Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
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Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand die Untersuchung der Reaktivität von Chlorsilanen gegenüber Elektronenpaardonoren. Als Basis hierfür diente die Alkylamin-katalysierte (NMe3, NMe2Et, NEt3) quantitative Disproportionierung von Si2Cl6 bzw. Si3Cl8 zum Neopentasilan 3 und SiCl4 (T ≤ RT, Schema 40). Obwohl diese Reaktion bereits seit über 60 Jahren bekannt ist, sind für ihren Mechanismus nur Vermutungen aufgestellt worden. In Kooperation mit der Gruppe um M. Holthausen ist es hier gelungen, das SiCl2-Amin-Addukt 57 als entscheidende Zwischenstufe zu identifizieren (1H29Si-HMBC-NMR-Experiment sowie DFT-Rechnungen). Si(SiCl3)4, die thermodynamische Senke des Systems, entsteht durch anschließende Insertion des Dichlorsilylens in Si−Cl-Bindungen – bevorzugt am höchst substituierten Si-Zentrum (es bilden sich keine linearen bzw. weniger verzweigten Oligosilane). Zudem lässt sich das koordinierte Amin vom SiCl2-Addukt wieder abspalten, was die Si(SiCl3)4-Synthese überhaupt erst ermöglicht. Dieses Verhalten unterscheidet sich grundlegend vom jenen literaturbekannter stabilisierter Chlorsilylene: hier bindet der Donor so stark an das Si-Atom, dass er den ambiphilen Charakter des Silylens zugunsten der Lewis-basischen Funktion einschränkt. Daher kann man mit diesen Addukten auch keine Oligosilane aufbauen, die mittlerweile auch das Interesse der chemischen Industrie erweckt haben...
In der vorliegenden Arbeit wurde die dreidimensionale Struktur des CaM/C20W Komplexes mit Hilfe von heteronuklearer, mehrdimensionaler NMRSpektroskopie ermittelt. Der stabile CaM/C20WKomplex mit einer Bindungskonstanten KD = 11 nM besteht aus dem Protein CaM und dem Peptid C20W. CaM, ein kleines, saures Protein (16,7 kDa), das in allen eukaryontischen Zellen vorkommt und hantelförmig mit zwei Domänen aufgebaut ist, übermittelt die Signalwirkung von Calciumionen an eine Reihe von Zielenzymen. Durch die Bindung von CaM an die Plasmamembran Ca 2 ATPase wird das Calciumsignal wieder beendet. Das Peptid C20W entspricht dem Nterminalen Teil der CalmodulinBindungsdomäne der Ca 2 ATPase. Röntgenkleinwinkelstreu experimente an dem CaM/C20WKomplex führten zu der Vermutung, daß das Peptid C20W nur an die Cterminale Domäne von CaM bindet und damit einen unterschiedlichen Bindungsmodus im Gegensatz zu den bekannten Calmodulin bindenden Peptiden zeigt. Zur Strukturbestimmung des CaM/C20WKomplexes wurde eine Probe aus 13 C, 15 Nmarkiertem CaM und unmarkiertem C20W verwendet. Diese unterschiedliche Markierungsweise erlaubt die Unterscheidung beider Komponenten in den NMR Spektren. Für CaM wurden eine Serie von heteronuklearen, dreidimensionalen Tripelresonanzexperimente aufgenommen, die zunächst die Zuordnung der Resonanzen des Proteinrückgrats und dann auch der der Seitenketten erlaubte. Spezielle NMR Experimente wurden für die Zuordnung der neun Methionine durchgeführt, die bei der Bindung des Peptids eine wichtige Rolle spielen. Durch die Auswertung von NOESY Spektren wurden 1645 Abstandsrestraints für CaM ermittelt, die sich in 794 intraresiduale, 387 sequentielle, 311 mittelreichweitige und 153 langreichweitige restraints aufteilen. Durch die Bestimmung der Temperaturkoeffizienten der Amidprotonen konnten 52 Wasserstoffbrücken von CaM zugeordnet werden. Durch doppeltgefilterte, homonukleare Korrelationsexperimente, bei denen die Protonen resonanzen von 13 C, 15 Nmarkiertem CaM unterdrückt werden, konnten die Resonanzen des unmarkierten Peptids C20W zugeordnet werden. Es wurden 163 NOE restraints ermittelt, wobei 102 intraresidual, 32 sequentiell und 29 mittelreichweitig waren. Schließlich konnten mit Hilfe eines halbgefilterten NOESYExperiments 49 intermolekulare NOE's zwischen CaM und C20W zugeordnet werden. Außerdem wurden neben den Abstandsrestraints für CaM 129 Dihedralwinkelrestraints ermittelt. Die gesamte Zuordnung des CaM/C20WKomplexes wurde in der Datenbank BioMagResBank mit der Nummer 4284 abgelegt (http://www.bmrb.wisc.edu/). Die experimentell gewonnenen restraints wurden in einer MoleküldynamikRechnung mit einem simulated annealingProtokoll verwendet, wobei insgesamt 200 Strukturen berechnet wurden. Die 26 energieärmsten Strukturen wurden als repräsentativ ausgewählt und in der Brookhaven Protein Datenbank mit dem PDB IDCode 1CFF abgelegt (http://www.rcsb.org/). Die 26 Strukturen weisen für die Nterminale Domäne einen RMSDWert von 0.75 Å über die Proteinrückgratatome und für die Cterminale Domäne zusammen mit dem Peptid C20W einen RMSDWert von 0.53 Å über die Proteinrückgratatome auf. Die hohe Konvergenz der Strukturen und gute Werte bei der RamachandranStatistik (73.7% in den erlaubten Bereichen) sprechen für eine gute Qualität der ermittelten Strukturen. Die ermittelte Struktur des CaM/C20WKomplexes zeigte einen neuartigen Bindungsmodus des Peptids. C20W bindet nur an die Cterminale Domäne von CaM, die Nterminale Domäne ist nicht in der Bindung involviert. Diese Struktur steht damit im Gegensatz zu den bisher bekannten CaM/PeptidKomplexen, bei denen das Peptid von beiden Domänen gebunden wird und ein globulärer Komplex entsteht. Der Bindungsmodus des C20Ws wurde zum einen durch chemische Verschiebungs differenzen der Amidprotonen und der Methionine ermittelt. Zum anderen konnten ausgehend von C20W intermolekulare NOE's nur zur Cterminalen Domäne von CaM zugeordnet werden. Die Sekundärstruktur von CaM ändert sich durch die Bindung des Peptids kaum. Beide Domänen, die zueinander homolog sind, bestehen aus vier alphaHelices und einem kurzen antiparallelen betaFaltblatt. Verbunden sind beide Domänen durch eine flexiblen Linkerbereich, wobei die Domänen zueinander keine Orientierung zeigen, da keine NOE's zwischen den Domänen gefunden wurden. Der ungewöhnliche Bindungsmodus des Peptids C20W steht im Einklang mit der Tatsache, daß die Plasmamembran Ca 2 ATPase bereits durch die Cterminale Domäne von CaM aktiviert werden kann. Der CaM/C20WKomplex läßt sich daher als Schnappschuß auf dem Weg der vollständigen Aktivierung der Ca 2 ATPase durch CaM verstehen. Die Ergebnisse der NMRspektroskopischen Untersuchung des CaM/C20WKomplexes wurden in (1999) Biochemistry 38, 1232012332 veröffentlicht. Die Publikation ist im Anhang (Kapitel 6.9) beigefügt. Um die Orientierung der Domänen des CaM/C20WKomplexes zueinander zu untersuchen, sind weiterführende Experimente geplant. Hierzu sollen Messungen an einem CaM/C20WKomplex unternommen werden, der am NTerminus des Peptids einen paramagnetischen Marker trägt, wobei dipolare Kopplungen und Pseudo kontaktshifts ermittelt werden sollen. Weiterhin sind ähnliche Untersuchungen an einem CaM/C20WKomplex geplant, der am NTerminus von CaM einen paramagnetischen Marker trägt. Mit diesen Experimenten sollte es gelingen, die Frage der Domänen orientierung zu klären.
SIVsmmPBj-derived lentiviral vectors are capable of efficient primary human monocyte transduction, a capacity which is linked to the viral accessory protein Vpx. To enable novel gene therapy approaches targeting monocytes, in this thesis it was aimed to generate enhanced lentiviral vectors that meet the required standards for clinical applications with respect to gene transfer efficiency and safety. The vectors were tested for their suitability in a relevant therapeutic gene transfer approach. At first, it was investigated whether vectors derived from another Vpx-carrying lentivirus reveal the same capacity for monocyte transduction as SIVsmmPBj-derived vectors. A transduction experiment using HIV-2-derived vectors in comparison to PBj-derived vectors revealed a comparable transduction capacity, thus disproving the assumed uniqueness of the PBj vectors. The further generation and analysis of expression constructs for the vpx genes of HIV-2 and SIVmac demonstrated a similar functionality in monocyte transduction as the Vpx of PBj. As VpxPBj, both Vpx proteins facilitated monocyte transduction of a vpx-deficient PBj-derived vector system. For the generation of enhanced SIVsmmPBj and HIV-2 vector systems, only the transfer vectors were optimized, since the packaging vectors available already meet current standards. At first, several modifications were introduced into an available preliminary PBj-derived transfer vector by conventional cloning. The modifications included insertions of cPPT/CTS and WPRE as well as the deletions of the remaining pol sequence, the second exons of tat end rev, and the U3-region within the 3’LTR to generate a SIN vector. Thus, beside safety enhancement, the vector titers were also increased from 9.1x105 TU/ml achieved after concentration with the initial transfer vector up to 1.1x107 TU/ml with the final transfer vector. The PBj vector retained its capability of monocyte transduction when supplemented with Vpx. This conventional method of vector enhancement is time-consuming and may result in only sub-optimal vectors, since it depends on the presence of restriction sites which may not allow deletion of all needless sequences. Moreover, mutations may accumulate during the high number of cloning and amplification steps. Therefore, a new and easier method for lentiviral transfer vector generation was conceived. Three essential segments of the viral genome (5‘ LTR, RRE, ΔU3-3’ LTR) are amplified on the template of the lentiviral wild-type genome and fused by Fusion-PCR. Further necessary elements namely the cPPT/CTS-element, MCS, and PPT are included into the resulting vector by extension of the nucleotide primers used for the PCRs. The amplified and fused vector-scaffold can easily be integrated into a plasmid backbone, followed by insertion of the expression cassette of choice. By applying this approach, two novel lentiviral transfer vectors, based on the non-human SIVsmmPBj and the human HIV-2, were derived. Vector titers achieved for PBj and HIV-2 vectors supplemented with Vpx reached up to 4.0x108 TU/ml and 5.4x108 TU/ml, respectively. The capacity for monocyte transduction was maintained. Thus, safe and efficient, state of the art HIV-2- and PBj-derived vector systems are now available for future gene therapy strategies. Finally, the new vectors were used to set up an approach for gene correction of gp91phox-deficient monocytes for the treatment of X-linked chronic granulomatous disease (xCGD). The administration of autologous, gene-corrected monocytes to counteract systemic and acute infections could lead to a decreased infection load, dissolve granulomas and therefore improve the survival rate of hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) which is the current treatment of choice for this disease. First, methods for analysis of gp91phox function were established. Next, they were employed to demonstrate the capacity of monocytes, obtained from healthy humans or mice, for phagocytosis, oxidative burst, and Staphylococcus aureus killing. The in vivo half-life of murine monocytes in the bloodstream and their distribution to specific tissues was determined. Lastly, HIV-1 vectors were used to transfer the gp91phox gene into monocytes from gp91phox-deficient mice. This resulted in the successful restoration of the oxidative burst ability in the cells. In summary, the general suitability of the new vectors for treatment of CGD by monocyte transduction was demonstrated. The results of the mouse experiments provide the foundation for future challenge experiments to evaluate the capability of gene-corrected monocytes to kill off microbes in vivo.
This cumulative thesis discusses the development of optimized force field parameters for Magnesium and resulting improved simulations of Magnesium-RNA interactions, including the in silico exploration of binding sites. This thesis is based on four publications as well as unpublished data. A fifth publication that was written during the time of the Ph.D. is discussed in the Appendix. This publication analyzes monovalent ion-specific effects at mica surfaces.
Nucleic acids in general and RNA in particular are fundamental to life itself. Especially in the folding and function of RNA, metal cations are crucial to screen the negatively charged nucleic acid backbones to allow for complex functional structures. They stabilize the tertiary structure of RNA and even drive its folding. Furthermore, similarly to proteins, RNAs can catalyze multiple reactions, rather than consisting of the 20 amino acids of a protein, RNA constitues of only four different building blocks. Metal cations play an important role here as additional cofactors. One essential ion is Magnesium (Mg2+), commonly referred to as the most important cofactor for nucleic acids. Mg2+ carries two positive charges. Its comparably small size and high charge result in a high charge density that has strong polarizing effects on its surroundings. Furthermore, Mg2+ forms a sharply defined first hydration shell with an integer number of coordinating water molecules. As a result, an exclusion zone exists around the ion within which no water molecules are observed. Moreover, Mg2+ displays a high solvation free energy and a low exchange rate of waters from its first hydration shell. Finally, it contains a strong preference towards oxygens . Together, this makes Mg2+ a particularly well suited interaction partner for the charged non-bridging phosphate oxygens on nucleic acid backbones and explains its crucial biological role.
The immense number of physiological and technological functions and applications indicates the significant scientific attention Mg2+ received. In experimental studies, however, severe difficulties arise for multiple reasons: Mg2+ is spectroscopically silent and cannot be detected directly by resonance techniques like NMR or EPR. Indirect observation is possible, either by detecting changes in the overall RNA structure with and without bound Mg2+, or by replacing the Mg2+ ion with another spectroscopically visible ion. In the latter, however, it cannot be guaranteed that the altered ion does not also alter the interaction site or even the whole structure. Another detection method is X-ray crystallography, but here challenges arise from Mg2+ being almost indistinguish- able from other ions as well as from water if not for very high resolutions and precise stereochemical considerations.
Alternatively, molecular dynamics (MD) simulations can be performed, with the power of adding atomistic insight to the interplay of metal cations and nucleic acids. MD simulations, however, are only as accurate as their underlying interaction models and the development of accurate models for the description of Mg2+ faces challenges especially in describing three properties:
(i) Polarizability. Commonly used simple models like the 12-6 type Lennard-Jones model typically fail to reproduce simultaneously thermodynamic and structural properties of a single ion in water. Alternative strategies include the use of a 12-6-4 type Lennard-Jones potential as proposed by Li and Merz, where the additional r−4 term explicitly accounts for polarization effects. The resulting Lennard-Jones potential is thereby more attractive and more long-ranged than for typical models of the 12-6 type.
(ii) Kinetics. Most Mg2+ models either fully ignore considerations about the timescales on which water exchanges from the first hydration shell of the ion or use inappropriate methodology to calculate the underlying kinetics. A realistic characterization of the involved timescales is imperative to be able to describe a seemingly simple process like the transition from inner-to-outer sphere binding and vice versa. This transition governs most biochemical reactions involving Mg2+ and therefore subsequent processes can only by as fast as the transition itself. However, already the previous step – the exchange of a water from the first hydration shell of the ion – is described my current Mg2+ models up to four orders of magnitude too slowly, which makes the observation of such events on the timescale of a typical simulation difficult or even impossible. Alln ́er et al. [48] as well as Lemkul and MacKerell explicitly considered the exchange rate into their parameter optimization procedure. To compute the rate, both studies applied Transition State Theory along a single reaction coordinate – the distance towards one of the exchanging waters. However, it could be shown that the water exchange from the first hydration shell requires at least the consideration of both exchanging water molecules in order to be able to realistically record the underlying rate using Transition State Theory. Furthermore, the model of Alln ́er et al. significantly underestimates the free energy of solvation of the ion.
(iii) Interactions between Mg2+ and nucleic acids. Typically, ionic force field parame- terization concentrates on the optimization of solution properties. The trans- ferability of these solution optimized parameters towards interactions with biomolecules, however, often fails.
The focus of this thesis has been to further advance and develop existing NMR techniques for the study of protein folding. In order to do so, experimental as well as theoretical approaches have been pursued. From the theoretical side, a successful attempt to the development of a general theory for the treatment of residual dipolar couplings in the case of unfolded proteins has been undertaken. Information contained in residual dipolar couplings is especially valuable due to its long-range nature. The dynamic character of unfolded states of proteins, which may be composed of distinct subsets of conformations, renders reliable interpretation of data a non-trivial task. Statistical-coil-based approaches have been shown to be powerful in data interpretation. A consistent theory based on fundamental polymer physics, however, had not been presented so far. The herein presented model addresses this problem building on the original work by Annila and co-workers. In this work, several shortcomings have been identified. These shortcomings have been corrected here leading to a general approach for the treatment of residual dipolar couplings of unfolded proteins. More specifically, it is shown that, in the case of fully unfolded proteins aligned by a steric mechanism, basic dependencies of dipolar couplings such as on chain length and location with in the chain can be analysed in simple analytical terms. The main predictions of the model are compared to experimental data showing reasonable agreement. The presented mathematical framework is principally suited for various improvements which could include the treatment of long-range interactions and of the actual geometry of the given aligment medium. From the experimental side, bovine alpha-lactalbumin has been chosen as a model system for the development of improved time-resolved 1D NMR methods aiming at the observation of conformational transitions by kinetic means. The presented results show that high-quality data can now be obtained at protein concentrations as low as 100uM. Rate constants characterising distinct conformational transitions of up to 8/s have been measured. These are the fastest rate constants which have been reported so far for protein folding events. The NMR data supplemented by complementary biophysical data furthermore demonstrate that the folding of bovine alpha-lactalbumin is more complex than has been anticipated. All data are consistent with a triangular folding mechanism involving parallel pathways of folding for formation of the native state of the protein. Interestingly, such a folding mechanism has also been found for the highly structurally homologous protein lysoyzme from hen egg white. Evidence is presented that the guiding role of long-range interactions in the unfolded state of lysoyzme for mediating intersubdomain interactions during folding is replaced in the case of bovine alpha-lactalbumin by the Ca2+ binding site.
Specific functions of biological systems often require conformational transitions of macromolecules. Thus, being able to describe and predict conformational changes of biological macromolecules is not only important for understanding their impact on biological function, but will also have implications for the modelling of (macro)molecular complex formation and in structure-based drug design approaches. The “conformational selection model” provides the foundation for computational investigations of conformational fluctuations of the unbound protein state. These fluctuations may reveal conformational states adopted by the bound proteins. The aim of this work is to incorporate directional information in a geometry-based approach, in order to sample biologically relevant conformational space extensively. Interestingly, coarse-grained normal mode (CGNM) approaches, e.g., the elastic network model (ENM) and rigid cluster normal mode analysis (RCNMA), have emerged recently and provide directions of intrinsic motions in terms of harmonic modes (also called normal modes). In my previous work and in other studies it has been shown that conformational changes upon ligand binding occur along a few low-energy modes of unbound proteins and can be efficiently calculated by CGNM approaches. In order to explore the validity and the applicability of CGNM approaches, a large-scale comparison of essential dynamics (ED) modes from molecular dynamics (MD) simulations and normal modes from CGNM was performed over a dataset of 335 proteins. Despite high coarse-graining, low frequency normal modes from CGNM correlate very well with ED modes in terms of directions of motions (average maximal overlap is 0.65) and relative amplitudes of motions (average maximal overlap is 0.73). In order to exploit the potential of CGNM approaches, I have developed a three-step approach for efficient exploration of intrinsic motions of proteins. The first two steps are based on recent developments in rigidity and elastic network theory. Initially, static properties of the protein are determined by decomposing the protein into rigid clusters using the graph-theoretical approach FIRST at an all-atom representation of the protein. In a second step, dynamic properties of the molecule are revealed by the rotations-translations of blocks approach (RTB) using an elastic network model representation of the coarse-grained protein. In the final step, the recently introduced idea of constrained geometric simulations of diffusive motions in proteins is extended for efficient sampling of conformational space. Here, the low-energy (frequency) normal modes provided by the RCNMA approach are used to guide the backbone motions. The NMSim approach was validated on hen egg white lysozyme by comparing it to previously mentioned simulation methods in terms of residue fluctuations, conformational space explorations, essential dynamics, sampling of side-chain rotamers, and structural quality. Residue fluctuations in NMSim generated ensemble is found to be in good agreement with MD fluctuations with a correlation coefficient of around 0.79. A comparison of different geometry-based simulation approaches shows that FRODA is restricted in sampling the backbone conformational space. CONCOORD is restricted in sampling the side-chain conformational space. NMSim sufficiently samples both the backbone and the side-chain conformations taking experimental structures and conformations from the state of the art MD simulation as reference. The NMSim approach is also applied to a dataset of proteins where conformational changes have been observed experimentally, either in domain or functionally important loop regions. The NMSim simulations starting from the unbound structures are able to reach conformations similar to ligand bound conformations (RMSD < 2.4 Å) in 4 out of 5 cases of domain moving proteins. In these four cases, good correlation coefficients (R > 0.7) between the RMS fluctuations derived from NMSim generated structures and two experimental structures are observed. Furthermore, intrinsic fluctuations in NMSim simulation correlate with the region of loop conformational changes observed upon ligand binding in 2 out of 3 cases. The NMSim generated pathway of conformational change from the unbound structure to the ligand bound structure of adenylate kinase is validated by a comparison to experimental structures reflecting different states of the pathway as proposed by previous studies. Interestingly, the generated pathway confirms that the LID domain closure precedes the closing of the NMPbind domain, even if no target conformation is provided in NMSim. Hence, the results in this study show that, incorporating directional information in the geometry-based approach NMSim improves the sampling of biologically relevant conformational space and provides a computationally efficient alternative to state of the art MD simulations.
In Nervensystemen werden zahlreiche Informationen wahrgenommen und verarbeitet um ein adäquates Verhalten hervorzurufen. Für die Untersuchung der funktionellen Zusammenhänge hierbei wurden verschiedene Methoden entwickelt, die eine gezielte Manipulation neuronaler Prozesse ermöglichen. Durch Analyse der resultierenden Effekte können dabei synaptische Proteine, einzelne Neuronen oder neuronale Netzwerke funktionell charakterisiert werden. Bisherige Ansätze verfügen jedoch nur über eine geringe zeitliche und räumliche Auflösung oder erlauben lediglich eine eingeschränkte Anwendung im frei beweglichen Tier.
Diese Nachteile können durch die heterologe Expression von lichtgesteuerten, mikrobiellen Rhodopsinen zur gezielten Manipulation des Membranpotentials umgangen werden. So induziert die Photoaktivierung des Kationenkanals Channelrhodopsin 2 (ChR2; (Nagel et al., Curr Biol 2005)) eine Depolarisation, während die Chloridpumpe Halorhodopsin (NpHR; (Zhang et al., Nature 2007)) für die Hyperpolarisation verwendet werden kann. Dabei ermöglichen die schnellen Kinetiken der Rhodopsine eine zeitlich präzise Steuerung des Membranpotentials. Durch Auswahl geeigneter Promotoren ist zudem oftmals eine zell spezifische Expression möglich. Dieser Ansatz wird daher allgemein als Optogenetik bezeichnet.
In der vorliegenden Arbeit wurden zunächst konventionelle Techniken genutzt, um die Funktion von zwei assoziierten Proteinen eines Acetylcholin Rezeptors in C. elegans zu untersuchen. Des Weiteren wurden verschiedene Methoden für den Fadenwurm entwickelt und angewendet, die die Vorteile optogenetischer Techniken für die funktionelle Charakterisierung synaptischer Proteine und neuronaler Netzwerke nutzbar machen. Hierbei erlaubt die Transparenz von C. elegans die optogenetische Stimulation im lebenden Organismus unter nicht invasiven Bedingungen. Weitere Vorteile von C. elegans als neurobiologischem Modellorganismus liegen in seiner einfachen Handhabung (Hope, 1999) und der stereotypen Entwicklung seines Nervensystems mit bekannten anatomischen Ausprägungen (Sulston and Horvitz, Dev Biol 1977; Varshney et al., PLoS Comput Biol 2011; White et al., Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 1986). Durch ihre Häufigkeit und die experimentelle Zugänglichkeit wird hierbei die neuromuskuläre Synapse oftmals zur Erforschung der synaptischen Reizweiterleitung genutzt (Von Stetina et al., Int Rev Neurobiol 2006). Durch pharmakologische (Lewis et al., Neuroscience 1980; McIntire et al., Nature 1993; Miller et al., Proc Natl Acad Sci U S A 1996; Richmond and Jorgensen, Nat Neurosci 1999) und elektrische Stimulation (Richmond and Jorgensen, Nat Neurosci 1999) können dabei Defekte der Transmission hervorgehoben werden, während Verhaltensexperimente oder elektrophysiologische Messungen der post synaptischen Ströme in Muskelzellen eine quantitative Analyse ermöglichen (Richmond and Jorgensen, Nat Neurosci 1999).
Diese Methoden wurden für die funktionelle Charakterisierung von NRA 2 und NRA 4 verwendet, die beide als akzessorische Proteine zusammen mit dem Levamisol sensitiven Acetylcholin Rezeptor der Körperwandmuskelzellen aufgereinigt wurden (Gottschalk et al., EMBO J 2005). Dabei konnte gezeigt werden, dass NRA 2 und NRA 4 im Endoplasmatischen Retikulum (ER) der Muskelzellen einen Komplex bilden, der die Sensitivität von beiden nikotinischen Acetylcholin Rezeptoren gegenüber verschiedenen cholinergen Agonisten verändert. In diesem Zusammenhang wurde auch nachgewiesen, dass die Oberflächenexpression einzelner Untereinheiten der beiden Rezeptoren durch NRA 2/4 beeinflusst wird. Diese Resultate legen die Vermutung nahe, dass beide Proteine die Zusammensetzung der Rezeptoren und somit ihre pharmakologischen Eigenschaften modulieren. Denkbar ist dabei eine regulatorische Funktion bei der Assemblierung verschiedener Untereinheiten zu einem funktionellen Rezeptor oder bei der Kontrolle des ER Austritts von Rezeptoren mit bestimmter Zusammensetzung. In dieser Hinsicht konnte jedoch keine Interaktion von NRA 2/4 mit der Notch Signalkaskade nachgewiesen werden, wie sie für die homologen Proteine nicalin und NOMO in Vertebraten gezeigt wurde (Haffner et al., J Biol Chem 2007; Haffner et al., EMBO J 2004).
Für die Untersuchung synaptischer Proteine durch optogenetische Techniken wurde ChR2(H134R) selektiv in cholinergen oder GABAergen Motorneuronen exprimiert, um die akute und lichtgesteuerte Freisetzung des jeweiligen Neurotransmitters zu ermöglichen. Die resultierende Stimulation bzw. Inhibition von Muskelzellen wurde hierbei durch elektrophysiologische Messungen der post synaptischen Ströme und durch Analyse von Kontraktionen respektive Relaxationen untersucht. Dabei wurde gezeigt, dass Störungen der synaptischen Reizweiterleitung die Ausprägung und Dynamik dieser lichtinduzierten Effekte beeinflussen und dadurch charakterisiert werden können. So zeigten beispielsweise Mutanten von Synaptojanin und Endophilin nachlassende Effekte bei anhaltender oder wiederholter Stimulation, was durch die gestörte Regeneration synaptischer Vesikel erklärt werden kann (Harris et al., J Cell Biol 2000; Schuske et al., Neuron 2003; Verstreken et al., Neuron 2003).
Die hohe Sensitivität dieser Methode wurde im Nachfolgenden dazu verwendet, die Inhibition cholinerger Motorneuronen durch den metabotropen GABAB Rezeptor zu untersuchen, der in C. elegans aus den beiden Untereinheiten GBB 1 und GBB 2 gebildet wird (Dittman and Kaplan, J Neurosci 2008; Vashlishan et al., Neuron 2008). Dabei konnte zunächst gezeigt werden, dass diese heterosynaptische Inhibition verschiedene lokomotorische Verhaltensweisen der Tiere beeinflusst. Für die mechanistische Untersuchung wurden anschließend cholinerge Motorneuronen durch ChR2(H134R) photoaktiviert, während resultierende Kontraktionseffekte in Abhängigkeit von GBB 1/2 analysiert wurden. Um hierbei die Funktion von GBB 1/2 durch erhöhte GABA Konzentrationen hervorzuheben, wurden zusätzlich GABAerge Motorneuronen optogenetisch stimuliert oder die Wiederaufnahme von GABA aus dem synaptischen Spalt durch Mutation des Membran ständigen GABA Transporters blockiert. So konnte gezeigt werden, dass GBB 1/2 eine akute Inhibition der cholinergen Motorneuronen bewirken, was vermutlich für die Regulation von Bewegungsabläufen eine wichtige Rolle spielt. Die geringe Dynamik der GBB 1/2 induzierten Effekte deutet allerdings darauf hin, dass die synaptische Aktivität durch den metabotropen Rezeptor kaum nachhaltig moduliert wird.
In nachfolgenden Versuchen wurde die optogenetische Stimulation von Motorneuronen außerdem mit der elektronenmikroskopischen Analyse der präsynaptischen Feinstruktur kombiniert. Dadurch konnte die Dynamik der Exozytose und Endozytose synaptischer Vesikel (SV) in Abhängigkeit von neuronaler Aktivität untersucht werden. So wurde gezeigt, dass synaptische Vesikel nahe der aktiven Zone während einer 30 sekündigen Hyperstimulation nahezu komplett aufgebraucht waren. Die vollständige Regeneration der SV Pools benötigte anschließend etwa 12 Sekunden und erfolgte zunächst in der Peripherie der aktiven Zone, was auf eine laterale Heranführung der Vesikel schließen lässt. Nach etwa 20 Sekunden erholte sich ebenfalls die Wirksamkeit der Stimulation von Muskelzellen durch die Motorneuronen, was durch elektrophysiologische Messungen der photo induzierten post synaptischen Ströme gezeigt wurde. Während der Hyperstimulation bildeten sich außerdem große vesikuläre Strukturen, die sich anschließend nach etwa acht Sekunden wieder aufgelöst hatten. In Analogie zu vergleichbaren Experimenten in anderen Organismen liegt die Vermutung nahe, dass es sich dabei um Zwischenprodukte der so genannten Bulk Phase Endozytose handelt, die das Clathrin abhängige Recycling von synaptischen Vesikeln bei starker neuronaler Aktivität ergänzt (Heuser and Reese, J Cell Biol 1973; Miller and Heuser, J Cell Biol 1984; Richards et al., Neuron 2000). Bemerkenswerterweise war der Abbau der vesikulären Strukturen in Synaptojanin und Endophilin defizienten Tieren stark verzögert. Denkbar ist, dass beide Proteine für die Synthese von synaptischen Vesikeln aus den vesikulären Zwischenprodukten der Bulk Phase Endozytose wichtig sind, analog zur ihrer Funktion bei der Clathrin abhängigen Endozytose an der Plasmamembran.
Durch die zielgerichtete Manipulation der Zellaktivität ermöglichen optogenetische Techniken außerdem die funktionelle Charakterisierung von Neuronen und neuronalen Netzwerken. Um die zelluläre Spezifität dieses Ansatzes zu erhöhen, wurde ein Tracking System entwickelt das die Position frei beweglicher Tiere in Echtzeit bestimmt und nachverfolgt. Dadurch konnte die Photoaktivierung optogenetischer Proteine auf definierte Bereiche der Fadenwürmer und somit auf ausgewählte Neuronen innerhalb der Expressionsmuster von verwendeten Promotoren eingeschränkt werden. Des Weiteren ermöglichte hierbei die Auswertung translatorischer Parameter die Analyse verschiedener lokomotorischer Merkmale wie Geschwindigkeit, Bewegungsbahn oder Ausprägung der Körperbiegungen. Dieses System wurde beispielhaft für die konzertierte Photoaktivierung durch ChR2(H134R) bzw. Photoinhibition durch MAC von zwei verschiedenen Gruppen von Neuronen angewendet, um die Integration mechanosensorischer Informationen durch Command Interneuronen zu untersuchen. In diesem Zusammenhang wurde zudem eine Rekombinase basierte Methode für optogenetische Proteine adaptiert, die die Transkription auf die zelluläre Schnittmenge von zwei verschiedenen Promotoren einschränkt und somit die Spezifität der Expression erhöht. Idealerweise kann dieser Ansatz außerdem mit der gezielten Photoaktivierung kombiniert werden, um die zelluläre Selektivität optogenetischer Anwendungen weiter zu verbessern.
Weiterhin ist die Anwendung optogenetischer Techniken bisher durch intrinsische Eigenschaften der verwendeten Rhodopsine auf die relativ kurzzeitige Manipulation des Membranpotentials von Zellen beschränkt. So benötigt ChR2 durch die schnelle Schließung seines offenen Kanals eine kontinuierliche Photoaktivierung, um eine andauernde Depolarisation hervorzurufen. Dies ist jedoch potentiell mit phototoxischen und – besonders bei C. elegans – phototaktischen Nebeneffekten verbunden. Deswegen wurden diverse Mutanten von ChR2 mit stark verlangsamter Inaktivierung (Berndt et al., Nat Neurosci 2009) für ihren Nutzen zur Langzeit Stimulation von erregbaren Zellen im Nematode getestet. Dabei wurde gezeigt, dass ChR2(C128S) durch einen kurzen Photostimulus mit vergleichsweise niedriger Intensität eine anhaltende Depolarisation über mehrere Minuten auslösen kann. Die wiederholte Stimulation in ASJ Neuronen ermöglichte zudem eine langzeitige Depolarisation über mehrere Tage, wodurch die genetisch veranlagte Entwicklung von Tieren manipuliert werden konnte. Durch gezielte Punktmutation konnten außerdem relevante Eigenschaften von ChR2(C128S) für die Langzeit Stimulation weiter verbessert werden.
Als weiteres optogenetisches Werkzeug wurde zudem die Photoaktivierbare Adenylatzyklase alpha (PACa) aus Euglena gracilis (Iseki et al., Nature 2002; Ntefidou et al., Plant Physiol 2003; Schroder-Lang et al., Nat Methods 2007) für die akute und lichtgetriebene Synthese des sekundären Botenstoffs cAMP in C. elegans etabliert. Die Photoaktivierung von PACa in cholinergen Motorneuronen verstärkte dabei die Neurotransmitterfreisetzung und induzierte hyperlokomotorische Phänotypen, vergleichbar zu Mutanten mit erhöhten cAMP Konzentrationen.
Zusammengefasst wurden diverse optogenetische Techniken für C. elegans entwickelt und optimiert, die die zellspezifische und nicht invasive Manipulation des Membranpotentials beziehungsweise die Synthese des sekundären Botenstoffs cAMP durch Licht im frei beweglichen Tier ermöglichen. Diese Methoden können zur gezielten Störung neuronaler Aktivität angewendet werden, um dadurch neurobiologische Fragestellungen im Fadenwurm zu untersuchen. Dies wurde beispielhaft für die Erforschung der synaptischen Reizweiterleitung und die funktionelle Analyse neuronaler Netzwerke demonstriert. Denkbar ist außerdem, diese für C. elegans etablierten Methoden vergleichbar in anderen Modellorganismen anzuwenden. So sind die Fruchtfliege ebenso wie der Zebrafisch Embryo bereits für optogenetische Techniken erprobt (Arrenberg et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2009; Schroll et al., Curr Biol 2006). Für Säugetiere wie die Maus, die Ratte und den Makaken wurden zudem bereits Ansätze entwickelt, die die gezielte Photostimulation in lebenden und frei beweglichen Tieren ermöglichen (Han et al., Neuron 2009; Wentz et al., J Neural Eng 2011; Yizhar et al., Nature 2011; Zhang et al., Nat Rev Neurosci 2007).
Pulsed electron-electron double resonance (PELDOR), also called Double Electron-Electron Resonance, (DEER) is a pulsed EPR technique that can provide structural information of biomolecules, such as proteins or nucleic acids, complementary to other structure determination methods by measuring long distances (from 1.5 up to 10 nm) between two paramagnetic labels. Incorporation of the rigid Ç-label pairwise into DNA or RNA molecules enables the determination not only of the distance but also of the mutual orientation between the two Ç-labels by multi-frequency orientation-selective PELDOR data (X-, Q- and G-band frequencies). Thus, information about the orientation of secondary structure elements of nucleic acids can be revealed and used as additional angular information for structure determination. Since Ç does not have motion independent from the helix where it resides, the conformational flexibility of the nucleic acid molecule can be directly determined. This thesis demonstrates the advancement of PELDOR spectroscopy, beyond its original scope of distance measurements, to determine the mutual orientation between two rigid spin labels towards the characterization of the conformational space sampled by highly flexible nucleic acid molecules. Applications of the methodology are shown on two systems: a three-way junction, namely a cocaine aptamer in its bound-state, and a two-way junction, namely a bent DNA.
More in detail, the conformational changes of the cocaine aptamer upon cocaine binding were investigated by analysis of the distance distributions. The cocaine-bound and the unbound states could be differentiated by their conformational flexibility, which decreases in the presence of the ligand. Moreover, the obtained distance distributions revealed a small change in the mean distance between the two spin labels upon cocaine binding. This indicates a ligand-induced conformational change, which presumably originates at the junction where cocaine is known to bind. The investigation of the relative orientation between the two spin-labeled helices of the aptamer revealed further structural insights into the conformational dynamics of the cocaine-bound state. The angular information from the orientation-selective PELDOR data and the a priori knowledge about the secondary structure of the aptamer were helpful in obtaining a molecular model describing its global folding and flexibility. In spite of a large flexible aptamer, the kink angle between the Ç-labeled helices was found to be rather well-defined.
As for the bent DNA molecule, a two-step protocol was proposed to investigate the conformational flexibility. In the first step, a database with all the possible conformers was created, using available restraints from NMR and distance restraints derived from PELDOR. In a second step, a weighted ensemble of these conformers fitting the multi-frequency PELDOR data was built. The uniqueness of the obtained structural ensemble was checked by validation against an independent PELDOR data set recorded at a higher magnetic field strength. In addition, the kink and twist angle pairs were determined and the resulting structural ensemble was compared with the conformational space deduced both from FRET experiments and from the structure determined by the NMR restraints alone.
Overall, this thesis underlines the potential of using PELDOR spectroscopy combined with rigid spin labels in the context of structure determination of nucleic acids in order to determine the relative orientation between two helices, the conformational flexibility and the conformational changes of nucleic acid molecules upon ligand binding.
Die Na,K-Pumpe ist ein integrales Membranenzym und gehört zur Gattung der P-Typ-ATPasen. Das Enzym setzt bei der Hydrolyse von ATP die resultierende freie Energie in aktiven Transport zur Errichtung eines Na+/K+-Konzentrationsgradienten über der jeweiligen Plasmamembran um. Diese Funktion wird mit einer strukturellen Alternierung zwischen zwei Hauptkonformationen E1 und E2 des Enzyms in Verbindung gebracht. In der vorliegenden Arbeit erfolgte eine Charakterisierung von Sekundärstruktur- und Proteinmikroumgebungsänderungen bei Teilreaktionen der Na,K-ATPase mittels reaktionsinduzierter und zeitaufgelöster FTIR-Differenzspektroskopie. Die hier verwendete IR-Durchlichttechnik setzt voraus, daß das zu untersuchende Enzym in hochreiner, hochkonzentrierter (1 mM) und aktiver Form in einen Proteinfilm in Gegenwart eines geschützten, photolytisch spaltbaren ATP-Derivats (caged ATP) überführt werden kann. In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal eine umfassende IR-spektroskopische Beschreibung von einzelnen Teilreaktionen innerhalb des E1/E2-Reaktionsmodells der Na,K-ATPase durchgeführt. Die Untersuchung des Enzyms in Form eines Proteinfilms mit einer Schichtdicke von etwa 5 µm ist aufgrund der hohen Hintergrundabsorption des Wassers und der geringen Extinktionskoeffizienten der Proteinschwingungsmoden erforderlich. Der überwiegende Teil der Messungen wurde mit (1-(2-nitrophenyl)ethyl)-caged ATP und Schweinenierenenzym bei 5° und 15°C durchgeführt. Nach Abspaltung der Schutzgruppe mittels eines UV-Blitzes und somit der Freisetzung von ATP wurden zeitabhängig (Millisekunden bis Sekunden) die Differenzspektren verschiedener Teilreaktionen im Bereich von 2000 bis 950 cm-1 ermittelt. Der große Vorteil dieser Technik besteht in der Möglichkeit der Registrierung von Zustandsänderungen einzelner Aminosäuren des Proteins, in Bezug auf die Sekundärstruktur, Phosphorylierung, Protonierung und Kationenkoordination. Besonders gut können Änderungen an den Seitenketten der Aminosäuren Aspartat und Glutamat detektiert werden. Die enzymatische ATP-Hydrolyseaktivität der Na,K-ATPase wurde in den Proteinfilmen IR-spektroskopisch anhand der V as (PO2-) bei 1246 cm-1 bestimmt. Die Messungen der spezifischen Aktivität von Schweinenierenenzym ergab bei 15°C einen Wert von 34 nmol Pi mg-1 min-1. Vergleichsmessungen, die mit einem Standardaktivitätstest in Annäherung an die Protein-filmbedingungen durchgeführt wurden, ergaben Ergebnisse von der gleichen Größenordnung. In Abhängigkeit von der Zusammensetzung des kationischen Mediums konnten nach der photochemischen Freisetzung von ATP IR-Differenzspektren von drei verschiedenen Teilreaktionen untersucht werden: (1) ATP-Bindung, (2) Bildung des Phosphoenzyms E1P, (3) Bildung des Phosphoenzyms E2P. Des weiteren wurden Differenzspektren der AMPPNP-Bindung, der ADP-Bindung und der Ammoniumbindung, die mit der K+-Bindung vergleichbar ist, ermittelt. Alle Teilreaktionen führten zu unterschiedlichen Differenzspektren, die charakteristisch für die jeweiligen Zustandsänderungen sind. Durch geeignete Differenzbildung konnten ebenfalls die Differenzspektren der Phosphorylierung (EATP -> E1P) und der Phosphoenzym-Konversion (E1P -> E2P) berechnet werden. Sekundärstrukturänderungen können bei der IR-Spektroskopie innerhalb des Amid I-Bereichs zwischen 1700 und 1610 cm-1 detektiert werden. Die Ergebnisse der IR-Differenzspektroskopie zeigen, daß die Sekundärstruktur der Na,K-ATPase bei allen untersuchten Teilreak-tionen weitgehend konserviert bleibt. Unter den ermittelten Differenzspektren der Teilreaktionen resultiert die größte Netto-Sekundärstrukturänderung in einer Größenordnung von etwa 0,2 % (~3 Aminosäuren/Protomer) bei der E2P-Bildung. Als Folge der Bindung von ATP und ADP an das Enzym gibt es Evidenzen für die Beteiligung von Arginin. Die Bindung von AMPPNP an die Na,K-ATPase hingegen zeichnet sich klar durch andere molekulare Wechselwirkungen unter Beteiligung von Asp und/oder Glu aus. Die Phosphorylierung der Na,K-ATPase in Gegenwart von 1,2 M Na+ (E1P-Bildung) kann anhand von zwei Signalen der V (C=O) bei 1739 und 1709 cm-1, wobei eines der phosphorylierten Seitenkette Asp 369 zugeordnet wird, detektiert werden. Das zweite Signal wird der Protonierung eines Seitenkettenrestes Asp oder Glu zugerechnet, welches in Verbindung mit der Na+-Okklusion bei der E1P-Bildung stehen dürfte. Weitere Signale, die in Zusammenhang mit den molekularen Vorgängen bei der Phosphorylierung und Na+-Koordination stehen, können in der spektralen Region um 1550 cm-1 (V as(COO-)) und 1400 cm-1 (V s(COO-)) detektiert werden. Das Differenzspektrum der Phosphorylierung der Na,K-ATPase in Gegenwart von 130 mM Na+ (E2P-Bildung) enthält keine Beiträge der Kationenokklusion oder -deokklusion. Dennoch enthält das Differenzspektrum der E2P-Bildung die Information über die Transformation der Kationenbindungsstellen von E1 -> E2. Während E1 den Na+-affinen Zustand darstellt, repräsentiert E2 den K+-affinen Zustand der Na,K-ATPase. Das Signalprofil der Differenzspektren der E2P-Bildung unterscheidet sich stark von dem der E1P-Bildung. Neben der Phosphorylierung an Asp 369, die auch hier oberhalb von 1700 cm-1 anhand eines V (C=O)-Signals detektiert wird, können weitere positive und negative Signale sowohl oberhalb von 1700 cm-1 als auch im Bereich um 1550 cm-1 (V as(COO-)) und 1400 cm-1 (V s(COO-)) nachgewiesen werden. Bei der Transformation der Kationenbindungsstellen von E1 -> E2 können somit starke Änderungen an den Seitenketten von Asp und/oder Glu detektiert werden, die auf eine Neuorganisation der Kationenbindungsstellen der Na,K-ATPase schließen lassen. An dieser Neuorganisation sind sowohl Ände-rungen des Protonierungszustandes als auch Änderungen in der Koordinationssphäre der kationenkoordinierenden Gruppen Asp und/oder Glu beteiligt. Da von der Na,K-ATPase keine hochauflösenden Kristallstrukturen existieren, wurden die Kristallstrukturen der Ca-ATPase des sarkoplasmatischen Retikulums, ebenfalls eine P-Typ-ATPase, zur Erläuterung des Mechanismus der Kationenbindung herangezogen (Toyoshima et al., 2004b). Zur Ca-ATPase existieren bereits analoge IR-Differenzuntersuchungen. Dies bot die Möglich-keit des direkten Vergleichs gleicher Teilreaktionen innerhalb des gemeinsamen E1/E2-Reaktionsmodells. Dieser Vergleich zeigt, daß die Sekundärstrukturen beider Enzyme bei den jeweiligen Teilreaktionen weitgehend konserviert bleiben. Bei der Ca-ATPase können die größten Netto-Sekundärstrukturänderungen von etwa 0,3 % des Enzyms (~3 Aminosäuren/Enzym) als Folge der ATP-Bindung beobachtet werden (Barth et al., 1996). Bei dieser Teilreaktion werden bei der Na,K-ATPase die kleinsten Sekundärstrukturänderungen detektiert. Beim Vergleich der Signalprofile beider Enzyme weist der sekundärstrukturrelevante Amid I-Bereich bei der Phosphoenzym-Konversion auf konträre Strukturrelaxationen hin. Die Differenzspektren der Ca-ATPase im Vergleich zur Na,K-ATPase deuten auf eine sich unterscheidende Kationenkoordination hin. Durch eine Kombination der Resultate von IR-Differenz- und Fluoreszenzspektroskopie der FITC-Na,K-ATPase zur Charakterisierung von Enzymzuständen, konnte ein Modell zum Mechanismus der Inhibierung der Na,K-ATPase durch das Herzglucosid Ouabain postuliert werden. Durch Fluoreszenzmessungen an der FITC-Na,K-ATPase konnte gezeigt werden, daß Ouabain in Gegenwart von 20 mM Na+ an das Enzym bindet, was bei 130 mM Na+ nicht mehr der Fall ist. Aufgrund von IR-Differenzsignalen der E2P-Bildung, aufgenommen bei 20 mM Na+, ist es möglich, oberhalb von 1700 cm-1 (ν(C=O)), bei 1554 cm-1 (V as(COO-)) und bei 1408 cm-1 (V s(COO-)) zwischen der an Asp 369 phosphorylierten und unphosphorylierten Na,K-ATPase zu unterscheiden. Nach Ouabain-Zugabe hingegen konnten diese Signale nicht mehr detektiert werden. Bezüglich der Inaktivierung des Enzyms im Standardaktivitätstest, für dessen Ablauf Na+-Konzentrationen von um die 130 mM eingesetzt werden, kann gefolgert werden, daß Ouabain nicht an das freie, sondern an das phosphorylierte Enzym bindet und somit die Inaktivierung der Na,K-ATPase nach sich zieht.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Protein CtaG aus Paracoccus denitrificans eingehend charakterisiert. Es wurde überprüft, ob dieses 21 kDa große Membranprotein als Kupferchaperon und Assemblierungsfaktor für die Untereinheit I der Cytochrom c Oxidase, das heißt für die Biogenese des CuB-Zentrums, in Frage kommt. Eine bioinformatische Analyse zeigte zunächst, dass CtaG, ein Homolog des eukaryotischen Proteins Cox11, zu den am stärksten konservierten Assemblierungsfaktoren der Cytochrom c Oxidase gehört. Interessanterweise sind diese Proteine alle an der Biogenese der redoxaktiven Metallzentren beteiligt, und nur sie sind auch in Paracoccus denitrificans konserviert. Somit stellt Paracoccus ein ideales Modellsystem dar, um die essentiellen Schritte der Biogenese der Cytochrom c Oxidase zu untersuchen. Ein lösliches Fragment von CtaG (CtaGLF) wurde heterolog in E. coli exprimiert und mit Hilfe eines spaltbaren His6-tags aufgereinigt. Es wurde ein Protokoll entwickelt, mit dessen Hilfe die Aggregation des löslichen Fragments minimiert und das Protein in hochreiner, aggregatfreier Form isoliert werden kann. Rekonstitutionsversuche zeigten, dass CtaGLF ein spezifisch Cu(I)-bindendes Protein ist. Nach der heterologen Expression in E. coli ist CtaGLF kofaktorfrei. Ein Protokoll zur in vitro Rekonstitution mit Kupferionen wurde entwickelt, mit welchem ein stöchiometrisches Kupfer/Protein-Verhältnis erreicht wird. Gelfiltrations- und ICP-MS-Analysen zeigten, dass CtaGLF Kupferionen ausschließlich als Dimer bindet. Rekonstitutionen bei denen Cu(I), Cu(II), Co(II), Fe(II), Mn(II), Mg(II) und Ni(II) sowohl einzeln als auch simultan angeboten wurden, führten zwar zu wenig reproduzierbaren absoluten Stöchiometrien, bestätigten aber, dass CtaGLF bevorzugt Cu(I) bindet. Mutagenesestudien bewiesen einerseits, dass drei Cysteinreste maßgeblich für die Kupferbindung verantwortlich sind und deuteten andererseits darauf hin, dass zwei identische, punktsymmetrische Bindungsstellen des CtaGLF-Dimers die Kupferionen koordinieren. Mit Hilfe einer Multiseq-Analyse wurden zunächst hochkonservierte Oberflächenreste von CtaG identifiziert. Eine Auswahl dieser Aminosäuren wurde per gerichteter Mutagenese ersetzt und der Effekt dieser Mutationen auf Stöchiometrie, Affinität und Dimerisierung von CtaGLF wurde untersucht. Die Affinitäten wurden dabei mit Hilfe von Kompetitionsexperimenten mit dem Cu(I)-spezifischen Chelator BCA analysiert. Insgesamt vier mögliche Szenarien für die Kupferbindung von CtaG wurden postuliert und anhand der Datenlage diskutiert. Das Szenario III, welches die Datenlage am besten zu erklären vermag, sieht eine trigonale Koordination der Kupferionen vor, an welcher die Cysteine des hochkonservierten CFCF-Motivs einer Polypeptidkette ein gemeinsames Koordinationsfeld mit dem nahe der Transmembranhelix gelegenen Cystein 38 der jeweils anderen Polypeptidkette bilden. Mit Hilfe von UV/Vis-spektroskopischen Messungen wurde gezeigt, dass die Bindung von Kupferionen an CtaGLF zu einer Absorption bei 358 nm führt. Diese kann mit einem Extinktionskoeffizienten von E delta 358 nm = 936 M-1cm-1 zur Beobachtung des Kupfertransfers von CtaGLF auf einen Akzeptor verwendet werden. Um eine Beteiligung von CtaG bei der Insertion des CuB-Ions in die Untereinheit I der Cytochrom c Oxidase (UE I) zu beweisen, wurden zwei Arbeitshypothesen aufgestellt und empirisch untersucht: Die erste Hypothese geht von einer posttranslationalen Kupferinsertion aus. Die UE I wird laut dieser Hypothese zunächst vollständig exprimiert und in die Membran inseriert, bevor das Kupferion über einen Kanal in das 13 Å unterhalb der Membranoberfläche gelegene aktive Zentrum der Oxidase inseriert wird. Drei Ansätze wurden zur empirischen Überprüfung dieser Hypothese verfolgt: Erstens wurde ein in vitro Transferassay etabliert, bei dem heterolog exprimierte, kofaktorfreie UE I als Akzeptor für Kupferionen von CtaGLF diente. Zweitens wurden bioinformatische Analysen durchgeführt um potentielle Interaktionsflächen zwischen CtaG und UE I zu identifizieren. Und drittens wurde mit Hilfe koaffinitätschromatographischer Versuche eine Interaktion zwischen CtaG und kofaktorfreier UE I untersucht. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sprechen allesamt gegen eine posttranslationale CtaG-vermittelte Insertion von Kupferionen in die UE I der Cytochrom c Oxidase. Die zweite Hypothese geht davon aus, dass die prosthetischen Häm- und Kupfergruppen bereits vor der vollständigen Membraninsertion, das heißt kotranslational auf die UE I übertragen werden. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden ebenfalls mehrere Ansätze verfolgt: Erstens wurde die UE I in Gegenwart und Abwesenheit von CtaG heterolog in E. coli exprimiert und anschließend aufgereinigt. In Abwesenheit weiterer Assemblierungsfaktoren ist CtaG in diesem System nicht dazu in der Lage den Kupfergehalt der UE I zu erhöhen. Zweitens wurde mit Hilfe von Blau-Nativ Gelen und Crosslinking-Versuchen im nativen Wirt Paracoccus denitrificans nach einer Wechselwirkung zwischen CtaG und UE I gesucht. Insbesondere die Ergebnisse der Crosslinking-Versuche deuten auf einen Assemblierungskomplex hin, der sowohl CtaG als auch die UE I der Cytochrom c Oxidase enthält. In einem dritten Ansatz wurde ein zellfreies Expressionssystem etabliert, welches direkten Zugang zu naszierenden Ketten der UE I ermöglicht. Dieses System erscheint vielversprechend und dient derzeit als Basis für weitere Biogenesestudien. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass CtaG ein spezifisch Cu(I)-bindendes Protein ist, das im Zuge der Kupferbindung dimerisiert und in Paraoccus denitrificans in einem hochmolekularen Komplex gemeinsam mit UE I vorliegt. Die gegenwärtige Datenlage spricht dafür, dass CtaG als Kupferchaperon an der Biogenese der Cytochrom c Oxidase beteiligt ist und das CuB-Ion in einem kotranslationalen Mechanismus in die UE I der Cytochrom c Oxidase inseriert.