedarf an hausärztlichen Betreuungsleistungen seit einiger Zeit diskutiert. Inzwischen wurden unterschiedliche Qualifikationsmodelle für Medizinische Fachangestellte (MFA) (z.B. die Versorgungs-assistentin in der Hausarztpraxis, VERAH) konzipiert und implementiert, die für eine Delegation von Leistungen qualifizieren. VERAH sind v.a. in Baden-Württemberg in Hausarztpraxen tätig, da deren Einsatz dort im Rahmen der Hausarztzentrierten Versorgung (HzV) seit 2008 finanziell honoriert wird. Dabei ist es den Praxen freigestellt, wie sie das VERAH-Konzept und damit auch die Delegation umsetzen. Auch gesetzliche Vorgaben zur Delegation lassen erheblichen Spielraum bei der Umsetzung. Erschwerend kommt hinzu, dass weiterhin Unklarheit darüber besteht, welche Leistungsübertragung als „Delegation“ und welche eher als „Substitution“ zu verstehen ist.
Zielrichtung der Arbeit: Ziel dieser publikationsbasierten Dissertation ist eine Darstellung der Formen und Graduierungen von Delegation, d.h. der tatsächlichen Umsetzung von Leistungsübertragung in der Hausarztpraxis am Beispiel der VERAH in Baden-Württemberg. Es können Empfehlungen für das Gelingen der Delegation aus der Analyse von Ergebnissen auf Patienten-, Praxis- und Teamebene abgeleitet werden.
Resultate: Diese Dissertation basiert auf sechs Publikationen, die im Rahmen von zwei Projekten zur Evaluation des VERAH-Einsatzes in der HzV in Baden-Württemberg entstanden. Die Evaluationen basieren auf einem Mixed Methods-Design, d.h. auf der Analyse von querschnittlich erhobenen quantitativen Daten sowie qualitativen Daten zu verschiedenen Fragen des VERAH-Einsatzes.
Es existiert ein breites Spektrum an Formen und Graduierungen der Delegation in Hausarztpraxen, die am HzV-Modell teilnehmen. VERAH übernehmen einerseits supplementäre (zusätzliche) ärztliche Tätigkeiten, wie z.B. Geriatrisches Assessment oder Impfberatungen, aber auch komplementäre (ergänzende) Tätigkeiten wie z.B. die Beratung der Angehörigen zu Hilfeleistungen im Gesundheitssystem. Vor allem im Rahmen von Hausbesuchen üben VERAH auch substituierende (ersetzende) Funktionen
aus. Auf Patientenseite sind gerade ältere, multimorbide und pflegebedürftige Patienten Empfänger delegierter Leistungen. Sie erhalten eine umfassende Betreuung und werden beim Erhalt ihrer häuslichen Selbständigkeit unterstützt. Die Patienten sehen in der VERAH eine zusätzliche Vertrauensperson in der Praxis und akzeptieren sie als kompetente Ansprechpartnerin. Die Hausärzte profitieren durch die Delegation von Tätigkeiten an VERAH, indem sie entlastet werden und Zeit für wichtige medizinische Aufgaben gewinnen. Für VERAH stellt die Delegation eine Erweiterung ihrer Tätigkeits- und Kompetenzbereiche dar und kann insofern als ein Schritt zur Professionalisierung des nichtärztlichen Personals einer Hausarztpraxis gelten.
Viele Faktoren, die zum Gelingen einer Umsetzung der Delegation beitragen, können vom hausärztlichen Team selbst beeinflusst werden. Darunter fallen das Engagement der MFA, die Qualifikation, zeitliche Flexibilität, ausreichend Gestaltungsspielraum, Grad der Autonomie, Abgrenzung des Verantwortungsbereiches und auch adäquates Equipment. Entsprechend richten sich die hier formulierten Empfehlungen meist an die Praxis, aber auch an den Gesetzgeber.
Bedeutung für die übergeordnete Fragestellung: Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass mit dem VERAH-Konzept erste Ansätze einer teambasierten Versorgung vorhanden sind, und dass sich die Analyse dieses Konzeptes eignet, um Desiderata für die Zukunft von Delegation (haus-)ärztlicher Leistungen an nichtärztliches Personal formulieren zu können. Teambasierte Ansätze bedürfen, wie auch internationale Beispiele verdeutlichen, einer Weiterentwicklung der bestehenden Delegationskonzepte in deutschen Hausarztpraxen. Idealerweise mündet eine mit Delegation einhergehende Aufgaben- und Rollenneuverteilung in einer Betreuungsform, in der alle Teammitglieder entsprechend ihrer Qualifikation an der Versorgung der Patienten in der Hausarztpraxis beteiligt sind. Daher kommt die Einbindung von Pflegekräften in die hausärztliche Versorgung genauso in Frage, wie auch speziell ausgebildete VERAH/MFA. In jedem Fall sollte über Schritte der Professionalisierung nichtärztlicher Berufsgruppen nachgedacht werden. Ob sich in Deutschland, wie in den USA und in Kanada, aus diesen Delegationskonzepten im Laufe der Zeit Substitution (im Sinne der Verantwortungsübertragung an nichtärztliche Berufsgruppen) entwickelt, bleibt abzuwarten. Die Ergebnisse der Dissertation zeigen, dass es mit der gegenwärtigen Umsetzung der Delegation an VERAH zu einer Erweiterung des Leistungsspektrums in den Hausarztpraxen kommen kann; eine Ausweitung der Delegation sollte jedoch zeitnah vorangetrieben werden.
Development and implementation of novel optogenetic tools in the nematode Caenorhabditis elegans
(2016)
Optogenetics, though still only a decade old field, has revolutionized research in neurobiology. It comprises of methods that allow control of neural activity by light in a minimally-invasive, spatio-temporally precise and genetically targeted manner. The optogenetic actuators or the genetically encoded light sensitive elements mediate light driven manipulation of membrane potential, intracellular signalling, neuronal network activity and behaviour (Fenno et al. 2011; Dugué et al. 2012). These techniques have been particularly useful for dissecting neural circuits and behaviour in the transparent and genetically amenable nematode model system Caenorhabditis elegans (Husson et al. 2013; Fang-yen et al. 2015).
In fact, C. elegans was the first living organism in which microbial rhodopsin based optogenetic tools (Channelrhodopsin-2 or ChR2, and Halorhodopsin or NpHR) were successfully implemented and bimodal 'remote' control of behaviour was achieved (Nagel et al. 2005; Zhang et al. 2007). Since then it has been a prominent model for the development and application of novel optogenetic tools and techniques, especially in the nervous system which comprises of 302 neurons and is organised in a hierarchical organization. The environmental stimuli are sensed by the sensory neurons, leading to the processing of information by the downstream interneurons, that relay to motor neurons which in-turn synapse onto muscles that drive the movement-based responses.
The microbial rhodopsins like ChR2 and NpHR mediate light driven depolarization and hyperpolarization, respectively and thereby activate or inhibit neural activity. However, they do not allow local control of membrane potential as they are expressed all over the plasma membrane of the cell rather than being restricted to specific domains, for example synaptic sites. Moreover, they completely over-ride the intrinsic activity of the cell, completely bypassing the signal transduction processes inside the cell. Thus, in order to study intracellular signalling and to answer questions pertaining to the endogenous role of receptors and channels in an in-vivo context, the optogenetic tool-kit needs to be expanded.
This thesis aimed at developing and implementing novel optogenetic tools in C. elegans that allow for sub-cellular signalling control as well as endogenous receptor control. These are: two light activated guanylyl cyclases (bPGC and BeCyclOp) to modify cyclic guanosine monophosphate (cGMP) mediated signalling in the sensory neurons, as well as attempts towards rendering endogenous C. elegans receptors - glutamate receptor (GLR-3/-6), acetylcholine receptor (ACR-16), glutamate gated chloride channel (GLC-1) light switchable and to understand their biological function in-vivo.
Organisms respond to sensory cues by activation of a primary receptor followed by relay of information downstream to effector targets by secondary signalling molecules. cGMP is a widely used 2nd messenger in cellular signaling, acting via protein kinase G or cyclic nucleotide gated (CNG) channels. In sensory neurons, cGMP allows for signal modulation and amplification, before depolarization. Chemo-, thermo-, and oxygen-sensation in C. elegans involve sensory neurons that use cGMP as the main 2nd messenger. For example, ASJ is the pheromone sensing neuron regulating larval development, AWC is the chemosensory neuron responding to volatile odours and BAG senses oxygen and carbon dioxide in the environment. In these neurons, cGMP acts downstream of the GPCRs and functions by activating cationic TAX-2/-4 CNG channels, thereby depolarising the sensory neuron. Manipulating cGMP levels is required to access signalling between sensation and sensory neuron depolarization, thereby provide insights into signal encoding. We achieve this by implementing two photo-activatable guanylyl cyclases - 1) a mutated version of Beggiatoa sp. bacterial light-activated adenylyl cyclase, with specificity for GTP (Ryu et al. 2010), termed BlgC or bPGC (Beggiatoa photoactivated guanylyl cyclase) and 2) guanylyl cyclase rhodopsin (Avelar et al. 2014) from Blastocladiella emersonii (BeCyclOp).
bPGC is a BLUF (blue light sensing using flavin) domain containing cyclase which uses FAD as the co-factor and catalyses the synthesis of cGMP from GTP upon activation by blue light. Prior to implementation in sensory neurons, a simpler heterologous system with co-expression of the TAX-2/-4 CNG channel in C. elegans body wall muscle (BWM) was used. The cGMP generated by the light activated cyclases activates the CNG channel leading to the muscle depolarization, thereby causing changes in body length which can be easily scored.
One of the main things that we as humans do in our lifetime is the recognition and/or classification of all kind of visual objects. It is known that about fifty percentage of the neocortex is responsible for visual processing. This fact tells us that object recognition (OR) is a complex task in our and in the animal brain, but we do it in a fraction of a second.
The main question is: How does the brain exactly do it? Does the brain use some feature extraction algorithm for OR tasks? The hierarchical structure of the visual cortex and studies on a part of the visual cortex called V1 tell us that our brain uses feature extraction for OR tasks by Gabor filters. We also use our previous knowledge in object recognition to detect and recognize the objects which we never saw before. Also, as we grow up we learn new objects faster than before.
These facts imply that the visual cortex of human and other animals uses some common (universal) features at least in the first stages to distinguish between different objects. In this context, we might ask: Do universal features in images exist, such that by using them we are able to efficiently recognize any unknown object? Is it necessary to extract new special features for any new object? How about using existing features from other tasks for this? Is it possible to efficiently use extracted feature of a specific task for other tasks? Are there some general features in natural and non-natural images which can also be used for specific object recognition? For example, can we use extracted features of natural images also for handwritten digit classification?
In this context, our work proposes a new information-based approach and tries to give some answers to the questions above. As a result, in our case we found that we could indeed extract unique features which are valid in all three different kinds of tasks. They give classification results that are about as good as the results reported by the corresponding literature for the specialized systems, or even better ones.
Another problem of the OR task is the recognition of objects, independently of any perception changes. We as humans or also animals can recognize objects in spite of many deformations (e.g. changes in illumination, rotation in any direction or angles, distortion and scaling up or down) in a fraction of a second. When observing an object which we never saw, we can imagine the rotated or scaled up objectin our mind. Here, also the question arises: How does the brain solve this problem? To do this, does the brain learn some mapping algorithm (transformation), independent of the objects or their features?
There are many approaches to model the mapping task. One of the most versatile ones is the idea of dynamically changing mappings, the dynamic link mapping (DLM). Although the dynamic link mapping systems show interesting results, the DLM system has the problem of a high computational complexity. In addition, because it uses the least mean squared error as risk function, the performance for classification is also not optimal. For random values where outliers are present, this system may not work well because outliers influence the mean squared error classification much more than probability-based systems. Therefore, we would like to complete the DLM system by a modified approach.
In our contribution, we will introduce a new system which employs the information criteria (i.e. probabilities) to overcome the outlier problem of the DLM systems and has a smaller computational complexity. The new information based selforganised system can solve the problem of invariant object recognition, especially in the task of rotation in depth, and does not have the disadvantage of current DLM systems and has a smaller computational complexity.
The fungal genus Pestalotiopsis s.l. contains approximately 300 described species and is globally distributed. The monotypic genus Pestalotia is considered the closest relative of Pestalotiopsis s.l. This study aims to investigate the diversity and systematics within Pestalotiopsis s.l. and its relation to Pestalotia. Therefore, an integrative approach is used considering molecular phylogeny methods as well as examination of morphological characters.
Recently, Pestalotiopsis s.l. was split into three genera with the addition of the newly erected Neopestalotiopsis and Pseudopestalotiopsis. The species of these genera are usually saprotrophic, phytoparasitic, or endophytic, and have been isolated from soil, air, and many kinds of anorganic material. The asexual fruiting bodies appear on infected plant material as black acervuli that release conidia. The conidia are important to examine for morphological taxon recognition. The number of conidial cells is the feature that distinguishes Pestalotiopsis s.l. spp. with five celled conidia, from Pestalotia pezizoides with six celled conidia. However, the significance of morphological characters is controversially discussed among mycologists. In recent years, 55 new species were described based on minor genetic distances and marginal or no morphological differences. Thus, the value of certain morphological characters and genetic markers need to be reconsidered.
In this study, 102 herbarium specimens of 26 described species, with an emphasis on plant pathogenic species from North America, have been morphologically examined and documented through drawings and photographs. Morphological examination was complemented with a comprehensive molecular dataset obtained from 191 cultures representing the genera Neopestalotiopsis, Pestalotia, Pestalotiopsis, Pseudopestalotiopsis, and Truncatella. One novelty of this work is that, besides the well-established markers ITS, TEF1, and ß-tubulin, the protein-coding genes MCM7 and TSR1 were successfully sequenced and included in the analyses. Phylogenies using Maximum Likelihood and Bayesian inference methods of single loci and the combined dataset were calculated. By comparison of these phylogenies, MCM7 was identified as the most powerful one in terms of phylogenetic resolution and statistical support of nodes and is proposed as an additional barcoding marker in Pestalotiopsis s.l.
In Pestalotiopsis, species delimitation was tested using the Baysian Phylogenetics and Phylogeography (BP&P) program that tests an existing species scenario against Bayesian inference methods under a multispecies coalescent model. The program supported only ten species out of the predetermined 19 species scenario. Measurements of conidia for species detected by BP&P were explored using a TukeyHSD-Test in the program R to find means that are significantly different from each other. This test revealed that combinations of morphological characters are required to distinguish between the ten species found by BP&P.
Another purpose of this work was to clarify the status of Pestalotia with regard to Pestalotiopsis s.l. Therefore, fresh epitypic material of Pestalotia pezizoides, was collected, isolated, and cultivated. The molecular analysis of a combined dataset of the gene regions ITS and LSU for species of Amphisphaeriales nested P. pezizoides in the genus Seiridium. Thus, synonymy of Pestalotia with Seiridium is proposed here. This is supported by morphology of the conidia. Further, an epitype is proposed for the type species of Pestalotiopsis, P. maculans. On the other hand, the recently proposed epitype of P. adusta is rejected here as it conflicts with the taxonomic hypothesis obtained in this study and its introduction is inconsistent with the formal requirements for epitypification. A new topotypic specimen is proposed instead. Additionally, several nomenclatural changes become necessary in many species examined. These include three new combinations and six synonyms of species of Pestalotiopsis s.l.
The conclusion of this work is that morphological data have potential as a valuable, inexpensive and easy way to recognize species. However, it is not the best method for species discovery and delimitation bearing in mind that in microfungi and many other organisms, individual plasticity and analogous structures are inadequately investigated. By phylogenetic analyses of molecular sequence data, it is possible to compare a great amount of equivalent characters and to delimit species that are morphologically cryptic. This is especially important since species of Pestalotiopsis s.l. mostly lack sexual structures that are helpful for morphological species delimitation in other groups of fungi. Thus, the Genealogical Concordance Species Concept (GCSC) finds its application in many fungal taxa. Conflicts in the genealogy between phylogenetic trees of different markers are interpreted as recombination of the genetic material within a linage. Accordingly, the change from conflict to congruence in a set of different phylogenetic trees can be seen as the species limit. It can be expected that increased application of the GCSC will lead to further approximation of described species numbers to the real number of species, especially in complicated groups like asexual microfungi.
Um die Funktionsweise von biologischen Prozessen zu untersuchen, werden Trigger-Signale benötigt, die die Prozesse initiieren können, ohne dabei dem Organismus zu schaden oder Nebenreaktionen hervorzurufen. Ein geeignetes Trigger-Signal stellt Licht dar, da es bei geeigneter Wellenlänge nichtinvasiv ist und nur wenige biologische Prozesse durch Licht gesteuert werden. Um einen Prozess mit Licht aktivierbar zu machen, benötigt man eine lichtsensitive Einheit, beispielsweise eine photolabile Schutzgruppe, die durch die Bestrahlung mit Licht einen zuvor blockierten Bereich freisetzt.
Hauptziel dieser Arbeit war es die Zweiphotonen-Technik für die Photolyse von photolabil geschützten Oligonukleotiden nutzbar zu machen und das Photolyseergebnis zu visualisieren.
Dazu wurden zunächst verschiedene mit Zweiphotonen-sensitiven Schutzgruppen modifizierte Phosphoramidite synthetisiert und über Festphasensynthese in Oligonukleotide eingebaut. Die Oligonukleotide mit den erstmals neu eingebauten Schutzgruppen ANBP und hNDBF wurden zunächst auf ihre Einphotonen-Eigenschaften, wie Schmelzpunkt, Absorptionsverhalten und Quantenausbeute untersucht. Weiterhin wurden erste Versuche zur wellenlängenselektiven Photolyse von hNDBF- und ANBP-geschützten Oligonukleotiden durchgeführt.
Die Existenz eines Zweiphotonen-induzierten Effekts kann durch die quadratische Abhängigkeit des erzeugten Effekts von der eingestrahlten Leistung nachgewiesen werden. Dazu wurde ein Verdrängungs-Assay entwickelt, dessen Doppelstrang-Sonde aus einem FRET-Paar besteht. Der Fluorophor-markierte Strang dient dabei als Gegenstrang zum photolabil geschützten Strang. Durch einen Thiol-Linker am photolabil geschützten Oligonukleotid konnte dieses erfolgreich in Maleimid-Hydrogele immobilisiert werden und der Verdrängungs-Assay im Gel durchgeführt werden. Die immobilisierten Stränge enthielten DEACM bzw. ANBP Schutzgruppen. Neben der quadratischen Abhängigkeit der Photolyse von der eingestrahlten Leistung konnten in diesen Hydrogelen auch 3D-aufgelöste Photolysen realisiert werden, die eindeutig die Zwei-Photonen-Photolyse belegen. Diese 3D-Experimente wurden zusammen mit Dr. Stephan Junek am MPI für Hirnforschung durchgeführt. Durch die Wahl zweier unterschiedlicher Sequenzen für die dTDEACM und dGANBP modifizierten Stränge und zwei unterschiedlicher Fluorophore für die Doppelstrang-Sonden, konnte die orthogonale Zweiphotonen-Photolyse gezeigt werden. Um zu zeigen, dass die Zweiphotonen-Photolyse von Oligonukleotiden auch in Organismen realisiert werden kann ohne das biologische System zu schädigen, wurde versucht den Verdrängungs-Assay auch in Zellen durchzuführen. Durch die Verwendung der Patch-Clamp-Technik in Zusammenarbeit mit Dr. Stephan Junek am MPI für Hirnforschung konnten die Stränge über die Elektrolyt-Lösung in Hippocampus-Neuronen eingebracht werden und durch Zweiphotonen-Bestrahlung dort photolysiert werden, was zu einem deutlichen Fluoreszenzanstieg führte. Durch die angeschlossene Patch-Clamp-Pipette konnten so zusätzlich elektrophysiologische Messungen durchgeführt werden, die zeigten, dass die durchgeführte Zweiphotonen-Bestrahlung nicht invasiv für die Zellen ist.
Die durchgeführten Experimente beweisen, dass Zweiphotonen-sensitive Schutzgruppen auf Oligonukleotiden photolysiert werden können und dass ihr Einsatz auch in biologischen Systemen möglich ist. Der entwickelte Verdrängungs-Assay ermöglicht es weiterhin neue photolabile Schutzgruppen auf Oligonukleotiden auf ihre Zweiphotonen-Sensitivität zu untersuchen.
Ein weiteres Projekt beschäftigte sich mit der Synthese der neuen Schutzgruppe DMA-NDBF-OH, die in-silico von der Arbeitsgruppe von Prof. Andreas Dreuw aus Heidelberg als effiziente Zweiphotonen-sensitive Schutzgruppe beschrieben wird. Es wurde versucht DMA-NDBF-OH über zwei Syntheserouten herzustellen. Eine Route basierte auf der Einführung der Funktionalitäten an einem unmodifizierten Dibenzofuran, die leider an der Bromierung der Seitenkette scheiterte. Die zweite Syntheseroute wurde in Anlehnung an die NDBF-Synthese von Deiters et al., bei der das Dibenzofuran durch eine Kondensation zweier modifizierter Benzolringe und einem Pd-katalysierten Ringschluss aufgebaut wird, durchgeführt. Mit dieser Syntheseroute konnte das DMA-NDBF-OH erfolgreich synthetisiert werden. Aufgrund ihrer starken bathochromen Verschiebung sollte sich diese Schutzgruppe hervorragend für die wellenlängenselektive Photolyse auf Ein- und Zweiphotonenebene eignen.
The condensation phase transition and the number of solutions in random graph and hypergraph models
(2016)
This PhD thesis deals with two different types of questions on random graph and random hypergraph structures.
One part is about the proof of the existence and the determination of the location of the condensation phase transition. This transition will be investigated for large values of $k$ in the problem of $k$-colouring random graphs and in the problem of 2-colouring random $k$-uniform hypergraphs, where in the latter case we investigate a more general model with finite inverse temperature.
The other part deals with establishing the limiting distribution of the number of solutions in these structures in density regimes below the condensation threshold.
Embryonale Stammzellen (ESCs) sind ein wichtiges Werkzeug zur Untersuchung der frühen embryonalen Entwicklung. ESCs können mit Hilfe neuer Technologien zur Modifikation von Genen (z.B. mit dem CRISPR/Cas9 System) genetisch manipuliert werden. Daraus resultierende „knockout“ ES Zelllinien können helfen, die physiologische Rolle von Proteinen während der Differenzierung zu verstehen.
Transkriptionsfaktoren, die schnell und spezifisch Signalwege regulieren, spielen während der Embryonalentwicklung und während der Differenzierung von ESCs in vielen verschiedenen Zelltypen eine essentielle Rolle. Der Transkriptionsregulator „Far Upstream Binding Protein 1“ (FUBP1) ist ein Protein, welches eine ganz bestimmte einzelsträngige DNA Sequenz, das „Far Upstream Sequenz Element“, erkennt, bindet, und dadurch Gene wie z.B c-myc oder p21 reguliert. Mit der Entwicklung zweier Fubp1 Genfallen Mausstämme (Fubp1 GT) sollte die Frage nach der physiologischen Funktion von FUBP1 beantwortet werden. Die homozygoten FUBP1-defizienten GT Embryonen sterben im Mutterleib ungefähr am Tag E15.5 der Embryonalentwicklung. Sie sind kleiner als Wildtypembryonen und zeigen ein anämisches Aussehen. Daher wurden diese Mausmodelle hinsichtlich der Hämatopoese untersucht, die zu diesem Zeitpunkt vor allem in der Leber stattfindet. Es konnte eine signifikante Reduktion der hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) festgestellt werden und zusätzlich war die langfristige Repopulation der FUBP1-/--Stammzellen im Knochenmark in Transplantationsexperimenten reduziert.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von FUBP1 in einem weiteren Stammzellsystem analysiert und gleichzeitig seine Bedeutung in anderen Zelltypen der frühen Embryonalentwicklung untersucht.
Die Quantifizierung der FUBP1 Expression in den ESCs und während der Differenzierung zu sogenannten `embryoid bodies` (EBs) zeigten eine starke Expression auf mRNA- und auf Proteinebene. Nach der erfolgreichen Optimierung der Differenzierung von murinen ESCs wurden Fubp1 „knockout“ (KO) ESC Klone mit Hilfe der CRISPR/Cas9 Technologie etabliert. Die molekularbiologische Analyse der ESCs zeigte eine signifikante Erhöhung der Oct4 mRNA-Expression, während Nanog und die Differenzierungsmarker Brachyury, Nestin und Sox17 unverändert und in vergleichbarer Menge zu den Kontrollen vorhanden waren. Während der Differenzierung der Fubp1 KO Klone zu EBs zeigte sich eine signifikante Reduktion mesodermaler Marker wie Flk-1, SnaiI, Snai2, Bmp4 und FgfR2. Mit Hilfe durchflusszytometrischer Analysen bestätigte sich die verzögerte Bildung mesodermaler Zellen (Brachyury- und Flk-1-exprimierender Zellen) in den Fubp1 KO Klonen der EBs an den Tagen 3, 4 und 5 nach Beginn der Differenzierung.
Die Anwendung einer Ko-Kultivierung auf OP9 Zellen zur Differenzierung der ESCs in hämatopoetische Linien sollte zeigen, ob der Fubp1 KO ESCs ein Defekt in der frühen Entwicklung hämatopoetischer Stammzellen zu beobachten ist. Erneut konnte am Tag 5 der ESC-Differenzierung in der OP9 Ko-Kultur eine signifikante Reduktion der mesodermalen (Flk-1+) Zellen festgestellt werden. Die weitere Differenzierung zu hämatopoetischen CD45+ Zellen zeigte jedoch keinen Unterschied im prozentualen Anteil CD45+ Zellen am Tag 12 der Differenzierung. Auch die gezielte Differenzierung zu erythroiden Zellen durch Zugabe des Zytokins EPO zum Medium zeigte keinen signifikanten Unterschied im Differenzierungsgrad der erythroiden Zellen zwischen Kontroll- und Fubp1 KO Klonen.
In weiteren Experimenten habe ich in dieser Arbeit die Expression von FUBP1 in WT Embryos an den Tagen E9.5 und E13.5 der Embryonalentwicklung untersucht. Hierbei zeigte sich in beiden Entwicklungsstadien eine immunhistochemische Anfärbung von FUBP1 in den meisten Zellen des Embryos. Die Annahme, dass die Abwesenheit von FUBP1 in der Embryonalentwicklung zu verstärkten apoptotischen Vorgängen führen könnte und gleichzeitig die massive Expansion von Zellen gestört sein könnte wurde mit Hilfe immunhistochemischer Färbung von „cleaved Caspase 3“ (Apoptosemarker) und „Ki-67“ (Proliferationsmarker) in den homozygoten Fubp1 GT Embryos an den Tagen E9.5 und E13.5 nicht bestätigt.
Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen darauf schließen, dass die Regulation von Apoptose und Proliferation durch FUBP1 während der Embryonalentwicklung nicht die Hauptrolle von FUBP1 darstellt. Es zeigte sich jedoch, dass FUBP1 als Transkriptionsregulator wichtig für die mesodermale Differenzierung von ESCs ist. Zu beobachten war, dass es in den FUBP1-defizienten ESCs zu einer Verzögerung der mesodermalen Differenzierung kommt. Es konnte bereits gezeigt werden, dass FUBP1 essenziell für die Selbsterneuerung von HSCs ist. Dies macht deutlich, dass FUBP1 neben der Proliferation und Apoptose ein breiteres Spektrum an Signalwegen reguliert, die für Stammzellen und deren Differenzierung von Bedeutung sind.
Bei Cryptochromen handelt es sich um Blaulichtrezeptoren der Cryptochrom-Photolyase-Proteinfamilie (CPF). Mitglieder dieser Proteinfamilie sind in allen Domänen des Lebens zu finden und haben eine essentielle Rolle in der Reparatur der DNA sowie der lichtgesteuerten Regulation der Expression. Cryptochrome sind in der Regel keine DNA-reparierenden Proteine. Sie sind regulativ an der Steuerung der inneren Uhr und des Zellzyklus der Organismen beteiligt. In der Kieselalge Phaeodactylum tricornutum konnten bisher sechs phylogenetisch unterschiedliche Mitglieder der CPF identifiziert werden. Bei CryP handelt es sich um das einzige pflanzenähnliche Cryptochrom der photoautotrophen Diatomee. Für das Protein CryP konnte bereits ein blaulichtinduzierter Photozyklus durch die Absorption der Chromophore 5-Methenlytetrahydrofolat (MTHF) und Flavinadenindinukleotid (FAD) gezeigt werden. Außerdem ist eine regulative Wirkung des Proteins auf die Lichtsammelkomplexe (Lhc) der Diatomee bekannt. Für eine weitere Charakterisierung des CryPs wurde in dieser Arbeit zunächst das Absorptionsverhalten unter verschiedenen Wellenlängen beobachtet, um so einen Einblick in eine mögliche Aktivierung und Deaktivierung des Proteins durch Licht unterschiedlicher Wellenlängen zu erlangen. Es zeigte sich hierbei eine mit pflanzlichen Cryptochromen vergleichbare Anreicherung verschiedener Redoxzustände des FADs in Abhängigkeit von der Wellenlänge.
Für eine Aufklärung der Wirkungsweise des CryP-Proteins wurden verschiedene Hypothesen untersucht: Die phylogenetische Nähe und ein ähnliches Absorptionsverhalten des CryPs zu Cryptochromen mit Reparaturfähigkeit für einzelsträngige DNA (Cry-DASH) führte zu einer Untersuchung des Proteins als möglicher Transkriptionsfaktor. Hierfür konnte eine Kernlokalisation des Proteins nachgewiesen werden, was Rückschlüsse auf eine potentielle Regulation der Expression mittels DNA-Bindung zulässt. Außerdem wurde gezeigt, dass CryP DNA-Bindefähigkeit besitzt. Die bisher nachgewiesenen Bindungen waren jedoch unspezifischer Art. Dies konnte auch für die Promotersequenz eines der durch CryP regulierten Gene lhcf1 festgestellt werden. Auf Grund der unspezifischen DNA-Bindung wurde eine zweite Hypothese für CryP untersucht: CryP wirkt regulativ auf die Expression verschiedener Gene durch Protein-Protein-Interaktionen und ist Teil einer Reaktionskaskade zur Signalweiterleitung in P. tricornutum.
Durch die Untersuchung der zweiten Hypothese konnten drei Interaktionspartner für CryP identifiziert und eine Interaktion verifiziert werden. Hierbei handelt es sich um das Protein AAA mit einer bisher unbekannten Funktion und das Protein BolA, welches Teil der zuerst in Escherichia coli identifizierten BolA-like-Proteinfamilie ist. Außerdem konnte eine Interaktion mit dem Cold-Shock-Domänen-Protein CSDP gezeigt werden. Bei den Proteinen BolA und CSDP handelt es sich um potentiell regulierende Faktoren der Transkription und Translation, was Teil einer Reaktionskaskade sein kann. Die aus anderen Organismen bekannten Funktionen des BolA-Proteins überschneiden sich mit den in CryP-Knockdown-Mutanten beobachteten Effekten. Sie zeigen eine erhöhte Sensitivität für Stresssituationen wie abweichende Nährstoffkonzentration, Osmolaritäten und Temperaturen. Diese Beobachtungen stellen einen Zusammenhang der durch einen CryP-Knockdown beobachteten Effekte und der CryP-BolA-Interaktion her. Durch Homologien zu Cold-Shock-Proteinen aus Chlamydomonas reinhardtii gibt die CryP-Interaktion mit dem Protein CSDP Hinweise auf einen potentiellen Mechanismus zur Regulation der Lhc-Proteine, für welche zuvor ein CryP-abhängiger Effekt beschrieben war.
Über die Protein-Protein-Interaktionen hinaus wurde die Phosphorylierung des CryPs als Möglichkeit der Signalweiterleitung untersucht. Es konnte eine reversible Phosphorylierung des heterolog aus E. coli isolierten CryPs gezeigt werden. Diese zeigt Ähnlichkeiten zu bekannten Phosphorylierungen pflanzlicher Cryptochrome und gibt Hinweise auf einen Mechanismus der Signalweiterleitung.
Durch die Untersuchung der CryP-regulierten Transkription mit P. tricornutum CryP-Knockdown-Mutanten durch Next-Generation-Sequencing (NGS) konnte die Hypothese der regulativen Proteinkaskade und der Signalweiterleitung weiter bestätigt werden. Die Auswirkungen des CryPs auf die Transkription erwiesen sich als nicht auf einen Teilbereich des Metabolismus begrenzt, sondern sind in einem großen Teil der funktionellen Gengruppen in P. tricornutum zu sehen. Außerdem konnten drei Klassen CryP-regulierter Gene festgestellt werden. Kategorie 1: die ausschließlich unter Blaulicht regulierten Gene; Kategorie 2: die sowohl unter Blaulicht als auch im Dunkeln regulierten Gene und Kategorie 3: die ausschließlich im Dunkeln regulierten Gene. Ein im Dunkeln und unter Blaulicht jeweils unterschiedlicher regulativer Effekt deutet auf eine Doppelfunktion des CryPs hin. Möglicherweise hat das Cryptochrom unterschiedliche lichtabhängige und lichtunabhängige Funktionen.
Durch die Analyse der CryP-regulierten Genexpression konnte außerdem ein Zusammenhang zwischen CryP und weiteren Photorezeptoren gezeigt werden. Der CryP-Proteingehalt in der Zelle hat einen regulativen Einfluss auf das CPF1-Protein, eine Photolyase mit dualer Funktion aus der gleichen Proteinfamilie. Zusätzlich konnte auch ein Einfluss auf die Lichtsensitivität der Genexpression des Rotlichtrezeptors Phytochrom (DPH) durch CryP gezeigt werden. Vergleichbar mit höheren Pflanzen scheint ein regulatives Netzwerk der Photorezeptoren auch in der Diatomee P. tricornutum vorhanden zu sein.
Für die Optimierung sowie Entwicklung lichtsteuerbarer Systeme für biologische Anwendungen oder neue Materialien ist ein detailliertes Verständnis der zugrunde liegenden komplexen, lichtinduzierten Prozesse eine Voraussetzung. Die Verwendung von Photoschaltern in Makromolekülen ermöglicht eine zeitliche und örtliche Kontrolle über strukturelle Änderungen sowie die entsprechend folgenden (biologischen) Funktionen durch die Verwendung von Licht als externem Auslöser.
Ein wichtiger Bestandteil dieser Arbeit befasst sich mit der Entwicklung eines auf Licht reagierenden Riboschalters, welcher die gezielte Kontrolle über Genexpression ermöglicht. Hierzu wurde eine spektroskopische Charakterisierung von verschiedenen Photoschaltern bezüglich einer Verwendung als biologischer Ligand sowie der Wechselwirkungen zwischen Azobenzolen und RNA, auch hinsichtlich ihrer Bindungsdynamiken durchgeführt. Zunächst wurde die hohe Abhängigkeit der (photo-)chemischen Eigenschaften der Azobenzole von der Wahl der Substituenten untersucht, wobei besonders die Anwendung in wässrigem Milieu betrachtet wurde. In einer detaillierten (zeitaufgelösten) Studie wurde der positionsabhängige Einfluss der Hydroxy-Substitution von Azobenzolen auf die Photoisomerisierung in wässriger Lösung untersucht. Für eine ortho-Substitution ergab sich hierbei ein alternativer Deaktivierungskanal nach Photoanregung, welcher stärker ausgeprägt ist als die Isomerisierung. Hierbei wird ein intramolekularer Protontransfer im angeregten Zustand (ESIPT) beobachtet, welcher mit einer Zeitkonstante von 0.3 ps beschrieben werden kann und in einer Keto-Spezies resultiert. Eine Keto-Enol-Tautomerie konnte für die para-Hydroxy-Substitution schon im Grundzustand beobachtet werden. Somit können beide Spezies gezielt adressiert werden. Durch Acetylierung der Hydroxygruppe verlangsamt sich die thermische Relaxation des cis-Isomer zu dem entsprechenden trans-Isomer signifikant ohne die Isomerisierung zu beeinträchtigen. Dementsprechend ermöglicht eine solche Acetylierung die Verwendung von bekannten Azobenzolderivaten als Photoschalter.
Zudem werden in dieser Arbeit zwei verschiedene Herangehensweisen in der Entwicklung eines Riboschalters beschrieben, welcher sich durch Licht regulieren lässt.
Diese sind durch kovalentes bzw. nicht-kovalentes Einbringen eines Azobenzolderivats in die RNA Struktur charakterisiert. Ein neuer Linker, welcher auf einer Desoxyribose-Struktur beruht, wird für die kovalente Anbindung des Azobenzols an den RNA Strang präsentiert, welcher eine licht-induzierte Dehybridisierung ermöglichen soll. Eine außergewöhnlich hohe Schaltamplitude mit einem cis-Gehalt von etwa 90% konnte für das Azobenzol im RNA Einzelstrang schon bei Raumtemperatur ermittelt werden. Zudem wurde der Einfluss des Photoschalters sowie der benachbarten Nukleotide in der RNA auf die Stabilität der RNA Doppelhelix untersucht. Die zweite Vorgehensweise beruht auf einer nicht-kovalenten Bindung zwischen einem Azobenzolderivat und einem RNA-Aptamer, welche lediglich für eines der Photoisomere ermöglicht wird, wodurch eine örtliche und zeitliche Kontrolle der Ligandenbindung der RNA erfolgt. Im Rahmen dieser Arbeit war es möglich zwei verschiedene photoschaltbare RNA Aptamere zu identifizieren und zu untersuchen, welche eine hohe Spezifität und Affinität aufweisen. Zudem wurde die Photoisomerisierung des Azobenzols innerhalb der RNA-Struktur sowie daraus resultierende lichtinduzierte Konformationsänderungen der RNA mittels zeitaufgelöster Anreg-/Abtastspektroskopie untersucht. Die daraus resultierende Dynamik der photoinduzierten Ligandenbindung sollte eine weitere gezielte Optimierung lichtschaltbarer biologischer Systeme erlauben.
Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der zeitaufgelösten Untersuchung eines photoschaltbaren Foldamers. Speziell wurde der strukturelle Übergang des OmPE-Foldamers 10-5 zwischen einer definierten helikalen und einer ungefalteten Konformation auf Grund der Photoisomerisierung der, in das Rückgrat integrierten, Azobenzole untersucht.
Dabei konnten die frühen (Ent-)Faltungsmechanismen des Foldamers im sub-Nanosekunden-Zeitbereich beobachtet werden, welche durch quantenmechanische Rechnungen unterstützt werden konnten. Darüberhinaus, war es möglich einen Anregungsenergietransfer vom PE-Rückgrat des Foldamers auf die Azobenzole nachzuweisen, welcher die Lebensdauer der angeregten Zustände des Systems signifikant verkürzt.
Diese Arbeit liefert wichtige Informationen zu den Reaktionspfaden, den gezielten Wechselwirkungen zwischen Photoschaltern und größeren organischen Molekülen, sowie den daraus resultierenden lichtinduzierten strukturellen Änderungen durch die Anwendung einer Vielzahl an (zeitaufgelösten) spektroskopischen Methoden. Diese Ergebnisse tragen zum weiteren Verständnis komplexer Prozesse in biologischem sowie nicht-biologischem Zusammenhang und somit zu einer weiterführenden Entwicklung neuer Systeme bei.
Algorithms for the Maximum Cardinality Matching Problem which greedily add edges to the solution enjoy great popularity. We systematically study strengths and limitations of such algorithms, in particular of those which consider node degree information to select the next edge. Concentrating on nodes of small degree is a promising approach: it was shown, experimentally and analytically, that very good approximate solutions are obtained for restricted classes of random graphs. Results achieved under these idealized conditions, however, remained unsupported by statements which depend on less optimistic assumptions.
The KarpSipser algorithm and 1-2-Greedy, which is a simplified variant of the well-known MinGreedy algorithm, proceed as follows. In each step, if a node of degree one (resp. at most two) exists, then an edge incident with a minimum degree node is picked, otherwise an arbitrary edge is added to the solution.
We analyze the approximation ratio of both algorithms on graphs of degree at most D. Families of graphs are known for which the expected approximation ratio converges to 1/2 as D grows to infinity, even if randomization against the worst case is used. If randomization is not allowed, then we show the following convergence to 1/2: the 1-2-Greedy algorithm achieves approximation ratio (D-1)/(2D-3); if the graph is bipartite, then the more restricted KarpSipser algorithm achieves the even stronger factor D/(2D-2). These guarantees set both algorithms apart from other famous matching heuristics like e.g. Greedy or MRG: these algorithms depend on randomization to break the 1/2-barrier even for paths with D=2. Moreover, for any D our guarantees are strictly larger than the best known bounds on the expected performance of the randomized variants of Greedy and MRG.
To investigate whether KarpSipser or 1-2-Greedy can be refined to achieve better performance, or be simplified without loss of approximation quality, we systematically study entire classes of deterministic greedy-like algorithms for matching. Therefore we employ the adaptive priority algorithm framework by Borodin, Nielsen, and Rackoff: in each round, an adaptive priority algorithm requests one or more edges by formulating their properties---like e.g. "is incident with a node of minimum degree"---and adds the received edges to the solution. No constraints on time and space usage are imposed, hence an adaptive priority algorithm is restricted only by its nature of picking edges in a greedy-like fashion. If an adaptive priority algorithm requests edges by processing degree information, then we show that it does not surpass the performance of KarpSipser: our D/(2D-2)-guarantee for bipartite graphs is tight and KarpSipser is optimal among all such "degree-sensitive" algorithms even though it uses degree information merely to detect degree-1 nodes. Moreover, we show that if degrees of both nodes of an edge may be processed, like e.g. the Double-MinGreedy algorithm does, then the performance of KarpSipser can only be increased marginally, if at all. Of special interest is the capability of requesting edges not only by specifying the degree of a node but additionally its set of neighbors. This enables an adaptive priority algorithm to "traverse" the input graph. We show that on general degree-bounded graphs no such algorithm can beat factor (D-1)/(2D-3). Hence our bound for 1-2-Greedy is tight and this algorithm performs optimally even though it ignores neighbor information. Furthermore, we show that an adaptive priority algorithm deteriorates to approximation ratio exactly 1/2 if it does not request small degree nodes. This tremendous decline of approximation quality happens for graphs on which 1-2-Greedy and KarpSipser perform optimally, namely paths with D=2. Consequently, requesting small degree nodes is vital to beat factor 1/2.
Summarizing, our results show that 1-2-Greedy and KarpSipser stand out from known and hypothetical algorithms as an intriguing combination of both approximation quality and conceptual simplicity.
The human Long Interspersed Nuclear Element-1 (LINE-1, L1) is a member of the group of autonomous non-LTR retrotransposons found in almost every eukaryotic genome. L1 elements generate copies of themselves by reverse transcription of an RNA intermediate and integrate into the host genome by a process called Target Primed Reverse Transcription (TPRT). They are responsible for the generation of approximately 35% of the human genome, cover about 17% of the genome and represent the only group of active autonomous transposable elements in humans. L1 activity bears several risks for the integrity of the human genome, since the L1-encoded protein machinery generates DNA double-strand breaks (DSBs) and is capable of conducting numerous genome-destabilizing effects, e.g. causing deletions at insertion sites, disrupting or rearranging coding sequences and deregulating transcription of functional host genes. On the other side, L1 elements have had and still exert a great impact on human genome structure and evolution by increasing the genome size and rearranging and modulating gene expression. Furthermore, due to its endogenous and generally non-pathogenic nature, L1 is a promising candidate as vector for gene delivery in somatic gene therapy. The structure of the flanking regions between de novo L1 integrants and the genomic sequence suggests an involvement of cellular DSB repair pathways in L1 mobilization. To elucidate the role of DSB repair proteins in L1 retrotransposition, I disabled DSB repair factors ATM, ATR, DNA-PK, p53 and Ku70 by knock down (KD) using short hairpin RNA (shRNA) expression constructs. To inhibit the function of DSB repair factors PARP and Rad51, I used dominant negative (DN) PARP and Rad51 mutants. Applying a well established L1-retrotransposition reporter assay in HeLa cells, de novo retrotransposition events were launched in order to test L1 for its retrotransposition activity in the context of altered DSB repair conditions. I could show that L1 retrotransposition frequency after ATM KD had increased by 3-fold, while ATR and p53 KD reduced L1 retrotransposition by approximately one third. Unfortunately, the cytotoxic effects of the DNA-PK and Ku70 shRNA expression constructs were too strong to determine potential effects of DNA-PK and Ku70 KD on L1 retrotransposition. Inhibition of PARP function by expression of the DN mutant and overexpression of wild type PARP were found to increase L1 retrotransposition by 1.8 and 1.5, respectively, while Rad51 DN had no detectable effect. Interestingly, overexpression of wild type Rad51 seemed to roughly double L1 retrotransposition frequencies. Since in my experiments KD or expression of DN mutants was time-delayed to the onset of L1 retrotransposition after transfection into the cells, I developed a temporally controllable, tetracyclin transactivator (tTA)-dependent L1 retrotransposition reporter assay which will be of great value for future L1 retrotransposition studies that rely on temporally controllable retrotransposition. Due to a previously published hypothesis of L1 playing a role in brain development by contributing to somatic mosaicism in neuronal precursor cells, I generated a transgenic mouse (LORFUS) using the tTA-dependent L1 construct to further test this hypothesis. LORFUS harbors a bidirectional cassette driving simultaneous expression of a GFP-tagged L1 retrotransposition reporter and beta-galactosidase. It was bred to another transgenic mouse line expressing tTA in the forebrain. The double transgenic offspring was used to characterize L1 expression and retrotransposition patterns in the brain at postnatal day 15 (P15). General transgene expression indicated by beta-galactosidase activity was found in hippocampus, cortex and striatum, while retrotransposition events revealed by GFP expression were found in hippocampus, cortex, striatum, olfactory bulb and brainstem. These results suggested L1 retrotransposition in the granule layer of the dentate gyrus earlier than P15 and migration of cells carrying these events along the rostral migratory stream into the olfactory bulb. To facilitate the use of L1 as gene delivery tool in gene therapy or genetic engineering, I furthermore intended to manipulate the L1 target site recognition to allow the site-specific integration into defined genomic locations. To this end, I performed crystal structure-guided mutational analysis exchanging single amino acid residues within the endonuclease (EN) domain of L1 to identify residues influencing target site recognition. However, individual point mutations did not change the nicking pattern of L1-EN, but resulted in a reduction of endonucleolytic activity reflected by a reduced retrotransposition frequency. This suggests that additional factors other than the DNA nicking specificity of L1-EN contribute to the targeted integration of non-LTR retrotransposons in the host genomes.
Die Etablierung der Festphasensynthese innerhalb der letzten Jahrzehnte macht hoch modifizierte Oligonukleotide verfügbar. Damit werden Methoden wie Einzelmolekül-aufgelöstes Tracking möglich, um beispielsweise den Weg einer einzelnen RNA von der Transkriptionsstelle im Nukleus bis zur Proteinbiosynthese im Cytoplasma verfolgen und kritische Stelle verstehen zu können. In den letzten Jahren entwickelten sich auch vermehrt Fragen zur lokalen Proteinsynthese. Dabei nimmt man besonders im Fall von polaren Zellen wie Neuronen an, dass die Proteinbiosynthese nicht global im Cytosol stattfindet, sondern es einen Transport der „ruhenden“ RNA bis zu dem Ort geben muss, an dem das entsprechende Protein lokal benötigt wird. In dieser vorliegenden Arbeit sollen nun in zwei Hauptprojekten molekulare Werkzeuge entwickelt werden, mit deren Hilfe oben genannte Fragestellungen in Zukunft beantwortet werden könnten. Im ersten Hauptprojekt wurde dazu eine neue Generation lichtaktivierbarer Molecular Beacons (von engl.: molekulare Leuchtfeuer) entwickelt. Dabei handelt es sich um Oligonukleotide, die komplementär zu einer intrazellulären RNA-Sequenz (Target-RNA) sind und mit Fluorophor und Fluoreszenz-Quencher modifiziert werden. Bei den lichtaktivierbaren Designs kann Fluoreszenz detektiert werden, wenn der Molecular Beacon an seine Targetsequenz gebunden und zusätzlich zuvor eine Lichtaktivierung stattgefunden hat. Im Gegensatz zu früheren Designs wurde bei diesem hier vorgestellten Molecular Beacon der Fluorophor mit Hilfe eines zweiten photoabspaltbaren Quenchers verbunden. Dadurch kann der Beacon an seine Targetsequenz binden, obwohl noch keine Lichtaktivierung stattgefunden hat. Fluoreszenz kann allerdings erst nach photoinduzierter Abspaltung des zusätzlichen Quenchers detektiert werden. In der vorliegenden Studie konnten dadurch extrem gute Signal-zu-Rausch-Verhältnisse von bis zu 170:1 erreicht werden. Zusätzlicher Vorteil dieses Designs ist die Tatsache, dass eine Vielzahl kommerziell erhältlicher Fluorophor-Quencher-Paare verwendet werden kann. Dabei ist es nicht relevant, ob der entsprechende Farbstoff co-synthetisch während der Festphasensynthese oder post-synthetisch durch die Modifikation funktioneller Gruppen angebracht wird. Nach anfänglichen in vitro Tests wurden die besten Molecular Beacons in vivo in der Zuckmücken-Art Chironomus tentans getestet. Dieser Organismus ist aufgrund seiner Polytänchromosomen, der sog. Balbiani Ringe, interessant. Dabei handelt es sich um ein Chromosom, das viele Chromatiden mit jeweils identischen Gensequenzen enthält. Diese Balbiani Ringe haben eine sehr charakteristische Struktur. Die Molecular Beacons wurden in den Zellkern injiziert und anschließend photoinduziert. Auch in den in vivo Messungen zeigte sich die Überlegenheit des neuen Design mit Signal-zu-Rausch-Verhältnissen von bis zu 80:1. Im zweiten Hauptprojekt war es das Ziel, lokale mikroRNA-Reifung in Neuronen nachzuweisen bzw. sichtbar zu machen. MikroRNA (kurz miRNA) ist einer der wichtigsten zellulären Werkzeuge, um Genregulation auf post-transkriptioneller Ebene zu ermöglichen. Für dieses Projekt wurde eine Sonde entwickelt, die den nativen miRNA-Vorläufer – die sog. prä-miRNA – nachbildet. Der enzymatische Reifungsprozess durch die RNase Dicer sollte durch Fluoreszenz nachweisbar sein. Dies gelang durch Modifikationen der Sequenz um die enzymatische Schnittstelle herum. Durch den Dicer-vermittelten, enzymatischen Verdau wurde ein Fluorophor von einem Quencher getrennt, wobei der fluoreszente Farbstoff an der reifen mikroRNA verblieb. Nach der Etablierung der in vitro Tests und Auswahl des optimalen Fluorophor-Quencher-Paars zeigte sich in einem Kontrollexperiment, dass bei Verwendung von neuronalen Ganglien aus Dicer-Knock-Out Mäusen kein Fluoreszenzanstieg zu beobachten war. Dieses Experiment bewies, dass bisher beobachtete Fluoreszenzanstiege Dicer-spezifisch waren. Im nächsten Schritt wurden in vivo Messungen durchgeführt. Es zeigte sich dabei, dass die sog. Patch Clamp Technik herkömmlichen Transfektionsmethoden überlegen war. Unter normalen Bedingungen zeigte sich sowohl im Soma als auch in den Dendriten ein Fluoreszenzanstieg. Durch Depolarisation des Neurons konnte dieser Effekt noch verstärkt werden, wobei das somatische Signal grundsätzlich als höher einzustufen war. Interessanterweise führte eine Blockade der NMDA-Rezeptoren auch bei gleichzeitiger Depolarisation zu einer verringerten Fluoreszenz. Dies lässt darauf schließen, dass die Reifung der untersuchten prä-miRNA in Dendriten von der Aktivität des NMDA-Rezeptors bzw. einem als Konsequenz ansteigenden Ca2+-Spiegels in der Zelle abhängig ist. In einem weiteren Experiment wurde nach „Beladung“ eines Neurons mit der prä-miRNA-Sonde Dendriten punktuell aktiviert. Dies konnte durch Licht-aktivierbares Glutamat erreicht werden. Im zentralen Nervensystem gilt Glutamat als der wichtigste aktivierende Neurotransmitter. Es konnte beobachtet werden, wie einerseits Fluoreszenz lokal an der aktivierten Stelle anstieg und gleichzeitig sog. dendritische Spines wuchsen. Zum Teil war auch ein Wachstum benachbarter Spines zu beobachten. Dabei handelt es sich um pilzförmige Aussackungen der Dendriten an Stellen, an denen Vernetzungen zu Synapsen anderer Neuronen existieren. Als Ergebnis kann geschlussfolgert werden, dass es eine lokale Reifung der untersuchten prä-miRNA durch Dicer in Dendriten gibt. Dieser Prozess kann sehr spezifisch und lokal durch die Aktivierung einzelner synaptischer Verbindungen initiiert werden.
Since 2009 has the central Nigerian Nok Culture – until then primarily known for its highly artistic terracotta figurines and early evidence of iron working in the first millennium BCE – been the focus of a research project by the Goethe University Frankfurt/Main, Germany. The analysis of Nok sculptures has so far been almost entirely restricted to their stylistic features which show such great similarities that one hypothesis of the Frankfurt project has been the possible central production of these artfully crafted figurines.
This volume, written within the scope of a dissertation project completed in 2015, challenges this hypothesis by using scientific materials analysis. Combining the results of the mineralogical and geochemical analyses as well as geographic and geological observations, an alternative model for the organisation and procedure of the manufacture of the famous Nok terracottas is suggested.
They were – as the domestic pottery that is used for comparison and differentiation in this study – manufactured with locally available raw materials (clay and temper) but in different manufacturing sequences with regard to temper and clay composition. The terracottas’ clay was obviously reserved for their production only, demonstrating – aside from stylistic similarities – the value these figurines had during the Nok Culture.
Invasive non-native species are key components of human-induced global environmen-tal change and lead to a loss of biodiversity, alterations of species interactions and changes of ecosystem services. Freshwater ecosystems in particular are strongly affect-ed by biological invasions, since they are spatially restricted environments and often already heavily impacted by anthropogenic activities. Recent human-induced species invasions are often characterized by long-distance dispersal, with many species having extended their native distribution range within a very short time frame. However, a long term view into the past shows that biological invasions are common phenomena in nature—representing the arrival of a species into a location in which it did not originally evolve—as a result of climatic changes, geotectonic activity or other natural events. Once a species arrives in a new habitat, it may experience an array of novel selection pressures resulting from abiotic and biotic environmental factors and simultaneously act as a novel selective agent on the native fauna. Consequences of species invasions are manifold. My thesis, which combines seven studies on different aspects of biological invasions, aims to explore the influence of abiotic stressors and biotic interactions during species introductions and range expansions, as well as the consequences of biological invasions on evolutionary and ecosystem processes.
The first part of my thesis examines human-induced biological invasions, dealing with basic ecological characteristics of invaded ecosystems, novel predator-prey interactions, functional consequences of species invasions and certain behavioral traits that may contribute to the invasiveness of some species. The second part of my thesis examined distribution patterns and phenotypic trait divergence in species that historically invaded new geographical areas. I investigated variation of abiotic and biotic selection factors along a stream gradient as well as ecological and evolutionary consequences of species invasions to extreme habitats. The results highlight the importance of simultaneously considering processes involved in natural invasions and during human-induced invasions to understand the success of invading species.
We often lack detailed information on the impacts of historical biological inva-sions. Also, we are currently lacking crucial knowledge about the time scales during which different mechanisms (behavioral flexibility, plastic phenotypic changes, and ge-netic adaptation) play a role during biological invasions and affect species exchange and establishment. Comparative analyses of historical, natural invasion and recent (man-made) invasions can provide insights into the relative importance of the processes governing adaptation to abiotic stressors and selection resulting from biotic interactions. Beyond their negative effects, the establishment of invasive species and the subsequent range expansion represent “natural experiments” to investigate fundamental questions in ecology and evolution. My comparison of natural and human-induced biological invasions revealed that in many cases preadaptation to altered abiotic conditions plays a key role during early stages of invasions and range expansions. Considering the evolutionary history of invasive species and the evolutionary history of the recipient native fauna might therefore help predict the consequences of biological invasions for the ecosystem under consideration and the future success of the invading species. This knowledge can also be implemented when formulating conservation strategies, including methods to mitigate and manage human-induced biological invasions.
In this thesis, the production of charged kaons and Φ mesons in Au+Au collisions at sqrt sAuAu = 2.4 GeV is studied. At this energy, all particles carrying open and hidden strangeness are produced below their respective free nucleon-nucleon threshold with the corresponding so-called excess energies: sqrt sK+ exc = -0.15 GeV, sqrt sK- exc = -0.46 GeV, sqrt sΦ exc = -0.49 GeVGeV. As a consequence, the production cross sections are very sensitive to medium effects like momentum distributions, two- or multistep collisions, and modification of the in-medium spectral distribution of the produced states [1]. K+ and K- mesons exhibit different properties in baryon dominated matter, since only K- can be resonantly absorbed by nucleons. Although strangeness exchange reactions have been proposed to be the dominant channel for K- production in the analyzed energy regime, the production yield and kinematic distributions could also be explained in smaller systems based on statistical hadronization model fits to the measured particle yields, including a canonical strangeness suppression radius RC, and taking the Φ feed-down to kaons into account [2, 3]. For the first time in central Au+Au collisions at such low energies, it is possible to reconstruct and do a multi differential analysis of K- and Φ mesons. In principle, this should be the ideal environment for strangeness exchange reactions to occur, as the particles are produced deeply sub-threshold in a large and long-living system. Therefore, it is the ultimate test to differentiate between the different sources for K- production in HIC.
In total 7.3x10exp9 of the 40% most central Au(1.23 GeV per nucleon)+Au collisions are analyzed. The data has been recorded with the High Acceptance DiElectron Spectrometer HADES located at Helmholtzzentrum für Schwerionenforschung GSI in April/May 2012. A substantially improved reconstruction method has been employed to reconstruct the hadrons with high purity in a wide phase space region.
The estimated particle multiplicities follow a clear hierarchy of the excess energy: 41.5 ± 2.1|sys protons at mid-rapidity per unit in rapidity, 11.1 ± 0.6|sys ± 0.4|extrapol π-, (3.01 ± 0.03|stat ± 0.15|sys ± 0.30|extrapól) x10 exp -2 K+, (1.94 ± 0.09|stat ± 0.10|sys ± 0.10|extrapol)x10 exp -4 K- and (0.99 ± 0.24|stat ± 0.10|sys ± 0.05|extrapol)x10 exp -4 Φ per event. The multiplicities of the strange hadrons increase more than linear with the mean number of participating nucleons hAparti, supporting the assumption that the necessary energy to overcome the elementary production threshold is accumulated in multi-particle interactions. Transport models predict such an increase, but are overestimating the measured particle yield and are not able to describe the kinematic distributions of K+ mesons perfectly. However, the best description is given by the IQMD model with a density dependent kaonnucleon potential of 40 MeV at nuclear ground state density.
The K-=K+ multiplicity ratio is constant as a function of centrality and follows with (6.45 ± 0.77)x10 exp -3 the trend of increasing with beam energy indicated from previous experiments [4]. The effective temperature of K- TK+eff = (84 ± 6) MeV is found to be systematically lower than the one of K+ TK+eff = (104 ± 1) MeV, which has also been observed by the other experiments.
The Φ=K- ratio is with a value of 0.52 ± 0.16 higher than the one obtained at higher center-of-mass energies and smaller systems. This behavior is predicted from a tuned version of the UrQMD transport model [5], when including higher mass baryonic resonances which can decay into Φ mesons and from statistical hadronization models when suppressing open strangeness canonically. The found ratio is constant as a function of centrality and results with a branching ratio of 48.9%, that ~ 25% of all measured K- originate from Φ feed-down decays. A two component PLUTO simulation, consisting of a pure thermal and a K- contribution originating from Φ decays, can fully explain the observed lower effective temperature in comparison to K+ and the shape of the measured rapidity distribution of K-. As a result, we find no indication for strangeness exchange reactions being the dominant mechanism for K- production in the SIS18 energy regime, if taking the contribution from Φ feed-down decays into account.
The hadron yields for the 20% most central collisions can be described by a statistical hadronization model fit with the chemical freeze-out temperature of Tchem = (68 ± 2) MeV and baryochemical potential of μB = (883 ± 25) MeV, which is higher than expected from previous parameterizations. The analysis of the transverse mass spectra of protons indicate a kinetic freeze-out temperature of Tkin = (70 ± 4) MeV and radial flow velocity of βr = 0.43 ± 0.01, which is in agreement with the parameters obtained from the linear dependence of the effective temperatures on the particle mass Tkin = (71.5 ± 4.2) MeV and βr = 0.28 ± 0.09.
The Standard Model is one of the greatest successes of modern theoretical physics. Itl describes the physics of elementary particles by means of three forces, the electro-magnetisc, the weak and the strong interactions. The electro-magnetic and the weak interaction are rather well understood in comparison to the strong interaction.
The latest is as fundamental as the others, it is responsible for the formation of all hadrons which are classified into mesons and baryons. Well-known examples of the former is the pion and of the latter is the proton and the neutron, which form the nucleus of every atom. This fundamental force is believed to be described by the Quantum Chromodynamics (QCD) theory. According to this theory, hadrons are not elementary particles but are composed of quarks and gluons. The latter are the vector particles of the force and so are bosons of spin 1 and the former constitute the matter and are fermions with spin 1/2. To describe the interaction a new quantum number had to be introduced: the color charge which exists in three different types (blue, green and red). The name has not been chosen arbitrary as elements created from three quarks of different colors are colorless in the same way that mixing the three primary colors leads to white. However, experimentally no colored structure has ever been observed. The quarks and the gluons seem to be confined in colorless hadrons. This property of QCD is called confinement and results from a large coupling constant at low energy (or large distance). For high energy (or small distance), the perturbative analysis of QCD permits to establish the coupling constant to be small and quarks and gluons are almost free. This property is called asymptotic freedom. The possibility for QCD to describe both behaviors is one of its amazing characteristics. However, both phenomena are not well understood and one needs a method to study both the pertubative and the confining regime.
The only known method which fulfills the above criteria is Lattice QCD and more generally Lattice Quantum Field Theory (LQFT). It consists of a discretization of the spacetime and a formulation of QCD on a four-dimensional Euclidean spacetime grid of spacing a. In this way, the theory is naturally regularized and mathematically well-defined. On the other hand, the path integral formalism allows the theory to be treated as a Statistical Mechanics system which can be evaluated via a Markov chain Monte-Carlo algorithm. This method was first suggested by Wilson in 1974 [1] and shortly after Creutz performed the first numerical simulations of Yang-Mills theory [2] using a heath-bath Monte-Carlo algorithm. It appears that this method is extremely demanding in computational power. In its early days the method was criticized as the only feasible simulations involved non-physical values such as extremely large quark masses, large lattice spacing a and no dynamical quarks. With the progress of the computers and the appearance of the super-computer, the studies have come close to the physical point. But one still needs to deal with discrete space time and finite volume. Several techniques have been developed to estimate the infinite volume limit and the continuum limit. The smaller the lattice spacing and the larger the volume, the better the extrapolation to continuum and infinite volume limits is. The simulations are still very expensive and for the moment a typical length of the box is L ≈ 4fm and a ≈ 0.08fm. However, it has been realized simulating pure Yang-Mills theory and other lower dimensional models that the topology is freezing at small a [3]. It was also observed recently on full QCD simulations [4,5].
The typical lattice spacing for which this problem appears in QCD is a ≈ 0.05fm but this value depends on the quark mass used and on the algorithm. The freezing of topology leads to results which differ from physical results. Solving this issue is important for the future of LQCD [6]. Recently several methods to overcome the problem have been suggested, one of the most popular is the used of open boundary conditions [7] but this promising method has still its own issues, mainly the breaking of translation invariance.
Metal-organic frameworks (MOFs) have emerged as a promising class of crystalline porous inorganic-organic hybrid materials showing a wide range of applications. In order to realize the integration of MOFs into specific devices, this thesis mainly focuses on the controlled growth and the properties of highly oriented surface-mounted metal-organic frameworks (SURMOFs).
The stepwise layer-by-layer (LbL) growth method exhibits vast advantages for the controllable growth of SURMOFs regarding the crystallite orientation, film thickness and homogeneity. However, up to date, only a few MOFs have been demonstrated to be suited for this protocol. So the first project of this thesis was designed to extend the applicability of the LbL growth. To this end, a semi-rigid linker based [Cu2(sdb)2(bipy)] (sdb = 4,4’-sulfonylbiphenyl dicarboxylate; bipy = 4,4’-bipyridine) MOF was chosen. Employing the LbL growth, [Cu2(sdb)2(bipy)] SURMOFs were successfully grown onto both pyridyl- and carboxyl-terminated surfaces at the temperature range of 15-65 °C. Interestingly, the orientation of the SURMOFs largely depends on temperature on both surfaces. At low temperatures (below 40 °C), SURMOFs with exclusive [010] orientation are obtained. In contrast, at high temperatures (40-65 °C), [001] oriented SURMOF growth is favored. A novel growth mode was demonstrated, which is, instead of surface chemistry, the temperature-induced ripening processes and the tendency to minimize surface energies can dominate the SURMOF growth.
Inspired by the advantages of LbL deposition of isoreticular SURMOFs, the second project was conceived to grow multivariate SURMOFs (MTV-SURMOFs) using mixed dicarboxylate linkers. We advance a hypothesis that linker acidity (expressed by the pKa values) may have an influence on the oriented growth of MTV-SURMOFs. To test the hypothesis, seven isoreticular [Cu2L2(dabco)] (L = single kind of dicarboxylate linker; dabco = 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane) SURMOFs were grown onto pyridyl-terminated surfaces at 60 °C. The quality of [001] orientation is greatly affected by the acidity of the linkers. With this observation, we deposited a series of [Cu2Lm2(dabco)] (Lm = mixed dicarboxylate linkers) SURMOFs under the same conditions. [Cu2Lm2(dabco)] SURMOFs with exclusive [001] orientation are obtained when the growth solution contains two linkers of relatively high pKa value or more than two kinds of linkers (independent of the pKa values), while the mixtures of ligands with relatively low pKa values or a high content of low pKa valued linkers can result in mis-oriented growth of SURMOFs with unexpected [100] orientation.
Moreover, the LbL growth shows enormous potential in the rational construction of functional SURMOFs. Therefore, the third project of this thesis was devised to deposit SURMOFs containing redox-active species. For this, the 4,4’-biphenyldicarboxylic acid (H2(bpdc)) linker was functionalized with ferrocene (Fc) and dimethyl ferrocene (Me2Fc) moieties. [Cu2(bpdc-amide-Fc)2(dabco)] SURMOF (Fc-SURMOF) is perfectly grown along the [100] direction, while mis-oriented growth of [Cu2(bpdc-amide-Me2Fc)2(dabco)] SURMOF (Me2Fc-SURMOF) was observed. Surprisingly, Fc-SURMOF shows excellent electrochemical properties due to the reversible oxidation and reduction of the ferrocene moieties in the oriented pores, while the Me2Fc-SURMOF was found to be a closely packed insulating layer since no extensive charge transfer is observed. A diffusion controlled mechanism of redox reaction is proposed, where the diffusion of the counter anions in the pores limits the current.
Besides the LbL growth protocol, the spin-coating technique is also promising for the oriented growth of SURMOFs. Driven by the specific applications, the fourth project of this thesis was planned to grow functional SURMOFs containing catalytically active units. The Keggin-type polyoxometalates (POMs) with high catalytic activities were chosen to functionalize the HKUST-1 SURMOFs. Combining the technique with methanol vapor induced growth, a series of POM functionalized HKUST-1 SURMOFs (denoted as POM@HKUST-1 SURMOFs) were controllably deposited onto pyridyl-terminated surfaces. The SURMOFs exhibit great potential as electrocatalysts in electrochemical devices due to the excellent redox properties of POMs. In addition, the PTA@HKUST-1 (PTA = phosphotungstic acid) SURMOF can be employed as an ideal platform for the selective loading of methylene blue (MB) dye with high efficiency. Owing to the strong binding between the dye molecules and the framework, the MB dye cannot be desorbed by ion exchange and MB loaded PTA@HKUST-1 SURMOF shows reliable redox properties under inert conditions, further confirming the application potential in electrochemical devices.
The brain is a highly dynamic and variable system: when the same stimulus is presented to the same animal on the same day multiple times, the neural responses show high trial-to-trial variability. In addition, even in the absence of sensory stimulation neural recordings spontaneously show seemingly random activity patterns. Evoked and spontaneous neural variability is not restricted to activity but is also found in structure: most synapses do not survive for longer than two weeks and even those that do show high fluctuations in their efficacy.
Both forms of variability are further affected by stochastic components of neural processing such as frequent transmission failure. At present it is unclear how these observations relate to each other and how they arise in cortical circuits.
Here, we will investigate how the self-organizational processes of neural circuits affect the high variability in two different directions: First, we will show that recurrent dynamics of self-organizing neural networks can account for key features of neural variability. This is achieved in the absence of any intrinsic noise sources by the neural network models learning a predictive model of their environment with sampling-like dynamics. Second, we will show that the same self-organizational processes can compensate for intrinsic noise sources. For this, an analytical model and more biologically plausible models are established to explain the alignment of parallel synapses in the presence of synaptic failure.
Both modeling studies predict properties of neural variability, of which two are subsequently tested on a synapse database from a dense electron microscopy reconstruction from mouse somatosensory cortex and on multi-unit recordings from the visual cortex of macaque monkeys during a passive viewing task. While both analyses yield interesting results, the predicted properties were not confirmed, guiding the next iteration of experiments and modeling studies.
For the transport of high-intensity hadron beams in low-energy beam lines of linear accelerators, the compensation of space charge forces by the accumulation of particles of opposite charge is an important effect, reducing the required focusing strength and potentially the emittance growth due to space charge forces. In this thesis, space charge compensation was studied by including the secondary particles in particle-in-cell simulations.
For this purpose, a new electrostatic particle-in-cell code named bender was developed. The software was tested using known self-consistent solutions for an electron plasma confined in an external potential as well as for a KV distributed beam in a periodic focusing lattice. For the simulation of compensation, models for residual gas ionisation by proton and electron impact were implemented.
The compensation process was studied for a 120 keV, 100 mA proton beam transported through a short drift section. Various features in the particle distributions were identified, which can not explained by a uniform reduction in the electric field of the beam. These were tied to the presence of thermal electrons confined within the beam potential. Using the Poisson-Boltzmann equation, their distribution could be reproduced and their influence on the beam for a wider range of parameters studied. However, the observed temperatures show a significant numerical influence. The hypothesis was formed, that stochastical heating present in particle-in-cell simulations is the mechanism leading to the formation of the observed (partial) thermal equilibrium.
For the low-energy beam transport line of the Frankfurt neutron source FRANZ, bender was used to predict the pulse shaping in the novel ExB chopper system. The code was also used for the design and the study of an electron lens for the Integrable Optics Test Accelerator at Fermi National Accelerator Laboratory. Aberrations due to guiding center drifts and the strong electric field of the electron beam as well as the current limits in such a system were investigated.