Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
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Eine in vivo Modifizierung von Blutstammzellen wäre für eine Reihe gentherapeutischer Therapieansätze vorteilhaft. Dies würde voraussetzen, dass retrovirale Vektoren gezielt auf Blutstammzellen ausgerichtet werden können. Für dieses sogenannte Zelltargeting bietet sich das vom Milznekrose-Virus von Vögeln (SNV) abgeleitete Vektorsystem an, bei dem die Rezeptorbindungsdomäne des Env-Proteins modifiziert werden kann. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte ein SNV-basierter retroviraler Zelltargeting-Vektor entwickelt werden, der einen selektiven Gentransfer in die primären humanen CD34-positiven hämatopoetischen Zellen ermöglicht. Zur weitergehenden Charakterisierung des SNV-Vektorsystems sollte geklärt werden, ob das Env-Protein des SNV ein mit anderen gamma-retroviralen Env-Proteinen vergleichbares R-Peptid aufweist, dessen mögliche Rolle bei viralem Zelleintritt ebenfalls untersucht werden sollte. Um eine Zielzell-Spezifität des SNV-Vektors zu erreichen, wurde die gesamte SU-Domäne des SNV-Env-Proteins mit einem einkettigen Antikörperfragment (scFv) ersetzt, das gegen das CD34 Molekül gerichtet ist,. Mit diesem modifizierten Env gelang es, [(antiCD34-TM)SNV]-Vektorpartikel herzustellen, die spezifisch CD34-positive Zellen transduzierten. Essentiell für die Erzeugung solcher Vektoren war die Etablierung einer stabilen Verpackungszelllinie, die Vektorpartikel mit einem Titer von 2x105 i.E./ml produzierte. In Transduktionsexperimenten mit verschiedenen Zelllinien wurde gezeigt, dass [(antiCD34-TM)SNV]-Vektoren eine deutliche Präferenz für CD34+-Zellen und nicht für CD34--Zellen besitzen, wobei der Unterschied in der Transduktionseffizienz zwischen CD34-positiven und –negativen Zellen um den Faktor 100 lag. [(antiCD34-TM)SNV]-Vektoren waren in der Lage, den Reportergentransfer auch in primäre humane Stammzellen zu bewirken. Hierzu wurde ein Transduktionsprotokoll so optimiert, dass die aus dem Nabelschnurblut isolierten CD34+-Zellen transduziert werden konnten. Der für diese Zielzellen bestimmte Vektortiter betrug bis zu 2x106 i.E./ml. In einem Gemisch von primären CD34+- und CD34--Zellen konnte der Vektor zwischen dem Target- und Nontarget-Zellen unterscheiden. Somit wurde zum ersten Mal nicht nur Spezifität, sondern auch Selektivität des SNV-Vektorsystems demonstriert. Dieses Ergebnis ist für eine Weiterentwicklung des Vektors für die in vivo Anwendung in Rahmen einer Gentherapie eine wichtige Voraussetzungen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Fusionsvorgang bei Virus-Eintritt näher untersucht. Anlass dafür war die experimentelle Beobachtung, dass das Env-Protein des SNV bei der Virusknospung von einer viralen Protease innerhalb der zytoplasmatischen Domäne proteolytisch gespalten wird. Ein Sequenz-Vergleich des SNV TM-Proteins mit dem MLV TM-Protein ergab Hinweise darauf, dass es sich um die Abspaltung des sogenannten R-Peptides analog zu MLV handeln könnte. Die Expression von SNV-Env- Mutanten mit einem entsprechend verkürzten C-Tail (Env delta R) führte zur Synzytien-Bildung. Die bildung hochfusogener Oberflächenhüllproteine durch die Abspaltung des R-Peptids konnte auch für andere gamma-Retroviren gezeigt werden. Die Synzytienbildung konnte quantitativ unter den Env delta R-Varianten verschiedener gamma-Retroviren in einem etablierten Fusionsassay verglichen werden. Das Env delta R des endogenen Retrovirus des Schweins (PERV) des Typs A erwies sich als potentestes Fusionsagens. Als Folge der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit wurde postuliert, dass die Abspaltung des R-Peptides ein allgemeiner Mechanismus bei der Partikelreifung der gamma-Retroviren ist und eine fusionsregulierende Rolle besitzt. Eine Weiterentwicklung fusionsaktiver Env-Varianten als mögliche therapeutische Gene für eine Tumor-Gentherapie ist somit diskutierbar.
Ziel der Arbeit war die Analyse von langen eukaryotischen Signalpeptiden, mit einer Länge von mindestens 40 Aminosäuren, und ihre Diskriminierung zu kurzen SP. Signalpeptide sind notwendig, um die im Cytosol translatierten Proteine zum Ort ihrer Funktion zu dirigieren. Sie spielen dadurch eine fundamentale Rolle bei der Entwicklung von Zellen. Signalpeptide weisen keine Sequenzhomologie, aber einen typischen, in drei Regionen gegliederten Aufbau (n-, h-, c-Region) auf. In den letzten Jahren wurden zunehmend Beispiele von Signalpeptiden gefunden, die neben dem Targeting zum endoplasmatischen Retikulum weitere Post-Targeting-Funktionen aufweisen. Auffällig ist hier die besondere Länge der Signalpeptide. Für die Analyse dieser langen Signalpeptide standen bis jetzt keine gezielt entwickelten Vorhersageprogramme zur Verfügung. Im Rahmen dieser Arbeit wurde diese Gruppe langer Signalpeptide untersucht und ein Modell zu deren interner Organisation entwickelt. Das entwickelte „NtraC“-Modell erweitert etablierte sequenzbasierte Ansätze für kurze SP um eine Sekundärstruktur-motivierte Perspektive für lange Sinalpeptide. Zuerst wird dabei ein Übergangsbereich (transition area, N„tra“C), der potentiell β-Turn bildende Aminosäuren enthält, identifiziert. Dieser dient im Modell zur Zerlegung des SP in zwei hinsichtlich ihrer Funktion unabhängige Domänen: eine N-terminale N-Domäne (‚N’traC) und eine C-terminale C-Domäne (Ntra‚C’). Diese mit bekannten Vorhersageprogrammen nicht identifizierbaren „kryptischen“ Domänen innerhalb der Signalpeptid-Sequenz können unterschiedliche Targeting-Kapazitäten aufweisen und entsprechen für sich genommen eigenständigen Protein-Targeting-Signalen. Im Fall einer ER-Targeting Kapazität z.B. weist eine Domäne für sich genommen eine n-, h-, und c-Region auf. 63% aller Vertebrata-Signalpeptide entsprechen der in dieser Arbeit vorgeschlagenen NtraC-Organisation. Eine basierend auf dem NtraC-Modell vorgeschlagene Architektur für die langen Signalpeptide von shrew-1 (43 Aminosäuren), DCBD2 (66 Aminosäuren) und RGMA (47 Aminosäuren) wurde vom Autor selbst in vitro überprüft. Für alle drei Proteine wurden eine N-Domäne mit mitochondrialer Targeting-Funktion und eine C-Domäne mit Signalpeptid-Funktion vorhergesagt. Die langen Signalpeptide der Proteine wurden bisher als reine ER-Targeting-Signale betrachtet. Die vorliegende Studie zeigt jedoch, dass in diesen langen Signalpeptiden multiple Targetingsignale kodiert sind. Die ER-Targeting-Kapazität der C-Domänen wurde durch SEAP-Assays überprüft, die mTP-Funktion der N-Domäne durch biochemische Aufreinigung von Mitochondrien. Die in silico-Vorhersagen konnten in vollem Umfang für alle drei Proteine in vitro bestätigt werden. Eine Untersuchung der semantischen Wolke aller Proteine mit NtraC-organisiertem Signalpeptid zeigte, dass eine NtraC-Organisation in mehr als 50% der Fälle im Zusammenhang mit Typ-I Transmembranproteinen auftritt. Auch die Proteine der hier experimentell untersuchten Signalpeptide von shrew-1, DCBD2, RGMA sind Typ-I Transmembranproteine. Des Weiteren weisen 15% aller langen Vertebrata-Signalpeptide eine Domänen-Kombination analog zu shrew-1, DCBD2 und RGMA auf. Der gefundene analoge Aufbau der langen Signalpeptide könnte somit funktionelle Gruppen von Proteinen zusammenführen, die bisher anderweitig nicht gruppiert werden konnten. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass bakterielle Autotransporter Gram-negativer Bakterien in Variation ebenfalls eine NtraC-Organisation in ihren Signalpeptiden aufweisen. Gleiches konnte für Gruppen langer viraler Signalpeptide gezeigt werden. Das NtraC-Modell ist somit nicht auf Vertebrata-Signalpeptide beschränkt. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Modell zur Domänen-Architektur langer Signalpeptide entwickelt und erfolgreich angewendet: das NtraC-Modell. Ein Vorhersage-Algorithmus zur in silico-Untersuchung langer Signalpeptide wurde implementiert und in einer webbasierten Benutzeroberfläche öffentlich zugänglich gemacht. Das Modell trifft auf 63% der annotierten langen Vertebrata-Signalpeptide zu. Des Weiteren wurden, basierend auf dem NtraC-Modell, für die langen Signalpeptide von drei Proteinen (shrew-1, DCBD2, RGMA) in vitro-Versuche durchgeführt. Die erhaltenen in vitro-Ergebnisse unterstützen klar die These, dass lange Signalpeptide eine aus definierten Domänen bestehende Organisation aufweisen können.
In der vorliegenden Studie wurde der modulierende Einfluss von Acetylcholin auf die Frequenzabstimmung der Neurone im primären Hörkortex untersucht. Im primären Hörkortex von betäubten Wüstenrennmäusen (Meriones unguiculatus) wurden Einzel- und Mehrzellableitungen in Elektrodenpenetrationen senkrecht zur Kortexoberfläche durchgeführt und die Antworteigenschaften der Neurone vor und während der iontophoretischen Applikation von Acetylcholin, dem Agonisten Carbachol bzw. dem muskarinischen Antagonisten Atropin gemessen. Bei rund der Hälfte der gemessenen Neurone konnte ein cholinerger Einfluss auf die Frequenz-Antwortbereiche gemessen werden. Dabei können sich die Frequenz-Antwortbereiche unter dem Einfluss von Acetylcholin sowohl vergrößern als auch verkleinern, so dass für die gesamte Neuronenpopulation keine signifikante gerichtete Veränderung auftrat. Bereits bei den niedrigsten verwendeten Dosen von Acetylcholin waren maximale Effekte zu beobachten. Cholinerge Einflüsse in Form von Veränderungen der Frequenz-Abstimmkurven von Neuronen konnten in allen kortikalen Schichten gemessen werden. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit werden die neuronalen Antworten auf repetitive Schallereignisse, d.h. einfache zeitliche Muster, beschrieben. Für die Versuche wurden drei unterschiedlich zeitlich strukturierte Reize ausgewählt. Es handelte sich um sinusamplituden-modulierte (SAM) Reize, sowie repetitive Ton- und Rauschpulse. SAM Reize und repetitive Tonpulse ähnelten sich in ihrem Frequenzgehalt. Die repetitiven Ton- und Rauschpulse wiesen ein identisches zeitliches Muster auf, das sich von SAM Reizen unterschied. Es wurden sowohl die Wiederholfrequenzen, als auch an der besten Wiederholfrequenz die Schalldruckpegel systematisch verändert. Zusätzlich erfolgte die iontophoretische Applikation von Bicucullin (BIC), um den möglichen Einfluss schneller GABAerger Inhibition zu ermitteln. Während die neuronale Aktivitätsrate mit höheren Wiederholfrequenzen annähernd konstant blieb, war die Stärke der zeitlichen Synchronisation der neuronalen Aktivität von der jeweiligen Wiederholfrequenz des repetitiven Reizes abhängig. Die zeitliche Synchronisation der neuronalen Aktivität sank in der Mehrheit der Neurone mit steigender Wiederholfrequenz drastisch ab (Tiefpasscharakteristik) und nur in einem Bruchteil der Neurone fanden sich einzelne Wiederholfrequenzen, die eine maximale Synchronisation auslösten (Bandpasscharakteristik). Die kortikalen Neurone zeigten unabhängig vom benutzten Reiztyp ein gutes neuronales Folgeverhalten auf repetitive Schallreize bis zu Wiederholfrequenzen von 15 – 30 Hz, mit besten Wiederholfrequenzen von 5 -10 Hz. Unter dem Einfluss von BIC war eine deutliche Veränderung der neuronalen Aktivitätsrate zu erkennen. Diese hatte jedoch weder einen Effekt auf die Synchronizität, noch auf die Repräsentation der Reiztypen. Eine einfache Inhibition im auditorischen Kortex fällt damit als Erklärung für die gemessenen neuronalen Aktivitätsmuster aus. In der realen Umwelt können komplexe akustische Reize in sehr unterschiedlichen Schallintensitäten auftreten. Die reizsynchronisierte neuronale Aktivität erlaubt, ein zeitliches Muster innerhalb eines komplexen Reizes zu kodieren. Es wurde untersucht, inwieweit diese zeitliche Kodierung von der Schallintensität abhängt und inwieweit schnelle GABAerge Inhibition darauf einwirkt. Es fand sich kein Zusammenhang zwischen der allgemeinen neuronalen Aktivitätsrate oder der neuronalen Synchronizität in Abhängigkeit vom Schalldruckpegel. Allerdings konnte bei verschiedenen Neuronenpopulationen ein unterschiedliches Verhalten in der Synchronisation mit höheren Schalldruckpegeln bei Stimulation der Neurone mit SAM Reizen und repetitiven Tonpulsen festgestellt werden, das im Hinblick auf die sich verändernde Flankensteilheit bei höheren Schalldruckpegeln und den daraus resultierenden veränderten Interstimulusintervallen diskutiert wird. Die Ergebnisse aus den Experimenten mit BIC und variierenden Schalldruckpegeln zeigten im Mittel keinen Einfluss der kortikalen Inhibition auf die Abhängigkeit der neuronalen Aktivitätsrate und der Synchronisation vom Schalldruckpegel. Allerdings fanden sich im Einzelfall Änderungen in der Synchronisation auf SAM Reize unter BIC. Insgesamt scheint der Einfluss der kortikalen Inhibition auf Veränderungen der neuronalen Antwort im Zusammenhang mit variierenden Schalldruckpegeln gering bzw. nicht vorhanden zu sein.
Die Maus hat wie die meisten Säugetiere zwei Zapfenopsine, das S-Opsin (UV-empfindlich) und das M-Opsin (grün-empfindlich). Die Zapfen werden nach dem jeweils exprimierten Opsin S-Zapfen oder M-Zapfen genannt. Bei der Maus wird die Zapfenzahl embryonal festgelegt, aber das Opsin-Expressionsmuster entwickelt sich erst postnatal (Szel et al. 1998). In der ersten Postnatalwoche (PWo 1) exprimieren alle Zapfen über die gesamte Retina das S-Opsin. Ab PWo 2 kann das M-Opsin immunzytochemisch nachgewiesen werden. Eine Besonderheit der adulten Maus ist die Koexpression beider Opsine in vielen Zapfen (Dualpigmentzapfen; Lukats et al. 2005). Außer einer geringen Zahl "echter" S-Zapfen exprimieren alle Zapfen das M-Opsin entweder allein oder zusammen mit dem S-Opsin (Szel 1993, Applebury 2000, Haverkamp et al. 2005). Das adulte wildtypische Zapfenmuster besteht aus gegenläufigen dorso-ventralen Gradienten der S- und M-Zapfen (Szel 1993, Applebury 2000). Das M-Opsin wird stärker in der dorsalen Retina exprimiert und die Expression nimmt zur ventralen Retina ab. In der ventralen Retina exprimieren alle Zapfen das S-Opsin, in der dorsalen Retina ist die Zahl der S-Zapfen sehr gering. Das adulte Zapfenmuster entsteht durch einen Wechsel von S- zu M-Opsinexpression in vielen Zapfen. Die Expression der Opsine wird während der postnatalen Entwicklung durch den Schilddrüsenhormonrezeptor beta 2 (TRbeta2) reguliert. Ein Fehlen des TRbeta2 (TRbeta2 -/-) führt zum Verlust des M-Opsins und zur Expression des S-Opsins in allen Zapfen (Ng et al. 2001). Auch das Schilddrüsenhormon und der Retinsäurerezeptor gamma (RXRgamma) sind Regulatoren in der postnatalen Entwicklung der Opsinexpression (Roberts et al. 2005, 2006). Die Pax8 -/- Maus hat durch den Verlust des Pax8-Gens eine mißgebildete Schilddrüse, die kein Schilddrüsenhormon produzieren kann (Mansouri et al. 1998). In der vorliegenden Studie wurde die Auswirkung der postnatalen Hypothyreose von Pax8 -/- auf die Entwicklung des Auges und der Retina im Alter von PWo 3 untersucht. Die Ergebnisse von Pax8 -/- wurden mit Pax8 +/- und +/+ Wurfgeschwistern verglichen. Die Hypothyreose von Pax8 -/- wurde durch Messung der Schilddrüsenhormonwerte im Blut bestätigt. Die Augenparameter unterscheiden sich nicht zwischen Pax8 -/- und den Kontrolltieren. Auch die Entwicklung der Retina ist bei allen drei Pax8-Genotypen gleich. Pax8 -/- zeigt keine Veränderungen in der Schichtung der Retina sowie der Morphologie untersuchter Zelltypen. In allen drei Pax8-Genotypen konnten die Transkripte der S- und M-Opsine und des Stäbchenopsins nachgewiesen werden. Auch die Transkripte des TRbeta2, der Deiodinase 2 und der Deiodinase 3 wurden ermittelt. Anhand dieser Ergebnisse kann die Aussage gemacht werden, daß die Hypothyreose von Pax8 -/- keinen Einfluß auf die generelle postnatale Entwicklung des Auges und der Retina zeigt. Im Gegensatz dazu ist die Auswirkung der Hypothyreose auf die Ausprägung des S- und M-Zapfenmusters gravierend. Sie wurde durch Dichtezählungen der S- und M-Zapfen analysiert. Zunächst wurde das Zapfenmuster der wildtypischen Maus-Stämme C57, Sv129 und Pax8 +/+ untersucht. Alle drei Wildtypen zeigen im Alter von PWo 3 und PWo 22 (adult) ein vergleichbares Zapfenmuster mit gegenläufigem dorso-ventralem Gradienten der S- und M- Zapfen. Auch die heterozygote Pax8 +/- Maus zeigt das wildtypische Zapfenmuster. Pax8 -/- hingegen hat ein verändertes Zapfenmuster. Die S-Zapfendichten sind bei PWo 3 und PWo 22 über die gesamte Retina gleich, so daß kein Gradient ausgebildet ist. Die Veränderung im M-Zapfenmuster von Pax8 -/- ist bei PWo 3 deutlich zu sehen, während das adulte M-Zapfenmuster wieder wildtypisch erscheint, hier scheint also eine verzögerte normale Entwicklung vorzuliegen. Durch eine Substitution mit Thyroxin (T4) ab P2 kann bei Pax8 -/- das wildtypische Zapfenmuster erzeugt werden, somit ist das Schilddrüsenhormon für die Ausprägung des Zapfenmusters während der postnatalen Entwicklung verantwortlich. Weitere Versuche zeigen, daß die Opsinexpression während des ganzen Lebens plastisch und Schilddrüsenhormon-abhängig ist. Eine Unterbrechung der T4-Substitution ab PWo 4 führt bei Pax8 -/- zum Rückgang auf das hypothyreote Zapfenmuster. Auch wenn Pax8 -/- erst im adultem Alter mit T4 substituiert wird, ist eine Veränderung des Zapfenmusters sichtbar. Eine künstlich durch Methimazol erzeugte Hypothyreose in adulten C57-Mäuse führt ebenfalls zu einer Veränderung des Zapfenmusters, das dann mit dem Zapfenmuster von Pax8 -/- identisch ist. Zusammenfassend erlauben die Ergebnisse den Schluß, daß das Schilddrüsenhormon über die Expression der Opsine die Ausprägung des Zapfenmusters sowohl während der Entwicklung reguliert, als auch für eine Aufrechterhaltung des Zapfenmusters während des ganzen Lebens benötigt wird. Dieser Befund hat auch klinische Relevanz. Die nicht seltene Neugeborenen-Hypothyreose beim Menschen wird heute durch eine direkt nach der Geburt beginnende lebenslange Thyroxin-Substitution therapiert. Nach unseren Befunden bei der Maus könnte dies auch für die Aufrechterhaltung einer normalen Zapfenopsin-Expression und damit eines normalen Sehvermögens notwendig sein.
In vorliegender Studie wurde lebend und tot gesammeltes Schalenmaterial der Europäischen Flussperlmuschel Margaritifera margaritifera verschiedener Lokalitäten in Schweden, Finnland und Deutschland (bzw. Frankreich) sklerochronologisch und isotopengeochemisch untersucht. Sauerstoffisotopen-Zeitreihen, trendbereinigte und standardisierte stabile Kohlenstoffisotopen-Zeitreihen (SSCI) sowie jährliche Zuwachsraten (SGI-Zeitreihen) jeder der acht Populationen sind zu Compound-Chronologien zusammengefasst und auf Zusammenhänge mit Temperatur, Sonnenflecken-Zyklen und Niederschlag untersucht sowie auf Korrelationen mit verschiedenen Klimaindizes (z.B. dem Dipol der Meeres-Oberflächenwasser Temperatur-Anomalien im Nordatlantik, NADP-SST, und der Nordatlantischen Oszillation, NAO) getestet worden. Im Vergleich ergaben sich für die geglätteten Zeitreihen (25-Jahresfilter) Korrelationskoeffizienten von r = 0,57 (SGI Master-Chronologie und NAO) bzw. r = 0,59 (Master-Chronologie) und NADP-SST. Obwohl weder Isotopendaten noch Zuwachschronologien der Muscheln auf hochfrequenten Signalen hohe Korrelationen mit instrumentellen Messdaten aufweisen, sind dekadische Klimaoszillationen deutlich repräsentiert. Mit zunehmendem Lebensalter nimmt der Schalenzuwachs exponentiell ab. Gleichzeitig nähern sich die d13C-Werte der Schale dem d13CDIC-Wert des Wassers, der bei den hier untersuchten Lokalitäten zwischen -9,3 ‰ und -12,7 ‰ lag. Erst im hohen Lebensalter findet also die Schalenbildung nahezu im kohlenstoffisotopischen Gleichgewicht mit dem umgebenden Medium statt. In der Jugend der Tiere hingegen wirken sich lokalitätsspezifische Trends aus. Extrinsische Faktoren führen zu drei Mustern: 1) Trends hin zu stärker negativen d13C-Werten (um etwa -4,5 ‰) in den Bächen Nuortejaurbäcken (NJB) und Grundträsktjärnbäcken (GTB), 2) Trends hin zu weniger stark negativen d13C-Werten (um etwa +4,5 ‰) in den großen Flüssen (GJ: Görjeån, NWS: Tarn/Frankreich) und 3) Schwankungen um etwa ±1,5 ‰ um einen Mittelwert (RG: Regnitz). Der Einfluss auf die d13C-Trends könnte möglicherweise in Veränderungen der Bioproduktivität begründet sein, da sich diese unmittelbar auf den DIC-Pool des umgebenden Milieus und des Habitats auswirkt. In den Sauerstoffisotopen spiegelte sich die geographische Herkunft des untersuchten Materials wider. Die Chronologien der am nördlichsten gelegenen Populationen wiesen d18OMittelwerte von -11,5 ‰ (GJ), bzw. -9,5 ‰ (NJB, GTB) auf, die RG-Chronologie von -7,9 ‰ und die Zeitreihe der NWS von -5,3 ‰. Im Gegensatz zu anderen Arbeiten zeigten die untersuchten Individuen jedoch keinen statistischen Zusammenhang mit annuellen Temperaturdaten. Als beeinflussende Faktoren kommen die Schneeschmelze und die isotopengeochemische Ausprägung des Habitats (See, Fluss, Bach) in Frage. Eine sehr hohe Korrelation von r = -0,74 (25-Jahresfilter) wurde zwischen der Görjeån-Chronologie (d18OAragonit) und Niederschlagsraten für das in der Nähe des Flusses gelegene Jokkmokk festgestellt.
H. salinarum ist einer von zwei archaealen Organismen, die synchronisiert werden können. Die Synchronisations-Methode konnte in dieser Arbeit optimiert werden. Nahezu 100 % aller Zellen teilen sich in einer Zeitspanne von einem Viertel der Generationszeit. Die Analyse zweier aufeinanderfolgender Zellzyklen zeigte, dass die Zellen sich auch im zweiten Zyklus synchron teilen. Die Zellsynchronisation wurde angewendet, um zellzyklusabhängige Vorgänge in H. salinarum auf unterschiedlichen Ebenen zu charakterisieren. Mittels DNA-Mikroarrays wurden Transkriptomänderungen untersucht. Nur 87 Gene zeigten zellzyklusspezifische Regulationen. Dies entspricht 3 % aller vorhergesagten offenen Leserahmen und ist somit im Vergleich zu allen anderen Organismen, deren Transkriptome untersucht wurden, deutlich geringer. Die Transkriptmengen von 15 ausgewählten Genen wurden mit Northern Blot Analysen verifiziert. Die regulierten Gene konnten in sieben Gruppen mit unterschiedlichen Transkriptprofilen eingeordnet werden. Gruppenspezifische DNA-Sequenzmotive wurden gefunden, von denen angenommen wird, dass sie in die zellzyklusspezifische Transkriptionsregulation involviert sind. Überraschenderweise wurden die meisten als Zellzyklusgene annotierten Gene konstitutiv transkribiert. Die Analyse zellzyklusabhängiger Proteomänderungen erfolgte mittels 2D-Gelelektrophorese. 1200 Proteine konnten reproduzierbar detektiert werden. Die meisten Proteine wurden konstitutiv exprimiert. Nur 30 Proteine zeigten eine zellzyklusabhängige Regulation. Dies entspricht 2,5 % der reproduzierbar detektierten Proteine. Es konnten unterschiedliche Expressionsprofile gefunden werden. Aus den Transkriptom- und Proteomanalysen folgt, dass auf Ebene der Genexpression nur wenige zellzyklusabhängige Regulationen existieren. Sekundäre Botenstoffe spielen eine wesentliche Rolle bei Signaltransduktionen und sind an Regulationen von Zellzyklen beteiligt. Eine Methode zur Messung intrazellulärer cAMP-Konzentration in H. salinarum konnte etabliert werden. Die basale cAMP-Konzentration von 200 µM in haloarchaealen Zellen ist bedeutend höher als die von Hefe. Synchrone Kulturen wurden auf die Oszillation des sekundären Botenstoffes hin untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Konzentration zellzyklusabhängig zweimal kurzfristig signifikant erhöht wird. Die cAMP-Konzentration steigt einmal vor und einmal direkt nach der Zellteilung an. cAMP könnte daher ein wichtiges Signal für das Fortschreiten des Zellzyklusses sein. Es konnte eine Methode zur Analyse der Replikation in H. salinarum entwickelt werden. Hierfür wurde das Basenanalogon BrdU und ein spezifischer Antikörper gegen dieses verwendet. Die Analyse synchroner Kulturen zeigte das überraschende Ergebnis, dass die Zellen ihre DNA während des gesamten Zellzyklusses zu replizieren scheinen. Vor allem die DNA-Synthese in synchronen Kulturen während der Teilungsphase der Zellen stellt einen völlig neuartigen Zellzyklusablauf dar. Für in vivo Analyse von Zellzyklusproteinen können diese mit GFP markiert und fluoreszenzmikroskopisch analysiert werden. Mit dieser Methode konnten wichtige zellzyklusabhängige Aspekte in anderen Arten aufgeklärt werden. Für einen GFP-Modellversuch wurde in dieser Arbeit ein Fusionsgen bestehend aus den offenen Leserahmen von bop (bacterio-opsin) und gfp (green fluorescent protein) erstellt. Die Expression des chromosomalen bop Gens und des plasmidkodierten bop-gfp Fusionsgens wurde mit Northern Blot Analysen nachgewiesen. Die Purpurmembranbiogenese wurde fluoreszenzmikroskopisch in lebenden H. salinarum Zellen untersucht. Es stellte sich heraus, dass die Bildung der Purpurmembran ca. 15 Stunden nach Eintritt der Zellen in die stationäre Wachstumsphase beginnt. Innerhalb der folgenden sieben Stunden stieg sowohl die Anzahl an Zellen mit fluoreszierenden Signalen als auch die durchschnittliche Anzahl an Signalen pro Zelle gleichmäßig an. Die Ergebnisse zeigen, dass GFP-Fusionsproteine in H. salinarum z. B. zur Charakterisierung von differentieller Genexpression verwendet werden können. Des Weiteren könnten sie für die Untersuchung zellzyklusabhängiger Proteinlokalisation und für die Analyse der intrazellulären Verteilung putativer Cytoskelettproteine eingesetzt werden.
Beta-Barrel-Membranproteine der Omp85-Familie besitzen essentielle Funktionen in der Lipidbiogenese und der Proteinintegration und -assemblierung in der äußeren Membran von Gram-negativen Bakterien. Auch in endosymbiotisch erworbenen Organellen der Eukaryoten übernahmen Vertreter dieser Proteinfamilie wichtige Rollen, wie bei der Translokation von Vorstufenproteinen durch die äußere Hüllmembran von Chloroplasten und der Assemblierung von Proteinkomplexen in der äußeren Hüllmembran von Mitochondrien. Eine phylogenetische Analyse der bekannten Vertreter dieser Proteinfamilie wies auf eine Aufspaltung der Omp85-Familie in zwei Hauptzweige hin. Während der Toc75-Zweig aus plastidären und cyanobakteriellen Omp85-Proteinen besteht, bilden mitochondrielle Proteine sowie die Omp85-Vertreter der Proteobakterien eine zweite Unterfamilie, den Sam50-Zweig. In dieser Arbeit wurden die elektrophysiologischen Eigenschaften von pro- und eukaryotischen Vertretern beider Unterfamilien verglichen. Zu diesem Zweck wurde ein elektrophysiologischer Messstand konstruiert, mit dem diese Kanalproteine mittels der Lipid-Bilayer-Technik untersucht werden konnten. Die Analyse der experimentellen Daten der verwendeten Omp85-Proteine zeigte deutliche Gemeinsamkeiten der gesamten Proteinfamilie hinsichtlich ihrer Kationenselektivität. Hingegen ergab ein Vergleich der Kanalleitwerte signifikante Unterschiede zwischen beiden Unterfamilien. So lagen die aus den Leitwerten berechneten Porendurchmesser bei den Mitgliedern des Toc75-Zweigs um das Zwei- bis Dreifache über den für die Vertreter des Sam50-Zweigs bestimmten Werten. Topologievorhersagen ergaben, dass die Mitglieder der Omp85-Familie aus zwei Domänen aufgebaut sind. Durch die Analyse der elektrophysiologischen Eigenschaften von Teilkonstrukten, die aufgrund dieser Vorhersagen erstellt wurden, konnte gezeigt werden, dass die C-terminale Domäne die Porenregion des beta-Barrel-Proteins bildet. Die elektrophysiologischen Eigenschaften der Omp85-Proteine werden allerdings durch die N-terminale Domäne moduliert. Aufgrund der in dieser Arbeit erzielten elektrophysiologischen Ergebnisse und unter Berücksichtigung der phylogenetischen Analyse der Omp85-Familie konnte eine Hypothese zur evolutionären Entwicklung dieser sehr alten Proteinfamilie aufgestellt werden.
Eine Reihe kurzer synthetischer Peptide, die auf verschiedenen Ebenen während des mehrstufigen Infektions-Prozesses HIV-1 hemmen konnten, wurden in unserer Gruppe über Phage-Display identifiziert. Diese Peptide hatten allerdings nur geringe Affinitäten zu gp120 und eine kurze Halbwertszeit. In der vorliegenden Arbeit wurden diese und andere HIV-1 „Entry“ hemmende Peptide über gentechnische Methoden in eukaryotischen Zellen exprimiert, um ihre Stabilität und antivirale Aktivität zu verbessern. Durch die angeknüpfte Multimerisierungsdomäne C4bp sind die therapeutischen Peptide groß genug, um von Zellen sekretiert zu werden. Die eukaryotisch sekretierten Multimere sind posttranslational modifiziert, besitzen eine höhere Stabilität und die Anzahl der funktionellen Valenzen ist erhöht. Außerdem bietet das System die Möglichkeit, auch Heteromultimere mit verschiedenen Teilstrukturen in einem Molekül zu kombinieren. Wir konnten zeigen, dass sich das C4bp-System zur Expression des Fusions-Inhibitorischen C46-Peptids in löslicher multimerer Form eignete, welches in monomerer Form nicht vollständig durch ER und den Golgi-Apparat geleitet und sekretiert werden konnte. Außerdem hatte multimeres C46 eine deutlich höhere Plasma-Halbwertszeit und wies eine höhere antivirale Aktivität gegenüber dem monomeren Peptid auf (Dervillez et al. 2006). In dieser Arbeit standen die hoch konservierten CD4i-Epitope von gp120, welche an die HIV Corezeptoren binden, als Target für die HIV-Inhibition im Mittelpunkt. Verschiedene Peptidliganden für diese Epitope, wie die zweite extrazelluläre Schleife und der N-Terminus des CCR5-Rezeptors, die sulfatierte CDR3-Domäne des E51-Antikörpers, sowie durch Phage Display gezielt selektionierte Peptide wurden in den C4bp-Expressionsvektor kloniert und nach Transfektion in 293T-Zellen als lösliche Multimere vom Überstand aufgereinigt und funktionell analysiert. Die Multimere waren sowohl in Protein-Protein-Interaktionsstudien als auch bei in vitro HIV-1 Neutralisationsversuchen funktionell aktiv. In den meisten Hemmversuchen war die HIV-1 Inhibition multimerer Peptide mindestens vergleichbar mit dem Fusionsinhibitor T20. Insbesondere im Hinblick auf eine in vivo Applikation ist zudem die verlängerte Halbwertszeit der Multimere im Plasma von Vorteil, da dadurch möglicherweise die Anzahl der Injektionen verringert werden könnte.
Stressorinduzierte ökotoxikologische Effekte und Genexpressionsveränderungen bei Chironomus riparius
(2008)
Die Effekte von Stressoren auf Chironomus riparius wurden im Lebenszyklustest und auf genomischer Ebene mit dem Ziel untersucht, ein auf einem DNA-Mikroarray („ChiroChip“) basierendes Screeningverfahren zu entwickeln. Die empfindlichsten Endpunkte der Lebenszyklustests waren die Mortalität, der Anteil fruchtbarer Eigelege, der mittlere Schlupfzeitpunkt der Weibchen sowie das Gewicht der Männchen. Temperaturveränderungen um ± 6°C gegenüber einer normalen Hälterungstemperatur von 20°C führten in allen Endpunkten zu hochsignifikanten Effekten. Eine LC10 konnte nur für die Salinität berechnet werden (0,66‰, KI: 0,26 − 1,68‰). Aufgrund der nicht-linearen Konzentrations-Wirkungs-Beziehungen konnte nur für den mittleren Schlupfzeitpunkt der Weibchen nach einer Exposition gegenüber Cadmium eine EC50 (0,53 mg/kg, KI: 0,29 − 0,97 mg/kg) bestimmt werden. In den Versuchen mit Methyltestosteron, Ethinylöstradiol, Carbamazepin, Fluoxetin, Blei und Tributylzinn (mit denen auch molekularbiologische Untersuchungen durchgeführt wurden) waren die empfindlichsten Endpunkte die Mortalität, der Anteil fruchtbarer Eigelege, der mittlere Schlupfzeitpunkt der Weibchen sowie die Populationswachstumsrate. Carbamazepin (CBZ) wirkte schlupfverzögernd bei den Weibchen. 10 mg CBZ/kg führte zu einer höheren Mortalität, weniger Eigelegen, die vermehrt unfruchtbar waren, sowie zu einer geringeren Populationswachstumsrate. Fluoxetin (FX) wirkte bei beiden Geschlechtern schlupfverzögernd. 0,9 mg FX/kg führte zu einer erhöhten Mortalität, weniger und vermehrt unfruchtbaren Eigelegen und einer geringeren Populationswachstumsrate. In der höchsten Konzentration (5,9 mg/kg) waren die Weibchen leichter als die Kontrolltiere. Tributylzinn (in µg Sn/kg angegeben) bewirkte eine höhere Mortalität und geringere Populationswachstumsrate bei 100 µg Sn/kg und führte zu einer Verzögerung im Schlupfverlauf bei den Weibchen. Bei 160 µg Sn/kg gab es weniger Eigelege, die vermehrt unfruchtbar waren. Die Männchen, die gegenüber Konzentrationen von 120 und 160 µg Sn/kg exponiert wurden, waren leichter als die Kontrolle. Expositionen gegenüber Blei (Pb) in Konzentrationen von 0,65 − 65 mg/kg führten bei 6,5 mg Pb/kg zu einer erhöhten Mortalität und zu mehr unfruchtbaren Gelegen. Bei 0,65 mg Pb/kg waren die Männchen leichter und bei 6,5 mg Pb/kg schwerer. Die Anzahl der fruchtbaren Gelege pro Weibchen war bei 3,25 und 6,5 mg Pb/kg geringer als in der Kontrolle. Die gegenüber 17alpha-Methyltestosteron (MET) exponierten Mücken hatten geringere Mortalitäten als in der Kontrolle und zeigten einen verfrühten Schlupf beider Geschlechter. Ab 27 µg MET/kg gab es weniger unfruchtbare Gelege, leichtere Männchen sowie erhöhte Populationswachstumsraten. 17alpha-Ethinylöstradiol (EE2) führte zu einem verfrühten Schlupf bei beiden Geschlechtern sowie zu erhöhten Populationswachstumsraten. Bei 9 µg EE2/kg gab es weniger unfruchtbare Gelege. Die Exposition von Chironomus-Larven gegenüber Methyltestosteron, Ethinylöstradiol, Fluoxetin, Carbamazepin, Tributylzinn und Blei führte zur differenziellen Expression von neun (Methyltestosteron) bis 49 (Carbamazepin) Genen. Bei der Untersuchung der exprimierten Proteine fällt auf, dass kaum bekannte Stressproteine (z.B. Glutathion-S-Transferase oder Cytochrom P450) differentiell reguliert wurden. Bei der Exposition wurden verschiedene Prozesse durch eine veränderte Genexpression beeinflusst. Eine Exposition gegenüber Methyltestosteron führte zu einer Beeinträchtigung von drei identifizierten biologischen Prozessen, während bei den anderen Substanzen sieben bis acht Prozesse beeinflusst waren. Die am häufigsten beeinflussten Prozesse waren der Protein- und der Energiemetabolismus. Der Sauerstofftransport ist ein Prozess, der bei allen Substanzen beeinflusst wurde, jedoch mit unterschiedlichen Anteilen. Bei einer Exposition gegenüber Methyltestosteron war der Anteil des Sauerstofftransports an den beteiligten Prozessen mit 84,6% am größten und mit 10,5% bei Fluoxetin am geringsten. Die veränderte Genexpression der Globine kann möglicherweise aufgrund der schadstoffspezifischen Veränderungen als Biomarker für das Monitoring von Freilandgewässern angewendet werden. Da Tubulin und Aktin häufig nach einer Exposition gegenüber Stressoren differenziell exprimiert wird (bei Tributylzinn und CBZ in der vorliegenden Arbeit und bei Antidepressiva und Östrogenen in anderen Studien) wären die beiden Proteine möglicherweise ebenfalls als Biomarker für Chemikalienstress geeignet. Vor der Verwendung des ChiroChips als Screeninginstrument für die Chemikalienuntersuchung und das Biomonitoring müssen noch Untersuchungen zur konzentrationsabhängigen Genexpression und zur Expression in unbehandelten Larven und weiteren Lebensstadien erfolgen. Des Weiteren müssen die vorliegenden Daten verifiziert und die Funktion der differentiell regulierten Gene vertieft untersucht werden.
In dieser Arbeit wurden potentielle Mitglieder des Proteinnetzwerks um Ataxin-2 untersucht, um Rückschlüsse auf die bisher unbekannte Funktion von Ataxin-2 machen zu können. Ataxin-2 ist das Krankheitsprotein der Spinozerebellären Ataxie Typ 2, einer Polyglutaminerkrankung, bei der die Expansion eines Polyglutamintraktes zur Degeneration von Purkinje-Neuronen führt. Da die Funktion von Ataxin-2 bisher nicht ermittelt werden konnte, sollte die Charakterisierung seiner Protein-Interaktoren es ermöglichen, Einblicke in seine Funktion zu gewinnen. Dazu wurden die drei Kandidaten „Similar to golgin-like“, TRAP und alpha-Actinin-1 untersucht, die alle drei mit Hilfe von Hefe-2-Hybrid Screens identifiziert worden waren. Im Fall von „Similar to golgin-like“, einem aus Genom und cDNA-Fragmenten hervorgesagten Protein unbewiesener Existenz, konnte eine mutationsabhängige Modulation der Bindungsstärke an Ataxin-2 im Hefe-2-Hybrid-System gezeigt werden, die sich allerdings mit rekombinanten Proteinen in Koimmunpräzipitationen in Säuger-Zellen nicht reproduzieren ließ. Beide Proteine kolokalisierten am ER, unabhängig von der Länge des pathogenen Polyglutamintraktes-2 in Ataxin. Gegen ein SIM-Peptid hergestellte Antikörper zeigten eine exklusive Expression im menschlichen Gehirn und wurden erfolgreich zum Nachweis eines endogenen Komplexes aus Ataxin-2 und SIM-IR im krankheitsrelevanten Gewebe eingesetzt. Allerdings war es nicht möglich, mittels 5’-RACE und 2D-Gel Massenspektrometrie die potentiellen Isoformen von SIM näher zu charakterisieren. Zur funktionellen Analyse von SIM wurden intrazelluläre Transportvorgänge am Golgi-Apparat untersucht, aber ein Einfluss von SIM / Ataxin-2 ließ sich nicht belegen. Im Fall des Interaktions-Kandidaten TRAP wurden Antikörper hergestellt und mit einem bereits publizierten polyklonalen Antikörper, der TRAP in rattus norvegicus erkennt, verglichen. Die Expressionsmuster zeigten eine identische Expression im Hirn und der Testis. Eine Kolokalisations-Studie wies sowohl TRAP als auch Ataxin-2 am ER nach. Allerdings erwiesen sich alle verwendeten Antikörper als ungeeignet für Immunpräzipitationen, so dass die physiologische Existenz des endogenen TRAP-Ataxin-2 Komplexes nicht bewiesen werden kann. Im Fall des Interaktor-Kandidaten alpha-Actinin-1 ließ sich die Interaktion mit Ataxin-2 sowohl für die endogenen Proteine in der zytosolischen Fraktion von Mausgehirnen als auch für die rekombinanten Proteine in Säuger-Zellen belegen. Beide Proteine konnten im Zytosol und zu kleineren Anteilen an der Plasmamembran kolokalisiert werden. Als verantwortliche Subdomänen im Fall von Ataxin-2 wurde der N-terminale Bereich des Proteins in der Nähe der pathogenen Expansion, im Fall von alpha-Actinin-1 die Aktin-bindende Domäne durch GST-pulldown Analysen identifiziert. Darauf aufbauend wurde in Patienten-Fibroblasten das Aktinzytoskelett und die Dynamik von alpha-Actinin-1 in Anwesenheit der Ataxin-2-Polyglutamin-Expansion untersucht, wobei allerdings kein Unterschied zu erkennen war. Anschließend an die Analyse des Zytoskeletts wurde ein möglicher Einfluss von Ataxin-2 und seiner Polyglutamin-Expansion auf die EGF-Rezeptorinternalisierung studiert, da eine Rolle von Ataxin-2 auf die Endozytose in parallelen Analysen der Arbeitsgruppe wahrscheinlich wurde. Hierzu wurden Säuger-Zellen mit alpha-Actinin-1 transfiziert und die Internalisierung mikroskopisch und mittels Analyse der ERK1/2 Aktivierung verfolgt. Ergänzt wurden die Experimente durch Analysen zur ERK1/2 Aktivierung in Patienten- und Kontroll-Fibroblasten. Entgegen den Erwartungen hatte die Überexpression von alpha-Actinin-1 keinen Einfluss auf die Internalisierung, und bei keinem der Ansätze zeigte sich eine signifikante Veränderung der ERK1/2 Aktivierung. Auch Transkriptombefunde aus SCA2-KO Gewebe, nach denen einzelne Gene des Zytoskeletts oder der Rezeptor-Endozytose ihre Expression ändern, ließen sich nicht mit Konsistenz validieren. Abschließend wurden Experimente zur subzellulären Lokalisation von Ataxin-2 durchgeführt, die eine Lokalisation am ER und nicht wie bisher berichtet am Golgi-Apparat sicherten und Ergebnisse zur Assoziation mit Polyribosomen bekräftigten. Obwohl somit bei allen drei Proteininteraktor-Kandidaten glaubwürdige Befunde für eine Ataxin-2 Bindung sprechen, ist derzeit eine funktionelle Analyse der Assoziationen nicht möglich und eine klare Definition der physiologischen Rolle von Ataxin-2 lässt sich aus diesen Daten nicht ableiten, wenn auch die prominente Lokalisation von Ataxin-2 am rauen endoplasmatischen Retikulum mit einem Einfluss von Ataxin-2 auf die ribosomale Translation und die Sekretion in Cisternen kompatibel ist.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden ausgewählte 5’- und 3’-untranslatierte Regionen (UTRs) von mRNAs aus H. volcanii bestimmt. Dieses Datenset wurde verwendet um (1) haloarchaeale UTRs zu charakterisieren, (2) Konsensuselemente für die Transkrikptionsinitiation und -termination zu verifizieren und (3) den Einfluss haloarchaealer UTRs auf die Initiation und Regulation der Translation zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass alle untersuchten Transkripte nichtprozessierte 3’-UTRs mit einer durchschnittlichen Länge von 45 Nukleotiden besitzen. Darüber hinaus konnte ein putatives Transkriptionsterminationssignal bestehend aus einem pentaU-Motiv mit vorausgehender Haarnadelstruktur identifiziert werden. Die Analysen der Regionen stromaufwärts der experimentell bestimmten Transkriptionsstarts führten zur Identifizierung dreier konservierter Promotor Elemente: Der TATA-Box, dem BRE-Element und einem neuen Element an Position -10/-11. Überraschenderweise bestand die TATA-Box nur aus vier konservierten Nukleotiden. Die Untersuchung der UTRs ergab, dass die größte Anteil der haloarchaealen Transkripte keine 5’-UTR besitzt. Falls eine 5’-UTR vorhanden ist, besitzen unerwarteterweise nur 15% der 5’-UTRs aus H. volcanii eine Shine-Dalgarno-Sequenz (SD-Sequenz). Es konnte jedoch gezeigt werden, dass verschiedene native und artifizielle 5’-UTRs ohne SD-Sequenz sehr effizient in vivo translatiert werden. Außerdem hat die Sekundärstruktur der 5’-UTR und die Position struktureller Elemente offenbar einen entscheidenden Einfluss auf die Translatierbarkeit von Transkripten. Die Insertion von Strukturelementen nahe des Startkodons führte zu einer vollkommenen Repression der Translation, während die proximale Insertion des Motivs an das 5’-Ende der 5’-UTR keinen Einfluss auf die Translationsseffizienz hatte. Zusammenfassend kann sowohl der eukaryotische Scanning-Mechanismus als auch die bakterielle Initiation der Translation über die SD-Sequenz für haloarchaeale Transkripte mit 5’-UTR ohne SD-Sequenz ausgeschlossen werden. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen bilden die Grundlage für weitere Untersuchungen zur Identifizierung eines entsprechenden dritten Mechanismus zur Initiation der Translation in H. volcanii. Eine aktuelle Studie zur globalen Analyse der Translationsregulation zeigte, dass der Anteil translational regulierter Gene in H. volcanii genauso hoch ist wie bei Eukaryoten (Lange et al., 2007). Um die Rolle haloarchaealer UTRs bei der Regulation der Translation zu charakterisieren, wurden die UTRs zweier ausgewählter translationsregulierter Gene untersucht. Es stellte sich heraus, dass nur die Anwesenheit beider UTRs, 5’- und 3’-UTR, zu einer Wachstumsphasen-abhängigen Regulation der Translation führt. Dabei hat die 3’-UTR allein keinen Einfluss auf die Translationseffizienz, während die 5’-UTR die Translationseffizienz in beiden Wachstumsphasen reduziert. Es zeigte sich außerdem, dass die 3’-UTR für die „Richtung“ der Regulation auf Translationsebene verantwortlich ist und putative Strukturelemente möglicherweise in den Regulationsmechanismus involviert sind. Zusammengefasst ergibt sich folgendes Modell der Translationsregulation in H. volcanii: Strukturierte 5’-UTRs führen zu einer Herabsetzung der konstitutiven Translationseffizienz. Dies kann differentiell durch regulatorische Faktoren kompensiert werden, welche spezifische Elemente der 3’-UTR binden. Sowohl natürliche als auch artifizielle Aptamere und allosterische Ribozyme stellen effektive Werkzeuge zur exogen kontrollierten Genexpression dar. Daher wurde die Anwendbarkeit eines Tetracyclin-induzierbaren Aptamers und eines konstitutiven Hammerhead-Ribozyms in H. volcanii untersucht. Es stellte sich allerdings heraus, dass das Aptamer bereits ohne Tetracyclin starke inhibitorische Sekundärstrukturen ausbildet. Als Alternative wurden Reportergenfusionen mit einem selbstspaltenden Hammerhead-Ribozym konstruiert. Die selbstspaltende Aktivität des Hammerhead-Ribozyms in H. volcanii konnte erfolgreich in vivo demonstriert werden, was die Grundlage zur Entwicklung konditionaler Expressionssysteme basierend auf dem Hammerhead-Ribozym in H. volcanii bildet.
Das Steroid-Hormon 17ß-Estradiol ist maßgeblich an der Entstehung und Entwicklung von Brustkrebs beteiligt. Die intrazelluläre Verfügbarkeit des aktiven Estrogens, 17ß-Estradiol, wird durch die 17ßHydroxysteroiddehydrogenase (17ßHSDl) reguliert, die die NADPH-abhängige Reduktion von Estron zu Estradiol katalysiert. Damit stellt die 17ßHSD1 einen interessanten Ansatzpunkt für die Entwicklung neuer Inhibitoren im Hinblick auf potente Wirkstoffe gegen Brustkrebs dar. Die 17ß-Hydroxysteroiddehydrogenase 2 bevorzugt hingegen die oxidative Aktivität und wandelt die biologisch aktiven Hydroxysteroide wie Estradiol in ihre inaktiven Ketoformen um. Ein möglicher Inhibitor der 17ß-HSD1 sollte demnach die Funktion der 17ß-HSD2 nicht beeinträchtigen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Strategien und Methoden entwickelt, die 17ßHSD1 durch heterologe Expression erstmals in E. coli darzustellen. Durch NMR-Spektroskopie in Kombination mit Docking konnten detaillierte Aussagen über die Bindungsepitope der untersuchten Liganden gemacht werden. Diese Informationen sind für eine gerichtete Optimierung von Leitstrukturen von großer Bedeutung.
mRNA-Abbau ist ein essentieller Prozess der Genexpression, der den Zellen ermöglicht, die Qualität und die Quantität der mRNA zu kontrollieren. Besonders unter Stressbedingungen könnte der mRNA-Abbau eine bedeutende Rolle neben der Speicherung von mRNAs sowie der Regulation der Proteinhomöostase zum Schutz vor schädigenden Einflüssen spielen. Studien mit Hefen und Säugerzellen zeigten, dass dem 5'-3'mRNA-Abbau ein wichtige Rolle sowohl unter normalen Bedingungen als auch unter Stressbedingungen zukommt und dieser in zytoplasmatischen Processing bodies (P-bodies) stattfindet. Im Rahmen dieser Arbeit sollten Erkenntnisse über den 5'-3'mRNA-Abbau erhalten werden. Im Vordergrund stand die Frage nach der Existenz von P-bodies in Arabidopsis thaliana und die Identifikation und Charakterisierung deren Komponenten. Weiterhin sollten Erkenntnisse über die Rolle der P-bodies unter Stressbedingungen gewonnen werden. Dabei sollten besonders Informationen über die Beziehungen zwischen den P-bodies und RNA Stressgranula (mRNA Speicherkompartimente) und Hitzestressgranula (Regulation der Proteinhomöostase) erhalten werden. Das komplette sequenzierte Genom von Arabidopsis thaliana eignete sich zur Identifikation von mRNA-Abbauproteine kodierender Gene. Unter Verwendung von Aminosäuresequenzen bereits bekannter mRNA-Abbauproteine aus Hefe und Säugerzellen konnten Homologe für die Decappingproteine Dcp1 und Dcp2 sowie für die Proteine LSm1,2,5,8 als Untereinheiten des LSm1-7 Komplexes, welcher an der Regulation der Decappingreaktion beteiligt ist, identifiziert werden. Über Hefe-Zwei-Hybrid Analysen konnten anschließend Protein-Protein-Interaktionen zwischen den untersuchten Proteinen identifiziert werden. Weiterhin konnte unter Einsatz der BIFC-Analyse gezeigt werden, dass die Interaktionen zwischen den untersuchten Proteinen hauptsächlich in zytoplasmatischen Strukturen stattfanden. Aufbauend auf diesen Befunden wurde ein Antikörper gegen Dcp1 als Marker für die zytoplasmatischen Strukturen erstellt. Dieser ermöglichte erstmals die Detektion der endogenen Strukturen in Arabidopsis thaliana. Die weitere Charakterisierung über Immunofluoreszenzanalysen zeigten, dass diese P-bodies sind. Wie die P-bodies anderer Organismen sind sie hochdynamisch und benötigen untranslatierte mRNA für die Assemblierung. Die Größe und Anzahl der P-bodies hängt dabei vom Verhältniss des Zuflusses von mRNA und der mRNA-Abbaurate ab. Weiterhin konnte beobachtet werden, das die P-bodies besonders groß unter Stressbedingungen sind und deuten eine wichtige Funktion des mRNA-Abbaus unter Stress an. Dies führte zu der Frage nach der Beziehung der P-bodies zu RNA Stressgranula, die der Speicherung von mRNA unter Stressbedingungen dienen, sowie zu Hitzestressgranula, die an der Aufrechterhaltung der Proteinhomöostase beteiligt sind. Durch Kolokalisationsanalysen mit Markern der RNA Stressgranula, der Hitzestressgranula und der P-bodies konnte erstmals gezeigt werden, dass es sich um voneinander unabhängige Mikrokompartimente handelt, und dass unter Stressbedingungen die zellulären Prozesse mRNA-Abbau, mRNA-Speicherung und Aufrechterhaltung der Proteinhomöostase auf einzelne Mikrkompartimente beschränkt sind. Allerdings konnte zwischen P-bodies und RNA Stressgranula häufig eine räumliche Nähe beobachtet werden. Dies deutet auf einen Austausch von Komponenten zwischen diesen Strukturen hin. Zusammen zeigen die erhaltenen Ergebnisse, dass die identifizierten Proteine Komponenten des 5'-3'mRNA-Abbaus darstellen, und dass der 5'-3'mRNA-Abbau in Pflanzen auch in P-bodies stattfindet. Die Identifizierung und Charakterisierung der pflanzlichen P-bodies bildet eine Grundlage für zukünftige Untersuchungen. Vor allem die massive Bildung von P-bodies unter Stressbedingungen und die Interaktion der P-bodies mit RNA Stressgranula zeigen neue Aspekte der pflanzlichen Hitzestressantwort auf.
Weiterentwicklung und Evaluation eines drei-dimensionalen Hautmodelles zur pharmakologischen Testung
(2008)
Der Typ I Interferonrezeptor, der aus den Transmembranproteinen ifnar1 und ifnar2 besteht, nimmt eine wichtige Rolle bei der angeborenen und erworbenen Immunantwort ein. Durch Bindung von Typ I Interferonen werden antivirale, antiproliferative und immunmodulatorische Aktivitäten in der Zelle induziert. Die Wirkung der Interferone wird bereits bei der Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten eingesetzt. Es ist bislang nicht bekannt, wie die verschiedenen Typ I Interferone nach Bindung an einen gemeinsamen Rezeptor, unterschiedliche Zellantworten induzieren. So unterscheiden die Typ I Interferone sich nicht hinsichtlich ihrer Bindungsstelle oder der Stöchiometrie der Bindung an ifnar1 bzw. ifnar2. Sie weisen jedoch unterschiedliche Affinitäten zu den Rezeptoruntereinheiten auf, wobei ihnen eine niedrigere Affinität zu ifnar1 gemeinsam ist. Bislang konnte keine Interaktion zwischen den Rezeptoruntereinheiten nachgewiesen werden. Es wird angenommen, dass bei der Rezeptorassemblierung das Interferon zunächst an ifnar2 bindet und anschließend ifnar1 rekrutiert. Es wird postuliert, dass die unterschiedlichen Zellantworten für verschiedene Typ I Interferone auf Unterschieden in der Stabilität der ternären Komplexe beruhen könnten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden daher die Struktur und Dynamik des Interferonrezeptors in vitro für die Typ I Interferone IFNa2 und IFNb charakterisiert. Die Struktur des ternären Komplexes aus den extrazellulären Domänen von ifnar1 und ifnar2 mit IFNa2 wurde mittels Elektronenmikroskopie untersucht. Über Einzelpartikelanalyse aufgereinigter Komplexe von IFN mit den extrazellulären Domänen von ifnar1 (ifnar1-EC) und ifnar2 (ifnar2-EC) konnte ein Strukturmodell des ternären Komplexes erstellt werden. Dieses zeigte eine Verschiebung der membranproximalen Domänen von ifnar1-EC und ifnar2-EC wie sie bereits für den Rezeptor für Erythropoietin und den Wachstumsfaktor beobachtet wurden, welche zu den Typ I Zytokinrezeptoren gehören. Die Struktur des ternären Komplexes ermöglicht als erste Struktur eines Typ II Zytokinrezeptors einen Einblick in die Architektur des Komplexes und mögliche Aktivierungsmechanismen. Die Strukturen der Komplexe für die verschiedenen Typ I Interferone IFNa2 und IFNb wiesen keine fundamentalen Unterschiede auf, was auf einen gemeinsamen Aktivierungsmechanismus hinweist. Temperatur-abhängige Messungen von Bindungskinetik und –affinität ergaben sehr unterschiedliche Energiehyperflächen für die Ligandenbindung an ifnar1- und ifnar2-EC, und wiesen auf einen mehrstufigen Prozess und mögliche Konformationsänderungen bei der Bindung an ifnar1-EC hin. Zur Analyse der Dynamik von ifnar1-EC wurden daher verschiedene fluoreszenzbasierte Assays etabliert. Eine besondere Herausforderung bestand darin, das Protein ortsspezifisch und stöchiometrisch mit zwei verschiedenen Fluorophoren zu koppeln. Ifnar1-EC wurde an verschiedenen Stellen kovalent mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Es wurde gezeigt, dass nach Bindung eines geeigneten tris-NTA-Fluorophor-Konjugats an den C-terminalen His-Tag die Fluoreszenz abstandsabhägig durch Förster-Resonanz-Energie-Transfer gelöscht wurde. Für ifnar1-EC wurde eine ligandeninduzierte Abstandsänderung detektiert. Die detaillierte Analyse ergab nach Bindung von IFNa2 eine Abstandszunahme von 13 A vom N- zum C-Terminus. Durch die Interferonbindung nimmt demnach ifnar1-EC eine gestrecktere Konformation ein. Ähnliche Ergebnisse wurden auch in Anwesenheit von ifnar2-EC und für IFNb erhalten. Die Einzelmolekülanalysen mittels Fluoreszenz Korrelationsspektroskopie (FCS) zeigten sowohl einen Verlust der Flexibilität von ifnar1-EC nach Ligandenbindung als auch ein ligandeninduziertes Rearangement der Ig-ähnlichen Domänen. Die Änderung der Flexibilität wurde durch Messungen der Fluoreszenzlebensdauer bestätigt. Untersuchungen der Kinetik der Ligand-induzierten Konformationsänderung mittels Stopped-Flow Messungen bestätigten eine mehrstufige Umorientierung der Ig-ähnlichen Domänen nach Ligandenbindung. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass sich nach Ligandenbindung die Zugänglichkeit des Tryptophans in der membranproximalen Domäne von ifnar1-EC ändert. Da die membranproximale Domäne nicht bei der Ligandenbindung beteiligt ist, deutet dieser Effekt auf eine Propagation der Ligand-induzierten Konformationsänderung in diese Domäne hin. Das Tryptophan könnte mit der Membran interagieren, was auf eine wichtige Rolle der membranproximalen Domäne für die korrekte Orientierung von ifnar1 in der Membran hindeut. Die Stopped-Flow Analyse zeigte, dass es sich hierbei um einen einstufigen Prozess handelt, der mit der Interferonbindung korreliert. Die Ergebnisse wiesen insgesamt auf eine Ligand-induzierte Flexibilitätsänderung und Umorientierung der Ig-ähnlichen Domänen bei ifnar1-EC hin. Vermutlich wird nach Ligandenbindung das Signal in die membranproximale Domäne von ifnar1-EC propagiert. Die Strukturen der ternären Komplexe mit den verschiedenen Typ I Interferonen wiesen keine fundamentalen Unterschiede auf. Auch die Ergebnisse der fluoreszenzbasierten Assays zeigten keine Unterschiede für IFNa2 und IFNb, was die Hypothese stützt, dass die differentielle Aktivität der Interferone nicht auf grundsätzlichen Unterschieden in der Architektur des ternären Komplexes beruht, sondern in der unterschiedlichen Dynamik der Komplexe codiert sein könnte.
Reziproke chromosomale Translokationen sind häufig mit Leukämien und Lymphomen assoziiert und gelten in vielen Fällen als Ursache der Erkrankung. Die reziproke Translokation t(4;11) findet man hauptsächlich bei Kleinkindern, die an einer akuten lymphatischen Leukämie erkrankt sind, aber auch bei älteren Patienten mit einer Sekundärleukämie. Die leukämischen Blasten dieser Patienten sind meist gegen konventionelle Therapiekonzepte resistent, was zu einer ungewöhnlich schlechten Prognose führt. Die Chromosomenbande 11q23 ist an einer Vielzahl chromosomaler Translokationen beteiligt. Die dadurch erzeugten reziproken MLL-Fusiongene sind alle mit der Entstehung einer Hochrisikoleukämie korreliert. Für einige der dabei entstehenden Fusionsproteine konnte nach retroviraler Transduktion in hämatopoietische Vorläuferzellen gezeigt werden, dass sie onkogenes Potential besitzen und eine myeloische Leukämie in transgenen oder transienten Mausmodellen initiieren können. Für die Produkte einer Translokation t(4;11) konnte dies bislang nicht erfolgreich untersucht werden. Bei der Translokation t(4;11) werden die beiden Partnergene MLL und AF4 so miteinander verknüpft, dass auf den neu gebildeten Derivatchromosomen zwei Fusionsgene (MLL•AF4 und AF4•MLL) mit einem intakten Leserahmen entstehen. Da man in den leukämischen Blasten im Regelfall beide Fusionstranskripte findet, nehmen wir an, dass beide Genprodukte zur Fehlregulation und Entartung der Zelle beitragen. Um den potentiell onkogenen Wirkmechanismus der t(4;11) Translokation zu untersuchen, wurde ein induzierbares Expressions-System in murinen embryonalen Fibroblasten (MEF) etabliert. Anhand dieses Zellsystems gelang es das potententielle onkogene Potential der Fusionsproteine MLL•AF4 und AF4•MLL, bzw.des Wildtyp AF4 Proteins in Focus Formation Assays sichtbar zu machen. Dabei konnte die Bildung zellulärer Foci eindrucksvoll für das Wildtyp AF4 Protein und das AF4•MLL Fusionsprotein dargestellt werden. Das MLL•AF4 Fusionsprotein war nicht in der Lage den Verlust der Kontaktinhibition und damit Focus-Bildung in den Zellen zu initiieren. Die anschließende Definition des AF4 Wildtyp- und AF4•MLL Fusionsproteins als Proto-/Onkoprotein, führte zu der Arbeitshypothese, dass der Nterminale Bereich des AF4 Proteins (AF4•N) Wachstums-transformierendes Potential besitzt. Aufgrund der vorliegenden Daten und zur genaueren Charakterisierung des AF4 Proteins wurden anschließend Interaktions-Studien mit dem AF4•N Protein durchgeführt, wobei die beiden E3 Ubiquitin Ligasen SIAH1 und SIAH2 als Interaktionspartner des AF4•N Proteins identifiziert wurden. E3 Ubiquitin Ligasen sind wichtige Bestandteile der Ubiquitinylierungs-Maschinerie und der damit verbundenen proteasomalen Degradation. Dabei sind die SIAH Proteine, wie alle E3 Ubiquitin Ligasen, für die Spezifität der Proteasom-abhängigen Degradation verantwortlich, indem sie über ihre Substrat-Binde Domäne im C-Terminus mit den abzubauenden Targetproteinen interagieren. Die spezifische Interaktion der SIAH Proteine mit dem AF4•N Protein konnte in unabhängigen Experimenten sowohl in vitro als auch in vivo bestätigt werden. Durch den Einsatz des Proteasom-Inhibitors MG132 konnte zudem der effiziente, SIAH1-vermittelte und Proteasom-abhängige Abbau von AF4•N demonstriert werden. Mit weiterführenden Experimenten konnte auch für das Wildtyp AF4 Protein und für das AF4•MLL Fusionsprotein eine Regulation der Proteinstabilität über das SIAH1 Protein festgestellt werden. Eine SIAH1-vermittelte Degradation ist jedoch nur auf das AF4•MLL full-length Fusionsprotein beschränkt. Eine proteolytische Spaltung des AF4•MLL Fusionsproteins durch die Protease Taspase1 innerhalb des MLL Fusionsanteils führte zur Bildung eines stabilen der4•N/MLL•C Proteinkomplexes und dessen Akkumulation in den Zellen. Basierend auf diesen Ergebnissen konnte für t(4;11) Translokationen ein erster pathomolekularer Mechanismus zur Leukämie-Entstehung aufgezeigt werden. Dieser beruht im wesentlichen auf der Akkumulation des der4•N/MLL•C Proteinkomplexes, welcher sich der effizienten Kontrolle durch die E3 Ubiquitin Ligase SIAH1 entzieht. Dadurch wird der Wachstums-transformierende AF4•N Proteinanteil in die Lage versetzt sein onkogenes Potential zu vermitteln.
Die Arbeit überprüft die Zusammensetzung der F1FO-ATP-Synthase in Säugetiermitochondrien, dem Enzymkomplex, der das meiste ATP für den Energiebedarf einer Zelle liefert. Es sind zwei neue Proteine identifiziert und als ATP-Synthase assoziiert verifiziert worden, das sog. dapit protein (diabetes-associated protein in insulin-sensitive tissue; Datenbanknummer in NCBI für Rattus norvegicus, gi|19424210) bzw. 6.8 kDa mitochondrial proteolipid (Datenbanknummer in NCBI für Rattus norvegicus, gi|109478763). Bis jetzt sind beide Proteine nicht zusammen mit dem Komplex V detektiert worden, da es sich bei beiden Proteinen um sehr kleine Membranproteine (kleiner 7 kDa) handelt und sie sehr leicht in Gegenwart von Detergenzien verloren gehen. Die etablierte Strategie zur milden Aufreinigung von Komplex V, die eingesetzte gelelektrophoretische Trennung und die gewonnenen Erkenntnisse zur Identifizierung solch kleiner Proteine können sicherlich auch Lösungsansätze für andere ungelöste Problemfälle in der Proteinkomplexanalytik liefern. Da beide neuen Proteine in die Modulation des metabolischen Zellzustandes involviert sein könnten, sind die erarbeiteten Daten für weitere funktionelle und biochemische Untersuchungen der ATP-Synthase äußerst nützlich. Außerdem könnten die Ergebnisse für neurologische und klinische Studien hinsichtlich der Ursachenforschung von Funktionsstörungen in den Mitochondrien von Interesse sein, da eines der zwei neuen Proteine früher schon mit Diabetes in Zusammenhang gebracht worden ist (dapit, diabetesassociated protein in insulin-sensitive tissue). Für ein bakterielles Multihäm c-Typ Cytochrom konnte massenspektrometrisch gezeigt werden, dass es auf eine unkonventionelle Weise Häm bindet. Durch massenspektrometrische Charakterisierung des Proteins konnte erstmals nachgewiesen werden, dass es nicht nur die Häm c-Bindemotive CX2-4CH und CXXCK, sondern auch Häm c-Bindemotive der Form CXnCH in Bakterien gibt. Diese Erkenntnis führt in der Molekularbiologie zu neuen Fragen, z. B. welche speziellen Lyasen (cytochrome c haem lyases) letztendlich für das Einfügen der Häm-Gruppe an solche neuen Motive verantwortlich sind. Auch die computerbasierte Vorhersage von c-Typ Cytochromen wird dieses Wissen wohl zukünftig in Suchstrategien umsetzen, um die neuen Häm c-Bindemotive bei der Genomanalyse von Organismen nicht zu übersehen. In dem Feld der Identifizierung und Charakterisierung von Membranproteinen im Allgemeinen konnten grundlegende Erkenntnisse zum Umgang mit alternativen Enzymen und deren Potential für einen zukünftigen Einsatz erarbeitet werden. Schwerpunktmäßig wurden die Enzyme Chymotrypsin, Elastase und Pepsin untersucht. Es konnte für alle drei Kandidaten gezeigt werden, dass sie bevorzugt an einer begrenzten Anzahl von Aminosäuren spalten. Besonders für Elastase ist diese Erkenntnis neu, da sie in der Literatur bisher als unspezifisches Enzym wie Proteinase K geführt wurde. Auch wenn die Spezifität der drei Enzyme nicht zu 100% wie bei Trypsin festgelegt werden kann, sondern es sich nur um eine Bevorzugung gewisser Aminosäuren handelt, sind die enzymatischen Spaltungen reproduzierbar. Selbst eine Auswertung der MS-Spektren mittels Peptide Mass Fingerprint (PMF) ist deshalb auch bei diesen weniger spezifischen Enzymen möglich. Die Intensität der MS-Signale muss aber berücksichtigt werden, was bei bisherigen PMF-Suchen jedoch nicht in der Art und Weise geschieht, wie es für diese Enzyme nötig wäre. An einigen Membranproteinen konnte letztendlich bereits beispielhaft gezeigt werden, dass der Einsatz von weniger spezifischen Enzymen für die Identifizierung des Proteins und der nachfolgenden Charakterisierung (z. B. Identifizierung von posttranslationale Modifikationen) vorteilhaft ist. Für Elastase konnte in diesem Zusammenhang auch demonstriert werden, dass sie problemlos in Lösungsmittelsystemen mit einem hohen organischen Anteil (Acetonitril, Isopropanol, Methanol) einsetzbar ist. 100% Sequenzabdeckung lassen sich aber auch bei weniger spezifischen Enzymen trotz der größeren Anzahl an Schnittmöglichkeiten nur erahnen. Zwei Hauptursachen hierfür sind wahrscheinlich die schlechte Zugänglichkeit des Enzyms zum Membranprotein bzw. die Bevorzugung bestimmter enzymatischer Fragmente in MALDI und ESI. Polyacrylamidgele mit alternativen Quervernetzern, bei denen sich die Geldichte vor dem Verdau verringern lässt, könnten die Zugänglichkeit zum Membranprotein zukünftig vielleicht positiv beeinflussen. Der Einsatz von organischen Lösungsmitteln und bestimmter Detergenzien beim Verdau verbessert ebenfalls die Zugänglichkeit zum Membranprotein. Die Zahl der Tenside, die mit der Massenspektrometrie sehr gut kompatibel sind, ist aber sehr gering, wie Untersuchungen in dieser Arbeit ebenfalls ergeben haben. Außerdem beschränkt sich die Anwendung von diesen Detergenzien ausschließlich auf MALDI. Die zu erwartenden Fortschritte bei der Identifizierung und Charakterisierung von Membranproteinen umschreibt daher besonders gut ein Aphorismus von Christian Morgenstern (deutscher Schriftsteller; 1871 – 1914): „Es gibt nur ein Neues: Die Nuance.“ Einige Nuancen sind in dieser Arbeit enthalten. In der Zukunft werden aber viele weitere solcher Nuancen das Überwinden der Hürde „Membran Proteomics“ immer realistischer werden lassen.
Anti-T-Lymphozyten-Globuline (ATG) sind Immunglobuline zur Anwendung am Menschen. Sie werden aus den Seren von Kaninchen oder Pferden gewonnen, die zuvor mit humanen Thymozyten oder einer etablierten humanen T-Zell-Linie immunisiert wurden. ATG besitzen ein sehr starkes immunsuppressives Potenzial. In der klinischen Anwendung werden sie überwiegend bei Organtransplantationen, Knochenmarktransplantationen und zur Behandlung einzelner Autoimmunerkrankungen, wie z. B. der aplastischen Anämie, eingesetzt. Wissenschaftliches Ziel der Arbeit war, einen umfangreichen Beitrag zur immunologischen Charakterisierung und Spezifizierung unterschiedlicher ATG-Präparate zu erbringen. Dies ist eine wesentliche Voraussetzung für die Entwicklung und Validierung experimenteller Methoden, sodass die bisher verwendeten Praktiken der Wirksamkeitsprüfung von ATG entsprechend dem Stand der Wissenschaft abgelöst und der Tierversuch (Affenhaut-Transplantationstest; Balner H et al., 1968) ersetzt werden können. Darüber hinaus wurde in diesem Zusammenhang der Entwurf einer Arzneibuch-Monografie für ATG vorgelegt. Der immunsuppressive Wirkmechanismus von ATG ist selbst nach 40 Jahren klinischer Erfahrung nicht eindeutig geklärt. Ihre Wirksamkeit vermitteln sie über ihre spezifische Bindung an Lymphozyten, woraus sich modellhaft vier Effekte unterscheiden lassen: Die Reihe der Fc-abhängigen zytotoxischen Mechanismen, eine von ATG ausgelöste Aktivierung, eine über Todesrezeptoren (z.B. Fas/Apo-1) von ATG direkt induzierte Apoptose sowie die Maskierung von Rezeptoren. Die zytotoxische Wirkung von ATG und die Induktion des programmierten Zelltodes (Apoptose) wurde am Durchflusszytometer (FACS) nach Färbung der toten Zellen bzw. durch den Nachweis von DNA-Fragmentierung analysiert. Der Einfluss von ATG auf die Lymphozyten-Aktivierung in vitro sowie auf die gemischte Lymphozyten-Reaktion (mixed lymphocyte reaction, MLR) wurde durch Messung der Lymphozyten-Proliferation anhand des Einbaus von radioaktiv markiertem Thymidin bestimmt. Biochemisch wurden die in ATG enthaltenen anti-Lymphozyten-Antikörper durch den sog. Kinase-Assay charakterisiert. In einer nicht radioaktiven Methode wurden Zelloberflächenmoleküle zunächst biotinyliert. Nach Lyse der Zellen wurden die Proteine mit ATG präzipitiert, gelelektrophoretisch aufgetrennt sowie mittels Streptavidin und Chemilumineszenz im Westernblot nachgewiesen. Für das Verständnis der klinischen Wirksamkeit von ATG ist die Aufklärung der molekularen Mechanismen der komplement-unabhängigen, zytotoxischen Wirkung von erheblicher Bedeutung, da die enorme zytolytische, aber auch die breite immunsuppressive Wirkung von ATG nicht allein durch die Fc-abhängige Zytotoxizität erklärt werden kann. ATG können bei bestimmten Zielzellen Fas-abhängige Apoptose auslösen; darüber hinaus sind ATG aber auch in der Lage, einen komplement-unabhängigen Zelltod in Fas-resistenten Zell-Linien und T-Zell-Klonen, die resistent gegenüber aktivierungsinduziertem Zelltod (AICD) sind, auszulösen. In Kompetitionsversuchen konnte gezeigt werden, dass ATG entsprechende Antikörper-Spezifitäten gegen das Molekül CD95 (Fas/Apo-1) enthalten. Ferner konnten wir nachweisen, dass die durch ATG initiierte Fas-abhängige Apoptose und/oder der AICD durch Fas-neutralisierende Antikörper inhibiert werden können, was auch von anderen Arbeitsgruppen gezeigt wurde (Genestier L et al., 1998). Die DNA-Fragmentierung, als Nachweis von Apoptose, lässt sich nach der ATG-Inkubation von Fas-sensitiven Zielzellen durch Inhibitoren der Caspase-1 (Z-VAD-FMK) komplett sowie durch Inhibitoren der Caspase-3 (Ac-DMQD-CHO) und -6 (Ac-VEID-CHO) teilweise inhibieren. Die zytotoxische Wirkung von ATG lässt sich jedoch nicht in gleichem Maße durch Inhibitoren der Caspase-1 reduzieren, wie bei einem Apoptose induzierenden mAk gegen Fas. Es wird deutlich, dass ATG eine breit gefächerte zytotoxische Wirkung auf verschiedene Zellpopulationen ausüben, die alle mehr oder weniger eine Rolle in der klinischen Wirksamkeit von ATG spielen können. ATG sind in der Lage, periphere blutmononukleäre Zellen (PBMC) zu aktivieren, wobei der Proliferationsindex in etwa dem eines Standardmitogens, wie z. B. Phytohämagglutinin (PHA), entspricht. Isolierte T-Lymphozyten werden ebenfalls aktiviert, zeigen jedoch eine geringere Proliferationsrate. In PHA-Blasten lassen sich schwache Veränderungen im Muster der Protein-Tyrosin-Phosphorylierung erkennen, wobei eine gewisse Ähnlichkeit im Bandenmuster sowie in der Intensität zwischen der Stimulation mit ATG und dem anti-CD2 mAk zu erkennen ist. Im Unterschied zu publizierten Studien konnte in dieser Arbeit kein spezifisch hemmender Effekt der ATG auf die MLR nachgewiesen werden. Aus den Untersuchungen zur Charakterisierung der ATG hat sich der komplement-abhängige Zytotoxizitätstest, gemessen am Durchflusszytometer, als die Methode herausgestellt, die, bezogen auf den Wirkmechanismus der ATG und im Hinblick auf eine Routineanwendung in der Chargenprüfung, am besten geeignet ist. Eine Evaluierung der Methode wurde im Rahmen eines Ringversuches, an dem sich sieben verschiedene Labore beteiligten, durchgeführt. Die mittlerweile gültige Arzneibuch-Monografie für ATG (Ph. Eur.: 1928) sieht diese in vitro Methode zur Wirksamkeitsprüfung von ATG vor, womit die Voraussetzungen zur Abschaffung des Affenhaut-Transplantationstests geschaffen wurden. Neben einer zellulären Charakterisierung der ATG konnte gezeigt werden, dass sich insbesondere biochemische Methoden, wie z. B. der Kinase-assay oder die Biotinylierung von Zelloberflächenmolekülen, sehr gut zur Identitätsprüfung von ATG eignen. Mit beiden Methoden ließen sich produktspezifische Bande nachweisen. Im Rahmen der Entwicklung von ATG sind diese Methoden geeignet, die Konsistenz der Chargenproduktion zu überprüfen, sodass auch hier Alternativen zum Tierversuch vorhanden sind.
Resistenz polyklonaler, reifer T-Zellen gegenüber der Transformation durch retrovirale Transduktion
(2008)
Nach den ersten Erfolgen der Gentherapie bei angeborenen Immundefekten wurden einige Fälle von Leukämie nach gammaretroviralem Gentransfer in Blutstammzellen bei Patienten mit „severe combined immunodeficiency“ (SCID-X1) veröffentlicht. Diese entfachten eine Diskussion über das Risiko der Insertionsmutagenese bei der Verwendung gammaretroviraler Vektoren. Durch eine insertionsbedingte Transaktivierung potentieller Onkogene und damit verbundenen malignen Veränderungen können gammaretroviral transduzierte Blutstammzellen Leukämien hervorrufen. Aber nicht nur Blutstammzellen werden als Zielzellen in der Gentherapie genutzt. In der Gruppe von Laer wurde in den letzten Jahren eine neue Gentherapie der HIV-1 Infektion entwickelt. Hierbei werden dem Patienten genetisch geschützte, autologe T-Lymphozyten infundiert. Die Gefahr einer Leukämie durch Insertionsmutagenese sollte im Zuge dieser Studie für reife T-Lymphozyten evaluiert werden. In einer vergleichenden Analyse wurde untersucht, ob der gammaretrovirale Gentransfer in reife T-Lymphozyten die gleiche Genotoxizität birgt wie in hämatopoetische Stammzellen. Hierzu wurden reife T-Lymphozyten und hämatopoetische Progenitoren von C57BL/6(Ly5.1)-Mäusen mit multiplen Kopien gammaretroviraler Vektoren transduziert, die für die potenten T-Zell Onkogene LMO2, TCL1, dTrkA oder das Kontrollgen GFP kodierten. Es wurden sehr hohe Transduktionseffizienzen mit bis zu 70% für reife T-Lymphozyten und bis zu 98% für hämatopoetische Progenitoren erzielt, um möglichst leukämiefördernde Bedingungen zu schaffen. Nach Transplantation in kongene Rag-1 defiziente Empfängertiere (Ly5.2) entwickelten Onkogen-modifizierte Stammzellen nach einer charakteristischen Latenzperiode Leukämien/Lymphome. Am häufigsten wurden unreife, CD8+CD4+ doppelpositive T-Vorläufer Leukämien/Lymphome beobachtet. In einigen Rezipienten führte außerdem eine Überexpression von TCL1 in hämatopoetischen Stammzellen zu der Entwicklung von reifzelligen T-Zell Leukämien/Lymphomen und B-Zell Leukämien/Lymphomen. Die Integrationsanalyse ergab oligo- bis monoklonale Tumore, wobei keine offensichtlich tumorfördernden, die gammaretroviralen Insertionen flankierenden Gene identifiziert werden konnten. Bemerkenswerterweise entwickelte keines der T-Zell transplantierten Empfängertiere ein/e Lymphom/Leukämie, obwohl auch diese Zellen mit den gleichen Vektoren modifiziert wurden und über einen sehr langen Zeitraum persistierten. Um die Kontrollmechanismen dieser Resistenz näher zu untersuchen, wurde eine für den TCR monoklonale, adulte T-Zell Population mit dTrkA transduziert. Nach einer kurzen Latenzperiode entwickelten sich reifzellige T-Zell Leukämien/Lymphome. Anscheinend existiert eine Verbindung zwischen der relativen Transformationsresistenz reifer T-Lymphozyten und dem Konkurrenzverhalten verschiedener T-Zell Klone um stimulatorische MHC-TCR Nischen. Weiterhin wurde in vitro durch gammaretroviralen Transfer von LMO2 ein immortalisierter T-Zell Klon generiert. Dieser zeigte zwar nach einer langen Beobachtungszeit einen CD8-CD4-doppelnegativen Phänotyp, aber auch einen rekombinierten TCR. In vitro überwuchs er eine unmanipulierte Kompetitorpopulation, konnte jedoch nach Transplantation kein/e T-Zell Lymphom/Leukämie induzieren. Die LM-PCR Analyse des Klons lieferte eine sehr interessante Integration zwischen den Genen für die alpha-Ketten des IL-2 und des IL-15 Rezeptors, welche dadurch konstitutiv exprimiert wurden. Dies könnte das erste Beispiel für eine insertionsbedingte Immortalisierung eines adulten T-Zell Klons sein. In der vorliegenden Arbeit konnte zum ersten Mal eindeutig gezeigt werden, dass polyklonale, reife T-Zell Populationen in vivo eine hohe Transformationsresistenz aufweisen. Durch bestimmte Bedingungen können jedoch durchaus maligne Veränderung adulter, reifer T-Lymphozyten induziert werden. Für die Sicherheitsabschätzung gammaretroviraler Gentherapie-Studien mit reifen T-Lymphozyten sind die vorgestellten Ergebnisse von großer Bedeutung und könnten darüber hinaus Aufschluss über die populationsdynamischen Kontrollmechanismen reifer T-Zell Leukämien/Lymphome geben.
Identifizierung und Charakterisierung von Liganden für Faktor VIII neutralisierende Antikörper
(2008)
Das Fehlen von funktionellem Blutgerinnungsfaktor VIII (FVIII) in Hämophilie A- (HA-) Patienten wird durch Substitution mit FVIII-Präparaten therapiert. Die wesentlichste gegenwärtige Komplikation der FVIII-Ersatz-Therapie besteht in dem Auftreten von FVIII neutralisierenden Antikörpern (Inhibitoren) gegenüber exogenem FVIII. Diese können mittels verschiedener, kostenintensiver Therapien zur Induktion einer Immuntoleranz (ITI) mit unterschiedlichem Erfolg eliminiert werden. Für Patienten mit persistierenden Inhibitoren bedeuten diese nicht nur eine drastische Verminderung der Lebensqualität sondern ein lebensbedrohliches Szenario. Eine Liganden-vermittelte Blockierung von neutralisierenden anti-FVIII Antikörpern sowie die zielgerichtete Ansteuerung des Rezeptors FVIII-spezifischer Gedächtnis-B-Zellen stellen mögliche Ansätze zur Verwirklichung antigenspezifischer ITI-Strategien für eine dauerhafte, vollständige Eliminierung von FVIII-Inhibitoren dar. Zu diesem Zweck wurden in dieser Arbeit durch Screening von phagenpräsentierten, randomisierten Peptidbibliotheken mit Inhibitor-positiven Patientenplasmen Peptidliganden selektioniert. Diese wiesen eine spezifische Bindung von anti-FVIII Antikörpern in den verwendten Plasmen auf. Durch den Einsatz entsprechender Software konnten AS-Konsensusmotive der Peptidsequenzen möglichen, konformationellen, funktionellen Inhibitorepitopen in der A2- sowie C2-Domäne von FVIII zugeordnet werden. Die von in silico-Analysen vorgegebene Domänenspezifität der anti-FVIII Antikörper wurde in Bindungsstudien mit rekombinant exprimierten FVIII-Domänen verfiziert. Die korrespondierenden, synthetischen Peptidliganden blockierten die IgG-Bindung an FVIII und regenerierten partiell dessen Aktivität im Plasma. Die Peptide stellten funktionelle Mimotope der möglichen Inhibitorepitope in der A2- und C2-Domäne dar. Da FVIII neutralisierende Antikörper zumeist Epitope in beiden Domänen erkennen, wurden die Mimotope kombiniert, was in einer noch effektiveren Blockierung von FVIII-Inhibitoren resultierte. Weiterhin wiesen Mimotopkombinationen Kreuzreaktivität mit anti-FVIII IgG in heterologen Patientenplasmen auf. Durch Fusion der Peptide an die Multimerisierungsdomäne der alpha-Kette des humanen C4-Bindeproteins konnten in Zellkultur heptamere Proteine generiert werden. Gegenüber den synthetischen Peptiden wiesen die Multimere aufgrund ihrer Multivalenz sowie der strukturellen Integrität eine deutlich verbesserte Blockierung von anti-FVIII IgG auf. Das Multimerisierungskonzept erlaubte ferner die Kombination unterschiedlicher Peptidliganden in einem Heteromultimer, was anhand der selektierten, funktionellen Mimotope für mögliche A2- und C2-Epitope getestet wurde. Weiterhin zeichneten sich die Inhibitor-spezifischen Multimere gegenüber den synthetischen Peptiden durch deutlich verlängerte Halbwerstzeiten aus. In Präparationen peripherer mononuklearer Zellen (PBMCs) von Patienten färbten synthetische Peptide sowie Fluoreszenz-markierter FVIII B-Zellsubpopulationen mit einem Gedächntis-B-Zell Phänotyp (CD19+IgG+). Gedächtnis-B-Zellen in PBMCs wurden polyklonal stimuliert. Im ELISPOT-Verfahren konnten Tetanusspezifische, jedoch keine FVIII-spezifischen Zellen, detektiert werden. Im Gegensatz zu den verwandten Kontrollen bewirkte eine Präinkubation der Zellen mit dem Peptid 12C6, welches an das toxische D-AS-Peptid (KLAKLAK)2 gekoppelt war, allerdings eine Reduktion von anti-FVIII IgG in den Überständen stimulierter Zellen.
Chlamydomonas reinhardtii ist eines der bekanntesten Modellsysteme der Forschung, um photo-, zell- und molekularbiologische Fragestellungen zu untersuchen. Die phototaktischen Reaktionen dieser einzelligen Grünalge werden durch mikrobielle Rhodopsine, sogenannte Photorezeptoren initiiert, deren Chromophor all-trans-Retinal ist. Eines dieser Rhodopsine ist Channelrhodopsin 2 (ChR2). Ein Sequenzvergleich mit anderen mikrobiellen Rhodopsinen aus Archaebakterien, wie z.B. der lichtgetriebenen Protonenpumpe Bakteriorhodopsin, zeigt eine Homologie von bis zu 20 %. Aus diesem Grund kann angenommen werden, dass die hydrophobe N-terminale Hälfte mit circa 300 von 737 Aminosäuren ebenso aus einem Siebentransmembranhelixmotiv besteht, wie dies für Rhodopsinmoleküle typisch ist. Seit der Entdeckung 2003 durch Nagel et al. ist bekannt, dass es sich bei ChR2 um einen lichtgetriebenen, kationenselektiven Ionenkanal handelt, der in dieser Form bisher nicht bekannt war. Diese biophysikalische Charakteristik konnte durch detaillierte elektrophysiologische Daten erhoben werden. Sie lieferten zudem die Erkenntnis, dass ChR2 als „Werkzeug“ in der Neurobiologie verwendet werden kann, da die lichtinduzierte Depolarisation zum Feuern von Aktionspotentialen in ChR2-exprimierenden Neuronen führt. Die vorliegende Arbeit sollte dazu beitragen, die molekularen Mechanismen von ChR2 aufzuklären, indem elektrophysiologische, spektroskopische und biochemische Daten miteinander korreliert wurden. Dazu wurde ChR2 funktionell in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris exprimiert. Ein Glykosylierungstest konnte belegen, dass Pichia pastoris in der Lage ist, die für ChR2 erforderliche N-Glykosylierung durchzuführen. Mit einer 90%igen Expression war es somit möglich, ausreichend Protein für eine Metallchelat-Affinitätschromatographie zu gewinnen. Weiterhin konnte die bestehende Funktionalität nach der Isolierung von ChR2 nachgewiesen werden. Dies erfolgte zum einen über Messungen des charakteristischen Photostroms mittels der BLM-Technik. Zum anderen konnte dies durch spektroskopische Messungen der spezifischen Absorption von ChR2 bei 480 nm bestätigt werden. Die zeitaufgelöste Laserblitzabsorptionsspektroskopie lieferte zudem Differenzspektren des isolierten ChR2, die erstmalig das Vorhandensein eines spektral verschiedenen Intermediats bei 540 nm zeigten. Zusammen mit dem Zeitverlauf aller vier korrespondierenden Intermediate und der Hinzunahme elektrophysiologischer Daten konnte somit ein linearer Photozyklus bestehend aus vier Zuständen erstellt werden (erstellt durch Dr. Christian Bamann). Die ersten drei Intermediate des Photozyklus P1-P3 werden demnach durch die rotverschobene Spezies beschrieben, mit einer Relaxationszeit von unter einer Millisekunde. Dieses rote Intermediat spiegelt die Konformationsänderung des Retinals wider und geht mit dem Öffnen des Kanals einher. Die Zustände P2 und P3 konnten beide als kationenleitende Zustände identifiziert werden. Das Schließen des Kanals wird durch den Übergang von P3 zu P4 (spektral mit dem Grundzustand gleich) vermittelt. Das Zurückkehren in den Grundzustand folgt einem langsamen Prozess im Bereich von mehreren Sekunden. Biochemische, spektroskopische und elektrophysiologische Daten haben damit erfolgreich zur weiteren Aufklärung der molekularen Funktionsweise von ChR2 beigetragen. Mit diesen Ergebnissen ist nun die Erschließung neuer Informationen über die verschiedenen Signaltransduktionswege von Membranproteinen möglich.
Optimierung Apolipoprotein-modifizierter Albumin-Nanopartikel zur Überwindung der Blut-Hirn-Schranke
(2007)
Das Gehirn höherer Säugetiere ist durch die Blut-Hirn-Schranke vor dem Eindringen toxischer und schädlicher Substanzen geschützt. Allerdings bildet diese Barriere auch ein Hindernis für die gezielte medikamentöse Therapie von Erkrankungen des zentralen Nervensystems wie zum Beispiel Alzheimer, Gehirntumore oder Parkinson. Leider sind nur wenige potentielle Arzneistoffe für die Therapie dieser Krankheiten in der Lage die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden. Somit stellt die Blut-Hirn-Schranke einen limitierenden Faktor für die Arzneimitteltherapie dar. Diese Doktorarbeit beschäftigt sich mit der Herstellung, Charakterisierung, in vitro und in vivo Testung Liganden-modifizierter Nanopartikel auf Proteinbasis zur Überwindung der Blut-Hirn-Schranke. Als Ligand wurde das Apolipoprotein E, ein Bestandteil von physiologisch vorkommenden HDL, VLDL und LDL-Partikel, verwendet, welches sich in vorangegangenen Untersuchungen als potentieller Ligand zum Transport von Nanopartikeln ins Gehirn erwiesen hat. Diese so mit Apolipoprotein modifizierten Nanopartikel wurden mit dem Modellarzneistoff Loperamid, einem nicht gehirngängigen Opioid, beladen. Diese Zubereitung wurde Mäusen injiziert und der analgetische Effekt mittels des Tail-Flick-Tests bestimmt. Um auch eine therapeutische Anwendung zu erzielen, wurden Apolipoprotein modifizierte Partikel beladen mit dem Zytostatikum Doxorubicin entwickelt und die chemotherapeutische Effizienz an Gehirntumor tragenden Ratten getestet.
Funktionelle Charakterisierung von Peptidliganden für das komplexe HIV-1-RNA-Verpackungssignal PSI
(2008)
Im Laufe der vergangenen Jahre hat die Identifizierung von Peptidleitstrukturen in der Wirkstoffentwicklung zunehmend an Bedeutung gewonnen. Die Phage Display Technologie ist eine Methode, welche zur Selektion von inhibitorischen Peptiden weit verbreitet ist. Prinzipiell eignet sich dieser Ansatz auch für die Suche nach neuen Leitstrukturen für die Therapie der HIV-Infektion, welche in hochspezifische und -regulierte Schritte im HIV-Replikationszyklus eingreifen sollen. Bei der Verpackung viraler RNA in neu entstehende Virionen handelt es sich um einen Prozess, welcher auf der gezielten Erkennung der dreidimensionalen Struktur der PSI-Region am 5'-Ende ungespleißter, viraler RNA durch die NCp7-Domäne des Gagp55-Vorläuferproteins basiert. Darüber hinaus partizipiert das NCp7-Protein noch an der Reversen Transkription der HIV-RNA sowie an der Integration proviraler DNA und spielt somit eine zentrale Rolle im HIV-1 Replikationszyklus. In vorangegangenen Arbeiten konnten wir mittels der Phage Display Technologie Peptidliganden für die HIV-1 PSI-RNA selektieren, welche die PSI-RNA-NCp7-Interaktion hemmten und in Folge dessen die Verpackung viraler RNA verhindern sollten. Die Bindung der identifizierten tryptophanreichen Peptide an die PSI-RNA konnte zwar zum Teil in vitro mit NCp7 kompetitiert werden, jedoch wiesen die Peptide eine relativ geringe Affinität für die PSI-RNA auf. Im Vordergrund der vorliegenden Arbeit stand nach Optimierung der Affinität eine umfassende funktionelle Charakterisierung der Peptide hinsichtlich ihrer antiviralen Aktivität in vitro. Zunächst gelang es mittels Spot-Synthese-Membranen die Affinität der PSI-RNA-bindenden Peptide um etwa das 30-fache zu verbessern. Der KD-Wert des optimierten HKWPWW-Peptids lag bei 1,1 µM für ein Teilelement der PSI-RNA, das allein über Verpackungsaktivitäten verfügt. Die folgende Analyse der Bindungseigenschaften des HKWPWW-Peptids an die PSI-RNA über NMR und Fluoreszenz-Spektroskopie offenbarte, dass das Peptid über die hydrophoben Aminosäuren an eine charakteristische Schleifenregion in der Sekundärstruktur der PSI-RNA bindet, ähnlich wie der natürliche Ligand NCp7. Gestützt auf diese Ergebnisse, wurde im Hauptteil des Projekts untersucht, ob das HKWPWW-Peptid in der Lage ist, die Verpackung viraler RNA in HI-Virionen zu hemmen. Hierfür erfolgte die Etablierung diverser Testsysteme, welche die intrazelluläre Expression des Peptids ermöglichten. Die Expression von HKWPWW in Fusion mit RFP in Pseudoviren-produzierenden Zellen über transiente Transfektion führte in der höchsten getesteten DNA-Konzentration (2,5 µg) zu einer 95%igen Reduktion des infektiösen Titers. Dieser inhibitorische Effekt war spezifisch für lentivirale Pseudoviren, da die Produktion gammaretroviraler Pseudoviren nicht durch die Anwesenheit des Peptids beeinflusst wurde. Mittels einer stabilen HKWPWW-exprimierenden T-Zelllinie gelang es nachzuweisen, dass das Peptid sogar in der Lage ist, replikationskompetentes HIV über einen Zeitraum von fünf Tagen zu hemmen. Die Synthese des HKWPWW-Peptids in Fusion mit einer Proteintransduktionsdomäne ermöglichte die direkte Behandlung von HIV-infizierten Zellen und führte zu einer verminderten Freisetzung infektiöser HI-Viren in die Zellkulturüberstände. Dabei lagen die IC50- und IC90-Werte des HKWPWW-Peptids nach zweimaliger Peptidzugabe bei 5, 7 bzw. 28,6 µM. Eine in der Literatur oftmals beschriebene Beobachtung ist, dass bei einer reinen Hemmung der HIV-Verpackung Viren entstehen, welche keine virale RNA enthalten. Das Phänomen war in Anwesenheit des HKWPWW-Peptids wenig ausgeprägt wie Korrelationen von p24-Antigen-ELISA und die Quantifizierung viraler RNA in Viruspartikeln zeigten. Diese Gegebenheit sowie das Wissen über die mannigfaltigen Funktionen des NCp7-Proteins im HIV-Replikationszyklus ließen vermuten, dass HKWPWW noch zusätzlich andere Schritte im HIV-Replikationszyklus hemmen könnte. Unterstützt wurde diese Annahme dadurch, dass HKWPWW Ähnlichkeiten zu der hydrophoben Plattform von NCp7 aufweist, welche essentiell für die Verpackung viraler RNA sowie die Reverse Transkription ist. Damit in Einklang steht, das neben einer Bindung an die PSI-RNA auch eine schwächere Interaktion des HKWPWW-Peptids mit den viralen TAR- und PBS-Strukturen nachgewiesen werden konnte. Die auch beobachtete Hemmung der frühen HIV-Replikationsschritte durch HKWPWW könnte somit mit einer möglichen Hemmung der Transkription viraler Gene, der Reversen Transkription oder Integration erklärt werden. Jedoch zeigte die elektronenmikroskopische Analyse, dass nicht nur weniger Viren in Anwesenheit des HKWPWW-Peptids entstehen, sondern dass diese zum Teil einen weniger kondensierten Kern aufweisen. Dies kann als ein Anhaltspunkt angesehen werden, dass HKWPWW tatsächlich auch auf der Ebene der RNA-Verpackung bzw. der viralen Partikelentstehung einen hemmenden Effekt ausübt. Somit resultiert die beobachtete antivirale Aktivität des HKWPWW-Peptids vermutlich aus kombinierten inhibitorischen Effekten auf mehreren Ebenen der HIV-Replikation.
Viele physiologische Prozesse, wie zum Beispiel der Schlaf-Wach-Rhythmus, die Nahrungsaufnahme, die Aktivität, sowie unbewusstes Verhalten unterliegen circadianen Rhythmen. Diese Rhythmen werden durch die circadiane Uhr erzeugt, deren Sitz der SCN im Hypothalamus ist. Der SCN übermittelt das circadiane Signal in viele verschiedene Gehirnregionen (Reuss 1996). Die circadianen Rhythmen werden einerseits durch Umweltreize, wie Licht oder Nahrungsverfügbarkeit, eingestellt. Diese externen Signale beeinflussen direkt den SCN oder andere hypothalamische Nuclei, wie den lateralen Hypothalamus oder den N. arcuatus. Andererseits werden die circadianen Rhythmen jedoch auch an die physiologischen Parameter des Individuums angepasst. Diese externen und internen Signale werden durch den Signalaustausch zwischen den hypothalamischen Nuclei integriert. Zur Untersuchung dieser gegenseitigen Verbindungen wurden immunzytochemische Studien an Gehirnschnitten von Maus und Ratte durchgeführt, um das Vorkommen verschiedener Neuropeptide in Zellkörpern und Fortsätzen der Neurone in den entsprechenden hypothalamischen Gebieten aufzuzeigen. Untersucht wurden Vasopressin und VIP, die im SCN selbst synthetisiert werden, sowie Orexin A und MCH, die in den Zielgebieten des SCN vorkommen. Die Verteilungen der Neuropeptide bei Ratten und Mäusen stimmten weitgehend überein. Lediglich die Vasopressin-Expression im SCN weist Abweichungen im Vergleich der beiden Spezies auf. Weiterhin gibt es unterschiedliche Verbindungen zwischen den hypothalamischen Kerngebieten: Im SCN der Ratte, jedoch nicht im SCN der Maus, innervieren Orexin A-enthaltende Fasern VIP-exprimierende Zellen, sowie MCH-positive Fortsätze Vasopressin-enthaltende Neurone. Demzufolge variiert die Signalübertragung im Hypothalamus der Maus und der Ratte. GABA und Glyzin sind wichtige hemmende Neurotransmitter im ZNS. Daher wurden die transgenen Mauslinien GAD67-GFP knock-in und GlyT2-EGFP als Marker für GAD67-positive beziehungsweise Glyzin-positive Zellen verwendet. Gehirnschnitte dieser Mauslinien wurden immunzytochemisch gegen die oben genannten Neuropeptide gefärbt, um die Neuronenpopulationen in den hypothalamischen Kerngebieten zusätzlich zu charakterisieren. Viele Vasopressin- oder VIP-exprimierende Zellen im SCN sind GAD67-positiv. Im lateralen Hypothalamus sind einige MCH-positive Zellen GAD67-positiv. Orexin A enthaltende Zellen sind nicht positiv für GAD67. Orexin A-positive und GAD67-positiv Zellen sind miteinander durch direkte Kontakte verbunden. Der hemmende Neurotransmitter Glyzin wird von wenigen Zellen im lateralen Hypothalamus gebildet. Glyzin ist dort weder mit Orexin A, MCH oder Vasopressin kolokalisiert. Der gesamte Hypothalamus ist von einem dichten Netz stark verzweigter, Glyzin-enthaltender Fasern überzogen, deren Ursprung im Rahmen dieser Arbeit nicht eindeutig geklärt werden konnte. Die glyzinergen Fasern innervieren im lateralen Hypothalamus Orexin A-, Vasopressin- und MCH-exprimierende Neurone. Glyzinerge Fasern projizieren im lateralen Hypothalamus auf VIP-positive Fortsätze und im SCN auf Vasopressinenthaltende Fortsätze. Der hemmende Neurotransmitter Glyzin spielt vermutlich eine bedeutende Rolle bei der Signalübertragung zwischen Hypothalamus und anderen Gehirnbereichen. Damit wirkt Glyzin vermutlich auf diverse physiologische Abläufe ein, die durch hypothalamische Kerngebiete gesteuert und reguliert werden. Neben der Untersuchung der hypothalamischen Nuclei in Gehirnschnitten wurden die Zellen dieser Kerngebiete in histiotypischen primären Zellkulturen charakterisiert. Die Neuropeptid-Expressionen sowie synaptische Verbindungen wurden an den kultivierten Zellen untersucht. Der Vergleich der Neuropeptid-Expression bei Gehirnschnitten und bei Zellkulturen bestätigte, dass histiotypische Zellkulturen ein geeignetes Modell für Studien von Einzelzell- und Netzwerkeigenschaften sind. Die Ausbildung von zahlreichen Synapsen innerhalb nur weniger Tage bestätigt, dass die Signalübertragung in den Zellkulturen wie vermutlich auch im Hypothalamus überwiegend synaptischer Natur ist.
Das Bakterium Thermus thermophilus hat sich in den letzten Jahren zu einem Modell für thermophile Organismen entwickelt. Die maximale Wachstumstemperatur liegt bei bis zu 85°C, so dass auch Proteine und die gesamte Zellstruktur an diese hohen Temperaturen adaptiert sein müssen. Aufgrund der allgemein erhöhten Stabilität werden diese Proteine zunehmend für biotechnologische Prozesse und zur Strukturbestimmung verwendet. Im Energiehaushalt der Zelle ist der Elektronentransfer von NADH zu molekularem Sauerstoff ein wesentlicher Bestandteil und wird durch transmembrane Enzymkomplexe vermittelt. In dieser Arbeit konnten vier direkt aufeinanderfolgende Gene (fbcC, fbcX, fbcF, fbcB) identifiziert werden, die in einem 3,1 kb großen Operon mit einem GC-Gehalt von 69% organisiert sind und für die Untereinheiten eines putativen Thermus bc-Komplexes kodieren. Die in silico translatierte DNA-Information konnte für ausführliche Sequenzvergleiche und eine erste Charakterisierung der bc-Untereinheiten genutzt werden. Während Cytochrom b und das Rieske-Protein typische Eigenschaften zu anderen prokaryotischen Untereinheiten aufweisen, unterscheidet sich die Cytochrom c-Untereinheit hinsichtlich Topologie und Verwandtschaft von klassischen c1-Komponenten. Darüber hinaus wurde eine zusätzliche Untereinheit FbcX identifiziert, die keine Entsprechung in bisher bekannten bc-Komplexen hat. Das gesamte Operon mit vorangestellter d70 Promotorregion wurde amplifiziert, in einen Thermus/E.coli-Shuttlevektor mit hitzeoptimierter Kanamycinresistenz eingefügt und so plasmidkodiert für die Überexpression in T. thermophilus HB27 genutzt. Der membranständige Gesamtkomplex wurde nach Solubilisierung mit ß-D-Decyl-Maltosid stabil in Lösung gebracht und anschließend über eine Metallaffinitätssäule stöchiometrisch als vier-Untereinheiten Komplex aufgereinigt. Der Gesamtkomplex sowie seine Einzelkomponenten und deren Cofaktoren waren somit für eine nähere Charakterisierung verfügbar. Alle vier Genprodukte konnten als Untereinheiten des bc-Komplexes in T. thermophilus über N-terminale Sequenzierung und MALDI-MS/MS eindeutig identifiziert werden. Der in vitro Aktivitätstest zeigte keine Hemmbarkeit des aufgereinigten Thermus Komplexes durch klassische bc-Inhibitoren, was auf eine deutlich abweichende Substratbindung dieses Menachinol-oxidierenden Komplexes hinweist. Durch Optimierung des Thermus/E.coli-Shuttlevektors wurde auch die homologe Überexpression weiterer Thermus-Membranproteine ermöglicht. Dazu gehört neben der ba3-Oxidase auch ein MDL-ähnlicher ABC-Transporter. Weiterhin wurde gezeigt, dass die thermostabilen Eigenschaften sowohl des bc-Komplexes als auch des ABC-Transporters in Detergenzumgebung erhalten bleiben. Dieser Nachweis konnte darüber hinaus auch für den heterolog exprimierten und aus E. coli aufgereinigten ABC-Transporter erbracht werden, der im isolierten Zustand die gleiche Aktivität wie das aus Thermus aufgereinigte Äquivalent aufweist. Neben dem bc-Gesamtkomplex, der ba3-Oxidase und Cytochrom c552 wurden in dieser Arbeit weitere Komponenten der thermophilen Atmungskette in löslicher Form oder mit Membrananker, zum Teil auch heterolog in E. coli exprimiert und unter Erhalt der Redox-Cofaktoren aufgereinigt. Mit der Identifizierung und Charakterisierung eines intakten Cytochrom bc-Komplexes konnte die Lücke im Verständnis der thermophilen Atmungskette von T. thermophilus geschlossen und die Grundlage für weitere Struktur- und Funktionsanalysen dieses membranintegralen Enzymkomplexes geschaffen werden.
Der menschliche Körper ist permanent verschiedenen Mikroorganismen aus der Umwelt ausgesetzt. Dringen diese in den Körper ein, werden sie oder ihre Produkte vom Körper als „fremd“ erkannt und abgewehrt. Dies geschieht über zwei unterschiedliche immunologische Systeme, dem schnell und zuerst reagierenden angeborenen und einem langsamer reagierenden erworbenen Immunsystem. Vom angeborenen Immunsystem erkannt werden so genannte pathogen associated molecular pattern, zu denen auch die CpG-DNA zählt, welche als Ligand des TLR9 identifiziert wurde. CpG- und Non-CpG-ODN sind bislang hauptsächlich an Zellen des Immunsystems erforscht und bewirken dort eine Immunaktivierung und einen pro-inflammatorischen Effekt, der mit dem Ausschütten inflammatorischer Zytokine einhergeht. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass sowohl CpG- als auch Non-CpGPTO-ODN an humanen Keratinozyten eine IL-8-Suppression bewirken. Diese IL-8-supprimierende Wirkung wird nicht über den beschriebenen Rezeptor für CpG-DNA TLR9 entfaltet, sondern vermutlich mittels direkter physikalischer Interaktion mit IL-8 selbst. Durch diese Maskierung des IL-8 kann das Chemokin im ELISA nicht mehr detektiert werden. Des Weiteren gelang im Rahmen der vorliegenden Promotionsarbeit der funktionelle Nachweis, dass auch in vivo (im Kontaktdermatitis-Mausmodell) bei topischer Applikation eine anti-inflammatorische Wirkung durch eine Non-CpG-ODN-haltige Salbe erzielt werden kann. Auf intakter Haut, welche permanent mit einer eigenen Mikroflora besiedelt und somit auch permanent mit bakterieller DNA konfrontiert ist, lösen CpG- und Non-CpG-ODN eine Immunsuppression aus, vermutlich als Schutz vor überschießenden Entzündungen der Haut. Außerdem konnte anhand konfokaler Laser-Scan Mikroskopie gezeigt werden, dass die verwendeten ODN längen- und sequenzspezifisch in Keratinozyten aufgenommen und innerhalb der Zellen transportiert werden. Hier zeigte sich, dass Sequenzen, welche bei der IL-8-Suppression nur geringe oder keine Effekte zeigen, direkt in den Nukleus oder die Nukleoli transportiert werden, wo sie vermutlich an nukleare Bestandteile gebunden oder abgebaut werden. Untersuchungen zum Penetrationsverhalten der ODN an Multilayern zeigten, dass die ODN auch hier längenabhängig in tiefere viable Schichten gelangen. Die Untersuchungen zum Penetrations- und Aufnahme-Verhalten der ODN ist für einen möglichen therapeutischen Einsatz der ODN von hohem Interesse. Im Rahmen dieser Promotionsarbeit gelang zudem erstmals der Nachweis, dass PTO-ODN in der Lage sind, die zum angeborenen Immunsystem zählenden anti-mikrobiell wirksamen Substanzen HbD2, HbD3 und Psoriasin zu induzieren. Diese werden in der Haut synthetisiert und schützen gegen eine ganze Reihe von Mikroorganismen. Anhand Promoter-Aktivitätsstudien konnte demonstriert werden, dass die verwendeten ODN eine Aktivierung von NF K B vermitteln, welche in direktem Zusammenhang mit einer HbD2-Induktion steht. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass CpG- und Non-CpG-ODN zwar als "fremd" und potentiell gefährlich in intakter Haut erkannt werden, wodurch eine Induktion von anti-mikrobiell wirksamen Substanzen ausgelöst wird. Gleichzeitig findet jedoch eine IL-8-Suppression (in vitro), beziehungsweise eine anti-inflammatorische Wirkung (in vivo) statt, welche vermutlich vor überschießenden Immunreaktionen der Haut schützen sollen.
Bei endogenen Retroviren handelt es sich um feste Bestandteile des Genoms. Im Fall von PERV (porzine endogene Retroviren) existieren zusätzlich infektiöse, xenotrope Vertreter. Aufgrund dieser Tatsache ist es notwendig, diese replikationskompetenten Proviren aus dem Genom potentieller Donortiere für die Xenotransplantation zu entfernen. Mit dem Wissen um die chromosomale Lage und der damit verbundenen Möglichkeit des Nachweises per PCR wurde im Rahmen dieser Arbeit gezeigt, dass aufgrund einer polymorphen Verteilung ein Ausschluss dieser funktionellen Proviren, mittels konventioneller Züchtung, möglich ist. Allerdings stellen sowohl die deletierten und mutierten proviralen Sequenzen durch eine Rekombination oder eine Komplementation, als auch ekotrope PERV-C ein Restrisiko im Falle einer Xenotransplantation dar. Es ist eine PERV-A/C Rekombinante beschrieben ex vivo worden, welche eine höhere Infektiösität aufweist als alle bisher untersuchten PERV. Bis auf die Rezeptor-Bindedomäne stellt dieses Virus ein PERV-C dar. Deshalb sollten chromosomal PERV-C identifiziert werden, um bei polymorpher Verteilung im Schweinegenom durch entsprechende Züchtung diese aus dem Genom heraushalten zu können. Im Rahmen dieser Arbeit ist es mit Hilfe einer speziellen PCR gelungen sieben Integrationsorte von PERV-C zu identifizieren. Da das Genom des Schweins bisher noch nicht komplett sequenziert ist, war es noch nicht möglich die gefundenen chromosomalen Bereiche zu kartieren. Dies wäre wiederum die Basis für eine Durchmusterung von Schweinen auf die Anwesenheit der gefundenen Proviren. Des Weiteren ist noch nicht bekannt, ob es sich bei diesen PERV-C um vollständige Proviren handelt, da aufgrund der verwendeten PCR und der sehr hohen Homologie verschiedener PERV untereinander nur provirale 3'Enden mit entsprechenden Flanken identifiziert werden konnten. Zusätzlich wurden in den Proben transgener Schweine PERV-C env spezifische Anteile nachgewiesen. Die Verteilung dieser Sequenzen, welche ebenfalls polymorph ist, gibt zwar keinen Aufschluss über die Anwesenheit eines Volllängen Provirus, jedoch ist aufgrund dieser Verteilung gleichfalls ein Ausschluss dieses Virus durch herkömmliche Züchtung möglich. Auf der anderen Seite besteht ein weiteres Risiko nach einer Xenotransplantation, wenn ein infektiöses PERV durch Komplementation gebildet wird, welches als Erbinformation ein env-deletiertes Provirus trägt. Das komplementierte PERV könnte potentiell, nach erfolgter Xenotransplantation, menschliche Zellen infizieren. Daraufhin wäre es zwar nicht mehr in der Lage infektiöse Partikel zu bilden, jedoch besteht noch das Risiko einer Retrotransposition, welche an sich schon mutagen wirkt. Zusätzlich könnten durch diesen Vorgang Gene zerstört oder Onkogene angeschaltet werden. Um dieses Risiko abschätzen zu können, wurden im Rahmen dieser Arbeit modifizierte Proviren von PERV-B(33) und MoMLV (Positivkontrolle) hergestellt und in einem Retrotranspositions Assay getestet. Die Modifikation der Proviren beinhaltete die Deletion des für die Retrotransposition nicht notwendigen env-Leserahmens, im Austausch gegen eine inserierte Indikatorkassette für die Retrotransposition (neoint). Im Rahmen der in dieser Arbeit durchgeführten Experimente konnte im Fall des Molekularklons PERV-B(33) eine Frequenz der Retrotransposition von maximal 1,2*10-6 pro Zelle und Generation ermittelt werden. Demzufolge stellt eine Retrotransposition von env-deletierten proviralen porzinen Sequenzen nach erfolgter Xenotransplantation ein minimales Risiko dar.
Die mechanische Streckung hat einen großen Einfluss auf Keratinozyten und bei der Transduktion dieses Reizes nehmen ßl-integrine, E-Cadherine und EGF-Rezeptoren eine zentrale Rolle ein: Eine einfache mechanische Dehnung von HaCaT-Zellen um 10% fuhrt innerhalb von 5min zu einer schnellen Umorientierung der ßl-Integrine auf der Zellmembran, ohne dass sich dabei die Menge dieser Oberflächenrezeptoren ändert. Die Integrine sammeln sich in der basalen Membran zu größeren Adhäsionskomplexen. Dies hat Auswirkungen auf das Adhäsionsverhalten der Zellen. Eine Streckung bewirkt, dass die mechanisch stimulierten Zellen gegenüber den Kontrollzellen sowohl schneller an das Substrat anheften als auch eine stärkere Zell-Matrix-Adhäsion aufweisen. Das unterschiedliche Adhäsionsverhalten auf den verschiedenen Substraten (Arginin+Serum, Fibronektin, Kollagen) und Experimente mit funktionsblockierenden Antikörpern gegen ßl-Integrine sind Beweise für die Beteiligung dieser Oberflächenrezeptoren an diesem Vorgang. Da adhärente Zellen, wie Keratinozyten. neben Wachstumsfaktoren den Zell-Matrix-Kontakt benötigen, um in die S-Phase eintreten zu können, hat das unterschiedliche Adhäsionsverhalten von gestreckten und ungestreckten Zellen wiederum Einfluss auf die Proliferation. Diese ist bei den mechanisch gereizten Zellen im Vergleich zu den Kontrollzellen gesteigert und zwar im direkten Verhältnis zu der mechanisch induzierten Steigerung der Adhäsion. Im Rahmen einer Rezeptor-Transaktivierung (siehe vorne) kooperieren ßl-Integrine und E- Cadherine sowohl räumlich als auch funktionell mit dem EGF-Rezeptor bei der Übermittlung des Dehnungsreizes: Räumliche Interaktionen: Eine Koclusterung von ßl-Integrinen mit dem EGF-Rezeptor tritt bereits nach 5minütiger mechanischer Reizung an den Zell-Zell-Grenzen und den Fokalkontakten auf. Eine Kolokalisation zwischen E-Cadherinen und EGF-Rezeptoren besteht ebenfalls, wobei sich allerdings Kontrolle und Streckung nicht unterscheiden. Funktionelle Interaktionen: Eine mechanische Stimulation führt zu einer transienten Aktivierung des EGF-Rezeptors (Aktivitätsmaximum: 5min) und der MAP-Kinase ERK1/2 (Aktivitätsmaximum: 15min). Diese streckungsinduzierte Aktivierung von ERK1/2 wird sowohl durch die Blockierung der ßl-Integrine und E-Cadherine als auch durch die Inhibition des EGF-Rezeptors unterbunden. Weiterhin hemmt die Blockierung der Adhäsionsmoleküle die Aktivierung des EGF-Rezeptors. Dies spricht für die Transaktivierungs-Theorie des EGF- Rezeptors durch die ß1-Integrine und E-Cadherine. Die Zellstrukturen und viele zelluläre Prozesse werden durch eine zellintern erzeugte Grundspannung im Zytoskelett aufrechterhalten. Ohne eine Verankerung der Zelle an der ECM oder den Nachbarzellen, was durch die Blockierung der ßl-Integrine und E-Cadherine erreicht wird, bricht dieses fein ausbalancierte System zusammen; die Zytoskelett-Elemente F-Aktin, Intermediär-Filamente und Mikrotubuli zerfallen. Anhand der Ergebnisse dieser Arbeit wird ersichtlich, welche enorme Bedeutung den Adhäsionsrezerptoren - ßl-Integrine und E-Cadherine - für die Formstabilität und die funktionellen Eigenschaften der Zelle zukommt. Ein Ausfall dieser Adhäsionsmoleküle beeinträchtigt sowohl die Form der Zelle (Adhäsionsvorgänge und Tensigrity-Modell) als auch die Transduktion von Umweltreizen durch die Plasmamembran, z.B. einer mechanischen Stimulation, die letztendlich das Überleben der Zelle und die Proliferation bestimmt. Daher wäre denkbar, das die Ergebnisse dieser Grundlagenforschung in Zukunft zur Behandlung von Hautkrankheiten herangezogen werden können.
Das Tau-Protein bildet im Verlauf von zahlreichen Demenzen, mit Morbus Alzheimer als die bekannteste unter ihnen, Aggregate, die sogenannten „neurofibrillären Geflechte“, die aus Fibrillen, den „paired helical filaments“ (PHFs) bestehen. Außerdem ist das Tau-Protein ein essentielles „microtubule-associated protein“, welches für die Aufrechterhaltung des neuronalen Zellmetabolismus notwendig ist. Dies veranlasste uns dazu, das Tau-Protein als Monomer, in der Mikrotubuli-gebundenen Form und als Fibrille zu charakterisieren. Die Technik, die wir hierzu verwendeten war die NMR-Spektroskopie, die als einzige strukturaufklärende Technik mit atomarer Auflösung dazu in der Lage ist, intrinsisch ungeordnete Proteine, wie das Tau-Protein, zu charakterisieren. Zwar war die Signalzuordnung der NMR-Spektren eine große Herausforderung, dennoch war es möglich praktisch alle Rückgratresonanzen sogar für die längste Tau-Isoform htau40 mit 441 Resten erfolgreich eindeutig zu identifizieren. Mit Hilfe der Zuordnung war es möglich das Tau-Protein bezüglich residualer Strukturelemente, Rückgratdynamik und Bindungsverhalten zu untersuchen. Wir konnten zeigen, dass in der C-terminalen Hälfte des Tau-Proteins, in welcher eine charakteristische Domäne vorliegt, die durch vier imperfekte „repeat“-Regionen (Länge ist jeweils ca. 31 Reste) gekennzeichnet ist, partieller beta-Strukturcharakter vorliegt. Ebenfalls weist diese Region eine verhältnismäßig hohe Rigidität auf. Aus diesem Grund betrachten wird diesen sequentiellen Bereich als den Aggregationskeim, was auch durch die Beobachtung verstärkt wird, das genau diese Zone den rigiden Teil der Fibrillen bildet. Diese aggregationsanfällige Region bindet gleichzeit stark an Mikrotubuli, wodurch ihre Pathogenität im gesunden biologischen System blockiert sein sollte. Mutationen oder Instabilität in den Mikrotubuli können jedoch dazu führen, dass immer höhere Mengen an Tau in freier gelöster Form vorliegen, sich Dimere ausbilden, welche dann weiter aggregieren und schließlich PHFs bilden, die eine starke cross-beta-Struktur aufweisen. Die übrigen Bereiche, wie die N-terminale Hälfe oder die äußersten 50 C-terminalen Reste weisen hingegen einen partiellen alpha-helikalen Charakter auf und eine höhere Peptidrückgratflexibilität. Deshalb kann man diese Elemente als aggregationsinhibierend betrachten. Das genauere Zusammenspiel dieser Elemente muss noch aufbauend auf der vorliegenden Dissertation verstärkt im Detail untersucht werden.
Riboswitche sind hoch strukturierte RNA‐Elemente, die durch direkte Bindung von kleinen Metaboliten die Expression vieler bakterieller Gene kontrollieren. Sie bestehen aus einer Ligand‐bindenden Aptamerdomäne und einer so genannten Expressionsplattform. Im Zuge der Metabolitbindung an die Aptamerdomäne ändert sich die Konformation der Expressionsplattform. Diese Konformationsänderung führt zu einem vorzeitigen Abbruch der mRNA‐Transkription oder zu einer Inhibierung der Translationsinitiation. In Bacillus subtilis wurden zwei Klassen von Riboswitchen gefunden, die trotz einer sehr hohen Homologie in ihrer Primär‐ und Sekundärstruktur spezifisch zwischen den Purinen Guanin und Adenin unterscheiden.
Durch den direkten NMR‐spektroskopischen Nachweis von Wasserstoffbrückenbindungen konnte der Bindungsmodus von Adenin, Guanin und von weiteren Purinliganden an diese beiden Klassen von Riboswitch‐RNAs beschrieben werden. Für beide Purin‐Riboswitche wurde ein gemeinsamer Bindungsmechanismus des Purinliganden an die RNA beobachtet. Hierbei bildet der Purinligand ein intermolekulares Basentripel mit der Riboswitch‐RNA aus. Die Spezifität der Metabolitbindung ist das Resultat eines intermolekularen Watson‐Crick Basenpaars zwischen dem gebundenen Liganden Guanin und einem Cytidin bzw. zwischen dem Liganden Adenin und einem Uridin der jeweiligen Riboswitch‐RNA. Zusätzlich wurde eine zweite Basenpaarung zwischen der Riboswitch‐RNA und dem gebundenen Liganden entdeckt, die in beiden Riboswitch‐Klassen identisch ist und ein weiteres Uridin der RNA und die N3/N9 Seite des Purinliganden einschließt. Diese Basenpaarung entsteht durch ein bislang unbeschriebenes Wasserstoffbrückenbindungsmuster, das zur Affinität der RNA‐Ligand‐ Wechselwirkung beiträgt. Die beobachteten intermolekularen Wasserstoffbrückenbindungen zwischen der RNA und dem gebundenen Purinliganden erklären die beobachtete Spezifitätsumkehrung einer C zu U Mutation in der Ligandbindungstasche der Riboswitch‐ RNA und die Unterschiede der Bindungsaffinitäten von verschiedenen Purinanaloga.
Weiterhin wurden die Ligand‐ und Kation‐induzierten konformationellen Änderungen der isolierten Aptamerdomänen beider Purin‐bindenden Riboswitche und des gesamten Guanin‐ Riboswitches mittels NMR‐Spektroskopie untersucht. Demnach ist die Ligandbindungstasche in der Ligand‐ungebundenen Form unstrukturiert und Ligandbindung verläuft nach einem induced fit‐Mechanismus. Die Untersuchung der freien und Mg2+‐gebundenen Form der Ligand‐ungebundenen Aptamerdomäne zeigte Unterschiede zwischen den beiden eng verwandten Purin‐bindenden Riboswitchen. Während die Wechselwirkung zwischen den hoch konservierten Sequenzen der apikalen Schlaufen der Helix II und III in der Mg2+‐freien Form des Guanin‐Riboswitches vorgeformt ist, ist sie in der Mg2+‐freien Form des Adenin‐ Riboswitches nicht ausgebildet, wird jedoch in Gegenwart von Mg2+ ausgebildet. Es konnte gezeigt werden, dass dieser konformationelle Unterschied zwischen den Ligand‐ ungebundenen Purin‐Riboswitchen durch die Stabilität der apikalen Basenpaare in Helix II festgelegt wird. Die im Guanin‐Riboswitch gefundene stabile Schlaufen‐Schlaufen‐ Wechselwirkung kann auch außerhalb der Riboswitchsequenz existieren. Durch Mg2+, Mn2+ und Co(NH3)63+ Titrationen der Ligand‐gebundenen Purin‐Riboswitch Aptamerdomänen konnten spezifische Kationbindungsstellen lokalisiert werden, die in beiden Komplexen übereinstimmen und eine Rolle in der Stabilisierung der RNA‐Struktur spielen.
Um die Sekundärstruktur des gesamten Guanin‐Riboswitches in seiner freien und Ligand‐ gebundenen Form zu untersuchen, wurden die NMR‐Spektren dieser RNA mit denen der freien und Ligand‐gebundenen isolierten Aptamerdomäne und der isolierten Terminator‐ und Antiterminatorelemente verglichen. Überaschenderweise bildet bereits die freie Form des gesamten Guanin‐Riboswitches das Terminatorelement und die Aptamerdomäne aus. Somit finden konformationelle Änderungen im Zuge der Ligandbindung einzig in der Aptamerdomäne statt. Weiterhin wurde die Struktur der freien und Ligand‐gebundenen Form einer verkürzten Guanin‐Riboswitch‐RNA untersucht. Diese RNA ist ein Modell für ein Transkriptionsintermediat, das durch eine der drei RNA‐Polymerase‐Ruhestellen induziert wird, die in der Riboswitch‐Sequenz aufzufinden sind. Interessanterweis schließen sich die Ligandbindung an die Aptamerdomäne und die Ausbildung des Antiterminators nicht gegenseitig aus, wie bisher angenommen. Die verkürzte RNA kann in Abhaengigkeit von verschiedenen experimentellen Bedingungen unterschiedliche Sekundärstrukturen annehmen. Das hat interessante Auswirkungen auf die Rolle der im Terminatorelement lokalisierten Transkriptionsruhestelle für den genregulatorischen Prozess und führt zu einem neuen Modell der Funktionsweise des Guanin‐Riboswitches.
Starke allergische Reaktionen gegen nicht spezifische Lipidtransfer Proteine sind im Mediterranen Raum weit verbreitet. LTPs besitzen als Klasse 1 Nahrungsmittelallergene vermutlich die Fähigkeit über den oralen Weg, durch den Verzehr von Nahrung, eine Sensibilisierung auszulösen. Zu Beginn dieser Arbeit wurde jedoch in der Literatur die Möglichkeit diskutiert, ob auch bei einer LTP-Sensibilisierung eine Pollen-assozierte Nahrungsmittelallergie vorliegen könnte. Untersuchungen zur IgE-Bindungskapazität von Lebensmittel- und Pollen-LTPs zeigten partielle Kreuzreaktivitäten. Eine Aussage über eine einheitliche Tendenz zur stärkeren IgE-Bindungskapazität konnte anhand der derzeitigen Ergebnisse weder für die Lebensmittel- noch für die Pollen-LTP-Gruppe getroffen werden. Dementsprechend lag kein eindeutiger Hinweis zur Korrelation zwischen der Sensibilisierung gegen Pollen- und Nahrungsmittel-LTPs vor, wodurch die Frage zur Fähigkeit der einzelnen LTPs kausal eine Allergie auszulösen weiterhin offen bleibt. Die Untersuchungen dieser Arbeit fokussierten sich auf die Lebensmittelallergene und sollten ihre klinische Bedeutung analysieren und Aufschluss über die Fähigkeit dieser Allergene eine Allergie kausal auszulösen bringen. Hierbei sollte untersucht werden, ob jedes Nahrungsmittel-LTP die Fähigkeit besitzt eine IgE-Sensibilisierung auszulösen oder ob ein LTP als primär sensibilisierendes Agens wirkt und nachfolgend immunologische Kreuzreaktionen zu anderen LTPs auftreten. Aufgrund der großen Häufigkeit von Patienten mit einer Pfirsichallergie im mediterranen Raum mit einer Sensibilisierung gegen das Pfirsich-LTP (Pru p 3), sowie einer schweren Symptomatik, wird vermutet, dass dieses Allergen eine wichtige Rolle spielt und eventuell als primär sensibilisierendes Agens fungieren könnte. Zur Identifizierung eines primär sensibilisierenden Agens sollte das Ausmaß der Antikörper-Kreuzreaktivität, die Aufschluss über die Affinität und Vorkommen gemeinsamer Epitope liefern soll, untersucht werden. Weiterhin sollte die IgE-Prävalenz der einzelnen Allergene, ihre Immunogenität (T-Zell-Kreuzreaktivität und in vivo Antikörperinduktion) und die biologische Potenz untersucht werden. Um der Fragestellung nachzugehen wurden die LTPs aus taxonomisch verwandten (Kirsche, Pru av 3 und Pfirsich, Pru p 3) und nicht verwandten (Haselnuss, Cor a 8 und Salat, Lac s 1) Lebensmitteln in die Studie einbezogen. Für die Untersuchungen standen 51 Seren von spanischen Lebensmittelallergikern zur Verfügung, deren Allergien gegen Pfirsich, Salat, Haselnuss und Kirsche anamnestisch und serologisch erfasst wurden. Die Relevanz der LTPs wurde durch die Schwere der klinischen Symptomatik deutlich. LTPs besitzen eine hohe Stabilität gegenüber thermischer und proteolytischer Prozessierung. Natürliches Pru p 3 zeigte bei einer Erhitzung auf 90°C zum größten Teil eine intakte Sekundärstruktur. Diese Eigenschaften könnten die Aufnahme von intakten Allergenen im gastrointestinalen Trakt begünstigen, wodurch die teilweise starken allergischen Reaktionen erklärt werden können. Bei der Untersuchung zur Relevanz von Pru p 3 im Vergleich zu Lac s 1, Cor a 8 und Pru av 3 wurde die IgE-Prävalenz, IgE-Bindekapazität, IgE-Kreuzreaktivität und biologische Potenz untersucht. Spezifisches IgE gegen Lac s 1 (93%), Pru p 3 (90%), Cor a 8 (88%) und Pru av 3 (85%) wurde mittels ImmunoCAP-FEIA in der jeweiligen Lebensmittelallergikergruppe gefunden und quantitativ bestimmt. Alle untersuchten Lebensmittel-LTPs erwiesen sich als Hauptallergene in der jeweiligen Patientengruppe. Bei Untersuchungen der IgE-Bindekapazität zeigten alle untersuchten Patienten, mit Ausnahme von einem, eine stärkere IgE-Bindungen gegen Pru p 3 im Vergleich zu Cor a 8. Demnach korreliert eine IgE-Sensibilisierung gegen Cor a 8 mit der gegen Pru p 3. Lac s 1 zeigte in einigen Fällen eine stärkere IgE-Bindung im Vergleich zu Pru p 3 und umgekehrt. Mit Ausnahme eines Patienten war eine IgE-Sensibilisierung gegen Lac s 1 immer mit der gegen Pru p 3 assoziiert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in Einzelfällen spezies-spezifische Epitope beobachtet wurden, während IgE-Reaktivitäten gegen LTPs, die nicht zu der Familie der Rosengewächse gehören, in seltenen Fällen ohne eine begleitende Sensibilisierung gegen Pru p 3 auftraten. Die IgE-Bindung an Pru p 3 konnte durch Cor a 8 und Lac s 1 maximal bis 60% inhibiert werden, während Pru p 3 eine komplette Inhibition der Cor a 8 und Lac s 1 IgE-Bindung bewirkte. Demnach besitzt Pru p 3 alle IgE-Epitope von Lac s 1 und Cor a 8 und/oder eine stärkere Affinität zu den IgE-Antikörpern. Cor a 8 zeigte, trotz der Fähigkeit schwere Symptome auszulösen, eine relativ geringe biologische Potenz. Lediglich bei einem von fünf untersuchten Patienten zeigte Lac s 1 eine starke maximale Histaminfreisetzung. Pru p 3 und Pru av 3 zeigten die stärkste biologische Potenz bei allen untersuchten Pfirsichallergikern. Ein Salatallergiker ohne Pfirsichallergie zeigte durch die Stimulation mit Pru p 3 eine geringe Mediatorfreisetzung, wodurch dem Allergen Pru p 3 in Einzelfällen ohne klinische Symptomatik gegen das Allergen nicht zwangsläufig die stärkste biologische Potenz zugeschrieben werden kann. Pru p 3 und Pru av 3 zeigten aufgrund einer hohen Sequenzidentität von 85% nahezu identische IgE-Bindekapazitäten, IgE-Kreuzreaktivitäten, sowie eine ähnliche biologische Potenz. Eine Kreuzreaktivität auf T-Zell-Ebene wurde ebenfalls zwischen Pru p 3 und Pru av 3 detektiert, während im murinen System mittels RBL-2H3-Mediatorfreisetzungstest keine Kreuzreaktivität unter allen untersuchten Lebensmittel-LTPs nachweisbar war. Fehlende T-Zell-Kreuzreaktivitäten zwischen Pru p 3/Cor a 8 und Pru p 3/Lac s 1 deuten auf unterschiedliche T-Zell-Epitope der untersuchten Proteine hin. Um eine generelle Aussage über die T-Zell-Kreuzreaktivität treffen zu können, wären weitere systematische T-Zell-Proliferationsstudien erforderlich. Die erhaltenen Ergebnisse verdeutlichen, dass dem Allergen Pru p 3 hinsichtlich IgE-Prävalenz, IgE-Bindekapazität, IgE-Kreuzreaktivität im Inhibitions-ELISA und der biologischen Potenz im Mediatorfreisetzungstest die bedeutendste Rolle unter den untersuchten LTPs zukommt. In Einzelfällen konnten jedoch spezies-spezifische Epitope nachgewiesen werden, wodurch die Annahme verstärkt wird, dass Pru p 3 nicht das alleinige Immunogen sein kann. Weiterhin waren alle untersuchten LTPs im murinen System immunogen, wodurch die Annahme verstärkt wird, dass jedes untersuchte LTP eine Allergie kausal auslösen kann. Unterstützt wird diese Vermutung durch die fehlende Kreuzreaktivtität der murinen IgE-Antikörper. Eine eindeutige Aussage kann aufgrund der erhaltenen Ergebnisse derzeit noch nicht getroffen werden, da weitere systematische T-Zell-Proliferationsstudien und Inhibitions-ELISA der Maus-Immunsera in dieser Arbeit nicht mehr durchgeführt werden konnten.
Die Zuckertransporterfamilie ist eine Unterfamilie der MFS („major facilitator superfamily“), wobei die MFS wiederum als Überfamilie von Transportproteinen definiert wurde, die sich aus Proteinen mit 12 Transmembran-Domänen zusammensetzt. Im Rahmen dieser Doktorarbeit sollte die subzelluläre Lokalisation und physiologische Funktion der uncharakterisierten Mitglieder der Zuckertransporterfamilie Ybr241 und Ygl104 untersucht werden. Mittels Zellfraktionierung durch Saccharosedichtegradienten-Zentrifugation und Fluoreszenzmikroskopie konnte eine Lokalisation von Ybr241 und Ygl104 in der vakuolären Membran festgestellt werden. Da Plasmamembran-Proteine zur Degradation ubiquitiniert, über Endocytose internalisiert und in der Vakuole abgebaut werden, wurden weitere Lokalisationsstudien sowohl in Endocytose-Mutanten als auch in einer Mutante mit Defekten in der Ubiquitinierung durchgeführt. Diese ergaben, daß die vakuoläre Lokalisation nicht auf Degradation zurückzuführen war. Somit handelt es sich bei Ybr241 und Ygl104 um residente vakuoläre Membranproteine. Lokalisationsstudien in vps-Mutanten erbrachten Hinweise darauf, daß zumindest Ygl104, wie die meisten vakuolären Proteine, über den CPY-Weg zur Vakuole befördert wird. Weder durch Wachstumsanalysen noch mit Hilfe von Phenotype MicroArrays™ (Biolog, Inc.) konnten Phänotypen der Deletionsmutanten von Ybr241 und Ygl104 identifiziert werden. Allerdings zeigte sich im Verlauf der Arbeit, daß die Deletionsmutanten einen Vorteil beim Wachstum mit geringen Glucosekonzentrationen bei 37°C haben. Des weiteren bestanden aufgrund von Datenbankanalysen Anhaltspunkte auf eine Beteiligung am Trehalosestoffwechsel. Durch Hitzeschockexperimente konnte eine essentielle Rolle von Ybr241 und Ygl104 bei der Resistenz von Zellen gegenüber schwerem Hitzestreß identifiziert werden. Die verminderte Thermotoleranz der Deletionsmutanten war aber nicht auf einen geringeren Gehalt der Zellen am Streßschutzmolekül Trehalose zurückzuführen. Zudem deckte ein SGA („synthetic genetic array“) eine synthetisch kranke Interaktion von YBR241C und YGL104C mit dem Gen der Trehalose-6-Phosphat-Synthase TPS1 auf. Diese Interaktion sprach gegen eine Beteiligung der Genprodukte am Trehalosestransport, da tps1-Mutanten keine Trehalose enthalten. tps1-Mutanten haben einen Wachstumsdefekt mit schnell fermentierbaren Kohlenstoffquellen, der höchstwahrscheinlich auf einen Mangel an freiem Phosphat zurückzuführen ist. Somit scheinen die Proteine Ybr241 und Ygl104 die intrazelluläre Phosphatkonzentration zu beeinflussen. Eine Analyse ergab, daß der Phosphat- und Polyphosphatgehalt der Mutanten teilweise stark herabgesetzt war. Der Einfluß könnte direkt durch Phosphatimport in die Vakuole stattfinden oder sekundär über eine Verminderung der Glycerinproduktion, da durch die Synthese von Glycerin wieder Phosphat freigesetzt wird. Somit handelt es sich bei Ybr241 und Ygl104 möglicherweise um vakuoläre Phosphat- oder Glycerintransporter. Ferner konnte gezeigt werden, daß die saure Trehalase Ath1 sekretiert wird und Trehalose extrazellulär in Glucose hydrolysiert. Die Glucosemoleküle werden dann von der Hefezelle aufgenommen und verstoffwechselt. Somit spielt Ath1 eine essentielle Rolle beim Wachstum der Hefe mit Trehalose als Kohlenstoffquelle. Ziel des zweiten Teils dieser Doktorarbeit war die Entwicklung eines genomweiten Screens nach ER-Verpackungschaperonen, durch den bisher unbekannte Verpackungschaperone identifiziert werden sollten. Durch Testen verschiedener Varianten des Screens konnte ein Verfahren entwickelt werden, das prinzipiell funktionierte. Für den Einsatz im genomweiten Maßstab war es jedoch ungeeignet, da mit einer hohen Rate an falsch negativen Ergebnissen zu rechnen gewesen wäre.
Der Mangel von Faktor VIII (FVIII) führt zur häufigsten Gerinnungsstörung, der Hämophilie A. Die rekombinante Expression von FVIII für gentherapeutische Ansätze oder zur Herstellung von FVIII ist zwei bis drei Größenordnungen niedriger verglichen mit anderen Proteinen vergleichbarer Größe. Die Ursachen für die geringe Expression liegen zum großen Teil an der ineffizienten Transkription und dem ineffizientem intrazellulären Transport. (1) Im Rahmen der Untersuchung der FVIII-Sekretion, konnte durch Verwendung von FVIII-GFP Fusionsproteinen zum ersten Mal gezeigt werden, wie FVIII in lebenden Zellen transportiert wird. Außerdem wurde anhand von vergleichenden Immunfluoreszensfärbungen, FVIII-Messungen und Westernblotanalysen demonstriert, dass weder bei der B-Domäne deletierten noch bei der Volllängenvariante signifikante Unterschiede zwischen den GFP-fusionierten und Wildtyp-FVIII-Varianten messbar waren. Offensichtlich wird die Funktionalität von FVIII durch die C-terminal fusionierte GFP-Domäne nicht eingeschränkt. In ersten Lebendzellanalysen konnte gezeigt werden, dass sich FVIII in primären Zellen und Zelllinien hauptsächlich im ER befindet und eine für lumenale ER-Proteine charakteristischen Mobilität aufweist. Beim frühen sekretorischen Transport zeigte sich bei Temperaturblock-Experimenten eine verlängerte Dauer der Akkumulation in ER-Exit-Sites und eine vergleichsweise niedrige Frequenz von ER-Golgi-Bewegungen. Es konnte zum ersten Mal der Nachweis von FVIII-Transport durch vesikuläre tubuläre Cluster erbracht werden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass der möglicherweise durch Faltungsprobleme blockierte Austritt aus dem ER das Hauptproblem des ineffizienten FVIII-Transports zu sein scheint und weniger der intrazelluläre Transport an sich. Mittels siRNA-Silencing wurde außerdem die überwiegende Beteiligung von COPI am intrazellulären Transport von FVIII deutlich, dessen Herunterregulierung zu einer 78 prozentigen Reduktion der FVIII-Sekretion im Gegensatz zu 32 Prozent bei COPII führte. Dagegen konnte durch Herunterregulierung der Expression der p24-Cargo-Rezeptor Familienmitglieder p24 und p26 und der Clathrin Adapterproteine µ- und -Adaptin bzw. durch physiologischen Knock-out im Falle von ER-Exit-Rezeptor MCFD2 kein Einfluß auf die FVIII-Sekretion festgestellt werden. (2) Als Alternative zu dem ineffizienten FVIII-Expressionsystem in unphysiologischen Zelllinien, bieten primäre Endothelzellen den Vorteil einer hocheffizienten FVIII-Sekretion. Zur Verwendung bei der rekombinanten Produktion benötigt man allerdings eine kontinuierlich wachsende gut charakterisierte Zelllinie. Zur Immortalisierung wurden aus Nabelschnurblut gewonnene Endothelprogenitorzellen mit der aktiven Untereinheit der humanen Telomerase (hTERT) transduziert. Trotz erfolgreicher Transduktion und langfristiger Expression von hTERT, welche im TRAP-Assay normale Aktivität zeigte, gingen die Zellen nach der natürlichen Teilungsspanne in die Seneszenz über. Möglicherweise wird noch ein weiteres Immortalisierungsgen benötigt oder hTERT ist durch die ektopischen Expression in diesen Endothelzellen nicht funktionell. (3) Der Einsatz hämatopoetischer Stammzellen für gentherapeutische Ansätze zur Expression von humanen FVIII ist bislang aufgrund niedriger Expressionseffizienz der Vektoren limitiert. Es wurden daher die Kombinationen verschiedener transkriptioneller und posttranskriptioneller Elemente in FVIII-Expressionsvektoren ausgetestet. Hierbei zeigte sich, dass die Verwendung einer 5’ untranslatierten Region (5’UTR) des hämatopoetisch exprimierten FXIIIA-Gens die FVIII-Sekretion in verschiedenen Zelllinien und primären Zellen deutlich steigerte. Am stärksten war die Wirkung in primären Monozyten, in denen die FVIII-Expression den 6fachen Wert im Vergleich zum Ursprungsvektor ohne 5’UTR erreichte. Leberzellen stellen weitere attraktive Zielzellen für gentherapeutische Ansätze dar, da Sie den primären physiologischen Ort der FVIII-Synthese darstellen. Die häufig für Gentherapievektoren verwendeten ubiquitär exprimierenden viralen Promotoren bewirken zwar hohe Expression in den transduzierten Zellen, haben allerdings den Nachteil durch ektopische Expression vermehrt Immunantworten auszulösen und durch starke Interaktion mit benachbarten Promotoren der Integrationsstelle im Genom möglicherweise tumorgene Effekte zu verursachen. Bei der Untersuchung verschiedener physiologischer Promotoren im Vergleich zum viralen CMV Promotor in Leberzellen konnte mit dem zum ersten mal getesteten minimalen FVIII-Promoter in einem lentiviralen Vektor der dritten Generation in Leberzelllinien eine vergleichsweise hohe Expression von 0,5 IU/ml FVIII /106 Zellen erzielt werden. Der FVIII-Promoter ist daher geeignet für eine lebergerichtete Expression und minimiert dabei das potentielle Risiko der häufig verwendeten ubiquitären viralen Promotoren.
Eine Einschränkung des Hörvermögens durch Schäden der Sinnesrezeptoren im Innenohr gilt beim Menschen sowie bei allen anderen Säugetieren als irreversibel. Die Hörforschung ist an der Frage interessiert, ob durch Plastizität in zentralen Teilen des auditorischen Systems Kompensationsmechanismen die Folgen mildern können. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Frage, ob und in welchem Umfang nach peripheren Hörschäden durch zentrale Kompensationsmechanismen eine Erholung des Hörvermögens auftritt auf der Basis von plastischen Änderungen der neuronalen Verarbeitung der Eingangssignale aus dem geschädigten Hörorgan. Schäden des Sinnesepithels im Innenohr, z.B. durch überlaute Beschallung oder ototoxische Substanzen, betreffen in der Regel zunächst die äußeren Haarzellen und führen zu einem Verlust der Empfindlichkeit und Frequenzspezifität des Hörvermögens. Eine primäre selektive Schädigung der inneren Haarzellen (IHZ) tritt im Tiermodell, aus unbekannten Gründen nur bei einer Spezies auf, dem Chinchilla (Chinchilla laniger) und zwar nach Gabe des antineoplastischen Medikament Carboplatin. Das gute Tieffrequenzhören der Chinchillas (0.1-20 kHz) ermöglicht außerdem Aussagen zur akustischen Signalverarbeitung in einem für das menschliche Gehör relevanten Frequenzbereich (0.02-16 kHz). Dieses Tiermodell bietet somit die Gelegenheit, die Veränderungen in zentralen Teilen des auditorischen Systems nach einer definierten sensorischen Schädigung zu untersuchen. Hierfür kommt u.a. das auditorische Mittelhirn, der Colliculus Inferior (IC) in Frage. Der IC wird als Hauptintegrationszentrum der Hörbahn angesehen weil er Eingänge von fast allen vor ihm liegenden auditorischen Kernen (z.B. Nucleus cochlearis, Nucleus olivaris und Leminscus lateralis) bekommt. Ein weiterer Grund für die Wahl des IC als Untersuchungsgebiet der vorliegenden Arbeit ist, die Frage zu beantworten, ob die auf der Ebene des auditorischen Kortex bereits nachgewiesene funktionelle Plastizität auch auf der Ebene des IC schon realisiert oder vorbereitet wird. Die vorliegende Arbeit untersucht das Antwortverhalten der Neurone im ICc an wachen Tieren vor und nach einem selektiven Teilverlust der IHZ bei Erhalt der äußeren Haarzellen. Die Arbeitshypothese ist, dass es nach einem abgeschwächten sensorischen Eingang zu Veränderungen der exzitatorischen und inhibitorischen Antwortfelder kommt, die als funktionelle Plastizität bzw. als Kompensation verstanden werden können. Anhand elektrophysiologischer Ableitungen im ICc von wachen, chronisch implantierten Tieren wurden die exzitatorischen und die inhibitorischen Antwortfelder der Neurone durch Einton- und Zweiton- Stimulation getrennt gemessen und bestimmt. Die Resultate zeigen, dass die exzitatorischen und inhibitorischen Antworteigenschaften im IC bei wachen und narkotisierten Tieren unterschiedlich sind. In wachen Tieren weist die Inhibition generell höhere Variation auf als in narkotisierten Tieren und ist unabhängiger von der Art der Exzitation. Eine Carboplatinbehandlung führte bei allen Tieren nach 3-7 Tagen zu einer Abnahme der Amplituden und einer Erhöhung der Schwellen der akustisch evozierten Hirnstammpotentiale (ABRs). Die histologische Untersuchung des Innenohres (10 Wochen nach Carboplatinbehandlung), zeigte bei allen Tieren Verluste der IHZ (zwischen 20 und 60%) entlang der gesamten Basilarmembran. Es wurden aber keine Verluste von ÄHZ festgestellt. Die Gehirn-Schnitte zeigten, dass die Registrierungen aus dem zentralen Teil des Colliculus Inferior stammen. Die physiologische Untersuchung der Antworteigenschaften der Neurone im IC 4-6 Wochen nach der carboplatinbedingten Schädigung der IHZ zeigte eine Reduktion der Inhibition, die u.a. deutlich an dem Verlauf der Intensitätskennlinien zu beobachten war. Nach dem Teilverlust der IHZ wurden viel weniger nichtmonotone Kennlinien gefunden als vor der Innenohrschädigung. Darüber hinaus beobachteten wir eine Reduzierung der inhibitorischen Regionen und eine signifikante Ausweitung der exzitatorischen Antwortfelder nach dem Teilverlust der IHZ. Die Resultate der vorliegenden Arbeit führen zu der Schlussfolgerung, dass nach einer Teilschädigung der inneren Haarzellen, unter Erhalt der ÄHZ nur ein geringer Sensitivitätsverlust in der zentralen Hörbahn auftritt. Der Verlust von 20-60% der IHZ und der damit einhergehende reduzierte afferente Informationsfluss führt zu physiologischen Veränderungen in der Hörbahn, die im IC von wachen Tieren vor allem durch eine Reduktion der Inhibition hervortritt. Dies deutet daraufhin, dass zentrale Kompensationsmechanismen bei peripheren Hörschäden nicht, wie bisher vermutet, erst in kortikalen sondern zum Teil bereits in subkortikalen Arealen (im Mittelhirn) stattfinden.
Untersuchung der Interaktion zwischen NCoA-Koaktivator-Proteinen in der Transkriptionsregulation
(2007)
Die Mitglieder der NCoA-Koaktivator-Familie fungieren als Koaktivatoren für verschiedene Transkriptionsfaktoren, wie z.B. nukleäre Hormonrezeptoren und STAT-Proteine. NCoA-Proteine rekrutieren sekundäre Koaktivatoren, die durch die Modifikation des Chromatins die Transkriptionsaktivierung ermöglichen. Vorhergehende Studien postulierten die Dimerisierung von NCoA-Proteinen über die aminoterminalen bHLH/PAS-Domänen und die Rekrutierung von Paaren von NCoA-Proteinen, konnten jedoch eine direkte Interaktion nicht nachweisen. In unserer Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass die PAS-B-Domäne von NCoA-1 ein LXXLL-Motiv in der Transaktivierungsdomäne von STAT6 binden kann. Im Rahmen dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob eine Interaktion von Mitgliedern der NCoA-Proteinfamilie über die PAS-B-Domäne und eigene LXXLL-Motive vermittelt werden kann und welche physiologische Bedeutung die Interaktion von NCoA-Proteinen hat. Die Interaktion endogener NCoA-Proteine konnte in zwei verschiedenen Zelllinien nachgewiesen werden. Es konnte gezeigt werden, dass die PAS-B-Domänen aller drei NCoA-Familienmitglieder mit allen Volllängen-NCoA-Proteinen interagieren können und für eine solche Interaktion ausreichend sind. Dabei interagieren die PAS-B-Domänen spezifisch mit einer Region in der CBP-Interaktions-Domäne (CID/AD1) von NCoA-1, die zwei LXXLL-Motive und den vollständigen Bereich, der die Interaktion mit CBP vermittelt, enthält. Es zeigte sich, dass sich die Bindungsmotivspezifität der NCoA-1-PAS-B-Domäne von den Bindungsmotivspezifitäten der PAS-B-Domänen von NCoA-2 und NCoA-3 unterscheidet. Ebenso zeigten sich unterschiedliche Bindungsmotivspezifitäten für die Interaktion mit der CID/AD1 von NCoA-3, die nur mit der PAS-B-Domäne von NCoA-1 interagierte. Eine physiologische Bedeutung der charakterisierten PAS-B/CID/AD1-Interaktion auf die Bildung und Rekrutierung von Koaktivator-Komplexen wurde mittels Überexpressions-Experimenten untersucht, in denen dominant negative Effekte erwartet wurden. So führte die Überexpression der PAS-B-Domäne bzw. die Kompetition mit der CID/AD1 zur Inhibition der Interaktion von NCoA-1 mit dem Koaktivator CBP und dem Transkriptionsfaktor STAT6. Außerdem führte die stabile Überexpression der PAS-B-Domänen von NCoA-1 und NCoA-3 zu einer veränderten Expression des natürlichen endogenen Androgen-Rezeptor-Zielgenes PSA. Die in dieser Arbeit identifizierte Interaktion von NCoA-Proteinen stellt einen neuen und, zu den bisher bekannten Modellen der Koaktivator-Rekrutierung, ergänzenden Mechanismus dar. Dies gilt sowohl für eine postulierte inter- und intramolekulare Interaktion von NCoA-1 bei der STAT6-vermittelten Transkriptionsaktivierung, als auch für die durch nukleäre Hormonrezeptoren geforderte Rekrutierung von Paaren von NCoA-Proteinen. Zusammenfassend können die in dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse dabei helfen, das Verständnis der dynamischen Rekrutierung von Koaktivatoren bzw. Koaktivator-Komplexen und damit der Regulation der Genexpression, weiter zu verbessern.
Tumorerkrankungen, insbesondere solche im metastasierenden Stadium, erfordern effiziente Therapien. Krebstherapien wie Bestrahlung oder Chemotherapie wirken über die Induktion von Apoptose. Resistenz gegen diese Behandlungsansätze geht einher mit der Blockierung relevanter apoptotischer Signalwege. Dennoch haben Tumorzellen nicht grundsätzlich die Fähigkeit verloren, apoptotischen Zelltod zu sterben, d. h. mit einem geeigneten Stimulus kann in jeder Tumorzelle Apoptose induziert werden. In dieser Arbeit wurden Proteine entwickelt, die Enzyme apoptotischer Signalkaskaden selektiv in Tumorzellen einschleusen. Um Spezifität für transformierte Zellen zu erlangen, wurden diese Proteine mit Zellbindungsdomänen gekoppelt, die an tumorassoziierte Antigene binden. Als Zielstrukturen auf der Oberfläche von Krebszellen dienten die Rezeptoren der ErbB Familie „epidermal growth factor receptor“ (EGFR) und ErbB2. Überexpression dieser Rezeptoren wird auf einer Vielzahl von Tumoren epithelialen Ursprungs beobachtet und ist ursächlich beteiligt an der malignen Transformation. Als Apoptoseinduktoren wurden die Serinprotease Granzym B (GrB) sowie das Protein „apoptosis inducing factor“ (AIF) eingesetzt. GrB induziert Apoptose durch direkte Aktivierung von Caspasen und Spaltung zentraler Caspasen-Substrate. Damit greift die Protease am unteren Effektorende apoptotischer Signalwege ein und umgeht so die meisten Resistenzmechanismen transformierter Zellen. Um GrB in Tumorzellen einzuschleusen, wurde die Protease mit dem ErbB2 spezifischen Antikörperfragment scFv(FRP5) gekoppelt. Zunächst wurde eine biotinylierte Variante der Protease (bGrB) über die hochaffine Streptavidin/ Biotin Interaktion mit einem Fusionsprotein komplexiert, das aus dem scFv(FRP5) und Streptavidin besteht (SA-5). Komplexe aus enzymatisch aktivem bGrB und SA-5 wiesen selektive cytotoxische Aktivität gegenüber ErbB2 exprimierenden Zellen auf, die allerdings von der Präsenz des endosomolytischen Reagenz Chloroquin abhing. Dies zeigt die Notwendigkeit einer Translokation vom endosomalen Kompartiment, um internalisiertem GrB Zugang zu seinen cytosolischen Substraten zu ermöglichen. Aufbauend auf diesen Ergebnissen, die grundsätzlich nachweisen, daß das Einbringen von GrB in Tumorzellen ausreichend ist, um in diesen Zellen Apoptose zu induzieren, wurden Fusionsproteine abgeleitet, in denen GrB direkt mit Zellbindungsdomänen fusioniert ist. Neben dem scFv(FRP5) wurde auch der EGFR-Ligand TGFalpha eingesetzt. Fusionsproteine bestehend aus reifem GrB und scFv(FRP5) (GrB-5) bzw. TGFalpha (GrB-T) wurden in der Hefe Pichia pastoris exprimiert und mit hohen Ausbeuten gereinigt. GrB-5 und GrB-T zeigten enzymatische Aktivität und wiesen Affinität zu ErbB2 bzw. EGFR auf. In Gegenwart von Chloroquin zeigten GrB-5 und GrB-T selektive cytotoxische Aktivität gegenüber Zellen, die den jeweiligen Zielrezeptor exprimieren. Die IC50 Werte der Proteine lagen im pico- bis nanomolaren Bereich und sind damit vergleichbar mit denen rekombinanter Immun- bzw. Wachstumsfaktortoxine, die Exotoxin A (ETA) aus Pseudomonas aeruginosa als Effektor nutzen. Induktion von Apoptose erfolgte durch GrB-5 und GrB-T allerdings deutlich schneller (3 h) als durch ETA Fusionsproteine (72 h), da GrB im Gegensatz zu ETA direkt in apoptotische Signalkaskaden eingreift. Um die weitere Charakterisierung von GrB-5 und GrB-T zu erleichtern, wurden in der vorliegenden Arbeit Möglichkeiten für eine Optimierung der Expression dieser Fusionsproteine in Hefe untersucht. Dazu wurde eine Strategie entwickelt, die auf der Beobachtung beruht, daß die Löslichkeit und Stabilität von Proteinen durch Fusion mit solchen Domänen erhöht werden kann, die selbst eine hohe Löslichkeit und Stabilität besitzen. Ein Protein mit diesen Eigenschaften ist das Maltose Bindungsprotein (MBP) aus E. coli. In dieser Arbeit wurde MBP bei der Expression rekombinanter Proteine in P. pastoris eingesetzt, um die Ausbeute löslicher Proteine zu steigern. Es wurde eine Strategie entwickelt, die es erlaubt, MBP posttranslational in vivo vom Fusionspartner zu trennen. Hierzu wurde eine Erkennungssequenz der Protease Furin (furS) zwischen MBP und Fusionspartner eingefügt. Zunächst wurde untersucht, ob GrB als MBP Fusionsprotein in enzymatisch aktiver Form exprimiert werden kann, was eine Grundvoraussetzung für die Expression tumorspezifischer GrB Fusionsproteine in diesem System darstellt. Die Ausbeute von GrB konnte durch diese Strategie erheblich gesteigert werden. Daneben war eine vollständige Prozessierung der Fusionsproteine innerhalb der Furin-Erkennungssequenz nachweisbar. Als MBP Fusionsprotein exprimiertes GrB wies allerdings keine enzymatische Aktivität auf. Weitere Untersuchungen zeigten, daß das terminale Serin der furS-Sequenz, das nach Spaltung durch Furin am N-Terminus von GrB zurückbleibt, die enzymatische Aktivität der Serinprotease inhibiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher nicht weiter versucht, die Ausbeute an tumorspezifischen GrB Fusionsproteinen durch Fusion mit löslichen Proteindomänen zu erhöhen. Für Proteine, die ein N-terminales Serin tolerieren, stellt das hier entwickelte System allerdings eine neuartige Strategie dar, um die Ausbeute in P. pastoris um ein Vielfaches zu steigern. Dies wurde anhand von rekombinantem ErbB2 als Modellprotein bestätigt. Als alternativer Effektor in tumorspezifischen Fusionsproteinen wurde AIF als caspasenunabhängig agierendes proapoptotisches Signalmolekül eingesetzt. In apoptotischen Zellen bewirkt die Freisetzung von AIF aus dem mitochondrialen Intermembranraum die nachfolgende Translokation des Proteins in den Zellkern, woraufhin DNA-Fragmentierung induziert wird. Zum Einschleusen von AIF in Tumorzellen wurde das Flavoprotein mit dem scFv(FRP5) fusioniert (5-AIF). Um eine cytosolische Translokation von AIF zu erreichen, wurde ein Konstrukt abgeleitet, das zusätzlich die Translokationsdomäne von Exotoxin A enthält (5-E-AIF). Diese Domäne ist beim Wildtyp-Toxin notwendig für dessen retrograden Transport vom Endosom über den Golgi Apparat und das ER in das Cytosol. Innerhalb der Translokationsdomäne findet zudem eine Prozessierung durch die endosomale Protease Furin statt. AIF Fusionsproteine wurden in E. coli exprimiert, gereinigt und renaturiert. Die Proteine wiesen Affinität für ErbB2 auf und interagierten mit DNA, eine Eigenschaft, die essentiell für die proapoptotische Aktivität von AIF ist. 5-E-AIF zeigte gegenüber ErbB2 exprimierenden Zellen cytotoxische Aktivität, die vergleichbar mit der des Immuntoxins scFv(FRP5)-ETA war. Diese Aktivität war allerdings nur in Gegenwart von Chloroquin gegeben. Das Protein 5-AIF, in dem die Translokationsdomäne fehlt, zeigte auch in Kombination mit Chloroquin keine Cytotoxizität. Eine mögliche Folgerung hieraus ist, daß die N-terminale Antikörperdomäne der Fusionsproteine die proapoptotische Aktivität der AIF Domäne blockiert. 5-E-A wird sehr wahrscheinlich durch die endosomale Protease Furin „aktiviert“, die den scFv(FRP5) durch proteolytische Spaltung innerhalb der ETA-Domäne entfernt haben könnte. Für die eigentliche Translokation reicht der ETA-Anteil allerdings nicht aus, wahrscheinlich, weil in dem hier abgeleiteten Konstrukt ein für die Funktionsweise des Wildtyp-Toxins essentielles ER Retentionssignal fehlte. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, daß durch Einsatz apoptotischer Signalmoleküle in tumorzellspezifischen Fusionsproteinen hohe und selektive cytotoxische Aktivitäten erzielt werden können. Eine weitere Entwicklung dieser Proteine als mögliche Tumortherapeutika erscheint daher sinnvoll.
Im Rahmen der vorliegenden Dissertation sollte der Sphingolipid-Biosyntheseweg der Hefe Pichia ciferrii näher charakterisiert werden, um die Entwicklung einer fermentativen Route zur Sphingosin-Produktion zu ermöglichen. Darüber hinaus galt es patentierbare Selektionssysteme für diese Hefe zu etablieren. Durch Sequenzvergleiche mit nahe verwandten Hefen und das Ableiten degenerierter Primer wurden elf für die Sphingolipid-Biosynthese von Pichia ciferrii relevante Gene isoliert und sequenziert: LCB1 (codiert für eine UE der Serin-Palmitoyltransferase), TSC10 (3-Ketosphinganin-Reduktase), LAG1 und LAF1 (Ceramid-Synthasen), LIP1 (UE der Ceramid-Synthasen), DES1 (Dihydroceramid-delta4-Desaturase), YXC1 (Ceramidase), 8DES (Sphingolipid-delta8-Desaturase), 9MTR (Sphingolipid-C9-Methyltransferase), GCS1 (Ceramid-Glycosyltransferase) und LCB4 (LCB-Kinase). Bioinformatische Analysen, sowie in vivo-Experimente dienten der Einordnung der korrespondierenden Genprodukte in den Stoffwechselweg. Die Bestimmung der Substratspezifität einzelner Enzyme aus der Sphingolipid-Biosynthese erfolgte durch Überexpression der korrespondierenden Gene und anschließende Analyse des Einflusses auf die Zusammensetzung der Sphingolipidfraktion von Pichia ciferrii. Zusammengenommen wurde durch die Ergebnisse ein deutlich geschärftes Bild der Biosynthese von Sphingolipiden in Pichia ciferrii erstellt. Die gewonnenen Erkenntnisse über die Sphingolipid-Biosynthese in Pichia ciferrii fanden Anwendung auf die rationale Stammentwicklung eines Sphingosin-Produzenten. Durch die kombinierte Überexpression der die Dihydroceramid-delta4-Desaturase aus Pichia ciferrii, die Ceramid-Synthase aus Coccolithovirus und eine alkalische Ceramidase aus Mus musculus kodierenden Gene wurde eine 8,5-fache Erhöhung der Sphingosin-Konzentration von 7,5 mg/L in vom Wildtyp abgeleiteten Syringomycin-E-resistenten Stämmen auf 64,0 mg/L erzielt. Die Codon-Optimierung der heterolog exprimierten Gene zur Anpassung an die sehr eingeschränkte Codon-Verwendung von Pichia ciferrii erwies sich hierbei als essentiell. Zur Nutzbarmachung von rekombinanten Pichia ciferrii-Stämmen für die industrielle Anwendung wurden darüber hinaus drei neue Selektionssysteme etabliert. Zum einen wurde eine codon-optimierte Form des nat1-Gens genutzt, um eine Nourseothricin-Resistenz zu vermitteln. Zum anderen wurden stabile Uracil- bzw. Lysin-auxotrophe Pichia ciferrii-Stämme erzeugt, die mittels eines entsprechenden Integrationsvektors mit den Auxotrophie-Markergenen URA3 bzw. LYS2 aus Pichia ciferrii zu prototrophen Stämmen komplementiert werden konnten. Zusammengenommen mit der ersten gezielten Disruption eines Gens in Pichia ciferrii (SYR2, codiert für die Sphinganin-Hydroxylase) konnte somit auch die molekularbiologische Handhabbarkeit von Pichia ciferrii deutlich verbessert werden.
Bei inflammatorischen Schmerzen kann durch Hemmung der COX-2 im Rückenmark die zentrale Sensibilisierung reduziert werden. Da die Hemmung der gesamten COX-2 vermittelten Prostaglandinsynthese jedoch zahlreiche unerwünschte Nebenwirkungen verursacht, wird in jüngster Zeit diskutiert, ob eine selektive Hemmung der PGE2 Synthese auf Ebene der mPGES-1 für die Therapie passagerer Schmerzen sinnvoller ist. Um die funktionellen Rollen von COX-2 und mPGES-1 im Rückenmark zu charakterisieren, wurden in der vorliegenden Arbeit die Folgen einer COX-Inhibierung und mPGES-1-Deletion auf den spinalen Eicosanoidmetabolismus, die neuronale Erregbarkeit, die Synthese proinflammatorischer Zytokine und das nozizeptive Verhalten untersucht. Das proinflammatorische Zytokin TNFa induzierte in primären Rückenmarksneuronen eine COX-2- und mPGES-1-Expression und eine erhöhte PGE2 Synthese. Diese Induktion der PGE2 Synthese konnte durch den selektiven COX-2 Inhibitor Rofecoxib und den „selektiven COX-1 Inhibitor“ SC-560 gleichermaßen potent gehemmt werden. Da der Effekt von SC-560 unerwartet war, wurde sein Wirkmechanismus genauer untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass SC-560 in Rückenmarkskulturen weder die COX-2 und mPGES-1 Expression, die PLA2 Aktivität, die mPGES-1 Aktivität noch den PGE2 Transport hemmte. Durch Experimente mit Zellen aus COX-1-/- Mäusen konnte gezeigt werden, dass SC-560 in Rückenmarkskulturen die COX-2 unabhängig von COX-1 in nanomolaren Konzentrationen inhibiert. Da dieses Ergebnis den postulierten COX-1-selektiven Eigenschaften von SC-560 widersprach, wurde nach der Ursache für den Verlust der COX-1-Selektivität gesucht. Es zeigte sich, dass SC-560 in einer zellfreien in vitro Synthese und im Vollbluttest mit klarer Selektivität COX-1 hemmt. In kultivierten Rückenmarkszellen, RAW-Makrophagen und Blutzellen (Monozyten und Thrombozyten) inhibiert SC-560 allerdings d beide COX-Isoformen potent. Es wurde dadurch deutlich, dass die zelluläre Einbindung von COX-2 sowie ein niedriger Proteingehalt im extrazellulären Medium die halbmaximalen Konzentrationen (IC50) für die COX-2-Hemmung durch SC-560 stark reduzieren kann und hierdurch die COX-1-Selektivität der Substanz verloren geht. Neben einer COX-2 Hemmung verursachte auch eine mPGES-1-Deletion in Rückenmarkskulturen sowie im adulten Rückenmark eine Reduktion der PGE2 Synthese. Überrachenderweise bewirkte jedoch die mPGES-1-Defizienz im Gegensatz zur COX-2 Hemmung durch Etoricoxib im Zymosanmodell keine Reduktion der mechanischen Hyperalgesie. Um die Ursache für die unterschiedliche antihyperalgetische Wirkung der COX-2-Hemmung und mPGES-1-Deletion zu finden, wurden zunächst die Konsequenzen für die gesamte Prostaglandinsynthese untersucht. Die Analyse mittels LC-MS/MS zeigte, dass im Rückenmark mPGES-1-defizienter Mäuse verstärkt PGI2, PGF2a und PGD2 synthetisiert wird. Da für alle drei Prostaglandine bereits pronozizeptive Effekte beschrieben wurden, wurde die Expression von den entsprechenden Rezeptoren im Rückenmark und die Konsequenzen der Rezeptoraktivierung auf die neuronale Erregbarkeit untersucht. Mittels „calcium imaging“ wurde demonstriert, dass selektive IP Rezeptoragonisten in Rückenmarksneuronen eine PKA und PKC vermittelte Phosphorylierung der NMDA Rezeptoren verursachen und die Aktivierbarkeit der NMDA Rezeptoren sensibilisieren. Eine Verstärkung des NMDA induzierten Calciumeinstromes konnte nach Applikation der anderen Prostaglandine nicht beobachtet werden. Die Ergebnisse zeigen daher, dass in mPGES-1-defizienten Mäusen durch die Umleitung der Prostaglandinsynthese zu Prostacyclin die exzitatorischen NMDA Rezeptoren sensibilisiert und hierdurch die antihyperalgitische Wirkung von PGE2-Synthesehemmung kompensiert werden kann. Zusammenfassend lässt sich aus den Ergebnissen schlussfolgern, dass mPGES-1 als Zielmolekül für die Schmerztherapie eher nicht eignet ist. mPGES-1-defiziente Tiere zeigten in inflammatorischen Schmerzmodellen ein normales nozizeptives Verhalten. Dies kann dadurch erklärt werden, dass es nach einer mPGES-1 Deletion im Rückenmark zwar zur Reduktion der PGE2 Synthese aber auch gleichzeitig zur verstärkten Synthese anderer pronozizeptiv wirkender Prostaglandine kommt.
Lineare sowie zyklische 3-Alkylpyridinalkaloide sind vor allem in Schwämmen der Ordnung Haplosclerida, zu der auch Haliclona viscosa zählt, weit verbreitet. Die Synthese der zuvor von C. Volk isolierten Haliclamine C und D, des Viscosamins und des Viscosalin C bildete den Ausgangspunkt dieser Arbeit.[1-4] Sie erfolgte ausgehend von den bekannten Synthesen der Cyclostellettamine und Haliclamine[5-7] und gliedert sich in drei Abschnitte: erstens Synthese eines ω-Hydroxyalkylpyridins aus einem Bromalkohol, zweitens Funktionalisierung der Monomere in Abhängigkeit der gewählten Methode zur Di- bzw. Trimerisierung und drittens Verknüpfung und gegebenenfalls Zyklisierung. Durch Anwendung und Weiterentwicklung der bekannten Synthesewege wurden so insgesamt 14 lineare Monomere, zwei zyklische Monomere, 16 Cyclostellettamine, zwei Isocyclostellettamine, sieben Haliclamine, fünf Viscosaline sowie Viscosamin[8] und ein Analogon mit Heptylkette hergestellt. Dieser synthetische Zugang ermöglichte es, sowohl den finalen Strukturbeweis für die zuvor isolierten Verbindungen zu erbringen, als auch durch die Analyse der Fragmentierungs-muster von synthetischen und natürlichen Verbindungen mehr über das Verhalten dieser Verbindungen unter MS-Bedingungen zu erfahren. Die so gewonnenen Erkenntnisse führten dazu, dass drei unbekannte Verbindungen ohne Isolierung der Reinsubstanz mit einer Kombination von MS- und HPLC-Daten identifiziert werden konnten. So konnten das erste monozyklische 3-Alkylpyridinalkaloid marinen Ursprungs und zwei neue Haliclamine identifiziert und synthetisiert werden Des Weiteren gelang es, für die von C. Volk isolierten, jedoch nicht identifizierten Verbindungen Strukturen zu ermitteln bzw. auf Grund der MS-Daten Strukturvorschläge zu machen. Die durch den synthetischen Zugang große Anzahl verfügbarer 3-Alkylpyridinalkaloide ermöglichte außerdem eine systematische Untersuchung über den Zusammenhang von biologischer Aktivität und Struktur. Die Ergebnisse der am Helmholtz Institut für Infektionsforschung durchgeführten Experimente zu den antibakteriellen sowie cytotoxischen Eigenschaften von natürlichen wie auch rein synthetischen 3-Alkylpyridinalkaloiden zeigten, dass die Aktivität sich schon beim Addieren bzw. Subtrahieren einer Methylengruppe in einer Alkylkette signifikant ändert. [1] C. A. Volk, M. Köck, Org. Lett. 2003, 5, 3567-3569. [2] C. A. Volk, M. Köck, Org. Biomol. Chem. 2004, 2, 1827-1830. [3] C. A. Volk, H. Lippert, E. Lichte, M. Köck, Eur. J. Org. Chem. 2004, 3154-3158. [4] C. A. Volk, Dissertation, Johann Wolfgang Goethe Universität (Frankfurt am Main), 2004. [5] A. Grube, C. Timm, M. Köck, Eur. J. Org. Chem. 2006, 1285-1295 und Referenzen darin. [6] J. E. Baldwin, D. R. Spring, C. E. Atkinson, V. Lee, Tetrahedron 1998, 54, 13655-13680. [7] A. Kaiser, X. Billot, A. Gateau-Olesker, C. Marazano, B. C. Das, J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 8026-8034. [8] C. Timm, M. Köck, Synthesis 2006, 2580-2584.
Glycin ist ein wichtiger inhibitorischer Neurotransmitter im zentralen Nervensystem. Um die glycinerge Erregungsübertragung zu sichern, muss die Glycinkonzentration an Synapsen präzise reguliert werden. Hierfür sind die Glycintransporter, GlyT1 und GlyT2, verantwortlich. Der GlyT2 ist ein präsynaptisches Protein, das in glycinergen Nervenendigungen nahe der aktiven Zone lokalisiert ist. Das über den Transporter aus dem extrazellulären Raum aufgenommene Glycin steht anschließend für die Befüllung der synaptischen Vesikel durch den vesikulären inhibitorischen Aminosäuretransporter (VIAAT) zur Verfügung. Die GlyT2-Defizienz führt in Mäusen zu einem letalen Phänotyp und verdeutlicht die Notwendigkeit eines hochaffinen Glycinaufnahmesystems in glycinergen Neuronen. Um mögliche Mechanismen zu untersuchen, die zur präzisen Lokalisation des GlyT2 in der Präsynapse führen, wurde das PDZ-Domänenbindungsmotiv (PDZ-DBM) am extremen C-Terminus bzw. die lange N-terminale Domäne dieses Transporters deletiert. Durch biochemische und pharmakologische Analysen von transfizierten HEKT-Zellen konnte gezeigt werden, dass der Verlust des PDZ-DBM oder der N-terminalen Domäne die Proteinexpression, die Glykosylierung und die Transportaktivität des GlyT2 nicht beeinflussten. Längere Deletionen des N-Terminus (ΔAA1-184) setzten jedoch die Effizienz der Glycinaufnahme herab und ergaben im Vergleich zum wt-Protein einen um 60% reduzierten vmax-Wert, während die apparente Glycinaffinität (KM-Wert) unverändert blieb. Lokalisationsstudien und Oberflächenbiotinylierungen zeigten GlyT2 wt-Immunreaktivität an der Plasmamembran, die sich qualitativ und quantitativ nicht von denen der N- und C-terminalen Mutanten unterschied. Das PDZDBM und die N-terminale Domäne spielen folglich in der Prozessierung und der Transportfunktion des GlyT2 eine untergeordnete Rolle. Möglicherweise reduziert die fast vollständige Deletion der N-terminalen Domäne jedoch die Stabilität des GlyT2. In transfizierten hippocampalen Neuronen wurde der Einfluss des PDZ-DBM und der N-terminalen Domäne hinsichtlich der GlyT2 Lokalisation analysiert. Die transfizierten Mutantenproteine zeigten eine diffuse Verteilung mit partiellen Anreicherungen von GlyT2-Immunreaktiviät. Das wt-Protein kolokalisierte mit Synaptophysin, exzitatorischen synaptischen Markern wie PSD95 und mit den inhibitorischen Markern Gephyrin und VIAAT. Nach Deletion des PDZ-DBM hingegen zeigte der GlyT2 eine um ca. 50% verminderte Kolokalisation mit allen untersuchten synaptischen Markern. Damit konnte hier erstmals eine Funktion des PDZ-DBM für die Anreicherung von GlyT2 an Synapsen gezeigt werden. Mit N-terminalen Deletionsmutanten transfizierte hippocampale Neurone wiesen kolokalisierende GlyT2ΔN-PSD95-Puncta zumeist in MAP2-positiven Neuriten auf, während das wt-Protein zumeist in MAP2-negativen Neuriten kolokalisierte. MAP2 ist ein mikrotubuli-assoziertes Protein, das in Dendriten, aber nicht in Axonen, auftritt und somit eine Unterscheidung derselben ermöglicht. Aufgrund der Überexpression in transfizierten Neuronen war die GlyT2-Immunreaktivität aber sowohl in axonalen als auch dendritischen Neuriten zu beobachten. Zusätzlich zu der in größeren Clustern gefundenen synaptischen GlyT2ΔN-Immunreaktivität war eine Färbung hauptsächlich in sehr kleinen Strukturen (<= 1 μm) nachzuweisen, die Transportvesikeln entsprechen könnten. Dies ist mit einem längeren Verbleib der Deletionsmutanten in intrazellulären Strukturen erklärbar. Im Hippocampus wird GlyT2 endogen nur sehr schwach in einer Subpopulation von putativ glycinergen Neuronen exprimiert. Um die Lokalisation der N-terminalen GlyT2-Proteine in Zellen zu untersuchen, die eine hohe endogene GlyT2-Expression aufweisen, wie spinalen Neuronen, die sich aber nur schlecht transfizieren lassen und in Kultur keine adulte GlyT2-Lokalisation aufweisen, wurden BAC-transgene Mäuse generiert, die myc-markierte GlyT2ΔN-Proteine unter Kontrolle des GlyT2-Promotors exprimieren. Der Vorteil von BAC-transgenen Mauslinien ist, dass sie aufgrund der Verwendung des endogenen Promotors das Transgen nur schwach überexprimieren. Founder-Mäuse, in denen der jeweilige modifizierte BAC-Klon (mGlyT2 wt, ΔAA14-174 oder ΔAA14-184) integriert wurde, wurden identifiziert und mit C57BL/6J-Mäusen verpaart, um so transgene Mauslinien zu etablieren und die Lokalisation der mutierten GlyT2-Proteine zu analysieren. Zusätzlich wurde eine BAC-transgene Cre-Mauslinie generiert, die die Cre-Rekombinase in GlyT2-positiven Zellen exprimiert. Durch die Verpaarung mit konditionalen oder transgenen Mauslinien soll mit diesen GlyT2/Cre-Mäusen die Funktion einzelner Genprodukte in glycinergen Zellen untersucht werden. In dieser Arbeit wurden außerdem die Glycinrezeptor (GlyR) α-Untereinheiten (UE) in GlyT2-defizienten Mäusen untersucht. GlyT2 -/- Tiere sterben in der zweiten postnatalen Woche nach der Geburt und zeigen einen starken neuromotorischen Phänotyp. Da in demselben Zeitraum ein Austausch der embryonalen α2- durch die adulte α1-UE erfolgt, wurde die Entwicklung der α1- und der Gesamt-α- Immunreaktivität in Rückenmarksschnitten von wt und GlyT2 -/- Tieren analysiert und miteinander verglichen. Die Daten zeigen, dass der α-UE-Austausch in den GlyT2-defizienten Tieren ähnlich wie in wt Tieren erfolgt. In α1-GlyRs ist die Öffnungszeit des aktivierten Kanals kürzer als bei α2-GlyRs. Zusammen mit der geringeren Ausschüttung an Glycin aufgrund der GlyT2-Defizienz lässt sich so das Auftreten des Krampf-Phänotyps der GlyT2 -/- Mäuse nach erfolgtem UE-Austausch erklären.
Untersuchungen zur molekularen Kontrolle der Kupferhomöostase in dem Ascomyceten Podospora anserina
(2007)
Das essentielle Spurenelement Kupfer ist Co-Faktor mehrerer Schlüsselenzyme (z B. Cu/Zn-SOD, Cytochrom c Oxidase). Da Kupfer leicht Elektronen aufnehmen und abgeben kann, eignet es sich besonders gut für Redox-Reaktionen. Wenn Kupfer jedoch mit Sauerstoff reagiert, entstehen hoch cytotoxische reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die nach der „freien Radikaltheorie des Alterns“ (nach D. Harman 1956) ursächlich für Alterung und Zelltod sind. Um deren Bildung zu vermeiden, erfolgen alle Aspekte des Kupferstoffwechsels – Aufnahme, Transport und Speicherung - stets proteingebunden. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass sich bis auf drei Ausnahmen die gesamte bislang bekannte Maschinerie der molekularen Kupferhomöostase aus anderen Modellorganismen (z.B. S. cerevisiae oder H. sapiens) auch im Genom des Ascomyceten Podospora anserina mit Homologen bzw. Orthologen wiederfindet. Die drei Ausnahmen betreffen jeweils Proteine, für die in anderen Organismen mehrere Isoformen existieren und P. anserina nur jeweils ein Homolog/Ortholog besitzt. Für mehrere der neu vorhergesagten Gene (PaAtx1, PaCcc2, PaCcs1, PaCox11, PaCox19, PaCox23, PaSco1) konnte eine Expression im Wildstamm nachgewiesen werden. Dazu wurden Standardtechniken (Northern Blot Analyse, RT-PCR) und auch neu etablierte eGFP-Reporterkonstrukte verwendet. In Podospora anserina scheint Kupfer auf zwei verschiedene Arten Einfluss auf die Lebensspanne zu nehmen: Zum einen mittelbar darüber, dass die Verfügbarkeit von Kupfer über die in der mitochondrialen Atmung verwendete Endoxidase entscheidet. Bei Kupfermangel wird eine Eisen-abhängige alternative Oxidase (AOX) induziert. Durch Atmung über die AOX entstehen weniger ROS, was die Lebensspanne verlängert. Anhand einer Vielzahl langlebiger Mutanten konnte dieser Zusammenhang bereits mehrfach demonstriert werden. Zum anderen scheint Kupfer auch eine unmittelbare Rolle in der Seneszenz von P. anserina zu spielen. In früheren Arbeiten konnten mehrere indirekte Hinweise (Transkript- und Aktivitätsanalysen) gesammelt werden, dass im Alter die cytoplasmatische Kupferkonzentration drastisch ansteigt. Durch Messung der Kupferkonzentration mittels einer direkten chemisch-analytische Methode (TXRF) in fraktionierten Zellbestandteilen (Cytoplasma und Mitchondrien) konnten in dieser Arbeit diese Hinweise weiter untermauert werden. Experimente mit in die mitochondriale Matrix geleitetem eGFP brachten zusätzliche Indizien dafür, dass das mitochondriale Kupfer-Reservoir die Quelle des sich in seneszenten Pilzstämmen im Cytoplasma wiederfindenden Kupfers ist. Durch einen Prozess, der größenabhängig reguliert und in anderen Organismen als „Mitochondrial Permeability Transition – MPT“ zu Beginn der Apoptose bekannt ist, ergiesst sich beim Eintritt in die Seneszenz der Inhalt der mitochondrialen Matrix in das Cytosol. Die Bedeutung dieses Vorgangs und v.a. die Folgen der Umverteilung von Kupfer innerhalb der Zelle bleiben im Detail weiter zu klären. Durch die durchgeführten Arbeiten konnte ein weiterer deutlicher Beweis für das Ablaufen apoptotischer Mechansimen im Alterungsprozeß des Ascomyceten P. anserina erbracht werden.
Zur Rolle der Typ-I-Interferone in der Abwehr von viralen Infektionen des zentralen Nervensystems
(2007)
Das zentrale Nervensystem (ZNS) bildet eine einzigartige Umgebung für Immunantworten, da Neuronen eine essentielle und in weiten Teilen nicht-erneuerbare Zellpopulation bilden. Virale Infektionen des ZNS und lokale anti-virale Immunantworten können zu dem Verlust von Neuronen und somit zu katastrophalen Erkrankungen führen. Unter normalen Bedingungen ist das ZNS weitgehend von der Kontrolle durch das Immunsystem ausgeschlossen. In diesem Zusammenhang wurde das ZNS oft auch als „immunprivilegiert“ bezeichnet. Dieses Konzept musste in den letzten Jahren revidiert werden, da es sich gezeigt hat, dass das ZNS nicht völlig vom Immungeschehen isoliert ist. Wichtige Mediatoren antiviraler Immunantworten sind die Typ I Interferone (IFN). Die verschiedenen Typ I IFN binden an einen gemeinsamen Rezeptor, den Typ I Interferon-rezeptor (IFNAR). Die Bedeutung von Typ I IFN Antworten für die Kontrolle viraler Infektionen wurde besonders eindrucksvoll mit IFNAR-defizienten Mäusen (IFNAR-/-) gezeigt. Nach Infektion mit dem neurotropen Vesikulären Stomatitis Virus (VSV) führt das Fehlen des IFNAR zu einer stark erhöhten Empfänglichkeit für tödlich verlaufende Infektionen. In allen Organen und besonders im ZNS von VSV infizierten IFNAR-/- Tieren fanden sich stark erhöhte Virusmengen. Um zu untersuchen, ob die VSV-Infektion des zentralen Nervensystems in IFNAR-/- Mäusen in erster Linie auf ein Versagen der peripheren Immunität oder des IFN Systems innerhalb des ZNS zurückzuführen ist, wurden mittels der Cre loxP Tech-nologie Mäuse hergestellt, die auf allen peripheren Zellen IFNAR exprimieren, während die Neuronen des ZNS IFNAR defizient sind (NesCre+/-IFNARflox/flox). Nach intranasaler VSV Infektion zeigten NesCre+/-IFNARflox/flox Mäuse zunächst keine Krankheitssymptome. Nach 5 bis 6 Tagen traten aber aufsteigende und halbseitige Lähmungen auf, so dass die infizierten Tiere verstärkt im Kreis liefen und schließlich verstarben. Im Vergleich dazu verstarben IFNAR-/- Mäuse bereits nach 2 bis 3 Tagen während normale C57BL/6 Tiere nach Infektion keine Symptome zeigten und überlebten. Der beobachtete Krankheitsverlauf lässt in den IFNAR-/- Mäuse auf ein Multiorganversagen als Todesursache schließen. 3 und 6 Tage nach Infektion konnte in den Organen von C57BL/6 Tieren kein Virus reisoliert werden. In den NesCre+/ IFNARflox/flox Tieren fanden sich zum Todeszeitpunkt nur im Gehirn Viruspar-tikel, während alle anderen Organe virusfrei waren. Die Virustiter im Hirn waren im Vergleich zu den IFNAR-/- Mäusen 10- bis 100-fach erhöht. In den anderen Organen und im Blut sind keine Viruspartikel nachweisbar. Dieser Befund deutete gemeinsam mit den beobachteten Krankheitsverläufen auf eine neuropathologische Symptomatik hin, bei der es wahrscheinlich zu einer VSV-Infektion des Hirnstammes kam. Die Analyse einzelner Regionen des ZNS zeigte in IFNAR-/- Tieren, dass 2 Tage nach Infektion in allen Regionen des ZNS signifikante Virusmengen zu finden waren. In den NesCre+/-IFNARflox/flox und den C57BL/6 Tieren fanden sich zu diesem Zeitpunkt nur im Riechhirn (Bulbus olfactorius) signifikante Virustiter. In den C57BL/6 Tieren blieb das Virus auf diese Region beschränkt und wurde dort innerhalb von 6 Tagen eliminiert. In den NesCre+/-IFNARflox/flox Tieren kam es in den folgenden Tagen jedoch zu einer fortschreitenden Infektion des ZNS, und auch das Großhirn, das Kleinhirn, der Hirn-stamm und das Rückenmark zeigten hohe Virustiter. In der Induktion peripherer Immunantworten unterschieden sich NesCre+/-IFNARflox/flox und C57BL/6 Mäuse nicht. In den WT Tieren kam es im Gegensatz zu den NesCre+/ IFNARflox/flox und IFNAR-/- Tieren innerhalb von 48 Stunden nach Infektion im Riechhirn zu einer Typ I IFN abhängigen Phosphorylierung von STAT-1, einer Komponente des IFNAR-Signaltransduktionsweges. Alles deutet darauf hin, dass die Induktion geringer Mengen Typ I IFN innerhalb des Riechhirns notwendig ist, um Im-munantworten zu aktivieren, die ein Übergreifen der Virusinfektion auf andere Regio-nen des ZNS verhindern. Eine funktionierende Immunität in der Peripherie und die Blut-Hirn-Schranke scheinen nicht ausreichend zu sein, um eine Infektion des ZNS mit VSV zu verhindern. Stattdessen muss es zur Aktivierung von IFN-abhängigen Mechanismen innerhalb des Riechhirns kommen, die ein Übergreifen der VSV Infektion auf andere Hirnregionen verhindert und zur Elimination von VSV im Riechhirn beiträgt.
Humane hämatopoetische Stammzellen (HSCs) besitzen die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und übernehmen die kontinuierliche Neubildung aller zellulären Bestandteile des Blutes. Aufgrund der zunehmenden klinischen Bedeutung der HSCs ist es essentiell die molekularen Mechanismen, die den Prozess der Vermehrung und Differenzierung von humanen hämatopoetischen Stammzellen steuern, aufzuklären und deren funktionelle Bedeutung zu verstehen. Das Ziel der Arbeit war die Identifizierung, Charakterisierung und gerichtete Modulation funktionell relevanter Signalwege, die am Differenzierungsprozess von HSCs zu myeloiden Effektorzellen beteiligt sind. Für diese Untersuchung wurde ein Expansionsprotokoll für humane HSCs, sowie ein Differenzierungsprotokoll für das humane myeloide DC Differenzierungsmodell entwickelt. In der Arbeit wurden drei wichtige Signalwege der Zelle, die Mitogenen Signalkaskade (MAPK), Protein Kinase C (PKC) gekoppelten Prozessen und dem JAK/STAT Signalweg untersucht. Die vorliegende Arbeit zeigt, daß die Stimulation der HSCs mit GM-CSF und IL-4 zu einer zeitlich begrenzten Aktivierung von MAPK/ERK1/2, PKC delta, JAK2, sowie STAT5 und STAT6 führte. Kommerzielle Inhibitoren von MEK, PKC und Januskinase hemmten selektiv diese Aktivierung und führten zu einer veränderten Hämatopoese. Die Aktivierung dieser Signalwege ist daher für die myeloide Differenzierung von HSCs zu Dendritischen Zellen von entscheidender Bedeutung. Einer der entscheidenden nuklearen Faktoren für die myeloide Differenzierung ist der Ets-Transkriptionsfaktor PU.1, dessen Aktivität durch Phosphorylierung reguliert sein könnte. Obwohl die funktionelle Rolle von PU.1 in der Differenzierung von HSC in der vorliegenden Arbeit nicht vollständig geklärt werden konnte, wurde jedoch erstmals im in vitro Kinase-Assay gezeigt, daß PU.1 durch PKC delta, aber nicht durch MAPK/ERK2 spezifisch phosphoryliert wird. In einem PU.1-spezifischen Luciferasereporter-Assay wurde die transkriptionelle Aktivität von PU.1 durch die Inhibition von PKC delta und MAPK/ERK1/2 deutlich reduziert. Weiterführende Experimente in einem komplexen Differenzierungsmodell von humanen HSCs wiesen darauf hin, daß durch den gezielten Einsatz von Signalweginhibitoren eine Verschiebung der Verhältnisse der gebildeten Blutzellkolonieformen erreicht werden kann. So war die Differenzierung zu Erythrozyten von der Mitogenen Signalkaskade unabhängig, wohingegen die Differenzierung zu Makrophagen eine deutliche Abhängigkeit von der Aktivität der Mitogenen Signalkaskade sowie von der Aktivierung des Protein Kinase C Signalwegs zeigte. Im Gegensatz dazu führte die Inhibition der Januskinasen (JAKs) zu einer Hemmung der Differenzierung in allen Kolonieformen. Insgesamt zeigten die Ergebnisse, daß der MAPK/ERK und PKC delta Signalweg bei der Differenzierung von humanen hämatopoetischen Stammzellen eine wichtige Rolle spielen und eine gerichtete Steuerung der Differenzierung durch den Einsatz spezifischer Signalweginhibitoren möglich erscheint.
Seit der Einführung der antiretroviralen Therapie (HAART) ist die Mortalität von HIV-Infizierten in der westlichen Welt zwar deutlich zurückgegangen, die HIV-Infektion ist jedoch bis heute nicht heilbar. Die derzeitige Therapie unterdrückt zwar sehr effektiv die Virusreplikation, kann aber nicht das Virus vollständig eliminieren und somit die Infizierten nicht heilen. Die daher notwendige Langzeitbehandlung wird wiederum durch die relativ hohe Toxizität der Medikamente und durch das Auftreten resistenter Virusvarianten limitiert. Die Suche nach neuen Therapienansätzen und Wirkstoffklassen ist daher immer noch von größter Wichtigkeit. Die HIV-Gentherapie stellt neben der konventionellen antiretroviralen Therapie eine mögliche zusätzliche Behandlungsform dar. Die Arbeitsgruppe von Laer hat am Georg-Speyer-Haus retrovirale Vektoren entwickelt, die membrangebundene (ma) HIV-Eintrittsinhibitoren, sog. C Pepitde, kodieren. Das durch den Prototyp-Vektor M87 kodierte maC36-Peptid zeigte eine moderate Inhibition des Viruseintritts. In einem Optimierungsprozess wurde der Vektor M87o generiert. M87o kodiert im Vergleich zu M87 ein wirksameres maC-Peptid (maC46) und weist auch eine wesentlich höhere Expressionsstärke und dadurch eine stärkere inhibitorische Wirkung als der Prototypvektor auf. Ziel dieser Arbeit war es zunächst, HIV Varianten, die resistent gegenüber dem M87o–Genprodukt maC46 sind, in vitro zu generieren und anschließend den Resistenzmechanismus aufzuklären. In einer Kollaboration mit der Gruppe um M. Dittmar aus Heidelberg war durch Passage des HIV 1 Wildtyp (wt) Ba L-Isolats auf M87-transduzierten Zellen bereits das maC36-resistente Virusisolat Ba L_sel_MD generiert worden. Ba L_sel_MD wies zwei Resistenzmutationen in der gp41-Untereinheit des Hüllproteins auf: I556V (heptad repeat 1 Region) und N634K (heptad repeat 2 Region). Für die Mutation 634K war dabei gezeigt worden, dass sie auch zu einer leichten Reduktion der maC46-Sensibilität führt. In der vorliegenden Arbeit diente Ba L_sel_MD als Ausgang für die Selektion einer Virusvariante mit deutlich verminderter Sensibilität gegenüber maC46. Hierfür wurde Ba L_sel_MD über 149 Tage lang auf Zellen mit steigender maC46 Expressionshöhe passagiert und so das Isolat Ba L_FH1 generiert. Das Hüllprotein des selektierten Isolats war ausreichend, um einen maC46-resesistenten Phänotyp hervorzurufen. Das selektierte Hüllprotein war im Vergleich zu dem Ausgangsisolat ca. fünf- bis zehnfach weniger empfindlich gegenüber maC46. Die Sequenzierung des Ba L_FH1 Hüllproteingens zeigte, dass die Aminosäureausprägung an Position 634 des Ausgangsisolats (BaLsel_MD) konserviert worden war, während die Position 556 zur Wildtypsequenz revertiert war. Darüber hinaus wurden drei Mutationen in der gp120-Untereinheit des Hüllproteins (V2-Region (I187T), V3-Region (N305Y), C3-Region (E352K)), sowie eine Mutation in der heptad repeat 1 Region (A579T) der gp41-Untereinheit identifiziert. Für die reduzierte maC46-Empfindlichkeit waren in erster Linie die Mutation N305Y in der V3 Region und die Rückmutation 556I in Zusammenwirkung mit der bereits vorhandenen Mutation 634K verantwortlich. Die verbleibenden Mutationen hatten allenfalls modulierende Wirkung auf die maC46-Sensibilität. Die Resistenz ist vermutlich auf die beobachtete erhöhte Fusionsgeschwindigkeit des Hüllproteins von Ba L_FH1 im Vergleich zum Ausgangsisolat zurückzuführen, die interessanterweise mit einer reduzierten Corezeptoraffinität verknüpft war. Die erhöhte Fusionsgeschwindigkeit verkürzt das zeitliche Fenster, in welchem maC46 an seine Zielstruktur innerhalb des gp41 binden kann. Es scheinen zwei unterschiedliche Phasen des Eintrittprozesses durch die Mutationen verändert worden zu sein. Die Mutation in der V3-Region (N305Y) der gp120-Untereinheit beschleunigt wohl eine frühe Phase. Vermutlich ermöglicht diese Mutation, dass bestimmte Übergangszustände nach der Corezeptorbindung schneller durchlaufen werden können, indem die gp120/Corezeptorbindung destabilisiert wird. Die Rückmutation 556I beschleunigt wahrscheinlich in Zusammenspiel mit der bereits vorhandenen Mutation 634K die Ausbildung des 6 Helixbündels. Diese beiden Mutationen wirken somit auf eine späte Phase der Fusion. Obwohl bekannt ist, dass natürliche Variationen in gp120 die Sensibilität des HIV-Hüllproteins gegenüber C-Peptiden beeinflussen, konnte in der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal gezeigt werden, dass solche Mutationen auch in vitro selektiert werden, um eine C-Peptidresistenz herbeizuführen.
Der menschliche Körper ist permanent mechanischen Reizen in Form von Dehnung oder Druck ausgesetzt. Diese Stimuli können vielfältige zelluläre Prozesse induzieren. Dehnungsreize erhöhen die Zellproliferation in allen bisher untersuchten Zellspezies, inklusive Endothel- und Epithelzellen. Im Gegensatz dazu scheinen mechanische Druckbelastungen zu zellulärer Differenzierung zu führen. Die Relevanz dieser mechanischen Reize für die Physiologie und Pathophysiologie ist für viele Organe nachgewiesen worden. Jedoch gibt es bislang keine hinreichenden Untersuchungen, die belegen, dass mechanische Reize ebenso eine Rolle bei der Tumorproliferation spielen könnten. Im Fokus dieser Promotionsarbeit steht die Fragestellung, inwieweit die mechanischen Verhältnisse in Tumoren in einem funktionellen Zusammenhang mit der Tumorgenese stehen. Zur Klärung dieser Fragestellung ist ein Xenograft-Tumormodell etabliert worden, das es erlaubt in vivo-Untersuchungen an humanen epithelialen Tumoren durchzuführen. Um Erfahrungen aus vorherigen in vitro-Versuchen nutzen zu können, wurden humane epitheliale A431-Vulvakarzinom- und humane epitheliale A549-Lungenkarzinomzellen für das Tumormodell verwendet. Mit diesem Modell konnte erstmals in vivo gezeigt werden, dass solide humane Tumore einer permanenten mechanischen Dehnung ausgesetzt sind, die direkten Einfluss auf die Proliferation der Tumorzellen hat. Als zentraler Auslöser für die mechanische Dehnung der Tumorzellen konnte der erhöhte tumorinterstitielle Flüssigkeitsdruck (TIFP) identifiziert werden. Der Einfluss der mechanischen Dehnung auf die Proliferation der Tumorzellen wurde anhand der Phosphorylierung der extracellular regulated kinase 1/2 (ERK1/2) bzw. der Ki-67 Expression gezeigt. Durch die Punktion bzw. Drainage von Tumoren konnte der TIFP experimentell abgesenkt werden und in Folge dessen kam es zu einer reduzierten mechanischen Dehnung der Tumorzellen. In allen Versuchen war die Abnahme der mechanischen Dehnung von einer verringerten Phosphorylierung der ERK1/2 bzw. reduzierten Expression des Proliferationsmarkers Ki-67 begleitet. Der TIFP induziert aber nicht nur mechanische Dehnungsreize, sondern er stellt darüber hinaus eine physikalische Barriere für den effizienten Transport von Therapeutika in den Tumor dar. Der gegenüber dem umliegenden Gewebe erhöhte TIFP behindert den interstitiellen Transport und die Aufnahme von Molekülen aus dem Gefäßsystem in die Tumorzellen. Die Etablierung einer neuen experimentellen Technik zur Senkung des TIFP, durch i.v. Injektion von konzentriertem humanem Serumalbumin, führte zu einer signifikanten Verbesserung der Aufnahme und einer Verlängerung der Verweildauer von Makromolekülen/Therapeutika innerhalb von Tumoren. Des Weiteren konnten immunhistochemische Färbungen gegen lymphspezifische Marker in Gewebeproben von A431 und A549 Tumoren keinen direkten Zusammenhang zwischen Lympharchitektur und TIFP zeigen. Dies bedeutet, dass in den untersuchten Tumoren die Ausbildung des hohen TIFP eher auf eine erhöhte Rigidität der extrazellulären Matrix bzw. die hohe Permeabilität des tumorversorgenden vaskulären Gefäßsystems zurückzuführen ist. Parallel zu den in vivo-Untersuchungen durchgeführte in vitro-Versuche konnten Proteine identifizieren, die an der druckinduzierten p38 Signaltransduktionskaskade beteiligt sind. Diese Ergebnisse untermauern die bisherigen in vitro-Daten bzgl. der differentiellen Reaktionen von Zellen auf mechanische Druckreize. Abschließend lässt sich sagen, dass die Ergebnisse der in vivo-Versuche die Bedeutung und die klinische Relevanz des biophysikalischen Parameters TIFP hervorgehoben haben. Die Zukunft der Krebstherapie liegt nicht alleine in der Entwicklung neuer hochspezifischer Wirkstoffe, sondern auch in der Lösung des Transports der Wirkstoffe an den Zielort. Die vorgestellten Ergebnisse dieser Promotionsarbeit weisen eine beträchtliche klinische Relevanz auf, denn sie zeigen, dass die experimentelle Absenkung des TIFP zu einer verbesserten Aufnahme von Therapeutika beiträgt. Gleichzeitig wird die Proliferationsrate von Tumorzellen durch die reduzierte mechanische Dehnung signifikant verringert. Dieser Doppeleffekt könnte zu einer effizienteren Krebstherapie führen in Folge derer es zu einer verlängerten Überlebensrate sowie einer Verbesserung der Lebensqualität von Krebspatienten kommen könnte.
Maligne Gliome sind die häufigsten Neoplasien des Zentralen Nervensystems. Sie zählen zu den hypoxischsten Tumoren und entwickeln u.a. durch die Adaption an niedrige Sauerstoffbedingungen Apoptose-resistente Phänotypen. Darüber hinaus zeichnen sie sich durch schnelle Proliferation und ein diffuses, infiltratives Wachstum in das umliegende Neuropil aus, was eine vollständige Tumor-Resektion unmöglich macht. Entsprechend liegt die mediane Überlebenszeit nach der Diagnose trotz chirurgischen Eingriffs bei anaplastischen Astrozytomen (WHO Grad III) zwischen 18 und 20 Monaten und bei Glioblastomen (WHO Grad IV) zwischen 12 und 15 Monaten. Im ersten Abschnitt der vorliegenden Arbeit wurden 17 Gliomzelllinien in einem in vitro-Anoxiemodell auf ihre Hypoxie-Sensitivität hin untersucht. Dabei wurde eine hohe Variabilität hinsichtlich der Hypoxie-Toleranz festgestellt, sowie die Tendenz zu einer ausgeprägter Anpassung an niedrige Sauerstoffverhältnisse, begleitet von der Fähigkeit, das mitochondriale Membranpotential (delta psi m) aufrecht zu erhalten. Der durch Hypoxie induzierte Zelltod wurde als Caspase-unabhängig und Nekrose-ähnlich charakterisiert. Apoptose wurde hingegen auch in den Hypoxie-sensitiven Zelllinien nach 48 stündigem Sauerstoffentzug nur in sehr geringem Ausmaß beobachtet. Funktionelle Analysen mit den synthetischen BH3-Mimetika HA14-1 und BH3I 2’, die selektiv Bcl-2 bzw. Bcl xL/Bcl-2 inhibieren, lassen darauf schließen, dass die für Gliomzellen typische Bcl-2- und Bcl xL-Überexpression eine Blockade des mitochondrialen Signalwegs verursacht und so entscheidend zur Apoptose-Resistenz der Zellen beiträgt. Der Todesligand TRAIL, der selektiv in Tumorzellen Zelltod aktiviert, ist ein vielversprechender Kandidat für neue Apoptose-induzierende Krebstherapien. Da jedoch einige Krebszelltypen einschließlich maligner Gliome weitgehend gegen TRAIL resistent sind, richtet sich das Interesse verstärkt auf kombinatorische Therapieansätze, die Tumorzellen für TRAIL resensitivieren sollen. Nur zwei von sechs untersuchten Gliomzelllinien reagierten auf die Behandlung mit TRAIL, wobei eine Korrelation zwischen Hypoxie- und TRAIL-Resistenz deutlich wurde und die Hypothese einer ausgeprägten Kreuzresistenz stärkt. Ein Zusammenhang zwischen TRAIL-Sensitivität und TRAIL-Todes- bzw. –Decoy-Rezeptor-Expression konnte indes nicht hergestellt werden. Der Vergleich von konventionellen Therapienansätzen (Gamma-Bestrahlung) mit neuartigen Wirkstoffklassen (BH3-Mimetika und Proteasomeninhibitoren) zeigte, dass Gamma-Bestrahlung lediglich in TRAIL-sensitiven Zellen synergistisch mit TRAIL wirkte, während die BH3-Mimetika den TRAIL-induzierten Zelltod sowohl in TRAIL-sensitiven als auch –resistenten Zellen signifikant erhöhten. Diese Befunde legen nahe, dass die hohen Bcl-2- und Bcl xL-Proteinlevel verschiedene Signalwege hemmen, die an den Mitochondrien konvergieren und dadurch die Apoptose- bzw. Therapie-Resistenz maligner Gliome steigern. Der Einsatz der Proteasomeninhibitoren MG132 und Epoxomicin erwies sich vergleichsweise als am effizientesten: Beide Substanzen vervielfachten p53-unabhängig den TRAIL-induzierten Zelltod in TRAIL-sensitiven Gliomzellen und reaktivierten darüber hinaus potent die TRAIL-induzierte Apoptose in den TRAIL-resistenten Zelllinien. Microarray- und semi-quantitative RT-PCR-Analysen ergaben eine potente transkriptionelle Aktivierung des TRAIL-Rezeptors DR5 und der Stress-induzierten Transkriptionsfaktoren CHOP und c-Jun. Weitere Untersuchungen mit Hilfe von chemischen Inhibitoren und RNA-Interferenz zeigten, dass die CHOP-unabhängige, JNK/c-Jun-Signalwegs-vermittelte Aktivierung von DR5 eine maßgebliche Rolle bei der Proteasomeninhibitor-induzierten Sensitivierung von Gliomzellen für TRAIL spielt. Zusammengenommen legen die vorgelegten Befunde nahe, dass neue Ansätze basierend auf TRAIL oder agonistischen TRAIL-Rezeptor-Antikörpern in Kombination mit Proteasomeninhibitoren oder BH3-Mimetika vielversprechende Strategien zur Überwindung der Therapieresistenz maligner Gliome darstellen.
Das Non-LTR-Retrotransposon TRE5 A.1 aus Dictyostelium discoideum integriert positionsspezifisch 48 ± 2 bp oberhalb von tRNA Genen. Es konnte gezeigt werden, dass TRE5 A.1 Wechselwirkungen zwischen ORF1p und dem RNA Polymerase III spezifischen Transkriptionsfaktor DdTFIIIB nutzt, um seinen Integrationsort zu identifizieren. Damit wurden in dieser Arbeit erstmals direkte Proteininteraktionen zwischen einem Non-LTR-Retrotransposon und Komponenten des Chromatins zur Definition des Integrationsortes nachgewiesen. DdTFIIIB wurde durch Blastp Suchen in silico identifiziert. Wie auch in S. cerevisiae wird innerhalb des D. discoideum TFIIIB Komplexes eine stabile Interaktion zwischen der N terminal gelegenen Helix H2 von DdTBP und dem C Terminus von DdBrf1 gebildet. Es konnte sowohl mittels bakterieller Zweihybrid Versuche als auch durch biochemische Pulldown Experimente gezeigt werden, dass TRE5 A kodiertes ORF1 Protein (ORF1p) mit allen drei Untereinheiten von DdTFIIIB in Wechselwirkung tritt. Am ausgeprägtesten war diese mit DdTBP. Durch Mutations und Deletionsanalysen wurden die Kontaktflächen auf DdTBP und ORF1p näher charakterisiert. Demnach interagiert ORF1p über seinen N Terminus (AS 112 158) mit DdTBP, während die C terminalen 40 Aminosäuren sowohl von DdBrf1 als auch von ORF1p beansprucht werden und beide Proteine vermutlich um diese Bindestelle konkurrieren. DdTBP bindet hauptsächlich mit der C terminalen  Helix H2’ an ORF1p. Eine wichtige Position für diese Interaktion ist Ser195 auf DdTBP. Obwohl HsTBP selbst nicht mit ORF1p interagiert, kann die Einführung der Helix H2’ aus DdTBP in das humane Protein die Interaktion mit ORF1p wiederherstellen. Interaktionen zwischen DdTFIIIB und TRE5 A ORF2p wurden nicht detektiert, allerdings konnte ein vermutliches Dimerisationsmotiv in ENp entdeckt werden. Für weiterführende Versuche, die die Relevanz der hier gefundenen Proteininteraktionen für die Target Identifizierung in D. discoideum Zellen untersuchen soll, wurden in dieser Arbeit zwei monoklonale Antikörper gegen DdTBP und einen zufällig entdeckten „Epitop Tag“ isoliert und charakterisiert. Die genaue Rolle von ORF1p während der Retrotransposition von TRE5 A.1 ist noch ungeklärt. Erste grundlegende Einblicke weisen darauf hin, dass ORF1p Teil des Präintegrationskomplexes von TRE5 A sein muss.
Präklinische Untersuchungen zur Gentherapie der HIV-Infektion mit dem retroviralen Vektor M87o
(2007)
Mit der Einführung der hochaktiven antiretroviralen Therapie (HAART) 1995 wandelte sich die HIV-Infektion in den Industrieländern von einer akut lebensbedrohlichen zu einer chronisch verlaufenden und scheinbar gut kontrollierten Erkrankung. Das Virus wird allerdings nie vollständig aus dem Körper eliminiert, sodass die Betroffenen zeitlebens Medikamente einnehmen müssen. Die Langzeit-Medikation wird häufig von schweren Nebenwirkungen begleitet, führt zur Selektion resistenter Viren und muss häufig umgestellt werden. Gentherapeutische Verfahren, die die CD4+ Zielzellen durch die Expression antiviraler Gene vor der Infektion durch HIV schützen („intrazelluläre Immunisierung“), stellen viel versprechende Therapiealternativen dar. Der in der Arbeitsgruppe von Laer entwickelte retrovirale Vektor M87o (EGELHOFER et al. 2004, EGELHOFER 2004) exprimiert das 46 Aminosäuren lange membran-verankerte Peptid C46, das in der Lage ist, die gp41-vermittelte Fusion von Virus- und Zellmembran zu inhibieren. In Zelllinien und primären Lymphozyten konnte gezeigt werden, dass M87o die Infektion durch unterschiedliche HIV-Isolate sehr effektiv verhindert. Im Rahmen vorklinischer Untersuchungen konnte in vitro gezeigt werden, dass die retrovirale Transduktion mit M87o das Transformationsrisiko und damit das Risiko der Entstehung von Neoplasien nicht steigert. An primären peripheren T-Zellen konnte zeigt werden, dass M87o die Zielzellen weder phänotypische noch funktionelle verändert. Für die Untersuchung der retroviralen Gentherapie im Rhesusaffenmodell wurde zunächst ein Gentransferprotokoll für periphere Affenlymphozyten entwickelt, mit dem in Vorversuchen Gentransferraten von ca. 50% erreicht werden konnten. Das Transduktionsprotokoll wurde anschließend im Rahmen einer präklinischen Studie zur Toxizität und Immunogenität der M87o-Gentherapie, bei der Herstellung zweier Studientransplantate angewandt. Beide Zellpräparate wurden den Versuchstieren transplantiert. Während des Eingriffs traten keine akuttoxischen Reaktionen auf. M87o+-Zellen konnten bis 140 Tage nach der Transplantation mittels PCR nachgewiesen werden. Immunologische Untersuchungen (Cytokinfärbung, Proliferationsassay, ELISPOT) ergaben keine Hinweise auf zelluläre oder humorale Immunreaktionen. M87o-spezifische Antikörper waren im Serum nicht nachweisbar. Für die Durchführung einer klinischen Studie zur Toxizität und Wirksamkeit (Phase I/II) an HIV-infizierten Probanden wurde ein Protokoll zur Produktion M87o-modifizierter T-Zellen (mindestens 5 × 108 M87o+ CD4-T-Zellen pro Spender) entwickelt. In die klinische Prüfung wurden Patienten aufgenommen, die nach multiplem Therapieversagen durch das Auftreten multiresistenter HIV eine CD4-Zellzahl von 50 bis 200 µl-1 Blut, sowie eine Viruslast von >5.000 Kopien ml-1 Blut aufwiesen. Im Versuchsmaßstab konnte ein Transduktionsprotokoll erarbeitet werden, mit dem im Mittel 46% der CD4+ T-Zellen mit M87o transduziert werden konnten. Innerhalb von 10 Tagen expandierte die Zellzahl im Mittel um den Faktor 153, wobei die HIV-Replikation vollständig inhibiert wurde. Das Protokoll wurde erfolgreich vom Versuchsmaßstab in den klinisch relevanten Produktionsmaßstab übersetzt. In drei Versuchsläufen wurde im Mittel eine Transduktionsrate von 29% erreicht und die Zellzahl um den Faktor 44 vermehrt. Der Anteil an CD3+/CD4+ Zellen an der Gesamtpopulation lag im Mittel bei 91%. Insgesamt konnten mit dem etablierten Protokoll durchschnittlich 2,3 × 109 CD3+/CD4+/M87o+ Zellen, bei gleichzeitig vollständiger Inhibition der HIV-Replikation, generiert werden. Im Rahmen einer klinischen Studie zur Toxizität und Wirksamkeit der M87o-Gentherapie wurden 10 Studientransplantate gemäß dem im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Protokoll hergestellt. Alle Transplantate wurden am Universitäts-Krankenhaus Eppendorf in Hamburg transfundiert und von den Patienten sehr gut vertragen.
Durch die Forschung der letzten Jahre wurde zunehmend deutlich, dass die Tumorumgebung einen starken Einfluss auf Wachstum und Progression eines Tumors ausübt. Ein Schlüsselereignis ist dabei die veränderte Expression von Wachstumsfaktoren und deren Rezeptoren im Tumor selbst oder im Tumor-Stroma und somit eine Veränderung in der Interaktion zwischen Tumor- und Stroma-Zellen. Eine solche de novo Expression der hämatopoetischen Wachstumsfaktoren G-CSF und GM-CSF konnte in der Tumorprogression humaner Plattenepithelkarzinome der Haut ausschließlich im Tumorgewebe hochgradig maligner, schnell und invasiv wachsender und metastasierender Tumore mit einer ausgeprägten Vaskularisierung nachgewiesen werden (Mueller & Fusenig 1999). Um die Wirkung von G-CSF und GM-CSF getrennt analysieren zu können, wurde eine benigne Keratinozyten-Zelllinie, die die Rezeptoren für G-CSF und GM-CSF exprimiert, nicht jedoch die Faktoren selbst, mit G-CSF oder GM-CSF transfiziert. Die Konsequenz der Faktorexpression wurde in je 2 transfizierten Zelllinien in vitro und in vivo analysiert. Beide Faktoren wirkten autokrin stimulierend auf die Tumorzell-Proliferation und Migration in vitro. Darüber hinaus induzierte GM-CSF die Expression von IL-6 in Tumorzellen, welches dann wiederum die Expression von GM-CSF verstärkte. Untersuchungen der transfizierten Zelllinien in vivo demonstrierten einen deutlichen Beitrag von G-CSF und GM-CSF zur Tumormalignisierung. So ergab die subkutane Injektion der G-CSF exprimierenden Zellen in die Nacktmaus nach einer Latenzzeit von 50 Tagen schnell und invasiv wachsende Tumore mit ausgeprägter Vaskularisierung, während GM-CSF exprimierende Zellen nur ein transientes Tumorwachstum zeigten. Subkutane Injektion von Gemischen der G-CSF mit den GM-CSF transfizierten Zellen demonstrierten eine frühere Häufung der Tumorbildung in Abhängigkeit von der Höhe der GM-CSF Produktion durch die eingesetzte Zelllinie. Die in vivo Progression mittels Rekultivierung von Tumorgewebe der mit G-CSF transfizierten Zellen resultierte in Zellen, die ein sehr schnelles und aggressives Tumorwachstum ohne Latenz zeigten. Diese Progression war assoziiert mit einer de novo Expression von GM-CSF, was auf einen synergistischen Effekt beider Faktoren hinweist. Für die Progressions fördernde Wirkung von G-CSF und GM-CSF spielt neben der autokrinen Stimulation der Tumorzellen vor allem die parakrine Beeinflussung des Tumor-Stromas eine Rolle. Die Analyse der Kinetik der Tumor-Stroma Interaktionen im Oberflächentransplantat ergab eine deutlich schnellere und stärkere, zum Tumor hin gerichtete permanente Angiogenese in den G-CSF exprimierenden Zellen. Diese setzte in den durch in vivo Passage entstandenen, G-CSF und GM-CSF positiven Zellen deutlich früher ein. Die Faktor negativen parentalen Zellen und die mit GM-CSF transfizierten Zellen wiesen dagegen nur eine transiente Angiogenese auf. Die Rekrutierung neutrophiler Granulozyten in die Tumorumgebung war bei allen transfizierten Zelllinien beschleunigt, blieb jedoch bei GM-CSF exprimierenden Zellen wie auch bei den parentalen und Kontroll transfizierten Zellen transient, während G-CSF exprimierende und G-CSF und GM-CSF ko-exprimierende Zellen eine anhaltende Rekrutierung zeigten. Die Analyse der Kinetik der Makrophagen-Rekrutierung ergab eine deutliche Beschleunigung nur in den GM-CSF exprimierenden und den G-CSF und GM-CSF ko-exprimierenden Zellen. Die sehr frühe Gegenwart von Makrophagen in Transplantaten der GM-CSF positiven Zellen ohne die Präsenz von Granulozyten deutet im Zusammenhang mit der sehr unregelmäßigen und blasigen Epithelbildung und dem nur transienten Tumorwachstum dieser Zellen nach subkutaner Injektion auf eine durch Makrophagen ausgeübte frühe Anti-Tumor Immunität hin. Als Schlüsselenzyme der Tumorinvasion und Angiogenese wurde weiterhin die Expression Matrix degradierender Enzyme, der Matrix Metalloproteinasen, in Tumor und Stroma untersucht. Dabei konnte mit zunehmender Tumorprogression eine ansteigende Expression von MMP-2 in Tumoren, von MMP-13 in Tumor und Stroma und von MMP-3 und MMP-9 im Tumor-Stroma in direkter Nähe zum Tumor festgestellt werden, wobei die Proteasen eine der Tumor-Invasion vorangehende Deposition am Rand invasiver Bereiche des Tumors zeigten. Ein Teil der stromalen (murinen) MMP-9 positiven Zellen konnte über Immunfluoreszenz-Färbungen als neutrophile Granulozyten identifiziert werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ko-Expression von G-CSF, GM-CSF und ihren Rezeptoren in humanen Plattenepithelkarzinomen der Haut einen wesentlichen Beitrag zur Tumorprogression zu einem hochmalignen Tumor-Phänotyp leistet. Dies geschieht zum einen durch eine autokrine Stimulation von Proliferation und Migration der Tumorzellen. Zum anderen stimulieren diese Faktoren parakrin die Induktion einer Tumor fördernden stromalen Umgebung und tragen so zu verstärktem Tumorwachstum und Invasion bei.
Isolation des Carotinoidbiosynthese Genclusters aus Flavobacterium spec P99-3. Das isolierte Gencluster von 15 kb Größe zeigt 7 offene Leseraster, die auf Grund ihrer Sequenzhomologie Carotinoidgenen zugeordnet werden können oder anhand von Komplementationen in einem heterologen Expressionssystem in E. coli mit anschließender HPLC-Analayse eine eindeutige Funktion im Biosysnthesewegs des selten vorkommenden Myxols zugeordnet werden kann.
Obwohl für eine Vielzahl von Chemikalien Ergebnisse aus Standardtest vorliegen, gibt es relativ wenige Erkenntnisse über generationsübergreifende Substanzeffekte und die Auswirkungen von Chemikalien auf die genetische Diversität. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation werden generationsübergreifende Effekte des Modellschadstoffes Tributylzinn (TBT) bei drei subakuten Konzentrationen (4,46; 6,69 und 8,93 mikro g Sn/kg TG) auf Life-Cycle-Parameter und genetische Diversität der Zuckmücke Chironomus riparius untersucht. Dabei wird eine genetisch variable (GEN+) und eine genetisch verarmte (GEN-) Populationen betrachtet. Darüber hinaus wird das Anpassungspotential an den Stressor TBT abgeschätzt. Die genetische Variabilität von C. riparius wird mittels neu entwickelter Mikrosatellitenmarker bestimmt. Dabei werden geringfügige Längenunterschiede zwischen hochvariablen DNA-Fragmenten detektiert. Weiterhin werden Abweichungen vom Hardy-Weinberg-Gleichgewicht bestimmt. Für die Ermittlung von potentiellen Anpassungsprozessen an den Stressor TBT werden nach ausgewählten Generationen akute und chronische Anpassungstest durchgeführt. Um der Fragestellung nachzugehen, ob eine TBT-Vorexposition zu einer veränderten Sensitivität gegenüber einem Zweitstressor führt, werden Experimente mit Cadmium durchgeführt. Auch in den Zweitstressorstudien wird der Multigenerationsansatz gewählt, und es werden Life-Cycle-Experimente über drei weitere Generationen durchgeführt. Für die Experimente werden die mit 4,46 und 8,93 mikro g Sn/kg TG vorexponierten Tiere anschließend nach unterschiedlicher Generationenzahl einer umweltrelevanten Cadmiumkonzentration (1,2 mg/kg TG) ausgesetzt. Im Verlauf der Multigenerationsstudie mit 4,46 mikro g Sn/kg TG werden in beiden Populationen signifikante Effekte auf die Entwicklung und Reproduktion beobachtet. In den ersten Generationen ist der Schlupfzeitpunkt der Larven bei TBT-Exposition signifikant (p < 0,05, t-Test) verzögert. Die Reproduktion scheint ebenso ein sensitiver Parameter zu sein, wobei die Weibchen der genetisch variableren Population signifikant (p < 0,05, t-Test) größere Gelege in den späteren Generationen produzieren. Die niedrige TBT-Konzentration hat in beiden Populationen keinen signifikanten Effekt auf die durchschnittliche Populationswachstumsrate. In den letzten Generationen der Studie wird für die genetisch variablere Population eine Veränderung des Lebenszyklus festgestellt, wobei die Weibchen eine erhöhte Reproduktionsleistung aufweisen. Es werden keine Effekte auf die Heterozygotie festgestellt. Allerdings treten in beiden Populationen zahlreiche Abweichungen vom Hardy-Weinberg-Gleichgewicht auf. Weiterhin werden signifikante (Pearson-Korrelation, p < 0,05) Effekte der genetischen Diversität auf zahlreiche Life-Cycle-Parameter (Gelegeanzahl pro Weibchen, Gelegegröße) ermittelt. In den chronischen und akuten Anpassungsexperimenten gibt es deutliche Hinweise auf Adaptationsprozesse gegenüber dem Stressor TBT. In der TBT-Studie mit 8,93 mikro g Sn/kg TG werden in beiden Populationen signifikante Effekte auf zahlreiche Life-Cycle-Parameter festgestellt, wobei die Entwicklung und Reproduktion der Tiere negativ beeinflusst wird. Darüber hinaus werden in der genetisch variableren Population signifikante (p < 0,05, X2-Test) Effekte von TBT auf die genetische Diversität beobachtet. Diese nimmt im Verlauf der Studie ab. Nach der vierten Generation gibt es in der genetisch variableren Population Hinweise auf Anpassungsprozesse, die allerdings in den letzten Generationen nicht mehr nachzuweisen sind. Ähnlich wie in der ersten Multigenerationsstudie wird auch in dieser Studie ein signifikant (Pearson-Korrelation, p < 0,05) positiver Zusammenhang zwischen der genetischen Diversität und der Populationswachstumsrate bei TBT-Exposition festgestellt. In den Zweitstressorexperimenten wird der Effekt der Vorbelastung bei der genetisch variableren Population deutlich. Die mit 8,93 mikro g Sn/kg TG über neun Generationen exponierte Population reagiert dabei empfindlicher auf den Stressorwechsel als die dazugehörige Referenzpopulation. Innerhalb der Multigenerationsstudien werden zahlreiche Effekte der Organozinnverbindung TBT auf Life-Cycle-Parameter und die genetische Diversität von C. riparius deutlich. Diese Dissertation zeigt die hohe Bedeutung von Mehrgenerationenstudien für die Abschätzung und Bewertung eines Risikopotentials von Schadstoffen.
Das aktuell diskutierte Modell der lichtabhängigen Magnetrezeption bei Vögeln beschreibt, dass die Richtung des Erdmagnetfelds durch Radikalpaarprozesse in spezialisierten Photorezeptoren wahrgenommen wird. Dabei werden Cryptochrome, eine Klasse photoaktiver Flavoproteine, als potentielle Kandidaten für das Radikalpaarmodell und damit als mögliches Magnetrezeptormolekül diskutiert. Verhaltensbiologische Experimente mit Zugvögeln zeigen, dass der Magnetrezeptionsprozess offensichtlich stark lateralisiert im rechten Auge stattfindet und dass dieser Prozess Licht aus dem blau-grünen Teil des Spektrums benötigt. Cryptochrome absorbieren Licht in diesem Bereich und besitzen darüber hinaus biochemische Eigenschaften, die für die Funktion des Radikalpaarmodells entscheidend sind. Vor dem Hintergrund dieser Überlegungen habe ich untersucht, ob Cryptochrom (CRY) in der Retina des Rotkehlchens, Erithacus rubecula, einem nachtziehenden Singvogel, zu finden ist. Mit molekulargenetischen Methoden konnte ich erstmals drei individuell exprimierte Cryptochrome aus der Rotkehlchenretina isolieren: Erithacus (e)-CRY1a, -CRY1b und -CRY2. Während eCRY1a und eCRY2 fast vollständig homolog zu Cryptochrom 1 und 2 in der Retina des Haushuhns sind, besitzt eCRY1b eine noch unbeschriebene C-terminale Domäne, die auf neue Proteinbindungseigenschaften und Interaktionspartner hindeutet. Die Identifizierung eines Kernlokalisierungssignals bei eCRY2 weist auf dessen Lokalisierung im Zellkern hin und macht seine Funktion als sensorischer Lichtrezeptor eher unwahrscheinlich. Ein mit Hilfe der Aminosäurensequenz erstelltes Proteinmodell von eCRY1 zeigt, dass dieser Typus zwei Cofaktoren besitzt: das katalytische Chromophor Flavinadenindinukleotid (FAD) und das lichtsammelnde Pterin Methenyltetrahydrofolat (MTHF). eCRY1a und eCRY1b sind Spleißprodukte des gleichen Gens; ihre C-terminalen Domänen sind auf unterschiedlichen Exonen codiert. eCRY1a und eCRY1b besitzen beide keine Membranbindedomäne und liegen zytosolisch vor. Weil jedoch laut Radikalpaartheorie die magnetosensitiven Rezeptoren zumindest im Moment der Photonenabsorption in einer bestimmten Anordnung und Raumrichtung vorliegen müssen, benötigen beide eCRY1-Varianten daher mindestens einen sphärisch fixierten Interaktionspartner. In meiner Arbeit diskutiere ich Opsine als mögliche Partner, da diese in den Aussensegmenten der Photorezeptoren stark geordnet und in konstanter Raumrichtung vorliegen. Die Genexpression von eCRY1a und eCRY1b unterscheidet sich sowohl zwischen den Augen als auch zwischen den CRY-Varianten. Im Mittel waren die Expressionswerte von eCRY1a in der Rotkehlchenretina fünf- bis zehnmal höher als die von eCRY1b. In der Dämmerung und nachts ist eCRY1a im linken Auge signifikant höher exprimiert als im rechten Auge. Im Gegensatz dazu ist die Expression von eCRY1b in beiden Augen gleich, zeigt jedoch einen signifikanten Anstieg zu Beginn des Zuges in der Dämmerung. Durch die unterschiedlichen Expressionsraten von eCRY1a und eCRY1b verschiebt sich zum Zeitpunkt der Richtungsentscheidung des Vogels in der Dämmerung das Verhältnis zwischen den beiden Cryptochrom1-Varianten im rechten Auge zugunsten von eCRY1b. Die Ergebnisse meiner Expressionsstudie deuten darauf hin, dass die in Verhaltensversuchen nachgewiesene Lateralisation des Magnetkompass bereits auf Rezeptorebene in der Retina beginnen könnte. mRNA in situ- als auch immunohistochemische Untersuchungen dieser Arbeit zeigen, dass bei Zugvögeln sowohl die mRNA als auch die Proteine beider eCRY1-Typen in den Innensegmenten der retinalen Photorezeptoren lokalisiert sind. Die räumliche Nachbarschaft zu Opsinen unterstützt die Annahme einer möglichen Interaktion zwischen diesen und Cryptochrom. Darüber hinaus lässt dieser Befund Spekulationen zu, dass die neuronale Verarbeitung der aus den Photorezeptoren stammenden magnetischen Richtungsinformation analog zum bildverarbeitenden Sehen stattfinden könnte. Modelle für eine mögliche Verschaltung und Signalverarbeitung der Cryptochromsignale werden in dieser Arbeit diskutiert. Insgesamt unterstützen die Befunde meiner Arbeit die im Radikalpaarmodell diskutierte Annahme, dass Cryptochrome eine entscheidende Rolle bei der Perzeption von magnetischer Kompassinformation bei Zugvögeln spielen und möglicherweise als Magnetrezeptormoleküle fungieren. Darüber hinaus könnten die Ergebnisse einen wichtigen Beitrag zu einem besseren Verständnis des Gesamtprozesses der Magnetrezeption bei Tieren leisten, und zwar von der Rezeptorzelle bis zur Verhaltensantwort. Meine Ergebnisse tragen möglicherweise auch dazu bei, die bekannten neurowissenschaftlichen und funktionell morphologischen mit den entsprechenden ethologischen Ergebnissen zu verknüpfen. Ich würde es sehr begrüßen, wenn meine Arbeit zu weiterführender Forschung auf diesem spannenden Gebiet anregt und zu einem besseren Verständnis der noch unbekannten Aspekte der Magnetrezeption beitrüge.
RNA-Interferenz (RNAi) erlangte eine herausragende Bedeutung zum Studium der Genfunktion, nachdem auch in Säugersystemen gezeigt wurde, daß durch Applikation von 21 nt langen siRNAs (small interfering RNAs) eine Sequenz-spezifische Degradierung der mRNA-Transkripte kognitiver Gene erreicht werden konnte. Im Gegensatz zur antisense-Technologie erwies sich die Wirkung von siRNA im Hinblick auf die Hemmung der Genexpression um ein Vielfaches potenter und hoch spezifisch. Für eine längerfristige Unterdrückung von Genen kristallisierte sich die Methode der Plasmid-Vektor-vermittelten intrazellulären Expression von shRNA (short hairpin RNA) heraus, welche transient oder stabil angewendet werden kann. Diese exprimierte shRNA wird intrazellulär enzymatisch zu wirksamer siRNA prozessiert, welche den eigentlichen Enzym-vermittelten RNAi-Mechanismus der Degradierung von mRNA-Transkripten kognitiver Gene auslöst. Die Anwendung von RNA-Polymerase III-abhängigen Promotoren für die stabile konstitutive Expression von shRNA stellte ein großes Problem für behandelte Zellen dar, wenn es sich bei dem zu unterdrückenden Zielgen um ein Gen mit essentiellen Funktionen für die Zelle handelte. Im Falle der Polo-like Kinase 1 (Plk1), einer in vielen Spezies hoch konservierten Serin/Threonin-Kinase mit essentiellen mitotischen Funktionen, bedeutete eine dauerhafte und stringente Unterdrückung einen veränderten Phänotyp beteiligter Zellen, welcher sich durch Defekte bei mitotischen Ereignissen bemerkbar machte. Plk1 ist in zahlreiche mitotische Prozesse, wie den Eintritt der Zellen in die Mitose, die Segregation der Chromosomen und die Aktivierung des APC/C (anaphase promoting complex / cyclosome), eingebunden. Darüber hinaus ist bekannt, daß Plk1 in nahezu allen Tumorarten überexprimiert vorliegt und die Prognose von Tumorwachstum und Metastasierungspotential über den Plk1-Gehalt definiert werden kann. Des weiteren bewirkte eine RNAi-vermittelte Unterdrückung der Plk1-Expression bei Tumorzellen eine Hemmung der Zellproliferation mit Auslösung der Apoptose. Hingegen konnte bei gesunden primären Zellen weder eine signifikante Hemmung der Proliferation noch die Auslösung der Apoptose beobachtet werden, was die große Bedeutung von Plk1 als Ansatzpunkt für eine Krebstherapie hervorhebt. Um die Funktion von Plk1 im Hinblick auf molekularbiologische Zusammenhänge besser studieren zu können, war es notwendig, den intrazellulären Plk1-Gehalt zu variieren. Im Rahmen dieser Promotionsarbeit wurden dazu induzierbare RNAi-Elemente entwickelt, mit deren Hilfe die intrazelluläre Plk1-Expression konditionell inhibiert werden konnte. Unter Verwendung des prokaryotischen Tet-Systems wurden auf Basis des RNA-Polymerase abhängigen H1-Promotors durch Insertion von einer oder zwei Operatorsequenzen (TetO) für den Tetrazyklin-Repressor (TetR) an verschiedene Orte innerhalb der Sequenz des H1-Promotors drei induzierbare Promotor-Derivate geschaffen. Die drei entwickelten H1-Promotor-Derivate wurden zur Expression von shRNA gegen Plk1 eingesetzt und in bezug auf die Auslösung der RNAi-Antwort getestet und untereinander verglichen. Zu diesem Zwecke wurde der endogene Plk1-Gehalt von HeLa-Tumorzellen auf Transkript- und auf Proteinebene bestimmt. Die Zellen wurden zuvor mit Plasmid-Vektoren für konstitutive TetR-Expression und jeweils einer der verschiedenen shRNA-Expressions-Kassetten ko-transfiziert. Als Kontrollen dienten dabei Wildtyp-H1-Promotoren, welche zur konstitutiven Expression von shRNA gegen Plk1 und einer unwirksamen Kontroll-shRNA eingesetzt wurden. Mit Hilfe des synthetischen Tetrazyklin-Analogons Doxyzyklin, welches einen potenten Aktivator für TetR darstellt, konnten die hergestellten Promotor-Derivate induziert werden, was durch einen reduzierten intrazellulären Plk1-Gehalt sichtbar wurde. Dabei fiel auf, daß alle drei Promotor-Typen unterschiedliche Eigenschaften im nichtinduzierten Zustand wie auch im induzierten Zustand unter Anwesenheit von Doxyzyklin aufwiesen. Für die Basalaktivität in Abwesenheit von Doxyzyklin (leakiness) war die relative Lage der TetO-Sequenz(en) innerhalb des Promotors verantwortlich. So veränderte die Insertion einer TetO-Sequenz in 3’-Richtung der TATA-Box die Eigenschaften des Wildtyp-H1-Promotors weniger als die Insertion einer TetO-Sequenz in 5’-Richtung der TATA-Box. Zum Studium von Plk1 als Zielgen in der Krebstherapie wurde das Proliferationsverhalten von HeLa-Tumorzellen als Antwort auf die Doxyzyklin-vermittelte Induktion der shRNAExpression unter Kontrolle eines der induzierbaren Promotoren ermittelt. Dabei konnte die Proliferation von Tumorzellen durch einen reduzierten Plk1-Gehalt, welcher durch die Doxyzyklin-induzierte Auslösung der RNAi-Antwort vermittelt wurde, erfolgreich inhibiert werden. Zur Überprüfung der Eignung entwickelter Systeme, Tumorwachstum in vivo inhibieren zu können, wurden die entwickelten RNAi-Kassetten in das Genom von TetRexprimierenden HeLa-Zellen integriert und so stabile Klone geschaffen. Stabile HeLa-Klone zur induzierbaren Expression von Plk1-spezifischer shRNA, wie auch zur induzierbaren Expression von einer Kontroll-shRNA, wurden in die gegenüberliegenden Flanken von immunsupprimierten Nacktmäusen inokuliert, um anhand von Xenograft-Modellen einen direkten Vergleich des Tumorwachstums unter gleichen äußeren Bedingungen zu ermöglichen. Einem Teil der Mäuse wurde Doxyzyklin ins Trinkwasser gegeben, während Kontrollmäuse kein Doxyzyklin verabreicht bekamen. Das Tumorwachstum von Xenograft-Tumoren, welche aus Klonen zur Expression von shRNA gegen Plk1 hervorgingen, konnte in Doxyzyklin-behandelten Mäusen um 53% auf 47% an Tag 51 nach Inokulierung der Zellen inhibiert werden. Tumoren nicht-induzierter Mäuse, sowie Tumoren aus induzierten Mäusen, welche Kontroll-shRNA exprimierten, wuchsen dagegen unverändert in gleichem Maße. Anhand der in dieser Arbeit entwickelten induzierbaren H1-Promotor-Derivate zur konditionellen Auslösung von RNAi wurden wertvolle genetische Werkzeuge geschaffen, welche für das Studium der Genfunktion eingesetzt werden können. Im Falle der Unterdrückung von Plk1 können mit ihrer Hilfe sowohl grundlegende molekularbiologische Zusammenhänge studiert als auch die Bewertung von Plk1 als Zielgen in der Krebstherapie bewertet werden. Im Gegensatz zu kürzlich entwickelten Kinase-Inhibitoren, welche auf Proteinebene gegen Plk1 gerichtet sind und aufgrund ihrer bislang nicht nachgewiesenen Spezifität verwandte Kinasen in ihrer Wirkungsweise beeinflussen könnten, ist eine RNAibasierte Strategie hoch spezifisch und verspricht eine große Relevanz für zukünftige therapeutische Ansätze. Vorraussetzung für erfolgversprechende RNAi-basierte Strategien ist eine hohe Konservierung der Sequenz beteiligter Zielgene. Im Falle von Plk1 konnte eine hohe Konservierung durch Sequenzanalyse der Plk1-Gene von 15 Mamma-Karzinomen, 11 Ovarial-Karzinomen und mehrerer Tumorzellinien bestätigt werden.
Adenosintriphosphat (ATP) als universelles Energieäquivalent der Zelle wird durch die oxidative Phosphorylierung synthetisiert, bei der Elektronen entlang des elektrochemischen Gefälles der Atmungskette über verschiedene Redoxkomplexe transferiert und durch die chemiosmotische Kopplung Protonen über die Membran gepumpt werden. Der Protonengradient wird dann von der ATP-Synthase genutzt, um ADP zu ATP zu phosphorylieren. Zentraler Redoxkomplex der Atmungskette vieler Pro- und Eukaryonten ist der bc1-Komplex, der Elektronen von Ubichinol auf Cytochrom c überträgt, von wo sie nachfolgend auf die Cytochrom c-Oxidase transferiert werden. Das mesophile Bodenbakterium Paracoccus denitrificans wird als Modellsystem für den mitochondrialen Elektronentransfer (ET) verwendet, da es eine aerobe Atmungskette exprimiert, die der mitochondrialen homolog ist, allerdings einen wesentlich einfacheren Aufbau der einzelnen Redoxkomplexe aufweist. Auch Thermus thermophilus als extrem thermophiles Bakterium bildet eine vergleichbare aerobe Atmungskette aus, wobei deren Proteine allerdings eine hohe Thermostabilität aufweisen, wodurch sie in das Interesse der Forschung gerückt sind. Ziel dieser Arbeit war die funktionelle Charakterisierung des ET zwischen Komplex III und IV der Atmungsketten von P. denitrificans und T. thermophilus, die aufgrund ihrer mesophilen und thermophilen Eigenschaften unterschiedliche Mechanismen in der Wechselwirkung ihrer Redoxproteine aufweisen. Es wurden lösliche Redoxfragmente verwendet, um anhand von Mutagenesestudien, Stopped-Flow (SF)- und Laserflash-Kinetiken (LF) unter pre-steady state-Bedingungen sowie FRET-Experimenten den ET zu untersuchen. Für die LF-Experimente wurde eine photoaktive Rutheniumverbindung kovalent an Cyt c552 gekoppelt, durch die bei Laseranregung das Häm photooxidiert und dadurch der ET von einem reduzierten Redoxpartner induziert werden kann. Die Strukturdaten des bc1/Cyt c-Cokomplexes aus Hefe zeigen, dass direkte Kontakte zwischen Cyt c1 und Cyt c durch unpolare Wechselwirkungen und eine zentrale Kation-p-Interaktion vermittelt werden. Daher wurden anhand von Sequenz- und Struktur-alignments äquivalente Aminosäurepositionen im Paracoccus Cyt c1 identifiziert, die an der Wechselwirkung zu Cyt c552 beteiligt sein könnten. Diese wurden durch gerichtete Mutagenese in ihrem Raumvolumen, ihrer Polarität oder Ladung variiert und in kinetischen Studien untersucht. Für die LF-Kinetiken sowie für die FRET-Experimente wurden Oberflächen-Cysteinmutanten des Cyt c1 bzw. c552 generiert, über deren SH-Gruppen kovalent der Rutheniumkomplex bzw. Fluorophore gekoppelt werden konnten. Die ET-Reaktion zeigt zwei Phasen in Abhängigkeit von der Ionenstärke. Bei niedrigen Ionenstärken ergeben sich Geschwindigkeitskonstanten von 109 M -1s-1 und eine geringe Ionenstärkeabhängigkeit (etwa eine effektive Ladung), wohingegen bei Ionenstärken ab 35 mM 2-3 effektive Ladungen pro Redoxpartner beteiligt sind und bimolekulare Geschwindigkeitskonstanten von 107 bis 109 M-1s-1 erhalten werden. Diese Ergebnisse deuten auf die Bildung eines Encounter-Komplexes bei niedrigen Ionenstärken hin, der ein Ensemble verschiedener Distanzen und relativer Orientierungen der Redoxpartner zueinander darstellt. Diese Annahme wurde ebenfalls durch FRET-Experimente bestätigt, durch die selbst bei niedrigen Ionenstärken keine definierten Abstände erhalten werden konnten. Die Geschwindigkeitskonstanten der bimolekularen Reaktion weisen auf einen diffusionskontrollierten Prozess hin, an dem 2 bis 3 effektive Ladungen an der elektrostatischen Annäherung der beiden Redoxpartner beteiligt sind. Diese Ergebnisse werden durch vorherige kinetische Untersuchungen und EPR-Studien des ET von Cyt c552 zum CuA-Fragment der aa3-Oxidase bekräftigt, für den die gleiche Anzahl effektiver Ladungen und die Bildung eines Encounter-Komplex gefunden wurden. Lediglich c1-Mutanten, deren variierte Aminosäuren sich direkt oberhalb der Hämspalte und in der Sequenz um bzw. innerhalb des Hämbindemotivs befinden, bewirken eine Verlangsamung der Gesamtreaktion und ein leicht verändertes Ionenstärkeverhalten, das auf eine leicht verschobene Interaktionsfläche hindeutet. Es wurde durch Sequenz- und Strukturalignments kein aromatischer Rest in direkter Nähe der entsprechenden Position im Paracoccus Cyt c1 gefunden, der wie im Hefekomplex eine stabilisierende Kation-p-Interaktion zwischen den Redoxpartnern vermittelt. Zur Untersuchung des ET zwischen Komplex III und Komplex IV aus T. thermophilus wurde die hydrophile Cytochrom c-Domäne der caa3-Oxidase in Analogie zum Paracoccus-System als lösliches Redoxfragment kloniert, heterolog exprimiert und charakterisiert. Dieses Fragment wurde in SF-Studien eingesetzt, um den ET zu seinen potentiellen Redoxpartnern Cyt cbc des bc-Komplexes und Cyt c552 zu charakterisieren. Es konnte gezeigt werden, dass das ccaa3-Fragment Elektronen von beiden Redoxpartnern empfängt, wobei die ET-Reaktion mit Cyt c552 so schnell verläuft, dass sie durch SF-Techniken nur schlecht aufgelöst und lediglich eine Größenordnung der Geschwindigkeitskonstanten abgeschätzt werden kann (kon ~ 1010 M-1s-1). Die Reaktion mit Cyt cbc verläuft auch noch schnell (kon = 108-109 M-1s-1) und ist nahezu unabhängig von der Ionenstärke, was eine hydrophobe Wechselwirkung zwischen beiden Redoxpartnern bestätigt. Die Ergebnisse deuten erstmals darauf hin, dass ein ET direkt zwischen zwei Redoxproteinkomplexen (bc-Komplex und caa3-Oxidase) stattfindet, ohne dass ein Elektronenüberträger (wie z. B. Cyt c552) zwischengeschaltet ist. Um die Übertragbarkeit der Erkenntnisse, die hier über den ET an löslichen Redoxfragmenten gewonnen wurden, in einem Proteinkomplex zu verifizieren, wurde ein bc1-Komplex verwendet, in dem die für P. denitrificans einzigartige saure Cyt c1-Domäne deletiert ist. Der Komplex wurde für eine erleichterte Aufreinigung mit einem His-tag versehen, homolog exprimiert und erste Aufreinigungs- und Charakterisierungsschritte unternommen. Er soll zukünftig eingesetzt werden, um die Mutationen des löslichen c1-Fragmentes in den Komplex zu überführen und die Mutanten kinetisch mittels pre-steady state- und steady state-Techniken im Vergleich zum bc1WT-Komplex zu untersuchen, ohne dass die Effekte der Punktmutationen durch die hohe negative Ladungsdichte der sauren Domäne überlagert werden.
Die vorliegende Arbeit befaßte sich mit der Untersuchung der Protonenbewegung während des O-E Schrittes im katalytischen Zyklus der Cytochrom-c-Oxidase von P. denitrificans. Die Zuordnung der Protonenbewegung zu den einzelnen Schritten des katalytischen Zyklus der Cytochrom-c-Oxidase ist immer noch ein Gegenstand zahlreicher Kontroversen. Obwohl von Ruitenberg et al. (2000) durch Spannungsmessungen gezeigt wurde, daß die Reduktion von Häm a während des ersten Elektrontransfers in das oxidierte Enzyme eine schnelle Protonenaufnahme von der gegenüberliegenden Seite der Membran bewirkt, wurden diese Ergebnisse angezweifelt. Daher sollte mit einer unabhängigen und direkten Methode herausgefunden werden, ob Protonen bereits während des ersten Schrittes des katalytischen Zyklus aufgenommen werden. Dazu wurde ns-zeitaufgelöste Blitzlicht-Absorptionsspektroskopie in Kombination mit pH-sensitiven Farbstoffen genutzt, und zwar sowohl mit Fluorescein kovalent an der Proteinoberfläche gebunden als auch mit Phenolrot löslich im Medium vorliegend. Zur kovalenten Kopplung von thiolreaktiven Farbstoffen mußten zuerst die nötigen Voraussetzungen geschaffen werden. Dazu wurde in dieser Arbeit ein Mutagenesesystems für sowohl Untereinheit I als auch Untereinheit II etabliert und eine oberflächencysteinfreie Variante und elf Einzelcystein-Varianten hergestellt, exprimiert und aufgereinigt sowie die Enzymaktivitäten überprüft. Danach wurde ein Protokoll zur Kopplung der Einzelcysteinvarianten mit Iodoacetamidfluoresein ausgearbeitet und die Varianten Fluorescein-markiert. Dabei zeigte es sich, daß nur sieben Varianten erfolgreich mit IAF reagierten. Mittels dieser AF-markierten Varianten konnte die Pufferkapazität an der Oberfläche der Cytochrom-c-Oxidase bestimmt werden. Es zeigte sich, daß die Pufferkapazität des Enzyms in Lösung im Vergleich zu Bakteriorhodopsin dreimal so groß ist, an der Oberfläche sogar 10-15mal so groß. Dies deutet auf eine hohe Anzahl protonierbarer Gruppen um die für die Markierung ausgewählten Aminosäuren im Bereich der Eintrittsstellen der Protonen hin. Die gezielte Übertragung eines Elektrons auf die Cytochrom-c-Oxidase erfolgte durch Licht anregbare Rutheniumkomplexe. In unserem Meßsystem war die Elektronentransfereffizienz von [Ruthenium(2,2‘-bipyridin)2]2quarterpyridin am höchsten. Nach einer sorgfältigen Optimierung der Meßbedingungen wie pH-Wert, Ionenstärke und Energie des Lasers konnte eine 10-15 %ige Reduktion von Häm a mit einer Zeitkonstanten von t = 13,7 ± 2,4 µs nachgewiesen werden. Die Protonenkonzentrationsänderungen im Medium konnten durch Phenolrot verfolgt werden. Durch den Vergleich von Funktionsvarianten, bei denen jeweils einer oder beide Protoneneingangswege blockiert sind, konnte ein Modell für die Protonenaufnahme und -abgabe während der Einelektronen-Reduktion der Cytochrom-c-Oxidase entwickelt werden. Dies konnte durch Messungen an in Liposomen inkorporierter wt Cytochrom-c-Oxidase verifiziert werden. Die Nettoprotonenaufnahme von der N-Seite der Cytochrom-c-Oxidase beträgt somit 0,3 H+ für das im O-E Schritt aufgenommene Elektron. Die Variante CS-I302C-AF wurde dazu genutzt, die Oberflächenladungsdichte an der N-Seite der Cytochrom-c-Oxidase zu bestimmen. Die Oberflächenladungsdichte auf der N-Seite des Enzyms in der Nähe zum Eingang des K-Wegs ist negativ und beträgt 0,5 e-/1000 Å2.
Ziel dieser Arbeit ist es, einen Überblick über die Verhaltensweisen zoolebender Zwergschimpansen (Pan paniscus Schwarz 1929) zu geben. Dabei nimmt die Beschreibung des Sozialverhaltens eine zentrale Stellung ein. Dieser Aspekt ist von besonderem Interesse, weil die Zwergschimpansen oder Bonobos durch eine regelmäßige Überflutung großer Teile ihres Lebensraumes zu einer stärker arborealen Lebensweise gezwungen sind (s. HOFW 1975) als die zweite Schiopansenart, Pan troglodytes. Das läßt neben morphologischen auch ethologische Anpassungen an ein Baumleben erwarten, und zwar sowohl in Bereichen wie Lokomotion etc.. als auch in Bezug auf das Sozialverhalten. Gerade auf diesem Gebiet aber ist unser ohnehin bruchstückhaftes Wissen über die Ethologie des Bonobo besonders gering....
Untersuchung der Wirkung von Cyclooxygenase-Inhibitoren auf die Entstehung der Arteriosklerose
(2006)
In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der COX-2-selektiven NSAIDs Celecoxib und Rofecoxib sowie des traditionellen nichtselektiven NSAIDs Naproxen auf die Entstehung und Entwicklung von Arteriosklerose in ApoE-defizienten Mäusen untersucht. Befunde über kardiovaskuläre Risiken dieser Medikamentengruppe sowie die Beobachtung, dass COX-2 in arteriosklerotischen Plaques exprimiert wird, ließen sowohl die Hypothese von pro- als auch von antiatherogenen Wirkungen zu. Zunächst wurde die Funktionsfähigkeit des Versuchsdesigns nachgewiesen. In den Aorten von Diätgefütterten ApoE-defizienten Mäusen entwickelten sich im Alter von 22 Wochen Plaques, in denen typische atherogene sowie proinflammatorische Proteine exprimiert wurden. Die Effektivität und Selektivität der jeweiligen NSAIDs wurde durch Messung der Urinkonzentration relevanter Metabolite nachgewiesen, die aus der COX-2-vermittelten PGI2- und der COX-1-vermittelten TXA2-Synthese stammten. Erwartungsgemäß hemmten sowohl die Coxibe als auch Naproxen die Synthese von PGI2, während die TXA2-Produktion nur unter Naproxen reduziert wurde. Im Vergleich zu Kontrolltieren führte die chronische Behandlung mit Celecoxib und Rofecoxib tendenziell zu kleineren Plaques in der Aorta von diätgefütterten ApoE-defizienten Mäusen. In den Plaques wurde die Proteinexpression von COX-2 durch die Behandlung mit den NSAIDs nicht beeinflusst. Dies deutet darauf hin, dass die Reduktion der Plaques in den Aorten eher durch eine Hemmung der COX-2-Aktivität oder durch COX-unabhängige Effekte als über eine Inhibition der COX-2-Proteinexpression zustande kommt. Die Blutfettwerte wurden durch die eingesetzten NSAIDs nicht verändert, was den Daten aus der Literatur entspricht. ApoE-defiziente Mäuse, die normales Futter erhalten hatten und mit Celecoxib oder Rofecoxib behandelt wurden, entwickelten vereinzelt intimale Läsionen, während Kontrolltiere oder Naproxen-behandelte Mäuse in keinem Fall Plaques zeigten. Diese Ergebnisse könnten einen Hinweis dafür liefern, dass durch Coxibe COX-unabhängige Effekte ausgelöst werden, welche die Arteriogenese einleiten. Die umfangreichen Untersuchungen lassen auf eine unterschiedliche Beteiligung von NSAIDs bei der Arteriogenese schließen. Dabei scheinen die selektiven COX-2-Inhibitoren Celecoxib und Rofecoxib eine andere Rolle als Naproxen, dem nichtselektiven COX-2-Inhibitor, zu spielen. In ApoEdefizienten Diät-Mäusen wurde die Arteriosklerose durch Celecoxib und Rofecoxib über COX-2-abhängige Mechanismen inhibiert, wobei der Effekt vermutlich durch den stärker ausgeprägten Effekt der Hypercholesterinämie überlagert war. In den Kontroll-Mäusen (mit Normalfutter) dagegen könnte die Arteriogenese unter Celecoxib und Rofecoxib durch COX-unabhängige Mechanismen eingeleitet worden sein. Dabei scheint das Stadium der Arteriosklerose eine wichtige Rolle zu spielen. Zusammenfassend deuten die Ergebnisse daraufhin, dass Coxibe die Initiation der Arteriosklerose eher begünstigen, während bei weiter fortgeschrittenen Plaques tendenziell antiatherogene Effekte zu beobachten waren, die möglicherweise auf die entzündungshemmenden Eigenschaften der Substanzen zurückzuführen sind. Nachdem jedoch diese Effekte bisher nur in Maus-Modellen beobachtet und untersucht wurden, bleibt die Frage, wie NSAIDs thrombotische Ereignisse im Patienten auslösen, weiterhin offen. Erst kürzlich wurde beschrieben, dass unter Rofecoxib schon nach kurzer Behandlungsdauer Herzinfarkte ausgelöst werden können (Levesque et al. 2006). Weitere Daten deuten daraufhin, dass NSAIDs über COX-unabhängige Mechanismen dazu führen, dass sogar nach dem Absetzen des Medikament auf lange Sicht ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung kardiovaskuläre Erkrankungen bestehen bleibt (Merck, APPROVe Report 2006; unter www.merck.com). Die genauen Mechanismen dieser Langzeiteffekte von NSAIDs auf das vaskuläre System sind zurzeit nach wie vor unklar. Abschließend kann jedoch aufgrund der aktuellen Datenlage vermutet werden, dass Coxibe eine Schädigung von vaskulären Zellen verursachen können und das Risiko für kardiovaskuläre Effekte eher erhöhen als antiatherogene Effekte zu erzeugen und die Arteriosklerose zu verbessern.
Arten von Aschersonia Mont. (Anamorphe von Hypocrella spp., Clavicipitaceae, Hypocreales, Sordariomycetidae, Askomycota) parasitieren Weiße Fliegen und Schildläuse. Petch (1921) stellte eine Monographie über Hypocrella und Aschersonia vor. Seit dieser Zeit wurden einige Arten neu beschrieben und vereinzelte Artkomplexe revidiert. Die vorgestellte Arbeit ist seit rund 80 Jahren das umfassendste Werk über die Gattung Aschersonia. Hierfür wurden Proben in Kuba, Malaysia, Mexico, Panama, Taiwan und Thailand gesammelt und z.T. kultiviert. Es werden 20 Arten detailliert vorgestellt und illustriert. Die Arten sind: A. acutispora, A. aurantiaca, A. australiensis, A. badia, A. basicystis, A. blumenaviensis, A. caespiticia [A. insperata, syn. nov.], A. columnifera, A. crenulata, A. duplex, A. hypocreoidea [A. goldiana, syn. nov.; A. confluens, syn. nov.], A. marginata, A. oxystoma, A. philippinensis, die Anamorphe von H. rhombispora, A. samoensis, A. taitensis [A. aleyrodis, syn. nov.; A. placenta, syn. nov.; A. tamurai, syn. nov.], die Anamorphe von H. tubulata, A. turbinata [A. coffeae, syn. nov.] und A. viridans. Hierzu wurden auch wichtige Merkmale wie Stromataform und Konidiengröße in situ und in vitro charakterisiert. Mit anderen gültigen Beschreibungen von Arten, die nicht untersucht werden konnten, gibt es 32 Arten. Zum ersten Mal wurden ausführliche Daten über die Wirtsinsekten sowie die Trägerpflanzen berücksichtigt. Erstmals wurde die Verbreitung der Aschersonia-Arten kritisch beleuchtet. Die Funde von A. acutispora, A. basicystis, A. hypocreoidea, A. oxystoma, A. turbinata und A. viridans sind Erstnachweise für Panama. Die Funde von A. australiensis, A. hypocreoidea, A. marginata und A. tubulata sind Erstnachweise für Taiwan. Zum ersten Mal wird für Arten der Gattung Aschersonia ein dichotomer Bestimmungsschlüssel vorgestellt. Es werden drei Hypothesen zur Phylogenie der Aschersonia spp. vorgestellt: 1. Die Stellung der Aschersonia spp. innerhalb der Clavicipitaceae basierend auf Sequenzdaten des LSU-Gens: Aschersonia bildet eine schwach unterstützte Paraphylie, dabei steht A. badia basaler als die übrigen Aschersonia-Arten. 2. Die Beziehung der Aschersonia spp. zueinander: A. badia und eng verwandte Arten parasitieren ausschließlich Weiße Fliegen und stehen basal. Arten einer zweiten Gruppe parasitieren Arten der Aleurodidae und Coccidae und Arten einer dritten Gruppe parasitieren ausschließlich Arten der Coccidae. 3. Eine phylogenetische Hypothese basierend auf Sequenzdaten der ITS: Es gibt noch zu wenig Sequenzen um eine eindeutige Aussage treffen zu können.
In dieser Arbeit wurden die neuronalen Glutamattransporter EAAT4 (Excitatory Amino Acid Transporter) und EAAT3 in einem HEK (Human Embryonic Kidney) Zellsystem untersucht, in dem die Transporter transient exprimiert wurden. Diese Proteine katalysieren den Transport von Glutamat entgegen des Konzentrationsgradienten aus dem Extrazellulärraum in das Zytosol. Die Energie des Transports, stammt aus dem Kotransport von Natriumionen und Protonen und dem Gegentransport von Kaliumionen. Für EAAT3 ist bekannt, dass das Verhältnis 3 Na+:1 H+:1 Glutamat:1 K+ beträgt, wodurch 2 positive Ladungen pro Transportzyklus verschoben werden. Das führt zu einem messbaren positiven Einwärtststrom. Dieser Strom ist für EAAT4 wesentlich schwächer und die Stöchiometrie ist unbekannt. Beide Proteine besitzen eine Anionenkanaleigenschaft, die bei der Bindung von Na+ und der Bindung von Glutamat voll aktiviert wird. Diese Eigenschaft ist bei EAAT4 besonders ausgeprägt. Die Transporter wurden in Abhängigkeit von verschiedenen intra- und extrazellulären Ionen- und Substratkompositionen, sowie bestimmter Potentialen und der Temperatur elektrophysiologisch charakterisiert. Die Charakterisierung der stationären Eigenschaften des wenig bekannten Transporters EAAT4 brachten Erkenntnisse zu Tage, die 1) Klarheit über die apparenteAffinitäten der Substrate, insbesondere Glutamat und Na+ bringen 2) neu in Bezug auf die Spannungsabhängigkeit der apparenten Affinität von Glutamat sind. Die Untersuchung der vorstationären Ableitungen waren fruchtbar in Bezug auf a) die Ähnlichkeit des Transports, der durch EAAT4 katalysiert wird, zu anderen Glutamattransporter b) spezifische Parameter des Transports, wie den Unterschied in der Transportgeschwindigkeit c) die neuartige Kinetik der Anionenleitfähigkeit. Aus den Daten ergibt sich folgendes Bild über den Mechanismus des Transports. Die Substrate binden an EAAT4, im Vergleich zu den anderen Transportern, mit wesentlich höheren Km [ (0,6 ± 0,1)µM für Glutamat und (42,3 ± 5,2)mM für Na+]. Die Bindung von Glutamat, die schnell verläuft, ist, wie bei EAAT3, stark Na+ abhängig, genau wie die Leckleitfähigkeit, die ebenfalls durch Na+ aktiviert wird. Die folgenden glutamatabhängigen, vorstationären Reaktionen, inklusive der Translokation der Substrate verläuft wesentlich langsamer, als in anderen Transportersubtypen. Die Folge ist eine geringe Umsatzrate (<3 1/s) und daher ein geringer Transportstrom [(-3,6 ± 2,8)pA]. Die Daten zeigen, dass EAAT4 trotzallem denselben prinzipiellen Mechanismus, wie die anderen Subtypen folgt. Das Verhalten der Anionenleitfähigkeit zeigt allerdings erhebliche Unterschiede zu anderen Subtypen, da die Anionenleitfähigkeit durch negative Membranpotentiale inhibiert wird. Dies wird durch die Inhibierung der K+-Relokationsreaktion des Transporters erklärt. Zusammengenommen spricht die geringe Umsatzrate und die hohe apparente Affinität für Glutamat dafür, dass EAAT4 ein hochspezialisierter Transporter für die schnelle Pufferung von Glutamat und den langfristigen Transport von Glutamat bei niedrigen Konzentrationen ist. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Temperaturabhängigkeit des Glutamattransports durch EAAT3 untersucht. Die Temperaturabhängigkeit des Transports unter stationären Bedingungen zeigte interessante neue Ergebnisse. Die Ergebnisse lassen Aussagen zu bezüglich 1) der Thermodynamik der Bindung der Substrate und 2) der molekularen Natur bestimmter Teilreaktionen im Zyklus Die Bindung eines nicht-transportierbaren Glutamatanalogons zeigt, dass die Inhibitorbindung exotherm ist (H = 30,0 ± 3,3)kJ/mol. Die Bindung von Na+ an den unbeladenen Transporter ist im Gegensatz dazu nicht signifikant von der Temperatur abhängig mit H = (20,8 ± 21,5)kJ/mol. Es ist ebenfalls interessant, dass die Freie Enthalpie des Gesamtzyklus beiEAAT4 signifikant grösser ist als bei EAAT3, was in Übereinstimmung mit der höheren, apparenten Glutamataffinität ist [GEAAT4 = (35 ± 1)kJ/mol vs. .GEAAT3 = (30 ±1)kJ/mol]. Die Temperaturabhängigkeit der vorstationären Kinetik von EAAT3 enthüllt gleichfalls neue Ergebnisse. Zum einen ist die Bindung des Na+ Ions and den unbeladenen Transporter mit einer Konformationsänderung begleitet. Im Gegensatz dazu hat die Reaktion, die der Glutamatbindung zugeordnet wurde, nur eine moderate Aktivierungsenthalpie [H‡ = (39 ± 23 )kJ/mol], wie für eine diffusionskontrollierte Reaktion erwartet wird. Die nachfolgenden zwei langsameren Phasen des Transportstroms, die in der Literatur der Aktivierung der Anionenleitfähigkeit und der Glutamattranslokation zugeordnet wurden, sind mit hohen Aktivierungsenthalpien verbunden [H‡ = (121 ± 12)kJ/mol bzw. (94 ± 4)kJ/mol]. Dies bedeutet zum einen, dass zur Öffnung des Anionenkanals und der Translokation von Glutamat eine grössere Umstrukturierung des Transporters notwendig ist. Durch die hier gefundenen, neuen Daten für die Translokationsgeschwindigkeit bei physiologischen Temperaturen kann die Hypothese in Frage gestellt werden, die besagt, dass Glutamattransporter nicht schnell genug seien, um zur schnellen Entfernung des Glutamats nach der synaptischen Transmission beizutragen. Es scheint vielmehr so, dass bei physiologischen Temperaturen und Membranpotentialen, die Translokation von Glutamat hinreichend schnell verläuft.
Die Cytochrom c Oxidase von Paracoccus denitrificans katalysiert die Reduktion von Sauerstoff zu Wasser und „pumpt“ zusätzlich vier Protonen von der cytoplasmatischen Seite auf die periplasmatische Seite der Cytoplasmamembran. Die Spaltung des molekularen Sauerstoffes im binuklearen Zentrum erfolgt im katalytischen Zyklus des Enzyms bei der Umwandlung des Intermediates A, in welchem molekularer Sauerstoff an das Häm a3 Eisen gebunden ist, in das Intermediat PM durch spontane elektronische Umorganisation. Drei der dazu benötigten vier Elektronen werden von den Metallzentren geliefert. Das vierte Elektron wird sehr wahrscheinlich von einer Aminosäure in der Nähe des binuklearen Zentrums durch Bildung eines Aminosäureradikals beigesteuert. Dieses Radikal sollte in den Intermediaten PM und F• des katalytischen Zyklus der Cytochrom c Oxidase vorhanden sein. Durch Reaktion von stöchiometrischen Mengen an Wasserstoffperoxid mit dem vollständig oxidierten Enzym lassen sich PM; F• und F-Intermediate künstlich erzeugen und durch ihre Maxima in Absorptionsdifferenzspektren charakterisieren. Mit paramagnetischer Elektronenresonanzspektroskopie (EPR-Spektroskopie) können Struktur und Dynamik paramagnetischer Zentren in Proteinmolekülen untersucht werden. Mit dieser Methode konnte in mit Wasserstoffperoxid generierten PM und F•-Intermediaten ein Tyrosinradikal nachgewiesen werden. Der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war die Identifikation dieses Tyrosins mittels einer Mutagenesestudie. Dazu wurden Tyrosinvarianten (Y35F, Y167F, Y267F, Y280H, Y328F und Y414F) aus Untereinheit I, die einen maximalen Abstand von 25 Angström vom binuklearen Zentrum aufweisen, mit Hilfe von Absorptions- und EPR-Spektroskopie charakterisiert. Auf diese Weise konnte nachgewiesen werden, dass Tyrosin 167 eindeutig der Ursprungsort des Tyrosinradikals ist, das bei der Generierung von PM- und F•-Intermediaten der Cytochrom c Oxidase mit Wasserstoffperoxid entsteht. Da die Variante Y167F jedoch eine hohe katalytische Aktivität aufwies und in der Lage war, die Oxoferrylintermediate PM; F• und F zu bilden, konnte gleichzeitig gezeigt werden, dass dieses Tyrosin nicht der primäre Donor des vierten Elektrons sein kann, das im katalytischen Zyklus des Enzyms für die Spaltung der Sauerstoffbindung benötigt wird. Diese Ergebnisse wurden dahingehend interpretiert, dass Tyrosin 167 eine thermodynamische Senke darstellt, in die das von einem unbekannten kurzlebigen Elektronendonor bei der Wasserstoffperoxidreaktion gebildete Radikal verschoben wird. Als Donor des vierten Elektrons für die Sauerstoffspaltung kommt auch Tryptophan 272 infrage. Daher wurde auch die Variante W272M spektroskopisch charakterisiert. Diese Variante war katalytisch inaktiv und nicht in der Lage in Reaktion mit Wasserstoffperoxid die Intermediate PM, F• und F zu bilden. Es ließen sich weder das Tyrosin-167-Radikal noch ein anderes Radikal nachweisen. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass Tryptophan 272 möglicherweise der ursprüngliche Donor des vierten Elektrons für die Sauerstoffspaltung im katalytischen Zyklus der Cytochrom c Oxidase sein könnte. Während des PM zu F-Übergangs im katalytischen Zyklus der Cytochrom c Oxidase werden zwei Protonen gepumpt. Diese können vom Enzym entweder über den D-Weg oder den K-Weg aufgenommen werden. Eine Untersuchung des PM zu F-Übergangs von D-Weg- und K-Weg-Varianten der Cytochrom c Oxidase kann Aufschluss über die Beteiligung der beiden Protonenaufnahmewege des Enzyms an diesem Schritt des katalytischen Zyklus geben. Daher wurde die Reaktion der D-Weg Varianten D124N, N131D, Y35F und E278Q und der K-Weg Variante K354M mit Wasserstoffperoxid absorptionsspektroskopisch untersucht. Durch diese Experimente konnte die zentrale Bedeutung des D-Weges für die Protonentranslokation im PM zu F-Übergangs bestätigt, aber auch ein gewisser Einfluss des K-Weges nicht ausgeschlossen werden. Außerdem wurde der PM zu F-Übergang der Variante R437N, die eventuell Teil des noch nicht konkret identifizierten Protonenaustrittsweg der Cytochrom c Oxidase ist, untersucht.
Die Entwicklung neuer und die Adaption bestehender Methoden ist weiterhin eine der vordringlichsten Aufgaben der Forschung zur Bekämpfung der tödlichen Infektion mit dem HI-Virus. So wurde im ersten Teil dieser Arbeit untersucht, ob die Methode der Generierung MHC-unabhängiger Immunantworten gegen Oberflächenproteine, die bereits in der experimentellen Tumortherapie verwendet wird, für die HIV Therapie adaptiert werden kann. In dieser Arbeit war das HIV Hüllprotein Env das Zielmolekül. Der zweite Teil der Arbeit versucht, Erkenntnisse aus der HIV-Forschung für alternative Tumortherapieansätze am Beispiel des kutanen T-Zell Lymphoms zu verwenden. Der erste Teil beschäftigt sich mit der Verwendung des Hüllproteins Env von HIV als Zielstruktur für die Generierung MHC-unabhängiger Immunantworten gegen HIV-infizierte Zellen. Hierfür wurden CD4, 5-Helix sowie zwei Varianten von DC-SIGN als HIV Env-bindende Liganden als chimäre T Zell-Rezeptoren, zusammen mit Teilen von CD3 und CD28, in humanen Zellen exprimiert. Die Funktionalität der Konstrukte konnte gezeigt werden, ein therapeutischer Effekt in vitro war jedoch nicht nachweisbar. Der zweite Teil untersucht die Verwendung des HIV Hüllproteins als therapeutischem Gen zur Behandlung des kutanen T-Zell Lymphoms. Die Pseudotypisierung von MLV-basierenden Vektoren mit HIV Env ermöglicht das zielzellspezifische Eindringen der Vektoren in humane CD4-positive Zellen. Aus diesen Zellen besteht auch das kutane T Zell Lymphom (CTCL). MLV/HIV pseudotypisierte retrovirale Vektoren, die die 89.6P Variante des HIV Hüllproteins Env als therapeutisches Gen transportieren, wurden generiert und zunächst in vitro getestet. Das Wachstum von CTCL-Zellen konnte durch Zugabe dieser Vektorpartikel verhindert und die Zellzahl unter den Ausgangswert reduziert werden. Die Verwendung im Maus-Experiment zeigte einen vergleichbaren Erfolg wie die Verwendung der Herpes simplex Thymidinkinase, obwohl von syn Env nur etwa ein Viertel der Vektorpartikel appliziert wurde. Ein bystander-Effekt ließ sich damit also nachweisen. Die Verwendung chimärer T-Zell-Rezeptoren für MHC-unabhängige Immunantworten gegen HIV-Reservoirs im Körper ist ein vielversprechender Therapieansatz. Neben der Verwendung HIV Env-bindender zellulärer Proteine könnte das Spektrum möglicher Liganden durch die Verwendung Subtypen-übergreifender, nicht-inhibitorischer Antikörper, erweitert werden. Dies ist möglich, da für die Immunantwort lediglich die Bindung an das Hüllprotein notwendig ist. Zur Erhöhung des therapeutischen Effektes des retroviralen Gentransfers zur Therapie kutaner T-Zell Lymphome eignen sich hoch fusogene virale Hüllproteine, die auf diese Weise einen noch stärkeren bystander-Effekt ermöglichen. Die in dieser Arbeit beschriebenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieser sehr groß sein muss, solange replikationsinkompetente Vektoren verwendet werden.
Mitochondrien, Organellen der oxidativen Phosphorylierung, sind in vielfältiger Weise an Alterungsprozessen in unterschiedlichen Modellorganismen beteiligt. Viele Mechanismen und Faktoren, die das Altern beeinflussen, scheinen konserviert zu sein. In dem in dieser Arbeit untersuchten Ascomyzeten Podospora anserina treten z. B. altersabhängige Reorganisationen der mtDNA auf, die zu einem Verlust lebensnotwendiger Gene führen können. In Menschen wurden ebenfalls Umstrukturierungen des mitochondrialen Genoms in unterschiedlichen Geweben mit fortschreitendem Alter beschrieben. Umgekehrt treten manche Faktoren, die die Lebensspanne beeinflussen, nur in einigen Modellsystemen auf. Hierzu gehört z. B. die Induktion der alternativen Oxidase in vielen langlebigen P. anserina-Mutanten. Diese Modifikation in der Atmungskette kann in S. cerevisiae und Säugern nicht beobachtet werden, da diesen Organismen eine alternative terminale Oxidase der oxidativen Phosphorylierung fehlt. Der Fragestellung, wie die Atmungskette im Falle der exklusiven PaAOX-abhängigen Respiration in der unsterblichen Mutante ex1 hinsichtlich der Zusammensetzung und kinetischer Eigenschaften des Elektronentransports charakterisiert ist, wurde in der vorliegenden Arbeit nachgegangen. Über die funktionalen Eigenschaften der Mitochondrien hinaus ist auch die Morphologie dieser Organellen altersabhängiger Änderungen unterworfen. Hinsichtlich der Gestalt der Mitochondrien in verschiedenen Altersstadien ist nur sehr wenig bekannt. Bisher steht nur fest, dass der P. anserina-Wildstamm „S“ im mittelalten Stadium filamentöse Mitochondrien aufweist. Ob und in welchem Ausmaß es zu Veränderungen der mitochondrialen Morphologie während des Alterns im Wildstamm „s“ und der Mutante grisea kommt, wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit analysiert. In der vorliegenden Arbeit wurde darüber hinaus PaDnm1 als putativer mitochondrialer Teilungsfaktor charakterisiert. Insbesondere die Modulation der PaDnm1-Expression durch Überexpression bzw. Deletion soll zeigen, welchen Einfluss PaDnm1 auf die mitochondriale Morphologie und andere phänotypische Parameter wie z. B. die Lebensspanne hat. Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen führten zu folgenden Ergebnissen: 1. Im Wildstamm „s“ wurde im Gegensatz zu ex1 durch enzymkinetische Analysen eine starke Interaktion der Komplexe I und III nachgewiesen. Ein Großteil der Komplexe I und III ist im Wildstamm „s“ in Form von Superkomplexen organisiert. In der Mutante ex1 liegen die Komplexe I und III dagegen hauptsächlich frei vor. Die spezifische Aktivität der Cytochrom-c-Reduktase ist in ex1 niedriger als im Wildstamm „s“. 2. Seneszente Isolate des Wildstammes „s“ und der PaDnm1::ble-Mutante weisen im Gegensatz zur Mutante grisea eine starke Freisetzung von Wasserstoffperoxid auf. 3. Juvenile und mittelalte Wildstamm „s“-Isolate enthalten überwiegend kurze, filamentöse Mitochondrien, die entlang der Hyphenachse im Cytoplasma orientiert sind. Im seneszenten Stadium kommt es zu einer starken mitochondrialen Fragmentierung. Der Übergang von einer filamentösen zu einer sphärischen Morphologie dieser Organellen tritt auch in Mutante grisea auf. In ex1-Hyphen sind hauptsächlich filamentöse Mitochondrien enthalten. Initiale Analysen zur mitochondrialen Feinstruktur zeigen, dass in Wildstamm „s“ und Mutante grisea eine lamellenartige Cristaestruktur erkennbar ist. In der Mutante ex1 hingegen erscheinen die Cristae ungeordneter und weniger zahlreich. 4. Die Mitochondrienfragmentierung im seneszenten Wildstamm „s“ korreliert mit einer Induktion der Transkription von PaDnm1. In Mutante grisea ist die PaDnm1-Transkriptmenge während des Alterns konstant, obwohl sich die mitochondriale Morphologie wie im Wildstamm „s“ verändert. Überexpression von PaDnm1 führt zur Mitochondrienfragmentierung während die gezielte Deletion dieses Gens eine starke Elongation der Mitochondrien zur Folge hat. PaDnm1 ist somit das erste in einem filamentösen Pilz charakterisierte Gen der mitochondrialen Teilungsmaschinerie. 5. PaDnm1::ble-Isolate zeigen im seneszenten Stadium mitochondriale Fragmentierung wie Wildstamm „s“ und Mutante grisea. Das mitochondriale Genom von PaDnm1::ble ist stabilisiert, d. h. die Bildung der seneszenzfördernden plDNA wird unterdrückt. Die mittlere Lebensspanne der PaDnm1::ble-Mutante ist deutlich (> Faktor 10) gegenüber der des Wild-stammes „s“ erhöht. Bemerkenswerterweise zeigt PaDnm1::ble im Gegensatz zu anderen langlebigen P. anserina-Mutanten nach der Sporenkeimung keine physiologischen Defekte: Wuchsrate, männliche und weibliche Fertilität, Myzelmorphologie und Mitochondrien-segregation während der Ascosporengenese sind nicht eingeschränkt. Allerdings weist PaDnm1::ble eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Ammoniumazetat auf. Dies äußert sich in einer Inhibierung der Sporenkeimung und einer Verringerung der Wuchsrate bei Anzucht der Mutante auf AmAc-haltigem Medium.
Replizierende Murine Leukämieviren (MLV) können wertvolle Werkzeuge für die humane Krebsgentherapie werden, da sie das Transgen innerhalb des gewünschten Gewebes verteilen, ihr Genom stabil integrieren und einen natürlichen Tumortropismus aufweisen. In vorliegender Arbeit wurde ein System zur visuellen Analyse der MLV‐Replikation sowie der Virusbindung an Zielzellen mittels Einfügung fluoreszierender Proteine etabliert und als Werkzeug für dasDesign und die Optimierung dieser Viren als Gentherapievektoren benutzt. Zuerst wurde die Kodierungskapazität dieser Retroviren durch Aufteilen der viralen Gene auf zwei semireplikative Vektoren vergößert. Die Kopplung der Genome mit fluoreszierenden Proteinen ermöglichte ebenfalls in diesem Zusammenhang die Beobachtung der Repliktion aber auch die einfache Aufdeckung von Rekombinationsereignissen. Die Ergebnisse zeigten den Bedarf weiterer Optimierungen, stellten allerdings einen Vorreiter auf diesem Forschungsgebiet dar und zeigten das Potential dieses Systems auf (Sliva et al., 2004a). Zusätzlich zum natürlichen Tumortropismus sollte die Sicherheit von replizierenden Retroviren für die Tumortherapie erhöht werdn. Gezielte Veränderungen des ecotropen Hüllproteins zu EGFR‐exprimierenden Zellen mittels gerichteter Evolution sowie der Versuch, den Wirtstropismus des Env mit der Insertion des Liganden SDF‐1α auf humane CXCR4‐exprimierende Zellen auszuweiten, sind jedoch gescheitert. Diese Daten müssen sich in die Reihe der erfolglos gebliebenen Versuche, den Wirtstropismus des ecotropen Env auf humane Zellen auszuweiten, einreihen (Sliva et al., 2004b). Abschließend wurde shRNA als therapeutisches Effektormolekül erfolgreich mittels replikationskompetenter MLV in Zielzellen überragen, was zur deutlichen Herabsetzung des Proteinlevels des Zielproteins der siRNA führte (Sliva et al., 2006). Diese modifizierten Viren sind ein gutes Werkzeug zur einfachen in vitro Untersuchung von Genfunktionen, und könnten auch eine Erleichterung für die Untersuchung von Genfunktionen innerhalb von proliferierendem Tumorgewebe darstelln. Des Weiteren präsentieren die Ergebnisse und Beobachtungen dieser Arbeit einen großen Schritt in Richtung Anwendung dieser Virn für die humane Gentherapie. Denn gekoppelt mit z.B. einer tumorspezifischen Expression der shRNA‐Expressionskassette und der intelligenten Wahl der siRNA‐(Ziel)Sequenz, die nach Applikation zum Tod von malignen Tumorzellen führt, wären sie die perfekte Waffe gegen solide Tumoren.
Das Zytolysin ClyA von Escherichia coli ist der Prototyp einer neuartigen Familie von porenbildenden, bakteriellen Zytolysinen, welche in verschiedenen Vertretern der Enterobacteriaceae vorkommen. Es handelt sich bei diesem Toxin um ein Protein von 34 kDa, das hämolytische und zytotoxische Aktivität aufweist und das in Zellmembranen stabile Poren einführt, indem es sich zu ringförmigen ClyA-Oligomeren zusammenlagert. Die vorliegende Dissertation sollte einen Beitrag zur funktionalen Charakterisierung des ClyA-Proteins von E. coli K12 liefern. Insbesondere sollte die Bedeutung der N-terminalen Region für den Sekretionsmechanismus, für die hämolytische und porenbildende Aktivität, für die Interaktion mit Zielmembranen und für die Fähigkeit zur Oligomerisierung des Proteins analysiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden hierzu ClyA-Derivate mit spezifischen Mutationen innerhalb des N-terminalen Bereiches hergestellt und auf ihre Funktions-tüchtigkeit überprüft. Diese Untersuchungen gingen von den bestehenden Erkenntnissen aus, dass die Sekretion von ClyA über eine periplasmatische Zwischenstufe verläuft und keine N-terminale Prozessierung des Toxins erfolgt. Es wurde festgestellt, dass bereits kurze, sukzessive Deletionen innerhalb der beginnenden N-terminalen Region, wie die Deletion der Aminosäuren an Position zwei bis fünf (ClyA∆2-5) und sechs bis zehn (ClyA∆6-10), einen deutlich hemmenden Effekt auf den Transfer von ClyA über die zytoplasmatische Membran zur Folge hatte, welcher durch die Deletion der Aminosäuren an Position zwei bis zehn (ClyA∆2-10) weiter verstärkt wurde. Größere N-terminale Mutationen, wie die Deletionen der Aminosäuren an Position zwei bis fünfzehn (ClyA∆2-15) und zwei bis zwanzig (ClyA∆2-20) sowie interne Deletionen, die Aminosäuren jenseits von Aminosäureposition zehn betrafen (ClyA∆6-15, ClyA∆11-15, ClyA∆11-20, ClyA∆16-20), führten zur fast vollständigen Inhibierung (ClyA∆6-15) oder totalen Blockierung (ClyA∆11-15, ClyA∆11-20, ClyA∆16-20, ClyA∆2-20, ClyA∆2-15) des Transports von ClyA in den periplas-matischen Raum. Während die hämolytische Aktivität der ClyA-Mutanten ClyA∆2-5, ClyA∆6-10 und ClyA∆2-10 zwar abnahm, jedoch im Vergleich zu der des wildtypischen ClyA-Proteins noch verhältnismäßig hoch war, beeinflussten die weiteren Deletionen (ClyA∆6-15, ClyA∆11-15, ClyA∆11-20, ClyA∆16-20, ClyA∆2-15, ClyA∆2-20) die hämolytische Eigenschaft des Toxins ganz erheblich. So verursachten diese Mutationen eine massive Abnahme (ClyA∆6-15) bzw. einen kompletten Verlust (ClyA∆11-15, ClyA∆11-20, ClyA∆16-20, ClyA∆2-20, ClyA∆2-15) der zytolytischen Aktivität des ClyA-Proteins gegenüber Erythrozyten. Untersuchungen an künstlichen Lipidmembranen ergaben, dass die Deletion der Aminosäuren an Position zwei bis fünf, sechs bis zehn und zwei bis zehn die porenbildende Aktivität des ClyA-Proteins nur unwesentlich beeinträchtigt. Dagegen störte die Deletion der Aminosäuren an Position zwei bis fünfzehn und zwei bis zwanzig die porenbildende Eigenschaft von ClyA so tiefgreifend, dass keine (ClyA∆2-20) oder nur Transmembranporen mit extrem geringem Innendurchmesser (ClyA∆2-15) erzeugt wurden. Daneben spiegelten instabile Membranporen, die durch die ClyA-Mutanten ClyA∆6-15, ClyA∆11-15, ClyA∆11-20 und ClyA∆16-20 im künstlichen Lipid-Bilayer gebildet wurden, die negativen Auswirkungen dieser Mutationen auf die porenbildende Aktivität des Toxins wider. Die gesammelten Daten unterstreichen somit nicht nur die essentielle Bedeutung der N-terminalen Region des Zytolysins ClyA von E. coli K12 für den Transport in den periplasmatischen Raum, sondern auch für die hämolytische und porenbildende Eigenschaft des Toxins. Allerdings wurde die hämolytische und porenbildende Aktivität des ClyA-Proteins erst durch Mutationen ab Aminosäureposition zehn signifikant beeinträchtigt. Demgegenüber verdeutlichten Untersuchungen zum Bindungsverhalten an Zielzellen sowie Crosslinking-Experimente, dass die N-terminale Aminosäuresequenz von Position zwei bis zwanzig von ClyA weder für die Bindung an Erythrozyten noch für die Oligomerisierung des Toxins einen wesentlichen Faktor darstellt.
Die Na,K-Pumpe ist ein integrales Membranenzym und gehört zur Gattung der P-Typ-ATPasen. Das Enzym setzt bei der Hydrolyse von ATP die resultierende freie Energie in aktiven Transport zur Errichtung eines Na+/K+-Konzentrationsgradienten über der jeweiligen Plasmamembran um. Diese Funktion wird mit einer strukturellen Alternierung zwischen zwei Hauptkonformationen E1 und E2 des Enzyms in Verbindung gebracht. In der vorliegenden Arbeit erfolgte eine Charakterisierung von Sekundärstruktur- und Proteinmikroumgebungsänderungen bei Teilreaktionen der Na,K-ATPase mittels reaktionsinduzierter und zeitaufgelöster FTIR-Differenzspektroskopie. Die hier verwendete IR-Durchlichttechnik setzt voraus, daß das zu untersuchende Enzym in hochreiner, hochkonzentrierter (1 mM) und aktiver Form in einen Proteinfilm in Gegenwart eines geschützten, photolytisch spaltbaren ATP-Derivats (caged ATP) überführt werden kann. In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal eine umfassende IR-spektroskopische Beschreibung von einzelnen Teilreaktionen innerhalb des E1/E2-Reaktionsmodells der Na,K-ATPase durchgeführt. Die Untersuchung des Enzyms in Form eines Proteinfilms mit einer Schichtdicke von etwa 5 µm ist aufgrund der hohen Hintergrundabsorption des Wassers und der geringen Extinktionskoeffizienten der Proteinschwingungsmoden erforderlich. Der überwiegende Teil der Messungen wurde mit (1-(2-nitrophenyl)ethyl)-caged ATP und Schweinenierenenzym bei 5° und 15°C durchgeführt. Nach Abspaltung der Schutzgruppe mittels eines UV-Blitzes und somit der Freisetzung von ATP wurden zeitabhängig (Millisekunden bis Sekunden) die Differenzspektren verschiedener Teilreaktionen im Bereich von 2000 bis 950 cm-1 ermittelt. Der große Vorteil dieser Technik besteht in der Möglichkeit der Registrierung von Zustandsänderungen einzelner Aminosäuren des Proteins, in Bezug auf die Sekundärstruktur, Phosphorylierung, Protonierung und Kationenkoordination. Besonders gut können Änderungen an den Seitenketten der Aminosäuren Aspartat und Glutamat detektiert werden. Die enzymatische ATP-Hydrolyseaktivität der Na,K-ATPase wurde in den Proteinfilmen IR-spektroskopisch anhand der V as (PO2-) bei 1246 cm-1 bestimmt. Die Messungen der spezifischen Aktivität von Schweinenierenenzym ergab bei 15°C einen Wert von 34 nmol Pi mg-1 min-1. Vergleichsmessungen, die mit einem Standardaktivitätstest in Annäherung an die Protein-filmbedingungen durchgeführt wurden, ergaben Ergebnisse von der gleichen Größenordnung. In Abhängigkeit von der Zusammensetzung des kationischen Mediums konnten nach der photochemischen Freisetzung von ATP IR-Differenzspektren von drei verschiedenen Teilreaktionen untersucht werden: (1) ATP-Bindung, (2) Bildung des Phosphoenzyms E1P, (3) Bildung des Phosphoenzyms E2P. Des weiteren wurden Differenzspektren der AMPPNP-Bindung, der ADP-Bindung und der Ammoniumbindung, die mit der K+-Bindung vergleichbar ist, ermittelt. Alle Teilreaktionen führten zu unterschiedlichen Differenzspektren, die charakteristisch für die jeweiligen Zustandsänderungen sind. Durch geeignete Differenzbildung konnten ebenfalls die Differenzspektren der Phosphorylierung (EATP -> E1P) und der Phosphoenzym-Konversion (E1P -> E2P) berechnet werden. Sekundärstrukturänderungen können bei der IR-Spektroskopie innerhalb des Amid I-Bereichs zwischen 1700 und 1610 cm-1 detektiert werden. Die Ergebnisse der IR-Differenzspektroskopie zeigen, daß die Sekundärstruktur der Na,K-ATPase bei allen untersuchten Teilreak-tionen weitgehend konserviert bleibt. Unter den ermittelten Differenzspektren der Teilreaktionen resultiert die größte Netto-Sekundärstrukturänderung in einer Größenordnung von etwa 0,2 % (~3 Aminosäuren/Protomer) bei der E2P-Bildung. Als Folge der Bindung von ATP und ADP an das Enzym gibt es Evidenzen für die Beteiligung von Arginin. Die Bindung von AMPPNP an die Na,K-ATPase hingegen zeichnet sich klar durch andere molekulare Wechselwirkungen unter Beteiligung von Asp und/oder Glu aus. Die Phosphorylierung der Na,K-ATPase in Gegenwart von 1,2 M Na+ (E1P-Bildung) kann anhand von zwei Signalen der V (C=O) bei 1739 und 1709 cm-1, wobei eines der phosphorylierten Seitenkette Asp 369 zugeordnet wird, detektiert werden. Das zweite Signal wird der Protonierung eines Seitenkettenrestes Asp oder Glu zugerechnet, welches in Verbindung mit der Na+-Okklusion bei der E1P-Bildung stehen dürfte. Weitere Signale, die in Zusammenhang mit den molekularen Vorgängen bei der Phosphorylierung und Na+-Koordination stehen, können in der spektralen Region um 1550 cm-1 (V as(COO-)) und 1400 cm-1 (V s(COO-)) detektiert werden. Das Differenzspektrum der Phosphorylierung der Na,K-ATPase in Gegenwart von 130 mM Na+ (E2P-Bildung) enthält keine Beiträge der Kationenokklusion oder -deokklusion. Dennoch enthält das Differenzspektrum der E2P-Bildung die Information über die Transformation der Kationenbindungsstellen von E1 -> E2. Während E1 den Na+-affinen Zustand darstellt, repräsentiert E2 den K+-affinen Zustand der Na,K-ATPase. Das Signalprofil der Differenzspektren der E2P-Bildung unterscheidet sich stark von dem der E1P-Bildung. Neben der Phosphorylierung an Asp 369, die auch hier oberhalb von 1700 cm-1 anhand eines V (C=O)-Signals detektiert wird, können weitere positive und negative Signale sowohl oberhalb von 1700 cm-1 als auch im Bereich um 1550 cm-1 (V as(COO-)) und 1400 cm-1 (V s(COO-)) nachgewiesen werden. Bei der Transformation der Kationenbindungsstellen von E1 -> E2 können somit starke Änderungen an den Seitenketten von Asp und/oder Glu detektiert werden, die auf eine Neuorganisation der Kationenbindungsstellen der Na,K-ATPase schließen lassen. An dieser Neuorganisation sind sowohl Ände-rungen des Protonierungszustandes als auch Änderungen in der Koordinationssphäre der kationenkoordinierenden Gruppen Asp und/oder Glu beteiligt. Da von der Na,K-ATPase keine hochauflösenden Kristallstrukturen existieren, wurden die Kristallstrukturen der Ca-ATPase des sarkoplasmatischen Retikulums, ebenfalls eine P-Typ-ATPase, zur Erläuterung des Mechanismus der Kationenbindung herangezogen (Toyoshima et al., 2004b). Zur Ca-ATPase existieren bereits analoge IR-Differenzuntersuchungen. Dies bot die Möglich-keit des direkten Vergleichs gleicher Teilreaktionen innerhalb des gemeinsamen E1/E2-Reaktionsmodells. Dieser Vergleich zeigt, daß die Sekundärstrukturen beider Enzyme bei den jeweiligen Teilreaktionen weitgehend konserviert bleiben. Bei der Ca-ATPase können die größten Netto-Sekundärstrukturänderungen von etwa 0,3 % des Enzyms (~3 Aminosäuren/Enzym) als Folge der ATP-Bindung beobachtet werden (Barth et al., 1996). Bei dieser Teilreaktion werden bei der Na,K-ATPase die kleinsten Sekundärstrukturänderungen detektiert. Beim Vergleich der Signalprofile beider Enzyme weist der sekundärstrukturrelevante Amid I-Bereich bei der Phosphoenzym-Konversion auf konträre Strukturrelaxationen hin. Die Differenzspektren der Ca-ATPase im Vergleich zur Na,K-ATPase deuten auf eine sich unterscheidende Kationenkoordination hin. Durch eine Kombination der Resultate von IR-Differenz- und Fluoreszenzspektroskopie der FITC-Na,K-ATPase zur Charakterisierung von Enzymzuständen, konnte ein Modell zum Mechanismus der Inhibierung der Na,K-ATPase durch das Herzglucosid Ouabain postuliert werden. Durch Fluoreszenzmessungen an der FITC-Na,K-ATPase konnte gezeigt werden, daß Ouabain in Gegenwart von 20 mM Na+ an das Enzym bindet, was bei 130 mM Na+ nicht mehr der Fall ist. Aufgrund von IR-Differenzsignalen der E2P-Bildung, aufgenommen bei 20 mM Na+, ist es möglich, oberhalb von 1700 cm-1 (ν(C=O)), bei 1554 cm-1 (V as(COO-)) und bei 1408 cm-1 (V s(COO-)) zwischen der an Asp 369 phosphorylierten und unphosphorylierten Na,K-ATPase zu unterscheiden. Nach Ouabain-Zugabe hingegen konnten diese Signale nicht mehr detektiert werden. Bezüglich der Inaktivierung des Enzyms im Standardaktivitätstest, für dessen Ablauf Na+-Konzentrationen von um die 130 mM eingesetzt werden, kann gefolgert werden, daß Ouabain nicht an das freie, sondern an das phosphorylierte Enzym bindet und somit die Inaktivierung der Na,K-ATPase nach sich zieht.
NO ist ein gasförmiges Molekül, das durch drei verschiedene NO-Synthasen hergestellt werden kann. Die Signalkaskaden von NO sind multipel und sehr stark von der jeweiligen Konzentration abhängig. In niedrigen Dosen ist NO an der Regulation physiologischer Prozesse beteiligt, wohingegen hohe NO-Spiegel, wie sie von der induzierbaren NO Synthase (iNOS) im Verlauf von entzündlichen Erkrankungen produziert werden, zytotoxische Effekte wie Apoptose und Nekrose bedingen können. Der Wachstumsfaktor PDGF kann durch Inhibition der iNOS Expression, dieser hohen NO Produktion entgegen wirken. Ob NO im Gegenzug auch eine Wirkung auf das PDGF-System aufweist, sollte mit dieser Arbeit geklärt werden. Da die Aktivität von PDGF letztendlich von der Rezeptormenge abhängt, wurde die expressionsmodulatorische Wirkung von NO auf der PDGF-Rezeptorebene untersucht.
Im ersten Teil der Arbeit wurden MZ mit dem NO-Donator DETA-NO stimuliert. Mittels PCR-Analyse konnte gezeigt werden, dass NO die PDGFR-α-mRNA Expression zeit- und dosisabhängig induziert. Die Expression von PDGFR-β wird hingegen nicht wesentlich beeinflusst. Western-Blot-Analysen (WB) bestätigten die Regulierbarkeit des PDGFR-α auch auf Translationsebene. Als nächstes sollte geprüft werden, ob die durch exogene Applikation eines NO-Donatoren hervorgerufene Induktion des PDGFR-α auch durch eine endogene NO-Produktion imitiert werden kann. Hierzu wurden MZ mit dem Zytokin IL-1β inkubiert. IL-1β steigert die iNOS und auch die PDGFR-α-Expression durch Induktion von Transkriptionsfaktoren. Die IL-1β bedingte PDGFR-α-Expression könnte dabei über zwei Mechanismen reguliert werden: Einerseits über die gesteigerte Synthese von NO durch iNOS und andererseits durch direkte Interaktionen der IL-1β-induzierten Transkriptionsfaktoren mit dem PDGFR-α-Promotor. Um die NO bzw. iNOS-vermittelte von der Promotor-vermittelten Wirkung zu unterscheiden, wurden MZ zusätzlich mit dem NOS-Inhibitor L-NMMA inkubiert. L-NMMA war im Stande die durch IL-1β hervorgerufene Erhöhung der PDGFR-α Proteinmenge signifikant auf 60% zu reduzieren, was die Beteiligung der iNOS bzw. von NO an der IL-1β vermittelten Regulation des PDGFR-α impliziert. NO entfaltet seine Wirkung über verschiedene Signalkaskaden. Der klassische Weg verläuft über die Aktivierung der löslichen Guanylatzyklase (sGC). Um die Beteiligung der sGC an der NO-vermittelten Induktion des PDGFR-α zu untersuchen, wurden DETA-NO stimulierte MZ zeitgleich mit ODQ, einem Inhibitor der sGC inkubiert. Die durch NO verursachte Erhöhung der PDGFR-α-Proteinmenge konnte durch die gleichzeitige Zugabe von ODQ komplett gehemmt werden. Die Behandlung von MC mit dem sGC-Aktivator YC-1 imitierte andererseits den NO-Effekt. Beide Versuche zusammengenommen beweisen die Notwendigkeit der sGC-Aktivierung zur NO-vermittelten Induktion des PDGFR-α. Da viele Gene schon auf Transkriptionsebene durch NO beeinflusst werden, wurde der an einen Vektor gebundene PDGFR-α-Promotor vor das Luziferase-Gen kloniert und MZ mit diesem Konstrukt transfiziert. Die transfizierten MZ wurden mit DETA-NO oder 8-BromocAMP stimuliert. cAMP erhöht die Aktivität des PDGFR-α-Promotors und diente somit als Positivkontrolle. Die Promotoraktivität wurde indirekt über das Luziferase-Renilla-System bestimmt. Da NO im Gegensatz zu 8-Bromo-cAMP die Promotoraktivität nicht erhöhte, ist davon auszugehen, dass die NO-abhängige Induktion des PDGFR-α posttranskriptionell erfolgt oder, dass das NO-responsive Element nicht in unserem Konstrukt enthalten war.
Im letzten Abschnitt meiner Arbeit wurde die Funktionsfähigkeit des neusynthetisierten PDGFR-α Proteins bestätigt. Hierzu wurde die Phosphorylisierung vom PDGFR-α und von einem weiteren in der PDGF-Signalkaskade angeordneten Enzym, der antiapoptotisch wirksamen Proteinkinase B (PKB) untersucht. Mit DETA-NO vorbehandelte MZ wurden mit PDGF-BB stimuliert und eine Nachweisanalyse mit einem Phospho-spezifischen Antikörper der gegen pTyr720-PDGFR-α (pPDGFR-α) gerichtet ist, durchgeführt. Der Vergleich mit nichtvorbehandelten MZ belegt eindeutig, dass die NO vermittelte Erhöhung der basalen PDGFR-α-Proteinmenge auch zu einer Zunahme an detektierbarem pPDGFR-α führt, die dann wiederum eine Verstärkung der Signaltransduktion zur Folge hat. So konnten in DETANO vorbehandelten MZ, die mit dem α-Rezeptor spezifischen Liganden PDGF-AA stimuliert wurden, eine vergleichsweise erhöhte PKB-Phosphorylierung festgestellt werden. In einer Kooperation mit Dr. L. Schäfer (Universität Münster) konnte ferner gezeigt werden, dass die NO-Abhängigkeit der PDGFR-α Proteinexpression auch im Krankheitsverlauf eines experimentellen Glomerulonephritismodells, zu beobachten ist. Durch WB-Analysen und immunhistologischen Färbungen konnte dargelegt werden, dass die Vorinjektion des iNO-Sspezifischen Inhibitors L-NIL die Produktion von phosphoryliertem und unphosphoryliertem PDGFR-α Protein in Anti-Thy.1.1-behandelten Ratten signifikant hemmt. Zusammenfassend weisen die Ergebnisse darauf hin, dass NO über eine Aktivierung der sGC, die Produktion von funktionsfähigem PDGFR-α- Protein in vitro und in vivo steigert. Die pathophysiologische Bedeutung der NO-vermittelten Induktion des PDGFR-α im Krankheitsprozess der GN, wird gegenwärtig in weiteren in vivo Experimenten untersucht.
Bisher konnte allein für den Magnetkompass der Vögel ein Mechanismus der Magnetperzeption identifiziert werden. In Verhaltensversuchen, die Zugorientierung als Kriterium einsetzten, ob Magnetrezeption ungestört abläuft oder nicht, konnte dieser Mechanismus analysiert werden. Die Experimente zeigten, dass der Magnetrezeptionsmechanismus lichtabhängig ist. Vögel die im blau bis grünen Teil des Spektrums in Orientierungstrichtern getestet wurden bevorzugten signifikant ihre der Jahreszeit entsprechende Zugrichtung. Führte man diese Tests mit längerwelligerem Licht durch, zeigten die Tiere Desorientierung. Durch die gezielte Manipulation des umgebenden Erdmagnetfeldes durch künstliche Felder, ergab sich ein Wirkprinzip des Magnetkompasses der Vögel, welches nichts mit dem der uns bekannten technischen Kompasse gemein hat. Die Tiere richten sich nicht nach der Polarität des Feldes, sondern detektieren vielmehr den Neigungsgrad und den Verlauf der magnetischen Feldlinien. Durch den Einsatz von Hochfrequenzfeldern als diagnostisches Werkzeug, konnte gezeigt werden, dass der Inklinationskompass der Vögel auf einem Radikalprozess basiert. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass der Sitz des lichtabhängigen Magnetkompasses im rechten Auge lokalisiert ist. Unter bestimmten künstlichen Lichtbedingungen wurden von Rotkehlchen allerdings Verhaltensantworten gezeigt, die von der normalen Zugorientierung abwichen. In der vorliegenden Arbeit werden gerade jene Phänomene genauer analysiert, die in der Vergangenheit zu Nicht-Kompass-Antworten geführt haben. Die Intensitätserhöhung kurzwelliger Lichter hatte zu vermehrt axialem Verhalten geführt, eine Kombination aus langwelligem, gelben Licht mit einer kurzwelligen Komponente hatte zu Fixrichtungen geführt, d.h. die Vögel zeigten nicht mehr die saisontypische Zugumkehr. Auf biogenem Eisen (Magnetit) basierende Rezeptoren der Magnetfeld-wahrnehmung werden als zweites System der Perzeptionsmöglichkeit diskutiert, wobei ihnen im Zusammenhang mit dem ‚Kartensinn’ eher eine Intensitätssensibilität zugeschrieben wird. In der vorliegenden Arbeit wurden Versuche durchgeführt, die das komplexe Zusammenspiel unterschiedlicher Perzeptionsmechanismen des Erdmagnetfeldes untersuchen. Mischlichtbedingungen wurden daraufhin untersucht, ob sie einem radikalpaar-basierenden Inklinationskompass unterliegen, oder nicht. Für türkis-gelbes Mischlicht wird gezeigt, dass die eingeschlagene Fixrichtung nicht mit Hilfe eines Inklinationskompasses aufgesucht wird. Darüber hinaus beruht die Richtungswahl des getesteten Vogels nicht auf einem Radikalpaarmechanismus, ist aber abhängig vom vorliegenden Magnetfeld. Da Magnetit bei Vögeln in der Oberschnabelregion lokalisiert werden konnte, wurden Betäubungsversuche mit einem Lokalanästhetikum durchgeführt. Die Fixrichtung bricht zusammen und die Vögel zeigen desorientiertes Verhalten. Im Gegensatz dazu bleiben Vögel unter Grün und Weisslicht, Bedingungen wo ein Inklinationskompass zum Einsatz kommt, mit Oberschnabelbetäubung unbeeindruckt und suchen die jahreszeitlich passende Richtung auf. Für kurzwellige Lichter wird eine Intensitätsabhängigkeitsstudie durchgeführt, die analysiert ab wann Zugorientierung in Nicht-Kompass-Antworten umschlägt. Die Wellenlängenabhängigkeit der Intensitätssensitivität, die beobachtet wird, lässt auf die Beteiligung des optischen Systems schliessen. Deshalb wurden Versuche durchgeführt, die über die Lateralisation des Magnetkompasses hinaus die Rechtsdominanz des Rotkehlchenauges genauer untersucht haben. Mittels einer Brille, die die gleiche Lichtintensität auf beide Augen fallen ließ, aber in klare und unscharfe Wahrnehmung der Umgebung unterschied, konnte herausgefunden werden, dass über die reine Aktivierung von Licht hinaus Formensehen eine entscheidene Rolle zu spielen scheint. Versuche in absoluter Dunkelheit zeigen, dass von Rotkehlchen trotz der Abwesenheit von Licht signifikant eine Vorzugsrichtung aufgesucht wird, die keiner saisonalen Zugumkehr unterläuft. Die Fixrichtung beruht nicht auf einem Inklinationskompass und sie bricht nach Oberschnabelbetäubung zusammen. Alle bisher analysierten Nicht-Kompass-Antworten scheinen auf einem zweiten, magnetit-basierenden Mechanismus zu beruhen. Diese Rezeptoren scheinen neben Intensitätsinformationen des Erdmagnetfeldes auch Richtungsinformationen zu generieren. Die biologische Relevanz der ihnen unterliegenden Fixrichtungen bleibt allerdings ungeklärt.
Das für die Phytoen-Desaturase (CrtI) aus Rubrivivax gelatinosus kodierende Gen konnte aus genomischer DNA amplifiziert und in unterschiedliche Expressionsvektoren kloniert werden. Die Funktion der Phytoen-Desaturase wurde in vivo durch Komplemetierung einer Phytoen bildenden E. coli-Transformante überprüft. Die heterologe Expression von crtIRg in E. coli, als lösliches und aktives Enzym mit einer molekularen Masse von 57 kDa, konnte nur mit dem Plasmid pPEUcrtIRg erreicht werden. Mittels in vitro Enzymtests konnten kinetische Parameter und der Kofaktor des Enzyms bestimmt werden. Der Km-Wert für das Substrat Phytoen lag bei 14,8 μM, der Vmax-Wert bei 5,2 nmol/h*mg CrtIRg. Für das Substrat Neurosporin konnte ein Km-Wert von 33 μM und ein Vmax-Wert von 0,6 nmol/h*mg CrtIRg ermitteltwerden. FAD steigerte als Kofaktor den Umsatz des Substrates um das 39-fache. Sowohl für die Phytoen-Desaturase aus Rvi. gelatinosus, als auch für die Phytoen-Desaturase aus Rba. sphaeroides konnte in vitro gezeigt werden, dass die Anzahl der an einem Carotinoidmolekül katalysierten Reaktionsschritte stark von der Enzym- bzw. Substratkonzentration abhängt. Bei einer hohen Phytoen- und einer niedrigen Enzymkonzentration wird fast nur Neurosporin gebildet (3 zusätzliche Doppelbindungen), während bei einer hohen Enzym- und einer niedrigen Phytoenkonzentration deutlich mehr Lycopin synthetisiert wird (4 zusätzliche Doppelbindungen). In den jeweiligen Organismen spielt die Konkurrenz der bakteriellen Phytoen-Desaturase mit dem sich in der Carotinoidbiosynthesekette anschließenden Enzym in Bezug auf die Anzahl der eingefügten Doppelbindungen eine wichtige Rolle. Dies konnte in Hemmstoffuntersuchungen am Beispiel zweier Xanthphyllomyces dendrohous-Mutanten gezeigt werden. Die Verringerung der aktiven CrtI-Menge in der Torulin-Mutante DQ1 förderte die Bildung von β-Carotin (nur 4 Desaturierungsschritte). Dagegen führte die Senkung der aktiven Lycopin-Zyklase-Menge in der β-Carotin-Mutante PR1-104 zur Förderung der durch CrtI katalysierten Reaktion mit der Folge, dass hauptsächlich Torulin gebildet wurde (5 Desaturierungsschritte). Mittels Error Prone PCR sowie dem E. coli-Stamm XL1-Red konnte das Gen crtI aus Rvi. gelatinosus mutagenisiert werden. Die erstellten Mutationsbibliotheken konnten in Phytoen bildenden E. coli-Transformanten exprimiert und Klone mit veränderten Phytoen-Desaturasen mittels Farbscreening identifiziert werden. Aus Klonen mit einem veränderten Lycopin/Neurosporin-Verhältnis wurde die DNA isoliert und crtI sequenziert. Dadurch konnten mutierte Gene ermittelt werden, deren modifizierte Expressionsprodukte entweder mehr Lycopin oder fast ausschließlich Neurosporin bildeten. Es zeigte sich, dass die Veränderung der Aminosäure an Position 208 einen starken Einfluss auf die Anzahl der eingefügten Doppelbindungen hat. Die Aminosäure befindet sich in einer membrangebundenen Helixstruktur bei der es sich vermutlich um einen direkt an der katalytischen Reaktion beteiligten Bereich handelt. Es konnte gezeigt werden, dass alle Mutationen, die die Anzahl der katalysierten Reaktionsschritte senkten, Leucin-Prolin-Austausche (oder umgekehrt) waren. Prolin (bzw. Leucin) veränderte in diesen Fällen die Sekundärstruktur des Proteins wodurch, die Funktion gestört wurde. Neben diesen strukturellen Veränderungen wurden Mutationen ermittelt, die zu einer verstärkten Expression der Phytoen-Desaturase führten, was eine erhöhte Lycopinbildung bewirkte. Es zeigte sich, dass bei einigen dieser Mutanten die Replikation der Plasmid-DNA erhöht war. Die starke Replikation ist wahrscheinlich auf eine Verarmung an beladenen tRNA Molekülen zurückzuführen. In ColE1-Plasmiden (pPEU) kann es zu einer unkontrollierten Replikation kommen, die auf Wechselwirkungen zwischen den Replikationsregulierenden Strukturen RNAI und RNAII mit den unbeladenen tRNA Molekülen zurückzuführen ist. Auf der Grundlage der erlangten Erkenntnisse und mittels Computer gestützter Analysen konnte ein Modell der Sekundärstruktur und der Membranassoziation des Enzyms erstellt werden.
Die drei Atolle Glovers Reef, Lighthouse Reef und Turneffe Islands vor der belizischen Küste im Karibischen Meer unterscheiden sich in Geomorphologie, Lagunentiefe, Sedimentbeschaffenheit, Mangroven- und Seegrasbewuchs, Wellen- und Strömungseinfluss sowie in ihren Sedimentationsraten und ihrem Entstehungsalter. Um herauszufinden, ob die Bivalven-Vergesellschaftungen verschiedener Lagunenzonen diese Unterschiede widerspiegeln, wurden 32 bis 44 rezente Sedimentproben auf jedem Atoll entnommen (Gesamtprobenzahl: 111). Deren Datensatz von insgesamt 32 122 Bivalvenschalen wurde anschließend Q-Mode-Cluster-Analysen unterzogen. Neben der Verteilung charakteristischer Arten wurde auch die Verteilung von Bivalven unterschiedlicher Lebens- und Ernährungsweise untersucht. Chione cancellata, ein flach grabender Suspensionsfresser, besiedelt bevorzugt (1) flache, wellen- und strömungsbeeinflusste Lagunenzonen. Die Sedimente (2) sehr hoch energetischer Flachwasserbereiche enthalten zudem hohe Anteile tiefer grabender Suspensionsfresser der Gattung Ervilia. Im (3) Rückriffbereich und am Atollrand sind tief grabende, Detritus fressende Telliniden häufig. Gouldia cerina, wie Chione ein flach grabender Suspensionsfresser, ist typisch für (4) geschlossene Flachwasserbereiche, während die Chemosymbionten-tragende, ebenfalls flach grabende Parvilucina sp. A. vorwiegend in (5) geschlossenen, tiefen Lagunenzonen vorkommt. Charakteristisch für (6) Mangrovengebiete ist Crassinella lunulata, ein sehr flach grabender Suspensionsfresser. Die Anteile taphonomischer Signaturen auf den Schalen, wie Bohrspuren, Inkrustationen, Fragmentierung und Abrasion sowie Diversität, Evenness und Richness sind auf Glovers Reef am höchsten und nehmen über Lighthouse Reef nach Turneffe Islands ab. Da in die gleiche Richtung zunehmende Sedimentationsraten auf den drei Atollen zu verzeichnen sind (GISCHLER 2003), ist vermutlich der abnehmende Effekt des Time-averaging für diesen Trend verantwortlich. Neben der rezenten Fauna wurden auch die Bivalven aus Vibrationsbohrkernen (ein Kern von jedem Atoll) untersucht. Die fossilen Bivalven-Vergesellschaftungen der inneren Lagunen von Glovers Reef, Lighthouse Reef und Turneffe Islands zeigen seit deren Entstehung eine für das jeweilige Atoll typische Fauna, die sich seit ~7000 YBP weiter entwickelte. Sie reflektieren damit die bereits im Anfangsstadium charakteristischen Unterschiede der drei Atolle.
Im Gegensatz zu den Arbeiterinnen der sozial lebenden Wespen und Bienen sind alle Ameisen flügellos. Die Flügellosigkeit der Ameisenarbeiterinnen bedingt, dass selbst kleinste Räume in der Erde oder in Holz von Kolonien besiedelt werden können. Sie war eine wichtige Voraussetzung für ihre Vorherrschaft auf dem Boden. Die für bodennistende Arten als Baumaterial in Frage kommende Erde hat jedoch die Eigenschaft, dass z. B. starke Regenfälle die Stabilität der Bauwerke negativ beeinflussen können. Deshalb und weil Erde in den höheren Regionen des Laubdaches schwierig zu beschaffen ist, sind Erdnester für den Übergang zum Leben in den Baumkronen wenig geeignet. Höhlungen in verrottendem Holz stehen aufgrund der schnellen Zersetzung in den Tropen nur für einen relativ kurzen Zeitraum und wenig regelhaft zur Verfügung. Der dadurch vorherrschende Mangel an Nistraum im tropischen Regenwald ist möglicherweise der wichtigste Faktor der Koloniegrößeregelung bei Ameisen. Erst mit dem Übergang zu aktivem Freinestbau ist es den Ameisen gelungen, sich (i) unabhängig von natürlichen Höhlen zu machen und dadurch große Kolonien zu etablieren, (ii) den Kronenraum als Habitat dauerhaft zu erschließen, (iii) negativen Witterungseinflüssen entgegenzuwirken und (iv) vorhandene Nahrungsressourcen in diesem Stratum permanent zu nutzen. Die in der vorliegenden Arbeit untersuchten freinestbauenden Ameisen sind selbst in der Lage, additiv Nistraum zu schaffen. Die Vertreter dieser Gilde legen ihre Nester nicht in der Erde oder in natürlichen oder selbst ,ausgeräumten-- Hohlräumen von Bäumen an, sondern konstruieren aktiv frei in der Laubregion der Holzgewächse Nisträume bzw. Unterstände, indem sie Material zusammentragen oder herstellen, mit dem eine Abschottung des Brut- und Nahrungsraumes gegenüber der Umwelt erreicht wird. Die erfolgreiche Besiedlung der Kronenregion war den Ameisen nur durch veränderte Bautechniken und eine verbesserte und angepasste Materialverwendung möglich. Gegenstand der vorliegenden Dissertation war zunächst die Bestandsaufnahme der freinestbauenden Ameisen der Baumkronenregion südostasiatischer Regenwälder. Der erste Schritt einer Analyse der Freinestkonstruktionen von Ameisen bestand darin, die Vielfältigkeit der verwirklichten Nestformen zu erfassen und darzustellen, Gemeinsamkeiten und Unterschiede herauszuarbeiten und die beteiligten Ameisenarten zu identifizieren. Im zweiten Teil der Arbeit wurden intensiv die proximaten Mechanismen des aktiven Nest- und Pavillonbaus untersucht. Dazu wurden die einzelnen Schritte der Nestentwicklung für sieben Ameisenarten aus sechs Gattungen in allen Details dargestellt und zusammenfassend beschrieben. Es wurde ermittelt, welche Baumaterialien die verschiedenen Ameisen nutzen und wie diese Materialien verwendet werden. Zur Bestimmung der verschiedensten Nesttypen wurden neben architektonischen Unterschieden auch Differenzen in der Substratwahl, Materialbeschaffenheit und in der Funktion der Nestkonstruktionen berücksichtigt. Als weiteres Kriterium zur Klassifikation arborealer Nestanlagen diente die Verschiedenartigkeit der Materialbearbeitung und der Substratvorbereitungen durch die Ameisen. Einige dieser Nestcharakteristika sind quantitativer, andere qualitativer Natur. Im Verlauf der Untersuchung wurden 1767 Kolonien bearbeitet und eingeordnet. Davon konnten insgesamt 100 Arten bzw. Morphospezies bestimmt und als echte Freinestbauer im Sinne der vorher formulierten Definition charakterisiert werden. Die ermittelten Arten verteilten sich auf acht Gattungen aus den drei Unterfamilien Formicinae, Dolichoderinae und Myrmicinae. Diese drei Unterfamilien gelten als die am weitesten entwickelten Ameisen und dominieren in der Kroneregion tropischer Regenwälder. Auffallend an dieser höher entwickelten Gruppe von Ameisen ist die Tendenz, pflanzliche Produkte als Hauptnahrungsressource zu nutzen. Die artenreichste Gattung Polyrhachis (39 Arten) gehört der Unterfamilie Formicinae an; zusammen mit den Gattungen Camponotus (10) und Oecophylla (1) wurden allein 50 Arten aus dieser Unterfamilie gefunden. In der Gattung Camponotus konnten zwei Untergattungen (C. Karavaievia, C. Myrmotarsus) mit freinestbauenden Arten ermittelt werden. Mit 29 identifizierten Arten aus drei Gattungen stellten die Myrmicinae die zweitgrößte Unterfamilie, wobei allein 23 Arten auf die Gattung Crematogaster entfielen. In den beiden anderen Myrmicinen-Gattungen Monomorium (5 Arten) und Myrmicaria (1 Art) fanden sich nur vergleichsweise wenige Vertreter mit Freinestbau. Die dritte Unterfamilie, die Dolichoderinae, wird durch die Gattungen Dolichoderus und Technomyrmex mit zusammen 21 Arten repräsentiert. Die als Freinestbauer ermittelten Ameisenarten zeigen hinsichtlich ihrer Koloniestruktur und Nestorganisation einige nennenswerte Parallelen. Die Mehrzahl der Arten lebt in polydomen Kolonieverbänden, die ihre manchmal mehr als 200 Nestanlagen meist nur auf eine einzelne oder wenige Nestpflanzen verteilen. In den Gattungen Camponotus und Monomorium sind alle Arten polydom organisiert, bei Dolichoderus und Technomyrmex sind es 90 % und bei Crematogaster 70 %. Polydomie findet man auch bei Myrmicaria arachnoides und Oecophylla smaragdina. Als weitere Gemeinsamkeit fällt ins Auge, dass mit Ausnahme von Myrmicaria arachnoides und Polyrhachis spp. funktionell als Stallnester zu charakterisierende Nestkonstruktionen überwiegen. Insbesondere bei Technomyrmex (100 %), Dolichoderus (100 %), Camponotus (70 %), Crematogaster (82 %), aber auch bei Monomorium (100 %) und Oecophylla smaragdina besteht eine ausgeprägte Tendenz, die Honigtau liefernden Trophobionten und die Brut in denselben Bauten unterzubringen. Bei den meisten Arten besteht somit ein enger Zusammenhang zwischen Freinestbau und trophobiotischer Ernährungsweise. Diese enge räumliche Vereinigung von Nahrungs- und Nistressourcen bildet die Basis für die Entwicklung individuenreicher, konkurrenzstarker und ökologisch dominanter Ameisenarten in der Kronenregion. Insgesamt wurden 22 unterscheidbare Nesttypen ermittelt und in allen Einzelheiten dargestellt. Auf 47 Bildtafeln wurden dazu fotografisch und zeichnerisch die Charakteristika der verschiedenen Nesttypen hinsichtlich der Nestarchitektur und ethologischer Besonderheiten der beteiligten Ameisenarten abgebildet. Während die Anzahl der freinestbauenden Ameisenarten sicherlich nur annähernd erfasst werden konnte, ist bei der Darstellung der verschiedenen Nesttypen zu erwarten, dass die erfolgreichsten, auf der Basis ethoökologischer sowie material- und substrattechnischer Unterschiede ermittelten Erscheinungsformen aufgeklärt werden konnten. Die vorgenommene Unterteilung der Hauptkategorie ,Nestsubstrat-- in drei blattgebundene und zwei stammgebundene Unterkategorien zeigte, dass die zweifach geschützte und materialsparende Position zwischen Blättern, von zusammen 13 Arten aus den Gattungen Polyrhachis (6), Camponotus (Karavaievia) (2), Oecophylla (1) und Crematogaster (3) präferiert wurde. Nester auf der vergleichsweise ungeschützten Blattoberseite wurden nur von Arten der Gattung Polyrhachis gebaut. Die bevorzugte Position der Polyrhachis-Nester war auf der Blattunterseite, 67 % aller Polyrhachis Nester waren dort lokalisiert. Die Nester der Untergattung Camponotus (Karavaievia) waren zu 75 % und die von Technomyrmex, Monomorium und Myrmicaria gar zu 100 % auf der Blattunterseite angebracht. Zusammen betrachtet waren 64 % aller im Rahmen der vorliegenden Arbeit aufgenommenen Nestbauten auf der Unterseite einzelner Blätter zu finden. Von allen Nestbauten auf Stamm- und Astoberflächen waren 75 % von Crematogaster-Arten besiedelt. Diese Nestposition konnte ansonsten nur noch bei zwei Polyrhachis-Arten und bei der mit Epiphyten assoziierten Camponotus (Myrmotarsus) gefunden werden. Je nach Anteil der hauptsächlich verarbeiteten Baustoffe kann man in vier Nestmaterialtypen unterteilen: (i) Nester aus toten pflanzlichen Materialien, (ii) Pilznester, (iii) Seidennester und (iv) Wurzelnester (Ameisengärten). Am häufigsten vertreten waren die aus Larvalseide gefertigten Webenester der Gattungen Polyrhachis, Camponotus (Karavaievia) und Oecophylla; insgesamt 45 % aller Funde gehörten zu dieser Materialgruppe. Fremde Seide konnten neben drei Polyrhachis-Arten auch drei Arten aus der Gattung Dolichoderus verarbeiten. Bemerkenswert ist der hohe Anteil pilzbewachsener Nestbauten. In allen drei Unterfamilien fanden sich Arten, die zu unterschiedlichen Teilen Pilze in ihren Nestern hielten. In der Gattung Technomyrmex waren 70 % aller älteren Nester vollständig aus Pilzhyphen gebildet. Mehr als die Hälfte des Nestmaterials von Monomorium-Nestern bestand ebenfalls aus einem dichten Pilzmyzel. Pilze bildeten auch in den Nestern von einigen Arten der Gattungen Dolichoderus, Crematogaster und Camponotus (Myrmotarsus) die maßgebliche Materialkomponente. Folgt man der bisher verwendeten Begriffsdefinition, die arboreale Ameisennester in der Regel nach den hauptsächlich verwendeten Baumaterialien einteilt, so muss man zu den bislang bekannten Karton- und Seidennestern die dritte Gruppe der Pilznester hinzufügen. Die Wahl des jeweiligen Baumaterials wirkt sich direkt auf die angewandten Bearbeitungsmechanismen und die Art und Weise der Nestfixierung und Neststabilisierung aus. Die Vertreter der Myrmicinen-Gattungen Myrmicaria und Monomorium zeigten in der Materialnutzung sowie bei der Stabilisierung und Fixierung der Konstruktionen gattungsspezifische Eigenheiten. Die Festigung der Nestbauten werden über H- Brückenstabilisierung (Myrmicaria) und Trichomstabilisierung (Monomorium) erreicht. Pilzhyphenstabilisierte Nester bauen Vertreter der Gattungen Technomyrmex, Dolichoderus und Crematogaster. Wobei innerhalb der beiden letztgenannten Gattungen noch eine Reihe weiterer Fixierungsmechanismen auftreten können. Bei Dolichoderus und Crematogaster sind die Methoden der Materialverfestigung sehr vielfältig und haben jeweils eine große Radiation erfahren (Stabilisierung durch Fremdseide, Pilze, Wurzeln und Klebstoff). Den Camponotus-Arten war die Eroberung der Baumkronenregion mit Hilfe von wurzelstabilisierten Ameisengärten (C. (Myrmotarsus)) und mit der Verwendung klebriger Larvalseide (C. (Karavaievia)) möglich. Beschränkt auf Seide zur Nestfixierung sind die Arten der Gattungen Oecophylla und Polyrhachis. Das bestimmende Element in der Nestarchitektur von fast allen Ameisennestern ist die Bogenkammer oder der Bogengang. Die innere Architektur von Oecophylla-Nestern weicht praktisch als einzige von dieser weit verbreiteten ,Bogenkammer-Struktur-- ab. Bei allen anderen Ameisenarten sind die Nestkammern in der Höhendimension in etwa auf die Größe einer einzelnen Arbeiterin beschränkt. Wegen der kooperativen Zusammenarbeit vieler Arbeiterinnen bei Oecophylla wird die Korrelation von Kammerhöhe und Körpergröße in dieser Gattung aufgehoben. Morphologische Besonderheiten, die als Anpassung an das Leben in Freinestern gedeutet werden könnten, konnten in der vorliegenden Arbeit bei keiner der untersuchten Arten festgestellt werden. Bei Bienen, Wespen und bei den Termiten wird überwiegend eine modellierende Bearbeitungstechnik angewandt. Die körpereigenen, flüssig-adhäsiven Substanzen (Wachs, Sekret und Kot) werden dazu oft noch mit Wasser verdünnt. Auch viele Ameisenarten verarbeiten wassergetränktes Material, nur einige wenige Vertreter der Gattung Crematogaster versetzen es allerdings mit klebenden Sekreten. Die durch das Baumaterial und dessen Fixierung am Substrat vorgegebene Verschiedenartigkeit der Bearbeitungstechniken hat bei den Ameisen zu sehr komplexen Verhaltensweisen geführt. So zum Beispiel das gezielte Verzahnen von Blatthaaren und das Verbinden von Baustoffen ohne die Zugabe von Leim. Weiter bearbeiten Ameisen Materialien, indem sie sie mit Fäkalien und anderen nährstoffreichen Substanzen düngen und so das Wachstum von Pilzhyphen und Wurzelfasern aktiv lenken. Die Seidenweber zeigen mit dem Verspinnen noch eine zusätzliche Möglichkeit der Materialbearbeitung bei Ameisen. Im Vergleich mit anderen sozialen Insekten findet man innerhalb der Ameisen eine mehr generalisierte Bautechnik, die möglicherweise variabler und effizienter ist als die Spezialisierung auf nur eine Materialkomponente. Generell sind die Freinestbauer, anders als die weitgehend deterministisch eingenischten obligaten Pflanzenameisen, bei der Auswahl des Nistplatzes nicht auf vorgegebene Hohlraumstrukturen (Domatien etc.) ganz bestimmter Pflanzen angewiesen, sondern erhöhen ihre Beweglichkeit in der Nistplatzwahl durch die Auswahl vergleichsweise häufig zu findender Substrattypen und Nestmaterialien. Bei allen untersuchten Freinestbauern konnte keine Spezialisierung auf eine bestimmte Pflanzenart festgestellt werden. Stochastische Besiedlungsprozesse gewinnen damit in dieser Ameisengilde, im Vergleich mit den myrmekophytischen Ameisenarten, an Bedeutung. In der vorliegenden Dissertation konnte erstmalig experimentell gezeigt werden, dass die bislang nur aus der Neotropis bekannten Ameisengärten auch im paläotropischen Faunengebiet zu finden sind. Die erstaunlichen Ähnlichkeiten zwischen neotropischen und paläotropischen Ameisengarten-Assoziationen deuten darauf hin, dass es in den unterschiedlichen tropischen Gebieten zu einer konvergenten und parallelen Entwicklung von ähnlich präadaptierten Ameisen und Pflanzen gekommen ist. Freinestbau ist mehrfach unabhängig voneinander entstanden. Sehr wahrscheinlich stand bei vielen Ameisen die Sicherung von Trophobiosestellen am Anfang der Entwicklung. Denkbar ist ebenso, dass die Vergesellschaftung von Epiphyten und Ameisen bei einigen Gruppen die Basis für die Evolution von Freinestbau war. Die Fertigung ausgedehnter Schutzbauten außerhalb der Nester, wie man sie beispielsweise bei der Myrmicinen-Gattung Pheidole findet, könnte ebenfalls die Evolution von frei gestalteten Nestern initiiert haben. Insgesamt wird deutlich, dass Konkurrenzvermeidung und die Erweiterung des Nistraum- und Nahrungsspektrums die drei bestimmenden Faktoren in der Evolution des Nestbauverhaltens von Ameisen waren. Anders als bei Wespen und Termiten fehlt den Ameisen jegliche Prädisposition für die Produktion von liquiden Klebesubstanzen. Sie haben vielfältige Wege gefunden, Wasser zum Nest zu transportieren und damit ihren Möglichkeiten entsprechende Verarbeitungs- mechanismen anzuwenden. Die fehlende gemeinsame Prädisposition der Ameisen für eine dauerhafte Fixierung von Baumaterialien, wie sie für freie Nestkonstruktionen notwendig ist, hat viele verschiedene Lösungen hervorgebracht und ist einer der Gründe für die hohe Variabilität der Freinestbauten bei Ameisen. Die in der vorliegenden Arbeit gezeigte variable Nistbiologie hat einen wichtigen Einfluss auf die Abundanzstrukturen tropischer arborealer Arthropodengemeinschaften und ist in hohem Maße für den großen Erfolg der Ameisen in diesem Habitat verantwortlich.
Hypoxie entsteht, wenn das Sauerstoffangebot bzw. die Sauerstoffversorgung unter ein Niveau sinkt, das benötigt wird, um physiologische O2-Drücke des betreffenden Gewebes aufrecht zu erhalten. Sinkt der Sauerstoff-Partialdruck, so werden adaptive Mechanismen aktiviert. Neben der Anpassung durch das kardiovaskuläre System werden auch verschiedene Gene aktiviert. Die Forschung der letzten Jahre hat gezeigt, dass Hypoxieinduzierte Genexpression insbesondere von zwei Transkriptionsfaktoren, HIF (hypoxia inducible factor) -1 und -2 , gesteuert wird. Man kennt über 70 Gene, die von HIF transaktiviert werden. Dabei handelt es sich um Modulatoren von Angiogenese und Vasodilatation, Erythropoese sowie der Umstellung des Stoffwechsels von oxidativer Phosphorylierung auf Glykolyse. Die Hypoxie-induzierbare Genexpression wird sowohl über eine Steigerung der Transaktivierungsaktivität als auch der Proteinmenge der HIF- -Untereinheiten reguliert. Die Regulation der HIF-Proteinmenge erfolgt über eine vom O2-Partialdruck abhängige Stabilisierung der -Untereinheit des Proteins. Unter normoxischen Bedingungen wird das Protein durch die Prolylhydroxylasen (PHD) O2-abhängig hydroxyliert, pVHL-vermittelt (VHL = von Hippel-Lindau), ubiquitiniert und proteosomal abgebaut. Unter hypoxischen Bedingungen dagegen wird das Protein stabilisiert, akkumuliert im Zellkern und bindet an eine spezifische Zielsequenz, das Hypoxia-responsive element oder HRE, imPromotor von Hypoxie-aktivierten Genen. Die PHDs gehören zu einer Familie von Eisen- und 2-Oxoglutarat-abhängigen Dioxygenasen. Neben diesen Faktoren wird eine Regulation von HIF durch Sauerstoffradikale (ROS, reactive oxygen species) in der Literatur sehr kontrovers diskutiert, da die Wirkung von ROS auf HIF sich unter Normoxie, Hypoxie oder dem Einfluss von Wachstumsfaktoren unterscheidet. Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Frage, welche Rolle die PHDs bei der ROS-vermittelten HIF-Regulation spielen, beantwortet werden. Der zugrunde liegende Mechanismus wurde anhand von Glioblastom-Zelllinien untersucht. Die vorliegende Arbeit zeigt eine Stabilisierung von HIF nach Verringerung der ROS-Konzentration unter Normoxie. Eine Erhöhung der ROS-Konzentration führt dagegen zu einer dosisabhängigen Verminderung von HIF und der HIF-Targetgen-Expression. Es konnte eine direkte Abhängigkeit der Destabilisierung von VHL und den Prolylhydroxylasen gezeigt werden, da sowohl eine VHL-Defizienz als auch eine Mutation der Prolylreste oder eine Inhibition der PHDs zu einer Aufhebung des Effekts führen. Eine vergleichbare destabilisierende Wirkung auf HIF übt Ascorbat aus. Überraschenderweise führt sowohl die Zugabe von H2O2 mit seiner oxidativen Wirkung als auch die Zugabe des Reduktionsmittels Ascorbat zu einer Erhöhung des intrazellulären Fe2+-Gehaltes. Dieser Befund kann durch eine Aktivierung von Enzymen mit eisenreduzierenden Eigenschaften erklärt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Proteinfamilie der Ferrireduktasen (FR) identifiziert und fünf Enzyme, die eine Homologie zur cytb561-Domäne aufweisen, kloniert. Eine detaillierte Charakterisierung zeigte, dass die Enzyme tatsächlich eine eisenreduzierende Aktivität aufweisen, die durch die exogene Zugabe von ROS noch erhöht wird. Eine Überexpression der FR führt zu einem erhöhten Abbau von HIF. Ein knock down mittels siRNA führt dagegen zu einer Akkumulation von HIF und die destabilisierende Wirkung von ROS ist nach einemknock down der FR deutlich reduziert. Aufgrund der in dieser Doktorarbeit gezeigten Daten kann folgendes Modell aufgestellt werden: Die primäre oxidative Wirkung von ROS führt vermutlich zu einer Aktivierung der Ferrireduktasen, die in Abhängigkeit von Ascorbat dann vermehrt Eisen reduzieren, so dass dies den PHDs als Substrat zur Verfügung steht. Der regulierende Einfluss auf HIF wird somit vermutlich über eine erhöhte Aktivität der Prolylhydroxylasen durch eine Erhöhung des intrazellulären Fe2+-Gehaltes vermittelt. Die erhobenen Daten deuten an, dass die Familie der Ferrireduktasen ein zentrales Bindeglied im O2-Sensing darstellt, das in Abhängigkeit von Redox-Signalen homeostatische Antworten auf Hypoxie moduliert.
Die alpha-Untereinheiten von Ionenkanälen assemblieren durch eine Tetramerisierung von Coiled-Coils
(2002)
Der spannungsabhängige Kaliumkanal EAG1 besitzt eine carboxyterminale 40 Aminosäuren lange Domäne, die für die Assemblierung von vier alpha-Untereinheiten zu einem funktionellen Kanal verantwortlich ist. Die Zielsetzung dieser Arbeit war zunächst die Analyse der Sekundärstruktur dieser Assemblierungsdomäne, sowie die Identifikation weiterer Ionenkanäle, die im Carboxyterminus eine strukturelle Homologie zur Assemblierungsdomäne des EAG1- Ionenkanals zeigen. Darüber hinaus sollten Aussagen über die Bedeutung der Domäne für die Funktion des jeweiligen Ionenkanals getroffen werden. Computergestützte Analysen der Sekundärstruktur ergaben, dass strukturell konservierte homologe Domänen in den Familien der durch zyklische Nukleotide gesteuerten Kationenkanälen (CNG), in den spannungsabhängigen kaliumselektiven Kanälen (neben EAG, auch in ELK, ERG und KCNQ), in den calciumabhängigen Kaliumkanälen (SK, IK), in den nicht selektiven Kationenkanälen (PKD) und in den Calciumkanälen (TRP) zu finden sind. Diese Ionenkanäle zeigen in computergestützten Analysen Domänen, mit einer hohen Wahrscheinlichkeit zur Ausbildung einer Coiled-Coil Struktur im Caboxyterminus. Im zweiten Teil ging es darum, die berechnete Sekundärstruktur experimentell zu belegen. Dazu wurden die caboxyterminal gelegenen Proteinbereiche mit einer Möglichkeit zur Ausbildung eines Coiled-Coils exemplarisch von den Kanälen EAG1, EAG2 und ERG1 als Peptide synthetisiert und analysiert. Anhand von Gelfiltrationsexperimenten und Lichtstreuung wurde die Stöchiometrie der Peptid-Assemblierung als Tetramerisierung identifiziert. Mittels Zirkulardichroismus-Spektroskopie konnte ein hoher alpha-helikaler Strukturanteil und eine außerordentliche Stabilität gegenüber hitzedenaturierenden Bedingungen gezeigt werden. Aus diesen Daten kann, in Übereinstimmung mit computergestützten Analysen der Aminosäuresequenz, geschlossen werden, dass die Peptide zu tetrameren Coiled-Coils assemblieren. In Analogie kann diese Art der Zusammenlagerung ebenfalls für die alpha-Untereinheiten der Ionenkanäle angenommen werden, für die in computergestützten Analysen eine hohe Wahrscheinlichkeit zur Ausbildung eines Coiled-Coils berechnet werden konnte. Die dafür verantwortliche Domäne wurde als „Tetramerisierende Coiled-Coil“ (TCC) Domäne benannt und kann als generelles Strukturmotiv angenommen werden. Im dritten Teil wurde ein auf Oberflächen-Plasmonresonanz basierender Proteininteraktionstest entwickelt, der es ermöglicht, die Kinetik der Tetramerisierung in Echtzeit zu verfolgen. Für die Peptide, deren Aminosäuresequenz der TCC-Domäne eines funktionellen Ionenkanals entsprach, konnte eine Ausbildung homomerer Komplexe gezeigt werden. Eine stabile heterologe Interaktion konnte nur zwischen den aus einer Proteinunterfamilie stammenden Domänen EAG1 und EAG2 gemessen werden. Dagegen interagierten diese Peptide nicht mit der Interaktionsdomäne aus ERG1. Die TCC-Domäne ist demnach in der Lage, die Spezifität der Bindung zu bestimmen. Aufbauend auf den Ergebnissen der Sekundärstrukturanalyse stand nun die Bedeutung der TCC-Domäne für die Funktionalität des jeweiligen Ionenkanals im Zentrum dieser Arbeit. In weiteren Experimenten konnte gezeigt werden, dass der Austausch einer hydrophoben Aminosäure gegen eine polare Aminosäure innerhalb des Coiled-Coils drastische Auswirkungen auf die Funktion dieser ca. 40 Aminosäuren langen Domäne hatte. Diese Peptide lagen nur noch zu einem geringen Anteil als Tetramere vor und wiesen eine deutlich geringere Stabilität gegenüber hitzedenaturierenden Bedingungen auf. Im Proteininteraktionsassay äußerte sich der Einfluss des Austausches in einer rascheren Assoziations- und Dissoziationsphase im Vergleich zu den tetrameren Coiled-Coil Peptiden. In vivo durchgeführte elektrophysiologische Messungen an Ionenkanalkonstrukten bestätigten die physiologische Relevanz der TCC-Domäne. Die Abwesenheit dieser Domäne in HERG1 führte zu einem Verlust der Funktion des Ionenkanals. Diese konnte jedoch durch Klonierung der entsprechenden TCC-Domäne des EAG1-Ionenkanals in den HERG1-Ionenkanal wieder hergestellt werden. Das Ionenkanalkonstrukt, bestehend aus dem HERG1-Kanal mit der TCC-EAG1 Domäne konnte, im Gegensatz zu dem HERG1 Wildtyp, funktionelle Heteromultimere mit EAG1 alpha- Untereinheiten bilden, so dass ein Ionenkanal mit veränderten Eigenschaften elektrophysiologisch beschrieben werden konnte. Die Relevanz der TCC-Domäne für die Funktionalität des Ionenkanals wird auch durch natürlich vorkommende Mutationen belegt. Diese beeinflussen die Struktur und damit die Funktion der TCC-Domäne. In Datenbanken des humanen Genoms konnten 38 Mutationen in sieben verschiedenen Genen identifiziert werden, die die Struktur der Coiled-Coil Domäne der resultierenden Ionenkanäle beeinflussen. Diese Mutationen äußern sich in zahlreichen phänotypischen Krankheitsbildern.
Der bc1-Komplex ist eine Komponente der Atmungskette und damit essentiell für den Energiestoffwechsel vieler Organismen, die zum aeroben Wachstum befähigt sind. Im Vergleich zu mitochondrialen bc1-Komplexen, die bis zu elf unterschiedliche Untereinheiten besitzen, ist das Enzym aus Paracoccus denitrificans mit nur drei Untereinheiten einfach aufgebaut. Vergleicht man die Sequenz des P. denitrificans Cytochrom c1 Genproduktes mit denen anderer prokaryotischer und mitochondrialer Cytochrom c1 Untereinheiten, so fällt auf, dass dieses prokaryotische Protein eine für Paracoccus charakteristische zusätzliche N-terminale Domäne von ca. 150 Aminosäuren trägt, die zudem eine sehr auffällige Zusammensetzung besitzt (40% saure Reste, 40% Alanine, keine einzige positiv geladene Aminosäure). Diese saure Domäne wird in anderen Organismen durch zusätzliche Untereinheiten innerhalb des bc1-Komplexes dargestellt, die in direkter Assoziation mit dem Cytochrom c1 vorliegen. Bis dato konnte für Paracoccus jedoch noch kein eindeutiger Beweis für eine Beteiligung dieser sauren Domäne an der Wechselwirkung zwischen bc1 und den Substraten des Komplexes geführt werden. Ziel dieser Arbeit war es zunächst, zwei lösliche Fragmente des Cytochrom c1 aus P. denitrificans zu konstruieren und in E. coli heterolog zu exprimieren. Durch zielgerichtete Mutagenese am Cytochrom c1 und anschließende kinetische Charakterisierung der Produkte sollte die funktionelle Bedeutung einzelner Aminosäurereste dargestellt werden. Es ist im Rahmen dieser Arbeit gelungen, zwei lösliche Fragmente des Cytochrom c1 aus P. denitrificans zu exprimieren. Für das saure Fragment (SF) wurde lediglich der Membrananker deletiert, während das Kernfragment (KF) durch die zusätzliche Deletion der sauren Domäne als eine Art minimalisiertes Cytochrom c1 anzusehen ist. Beide Fragmente konnten nach erfolgreicher Aufreinigung durch pre-steady-state-Kinetiken in ihrer Wechselwirkung mit dem homologen Reaktionspartner Cytochrom c552 sowie mit drei weiteren c-Typ Cytochromen funktionell charakterisiert werden. Des weiteren wurden zahlreiche Mutanten von KF hergestellt und ebenfalls hinsichtlich ihrer Wechselwirkung mit Cytochrom c552 getestet. Die Untersuchungen zur Ionenstärkeabhängigkeit des Cytochrom c1 zeigten, dass das saure Fragment unter den gewählten Versuchsbedingungen im Vergleich zu KF keine erhöhte Spezifität gegenüber Cytochrom c552 besitzt. Es konnte jedoch eindeutig gezeigt werden, dass die Interaktion der beiden untersuchten Elektronentransportpartner von der Wechselwirkung geladener Aminosäureseitenketten auf beiden Proteinen abhängt und somit elektrostatischer Natur ist. Dieser Sachverhalt wird zusätzlich durch die Ergebnisse bestätigt, die mit der Negativkontrolle (Cytochrom c551 aus Ps. aeruginosa) erzielt wurden. Dieses negativ geladene Protein zeigte nur eine schwach affine Wechselwirkung mit dem ebenfalls stark negativ geladenen Cytochrom c1 aus P. denitrificans. Zusätzliche kinetische Untersuchungen mit weiteren Cytochromen im Bereich mittlerer Ionenstärke zeigten, dass die beiden löslichen Fragmente SF und KF keine erhöhte Spezifität gegenüber homologen Elektronenakzeptoren (Cyt c552 und Cyt c550 aus P. denitrificans) im Vergleich zu dem nicht-homologen Reaktionspartner (Pferdeherz Cyt c) besitzen. Bei diesen drei Cytochromen handelt es sich um Proteine, die eine basische Interaktionsfläche aufweisen. In Hinblick auf die Ergebnisse zur Wechselwirkung von KF und SF mit dem löslichen Cytochrom c551 aus Ps. aeruginosa wird jedoch deutlich, dass die Spezifität des Cytochrom c1 gegenüber möglicher Substrate alleinig durch das Kriterium des Oberflächenpotentials bedingt ist. Keine der eingeführten Punktmutationen führte zu einem vollständigen Aktivitätsverlust des Proteins. Vielmehr zeigten die meisten Mutanten eine im Vergleich zum Wildtyp leicht herabgesetzte Geschwindigkeitskonstante der Elektronentransport-Reaktion. Der deutlichste Effekt wurde für die Mutanten E243K (36 % der WT-Aktivität) und E243Q (78 % der WT-Aktivität) bestimmt. Dieser Rest ist am oberen, dem Periplasma zugewandten Rand der Hämspalte positioniert, wodurch eine direkte Interaktion mit dem Cytochrom c552 während der Elektronentransport-Reaktion sehr gut möglich ist. Die im Rahmen dieser Arbeit bestimmten Geschwindigkeitskonstanten der Reaktion zwischen Cytochrom c1 und Cytochrom c552 lassen eindeutig auf einen diffusionskontrollierten Prozess schließen. Ein solches Verhalten schließt eine spezifische Oberflächen-Wechselwirkung der beiden Proteine nicht aus Die Ergebnisse der Mutagenesestudie verdeutlichen jedoch, dass die Substratspezifität nicht primär durch definierte gegensätzliche Ladungspaare auf der Oberfläche von Cytochrom c1 und Cytochrom c552 definiert wird.
Protonen gekoppelter Elektronentransfer ist ein zentraler Bestandteil der chemiosmotischen Theorie. Die Beschreibung seiner Natur ist aufgrund seines transienten Charakters eine komplexe Aufgabe. Elektrometrische Messungen stellen hier eine große Hilfe in der Erfassung von Ladungsverschiebungen dar. Sie erlauben die zeitliche Beschreibung des Elektronen- und Protonentransportes, der mit kaum einer geeigneten Methode beobachtet werden kann, und geben Einblick in deren molekularen Mechanismus. Diese Technik wurde hier an drei verschiedenen Membrankomplexen der Atmungskette angewandt: der Cytochrom c Oxidase (COX) aus Paracoccus denitrificans, der Quinol-Fumarat-Reduktase (QFR) aus Wolinella succinogenes und dem bc(1)-Komplex aus Saccharomyces cerevisiae. Hinsichtlich der experimentellen Vorgehensweise für kinetische Untersuchungen stellte sich ein übergreifendes Problem. Neben einer schnellen Aktivierung der Enzymsysteme bedurfte es eines definierten Ausgangszustands. Ziel dieser Arbeit war das Etablieren von Bedingungen, die elektrometrische Messungen am bc(1) und der QFR erlauben, sowie die Fortführung dieser Methodik am bereits vorhandenen System der COX. Cytochrom c Oxidase Elektrometrische Untersuchungen an der COX wurden basierend auf Vorarbeiten weitergeführt. Insbesondere die Ladungsverschiebungen nach Photoreduktion ausgehend vom völlig oxidierten Zustand rückten in den Fokus. In diesem Schritt wird ein Proton aufgenommen, während Häm a vom angeregten Zustand eines Rutheniumkomplexes reduziert wird. Dieses Verhalten ist unabhängig vom heterogenen Ausgangszustand der COX, er wird jedoch durch eine Änderung des pH-Wertes beeinflußt. Der heterogene Ausgangszustand im O-E-Übergang wurde in einem sequentiellen Modell diskutiert. Dabei wurde auf die Diskrepanz zwischen den elektrometrischen und den publizierten spektroskopischen Messungen hingewiesen. Während spektroskopisch die Cu(A)-Oxidation und Häm a-Reduktion in einer Phase verliefen, wurde in den elektrometrischen Messungen eine zweite deutlich langsamere Phase für den Protonentransfer beobachtet. Ein sequentielles Reaktionsmodell führte hier zu einem Widerspruch. Die Auswirkungen auf die Natur der Kopplung von Häm a und dem aufgenommenen Proton wurden diskutiert. Die Kinetik der Ladungsverschiebung wurde detailliert anhand der Temperaturabhängigkeit und des Isotopeneffektes untersucht und mit den Ergebnissen aus den Messungen an einem thermophilen Enzym, der ba(3)-Oxidase aus Thermus thermophilus, verglichen. Quinol-Fumarat-Reduktase Für eine schnelle Aktivierung der QFR wurde ein caged Fumarat synthetisiert, das nach Photolyse zu einer schnellen Erhöhung der Fumaratkonzentration führte. Die neue Substanz wurde bezüglich einer möglichen Verwendung für die QFR charakterisiert. Die Freisetzung erfolgte mit einer Zeitkonstante von 0,1 ms und aktivierte die QFR nur im photolysierten Zustand. Aufgrund der Photochemie der metallischen Kofaktoren in der QFR konnten jedoch keine kinetischen Messungen durchgeführt werden. Da die photochemisch induzierten Elektronenbewegungen in der QFR mit zunehmender Wellenlänge abnahmen, wurde eine neue Substanz vorgeschlagen, die im sichtbaren Spektralbereich gespalten werden kann. bc(1)-Komplex Der bc(1)-Komplex kann wie die COX durch einen Rutheniumkomplex aktiviert werden. Ein dimerer sowie ein an Cytochrom c gekoppelter Rutheniumkomplex wurde hierfür anhand von Literaturdaten synthetisiert, und die Verbindungen wurden hinsichtlich ihrer Eigenschaften nach Lichtanregung charakterisiert. Für die elektrometrischen Messungen wurde der bc(1)-Komplex in Proteoliposomen rekonstituiert, und der Ausgangszustand des bc(1)-Komplexes unter reduktiven und oxidativen Bedingungen eingestellt. Mit dem dimeren Rutheniumkomplex wurden elektrometrische Experimente durchgeführt, die zu zwei Phasen in der Spannungsantwort führten. Die Daten wurden zusammen mit den publizierten spektroskopischen diskutiert. Dabei wurde eine schnelle elektrogene Phase einem Elektronentransfers zwischen Häm c(1) und dem Eisen-Schwefel-Cluster des Rieske-Proteins zugeordnet. Eine langsamere Phase erwies sich sensitiv gegenüber Antimycin und spiegelt Vorgänge unter der Kontrolle der Q(i)-Bindungsstelle wider.
Aus Fruktose-gezogenen Zellen von A. woodii, die in Gegenwart von Caffeat als Elektronenakzeptor gewachsen waren, wurde durch Behandlung mit Lysozym und anschliessendem French-Press-Aufschluß bei niedrigem Druck ein zellfreier Rohextrakt unter strikt anaeroben Bedingungen hergestellt. Dieser katalysierte eine H2-abhängige Caffeatreduktion mit Raten von 8,7 – 18,7 nmol/min x mg Protein. Die Aktivität war strikt ATP-abhängig. Nach einer Auftrennung des Rohextraktes in Cytoplasma- und Membranfraktion war die H2-abhängige Caffeatreduktion ausschliesslich in der cytoplasmatischen Fraktion lokalisiert. Die Zugabe von Membranen führte zu keiner Stimulierung der Aktivität. Die Membranfraktion selbst wies keine Caffeatreduktionsaktivität auf. Verschiedene Verbindungen wurden auf ihre Fähigkeit getestet, als artifizielle Elektronendonatoren für die Caffeatreduktion zu fungieren. TMPD, 1,5-Diphenylcarbazid und reduziertes Methylviologen konnten Caffeat nicht reduzieren. In Gegenwart von Phenylendiamin wurde in zellfreiem Rohextrakt und in der Cytoplasmafraktion Caffeatreduktionsaktivität beobachtet. In der Membranfraktion wurde dagegen keine Reduktion von Caffeat mit Phenylendiamin als Elektronendonor nachgewiesen. NADH + H+ konnte als physiologischer Elektronendonor für die Reduktion von Caffeat fungieren. Die NADH-abhängige Caffeatreduktion war ausschliesslich in der cytoplasmatischen Fraktion lokalisiert und strikt abhängig von ATP. Die Beobachtung, dass NADH + H+ als Elektronendonor für die Caffeareduktion fungieren kann, führte zu der Frage, wie im Zuge H2-abhängiger Caffeatreduktion NADH + H+ gebildet wird und welche Enzyme daran beteiligt sein könnten. NAD+-abhängige Hydrogenaseaktivität wurde an Membranen und im Cytoplasma nachgewiesen. Rund 70% der Aktivität waren in der löslichen Fraktion lokalisiert. Die Gegenwart einer Elektronendonor:NAD+-Oxidoreduktase in A. woodii wurde untersucht. Gewaschene Membranen vermittelten die Oxidation von NADH + H+ mit Kaliumhexacyanoferrat oder Benzylviologen als Elektronenakzeptor. Diese Beobachtung wurde als Hinweis auf eine NAD+-Reduktase gewertet, da solche Enzyme in der Regel reversibel sind. Eine Hydrogenase konnte hierfür ausgeschlossen werden, da die NADH-oxidierende Aktivität Sauerstoff-unempfindlich war. Die Aktivität des NADH-oxidierenden Enzyms konnte durch zugesetztes Na+ nicht stimuliert werden. In Analogie zu Na+-translozierenden NADH:Chinon-Reduktasen wurde die NADH-oxidierende Aktivität an gewaschenen Membranen aber durch Ag+ oder Cu2+ in mikromolaren Konzentrationen vollständig inhibiert. Membranen von A. woodii vermittelten die Reduktion von NAD+ mit reduzierten Ferredoxin als Elektronendonor. Ob diese Aktivität durch das gleiche membranständige Enzyme katalysiert wurde, das auch die NADH-Oxidation bewerkstelligte, konnte nicht geklärt werden. Die Ferredoxin-abhängige NAD+-Reduktion wurde durch micromolare Konzentrationen Ag+ vollständig inhibiert. Die Inihibition war aber wahrscheinlich unspezifischer Natur. Mittels vergleichender 2D-Gelelektrophorese wurden zwei Caffeat-induzierte Proteine identifiziert. Ein Vergleich der Peptidsequenzen, die durch ESI-MS/MS-Analyse der Proteine erhalten wurden, mit in Datenbanken hinterlegten Proteinsequenzen, ergab eine große Übereinstimmung zu der großen alpha- bzw. kleinen beta-Untereinheit von heterodimeren Elektronentransfer-Flavoproteinen (ETFP). Die Proteine wurden mit EtfA und EtfB bezeichnet. Anhand der Peptidsequenzen von EtfA und EtfB wurden degenerierte Oligonukleotide abgeleitet, die zur Amplifikation von Fragmenten der kodierenden Gene herangezogen wurden. Die Analyse der abgeleiteten Aminosäuresequenzen der erhaltenen PCR-Produkte untermauerte die Zuordnung von EtfA und EtfB als Untereinheiten eines ETFP. Die Fähigkeit zur Caffeatreduktion ist in A. woodii nicht konstitutiv vorhanden, sondern wird in erst durch Gegenwart des Phenylacrylats induziert. Die Spezifität dieser Induktion wurde untersucht. Suspensionen ruhender Zellen, die aus Caffeat-induzierten Zellen hergestellt worden waren, reduzierten neben Caffeat auch die Phenylacrylate Ferulat oder p-Cumarsäure mit H2 als Elektronendonor. Analoge Beoabachtungen wurden mit Ferulat-induzierten und p-Cumarsäure-induzierten Zellsuspensionen gemacht. Die Ergebnisse legen den Schluß nahe, dass in A. woodii die Reduktion von Phenylacrylaten durch ein induzierbares enzymatisches System bewerkstelligt wird. EtfA und EtfB wurden als MalE-Fusionsproteine dargestellt und gereinigt. Dagegen wurden Antiseren hergestellt. Immunologische Untersuchungen zeigten, dass die Produktion von EtfA und EtfB durch Gegenwart verschiedener Phenylacrylate induziert wird. Die Induktion war unabhängig vom Wachstumssubstrat. In Gegenwart von zu Phenylacrylaten ähnlichen Verbindungen erfolgte keine Induktion. Für EtfA und EtfB wurde eine Funktion als universeller Elektronenüberträger des Phenylacrylat-Reduktionssystems in A. woodii postuliert. Für die H2-abhängige Reduktion von Caffeat und anderer Phenylacrylate wurde die folgende Reaktionssequenz postuliert: die Oxidation des Elektronendonors H2 durch eine Hydrogenase geht einher mit der Bildung von reduziertem Ferredoxin. Dieses wird durch eine membranständige Ferredoxin-NAD+-Oxidoreduktase oxidiert, die den Transfer der Elektronen auf NAD+ mit der Translokation von Na+ koppelt. Ein aus EtfA und EtfB gebildetes ETFP fungiert dann als Elektronenüberträger zwischen NADH + H+ und einer löslichen Phenylacrylatreduktase.
Elche stellen eine Problemart in der Zootierhaltung dar. Sie erreichen im Zoo entgegen dem Trend, dass Tiere in Menschenobhut älter werden als ihre frei lebenden Artgenossen, meist weniger als die Hälfte des biologisch möglichen Alters. Besonders schwierig gestaltet sich die adäquate Fütterung, da die Tiere sehr stark von der Gabe frischer Laubäsung abhängen und die Fütterung mit Ersatzfuttermitteln, wie z.B. Heu, langfristig nicht erfolgsversprechend ist. Zudem sind die Tiere sehr anfällig für Parasiten und eine von Schafen übertragene Viruserkrankung (Bösartiges Katarrhalfieber). Ihr hoher Platzbedarf und das Problem der innerartlichen Aggression machen die Haltung dieser größten Hirschart zusätzlich kompliziert. In dieser Arbeit wird die Methode der Angewandten Chronoethologie in der Zootierhaltung vorgestellt, die sich die von der Inneren Uhr gesteuerten Verhaltensrhythmen einer Tierart zur Beurteilung ihres Wohlbefindens und ihrer Haltungsbedingungen in der künstlichen Zooumwelt zu Nutze macht. Der Besitz einer Inneren Uhr stellt in der hochgradig rhythmisch organisierten Umwelt einen Selektionsvorteil im Sinne einer frühzeitigen Anpassung an wiederkehrende Umweltbedingungen dar. Die Innere Uhr ist so alt wie das Leben selbst, genetisch fixiert, über Zeitgeberreize mit ihrer Umwelt synchronisiert und regelt die Lebensvorgänge von Organismen auf allen organisatorischen Ebenen, auch auf der Ebene des Verhaltens. Ist der normale Verhaltensrhythmus einer Tierart bzw. eines Individuums bekannt, ist es möglich, aus Abweichungen von der Norm auf Störungen des Organismus - auf Unwohlsein - zu schließen. Anhand des Vergleiches von drei Elchhaltungen mit jeweils zwei Tieren, die unter verschiedenen Bedingungen gehalten wurden, konnten mit Hilfe zeitgeraffter Videoaufzeichnung und dem Einsatz eines Speichertelemetriesystems die folgenden Faktoren als einflussreich auf das Verhaltensmuster von Elchen in Menschenobhut identifiziert werden. Die nächtliche Aufstauung von Elchen ist aufgrund des Raum- und Reizmangels in den Boxen ein erheblicher Eingriff in das natürliche, gleichmäßig über Tag und Nacht verteilte Verhaltensmuster der Tiere. Außerdem sind sie in ihrem Verhalten hochgradig vom täglichen Ablauf des Pflegeralltags im Zoo beeinflusst. Feste Fütterungszeiten können einen starken Zeilgeberreiz darstellen- den die Elche in den beiden naturferneren Haltungen stärker zu antizipieren scheinen als den Zeitgeber „Licht". Größe und vor allem Strukturierung des Außengeheges haben einen Einfluss auf dessen zeitliche und räumliche Nutzung. Abschüssige Gehegeteile können die unerwünschte Verhaltensweise Grasen fördern. In unseren mitteleuropäischen Breiten leiden die Elche im Sommer unter Hitzestress, was sich in verringerter Aktivität widerspiegelt. Ein hohes Besucheraufkommen kann die Tiere ebenfalls in ihrem Verhalten beeinflussen. Es hat sich jedoch gezeigt, dass sich der Elch schnell an die Zoogegebenheiten und viele Besucher gewöhnt. Durch den Vergleich der verschiedenen Haltungsbedingungen konnten in der vorliegen Arbeit Vorschläge zur Verbesserung der Haltung von Elchen in Menschenobhut und zu ihrem zeitlichen Management gemacht werden. Der Elch hat sich aufgrund des für Wiederkäuer typischen, sehr geregelten Verhaltensrhythmus aus alternierenden Aktivitäts- und Ruhephasen, der auch unter den verschiedenen Haltungsbedingungen prinzipiell bestehen bleibt, als sehr gut geeignetes Modelltier für die Anwendbarkeit der Methode der Angewandten Chronoethologie in der Zootierhaltung herausgestellt. Abweichungen von der Norm können leicht erkannt werden. Änderungen im Verhaltensmuster m Form erhöhter lokomotorischer Aktivität lassen bei den untersuchten Tieren auf Unwohlsein (Krankheit, Abweichungen von der täglichen Routine, unterbundenes Brunftverhalten) schließen und können im Sinne eines chronoethologischen Paradigmas als eine indikative Verhaltensweise gewertet werden. Das Ziel einer vollständig automatisierten Verhaltenserfassung- und Auswertung mittels Bewegungsmeldern soll im restringierten Raum der Elchbox in einem weiteren Projekt verwirklicht werden, um damit Tierpflegern, Zooveterinären und Verantwortlichen ein gut handhabbares Mittel zur objektiven und langfristigen Beurteilung des Wohlbefindens ihrer Schützlinge zur Verfügung stellen zu können.
Um die Biodiversität Burkina Fasos darzustellen und auszuwerten, wurden umfangreiche Diversitätsdaten aus Sammlungsbelegen, Vegetationsaufnahmen und Literatur zusammengestellt. Die eigene Datenerhebung während dreier Feldaufenthalte hat mit > 300 Vegetationsaufnahmen (einschließlich der Biodiversitätsobservatorien) und > 1200 Herbarbelegen dazu beigetragen. Die Verwendung von relationalen Datenbanken (Microsoft Access) und GIS ermöglichte eine umfassende Analyse dieser enormen Datenmengen (> 100 000 Verbreitungspunkte) unter Einbeziehung von weiteren Art- oder ortsgebundenen Informationen. Datenbankstrukturen und Prozeduren wurden zu einem großen Teil selbst entwickelt. Unregelmäßigkeiten in den Primärdaten konnten durch Artverbreitungsmodelle ausgeglichen werden, die rasterbasierte Umweltdaten verwenden, insbesondere Satellitenbilder, Klima- und Höhendaten. Für die zusammenfassenden Analysen (Artenreichtum nach Familie, Lebensform, Photosynthesetyp; turnover) mussten wiederum eigene Prozeduren entwickelt werden. Räumliche Muster der Biodiversität wurden im landesweiten Rahmen, wie auch lokal für die Regionen Oudalan und Gourma, dargestellt. Die Zusammenfassung der Flora nach taxonomischen und ökologischen Gruppen gewährt dabei Einblicke in ökologische Zusammenhänge und die Eignung einzelner Gruppen als Indikatoren. Deutlich zeigen sich die Veränderungen des Lebensformspektrums und des Artenreichtums sowohl auf Landesebene im Zusammenhang mit dem Makroklima als auch in einer detaillierten Analyse des Oudalan – wo der Einfluss von Boden und Relief deutlich wird. Die großräumigen Muster der Artenvielfalt sind hauptsächlich durch klimatische Faktoren geprägt, auch der menschliche Einfluss ist in Form verschiedener Nutzungsformen vom Klima abhängig und schwer davon zu trennen. Umso deutlicher werden die Folgen intensiver Landnutzung aber in den Detailstudien der nordsudanischen Biodiversitätsobservatorien und des sahelischen Wiederbegrünungsprojektes. Über die in diesem Rahmen dargestellten Ergebnisse hinaus ergeben sich insbesondere aus der umfassenden Datenbasis und der interdisziplinären Zusammenarbeit mit Fernerkundung und Ethnobotanik weitere vielversprechende Möglichkeiten. Unter anderem wird auf der Grundlage der Datenbanken und ergänzender Literaturrecherchen eine aktualisierte Checklist der Gefäßpflanzen Burkina Fasos erstellt und eine Revision der phytogeographischen Zonen für Burkina Faso ist geplant.
Screening und Charakterisierung von Peptidliganden für den BCR-ABL mRNA Translokationsbereich
(2005)
Die reziproke Translokation t(9;22) ist in 95% der chronischen myeloischen Leukämie vorhanden. Bei der Translokation entsteht ein Fusionsprotein BCR-ABL, welches ausreichend für die Entstehung von Leukämien ist. 30% aller akuten lymphatischen Leukämien sind ebenfalls positiv für diese Translokation. Durch die Translokation entsteht am Translokationsbruchpunkt eine einzigartige RNA-Sequenz, welche als Ziel für eine RNA-Liganden Suche dienen kann. Ziel dieser Arbeit war es, Peptidliganden zu finden, welche die BCR-ABL mRNA binden können. Zunächst wurde die bcr-abl mRNA nach Sekundärstruktur-Elementen durchsucht, welche als Interaktionspartner mit Peptiden in Fragen kommen. Hierzu wurde die BCR-ABL mRNA durch das MFold-Programm von Zuker analysiert. Durch die Auswertung der errechneten Diagramme für die thermodynamische Stabilität und die kinetische Prävelanz der Basenpaarinteraktion, wurden zehn verschiedene BCR-ABL mRNA-Bereiche ausgewählt, welche die Möglichkeit besitzen, sich in stabile Sekundärstruktur-Elemente zu falten. Um diese strukturellen Gegebenheiten am BCR-ABL Translokationsbruchpunkt b2a2 im Experiment zu überprüfen, wurden in Kooperation mit Prof. Göbel und Dr. Scheffer RNase-Mapping und Mapping mit einer künstlichen Nuklease durchgeführt. Es konnte im Experiment das Vorhandensein einer Sekundärstruktur nachgewiesen werden. Diese Struktur wird aus einem Stamm mit einer Fehlpaarung, einem asymmetrischen internen Loop, einem weiteren Stamm und durch einen Loop definiert. Gegen diese b2a2-Struktur und gegen neun weitere mRNA-Bereiche wurde eine Phage-Display-Selektion durchgeführt, welche zum Ziel hat, Peptide zu gewinnen, welche die entsprechende RNA-Struktur spezifisch binden können. Nach der Sequenzierung der Phagen, konnten insgesamt 14 verschiedene Peptid-Sequenzen für die zehn unterschiedlichen RNA-Bereiche gefunden werden, welche die Möglichkeit besitzen, mit der jeweiligen Ziel-RNA zu interagieren. Die Phagen-RNA Interaktion wurde durch Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie ermittelt. Bei dieser Meßmethode werden Diffusionszeiten von markierten Molekülen in Lösung bestimmt. Zwei von den 14 Phagen-Präsentierten-Peptiden zeigen eine Interaktion mit der Ziel RNA. Die gefundenen Peptide besitzen die folgenden AS-Sequenz: das Peptid 12, KHLHLHK und das Peptid 14, NPEKVKMLYVEF. Die Interaktion mit der RNA wurde in nicht kompetitiven und in kompetitiven FCS Experimenten gezeigt. Kompetiert wurde die Phagen-RNA Interaktion mit kompetitor RNA und in einem weiteren Experiment mit den synthetisierten Peptiden. Beide Peptide zeigten im FCS eine Interaktion mit dem b2a2 BCR-ABL Translokationsbruchpunkt. Die kD-Werte der Peptid-RNA Interaktion wurde durch CDTitration ermittelt. Peptid 12 bindet die b2a2-RNA mit einem kD-Wert von 42 μM und Peptid 14 bindet diese RNA mit einem kD-Wert von 52 μM. Durch die CD-Titration wurde auch der Interaktionsort der beiden Peptide mit der b2a2-RNA ermittelt. Ausgehend von unserem b2a2-Strukturmodell, wurden RNA-Mutanten generiert und in Gegenwart von den Peptiden CD-Spektrometrisch untersucht. Die Interaktion von Peptid 12 mit der RNA findet am Loop und am oberen Stamm statt. Das längere Peptid 14 benötigt alle b2a2-RNA Strukturmerkmale, außer dem unteren Stamm, zur Interaktion. Der Einfluß der Peptide auf die Translation wurde durch ein In-vitro-Translationssystem ermittelt. Demnach bindet Peptid 14 an die b2a2-RNA-Struktur und verringert auf diese Weise die Translation. Peptid 12 bindet zwar ebenfalls an die b2a2-RNA, jedoch konnte eine Verringerung der Translation bei diesem Peptid nicht beobachtet werden.
Die vorliegende Arbeit untersucht die Systematik und phylogenetischen Beziehungen der Familie der Bromeliaceae auf der Basis chloroplastidärer DNA-Sequenzdaten des trnT-trnL-Intergenischen Spacers (33 untersuchte Arten aus 28 Gattungen), des trnL-Introns (129 untersuchte Arten aus 48 Gattungen) und des trnL-trnF-Intergenischen Spacers (120 Arten aus 48 Gattungen). Untersucht wurden Vertreter aller Untergattungen der artenreichsten Gattungen Aechmea (Bromelioideae) und Tillandsia (Tillandsioideae). Mit den editierten Alignments der drei Sequenzdatensätze wurden Analysen zu den Verwandtschaftsverhältnissen durchgeführt. Alle drei untersuchten Marker lieferten phylogenetisch informative Signale. Die Pitcairnioideae erwiesen sich als polyphyletisch. Ayensua und Brocchinia sind nah verwandt und nehmen innerhalb der Familie eine basale Position ein. Hechtia und Navia stellen jeweils eigene Gruppen dar, aber ohne ausreichende Auflösung ihrer Beziehungen zu den übrigen Bromeliaceae. Fosterella und Puya sind gut gestützte Gruppen mit möglicher Schwestergruppenbeziehung zu den Bromelioideae. Die Gattungen Pitcairnia/Pepinia und Deuterocohnia/Dyckia bilden als Pitcairnioideae s.str. einen gut gestützten Ast. Die Tillandsioideae sind monophyletisch, nur die einzige untersuchte Akzession der Gattung Mezobromelia liegt außerhalb dieses statistisch gut gestützten Astes. Innerhalb der Tillandsioideae nehmen Catopsis, Glomeropitcairnia erectiflora und Alcantarea regina/Vriesea racinae basale Positionen ein. Die Gattungen Guzmania, Racinaea, Tillandsia und Vriesea sind keine natürlichen Gruppen. Für die Bromelioideae liegt die Sequenzdivergenz bei 0,1 bis max. 2%. Die beste Auflösung erreichte hier die kombinierte Analyse des trnL-Introns und des trnL-trnF Intergenischen Spacers bei Polarisierung der Daten mit den Tillandsioideae als Außengruppe. Bromelia, Deinacanthon, Greigia, Fascicularia-Ochagavia-Fernseea und eine wenig aufgelöste Kerngruppe der übrigen Bromelioideae bilden eine basale Polytomie. Mit höheren Wiederfindungswahrscheinlichkeiten gestützt sind Ananas, Greigia und von der Gruppe Fascicularia-Ochagavia-Fernseea die Gattung Fascicularia und die kontinentale Ochagavia litoralis. Die Gattungen Fascicularia-Ochagavia-Greigia (Bromelioideae) und Abromeitiella- Deuterocohnia (Pitcairnioideae) wurden mit Fragmentanalysen (AFLPs, RAPDs) untersucht. Analysen der RAPD- und AFLP-Daten mit UPGMA (Unweigthed pair group method using arithmetic averages) und NJ (Neighbor-Joining) stützen die Fassung der Gattung Fascicularia als eine Art (Fascicularia bicolor) mit zwei Unterarten (F. bicolor ssp. bicolor und F. bicolor ssp. canaliculata). F. bicolor ssp. canaliculata weist 28 Fragmente auf, die in keiner untersuchten Akzession von F. bicolor ssp. bicolor vorkommen. Die 5 untersuchten Akzessionen von F. bicolor ssp. bicolor sind durch 13 Fragmente charakterisiert, die in den 4 untersuchten Akzessionen von F. bicolor ssp. canaliculata fehlen. Die AFLP-Analysen der Gattungen Abromeitiella- Deuterocohnia stützen die Vereinigung der Gattungen Abromeitiella und Deuterocohnia in der älteren Deuterocohnia. Alle untersuchten Akzessionen der Artengruppe Abromeitiella-Deuterocohnia besitzen 11 gemeinsame charakteristische Banden, die Arten der Gattung Abromeitiella und Deuterocohnia für sich alleine genommen jedoch keine. Die größten genetischen Unterschiede bestehen zwischen der in Chile isoliert vorkommenden Deuterocohnia chrysantha und allen übrigen Arten der Gruppe. Der Informationsgehalt der analysierten chloroplastidären Sequenzen erwies sich für eine Auflösung der phylogenetischen Beziehungen von offenbar schnell evolvierenden Gattungsgruppen der Bromelioideae und Tillandsioideae als unzureichend. Fragmentanalysen, besonders AFLPs, zeigten auf der taxonomischen Ebene nah verwandter Gattungen eine gute Auflösung.
ATP-binding cassette (ABC) Transporter sind ubiquitäre Membranproteine, die die Hydrolyse von ATP in der Regel an die Translokation unterschiedlichster Substrate über biologische Membranen koppeln. Sie bilden eine der größten Familien von aktiven Transportern, werden in allen drei Reichen des Lebens gefunden und sind an einer Vielzahl physiologischer und pathophysiologischer Vorgänge beteiligt. Auf Grund ihrer zentralen Bedeutung für viele zelluläre Prozesse wurden in der hier vorliegenden Arbeit ausgewählte ABC-Transporter bzw. ihre Komponenten strukturell untersucht, mit dem Ziel einen Beitrag zur Aufklärung ihrer molekularen Mechanismen zu leisten. Das erste untersuchte System war der MDR-ABC-Transporter LmrA aus L. lactis, der auf Grund seiner funktionalen Austauschbarkeit mit dem humanen P-Glykoprotein ein geeignetes Modellsystem zur strukturellen Untersuchung dieser medizinisch relevanten Klasse von ABC-Transportern darstellte. In einem ersten Schritt zu seiner Kristallisation wurde durch die Analyse von 43 Protein-Detergens-Kombinationen eine für strukturbiologische Untersuchungen geeignete Proteinpräparation etabliert. Unter Verwendung von FOS-CHOLINE-16 wurde eine bis zur Homogenität gereinigte, monodisperse und stabile Proteinlösung zur Kristallisation gewonnen, mit der eine breit angelegte Analyse des n-dimensionalen Kristallisationsraums von LmrA durchgeführt wurde. Im Zuge der Analyse von insgesamt 9600 Bedingungen wurden vier verschiedene Kristallformen erhalten. Die Datenaufnahme lieferte für die Kristallform 2 unter Verwendung von Synchrotronstrahlung eine schwache Streuung bis zu einer Auflösung von 20 Å. In einem weiteren Projekt wurden die molekularen Grundlagen der Substratspezifität des ABC-Importers Ehu aus S. meliloti untersucht. Hierfür wurde die Kristallstruktur seines Substratbindeproteins EhuB im Komplex mit den kompatiblen Soluten Ectoin bzw. Hydroxyectoin mit einer Auflösung von 1,9 Å bzw. 2,5 Å gelöst. Die beiden erhaltenen Strukturen zeigten einen für Substratbindeproteine der Gruppe II typischen Aufbau aus zwei globulären Domänen, die durch zwei Segmente der Polypeptidkette verbunden wurden. Die Substratbindungsstelle von EhuB war, wie für Substratbindeproteine erwartet, in der Spalte zwischen den beiden globulären Domänen lokalisiert. Ihre Analyse zeigte eine Interaktion des Proteins mit der negativ geladenen Carboxylat-Gruppe der Substrate durch die Bildung von Salzbrücken mit der Seitenkette von Arg85 sowie mittels Wasserstoffbrückenbindungen mit den Hauptketten-Stickstoffatomen von Phe80 und Thr133. Im Unterschied dazu waren für die Bindung des kationischen Anteils der Substrate wesentlich seine Wechselwirkungen mit den aromatischen Resten Phe24, Tyr60 und Phe80 verantwortlich, die durch ihre räumliche Anordnung eine optimale Bindungsstelle für die delokalisierte positive Ladung der Substrate bildeten. Die Bedeutung dieser wahrscheinlich auf Kation-TT und van der Waals Interaktionen beruhenden Wechselwirkungen für die Substratbindung konnten – aufbauend auf der Kristallstruktur – in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. E. Bremer (Universität Marburg) bestätigt werden. Neben den beschriebenen Interaktionen wurde der kationische Anteil der Substrate durch zwei Salzbrücken mit der Seitenkette von Glu21 sowie durch eine Wasserstoffbrückenbindung mit der Hauptketten-Carbonyl-Funktion von Gly78 gebunden. Bei der Bindung des Substrats Hydroxyectoin wurde im Vergleich zu Ectoin eine zusätzliche Wasserstoffbrückenbindung zwischen der Seitenkette von Glu134 und der lediglich in diesem Substrat vorhandenen Hydroxyl-Gruppe beobachtet, die für die dreieinhalbfach höhere Bindungsaffinität von EhuB für Hydroxyectoin gegenüber Ectoin verantwortlich zu sein scheint. Der Vergleich der an der Substratbindung beteiligten Interaktionen in EhuB mit den ebenfalls für kompatible Solute spezifischen Substratbindeproteinen ProX aus E. coli, ProX aus A. fulgidus und OpuAC aus B. subtilis enthüllte gemeinsame Prinzipen der untersuchten Proteine zur Bindung dieser Klasse von Substraten. Von besonderer Bedeutung waren dabei die von bestimmten aromatischen Resten ausgehenden Wechselwirkungen mit dem kationischen Anteil der Substrate, die wahrscheinlich auf Kation-TT und van der Waals Interaktionen beruhen. Im Detail zeigten die Substratbindungsstellen der untersuchten Proteine jedoch signifikante Unterschiede, die eine Anpassung an die für ihre Aufgabe benötigte Bindungsaffinität und das zu bindende Substrat zu sein scheinen.
1.) Zahlreiche Medikamente werden nach Einnahme nahezu unverändert wieder ausgeschieden und gelangen über Abwasser und Kläranlagen in die aquatische Umwelt. 2.) Die gemessenen Konzentrationen erscheinen gegenüber anderen Kontaminantengruppen vergleichsweise niedrig, sind jedoch angesichts der Tatsache, dass Medikamente biologisch hoch aktive Substanzen sind, besorgniserregend. Das Beispiel Ethinylöstradiol zeigt, dass bereits im ng/l-Bereich Effekte auftreten. Abgesehen vom Beispiel Ethinylöstradiol lagen bislang keine Erkenntnisse über chronische Effekte von Medikamenten bei umweltrelevanten Konzentrationen vor. 3.) Die in der Umwelt festgestellten Arzneimittelwirkstoffe werden fast ausschließlich in Ab-, Oberflächen- und Grundwasser detektiert. Angaben über Medikamentanreicherungen in Sedimenten liegen nur vereinzelt vor. 4.) Angaben über die Ökotoxizität von Medikamenten beruhen bislang fast ausschließlich auf bei sehr hohen Substanzkonzentrationen durchgeführten Akuttests. Die Übertragung auf umweltrelevante Verhältnisse erfolgte durch Einbeziehung hoher Sicherheitsfaktoren. 5.) Die vorliegende Arbeit zeigt, dass in komplexeren Tests bereits bei sehr viel niedrigeren Konzentrationen Effekte auftreten. Diese Effekte sind nicht unmittelbar toxisch, beeinträchtigen jedoch die Entwicklung und Fortpflanzung der Versuchsorganismen nachhaltig. 6.) Als Modellsubstanzen für die in Oberflächengewässern nachgewiesenen Pharmaka wurden das Antiepileptikum Carbamazepin, Clofibrinsäure als Metabolit zahlreicher Lipidsenker, das Antibiotikum Ciprofloxacin und das Antidepressivum Fluoxetin ausgewählt. Sämtliche Pharmaka werden in der Umwelt weit verbreitet nachgewiesen. 7.) Als Testorganismen dienten die Zuckmücke Chironomus riparius, die Zwergdeckelschnecke Potamopyrgus antipodarum und der aquatische Annelide Lumbriculus variegatus. C. riparius ist ein bereits standardisierter Versuchsorganismus, L. variegatus ist zur Zeit im Standardisierungsverfahren (OECD 2004B) und für ökotoxikologische Untersuchungen empfohlen (ASTM 1995). Außerdem wurde mit den Einzellern Blepharisma japonicum und Tetrahymena thermophila ein Destruentenmikrokosmos entwickelt. Beide Einzeller sind ebenfalls erprobte Versuchsorganismen (PAULI 1996, FOX & MORIN 2001). 8.) Von den vier untersuchten Pharmaka erwiesen sich im getesteten Konzentrationsbereich Carbamazepin und Fluoxetin für jeweils einen der Testorganismen als schädlich. Carbamazepin blockierte ab einer Sedimentkonzentration von 234 µg/kg Sediment (Trockengewicht) die Entwicklung von C. riparius. Fluoxetin führte ab einer Testkonzentration von 2 µg/l zu einer Reduzierung der Embryonenzahl bei P. antipodarum. Die EC10 für Carbamazepin wurde zu 113 µg/kg Sediment berechnet, die EC10 für Fluoxetin zu 0,81 µg/l. Beide Konzentrationen sind bei Berücksichtigung der im TGD vorgesehenen Sicherheitsfaktoren umweltrelevant (PEC/PNEC > 1). Als Grundlage dieser Berechnung dienten gemessene Umweltkonzentrationen im Sediment beziehungsweise Wasser. Ein negativer Effekt von Ciprofloxacin auf L. variegatus erschien anhand der Daten zwar möglich, konnte jedoch nicht statistisch belegt werden. Für Clofibrinsäure ergaben sich keine Hinweise auf negative Effekte im getesteten Konzentrationsbereich. 9.) Die vorliegenden Berechnungen sind weitaus tragfähiger als bisher vorliegende, da sie auf chronischen Toxizitätsdaten und gemessenen Umweltkonzentrationen beruhen, statt auf Akutdaten und geschätzten Umweltkonzentrationen. 10.) Die in den Versuchen festgestellten, sehr niedrigen Effektkonzentrationen lassen Effekte auch bei umweltrelevanten Konzentrationen als wahrscheinlich erscheinen. Indirekte Effekte wie vermindertes Futterangebot für Prädatoren oder Verschiebungen im Artenspektrum sind denkbar. 11.) Der Destruentenmikrokosmos erwies sich als prinzipiell geeignet, Effekte von Xenobiotika auf Einzeller zu untersuchen, da die Positivkontrolle funktionierte. Die Daten aus den Versuchsansätzen zeigen jedoch, dass Versuchsdesign und Haltung der Testorganismen weiter entwickelt werden müssen. 12.) Die vorliegenden Daten zeigen, dass Pharmaka bei umweltrelevanten Konzentrationen ein ökologisches Risiko darstellen können. Maßnahmen zur Risikominderung sind dringend erforderlich. Angesichts des therapeutischen Nutzens der Substanzen erscheinen Verbote nicht durchsetzbar.
1. Das Dissoziations- und Reaggregationsverhalten von Epidermiszellen der Larven von Xenopus laevis wird unter verschiedenen Bedingungen in vitro mit Hilfe des Zeilrafferfilmes untersucht. Die Kultur der Schwänze erfolgt in Salzlösung nach STEINBERG und Serum hämolysierten Kälberblutes. Für die Reaggregation werden serumfreie Salzlösungen verwendet. 2. Am Auswandern der Zellrasen beteiligen sich alle dem Deckglas anliegenden Zellen. Sie bilden einen Plasmasaum in die Richtung aus, in der sie sich fortbewegen. Der Zusammenhalt zwischen den Zellen wird hierbei nicht gelöst. 3. Die Zellrasen lassen sich mit 0;05%igem EDTA in Einzelzellen auflösen; dabei tritt eine Trennung des Zellplasmas in ein zentral gelegenes granuliertes Plasma und einen hyalinen Plasmasaum auf. Bei längerer Einwirkung des EDTA werden die hyalinen Säume eingezogen. Die Zellen sind dann abgekugelt; es brechen blasenförmige "Lobopodien" aus den Zellen hervor und verschwinden wieder: "Blubbern". 4. In Gegenwart von Ca++ breiten sich die Zellen wieder auf dem Deckglas aus. Die Bildung "stabilisierter Aggregate" erfolgt in Ringerlösung (mit 0,02% CaCl2), in isotonischer Calciumchlorid-Lösung, in isotonischer Kochsalz- und Kaliumchlorid-Lösung, wenn Calciumchlorid mindestens 0,02%ig enthalten ist. Es wird angenommen, daß die einwertigen Kationen für die Zellbewegung und Reaggregation nur als Ladungsträger wirksam sind. In KCN-haltiger (2,5 X 10-3 M) und in PCMB-haltiger (2,5 X 10-3 M) Ringerlösung ist ebenfalls Reaggregation möglich. Unter dem Einfluß von PCMB ist die Stabilisierung der Zollgrenzen jedoch nicht von Dauer. Die Aggregate werden wieder aufgelöst; die Zellen zeigen keine Kontakthemmung mehr, sie wandern übereinander. 5. Wird das Calciumchlorid der Ringerlösung durch die äquimolare Menge Magnesiumchlorid ersetzt, so werden die Kontakte nicht stabilisiert, sondern "sliding sheets" gebildet. Keine Reaggregation ist in Calcium-haltiger Natrium- oder Kaliumchlorid-Lösung einer Konzentration unter 0,33 M und in Ringerlösung unter pH 4,0 möglich. Die Zellen sind dann auch zu keiner Ortsbewegung mehr fällig. Selbst kurze (3 min) Trypsinbehandlung (2%) verhindert die Reaggregation der Zellen im serumfreien Medium. 6. Besonders die Versuche zur Störung des Energiehaushaltes der Zellen legen nahe, daß die dabei zu beobachtenden Viskositätsänderungen im Hyaloplasmasaum auf einer Änderung des Kontraktionszustandes in ihm enthaltener kontraktiler Proteine beruhen. Die Auswirkungen von PCMB, niederem pH und geringer Ionenstärke deuten auf die Beteiligung eines Membranpotentials an der Steuerung der Viskositätsänderung hin. Diese Hypothese wird zu Ergebnissen der Muskelphysiologie in Beziehung gesetzt.
Sequenz-spezifische DNA-Rekombination (SSR) bewirkende Systeme aus niederen Organismen, wie z.B. das Cre/loxP-System aus dem P1-Phagen oder das Flp/FRT-System aus Hefe, sind in den letzten Jahren als wichtige und weitverbreitete Werkzeuge zur Modifikation des Säugergenoms etabliert worden. Dies hängt unter anderem mit der Vielfalt an Reaktionen zusammen, welche diese Systeme in der Lage sind durchzuführen. Dazu zählen Exzisions/Deletions-, Integrations-, Inversions- und Translokationsreaktionen. Die hier vorgestellte Arbeit fokussiert auf die Integrationsreaktion, welche aus thermodynamischen Gründen bisher keine breite Anwendung finden konnte, und ihren Einsatz bei der Etablierung allelischer Serien in embryonalen Stammzellen (ES Zellen) oder frühen Embryonen der Maus. Eine solche Methodik wäre ideal für Fragestellungen zu Funktionen von Genen in vivo (Functional Genomics) geeignet. Zur Anwendung kam ein als „Rekombinase vermittelter Kassettenaustausch“ (recombinase-mediated cassette exchange, RMCE) bezeichnetes Verfahren. RMCE ist ein Zwei-Schritt-Verfahren: Zuerst wird der interessierende Genort durch homologe Rekombination derart verändert, daß 5’ und 3’ des Genlocus SSR-Erkennungsstellen eingeführt werden. Durch das Einbringen eines die gleichen Erkennungsstellen tragenden Austauschplasmides und die Bereitstellung der entsprechenden Rekombinase kann die im Genom residierende gegen die eingebrachte Kassette (von Erkennungsstellen flankiertes DNA-Segment) ausgetauscht werden. In dieser Arbeit werden zwei verschiedene Ansätze für RMCE vorgestellt: Der erste Ansatz basiert auf der Verwendung heterospezifischer lox-Sequenzen, welche sich in einer Base unterscheiden (lox511/loxP). Diese Mutation sollte eine effektive Integration durch Verhinderung der Exzision gewährleisten. Es konnte hier gezeigt werden, daß RMCE unter Verwendung einer solchen Methodologie in ES Zellen und frühen Mausembryonen effizient möglich ist, daß das Produkt der Integration jedoch instabil ist und nachfolgender Exzision unterliegt. Diese Deletionsreaktionen sind durch promiskuitive Rekombination der verwendeten lox511 und loxP bedingt. Aus diesen Erkenntnissen wurde ein zweiter Ansatz entwickelt, welcher auf dem simultanen Einsatz des Cre/lox- und des Flp/FRT-Systems basiert. Diese Methodik umgeht die Nachteile promiskuitiver Erkennungssequenzen und ihre Anwendbarkeit, Funktionsfähigkeit und Effizienz in ES Zellen konnten demonstriert werden. Ein solches Verfahren, welches sowohl in Zellkultur als auch in frühen Mausembryonen zum Einsatz kommen könnte, bietet insbesondere im Hinblick auf zukünftige Bedürfnisse in der Functional Genomics viele Optionen.
Die Stat-Proteine liegen als latente Transkriptionsfaktoren im Zytoplasma vor, und spielen eine wichtige Rolle in der Übertragung von Zytokinsignalen von der Zellmembran in den Nukleus. Nach ligandeninduzierter Aktivierung der Zytokinrezeptoren phosphorylieren sich die assoziierten Jak-Kinasen selbst, die intrazellulären Donänen der Rezeptoren und die Mitglieder der Stat-Proteinfamilie. Nach Tyrosinphosphorylierung dimerisieren die Stat Proteine, indem sie Homo- oder Heterodimere bilden und wandern in den Zellkern. Dort können sie spezifische DNASequenzen von Zielgenen binden und deren Transkription steuern. Posttranslationale Modifikationen spielen eine wichtige Rolle in der Aktivierung von Proteinen, Interaktion mit Kofaktoren und in der Proteintranslokation. An einigen zytoplasmatischen und nukleäre Proteinen wie Transkriptionsfaktoren, RNA Polymerase II, Onkoproteinen, Kernporenproteinen und viralen Proteinen wurde eine O-Verknüpfung von einzelnen N-Acetylglukosamin Zuckerresten an Threoninen und Serinen nachgewiesen. Die Rolle dieser posttranslationalen Modifikation beinhaltet unter anderem den Schutz vor Proteolysis, Einfluß auf den Kerntransport, Regulation der Serin- und Tyrosin-Phosphorylierung und Transkriptionskontrolle. Ziel dieser Arbeit war es, eine Modifikation von Stat5a mit einem einzelnen Overknüpften N-Acetylglukosamin (O-GlcNAc) zu identifizieren, und die Funktion dieser Modifikation für Stat5 zu charakterisieren. Es wurde eine O-GlcNAc Modifikation von Stat5a nur im Zellkern nach Zytokinstimulation nachgewiesen. Es konnte auch gezeigt werden, daß andere Stat-Proteine, wie Stat1, Stat3, Stat5b und Stat6, mit O-GlcNAc modifiziert sind, und daß Stat5a auch in Krebs- und Leukämiezellinien glykosyliert vorliegt. Für die Analyse der Glykosylierungsstellen im Massenspektrum und für die weiteren funktionellen Experimente wurde phosphoryliertes, Stat5a rekombinant mit dem Baculovirussystem in Insektenzellen exprimiert. Hierfür wurden die Insektenzellen mit Jak2- und Stat5a-Baculoviren koinfiziert, und die Lysate anschließend chromatographisch aufgereinigt. Es konnte ein O-GlcNAc modifiziertes Peptid am N-Terminus von Stat5a identifiziert werden. Dieses Peptid trägt zwei potentielle Glykosylierungsstellen, Threonin 92 und Threonin 97. Die potentielle Glykosylierungstelle Threonin 92 wurde zu einem Alanin mutiert (Stat5a-T92A) und in funktionellen Experimenten mit glykosyliertem und nicht glykosyliertem Stat5a verglichen. Um den möglichen Einfluß der Stat5a-Glykosylierung auf den Kerntransport zu analysieren, wurden HC11-Zellen mit dem O-GlcNAcase Inhibitor PUGNAc und den Vorstufen von N-Acetylglukosamin, Glukose und Glukosamin, inkubiert. Dadurch wurde der allgemeine Glykosylierungsstatus der Proteine und auch von Stat5a erhöht, und die Kerntranslokation von Stat5a vor und nach Zytokinstimulation untersucht. Dabei konnte kein Unterschied in der Kerntranslokation von Stat5a im Vergleich von behandelten zu unbehandelten Zellen beobachtet werden. Da bekannt ist, daß die O-GlcNAc Modifikation die DNA-Bindung und die Protein-Protein Interaktionen von großen Proteinkomplexen beinflußt, wurde der Einfluß der Stat5-Glykosylierung auf die DNA-Bindung und auf bekannte Stat5a-Interaktionspartner, wie den Glukokortikoid Rezeptor, den Korepressor der Transkription N-CoR (nuclear corepressor receptor) und den Koaktivator der Transkription CBP (CREB binding protein), untersucht. Die in vitro DNA-Bindung am beta-Casein Oligomer zeigte keinen Unterschied hervorgerufen durch die Glykosylierung oder die Mutation von Threonin 92 von Stat5a auf. Die Interaktion mit N-CoR und mit dem Glukokortikoid Rezeptor wurde durch die Stat5a-Glykosylierung nicht beeinflußt, doch CBP interagierte bevorzugt mit glykosyliertem Stat5a. Die Interaktion mit CBP war nach Mutation der potentiellen Glykosylierungsstelle in Stat5a-T92A aufgehoben. In Luciferase-Experimenten konnte nachgewiesen werden, daß Stat5a-T92A keine Transaktivierungsaktivität im Vergleich zu Wildtyp Stat5a am β-Casein Promotor besitzt. Die Ergebnisse sprechen dafür, daß die Glykosylierungsstelle von Stat5a durch die Mutation des Threonins 92 am N-Terminus zerstört wurde, und daß die fehlende Interaktion mit CBP die Transkription von Zielgenen negativ beinflußt.
Mit Hilfe des Modellorganismus S. cerevisiae konnten alle bisher unbekannten Gene der Gluconeogenese und des Glyoxylat-Zyklus des opportunistisch humanpathogenen Pilzes C. albicans isoliert werden. Erste Hinweise führten zu der Annahme, dass diese Stoffwechselwege möglicherweise essentiell für das vegetative Wachstum sind, so dass sie gute Wirkorte für neu zu entwickelnde Antimycotica darstellen könnten. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass diese Stoffwechselwege ungeeignete Wirkorte für Antimycotica sind, da sie weder essentiell für das vegetative Wachstum sind noch von ihnen Virulenzfaktoren von C. albicans beeinflusst werden (z.B. Hyphenentwicklung). Die Regulation der Gluconeogenese und des Glyoxylat-Zyklus in S. cerevisiae ist gut untersucht und alle Ergebnisse mit C. albicans zeigen, dass die Regulation dieser Stoffwechselwege zwischen diesen beiden Hefen sehr konserviert ist. Es wurde eine Methode für die Identifizierung von essentiellen Genen durch funktionelle Komplementation in S. cerevisiae entwickelt. Diese sogenannte Split-Marker-Selektion basiert auf einer Cre/loxP-vermittelten induzierten Deletion eines essentiellen Gens von S. cerevisiae und der Komplementation des resultierenden letalen Phänotyps durch ein heterolog exprimiertes Gen in einer DNS Genbank. Die Methode ist auch für die Funktionsanalyse von essentiellen Genen in S. cerevisiae geeignet (z.B. Identifizierung von Suppressoren, Analyse finaler Phänotypen). Mit Hilfe der Split-Marker-Selektion wurde das putativ essentielle Gen NEP1 ("nuclear essential protein") von C. albicans identifiziert. Die Funktionsanalyse des homologen Gens in S. cerevisiae ergab, dass das Gen für ein Mikrotubuli-assoziiertes Protein kodiert, das in allen Eukaryonten existiert. Es erwies sich, dass das menschliche Homolog in S. cerevisiae funktionell ist und den letalen Phänotyp einer NEP1 Deletion in S. cerevisiae überwindet. Es zeigte sich weiterhin, dass das menschliche Homolog in S. cerevisiae nicht an Mikrotubuli assoziiert ist. Dies deutet darauf hin, dass die Mikrotubuli-Assoziation nicht für die essentielle Funktion von Nep1p nötig ist. Das bisher uncharakterisierte Protein Ydl148p wurde als Interaktionspartner von Nep1p gefunden. Desweitern konnte SAM2 als Multicopy-Suppressor des konditional letalen Phänotyps (Temperatursensitivität) eines NEP1 Mutantenallels (nep1-ts1) identifiziert werden. Die Suppression wurde hierbei über die erhöhte Konzentration an S-Adenosylmethionin vermittelt. Dieser Cofaktor ist an Methylierungsreaktionen beteiligt, so besteht die Möglichkeit, dass Nep1p eine Methyltransferase ist oder an Methylierungsreaktionen beteiligt ist.
Der derzeitige Stand der Gentherapie bedarf der Entwicklung neuer Systeme zur Selektion bislang unbekannter Proteine und zur Verbesserung der Gentransfereffizienz viraler Vektorsysteme. Bisher verwendete Systeme wie Phagen display bergen erhebliche Nachteile, die alle auf die Verwendung von Prokaryonten zurückzuführen sind. Deswegen wurde in der vorliegenden Arbeit ein System entwickelt, welches eine Selektion und Produktion von Proteinen im stets eukaryonten Kontext ermöglicht. Dazu wurde ein ein replikationskompetenter retroviraler Vektor entwickelt durch den eine erhebliche Steigerung der Gentransfereffizienz möglich ist. Beide Teilaspekte meiner Arbeit beruhen auf Modifikationen unterschiedlicher Stämme des Maus Leukämie Virus (MLV). Zur Selektion von Proteinen im eukaryonten Kontext wurde erstmalig eine retrovirale display Bibliothek etabliert, wobei ecotropes MLV varible Antikörper-Fragmente (scFv´s) auf der Oberfläche präsentiert. Eine Modellselektion mit dem Antigen Laminin, simuliert durch das Mischen von zwei erstellten Virusvarianten (7A5 Xa Mo/ L36 Xa Mo) in unterschiedlichen Konzentrationen, konnte die Selektion der Laminin-bindenen Variante L36 Xa Mo aus einem Überschuß von 10 hoch -4 nicht bindender 7A5 Xa Mo zeigen. Die Anreicherung der bindenden L36 Xa Mo Variante konnte ebenfalls aus dem Kontext einer erstellten retroviralen alphaHUVEC Bibliothek erzielt werden. Die Anwendbarkeit des Systems wurde durch diese Modellselektionen sowie durch die Selektion der alphaHUVEC Bibliothek auf VEGFR-1 als Antigen demonstriert. Derart selektionierte Proteine konnten im nächsten Schritt, unter Verwendung einer Furinspaltstelle im Hüllprotein des amphotropen MLV, in verschiedenen Zelllinien produziert werden. Gezeigt werden konnte eine effiziente Produktion und Sezernierung der verwendeten scFv´s bis zu einer Konzentration von 6µg/ml im Zellkulturüberstand, wobei der Tropismus des amphotropen MLVs nicht beeinflußt wurde. Die biologische Aktivität derart hergestellter Proteine, konnte mittels FACS und ELISA nachgewiesen werden. Eine Abtrennung von den viralen Bestandteilen kann durch Filtration mit molekularer Ausschlußgrenze erzielt werden. Besonders hervorzuheben ist die genomische Stabilität derart mordifizierter Viren. Trotz des zusätzlichen Leserahmens war das auf die beschriebene Weise modifizierte MLV über 12 Infektionszyklen genetisch stabil und gewährleistete so erstmalig eine stetige Produktion der gewünschten Proteine. Die erfolgreiche Anwendung dieses Vektorsystems zur Tumortherapie erwies sich bereits in weiterführenden Arbeiten.
Die Zusammensetzung der Plasmamembran tierischer Zellen kann unter anderem durch regulierte Exozytose und durch hydrolytische Abspaltung von Ektodomänen membran-assoziierter Proteine (Ectodomain Shedding) modifiziert werden. Regulierte Exozytose spezialisierter Vesikel, den sogenannten GSVs (GLUT4 containing small vesicles), dient der intrazellulären Speicherung des Glucosetransporters4 (GLUT4) sowie seinem insulin-abhängigen Einbau in die Plasmamembran. Die proteolytische Abspaltung der Ektodomänen von Zelloberflächenproteinen wie z.B. des Heparin-bindenden epidermalen Wachstums-faktors (heparin binding-epidermal growth factor = HB-EGF) führt zur Modifikation der Plasmamembranzusammensetzung. Wir zeigten, dass GSVs in vielen Säugerzellen für die intrazelluläre Speicherung spezifischer Plasmamembranproteine und deren stimulations-abhängigen Transfer in die Plasmamembran zuständig sind. Um GSVs eindeutig identifizieren zu können, wurden Rat1-Zellen stabil mit GLUT4myc als heterologem Marker für dieses spezifische Speicherkompartiment transfiziert. Die intrazelluläre GLUT4-Lokalisation in den als positiv identifizierten Rat1/GLUT4myc-Klonen entsprach dem für CHO/GLUT4-Zellen beschriebenen Verteilungsmuster. In der Folge wurden mehrere potentiell vesikel-assoziierte Membranproteine in die Untersuchungen zur Membran-zusammensetzung einbezogen: eine endogene proHB-EGF hydrolysierende Proteaseaktivität und die Metalloproteasen ADAM10 und TACE. Es zeigte sich, dass GSVs eine Proteaseaktivität enthielten, die VSVG-proHB-EGF hydrolysierte. Eine Colokalisation der beiden endogenen Metalloproteasen ADAM10 und TACE mit GLUT4 in GSVs konnte gezeigt werden. Untersuchungen zeigten, dass beide endogenen Proteasen ADAM10 und TACE in Rat1/GLUT4myc-Zellen mit einer Subpopulation von GSVs assoziiert zu sein scheinen. Die Stimulation des G-Protein-gekoppelten Thrombinrezeptors löste in diesen Zellen eine regulierte Exozytose der GSVs aus. Die Metalloproteasen-enthaltenden GSVs reagierten jedoch nicht auf diese Art der Stimulation. Sie bildeten möglicherweise eine Reservepopulation von GSVs, die erst bei stärkerer Stimulation mobilisiert werden kann. Unter Ruhebedingungen schien auch diese Vesikelpopulation über andere intrazelluläre Kompartimente, nicht jedoch über die Plasmamembran, zu rezirkulieren.
Reinigung, biochemische Charakterisierung und Struktur der A1AO-ATPase aus Methanococcus jannaschii
(2006)
Die A1AO-ATPase wurde aus Membranen von M. jannaschii unter Erhalt der Struktur isoliert. Das Enzym wurde durch eine Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation, eine Anionenaustauschchromato-graphie an DEAE und eine Gelfiltration zur Homogenität gereinigt. Alle 9 aus der Operon-Struktur vorhergesagten Untereinheiten konnten mittels Western-Blot-Analyse oder einer N-terminalen Sequenzierung identifiziert werden. Die funktionelle Kopplung der A1- und AO-Domäne wurde durch Studien mit dem Inhibitor DCCD nachgewiesen. Das gereinigte Enzym hatte eine Masse von 670 kDa. Die ATP-Hydrolyseaktivität war bei einer Temperatur von 80°C und einem pH-Wert von 6 optimal. Der KM-Wert für MgATP wurde zu 1,2±0,2 mM bestimmt. Bei den Versuchen zur Entwicklung eines Na+-freien Tespuffers trat die strikte Abhängikeit des Enzyms von Hydrogensulfit oder Sulfit als Problem zu Tage. Aus Membranen von M. jannaschii wurden durch Chloroform/Methanol Lipide extrahiert, aus denen dann Liposomen hergestellt wurden. Die A1AO-ATPase aus M. jannaschii wurde in diese Liposomen erfolgreich rekonstituiert, eine ATP-Synthese konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. Die elektronenmikroskopischen Analysen zeigten einen für ATPasen charakteristischen Aufbau, aus einer hydrophilen Domäne, die durch mindestens zwei Stiele mit der Membrandomäne verbunden ist. Anhand der Bildrekonstruktion von 17.238 Einzelpartikeln konnten zwei Klassen von ATPase-Molekülen unterschieden werden, die entweder über einen oder zwei periphere Stiele verfügten. Aus verschiedenen Einzelprojektionen wurden Summenbilder generiert, anhand dieser 2D- Rekonstruktion wurde die ATPase vermessen. Der Kopfteil, die Membrandomäne und der zentrale Stiel haben eine Größe von 11,5 x 9,4 nm, 10,6 x 6,4 nm und 8 x 3,9 nm (Länge x Breite). Die Gesamtlänge des Enzyms betrug 25,9 nm. Der zentrale Stiel der ATPase ist über der Membran von einer Kragen-ähnlichen Struktur umgeben, die wiederum mit den peripheren Stielen in Kontakt steht. Scheinbar steht nur einer der peripheren Stiele in direktem Kontakt mit der AO-Domäne. Die Überlagerung der 3D-Rekonstruktion eines A1-Subkomplexes aus Methanosarcina mazei mit der 2D-Rekonstruktion der A1AO-ATPase aus M. jannaschii zeigen deutlich, dass die peripheren Stiele mit dem oberen Ende der A1-Domäne in Kontakt stehen. Durch diese Analysen konnte erstmals die Struktur einer A1AO-ATPase mit einer Auflösung von 1,8 nm dargestellt werden. Sequenzanalysen haben gezeigt, dass das Proteolipid-Gen von Methanopyrus kandleri verdreizehnfacht ist. Das Gen wurde mittels PCR vervielfacht und in einen TOPO®-Vektor kloniert. Versuche das Gen in einen Expressionsvektor umzuklonieren, waren noch nicht erfolgreich.
Heterologe Expression des humanen ß-2-adrenergen Rezeptors in Semliki-Forest-Virus-Expressionssystem
(2005)
Der humane ß2-adrenerge Rezeptor besitzt sieben Transmembrandomänen und gehört zur Superfamilie der G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCRs). Der Rezeptor ist an der Zelloberfläche lokalisiert und kann nach Bindung extrazellulärer Signalstoffe intrazelluläre Antworten auslösen. Als physiologische Liganden des ß2-adrenergen Rezeptors dienen hauptsächlich die Katecholamine wie Noradrenalin. Nach der Bindung des Liganden kann der Rezeptor an ein stimulatorisches G-Protein (Gs) koppeln und durch Aktivierung der Adenylatzyklase die intrazelluläre cAMP-Konzentration regulieren. Aufgrund der großen pharmakologischen Bedeutung von GPCRs ist es wichtig, die dreidimensionale Struktur dieser Rezeptoren aufzuklären. Da die GPCRs im nativen Gewebe nur in geringen Mengen vorkommen, müssen sie heterolog überproduziert und zur Strukturaufklärung gereinigt werden. In dieser Arbeit wurde das Semliki Forest Virus (SFV)-Expressionssystem zur Produktion des ß2-adrenergen Rezeptors etabliert und optimiert. Die Optimierung des SFV-Expressionssystems erfolgte zunächst bei der Produktion von rekombinanten Viren. Die in vitro Transkriptionsreaktion wurde zur Verbesserung der RNA-Ausbeute untersucht. Anschließend wurde eine optimale Bedingung für die Elektroporation gefunden. Dabei konnte einen Virustiter von 7,5 × 108 infektiöse Partikel pro ml erreicht werden. Zur Produktion des Rezeptors in Säugerzellen wurden sieben rekombinante Viren hergestellt. Verschiedene N- und C-terminale Fusionen wurden im Hinblick auf einen möglichen Einfluss auf die Rezeptorproduktion untersucht. Für das Gen des Kapsid-Proteins (CAP) des Semliki-Forest-Virusgenoms konnte eine deutliche Steigerung der Rezeptorproduktion gefunden werden. Auch die Kozak-Sequenz und das Hämagglutinin (HA)-Signal-Peptid zeigten einen positiven Einfluss auf die Rezeptorproduktion. Die heterologe Proteinexpression wurde in verschiedenen Zelllinien durchgeführt. Es zeigte sich, daß die BHK-21-Zellen für die Produktion in großen Mengen am besten geeignet sind. Die Expressionsrate des Rezeptors in BHK-21-Zellen stieg mit zunehmender Infektionsmultiplizität (MOI). Durch Zugabe von Liganden Alprenolol ins Kulturmedium konnte eine weitere signifikante Steigerung von Rezeptorproduktion erzielt werden. So konnte in adhärenten BHK-21-Zellen 20 Stunden nach der Infektion bei einer MOI von 150 und 2 µM Alprenolol im Medium eine Produktionsrate von 49,6 pmol Rezeptor pro mg Membranprotein erreicht werden. In Suspensionskultur konnte eine Produktionsrate von 36,0 pmol Rezeptor pro mg Membranprotein erreicht werden. Damit konnten 0,2 mg Rezeptoren aus 1 Liter Suspensionskultur produziert werden. Die Rezeptorproduktion in Suspensionskultur könnte jedoch weiter verbessert werden. Mit Immunogoldmarkierung konnte eine überwiegende Lokalisation des Rezeptors im endoplasmatischen Retikulum festgestellt werden. Ein N-Glykosylierung des Rezeptors konnte nachgewiesen werden. Die Glykosylierung gehört zum mannosereichen Typ. Für den Rezeptor wurde eine Dissoziationskonstante von 2,7 nM konnte für Liganden [3H]-CGP-12177 bestimmt. Durch Messung der intrazellulären cAMP-Konzentration wurde die vollständige Funktionalität des rekombinanten Rezeptors nachgewiesen. Für die Membranpräparation wurde ein Protokoll erarbeitet, womit ca. 120 mg Membranprotein aus 1 Liter Zellkultur gewonnen werden konnten. Bei der anschließenden Solubilisierung des Rezeptors mit 1,5 % n-Dodecyl-ß-D-maltosid bei pH 7,4 und 100 mM NaCl konnte eine Ausbeute von ca. 100% erreicht werden. In dieser Arbeit konnte nach verschiedenen Versuchen gezeigt werden, daß eine Reinigung über Immobilisierte Metallchelat-Affinitätschromatographie (IMAC) in einem einzigen Schritt nicht möglich war.
Das Ziel dieser Arbeit war, Unterschiede bezüglich der Körperbautypen an Elitekarateka zu eruieren. Hierzu wurden die Konstitutionstypologien nach Conrad, Knußmann, Parnell sowie Heath und Carter, Proportionsfiguren, und das Phantom stratagem verwendet, ebenso wie die Hautfettfalten-Dickenmessungen, die Bioelektrische-Impedanz-Analyse (BIA) und der Body-Mass-Index (BMI). Unter der Annahme Großmeisters Funakoshis, dass es durch ständiges Karatetraining zu körperbaulichen Konstitutionstypusänderungen kommt, wurde diese sportanthropologische Studie durchgeführt. Es sollte geklärt werden, ob innerhalb der Karatewettkampfdisziplinen Kata und Kumite unterschiedliche Körperbautypen, unter Einbeziehung des Sexualdimorphismus, zu finden sind. Die 80 untersuchten männlichen und weiblichen Karateka kamen aus den Disziplinen Kata (Schattenboxen) und Kumite (Freikampf). Im Vergleich dazu wurden 62 und 66 Breitensportkarateka als Kontrollgruppe gegenübergestellt. Das Vergleichskollektiv wurde aus zwei Fitnessstudios rekrutiert, in denen die Probanden 2 - 4 mal pro Woche trainierten. Die Messungen wurden unter standardisierten Bedingungen vom Verfasser dieser Arbeit (und einer Kollegin) durchgeführt. Die Ergebnisse wurden statistisch geprüft. Die Konstitutionstypognosen von Conrad, die durch die Betrachtungen der Somatocharts von Parnell bzw. Heath und Carter bestätigt wurden, zeigten Unterschiede der Leistungssportler gegenüber den Kontrollgruppen. Demnach ist der typische Kata- und Kumiteathlet kleiner und wiegt weniger als die Sportler des Vergleichskollektivs der Fitnessprobanden. Er ist athletischer gebaut und weist ein günstiges Verhältnis von aktiver und passiver Körpermasse auf. Des Weiteren sind innerhalb der Karatedisziplinen die Katasportler endomorpher als ihre Kollegen. Die Kumiteathleten nehmen mehr ektomorphe Positionen in den Somatocharts (Parnell, Heath und Carter) ein. Anhand der Ergebnisse lässt sich die ursprüngliche Vermutung Funakoshis nach differenzierten Konstitutionstypen sowohl für die beiden Untersuchungskollektive als auch innerhalb des Karate für die Wettkampfdisziplinen Kata und Kumite bestätigen. Die vorliegende Studie lässt den Schluss zu, dass es sowohl den Kata- als auch den Kumite-Konstitutionstypus im Karate gibt. Weiterer Forschungsbedarf besteht hinsichtlich longitudinaler Datenerhebungen des Konstitutionswandels jugendlicher Karateka im Laufe ihrer Wettkampfkarriere. Die Karriere beeinflussende Faktoren wie Trainingshäufigkeit, „Trainingsalter“ und Verletzungshäufigkeit, bezogen auf das Leistungsniveau, lassen Spielraum für weiterführende Untersuchungen. Dies gilt auch für eventuelle ethnische Körperbauunterschiede und das Leistungsniveau der Athleten.
Reggie-1 und Reggie-2 stellen eine über diverse Spezies konservierte Proteinfamilie dar und werden in den meisten Geweben exprimiert. Die physiologische Funktion dieser Proteine ist bisher nicht geklärt. Die Reggie-Proteine wurden zunächst im Zusammenhang mit der Regeneration von Axonen retinaler Ganglienzellen des Goldfisches beschrieben. In diesen Zellen wird die Expression beider Proteine nach Läsion des Nervs hochreguliert. Unabhängig davon wurden Reggies aufgrund ihres Sedimentationsverhaltens in Dichtegradienten als Flotilline beschrieben. Dabei ist Reggie-1 identisch mit Flotillin-2 und Reggie-2 mit Flotillin-1. Beide Reggie-Proteine sind Raft-assoziiert. Bei Rafts handelt es sich um Membran-Mikrodomänen, deren Rolle in verschiedenen zellulären Prozessen wie Signaltransduktion, Endozytose und dem Transport von Proteinen beschrieben wurde. Strukturell zeichnen sich Rafts durch einen im Vergleich zur restlichen Membran erhöhten Anteil an Cholesterol und Sphingolipiden aus, der unter anderem in einer herabgesetzten lateralen Beweglichkeit der beteiligten Moleküle resultiert, und so Sortierungs- und Signalvorgänge innerhalb der Zelle begünstigt. Aus der Beobachtung, dass Reggie-2 mit dem Struktur-Vorläuferprotein des Rotavirus interagiert, ergab sich die Fragestellung zu dieser Arbeit. Das Ausschleusen von Rotaviren aus infizierten Zellen ist von Rafts abhängig. Die strukturellen Eigenschaften des Rotavirus-Proteins ähneln Gag, dem Struktur-Vorläuferprotein des Humanen Immundefizienz-Virus und verwandter Retroviren. Das HIV Gag-Protein ist außerhalb des viralen Kontext nach Expression in der Lage, an zellulären Membranen zu assemblieren und Virus-ähnliche Partikel zu bilden. Die molekularen Abläufe dieses Vorgangs, der als budding bezeichnet wird, sind noch nicht im Detail verstanden. Sie werden jedoch sowohl für Gag allein, als auch für die Virusproduktion in infizierten Zellen mit Rafts in Verbindung gebracht. Ein Hinweis darauf ergibt sich aus der Tatsache, dass HIV-infizierte Zellen nach Cholesterol-Depletion kein produktives Virus mehr abschnüren. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Reggie-2 mit HIV-1 Gag interagiert und sich Veränderungen der Reggie-2 Expressions sowohl auf die zelluläre Lokalisation von Gag als auch auf die Produktion Virus-ähnlicher Partikel auswirkt. Die Überexpression von Reggie-2 in HeLa-Zellen führt zu einer Umverteilung von Gag mit erhöhter Lokalisation an der Plasmamembran, an der es dann stark mit Reggie-2 kolokalisiert. Die Verminderung der Reggie-2 Expression mittels siRNA resultiert in einer erhöhten Freisetzung Virus-ähnlicher Partikel aus Gag-transfizierten HeLa-Zellen und in einer eher löslichen Lokalisation des viralen Proteins im Zytoplasma. Der Ort des buddings von HIV ist Zelltyp-abhängig und involviert die zelluläre ESCRT-Maschinerie, die physiologisch für das Sortieren von Proteinen in multivesicular bodies (MVBs) zuständig ist. Gag rekrutiert das ESCRT-System, indem es über ein kurzes Aminosäuremotif an das ESCRT-I Protein TSG101 bindet und dabei die Eigenschaft des zellulären Proteins HRS nachahmt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Reggie-2 in HeLa-Zellen mit Komponenten der ESCRT-Maschinerie kolokalisiert. Dabei ist denkbar, dass eine Verbindung zwischen ESCRT und Reggie-Proteinen besteht, da Rafts als Signal- und Sortier-Plattformen die physiologischen Prozesse begünstigen könnten, die bei der Funktion von MVBs eine Rolle spielen. Im Gegensatz zu Reggie-2 findet keine Interaktion von Gag mit Reggie-1 statt. Beide Reggie-Proteine sind jedoch biochemisch in produktiven Viren infizierter primärer T-Zellen nachweisbar. Des Weiteren zeigen Immunfluoreszenz-Studien infizierter Lymphozyten, dass beide Reggies in diesen Zellen in einem großen Ausmaß mit Gag kolokalisieren. Der Grund dafür ist wahrscheinlich die Fähigkeit der Reggies zur Homo- und Heterooligomerisierung. Die direkte und spezifische Interaktion von Gag mit dem Raft-assozierten Protein Reggie-2 konnte mit verschiedenen Methoden gezeigt werden. Dabei können die Ergebnisse als Grundlage für ein besseres Verständnis der HIV-Pathogenese dienen, und zusätzlich gibt die mögliche Verbindung von Reggies zum ESCRT-Komplex neue Hinweise auf die zelluläre Funktion dieser Raft-Proteine.
Die postnatale Neovaskularisierung ist eine wichtige Vorraussetzung um Gewebe vor kritischer Ischämie zu schützen. Eine der Grundlagen dieses Prozesses bilden die Angiogenese, bei der neue Kapillaren durch Proliferation und Migration von Endothelzellen aus bereits vorhandenen Blutgefäßen entstehen. Ein zweiter Eckpfeiler ist die Vaskulogenese, die unter anderem durch zirkulierende endotheliale Vorläuferzellen (EPC) vermittelt wird. Homeobox-Gene der Klasse 1 (Hox) sind Transkriptionsfaktoren, die während der Embryonalentwicklung an der Organogenese und der Entwicklung des kardiovaskulären Systems beteiligt sind. Verschiedene Studien weisen darauf hin, dass Homeobox-Proteine auch im adulten Organismus bei der transkriptionellen Regulation von Genen der Angio- und Vaskulogenese eine wichtige Rolle spielen. Die in dieser Arbeit vorliegenden Ergebnisse zeigen eine essentielle Rolle von HoxA9 für die postnatale Neovaskularisierung sowie für die funktionelle Integrität von Endothelzellen und endothelialen Progenitorzellen. HoxA9-defiziente Mäuse hatten einen signifikant verringerten Blutfluss nach einer Hinterlauflauf-Ischämie. Für die reduzierte Neovaskularisierung des ischämischen Gewebes, genügte der Verlust eines einzigen HoxA9-Wildtypallels. Außerdem zeigen HoxA9-defiziente Endothelzellen in vitro eine stark gehemmte Migration sowie eine verringerte Gefäßstrukturbildung. Zusätzlich war auch deren Interaktion mit EPC im Matrigel verschlechtert. Eine Bestätigung dieser Beobachtung zeigten Untersuchungen an endothelialen Vorläuferzellen, die ebenfalls einen Verlust angiogener Funktionen bei verminderter HoxA9-Expression aufwiesen. Neben der postnatalen Neovaskularisierung konnten erste Untersuchungen embryonaler Allantois zeigen, das HoxA9 vermutlich auch in der embryonalen Gefäßbildung beteiligt ist. Diese Theorie wird durch eine nicht-Mendelsche Verteilung der postnatalen Genotypen nach Kreuzung heterozygoter HoxA9-Mäuse unterstützt. Als molekulare Ursachen der Hemmung angiogener Funktionen bei Endothelzellen, konnte die Regulation verschiedener Gene nachgewiesen werden. So ist HoxA9 für die Expression der endothelialen Stickstoffmonoxidsynthase (eNOS), des VEGF-Rezeptors 2 (VEGF-R2), der Adhäsionsmoleküle VE-Cadherin und Integrin v3 sowie des EphB4-Rezeptors von essentieller Bedeutung. Diese von HoxA9 regulierten Gene spielen für die Angio- und Vaskulogenese alle eine entscheidende Rolle. Der EphB4-Rezeptor, die eNOS und der VEGF-R2 werden durch eine direkte Bindung von HoxA9 an den jeweiligen Promotor auf transkriptioneller Ebene reguliert. Bei den Genen Integrin v3 und VE-Cadherin erfolgt die Regulation durch HoxA9 indirekt über andere Gene oder posttranskriptionell. Zusätzlich zum Nachweis der Kontrolle der Genexpression, konnte für den EphB4-Rezeptor nachgewiesen werden, dass dieser von großer Bedeutung für die HoxA9-regulierte Migration ist. Außerdem besitzt der EphB4-Promotor eine für die Regulation der EphB4-Expression durch HoxA9 wichtige Bindungsstelle. In weiteren Versuchen konnte gezeigt werden, dass HoxA9 Schubspannungs-abhängig reguliert wird und dabei auch in die Regulation der Schubspannungs-induzierten Migration und die Schubspannungs-abhängige Expression der untersuchten Zielgene von HoxA9 eingreift. Zusammenfassend zeigen die hier vorgestellten Daten, dass HoxA9 endotheliale Gene vielfältig reguliert, eine entscheidende Rolle bei der Modulation verschiedener endothelialer Funktionen spielt und essentiell für die postnatale Neovaskularisierung ist.
Hodgkin-Lymphom-Biopsien und abgeleitete Zelllinien sind charakterisiert durch die konstitutive Aktivität verschiedener Komponenten des JAK/STAT-Signalweges. Dennoch ist die Bedeutung dieser Signalvermittler für die Pathogenese des klassischen Hodgkin-Lymphoms nicht vollständig geklärt. Gegenstand dieser Arbeit war die Bedeutung der JAK/STAT-Signalkaskade, sowie insbesondere die zellulären Funktionen von STAT3 und STAT6 zu untersuchen. Zu diesem Zweck kamen zwei verschiedene synthetische Kinase-Inhibitoren (AG490, Cucurbitacin I) zum Einsatz. Beide Substanzen blockieren die Kaskade auf Ebene der Kinasen und sind als JAK2/STAT3-spezifische Inhibitoren beschrieben. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Behandlung mit beiden Substanzen das Wachstum der malignen Zellen hemmte. Gelretardierungsexperimente ergaben jedoch, dass beide Inhibitoren in allen HL-Zelllinien immer mehr als nur ein STAT-Molekül hemmten. Somit konnte keine Aussage über die Bedeutung einzelner STATs getroffen werden. Um die zellulären Funktionen von STAT3 und STAT6 zu untersuchen wurden daher spezifische siRNAs mittels lentiviraler Vektoren exprimiert. Die Rolle von STAT3 bei der Entstehung verschiedenster Krebsarten ist bereits gut charakterisiert. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass STAT3 auch in HL-Zellen ein wichtiger Regulator von Proliferation und Apoptose ist. Darüber hinaus konnte auch STAT6 als Vermittler proliferations-fördernder, anti-apoptotischer Signale identifiziert werden. Es konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass eine alleinige Hemmung von STAT6 ausreicht um Apoptose in einigen HL-Zellen auszulösen. Diese Induktion von Apoptose wurde durch Caspasen vermittelt. Um den genauen Mechanismus aufzuklären und um STAT6-Zielgene zu identifizieren, die anti-apoptotisch wirken, wurde eine Microarray-Analyse durchgeführt. Eine weitere Möglichkeit die Aktivierung der JAK/STAT-Signalkaskade zu beeinflussen bieten die SOCS-Proteine. Diese sind direkte Zielgene der STATs und regulieren die Signalvermittlung in einer negativen Rückkopplung. In vielen unterschiedlichen Krebsarten ist diese Negativregulation ausgefallen oder fehlerhaft. Das kann zu einer konstitutiven Aktivierung des JAK/STAT-Signalweges beitragen. Die Bedeutung der SOCS-Proteine im klassischen Hodgkin-Lymphom ist noch unbekannt und wurde in dieser Arbeit untersucht. Es wurden unterschiedliche Mengen endogenes SOCS1 und SOCS3 in verschiedenen HL-Zelllinien und in HL-Biopsien detektiert. In Überexpessionsexperimenten mit SOCS1 und SOCS3 konnte gezeigt werden, dass sowohl SOCS1, als auch SOCS3 nur in Zellen, die wenig endogene SOCS besitzen, die Aktivität von STAT3 und STAT6 inhibieren konnten. Die Überexpression resultierte in einem Wachstumsarrest und einem erhöhten Anteil toter Zellen. In Zellen, die bereits viel SOCS besaßen, konnten weder STAT3 noch STAT6 inhibiert werden. In diesem Zusammenhang wurde ein Modell, das potentielle Möglichkeiten zum Umgehen einer Negativregulation durch die SOCS-Proteine darstellt, diskutiert. Darüber hinaus konnte in Gelretardierungsexperimenten gezeigt werden, dass SOCS3 zusätzlich zu STAT3 und STAT6 in Zellen, die wenig SOCS besaßen, auch NF?B-Aktivierung hemmte. Da NF?B bereits als wichtiger Überlebensfaktor für HL-Zellen beschrieben wurde, trägt dessen Inhibition wahrscheinlich zu einer Hemmung des Wachstums bei. Zusammenfassend konnten in dieser Arbeit STAT3 und STAT6 als potentielle Ziele für therapeutische Ansätze für das klassische Hodgkin-Lymphom identifiziert werden. Einen weiteren Angriffspunkt für zukünftige Strategien liefern die SOCS-Proteine, die eine signalweg-übergreifende Hemmung von Transkritionsfaktoren erlauben.
Die Dissertation liefert einen Beitrag zur Identifizierung und Charakterisierung der an der Komplementresistenz von Borrelien beteiligten CRASP-Proteine aus Isolaten der Genospezies B. burgdorferi s.s. und B. afzelii. Im Rahmen der Arbeit gelang es mittels Identifizierung und immunologischer Charakterisierung die Zugehörigkeit der spezifisch Faktor H-bindenden BbCRASP-Proteine BbCRASP-3, BbCRASP-4 und BbCRASP-5 zur Erp-Proteinfamilie zu beweisen. Weiterhin konnten die Faktor H- und FHL-1-bindenden BbCRASP-Proteine BbCRASP-1 und BbCRASP-2 von B. burgdorferi s.s. identifiziert werden. Mit dem BbCRASP-2-Protein wurde ein bis dahin unbekanntes Faktor H- und FHL-1-bindendes CRASP-Protein aus den äußeren Membranen des B. burgdorferi s.s.-Isolates B31 isoliert und charakterisiert. BbCRASP-2 stellt innerhalb der CRASP-Proteinfamilie ein neues eigenständiges Lipoprotein dar und unterscheidet sich deutlich von den Sequenzen der anderen CRASP-Proteine. Es ist weder ein Mitglied der gbb54- oder der Erp-Proteinfamilie, noch gehört es zu einer anderen bekannten Proteinfamilie von B. burgdorferi s.s. In Ligandenaffinitätsblot-Analysen konnte mit Hilfe von rekombinantem FHL-1 sowie Deletionsmutanten von Faktor H und FHL-1 gezeigt werden, dass die Bindung von Faktor H und FHL-1 an das BbCRASP-2-Protein ausschließlich über die SCR 7-Domäne vermittelt wird. Die Analysen C terminaler Deletionsmutanten von BbCRASP-2 unterstrichen die Bedeutung der letzten 16 Aminosäuren des BbCRASP-2-Proteins für die Interaktion mit Faktor H und FHL-1.
An die Signalübertragung im ZNS werden in bestimmten Entwicklungsstadien sehr unterschiedliche Anforderungen gestellt. Im adulten Gehirn dient sie nicht nur der Nachrichtenübermittlung, sondern auch der aktivitätsbasierten Umgestaltung neuronaler Verbindungen bei Lernprozessen und der regenerativen Umgestaltung nach Verletzungen. Im sich entwickelnden Gehirn werden schon frühzeitig Nervenzellen elektrisch erregbar und spontan aktiv. Diese elektrische Aktivität und die dadurch verursachte Transmitterausschüttung spielen bei der selektiven Stabilisierung von Synapsen und damit bei der Ausgestaltung des neuronalen Netzwerks eine große Rolle. Im ZNS von Vertebraten beruht die Wirkung des Neurotransmitters und Neuromodulators Acetylcholin auf den nikotinischen und muskarinischen Acetylcholinrezeptoren. Muskarinische Acetylcholinrezeptoren (mAChRen) koppeln, abhängig von den fünf identifizierten Rezeptorsubtypen (M1- M5), an unterschiedliche intrazelluläre Signalketten an. Dabei interagieren für gewöhnlich die M1, M3 und M5 Rezeptoren mit einem G-Protein des Typs Gq/11, während M2 und M4 ein G-Protein des Typs Gi/o aktivieren. Der Colliculus inferior (IC) ist eine wichtige Verschaltungsstation im auditorischen Mittelhirn von Säugetieren. Inhibitorische und exzitatorische Eingänge werden dort während der Entwicklung mit großer Präzision angelegt und konvergieren auf einzelne ICNeurone. Die physiologische Bedeutung von mAChRen im IC ist weitgehend unerforscht und die Subtypen die im juvenilen IC eine Rolle spielen wurden noch nicht charakterisiert. Es war das Ziel der vorliegenden Arbeit mittels elektrophysiologischer Untersuchungen im IC der juvenilen Ratte (P5-P12) folgende Fragen zu klären: i) Gibt es im IC der jungen Ratte eine Modulation der GABAergen Transmission durch muskarinische Acetylcholinrezeptoren? ii) Welcher muskarinische Rezeptorsubtyp spielt dabei eine Rolle? iii) Welcher intrazelluläre Signalmechanismus ist der Aktivierung des muskarinischen Acetylcholinrezeptors nachgeschaltet? Unter Wirkung von Muskarin kam es bei 41,2% der untersuchten Neurone des Colliculus inferior zu einer Erhöhung der Frequenz der spontanen IPSCs. Die sIPSCs wurden durch Bicucullin blockiert, somit handelt es sich um GABAerge IPSCs. Die Wirkung von Muskarin nahm zu, wenn die Tiere älter als 9 Tage waren. Es wurde gezeigt, dass nAChRen keine Rolle spielen bei der Erhöhung der sIPSC-Frequenz, während eine selektive Blockade der M3-(M5-) mAChRen durch 4-DAMP die Muskarinwirkung blockierte. In der Regel sind die M3-Rezeptoren über folgende Signalkaskade aktiv: Phospholipase C, Kalzium-Calmodulin, NO-Synthase, Guanylatzyklase, die NO-Konzentration und cGMP. Alle Glieder dieser Kaskade wurden untersucht, sie hatten aber keinen Einfluss auf die Muskarinwirkung. Im Gegensatz dazu führte die Erhöhung des intrazellulären cAMP-Spiegels zu einer vergleichbaren Frequenzsteigerung der sIPSCs wie sie unter der Wirkung von Muskarin gemessen wurde. Weiterhin ließ sich die Erhöhung der sIPSC-Frequenz durch Muskarin vollständig aufheben, wenn die intrazelluläre Adenylatzyklase blockiert wurde. Es ist bekannt, dass der M3-(M5-) mAChR über verschiedenste Signalwege den intrazellulären cAMP-Spiegel verringern oder erhöhen kann und dass die Spezifizierung des Rezeptors vom Grad der Rezeptorexpression, dem Zelltyp und der Kombination der Effektormoleküle abhängig ist. Die Abweichung der juvenilen Kaskade vom im erwachsenen Tier üblichen Signalweg hat dabei den Vorteil, dass eine Aufgabentrennung zwischen Netzwerkbildung und Synapsenstabilisierung einerseits und Signalweiterleitung andererseits erfolgt. Beim juvenilen Tier steht die Netzwerkbildung im Vordergrund, beim erwachsenen Tier wird die Signalweiterleitung moduliert. Der sekundäre Botenstoff NO, der weit diffundieren kann, spielt beim juvenilen Signalweg keine Rolle und dies ermöglicht eine klare Trennung der aktivierten von den umgebenden Synapsen. Dadurch wird eine starke Selektion innerhalb der vorhandenen Synapsen ermöglicht und eine aktivitätsbasierte Netzwerkbildung vereinfacht. Die Etablierung funktioneller GABAerger Synapsen ist ausschlaggebend für die Entwicklung des neuronalen Netzwerks. Innerhalb der ersten postnatalen Wochen führt die Aktivierung von GABAA-Rezeptoren zur Depolarisierung der IC-Neurone und zu einer Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration. Acetylcholin potenziert also letztlich den GABA-aktivierten Einstrom von Ca2+ und führt damit zur Erhöhung der intrazellulären Ca2+ Konzentration im postsynaptischen Neuron des IC. Diese modulatorische Wirkung von Acetylcholin könnten damit eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und Stabilisierung von inhibitorischen Synapsen im sich entwickelnden IC der Ratte spielen.
Die Hitzestressantwort stellt einen universellen Schutzmechanismus aller lebenden Organismen dar. Infolge einer Temperaturerhöhung werden Hitzestresstranskriptionsfaktoren (Hsf) aktiviert und bewirken eine gesteigerte Expression von Hitzestressproteinen (Hsp). Als molekulare Chaperone schützen diese die Zelle vor durch Hitze verursachten Schäden. In höheren Pflanzen ist dieses Phänomen sowohl auf der Ebene der Hsf als auch der Hsp besonders komplex. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der Funktion von Komponenten des Chaperonsystems in der pflanzlichen Thermotoleranz. Zur Untersuchung der Thermotoleranz wurde ein transientes Expressionsystem mit Mesophyllprotoplasten aus steril angezogenen Tomatenpflanzen (Lycopersicon esculentum) zweier Linien (WT und CS) verwendet. CS-Pflanzen zeigen Cosuppression von HsfA1 und zeichnen sich durch eine Integration zweier direkt aufeinander folgender Transgenkassetten in invertierter Orientierung aus. Die fehlende Expression von HsfA1 in CS-Pflanzen ist die Folge eines Prozesses, der als RNA-interference (RNAi) bezeichnet wird. In unserem transienten Expressionssystem wurden Mesophyllprotoplasten mit einem Expressionsplasmid transformiert, das für Luciferase aus Photinus pyralis als thermosensitivem, leicht nachweisbarem Reporterprotein kodiert. Mit Hilfe dieses Testsystems konnten wir den Schutz der Luciferase gegen eine thermische Denaturierung bei 41°C (30 min) und die nachfolgende Renaturierung für 120 min bei 25°C in Abhängigkeit von endogenen und transient exprimierten Hsp und Hsf beobachten. Mit Hilfe der RNAi-Technologie und unter Verwendung von genspezifischen inverted repeat-Konstrukten konnten wir weiterhin die Bildung einzelner Komponenten des endogenen Chaperonsystems verhindern und damit ihre Funktion untersuchen. Es zeigte sich, dass in Protoplasten aus CS-Pflanzen praktisch alle hitzestressinduzierten Proteine fehlten und diese nicht in der Lage waren, Thermotoleranz auszuprägen, wie unter Verwendung des Reporterproteins Luciferase nachgewiesen werden konnte. Weiterhin fand keine Bildung cytoplasmatischer Multichaperonkomplexe, der sogenannten Hitzestressgranula (HSG), statt. Dieser Defekt in der Ausprägung von Thermotoleranz konnte durch Expression von HsfA2, HsfA3 und HsfA4b repariert werden. Die Überexpression dieser Hsf führte gleichermaßen zu (1) einer Expression von Chaperonen, (2) Thermoprotektion des Reporterenzyms Photinus pyralis-Luciferase und (3) Bildung von HSG-Komplexen. In weiteren Analysen lag unser Augenmerk insbesondere auf Vertretern der sHsp, sowie der Hsp70- und Hsp101-Chaperonfamilien. Hierbei erwies sich, dass vor allem Klasse CI-sHsp und Vertreter der Hsp70-Famile beim Schutz der Luciferase gegen Denaturierung während eines Hitzstresses eine Rolle spielen, während hauptsächlich Hsp101 und Vertreter der Hsp70-Familie in der darauf folgenden Erholungsphase von Bedeutung sind. Die Untersuchung der Interaktionen von drei Klassen cytoplasmatischer sHsp und ihrer intrazellulären Verteilung im Rahmen meiner Arbeit zeigte, dass jeder dieser Klassen eine unterschiedliche Funktion im Netzwerk cytoplasmatischer sHsp zukommt. Unter Verwendung nativer Gelelektrophorese und indirekter Immunfluoreszenz konnte nachgewiesen werden, dass sHsp der Klassen CI, CII und CIII in der Lage sind, auf der Ebene oligomerer Komplexe zu interagieren und ihre intrazelluläre Lokalisation wechselseitig zu beeinflussen. Proteine der Klasse CII zeigten eine starke Tendenz zur Bildung von Aggregaten, in die Klasse CIII-sHsp rekrutiert wurden. Im Unterschied dazu verfügten Klasse CI-Proteine über die Fähigkeit, diese Aggregate aufzulösen. Die detaillierte Untersuchung von fünf Isoformen der Klasse CI und zwei Isoformen der Klasse CII aus Lycopersicon esculentum ergab, dass diese oligomere Komplexe einer unterschiedlichen Anzahl von Untereinheiten bilden. Nach Coexpression waren Proteine beider Klassen in heterooligomeren Komplexe zu finden. Allerdings deuteten sich bei der Analyse der Fähigkeit einzelner Isoformen der Klasse CI, Heterooligomere mit Klasse CII-Proteinen zu bilden, Unterschiede an. sHsp kommt weiterhin eine Funktion in der Kontrolle der Aktivität von HsfA2 zu. Im Rahmen dieser Arbeit konnte ich zeigen, dass sHsps der Klassen CI und CII völlig unterschiedliche Rollen in der Regulation der intrazellulären Verteilung von HsfA2 spielen. Nach Überexpression in Mesophyllprotoplasten bildete LpHsp17.4-CII, nicht aber das nahe verwandte LpHsp17.3-CII mit HsfA2 große, cytoplasmatische Aggregate. Hsp17-CI dagegen verhinderte die Coaggregation von Hsp17.4-CII mit HsfA2.
Holzkohlen aus archäologischen Grabungen im Sahel von Burkina Faso belegen die regionale Geschichte der Gehölzvegetation über die letzten 2000 Jahre. Der Bodenbau, den die sesshaft lebende Bevölkerung seit Beginn unserer Zeitrechnung intensiv betreibt, veränderte die Zusammensetzung der Gehölzvegetation vor allem auf den Dünen der Region. Im Vergleich mit der heutigen Vegetation lassen sich zudem klimatische Veränderungen nachweisen. Untersucht wurden über 9000 Fragmente aus sieben verschiedenen archäologischen Grabungen. Sechs Inventare stammen aus Siedlungshügeln. Bei einem Fundplatz handelt es sich um einen Hausgrundriss. Insgesamt wurden 37 Holzkohletypen erkannt und dokumentiert. Die untersuchten Inventare der Siedlungshügel zeigen, dass vor allem die Gehölzvegetation der Dünen und der Galeriewälder zur Brennholzentnahme genutzt wurde. Je nach Lage der Siedlung und dem Schwerpunkt der Wirtschaftsweise können verschiedene Taxa mit höheren Anteilen vertreten sein, möglicherweise zusätzlich verstärkt durch die anthropogene Auswahl von verfügbarem Brennholz. Im Vergleich der Holzkohleinventare lassen sich für die Eisenzeit regionale Entwicklungen erkennen. Die natürlichen Gehölzbestände auf den Dünen, unter anderem aus verschiedenen Akazienarten, wurden, zumindest in der Umgebung der Siedlungen, verdrängt. Stattdessen nahmen aufgrund der selektiven Förderung durch den Menschen die Anteile der Gehölze der Kulturbaumparks, Vitellaria paradoxa und Faidherbia albida zu. Die Landwechselwirtschaft förderte zudem Brachearten insbesondere aus der Familie der Combretaceae. In der späten Eisenzeit nahm Guiera senegalensis zu, die von starker Beweidung der Brachen profitiert. Der Unterwuchs der Galeriewälder an den mares und Wasserläufen wurde mit zunehmender Besiedlungsdauer in der Umgebung der einzelnen Fundplätze aufgelichtet, die Anteile von Combretum micranthum gehen in den Inventaren der einzelnen Siedlungsplätzen jeweils zurück. Klima und Vegetation waren während der Eisenzeit sudano-sahelisch. Auf feuchteres Klima verweisen Vitellaria paradoxa und Detarium microcarpum, die deutlich höhere Niederschläge benötigen, als sie die Region heute erhält. Der hohe Anteil von Taxa, die heute weiter südlich verbreitet sind, belegt zudem den sudanischen Aspekt der Gehölzvegetation. Der Vergleich der anthrakologischen mit den palynologischen und karpologischen Ergebnissen zeigt, dass die Gehölzvegetation sich unter zunehmend arideren Bedingungen in den letzen 2000 Jahren anthropozoogen stark verändert hat. Das Klima scheint aber während der Eisenzeit von 0-1500 AD vergleichsweise stabil gewesen zu sein. Erst danach haben die Niederschläge sich soweit verringert, dass in den letzten 500 Jahren einige sudanische Taxa aus der Region verschwanden, die noch während der Eisenzeit zur regionalen Flora gehört hatten, zum Beispiel Vitellaria paradoxa, Detarium microcarpum und Lannea sp. Der Vergleich der eisenzeitlichen Holzkohleflora mit der rezenten Dynamik der Vegetation und mit der Verbreitung einiger Arten um die Mitte des 20. Jahrhunderts zeigt, dass einige Taxa, wie Terminalia sp. möglicherweise erst in den letzten fünfzig Jahren aus der Region verschwunden sind.
Die Medusen der metagenetischen Cnidarier (Nesseltiere) werden je nach Kultur- und Sprachraum z. B. mit einer weiblichen Gestalt mit schlangenartigen Haaren (Medusa), mit stark brennenden Quaddeln auf der Haut oder mit Stränden verklebenden Gallertmassen in Verbindung gebracht. Diese Assoziationen fußen hauptsächlich auf Merkmalen der Scheibenquallen (Scyphozoa), deren bisexuelle Medusen in Größe, Tentakellängen, Nematocytenbesatz und Mesogloeagehalt gegenüber der relativ unauffälligen ungeschlechtlichen Polypengeneration beeindrucken. Häufig ist die Medusengeneration der Scheibenquallen namensgebend. Die Medusen der Ohrenqualle Aurelia aurita (Fahnenquallen, Semaeostomeae) sind an den durchscheinenden, ohrenförmig um den Gastralraum angeordneten Gonaden erkennbar. In gemäßigten Klimazonen ist die bisexuelle Vermehrung - und das anschließende oft massenhafte Absterben in Küstennähe - auf den Sommer beschränkt (Lucas 1996), so daß die Medusen der Ohrenqualle häufige spätsommerliche Gäste an Stränden z. B. der Nord- und Ostsee (mit für den Menschen harmloser Nesselwirkung) sind. Vertreter der von Linné (1758) und Lamarck (1816) typologisierten Aurelia aurita sind weltweit verbreitet und bezüglich der Morphologie, Physiologie, Ethologie und Ökologie gut untersucht (z. B. Fautin & Lowenstein 1992; Costello & Colin 1994; Hammer et al. 1994; Lucas 1994). Unter ökologischen Gesichtspunkten ist das breite Spektrum der Ohrenqualle bezüglich abiotischer Umweltfaktoren hervorzuheben. Die häufig massenhaften Medusenaggregationen und der daraus resultierende Predationsdruck gegenüber dem Mikrozooplankton (Copepoden, Invertebratenund Fischlarven) weist der Ohrenqualle eine wichtige - und gelegentlich dominierende - Stellung in marinen Plankton-Lebensgemeinschaften zu (Janas & Witek 1993; Schneider & Behrends 1994; Sullivan et al. 1994; Tsikhon-Lukanina et al. 1996). Die breite Anpassungsfähigkeit und hohe Vermehrungsrate wird anekdotenhaft durch eine kürzlich erfolgte Meldung bekräftigt, nach der offensichtlich Aurelia-Schwärme die Kühlwasserleitungen eines Kraftwerks in Australien verstopften und lahmlegten (Cnidaria-List-Server). Das ubiquitäre Vorkommen läßt sich auf eine große ökologische Toleranz gegenüber Klima und Salzgehalt zurückführen, so daß die Ohrenqualle als Bewohner aller Meere von 40° südlicher bis 70° nördlicher Breite und Habitaten mit Salinitäten von 6-41‰ gilt (Kramp 1961). Dabei werden geographische Populationen, Unterarten und Arten der Gattung Aurelia anhand morphologischer Medusenmerkmale sowie auf Basis von Allozymunterschieden in unterschiedlicher Konsequenz teilweise in eine Art, Aurelia aurita zusammengefaßt, oder in mehrere distinkte Spezies voneinander abgegrenzt (Mayer 1910; Kramp 1961; Russell 1970; Kozloff 1987; Greenberg et al. 1996). Der nicht konsistente taxonomische Status der Ohrenqualle beruht entweder auf phylogenetisch uninformativen diagnostischen Merkmalen oder spiegelt Differenzierungen wider, die mit Artbildungsprozessen erklärt werden können. In der vorliegenden Arbeit sollen die phylogenetischen Beziehungen zwischen Aurelia-Populationen auf einer weltweiten geographischen Skala unter organismischen und molekularen Aspekten untersucht werden. Die möglichen Speziationsprozesse orientieren sich an den von Avise (2000) klassifizierten beiden Kategorien, nach denen die gängigen Spezieskonzepte auf Basis phylogenetischer und biologischer Kriterien, oder analog von Ridley (1996) nach evolutionären und zeitlich unabhängigen Kriterien eingeteilt werden. Die DNA-Sequenzinformationen eines mitochondrialen Gens (16S rDNA) sowie eines auf dem Kerngenom liegenden ribosomalen Locus (ITS-1/5.8S rDNA) sollen verwendet werden, um die genealogischen Beziehungen verschiedener Aurelia- Populationen sowohl phylogeographisch (Avise 1994) als auch bezüglich der phylogenetischen Artkonzepte zu untersuchen (Eldredge & Cracraft 1980; Wiley 1981; Cracraft 1989; Übersicht in Hull 1997). Mittels morphologischer Merkmale, Lebenszyklusdaten und den molekulargenetischen Daten soll gleichzeitig geprüft werden, ob sich die von Avise (2000) genannte Kategorie der biologisch definierten Spezieskonzepte in phänetisch (Sneath & Sokal 1973; Whittemore 1993), ökologisch (van Valen 1976; Schluter 1996) oder reproduktiv (Mayr 1963) getrennte Einheiten bei der Ohrenqualle widerspiegeln. Der Beitrag verschiedener Diversifizierungsfaktoren wie geographische Verbreitung, Selektion und genetische Drift wird in diesem Zusammenhang unter besonderer Berücksichtigung ökologischer Aspekte in Kapitel 2 dargestellt. Nicht zuletzt auch aufgrund ihrer besonderen ökologischen Plastizität empfiehlt sich die Ohrenqualle zur Nutzung als Biomonitor zur Untersuchung von Umweltbeeinträchtigungen auf Individuumebene. Eine in diesem Zusammenhang nützliche Besonderheit im Lebenszyklus von Aurelia betrifft den Übergang von der sich ungeschlechtlich vermehrenden Polypengeneration in die bisexuelle Medusengeneration, bei dem an der Oralseite des Polypen Medusenlarven (Ephyren) in Form einer polydisken Strobilation abgeschieden werden. Die Strobilation wird extrinsisch durch natürliche Faktoren ausgelöst und kann bei den Polypen der Ohrenqualle künstlich durch Temperaturabsenkung oder Erhöhung der Iod-Ionenkonzentration induziert werden (Spangenberg 1967). Dieses experimentell beeinflußbare Lebenszyklusstadium wurde im Rahmen von ökotoxikologischen Studien verwendet, um den Einfluß von Chemikalien auf die verzögerte Strobilation nach künstlicher Auslösung oder die Störung des Strobilationsverlaufs zu testen (Spangenberg 1984; Thiel & Jarms 1986). Black & Bloom (1984) untersuchten die Beziehung zwischen der Strobilationsinduktion und der Produktion von Hitzeschockproteinen (HSP) nach Temperaturerhöhung und konnten die Induzierbarkeit von Hitzeschockproteinen als Reaktion auf Temperaturstreß immunologisch nachweisen. Diese Studien zeigen, daß die Ohrenqualle ein hohes Reaktionspotential gegenüber variablen Umweltbedingungen besitzt. Die Charakterisierung dieses Reaktionspotentials soll in der vorliegenden Arbeit mittels der Analyse organismischer Reaktionen gegenüber anthropogen verursachten Streßfaktoren durchgeführt werden. Im Rahmen von experimentellen Schadstoff- expositionen sollen an Aurelia-Polypen genetische Reaktionen auf der Ebene der mRNATranskription untersucht werden. Der Schwerpunkt liegt auf der Etablierung von Biomarkern (van Gestel & van Brummelen 1996) mittels molekulargenetischer Methoden, wobei die Durchführbarkeit und Effektivität verschiedener Methodenansätze verglichen werden sollen. Die identifizierten Biomarker sollen im Hinblick auf die Analyse der Dosis-Wirkungsbeziehungen zwischen Schadstoffkonzentrationen und dem Ausmaß der genetischen Reaktion mittels quantitativer PCR-Verfahren näher charakterisiert werden. Ein anschließender Test der im Labor charakterisierten Biomarker auf die Anwendbarkeit im Freiland soll entsprechende Hinweise für die Sensitivität und Durchführbarkeit des in Kapitel 3 ausgeführten Biomarker-Assays liefern. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Verknüpfung verschiedener biologischer Organisationsebenen im Kontext ökologischer und ökotoxikologischer Forschung (Clements 2000). Erkenntnisse zum Wirken von Umwelteinflüssen auf molekularer Ebene bieten sich als Basis einer Bewertung individueller Reaktionen für Veränderungen auf Populationsebene an. Dieser Zusammenhang wird in Kapitel 4 anhand der Relevanz von Biomarkern für Aussagen auf Populationsund Speziesebene besprochen.
Durch Längenmessungen an Exuvien wurden die Größenverhältnisse von Beinlängen, Drehachsenlängen der Beingelenke und der Fläche des Carapax bei C. salei ermittelt. Für die hydraulisch gestreckten Femoro- Patellar- und Tibio-Metatarsalgelenke wurden die Volumen-Winkel-Kennlinien bestimmt. Das Sprungverhalten wurde durch Hochgeschwindigkeits-Videoaufnahmen (Bildfrequenz 500 Hz) mit drei Kameras dokumentiert. Aus den volumetrischen, kinematischen und morphometrischen Daten wurden die Volumenverschiebungen berechnet, die bei Sprungbewegungen auftreten. Aus der prosomalen Volumenverschiebung konnte der korrespondierende Carapaxhub berechnet werden. Mit einer Miniatur- Kraftmeßplattform und einem mit Schrittmotoren getriebenen "x-y-z-Tisch" wurden Steifigkeiten des Prosomas von Perania nasuta Schwendinger, 1989 und ausgewählten anderen Taxa bestimmt. Bei Cupiennius salei gibt es zwei unterschiedliche Sprungtypen: Unvorbereitete Sprünge als Reaktion auf sehr plötzliche Störungen zeichnen sich durch eine große Vielfalt der Bewegungsmuster aus. Vorbereitete Sprünge zeigen charakteristische Beinstellungen und Kontaktphasenmuster: Zunächst erfolgt eine etwa 20 ms dauernde Ausholbewegung, anschließend beginnt die 22 - 42 ms dauernde Beschleunigungsphase. Die Körperlängsachse vollzieht während der Beschleunigungsphase eine Vorwärtsrotation um etwa 50°, die nach dem Verlust des Bodenkontaktes der Beine gestoppt und umgekehrt wird. Dies erfolgt wohl durch ein kontrolliertes Bremsen des Ausstoßes des Sicherheitsfadens. Bei vorbereiteten Sprüngen konnten Sprungweiten bis zu 0.43 m beobachtet werden, die maximalen vertikalen Geschwindigkeiten betrugen 0.07 - 0.82 ms-1, maximale horizontale Geschwindigkeiten lagen bei 0.65 - 1.25 ms-1. Bei vorbereiteten Sprüngen wurden vertikale Beschleunigungen von 0.74 – 33.70 ms-2 und horizontale Beschleunigungen von 20.5 – 68.4 ms-2 erreicht. Die Kontaktphasen der Beine enden in einer charakteristischen Reihenfolge: Die Vorderbeine haben meist keinen Bodenkontakt, die dritten Beine heben nach durchschnittlich 37 % und die vierten Beine nach durchschnittlich 69 % der Dauer der Beschleunigungsphase ab. Zuletzt verlieren die zweiten Beine den Bodenkontakt. Zu Beginn der Beschleunigungsphasen richten sich innerhalb von durchschnittlich 4.6 ms Stacheln auf der Oberfläche der Beine auf. Die Stachelaufrichtung erfolgt bei Drucken von etwa 35 bis etwa 65 kPa. Dies zeigt einen Druckanstieg in den Beinen auf Werte von ³ 65 kPa während der Beschleunigungsphase an. Der Hauptanteil der Volumenverschiebungen in den Beinen wird durch Bewegungen der Femoro-Patellargelenke verursacht. Die Bewegungen der Tibio-Metatarsalgelenke bewirken nur geringe Volumenverschiebungen. Aufgrund der anatomischen Struktur der Trochantero- Femoralgelenke sind die bei Bewegung dieser Gelenke verschobenen Volumina vernachlässigbar klein. Die Abschätzung der zur Beinstreckung bei Sprüngen erforderlichen Carapaxverschiebungen ergab sehr geringe Werte, es sind nur Verschiebungen um wenige 1/100 bis 1/10 mm erforderlich. Für die vollständige Streckung aller Beine muß der Carapax nur um 10% der aufgrund der anatomischen Gegebenheiten maximal möglichen Strecke verschoben werden. Bei den Untersuchungen an Perania nasuta wurden prosomale Steifigkeiten von mehr als 3500 Nm-1 für Weibchen und mehr als 6500 Nm-1 für Männchen ermittelt. Das Prosoma von Perania nasuta ist sehr viel rigider als bei anderen Spinnen (Pholcus: 131 Nm-1, Zelotes: 79 Nm-1, Pardosa: 72 Nm-1, Dysdera: 1900 Nm-1). Die Carapaxverschiebung, die den zur vollständigen Beinstreckung erforderlichen Volumentransport bewirkte, würde bei Perania eine Verformungsarbeit von bis zu 27.56 myJ erfordern, bei den anderen Spinnen nur maximal 1.67 myJ (Dysdera). Das Sprungverhalten von Cupiennius salei läßt sich keinem der bislang beschriebenen Sprungtypen zuordnen. Hinsichtlich der Sprungweite und Geschwindigkeiten sind die Sprungleistungen von Cupiennius mit denjenigen von Salticiden vergleichbar. Die geringen Carapaxverschiebungen beim Sprung lassen sich im Sinne einer Optimierung der Arbeit extrinsischer coxaler Muskeln interpretieren. Eine Minimierung von Carapaxverschiebungen sollte die Koordinierbarkeit der Bewegungen der Coxae erhöhen, weil ein stärker formkonstanter Bezugsrahmen gegeben ist. Dementsprechend lassen sich Bein- und Carapaxdimensionen bei verschiedenen Spinnentaxa im Hinblick auf die jeweiligen Lokomotionsstrategien interpretieren. Die Untersuchungen an Perania nasuta bestätigen die von Kropf (in Vorb.) aufgestellte Hypothese einer starken Versteifung des Prosoma. Die Druckpumpe scheint hier im Opisthosoma lokalisiert zu sein. Hinsichtlich der möglichen Vorteile einer solchen Entwicklung lassen sich einerseits die besseren Bedingungen der Arbeit extrinsischer coxaler Muskeln im vollständig steifen "Gestell" des Prosoma nennen, andererseits könnte aufgrund entsprechender Lokomotionsmodi bei Perania keine Notwendigkeit zur schnellen Verschiebung großer Haemolymphvolumina aus dem Prosoma bestehen, so daß eine leistungsfähige prosomale Druckpumpe wegfallen konnte.