Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
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In den letzten Jahren findet die Wirkung von Polyphenolen auf den Alterungsprozess oder zur Behandlung von Krankheiten immer mehr Beachtung. Das Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung der Wirkmechanismen der Polyphenole Gossypol, Curcumin und Quercetin, um Hinweise für neue oder verbesserte Therapieansätze zu erhalten. Die dazu durchgeführten Untersuchungen lieferten folgende Ergebnisse:
1. Der Ascomycet "P. anserina" eignet sich als Modellorganismus zur Untersuchung der Wirkmechanismen verschiedener Polyphenole, da die bereits aus der Literatur bekannten Effekte auf das Überleben höherer Organismen auch in "P. anserina" beobachtet wurden.
2. Die Mitochondrienfunktion spielt auf unterschiedliche Art eine Rolle in der Kompensation von Dysfunktionen oder Stressbedingungen in der Zelle und wirkt somit positiv auf die Regulation der Lebensspanne von "P. anserina". In der "PaSod3"-Deletionsmutante wurde eine Verschiebung der mitochondrialen Atmung von einer Komplex I-abhängigen hin zu einer vermehrt Komplex II-abhängigen Atmung festgestellt. Die damit verbundene Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials dient neben der bereits bekannten hohen Superoxid-Menge als Signal zur Mitophagie-Induktion. Auch die Anpassung der Mitochondrienfunktion durch die erhöhte Bildung von mtRSCs, wie im Falle von Gossypol oder Quercetin, kann zur Kompensation von Dysfunktionen beitragen bzw. sie abschwächen.
3. Es gibt keinen grundlegenden gemeinsamen Wirkmechanimus der drei untersuchten Polyphenole. Zwar spielt Wasserstoffperoxid bei verschiedenen Stoffen eine Rolle, aber nicht bei allen. Zusätzlich wurde gezeigt, dass Wasserstoffperoxid abhängig von der vorherrschenden Konzentration wirkt und daher auch keine Allgemeingültigkeit des Effektes vorherzusagen ist. In niedrigen Konzentrationen sorgt Wasserstoffperoxid z. B. für eine Induktion der Autophagie und damit einhergehende eine Lebensverlängerung. Im Gegensatz dazu wirken hohe Wasserstoffperoxid-Konzentrationen lebensverkürzend und lösen verschiedene Formen von Zelltod aus.
4. Die Curcumin-vermittelte Langlebigkeit wurde das erste Mal in Verbindung mit einer funktionellen Autophagie gebracht. Im Detail führt die Behandlung mit Curcumin durch eine PaSOD1-abhängige leichte Erhöhung der Wasserstoffperoxid-Menge zu einer Induktion von nicht-selektiver Autophagie. Die induzierte Autophagie ist Ursache der Lebensverlängerung durch Curcumin.
5. Gossypol wirkt in Abhängigkeit der mitochondrialen Permeabilitäts-Transitionspore bzw. von ihrem Regulator Cyclophilin D. Hierbei verstärkt die deutlich erhöhte Wasserstoffperoxid-Menge wahrscheinlich die Induktion von programmiertem Zelltod. Gleichzeitig wird eine cytoprotektive Form von Autophagie und ein scheinbar ATG-unabhängiger Abbau von Mitochondrien induziert.
6. Quercetin wirkt in "P. anserina" abhängig vom Methylierungs-Status. Untersuchungen mit Mutanten der "O"-Methyltransferase PaMTH1 ergaben die Notwendigkeit der Anwesenheit von PaMTH1 für den lebensverlängernden Effekt von Quercetin. Analysen mit dem methylierten Derivat Isorhamnetin verdeutlichten diese Abhängigkeit und zeigten zudem, dass Quercetin sowohl in der methylierten als auch unmethylierten Form Effekte hervorruft. Jedoch sind nur die Effekte des unmethylierten Quercetin unabhängig von der Lebensverlängerung und eher schädlich für die Zelle.
Die forensische Entomologie nutzt nekrophage Insekten, hauptsächlich Dipteren und ihre juvenilen Stadien, zur Schätzung der minimalen Leichenliegezeit. Dem liegt zugrunde, dass nekrophage Dipteren binnen Minuten nach dem Todeseintritt potentiell in der Lage sind, einen Leichnam zu detektieren und zu besiedeln. Das anschließende Wachstum und die Entwicklung der juvenilen Stadien erfolgt als Funktion von der Art und der Umgebungstemperatur.
Mit Hilfe von Laborstudien konnten bislang für einige forensisch relevante Fliegenarten Entwicklungsdaten erhoben werden, die eine Altersbestimmung der sich an einem Leichnam entwickelnden Larven und Puppen erlauben und so eine Schätzung der minimalen Leichenliegezeit ermöglichen. Als Nährsubstrat für Laborstudien werden tierische Gewebe verwendet. Eine Übertragbarkeit der Daten auf humanes Gewebe wurde aber bislang nicht verifiziert. In der vorliegenden Arbeit wurde das larvale Wachstum und die juvenile Entwicklungsgeschwindigkeit der forensisch relevanten Schmeißfliege Calliphora vicina (Diptera: Calliphoridae) auf humanem Muskelgewebe untersucht und mit dem Wachstum auf Schweineleber, magerem Schweinemuskelfleisch und Schweinehackfleisch verglichen. Die auf humanem Gewebe heranwachsenden Individuen waren mit bis zu 3,5 mm signifikant länger als die Individuen, die sich auf Leber und dem mageren Schweinemuskelfleisch entwickelten. Bei der Verwendung von Hackfleisch vom Schwein zeigte sich kein Unterschied. Darauf basierend wird die Empfehlung ausgesprochen, für zukünftige Entwicklungsstudien Schweinehackfleisch als Ersatz für humanes Gewebe zu verwenden.
Zahlreiche Anleitungen zur Asservierung forensisch-entomologischer Spuren empfehlen das Sammeln getrennt nach Körperregionen eines Leichnams. Dies soll eine mögliche gewebespezifische Entwicklungsrate berücksichtigen. Das für die vorliegende Arbeit durchgeführte systematische Absammeln von Fliegenlarven von 51 Leichnamen getrennt nach Körperregionen zeigte keine artspezifischen Präferenzen für bestimmte Gewebe oder Körperregionen. Das Artenspektrum entsprach größtenteils dem aufgrund von Studien an Schweinekadavern zu erwartendem Artenspektrum für Deutschland und Mitteleuropa. Insgesamt konnten 15 Schmeißfliegenarten nachgewiesen werden, von denen in der Regel mehrere gleichzeitig an einem Leichnam zu finden waren. Dies zeigt, dass ein Faktor wie interspezifische Konkurrenz in Zukunft mehr Beachtung in der Forschung erhalten sollte.
Bislang wurde in der forensischen Entomologie die minimale Leichenliegezeit durch die Untersuchung juveniler Stadien von Fliegen eingegrenzt. Eine eventuell mögliche Ausweitung dieses Zeitfensters könnte durch eine Altersbestimmung der adulten Fliegen oder der leeren Puparien gelingen. Der Nachweis, dass die dafür untersuchten Fliegen bzw. Puparien tatsächlich von dem fraglichen Leichnam stammen, war bislang nicht möglich. Die forensische relevante Schmeißfliege Lucilia sericata wurde in der vorliegenden Arbeit auf humanem Gewebe und Gewebe von elf weiteren Tierarten großgezogen. Durch die Analyse stabiler Kohlen- und Stickstoffisotope konnte ein von diesen elf Tierarten abgrenzbares humanes Isotopenprofil sowohl für die adulten Fliegen von L. sericata, als auch für ihre leeren Puparien detektiert werden. Dieses Profil spiegelte die Nahrungszusammensetzung der Wirte wider.
Die vorliegende Arbeit erhebt Daten zur Entwicklung einer forensisch relevanten Schmeißfliegenart auf humanem Gewebe, belegt das bislang lediglich am tierischen Modell erhobene Schmeißfliegeninventar als für menschliche Leichen relevant und hinterfragt die gewebespezifische Asservierungsempfehlung als ein akademisches Artefakt. Auf dieser Basis konnten Empfehlungen für die Weiterzucht fallrelevanter entomologischer Spuren ausgesprochen werden, die gerichtsverwertbar sind und die Verwendung von tierischem Gewebe oder Tierkadaver in der forensisch-entomologischen Forschung legitimieren. Die Analyse stabiler Isotope legt darüber hinaus einen neuen, innovativen Grundstein für die routinemäßige Spurenzuordnung älterer Entwicklungsstadien und ist damit Vorreiter auf dem Gebiet der forensischen Entomologie.
Modellierung der klimatischen Habitateignung verschiedener krankheitsübertragender Vektorarten
(2018)
Der Klimawandel hat einen starken Einfluss auf die Verbreitungsgebiete von Arten. Infolgedessen kann sich das Verbreitungsgebiet von Arten verschieben, einschränken oder ausweiten. Bei thermophilen Arten wird vermutet, dass sie von den klimatischen Änderungen profitieren und sie sich wahrscheinlich ausbreiten werden. Eine solche Ausbreitung, wozu auch die Einwanderung von gebietsfremden Arten zählt, hätte nicht nur zahlreiche Konsequenzen für diese Ökosysteme, sondern könnte sich auch zu einem ernsten Gesundheitsrisiko entwickeln, wenn es sich bei den einwandernden Neobiota um Vektorarten handelt.
Stechmücken und Sandmücken, als blutsaugende Insekten, zählen zu den bekanntesten Vektorarten. Sie sind in der Lage, eine Vielzahl von Infektionskrankheiten wie das Denguefieber oder das Gelbfieber, aber auch protozoische Parasiten wie "Leishmania"-Arten zu übertragen. Als thermophile Arten sind viele dieser Vektoren aktuell in ihrer Verbreitung weitgehend auf tropische und subtropische Gebiete beschränkt. Eine Einwanderung in gemäßigtere Gebiete kann zu einer Einschleppung der durch sie übertragenden Erreger führen und damit zum Ausbruch von Infektionskrankheiten. Aufgrund der medizinischen Relevanz dieser Arten ist es essentiell, die räumliche Verbreitung, sowie die abiotischen Ansprüche der Vektorarten zu kennen, um deren mögliche Ausbreitung nachzuvollziehen.
Vor diesem Hintergrund beschäftigte sich die vorliegende kumulative Dissertation mit den klimawandelinduzierten Änderungen der Habitateignung verschiedener medizinisch relevanter Vektorarten. Dabei wurden die zwei invasiven Stechmückenarten "Aedes albopictus" (I-III) und "Aedes japonicus" (III), sowie zehn in Europa bereits vorkommende Sandmückenarten der Gattung "Phlebotomus" (IV), untersucht. Die Arbeit basiert auf vier (ISI-) Publikationen. Unter Verwendung ökologischer Nischenmodellierung wurden geeignete Gebiete unter aktuellen und zukünftigen Klimabedingungen bestimmt. Um dabei sowohl räumliche als auch zeitliche Aspekte zu berücksichtigen, wurden mehrere räumliche Skalen (Deutschland und Europa), sowie Zeitperioden (2030, 2050 und 2070) betrachtet. Des Weiteren wurden verschiedene Ansätze (einzelne Algorithmen und Ensemble-Modelle) zur Modellierung der Habitateignung verwendet.
Die Ergebnisse dieser Dissertation zeigen eine zukünftige klimawandelbedingte Ausweitung der geeigneten Gebiete für viele der betrachteten Vektorarten. So konnte gezeigt werden, dass die Habitateignung für "Aedes albopictus" in Deutschland (I) und in Europa (III) zukünftig deutlich zunimmt. Auch für die Sandmückenarten "Phlebotomus alexandri", "Phlebotomus neglectus", "Phlebotomus papatasi", "Phlebotomus perfiliewi" und "Phlebotomus tobbi" konnte eine deutliche Zunahme der klimatisch geeigneten Gebieten projiziert werden (IV).
Lediglich Arten, wie die Asiatische Buschmücke "Aedes japonicus" (III) und auch kältetolerantere Sandmücken, wie "Phlebotomus ariasi" und "Phlebotomus mascittii" (IV) scheinen weniger von diesen klimatischen Veränderungen zu profitieren und könnten in Zukunft sogar aktuell geeignete Gebiete verlieren (klimawandelinduzierte Arealverkleinerung). Bei "Aedes japonicus" konnte dies auf eine engeren Nische mit einem Optimum bei vergleichsweise niedrigen Temperaturen zurückgeführt werden (III).
Am Beispiel von "Aedes albopictus" wurden ferner Umweltfaktoren identifiziert, die die Verbreitung der Art limitieren (II). Als wärmeliebende Art spielen bei "Aedes albopictus" in Mitteleuropa insbesondere die niedrigen Temperaturen eine Rolle, während in Zukunft die Sommertrockenheit in Südeuropa zunehmend eine Rolle spielen könnte.
Nischenmodellierung stellt trotz ihrer vereinfachenden Annahmen und Unsicherheiten, eine hilfreiche Methode zur Untersuchung klimawandelinduzierter Arealverschiebungen dar. Mit Hilfe der Modellierungsergebnisse konnten Gebiete mit einem hohen Etablierungsrisiko für die Vektorarten identifiziert werden, welche daher im Fokus künftiger Überwachungsprogramme stehen sollten. In Zukunft könnten mehr Vektorarten geeignete Bedingungen in Mitteleuropa finden, wodurch die Vektordiversität zunehmen wird. Dadurch könnte auch das Risiko für einen Ausbruch der durch die Vektoren übertragenen Krankheiten steigen.
Auch wenn das Vorhandensein eines kompetenten Vektors eine unerlässliche Voraussetzung für den Ausbruch einer Infektionskrankheit darstellt, gibt es noch weitere Faktoren, wie das Vorhandensein des Erregers. In Bezug auf die Risikoabschätzung vektorassoziierter Krankheiten sollten neben der Verbreitung des Vektors und des Erregers auch die abiotischen Bedingungen für die Entwicklung des Erregers berücksichtigt werden. Neben neu eingewanderten Arten sollten zudem auch die heimischen Arten in Bezug auf ihre Vektorkompetenz untersucht werden, da diese ebenfalls als potentielle Vektoren dienen und somit das Gesundheitsrisiko weiter erhöhen könnten.
Nukleinsäuren besitzen neben der Speicherung und Übertragung der genetischen Information weitere vielfältige Funktionen in einem komplexen und dynamischen Netzwerk von gleichzeitig ablaufenden Prozessen in der Zelle. Die gezielte Kontrolle bestimmter Nukleinsäuren kann helfen, die jeweiligen Prozesse zu studieren oder auch zu manipulieren. Photoaktive Verbindungen, wie photolabile Schutzgruppen oder Photoschalter, sind ideal dazu geeignet die Struktur und Funktion von Nukleinsäuren zu studieren. Photolabile Schutzgruppen werden dazu meistens auf die Nukleobase installiert und stören die Watson-Crick Basenpaarung. Dies verhindert die Ausbildung einer Sekundärstruktur oder die Möglichkeit einen stabilen Doppelstrang zu bilden. Licht ist ein nicht-invasives Trigger-signal und kann mit hoher Orts- und Zeitauflösung angewendet werden, um selektiv die temporär geschützten Nukleinsäuren in der Zelle zu aktivieren.
Das erste Projekt dieser Arbeit ist eine Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Erin Schuman (MPI für Hirnforschung) und beschäftigt sich mit der lichtgesteuerten Regulation der miR-181a Aktivität in hippocampalen Neuronen von Ratten. Die Langzeitpotenzierung (LTP) ist der primäre Mechanismus von synaptischer Plastizität und somit essentiell für Lernen und Gedächtnis. Die langfristige Aufrechterhaltung von LTP erfordert eine gesteigerte (lokale) Proteinbiosynthese, ein Prozess, der noch nicht vollständig aufgeklärt ist. Die miR-181a reguliert die Genexpression von zwei für synaptische Plastizität wichtigen Proteinen, GluA2 und CaMKIIα. Mit einem lichtaktivierbaren AntimiR sollte der Einfluss der miR-181a auf die lokale Proteinsynthese von CaMKIIα und GluA2 untersucht werden. Photolabile Schutzgruppen sollen eine ortsaufgelöste Aktivierung des AntimiRs in den Dendriten ermöglichen. Ein Tracking-Fluorophor sollte die Lokalisierung des AntimiRs und eine gezielte Lichtaktivierung ermöglichen. Die Bindung der miRNA sollte fluoreszent visualisiert werden können, um eine Korrelation zwischen der inhibierten Menge an miR-181a und den neu synthetisierten CaMKIIα-Molekülen zu untersuchen. In diesem Projekt wurden drei Konzepte zur Synthese von lichtregulierbaren AntimiR-Sonden verglichen: Das erste Konzept verwendete eine Thiazolorange-basierte Hybridisierungssonde nach Seitz et al. Allerdings war mit diesem Konzept der Fluoreszenzanstieg zur Visualisierung der Hybridisierung zu gering. Im zweiten Konzept wurde ein dual-Fluorophor markierter Molecular Beacon entwickelt, bei dem die photolabilen Schutzgruppen in der Schleifen-Region die Hybridisierung der miR-181a vor Belichtung verhinderten. Nach Optimierung der Stammlänge, Anzahl und Position der photolabilen Schutzgruppen, sowie Auswahl des idealen Fluorophor-Quencher Paars, konnte nach UV-Bestrahlung in Anwesenheit der miR-181a ein signifikanter Anstieg des Hybridisierungsreporter-Fluorophors gemessen werden. Das dritte Konzept untersuchte lichtaktivierbare Hairpin-Sonden, bei denen ein Gegenstrang (Blockierstrang) über einen photospaltbaren Linker mit dem AntimiR verknüpft wurde. Dabei musste die optimale Länge des Blockierstrangs und die Anzahl der photo-spaltbaren Linker im Blockierstrang ermittelt werden, sodass die miR-181a erst nach Photoaktivierung das AntimiR binden und den Quencher-markierten Strang verdrängen konnte. Die in vitro Experimente vom Arbeitskreis Schuman waren zu dem Zeitpunkt des Einreichens dieser Arbeit noch nicht abgeschlossen. Erste Ergebnisse zeigten, dass der mRNA und Protein-Level von CaMKIIα eines gesamten hippocampalen Neurons durch ein nicht-lichtaktivierbare AntimiR um den Faktor ~1,5 gesteigert werden konnte. Zudem konnte durch die lokale Bestrahlung einer lichtaktivierbaren Hairpin-Sonde die lokale Gen-expression von CaMKIIα in einem Dendriten deutlich gesteigert werden.
Das zweite Projekt dieser Arbeit beschäftigte sich mit der reversiblen Lichtregulation von DNA und RNA durch Azobenzol Photoschalter. Azobenzole eignen sich ideal für die Regulation der Duplexstabilität, denn das planare trans-Azobenzol kann zwischen die Basen interkalieren und somit einen Doppelstrang stabilisieren. UV-Licht überführt das trans-Isomer in das cis-Isomer. Dies ist gewinkelt, benötigt mehr Platz und stört dadurch die Stabilität eines Nukleinsäuredoppelstrangs. Entscheidend für die Effizienz der Regulation der Duplexstabilität ist der Linker, der das Azobenzol mit der Nukleinsäure verknüpft. Während vorangegange Studien von Asanuma et al. unnatürliche Linker (D-Threoninol, tAzo) verwendeten, wurde in dieser Studie das Azobenzol mit der C1‘-Position von (Desoxy-)Ribose C-Nukleoside verknüpft, um Azobenzol (pAzo und mAzo) zu erhalten. Der Riboselinker sollte die helikale Natur der Nukleinsäure optimal nachahmen und möglichst wenig Störung des Ribose-Phosphat-Rückgrats bewirken. Thermische Stabilitätsstudien zeigten, dass UV-Licht induzierte trans-zu-cis Isomerisierung den Schmelzpunkt eines RNA- und DNA-Duplexes um 5,9 und 4,6 °C erniedrigte. Dabei führte der Austausch eines Nukleotids gegen pAzo oder mAzo zu einer effektiveren Regulation der Duplexstabilität als der zusätzliche Einbau eines Azobenzol C-Nukleosids in die Sequenz. Ein Vergleich mit dem in der Literatur etablierten System, tAzo, zeigte, dass pAzo und mAzo teilweise einen stärkeren Duplexdestabilisierungseffekt nach UV-Bestrahlung bewirkten.
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Entwicklung von Immunisierungsstrategien zur Induktion hoher funktionaler Antikörperantworten
(2018)
Neuartige Viren und Erreger, die sich antigenetisch tiefgreifend von bekannten Varianten unterscheiden, können verheerende Epidemien auslösen, da weder gegen diese Erreger eine Immunität in der Bevölkerung besteht, noch prophylaktische oder therapeutische Maßnahmen verfügbar sind. Eine prophylaktisch vermittelte Immunität durch Impfung stellt die bei Weitem effektivste Methode zur Vorbeugung viraler Infektionen dar, jedoch sind die Entwicklungs- und Herstellungszeiten eines neuen Impfstoffs in der Regel mit der Ausbruchsdynamik nicht kompatibel. Inzwischen steht zwar eine überschaubare Anzahl antiviraler Medikamente zur Verfügung, doch ist die Wahrscheinlichkeit gering, dass diese meist hoch spezifischen Wirkstoffe gegen neu auftretende Viren aktiv sind. Das beispiellose Ausmaß der Ebola-Epidemie 2014 führte zum Einsatz experimenteller antikörperbasierter Therapien, welche das Potential der passiven Vermittlung von temporärem Immunschutz naiver Personen verdeutlicht. Für viele neuartige Viren ist die Entwicklung von Therapieansätzen allerdings noch nicht entsprechend weit fortgeschritten. Zudem bedingt eine Verwendung des eigentlichen Erregers oft hohe Sicherheitsmaßnahmen, was die Arbeit erschwert. Aus diesem Grund werden Notfalltherapien benötigt, die schnell in klinisch relevanter Qualität und Quantität unter niedrigen biologischen Sicherheitsmaßnahmen produziert werden können.
Diese Arbeit basiert auf der zentralen Hypothese, dass die Induktion von hohen Titern funktioneller Antikörperantworten die Basis für einen breiteren Schutz gegen antigenetisch entferntere Virusstämme sowie für die schnelle Produktion von therapeutischen Antiseren darstellt.
Um diese Hypothese zu testen und Einblicke in verschiedene Aspekte dieses Prozesses zu bekommen, wurde zunächst die Nutzung von Adjuvanzien als Zusätze für Impfstoffe am Beispiel des pandemischen A(H1N1)pdm09-Impfstoffs untersucht. Neben den alljährlichen Epidemien, die von saisonalen Influenza-A-Viren der Subtypen H1N1 oder H2N3 verursacht werden, können neuartige Subtypen zu weltweiten Pandemien führen. Während die saisonalen Influenza-Impfstoffe in der Regel keine Adjuvanzien enthalten, wurden einige pandemische H1N1-Impfstoffe aus 2009 mit einem reduzierten Antigengehalt formuliert und mit squalenbasierten Adjuvanzien kombiniert, um eine ausreichende Wirksamkeit bei größerer Verfügbarkeit zu gewährleisten. Zur Charakterisierung des Effekts dieser Adjuvanzien auf die Immunantworten wurden Frettchen mit 2 µg des kommerziellen H1N1pmd09-Impfstoffes alleine sowie in Kombination mit verschiedenen Adjuvanzien immunisiert, die Antikörpertiter gegen homologe und heterologe Influenzastämme untersucht und mit dem Schutz vor einer Infektion korreliert. Dabei zeigte sich, dass die Verwendung squalenbasierter Adjuvanzien die funktionalen Antikörperantworten um das 100-fache erhöhte und zu einer signifikant reduzierten Viruslast nach der Infektion mit dem homologen pandemischen Virus führte. Während in keiner Gruppe Antikörper gegen die heterologen Hämagglutinin-(HA-)Proteine H3, H5, H7 und H9 nachweisbar waren, induzierten mit squalenbasierten Adjuvanzien kombinierte Impfstoffe subtypenspezifische Antikörper gegen das N1 Neuraminidase-(NA-)Protein einschließlich H5N1. Darüber hinaus führte die Immunisierung mit squalenbasierten Adjuvanzien zu einer besseren Kontrolle der Influenzavirus-Replikation in den oberen Atemwegen.
Anschließend wurde im zweiten Teil dieser Arbeit unter Einbeziehung der gewonnenen Erkenntnisse eine Immunisierungsstrategie zur schnellen Produktion therapeutischer Hyper-immunseren entwickelt, wobei unterschiedliche Antigenexpressionssysteme miteinander verglichen wurden. Während in den frühen Stadien eines Ausbruchs Rekonvaleszenzseren nicht ohne weiteres verfügbar sind, können Antiseren tierischen Ursprungs innerhalb eines kurzen Zeitraums hergestellt werden. Die Herausforderung liegt in der schnellen Induktion einer schützenden Immunität, wobei die effiziente Produktion und Reinigung von Hyperimmunserum in klinisch relevanten Mengen ebenso essenziell ist wie die Anpassungsfähigkeit der Immunisierungsstrategie an neue oder hinsichtlich ihrer Antigenizität veränderte Viren. Hierzu wurden verschiedene Immunisierungsstrategien in Mäusen und Kaninchen verglichen, die unterschiedliche Expressionssysteme für das Modellantigen Ebolavirus-Glykoprotein (EBOV-GP) verwenden: (i) Ebolavirus-ähnliche Partikel (VLP), (ii) das rekombinante modifizierte Vacciniavirus Ankara (MVA) sowie (iii) das rekombinante Virus der vesikulären Stomatitis (VSV). Im Ergebnis induzierte eine dreimalige Immunisierung mit VLPs in Kombination mit squalenhaltigem Adjuvans neutralisierende Antikörpertiter, die vergleichbar mit der Immunisierung mit replikationskompetentem VSVΔG/EBOV-GP waren. Dies deutet darauf hin, dass nicht die De-novo-Antigenexpression, sondern vielmehr die mehrfache Präsentation des Antigens in nativer Konformation für die Produktion von neutralisierenden Antikörpern essenziell ist. Darüber hinaus waren die funktionalen Antikörpertiter aller Kaninchenseren in der In-vitro-Analyse gegen das Wildtypvirus 10- bis 100-fach höher als der Durchschnitt, der in mit VSVΔG/EBOV-GP geimpften Probanden beobachtet wurde. Die Etablierung eines optimierten mehrstufigen Reinigungsverfahrens unter Verwendung einer zweistufigen Ammoniumsulfat-Präzipitation, gefolgt von einer Protein-A-Affinitätschromatographie, führte zu aufgereinigten IgG-Präparationen mit nahezu unveränderter neutralisierender Aktivität, die über neun Tage im xenogenen In-vivo-Modell stabil waren. Die signifikante Erhöhung von totalen und funktionalen Antikörpertitern in Kombination mit einer größeren Breite der Antikörperantwort im Kontext von squalenbasierten Adjuvanzien stützt die Hypothese dieser Arbeit. Adjuvantierte Immunisierungsstrategien sind damit ein vielversprechender Ansatz nicht nur zur Wirksamkeitssteigerung von Subunit- und Proteinimpfstoffen, sondern auch zur schnellen Herstellung von therapeutischen Antiseren.
Um molekulare Mechanismen in biologischen Prozessen zu verstehen, ist es unerlässlich biologisch aktive Verbindungen zu kontrollieren. Dabei spielt besonders die Aktivierung bzw. Desaktivierung von Genabschnitten eine zentrale Rolle in der gegenwärtigen chemischen, biologischen und medizinischen Forschung. Nukleinsäuren sind dabei offenkundige Zielmoleküle, da sie die Genexpression auf unterster Ebene regulieren und auf vielfältige Art und Weise an biologischen Prozessen beteiligt sind. Um solch eine genaue Steuerung zu erreichen, werden Nukleinsäuren häufig photolabil modifiziert und unter die Kontrolle von Licht gebracht. Da hochentwickelte Technologien es erlauben Photonen bestimmter Energie unter präziser räumlicher und zeitlicher Auflösung zu dosieren, ist Licht als nicht invasives Triggersignal ein besonders geeignetes Werkzeug um molekulare Prozesse zu kontrollieren.
Die Verwendung photolabiler Schutzgruppen („cage“) ermöglicht es, diese lichtaktivierbaren Nukleinsäuren („caged compound“) herzustellen. Üblicherweise werden Oligonukleotide damit an funktionsbestimmenden Stellen versehen, woraufhin die Funktion der Oligonukleotide unterdrückt wird. Die biologische Aktivität kann durch Bestrahlung mit Licht wieder hergestellt werden, da die photolabile Schutzgruppe durch den Lichtimpuls abgespalten wird. Neben der zeitweiligen Maskierung der Nukleinsäureaktivität existiert auch eine Methode, die als „photoaktivierbarer Strangbruch“ (‘‘caged strand break‘‘) bezeichnet wird. Dabei werden mit Hilfe von photolabilen Linkern (‘‘Verknüpfer‘‘) lichtinduzierte Strangbrüche in Oligonukleotiden ausgelöst, um so beispielsweise die Struktur eines Nukleinsäurestrangs zu zerstören. Die Idee der photoaktivierbaren Strangbrüche ist nicht neu, dennoch werden photolabile Schutzgruppen überwiegend nach der erstgenannten Strategie verwendet. Im Rahmen dieses Promotionsvorhabens wurden neue photosensitive Linkerbausteine für Oligonukleotide entwickelt und hergestellt, welche sich vor allem im Hinblick auf die Anwendbarkeit in lebenden biologischen Systemen von den bisherigen photolabilen Linkern unterscheiden.
Im ersten Projekt wurde ein nicht-nukleosidischer, photolabiler Linker, basierend auf dem Cumaringrundgerüst, entwickelt. Das Ziel war hier, vor allem, einen zweiphotonenaktiven Linker für biologische Anwendungen und Zweiphotonen-Fragestellungen nutzbar zu machen. Bisherige Zweiphotonen-Linker konnten hauptsächlich nur für Proteinverknüpfungen bzw. Neurotransmitter verwendet werden oder mussten chemisch umständlich (z.B. Click-Chemie) und postsynthetisch in Oligonukleotide eingeführt werden. Der neu entwickelte Zweiphotonen-Linker wurde als Phosphoramiditbaustein für die Oligonukelotid-Festphasensynthese synthetisiert, was einen problemlosen und automatisierten Einbau garantiert. Mit einem modifizierten Oligonukleotid konnten die photochemischen Eigenschaften des Linkers bestimmt und mit Hilfe eines fluoreszenzbasierten Verdrängungsassays und Lasertechniken der Zweiphotonen-Effekt visualisiert werden. Dazu wurde ein Hairpin-DNA-Strang hergestellt, welcher eine Linkermodifikation im Bereich der Loopregion enthält. Durch eine Thiolmodifikation am 5‘-Ende des Oligonukleotidstranges war es möglich, diesen in einem Maleimid-funktionalisierten Hydrogel zu fixieren. Ein DNA-Duplex mit einem Fluorophor/Quencherpaar und einer korrespondierenden Sequenz zum modifizierten Hairpin-Strang wurde ebenfalls dem System zugegeben, allerdings wurde dieser nicht fixiert, um Diffusion zu ermöglichen. Durch die räumliche Nähe des Fluorophors zum Quencher konnte im unbelichteten Zustand zunächst keine Fluoreszenz gemessen werden. Mit einem (Femtosekunden-)gepulsten Laser und dem damit verbundenen Bindungsbruch im Hairpin-Strang durch Zweiphotonen-Effekte wurde es dem fluoreszierenden Strang des DNA-Duplex ermöglicht, sich vom Quencher-Strang zu lösen und an den fixierten Strang zu hybridisieren. Das Photolyse-Ereignis konnte so in ein lokales Fluoreszenzsignal übersetzt und detektiert werden.
Der eindeutige Beweis, dass es sich tatsächlich um ein Zweiphotonen-induziertes Ereignis handelt, konnte durch die dreidimensional aufgelöste Photolyse und über die quadratische Anhängigkeit des Fluoreszenzsignals von der eingestrahlten Laserleistung erbracht werden.
Die generelle Kompatibilität des Cumarin-Linkers mit biologischen Systemen konnte in Zellkulturexperimenten gezeigt werden. Dazu wurde eine Transkriptionsfaktor-DNA Decoy-Strategie entwickelt, in der Linker-modifizierte DNA Decoys an regulatorische Transkriptionsfaktoren binden und diese aber auch photochemisch wieder freisetzen können („catch and release-Strategie“). Zellkulturexperimente, um mit dieser Methode das Transkriptionsfaktor-gesteuerte und endogene Gen für Cyclooxygenase-2 (COX2) zu regulieren, lieferten keine aussagekräftigen Ergebnisse. Daher wurden die verwendeten Zellen dahingehend manipuliert, sodass sie das Protein GFP (grün fluoreszierendes Protein) in Abhängigkeit von der Anwesenheit eines Transkriptionsfaktors exprimieren. Das so durch die Zellen verursachte Fluoreszenzsignal steht in direkter Abhängigkeit zur Decoy-Aktivität. Mit Hilfe modifizierter GFP-Decoys konnte hierbei eine Regulation auf Transkriptionsebene in biologischen Organismen erreicht werden. Mit dem Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA), einer molekularbiologischen in vitro-Analysetechnik, wurden die Interaktionen zwischen modifizierten Decoys und dem Transkriptionsfaktor untersucht.
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Im Rahmen dieser Arbeit wurden sRNAs des halophilen Archaeons Haloferax volcanii hinsichtlich ihrer biologischen und ihrer regulatorischen Funktion charakterisiert.
Um einen Überblick über die biologischen Funktionen archaealer sRNAs zu erhalten, wurde eine umfassende phänotypische Charakterisierung von 27 sRNA-Deletionsmutanten im Vergleich zum Wildtyp ausgewertet. Im Zuge dieser phänotypischen Charakterisierungen wurden zehn verschiedene Wachstumsbedingungen, morphologische Unterschiede und Veränderungen in der Zellmotilität untersucht. Hierbei zeigten nahezu alle Deletionsmutanten unter mindestens einer der getesteten Bedingungen phänotypische Unterschiede. Durch den Verlust von sRNAs wurden sowohl sogenannte Gain-of-function als auch Loss-of-function Phänotypen beobachtet. Haloarchaeale sRNAs spielen eine wichtige Rolle beim Wachstum mit verschiedenen Salzkonzentrationen, mit verschiedenen Kohlenstoffquellen und beim Schwärmverhalten, sind jedoch weniger in die Adaptation an diverse Stressbedingungen involviert.
Zur näheren Charakterisierung der regulatorischen Funktion archaealer sRNAs wurden sRNA362, sRNAhtsf468 und sRNA479 mittels molekulargenetischer Methoden wie Northern Blot-Analyse und DNA-Mikroarray sowie bioinformatischer in silico-Analyse untersucht. Das Expressionslevel von sRNA362 konnte bestimmt und potentielle Zielgene für sRNAhtsf468 und sRNA479 identifiziert werden.
Eine vorangegangene Studie zeigte den Einfluss von sRNA30 unter Hitzestress und führte zur Identifikation differentiell produzierter Proteine in Abwesenheit der sRNA. In dieser Arbeit wurde mittels Northern Blot-Analysen die Expression der sRNA30 charakterisiert. Das Wachstum in An- und Abwesenheit von sRNA30 wurde bei 42°C und 51°C phänotypisch charakterisiert und der regulatorische Einfluss der sRNA auf die mRNA differentiell regulierter Proteine durch Northern Blot-Analyse überprüft. Eine Transkriptomanalyse mittels DNA-Mikroarray nach Hitzeschock-Induktion führte zur Identifikation differentiell regulierter Gene involviert in Transportprozesse, Metabolismus, Transkriptionsregulation und die Expression anderer sRNAs. Die differentielle Regulation des Proteoms nach Hitzeschockinduktion in An- und Abwesenheit von sRNA30 konnte bestätigt werden.
Desweiteren wurde in dieser Arbeit sRNA132 und deren phosphatabhängige Regulation der Ziel-mRNA HVO_A0477-80 näher charakterisiert. Eine Induktionskinetik nach Phosphatentzug bestätigte die Bedeutung von sRNA132 für die verstärkte Expression des Operons HVO_A0477-80 unter Phosphatmangel-Bedingungen und verwies auf die Existenz weiterer Regulationsmechanismen. Während vor und nach Phosphatentzug kein Unterschied bezüglich der Zellmorphologie von Wildtyp und Deletionsmutante zu erkennen war, führte das Wachstum mit einem starken Phosphatüberschuss von 5 mM zu einer Zellverlängerung der Deletionsmutante. Die Kompetition der nativen 3‘-UTR des Operons HVO_A0477-80 mit einer Vektor-kodierten artifiziellen 3‘-UTR legt eine Regulation über die Bindung von sRNA132 an die 3‘-UTR nahe. Der Transkriptomvergleich nach Phosphatentzug in An- und Abwesenheit von sRNA132 führte zur Identifikation des Phosphoregulons der sRNA. Zu diesem Phosphoregulon gehören unter anderem zwei Glycerinphosphat-Dehydrogenasen, Transkriptionsregulatoren, eine Polyphosphatkinase und eine Glycerolphosphodiesterase. Zudem waren die Transkriptlevel der beiden ABC-Transporter HVO_A0477-80 und HVO_2375-8 für anorganisches Phosphat und des Transporters HVO_B0292-5 für Glycerinaldehyd-3-Phosphat in Abwesenheit der sRNA verringert. Die beiden ABC-Transportsysteme für anorganisches Phosphat wurden im Rahmen dieser Arbeit deletiert und weiter charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass das ABC-Transportsystem HVO_2375-8 bei geringen Phosphatkonzentrationen leicht induziert wird und das Transkriptlevel in Anwesenheit von sRNA132 erhöht ist. Wachstumsversuche der jeweiligen Deletionsmutante in direkter Konkurrenz mit dem Wildtyp zeigten, dass keiner der beiden ABC-Transporter den anderen vollständig ersetzen kann und der Wildtyp mit beiden intakten ABC-Transportern unter phosphatlimitierenden Bedingungen einen Wachstumsvorteil besitzt. In silico-Analysen der Promotorbereiche von sRNA und ABC-Transporter legen zudem die Existenz von P-Boxen nahe.
Photolabile Schutzgruppen haben sich im Laufe der letzten Jahre als wertvolle Werkzeuge für die Untersuchung und Regulation biologischer Prozesse etabliert. Dabei wird die photolabile Schutzgruppe auf geeignete Weise mit Biomolekülen verknüpft, sodass deren Funktion temporär deaktiviert wird. Durch Bestrahlen mit Licht geeigneter Wellenlängen wird die photolabile Schutzgruppe entfernt und die Aktivität des Biomoleküls bzw. des zu beobachtenden Prozesses wiederhergestellt. Die Grundlagen der Verwendung photolabiler Schutzgruppen im biologischen Kontext wurden in zwei Pionierarbeiten 1977 von J.W. ENGELS und 1978 von J.F. HOFFMAN gelegt. Davon ausgehend haben sich zahlreiche Anwendungen photolabiler Schutzgruppen für biologisch interessante Molekülklassen entwickelt. Auf dem speziellen Gebiet der Nukleinsäuren wurden in den letzten Jahren einige fundamentale Mechanismen entdeckt und aufgeklärt, die nicht zuletzt auch therapeutisch interessante Anwendungsmöglichkeiten für photolabile Schutzgruppen bieten. Hierbei stellt das An-/Aus-Schaltverhalten von Nukleinsäuren jedoch ein nicht-triviales Problem dar. Selbst der gezielte Einbau einer einzelnen photolabilen Schutzgruppe in ein multifunktionales Oligonukleotid führt in der Regel nämlich nicht zu einer vollständigen Deaktivierung dessen. Ein multipler Einbau photolabiler Schutzgruppen entlang der Sequenz eines funktionellen Oligonukleotids schaltet die Hintergrundaktivität im deaktivierten Zustand zwar vollständig aus, allerdings müssen in diesem Fall hohe Bestrahlungsintensitäten bzw. –dauern für das Entfernen aller photolabilen Modifikationen angewendet werden. Dadurch geht zum einen die Zeitauflösung der lichtgeschalteten Prozesse verloren, nicht zuletzt erhöht sich dabei aber auch das Risiko von lichtinduzierten Schäden am biologischen System. Das Kernthema der vorliegenden Dissertation war es daher, neue Architekturen für den Aufbau photoaktivierbarer Oligonukleotide zu entwickeln.
Das erste große Projekt basierte auf der Annahme, dass sich Duplexstrukturen, die für die Funktion vieler Nukleinsäuremechanismen fundamental sind, durch Zyklisierung von Oligonukleotiden global destabilisieren und damit effizienter photoaktivieren lassen, als durch lokalen Einbau einzelner photolabiler Schutzgruppen in Oligonukleotide. Hierzu wurden geeignete Alkin-Modifikationen an photolabile Nitrobenzyl- und Cumarin-Schutzgruppen angebracht und diese an die Nukleobasen verschiedener DNA-Bausteine geknüpft. Es ist daraufhin gelungen, Oligonukleotide mit je zwei photolabilen Alkin-Modifikationen herzustellen und diese intrasequentiell über eine Cu(I)-katalysierte Click-Reaktion mit einem Bisazid-Linker zu zyklisieren. Die so erhaltenen Oligonukleotide wiesen dramatisch erniedrigte Schmelzpunkte gegenüber den nativen Duplexen, sowie gegenüber den zweifach photolabil geschützten Oligonukleotiden auf. Dabei wurde außerdem festgestellt, dass Zyklisierungsparameter wie die Linkerlänge, -polarität und –flexibilität und die Wahl der photolabilen Schutzgruppe keinen signifikanten Einfluss auf die Duplexstabilität hat. Über einen Bereich von Ringgrößen zwischen ca. 11-21 Nukleotiden wurden die niedrigsten Duplexstabilitäten beobachtet. Sehr kleine, sowie große Ringe ab 30 Nukleotiden wiesen dagegen höhere Stabilität auf.
Da mit dem entwickelten Zyklisierungskonzept auch mehrere Ringstrukturen innerhalb einer Oligonukleotidsequenz aufgebaut werden können, wurde im nächsten Schritt eine photoaktivierbare Variante des C10-Aptamers hergestellt, welches selektiv gegen Burkitt’s Lymphomzellen bindet. Dieses 90-mer DNA-Oligonukleotid wurde an drei Stellen photolabil Alkin-modifiziert und infolge mit einem Trisazid-Linker zu einer bizyklisierten Struktur verknotet. Mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie-Experimenten konnte demonstriert werden, dass das durch eine solche „Photo-Klammer“ deaktivierte C10-Aptamer keine Bindungsaffinität gegenüber Burkitt’s Lymphomzellen aufweist, die Bindungsaktivität jedoch nach Belichten wiederhergestellt werden kann. Mit Atomkraftmikroskopie-Experimenten ist es darüber hinaus gelungen, die Photoaktivierung des verknäuelten C10-Aptamers mit molekularer Auflösung abzubilden. Mit diesem Ergebnis können nun lange funktionelle Oligonukleotide auf definierte Weise photoaktivierbar gestaltet werden, insbesondere auch dann, wenn keine (Informationen über) funktionelle Sekundärstrukturen existieren.
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Gegenstand der vorliegenden Arbeit sind die Untersuchungen lichtgesteuerter Reaktionen der zwei Retinalproteine Channelrhodopsin-2 (ChR-2) und Proteorhodopsin (PR) mit Hilfe zeitaufgelöster Laserspektroskopie.
Da der Mechanismus der Kanalöffnung des ChR-2 bis heute nicht vollständig aufgeklärt werden konnte, beschäftigt sich diese Arbeit insbesondere mit den Prozessen, die direkt nach der Photoanregung des Retinals stattfinden und die Kanalöffnung vorbereiten. Es wurde dabei gezielt auf für die Funktion des Proteins wichtige Faktoren wie strukturelle Besonderheiten des Chromophors und seiner Umgebung eingegangen und deren Auswirkung auf die Dynamik der Photoreaktionen sowie die Veränderungen im Protein nach der Anregung untersucht.
Zunächst wurden die Ergebnisse der vis-pump-IR-probe-Experimente an ChR-2 im Bereich der Carbonylschwingungsbanden protonierter Glutamat- und Aspartat-Reste dargestellt. Dabei wurde insbesondere die Bildungsdynamik der Differenzbanden in diesem Spektralbereich untersucht und in Anlehnung an die vorhandene Literatur eine Bandenzuordnung der für die Funktion des Proteins wichtigen Aminosäurereste vorgenommen. Aus den Messergebnissen konnte geschlossen werden, dass die mit der Kanalöffnung einhergehenden Konformationsänderungen in ChR-2 durch eine effektive Aufnahme der Überschussenergie durch das Protein auf einer sub-Pikosekunden-Zeitskala vorbereitet werden.
Des Weiteren wurden spektroskopische Untersuchungen an der R120H-Mutante des ChR-2 vorgestellt. Da diese Mutante bei elektrophysiologischen Messungen keine Kanalaktivität zeigte, sollte zunächst geklärt werden, ob die Mutation einen Einfluss auf die Retinalisomerisierung und den nachfolgenden Photozyklus hat. Dabei stellte sich heraus, dass die Retinalisomerisierung bei der R120H-Mutante zwar im Vergleich zum Wildtyp etwas verzögert stattfindet, der Einfluss der Punktmutation auf den weiteren Photozyklus jedoch insgesamt gering ist. Mit Hilfe der Kurzzeit-IR-Spektroskopie im Bereich der Amid I-Schwingung des Proteinrückgrats konnten für die Mutante allerdings signifikante Veränderungen der Bildungsdynamik sowie eine deutliche Abnahme der Amplitude des Amid I-Signals detektiert werden. Anhand weiterer Experimente an den Mutanten E123T und D253N in diesem Spektralbereich konnte anschließend ein Zusammenhang zwischen der Intensität der Amid I-Bande und der Kanalaktivität von ChR-2 festgestellt werden. Diese Ergebnisse ließen somit die Schlussfolgerung zu, dass die Aminosäurereste R120 und D253 eine entscheidende Rolle beim schnellen Transfer der Überschussenergie an das Protein nach der Retinalanregung und der so initiierten Kanalöffnung spielen.
Zusätzlich wurde der Frage nachgegangen, inwieweit Veränderungen am Chromophor die Isomerisierungsreaktion, den nachfolgenden Photozyklus sowie die Funktion des ChR-2 als Ionenkanal beeinflussen können. Zu diesem Zweck wurden spektroskopische Untersuchungen an einem mit 9-12-Phenylretinal (PheRet) rekonstituierten ChR-2 vorgestellt. Es konnte gezeigt werden, dass die Isomerisierung des PheRet zu seiner 13-cis-Form in ChR-2 stark verlangsamt ist und verglichen mit dem nicht modifizierten Chromophor deutlich ineffizienter abläuft. Es wurde außerdem festgestellt, dass die Veränderungen am Retinal zu deutlichen Beeinträchtigungen des Photozyklus führen. Zum einen wurde ein sehr schneller Zerfall des ersten Photoprodukts sowie die Bildung eines zusätzlichen, blauverschobenen Px-Zustands detektiert. Außerdem wurde festgestellt, dass nach der Deprotonierung des isomerisierten PheRet der Großteil der modifizierten Retinale in den Ausgangszustand zurückkehrt und der P3-Zustand nur in geringen Mengen gebildet wird. Die Messergebnisse führten somit zu der Schlussfolgerung, dass die all-trans-Konformation des PheRet in ChR-2 deutlich bevorzugt wird. Da elektrophysiologische Untersuchungen des Retinal-Analogons jodach keine signifikanten Verminderungen der Photoströme im Vergleich zum ATR in ChR-2 zeigten, ließ sich schließlich festhalten, dass die vorgenommenen Veränderungen am Chromophor, die zu einer deutlichen Hemmung der Isomerisierungsreaktion führen und einen starken Einfluss auf den nachfolgenden Photozyklus haben, nicht ausreichend sind, um die Kanalaktivität von ChR-2 komplett zu blockieren, solange noch ein kleiner Anteil der Retinale isomerisieren kann.
Der abschließende Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Absorption des UV-Lichts durch das Retinal mit deprotonierter Schiff-Base im grünabsorbierenden Proteorhodopsin, welches in einem alkalischen Medium im Dunkelzustand akkumuliert werden kann. Die Untersuchungen der Primärreaktion zeigten einen langsamen biexponentiellen Zerfall des angeregten Zustands der UV-absorbierenden Spezies mit anschließender Bildung des 13-cis-Photoprodukts. Aufgrund dieser Ergebnisse konnte ein Reaktionsmodell für die ersten Prozesse nach der UV-Anregung des Retinals im GPR aufgestellt werden, welches möglicherweise für weitere UV-Rezeptoren genutzt werden kann.
Licht ist ein wertvolles Werkzeug zur Regulation biochemischer Reaktionsabläufe. Denn die Applikation von Licht erlaubt eine sehr präzise Einflussnahme auf den Ort und den Startzeitpunkt der zu untersuchenden Reaktionen. Als nichtinvasives Medium bietet die Lichtkontrolle bei der Wahl einer geeigneten Anregungswellenlänge den Vorteil nur minimal in einen lebenden Organismus einzugreifen. Um eine solche lichtbasierte Kontrolle für biologische Anwendungen zu realisieren, ist die Anwesenheit einer lichtsensitiven Verbindung nötig. Ein Konzept der lichtsensitiven Verbindungen ist die sogenannte photolabile Schutzgruppe. Im Allgemeinen handelt es sich hierbei um einen Chromophor der temporär an ein Biomolekül angebracht wurde, um dessen biologische Aktivität zu unterdrücken.
In dieser Arbeit wurde dieses Konzept auf das Antibiotikum Puromycin angewendet, welches durch das synthetische Anbringen der Cumarin-Schutzgruppe DEACM in seiner biologischen Aktivität behindert und durch einen Lichtpuls wieder freigesetzt wurde. DEACM st eine photolabile Schutzgruppe mit breitem Anwendungsspektrum, da es im Vergleich zu anderen Cumarin-Derivaten vorteilhafte photophysikalische Eigenschaften aufweist. Zum einen ist durch den 7-Diethylamino-Substituenten das Absorptionsmaximum dieser Verbindung um etwa 20 nm bathochrom verschoben. Zum anderen zeichnet sich dieses Derivat durch einen erheblich erhöhten Extinktionskoeffizienten aus, sodass eine Freisetzungsreaktion mit einer geringeren Lichtdosis induziert werden kann, was weniger Stress für die Zellen in lebenden Systemen bedeutet.
Die antibiotische Wirkung von Puromycin beruht auf der strukturellen Ähnlichkeit zum5'-Ende von Tyrosyl-tRNA, wodurch sich das Antibiotikum kondonunspezifisch während der Translation der Proteinsynthese an das Ribosom anlagern kann. Anschließend wird die naszierende Polypeptidkette auf das Puromycin transferiert. Da diese neue Bindung unter biologischen Bedingungen nicht spaltbar ist, führt dies zu einer verfrühten Freisetzung des Polypeptid-Puromycin-Fragments. Schließlich ist die Proteinsynthese vollständig abgebrochen.
Die Motivation zur photoinduzierten Kontrolle von Puromycin besteht in der Vielzahl an biologischen Applikationsmöglichkeiten, da die lichtregulierte Freisetzung der biologischen Aktivität als Trigger für sich anschließende biochemische Abläufe verwendet werden kann. Durch das hier gezeigte System kann in Kombination mit anderen Techniken (z.B. NMR) die posttranslationale Proteinfaltung beobachtet werden, welche als hochgradig komplexer Prozess bisher nicht verstanden ist. Eine weitere Motivationsgrundlage ist die Anwendung von DEACM-puromycin in Nervenzellen. Hier kann durch die Photofreisetzung die Proteinsynthese in den Dendriten der Neuronen beobachtet werden, wodurch Rückschlüsse auf neurodegenerative Krankheiten möglich sein sollten, wie z.B. Alzheimer-Krankheit. In dieser Arbeit konnte in-vitro nachgewiesen werden, dass die antibiotische Wirkung von Puromycin mittels Licht kontrollierbar ist. Aus der photophysikalischen Grundcharakterisierung ging hervor, dass DEACM-puromycin einen hohen Extinktionskoeffizienten bei Wellenlängen größer als 380 nm aufweist. Folglich kann zur Induktion der Photolyse eine geringere Lichtdosis mit energiearmer Strahlung als bei dem Vorläufersystem NVOC-puromycin verwendet werden, angesichts dessen ist das hier vorgestellte DEACM-puromycin für Anwendungen in Zellen zu empfehlen.
Über die Kombination von quantenchemischen Rechnungen und spektroskopischen Methoden konnten die frühen Schritte der Freisetzungsreaktion bestimmt und quantifiziert werden. Zudem zeigte sich ein Einfluss der Lösungsmittelzusammensetzung auf die Uncaging-Schritte. In Gegenwart eines protischen Lösungsmittels wird der zum Uncaging in Konkurrenz stehende Prozess der Fluoreszenz unterdrückt, wodurch die Freisetzungsschritte effektiver werden. Zudem führt die Präsenz von Protonen zu einer Stabilisierung des ionischen Intermediates, sodass die Bildung dessen beschleunigt ablaufen kann. Die Spaltung der photolabilen Schutzgruppen vom Puromycin findet mit einer Rate von 0,71*10^8 s-1 statt, welche im Vergleich zu Vorgängersystem um eine Größenordnung größer ist. Die Wiederherstellung der biologischen Aktivität resultiert aber erst nach einem anschließenden Decarboxylierungsschritt. Mithilfe von IR-Messungen konnte die Decarboxylierung beobachtet und daraus die Quantenausbeute zu 2,5% determiniert werden. Die so bestimmte Quantenausbeute entspricht etwa dem Zweifachen von NVOC-puromycin, sodass die hier untersuchte Verbindung eindeutig als das effizientere System zu betrachten ist. Die hier beschriebenen Ergebnisse zeigen, dass DEACM-puromycin vorteilhafte photophysikalische Eigenschafen aufweist, die diese Verbindung zu einem wertvollen Hilfsmittel für eine Vielzahl von lichtkontrollierten Untersuchungen in biologischer Umgebung macht. Zudem wurden Einblicke in den Reaktionsmechanismus gegeben, die das Verständnis der photolytischen Spaltung von Carbamat-geschützten Cumarinen erstmals auf der ultrakurzen Zeitskala ermöglicht.
Verschiedene physikalische Effekte erlauben es Licht so zu führen und zu verändern, dass es Einblicke in für Menschen sonst unzugängliche Bereiche gewährt. Eines von insgesamt drei Elementen dieser Dissertationsschrift ist der Aufbau eines Multiphotonen-Mikroskops. Dieses fortschrittliche Werkzeug erweitert das zur Verfügung stehende Instrumentarium um verschiedene Analysemethoden, allen voran die 2-Photonen-Fluoreszenz-Mikroskopie. Durch geringfügige Modifikationen können auch weitere Methoden, wie beispielsweise stimulierte Raman-Streuung realisiert werden.
Insbesondere die 2-Photonen-Fluoreszenz-Mikroskopie war für das zweite Element dieser Dissertationsschrift von großer Bedeutung. In dieser Studie wurde das Bleichverhalten von Spinach bei 2-Photonen-Absorption untersucht, sowohl an frei in Lösung befindlichen als auch auf einem Träger immobilisierten Spinach-Komplexen. Die Ergebnisse zu den frei in Lösung befindlichen Spinach-Komplexen zeigen, dass die Verstärkung der Fluoreszenz von DFHBI grundsätzlich auch im Fall der 2-Photonen-Absorption eintritt. Dabei wurde ein Ausbleichen der 2-Photonen-induzierten Fluoreszenz für frei in Lösung befindliche Spinach-Komplexe erst bei außerordentlich hohen Intensitäten der Anregungsstrahlung beobachtet. Dieser Befund kann zumindest teilweise auf das Eindiffundieren fluoreszenter Spinach-Komplexe in das sehr kleine Fokalvolumen innerhalb der 2-Photonen-Anregung stattfindet zurückgeführt werden. Für immobilisierte Spinach-Komplexe konnte gezeigt werden, dass eine kontinuierliche Bildaufnahme gegenüber einer Bildaufnahme in Intervallen mit jeweils zusätzlichen Dunkelphasen zur Erholung des reversiblen Bleichens der 2-Photonen-induzierten Fluoreszenz, sowie der generelle Verzicht auf spezielle Belichtungsschemata und Methoden der Datenakquise mit keinen besonderen Nachteilen verbunden ist. Abschließend betrachtet erweist sich Spinach bei 2-Photonen-Anregung als ausgesprochen resistent gegenüber einem irreversiblem Ausbleichen des Fluoreszenzsignals.
Als drittes Element dieser Dissertationsschrift wurde die Dynamik von Chrimson, einem Kanalrhodopsin mit rot-verschobener Absorption mittels zeitaufgelöster Spektroskopie im sichtbaren Spektralbereich untersucht. Sowohl die Anregungswellenlänge als auch der pH-Wert bzw. der Protonierungszustand des Gegenions haben einen messbaren Einfluss auf die Primärreaktion. Diese verlangsamt sich, sobald der pH-Wert abgesenkt oder die Anregungswellenlänge rot-verschoben wird. Darüber hinaus führt eine Rot-Verschiebung der Anregungswellenlänge zu einer geringeren Effizienz der Isomerisation des Retinal-Chromophors. Die Primärreaktion von Chrimson entspricht dabei einem Reaktionsmodell mit einer Verzweigung des Reaktionspfades auf der Energiehyperfläche des angeregten Zustandes. Ein Reaktionspfad führt dabei durch ein lokales Minimum, welches in seiner Ausprägung stark von der elektrostatischen Umgebung des Retinal-Chromophors abhängt. Je nach ursprünglichem Protonierungszustand des Gegenions der Retinal-Schiff-Base wurden große Unterschiede hinsichtlich der beobachteten transienten Absorptionsmuster für den im Anschluss von Chrimson durchlaufenen Photozyklus gefunden. Bei pH 6,0 weist der Photozyklus von Chrimson eine insgesamt deutlich schnellere Kinetik auf, als es für den Photozyklus bei pH 9,5 beobachtet wurde. Es ist bemerkenswert, dass in elektrophysiologischen Messungen für beide Photozyklen eine Öffnung des Ionenkanals gefunden wurde. Die Kanalfunktion von Chrimson ist somit grundsätzlich nicht vom Protonierungszustand des Gegenions abhängig, wenngleich die Kinetik des Ionenkanals durchaus davon beeinflusst wird. Dies deutet auf Unterschiede in den Wechselwirkungen zwischen dem Ionenkanal und dem Gegenion der Retinal-Schiff-Base hin.
Im ersten Projekt der vorliegenden Arbeit wurden CD - 1 Mäuse mit drei unterschiedlichen Diäten für zwei Wochen ad libitum gefüttert. Die Diäten bestanden aus zwei kohlenhydratarmen, fettreichen Diäten und einer Standard Haltungsdiät. Die kohlenhydratarmen, fettreichen Diäten enthielten entweder Triheptanoin (dreifach mit Heptanoat verestertes Glycerol) oder Soja - Öl als Fettkomponente (jeweils 35 % der Gesamtkalorien). Nach zwei Wochen wurde ein ischämischer Schlaganfall für 90 min. mithilfe eines Silikonfadens induziert. Die Leber, das Blut und das Gehirn wurden nach dem Schlaganfall entnommen und die Konzentrationen der Metabolite β - Hydroxybutyrat, Glukose, Laktat und Citrat wurden mit der zuvor etablierten GC - MS-Methode ermittelt. Unter gleichen Bedingungen wurde eine Mikrodialysestudie durchgeführt.
Bei den Tieren, die die kohlenhydratarmen, fettreichen Diäten erhielten, konnte in den Leber - und Hirnhomogenaten, im Plasma sowie im Mikrodialysat eine Ketose festgestellt werden. Die BHB Konzentrationen durch eine Soja Diät erreichten im Leberhomogenat bis zu 4 mM, im Plasma bis zu 1,5 mM, im Hirnhomogenat bis zu 1,5 mM und im Mikrodialysat bis zu 30 µM. Um eine Aussage treffen zu können, ob das Gehirn die von der Leber produzierten Ketonkörper als Energiesubstrate nutzen kann, wurde eine Folgestudie (unter gleichen Bedingungen) durchgeführt. Bei dieser Studie wurde der Zeitpunkt der Gewebeentnahme 60 min. nach Entfernen des Fadens (Reperfusion) gewählt. In den Leber – und Hirnhomogenaten konnten erniedrigte Konzentrationen des Ketonkörpers BHB nachgewiesen werden. Die nicht operierten Tiere, die eine fettreiche Diät erhielten, hatten erhöhte Konzentrationen an Citrat in den genannten Geweben. Durch den Abbau des Ketonkörpers BHB können bei Verstoffwechslung in Geweben außerhalb der Leber, zwei Moleküle Acetyl - CoA gebildet werden. Diese gebildeten Acetyl - CoA Moleküle können in den Citratzyklus eingespeist werden.
Um diesen Befund mechanistisch besser verstehen zu können, wurde den Mäusen Propranolol (ein unselektiver β - Blocker) verabreicht, und zwar kurz nachdem der Faden die mittlere Zerebralarterie verschlossen hatte. Als Folge blieb bei den fettreich gefütterten Tieren die zuvor beobachtete Ketose, aus. Daraus wurde geschlossen, dass die auftretende Ketose bei den fettreich gefütterten Tieren durch adrenerge β - Rezeptoren vermittelt wurde. Zusammengefasst kann eine fettreiche bzw. ketogene Ernährung im Falle einer Ischämie die Versorgung des Gehirns durch die Bildung von Ketonkörper gewährleisten.
Die zu beobachtende hepatische Ketogenese aus dem ersten Projekt hat die Frage entstehen lassen, ob eine akute Gabe von β - Hydroxybutyrat (BHB) bei Entfernen des Fadens schützende Effekte auf das Verhalten bzw. die Mitochondrien als Kraftwerke der Zelle hat. Hierzu wurde BHB bei Reperfusion gegeben und die Wirkungen dieser Einmalgabe nach 24 h untersucht. Als erster Schritt wurde der Nachweis erbracht, dass eine exogene Gabe von BHB das Gehirn erreicht. Im zweiten Schritt wurde das Verhalten der Mäuse nach 24 h untersucht. Hierbei erbrachte die Gabe von BHB eine signifikante Verbesserung der sensorischen und motorischen Fähigkeiten der Mäuse. Die metabolischen Veränderungen nach 24 h wurden erneut in Leberhomogenaten und Plasma vermessen. Eine Einzelgabe von BHB bewirkte eine milde Ketose auch 24 h nach Reperfusion der mittleren Zerebralarterie. Um eine detailliertere Erkenntnis über die Wirkung von BHB zu erlangen, wurden die Mitochondrien als potentielles Ziel für BHB in den Fokus genommen. Die Einmalgabe von BHB verhinderte ein Absinken der Komplex – II Aktivität. Außerdem kann die Aktivität der Citratsynthase unter der Gabe von BHB erhalten werden, sodass die Mitochondrien vor allem im wichtigen Zeitraum nach der Reperfusion geschützt werden. Im Rahmen der Untersuchungen der Mitochondrien wurden unterschiedliche Substrateinflüsse auf die Respiration der isolierten Mitochondrien getestet. Bei Zugabe von BHB, Oxalacetat + Acetat oder Citrat zu dem Respirationsmedium stieg die Respiration der Mitochondrien an. Im Falle von Glukose, Propranolol oder Acetat wird die Respiration verringert. Bei Zugabe von Laktat, verbleibt die Respiration auf Ausgangsniveau. Abschließend ist festzustellen, dass die Einzelgabe von BHB nach 24 h das Verhalten der Mäuse verbessert, eine milde Ketose induziert, sowie Mitochondrien und die Citratsynthase gegen ischämische Ereignisse schützt.
Um die in dieser Arbeit gezeigten Daten über metabolische Veränderungen zeigen zu können, musste eine vorherige Etablierung der GC – MS Analytik vollzogen werden. Auf der einen Seite musste die Probenvorbereitung, aber auch die gesamte Vermessung der Proben aufgebaut werden. Es wurden insgesamt 11 Analyte in vier unterschiedlichen Kompartimenten quantifiziert. Die Nachweisgrenze lag bei diesen 11 Analyten bei 0,01 - 1 ng/µl, was einer umgerechneten Stoffmengenkonzentration von 0,5 - 10 µM entspricht. Mithilfe dieser Methode können optional weitere Substanzen aus verschiedenen Geweben zugänglich gemacht werden. Diese Arbeit bietet hierzu eine Anleitung, wie die Etablierung erfolgen kann. Im Rahmen der Probenvorbereitung wurden alle Schritte systematisch verbessert. Dazu wurden Wiederholungsmessungen für unterschiedliche Modalitäten vollzogen. Die Abundance und die Zeitbeständigkeit waren die wesentlichen Beurteilungskriterien. So wurden die Daten für die Extraktionseffektivität, die Lösungsmittelabhängigkeit der Silylierung, der Zusatz von Hünig - Base sowie die Temperatur und Zeitabhängigkeit der Silylierung in dieser Arbeit erarbeitet. Die Quantifizierung wurde anhand von internen Standardverbindungen durchgeführt. Die jeweiligen Response – Faktoren blieben über die gesamte Zeit nach der Etablierung konstant und erlaubten die Quantifizierung mit geringen Fehlern. Die Beurteilung der ermittelten Daten über die Validierung wurden anhand von geltenden Regelwerken der pharmazeutischen Industrie entschieden. Es wurde ein Protokoll entwickelt, das im Rahmen der universitären Forschung eine vertrauenswürdige Aussage über Veränderungen von Metabolitenspiegeln in vielen Geweben der Maus und der Ratte geben kann.
In der vorliegenden dreiteiligen Studie werden Mongolische Wüstenrennmäuse untersucht, deren Hörspektren im tieffrequenten Bereich und deren Unterscheidungsfähigkeiten von Kommunikationsrufen denen des Menschen ähneln. Die extrazelluläre Aktivität im primären auditorischen Kortex (AI) der narkotisierten Versuchstiere, evoziert durch Reintöne und arteigene Kommunikationsrufe, wird in der linken (LH) und rechten Gehirnhemisphäre (RH) aufgenommen. Es werden Multikanalelektroden (16 Eingangskanäle) verwendet, welche eine simultane Aufnahme der neuronalen Aktivitäten aller kortikalen Schichten ermöglichen. Zur Analyse der neuronalen Mechanismen werden Wellenformen einzelner Elektrodenkanäle und Aktivitätsprofile, bestehend aus den Wellenformen aller Elektrodenkanäle in einem Zeitfenster von 600 ms, auf Ebene von Aktionspotentialen (MUA), lokalen Feldpotentialen (LFP) und Current-source-density (CSD) Analysen, untersucht. Während MUAs die neuronalen Aktionspotentiale im Nahfeld der Elektrode reflektieren, umfassen die LFPs die summierten Potentiale (inhibitorisch und exzitatorisch) von Neuronen eines größeren Areals. Die CSDs hingegen werden durch die Integration von LFP-Wellenformen benachbarter, linear angeordneter Elektrodenkanäle berechnet und ermöglichen so eine Lokalisation der Ursprünge geräuschspezifischer Aktivitätsflüsse.
Im ersten Teilprojekt werden CSD-Profile in Antwort auf unterschiedliche Reintöne untersucht, um die Aktivitätskomponenten, die so genannten Sinks, für weiterführende Analysen zu quantifizieren. Es können zwei primäre (s1 und s2), drei mittlere (s3-s5) und vier späte (s6-s9) Sinks in einem Zeitfenster von 600 ms definiert werden. Eine Veränderung der Stimulusfrequenz eine Oktave über und unter der charakteristischen Frequenz (CF), beziehungsweise des Lautstärkepegels = 24 dB über der minimalen Schwelle, führt zu qualitativen Veränderungen in der CSD-Profilstruktur. Die Sink s7 wird durch Stimuli mit niedrigem Lautstärkepegel weniger verlässlich evoziert, wohingegen die Sink s9 bei Stimuli eine Oktave über der CF verlässlicher evoziert wird. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass im AI die spektralen Informationen eine Oktave über und unter der CF asymmetrisch integriert werden.
Auf Einzelschichtebene konnte bereits gezeigt werden, dass spektrotemporale Eigenschaften von Stimuli durch MUAs schlechter reflektiert wurden als durch LFPs, was vermutlich eine direkte Konsequenz der unterschiedlichen Ursprünge der Signaltypen ist. Daher werden im zweiten Teilprojekt die spezifischen Unterschiede der MUA-, LFP- und CSD-Antworten auf Ebene kortikaler Schichten und kompletter laminarer Profile untersucht, um die Unterschiede und den Informationsgehalt der drei Signaltypen zu charakterisieren. Signifikante Unterschiede, welche durch zwei Reintöne und sieben Kommunikationssignale evoziert werden, können verstärkt im mittleren und späten Latenzbereich und in granulären und infragranulären Schichten vorgefunden werden. Der Grad der Rufspezifizität ist in LFP und CSD-Antworten im Vergleich zu demjenigen in MUA-Antworten größer. Die Segregationsleistung ist im Vergleich zu einzelnen kortikalen Schichten in den von kortikalen Kolumnen abgeleiteten laminaren Profilen um den Faktor 1,8-2,6 erhöht. Die Neuronenpopulationen einzelner kortikaler Kolumnen sind vermutlich wichtig für die Kodierung von Geräuschen, welche sich in ihren spektrotemporalen Eigenschaften unterscheiden.
Viele vorangegangene Studien konnten zeigen, dass die Gehirnhemisphären akustische Signale asymmetrisch verarbeiten. Daher werden im dritten Hauptteil die laminaren Profile der LH und RH quantitativ und statistisch verglichen. Die MUA-, CSD-Profile und im geringeren Maße auch die LFP-Profile zeigen systematische Unterschiede auf signifikantem Niveau in der Dauer, Onset Latenz und vertikalen Ausdehnung bestimmter Aktivitäten. Kommunikationsrufe evozieren in der LH, welche beim Menschen auf Sprachstimuli spezialisiert ist, im Vergleich zur RH komplexere CSD-Profile. Die neuronale MUA-, LFP- und CSD-Aktivitätsstärke ist in der RH für weniger komplexe Stimuli teilweise signifikant erhöht. Die Asymmetrie in der Auftrittsverlässlichkeit der Sink s6 lässt vermuten, dass sich die intrakolumnäre Vernetzung in Schicht VIa zwischen der LH und RH unterscheidet. Die wenigen, signifikanten und nicht systematischen Unterschiede zwischen den Sink-Parametern der LH und RH nach kortikaler Ausschaltung mit dem GABAA-Rezeptor Agonist Muscimol weisen darauf hin, dass die Hemisphärenasymmetrie durch Prozesse des ipsilateralen Kortex maßgeblich beeinflusst wird.
Die humane 5-LO ist das Schlüsselenzym in der LT-Biosynthese. LTs sind wichtige Entzündungsmediatoren und sind in einer Vielzahl von Krankheiten involviert, u. a. Asthma, Atherosklerose, rheumatische Arthritis, Sepsis, allergischen Reaktionen und in vielen Krebsarten. Die Struktur der 5-LO besteht aus 673 Aminosäuren und besitzt ein Molekulargewicht von 78 kDa. Sie ist in zwei Domänen unterteilt: die kleinere C2-ähnliche regulatorische Domäne (C2ld) und der größeren katalytischen Domäne. Die 5-LO besitzt NIS und NES, die für die zelluläre Lokalisation der 5-LO verantwortlich sind. Außerdem wird die Lokalisation noch von Phosphorylierungsstellen reguliert, die auf der katalytischen Domäne identifiziert werden konnten. 2011 konnten Häfner et al. zeigen, dass die 5-LO in der Lage ist Homodimere zu bilden.
Wie für die meisten anderen humanen Gene konnten auch bei der 5-LO alternative Spleißvarianten identifiziert werden. Schon 1992 konnten die ersten unterschiedlich gesüleißten Transkripte in Hirntumoren und differenzierten HL-60-Zellen gefunden werden. Später konnten weitere Isoformen in verschiedenen Zelllinien entdeckt werden.
In der vorliegenden Arbeit wurden die alternativen Spleißvarianten 5-LO∆13, 5-LO∆4 und 5-LOp12 untersucht und charakterisiert. Auf mRNA-Ebene wurde die Expression des 5-LO-WT und deren Isoformen sowohl in B- und T-Zelllinien als auch primären B- und T-Zellen, monozytären Zelllinien und primäre Monozyten aus Patientenproben (RA und Sepsis) untersucht. Es wurde festgestellt, dass das Expressionsprofil der 5-LO-Varianten zellspezifisch ist. Im Vergleich zu den T-Zellen konnte in B-Zelllinien ein höheres Expressionslevel detektiert werden. Des Weiteren zeigte sich interessanterweise ein stark erhöhtes Expressionslevel in primären Monozyten von RA- und Sepsis-Patienten.
Untersuchungen der 5-LO-Aktivität ergaben unterschiedliche Ergebnisse, abhängig von der Transfektionsmethode. Als transiente Transfektion diente die Calciumphosphat-Methode. Für die stabile Integration der HEK293T-Zellen wurde die Sleeping Beauty-Methode gewählt. Hierfür wurden Proteine mit einem GFP bzw. mCherry-Tag (GFP-5-LO-WT, mCherry∆13, mCherry∆4, mCherryp12) verwendet, um diese mittels Konfokalmikroskop visualisieren zu können. Nach transienter Transfektion konnte eine Inhibition der 5-LO-Aktivität nach Kotransfektion mit jeweils einer Isoform gemessen werden. Nach stabiler Integration jedoch zeigte sich eine Steigerung der 5-LO-Produktbildung. Mit Hilfe von Western Blots wurden Expressionskontrollen angefertigt und die Menge des 5-LO-WT quantifiziert. In transient transfizierten Zellen wurde eine Erniedrigung der Expression des 5-LO-WT bestimmt, wohingegen in stabil integrierten Zellen ein Anstieg des 5-LO-WT als auch der Isoformen beobachtet werden konnte. Einerseits könnte dies einem Artefakt der Transfektionmethode zugrunde liegen, andererseits könnte es ein Hinweis darauf sein, dass sich die Proteine gegenseitig in ihrer Expression beeinflussen.
Ebenso wurde die Lokalisation der 5-LO und deren Isoformen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die 5-LO überwiegend im Zellkern lokalisiert ist, während alle alternativen Protein-Isoformen im Zytosol zu finden waren. Durch Ionophor-Behandlung wurde eine Translokation des 5-LO-WT an die Kernmembran detektiert, die Isoformen verblieben im Zytosol. Überraschenderweise konnte beobachtet werden, dass die Spleißvariante 5-LO∆13 mit höherer Ionophor-Konzentration ebenso in der Lage ist an die Kernmembran zu translozieren. Um eine mögliche Interaktion der 5-LO mit den Isoformen zu untersuchen, sollten alle Proteine im selben Zellkompartiment lokalisiert sein. Dafür wurden verschiedene Stimuli und Mutationen getestet. Mit der Mutante GFP-5-LO-S271A und dem Stressstimulus Sorbitol und den CaMKII/p38-Inhibotoren KN-93/SB203580 konnte eine Translokation in das Zytosol erreicht werden. Die Ergebnisse der anschließenden Aktivitätsassays zeigten, dass die Isoformen keinen Einfluss auf die Aktivität der 5-LO ausüben.
Des Weiteren wurden die Phosphorylierungen an S523 und S271 von 5-LO-WT, 5-LO∆13, 5-LO∆4 und 5-LOp12 untersucht. Es wurde herausgefunden, dass die 5-LO-Proteine unterschiedliche Phosphorylierungsmuster aufweisen. Während 5-LO-WT und 5-LO∆4 eine schwache Phosphorylierung an S271 aufzeigen, konnte eine starke Phosphorylierung der 5-LO∆13 und 5-LOp12 detektiert werden. Im Vergleich dazu zeigte lediglich die Isoform 5-LOp12 eine sehr starke Bande an der Phosphorylierungsstelle S523. Bei beiden Phosphorylierungen konnten deutlich stärkere Signale nach Kotransfektion gemessen werden. Durch Klonierung eines P2A-Linkers zwischen 5-LO und des GFP-Tags, konnten die Isoformen vom 5-LO-WT in Western Blots voneinander getrennt werden. Dies zeigte, dass es zu einer Hochregulation der Expression der alternativen 5-LO-Varianten nach Kotransfektion mit dem WT führte, aber auch, dass die stärkere Phosphorylierung nach Kotransfektion unabhängig von der Proteinmenge ist.
In dieser Arbeit soll identifiziert werden, welcher der zahlreichen Vertreter einer Arzneistoffklasse sich letztlich auf dem Markt durchsetzen kann und ob bestimmte pharmakokinetische, pharmakodynamische, klinische oder praktische Substanzeigenschaften retrospektiv für den Markterfolg einer Substanz verantwortlich gemacht werden können. Zudem stellt sich die Frage, ob und in wie fern Analogpräparate einen Nutzen in der Arzneimitteltherapie mit sich bringen, obwohl ihnen zum Zeitpunkt ihrer Markteinführung nur ein geringer Innovationsgrad zugebilligt wurde. Um derartige Rückschlüsse ziehen zu können wurden exemplarisch folgende fünf Arzneistoffklassen untersucht, die sich durch eine Vielzahl an Vertretern auszeichnen: Arsphenamine, Sulfonamide, Benzodiazepine, Glucocorticoide sowie Betablocker. Der Untersuchungszeitraum bemisst sich folglich vom Anfang des 20. Jahrhunderts, als industriell gefertigte, chemisch definierte hochpotente Wirkstoffe die Therapie zu bestimmen begannen, bis etwa zum letzten Drittel des 20. Jahrhunderts als Preise und Kostenerstattungsfragen zusätzlich zu Substanzeigenschaften für den Markterfolg mitbestimmend wurden.
Die Paarverteilungsfunktion (PDF) beschreibt die Wahrscheinlichkeit, zwei Atome eines Materials in einem Abstand r voneinander zu finden. Diese Methode bewährt sich seit längerer Zeit zur Untersuchung von Gläsern, Flüssigkeiten, amorphen, stark fehlgeordneten und nanokristallinen anorganischen Substanzen. Die Anwendung für organische Substanzen ist jedoch relativ neu, mit etwa 20 Veröffentlichungen und Patenten insgesamt.
Im Rahmen dieser Dissertation wurden zwei Methoden zur Strukturverfeinerung und Strukturlösung organischer Substanzen anhand von PDF-Daten erfolgreich entwickelt und an diversen Beispielen validiert. Als erster Schritt hierzu wurde eine Methodenverbesserung vorgenommen. Hierbei handelte es sich um eine Verbesserung der Simulation der PDF-Kurven organischer Verbindungen anhand eines gegebenen Strukturmodells. Mit Hilfe der bisherigen Methoden können die PDF-Kurven anorganischer Substanzen erfolgreich simuliert werden. Für organische Substanzen werden bei Anwendung der bisherigen Methode die Signalbreiten der intramolekularen und intermolekularen Beiträge zu der PDF-Kurve falsch wiedergegeben, dies führt zu einer schlechten Anpassung der simulierten PDF-Daten and die experimentellen PDF-Daten. Deshalb wurde ein neuer Ansatz entwickelt, in welchem für die Berechnung der intramolekularen Beiträge zum PDF-Signal ein anderer isotroper Auslenkungsparameter verwendet wurde, als bei der Berechnung der intermolekularen Beiträge zum PDF-Signal. Mit diesem Ansatz konnte eine sehr gute Simulation der PDF-Kurve für alle Testbeispiele erzielt werden. Zur Strukturverfeinerung organischer Substanzen anhand von PDF-Daten wurden zwei Ansätze entwickelt: der Rigid-Body-Ansatz zur Behandlung starrer organischer Moleküle und der Restraint-Ansatz zur Behandlung flexibler organischer Moleküle.
Neben methodischen Entwicklungen wurden in dieser Arbeit zwei weitere Untersuchungen organischer Verbindungen mittels PDF-Analyse durchgeführt.
Es wurden drei, auf unterschiedliche Weise hergestellte, amorphe Proben des Wirkstoffes Telmisartan untersucht. Des Weiteren wurde mittels PDF-Analyse eine pharmazeutische Nanosuspension untersucht.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Inhibitoren der bakteriellen Resistenzproteine New Delhi Metallo-β-Lactamase 1 (NDM-1), die beiden Mutanten der Verona-Integron Encoded Metallo-β-Lactamase 1 und 2 (VIM-1, bzw. -2), sowie die Imipenemase 7 (IMP-7) entwickelt.
Auf Grund natürlicher Selektion, aber vor allem auch bedingt durch den unüberlegten und verschwenderischen Einsatz von β-Lactam-Antibiotika, ist eine weltweite Zunahme an multiresistenten Erregern zu beobachten. Einer der Hauptgründe dieser Resistenzen sind die Metallo- β-Lactamsen (MBL), welche vor allem in Gramnegativen Bakterien vertreten sind und für die Hydrolyse und damit der Desaktivierung der β-Lactam-Wirkstoffe verantwortlich sind. Neben der Suche nach anderweitig wirkenden Antibiotika, ist die Entwicklung von Inhibitoren der MBLs von vordringlicher Bedeutung.
Basierend auf der Grundstruktur des ACE-Hemmers Captopril, wurden trotz synthetischer Herausforderungen erfolgreich mehrere Strukturen mit inhibitorischer Aktivität gegenüber den MBLs synthetisiert. Der Prolinring von Captopril wurde in einer neuen Variante der Captopril-Synthese durch verschiedene Ring- und nicht cyclische Teilstrukturen ersetzt. Durch die Entwicklung einer Schutzgruppenstrategie, konnte die Ringstruktur durch einen Piperazin-Rest ersetzt werden. Dies erlaubt es, die Molekülstruktur auf dieser Seite zu erweitern. Des Weiteren wurde eine neue Syntheseroute etabliert, welche es auf elegante Weise ermöglicht, weitere Derivatisierungen an der Methylgruppe des Captoprils durchzuführen.
In einem proteinbasierten Testsystem wurden die synthetisierten Substanzen auf ihr inhibitorisches Potential hin untersucht. Dabei wurden IC50-Werte im niedrig einstelligen mikromolaren, für drei Verbindungen sogar im sub-mikromolaren Bereich ermittelt. Die erhaltenen Ergebnisse wurden für die drei aktivsten Inhibitoren durch eine Erhöhung des Schmelzpunktes in einem TSA-Testsystem erfolgreich verifiziert. Mittels ITC-Untersuchungen konnte die unterschiedlichen Gewichtungen der entropischen und enthalpischen Beiträge zur Bindung der Inhibitoren an die untersuchten MBLs aufgezeigt werden. Hierdurch konnten die scheinbar widersprüchlichen Ergebnisse der ermittelten IC50-Werte und Schmelzpunktverschiebungen für die Verbindung DBDK48 bezüglich der NDM-1 aufgeklärt werden.
Die Strukturen DB320 konnte erfolgreich mit VIM-2 co-kristallisiert werden. Dies ermöglicht eine genauere Untersuchung und qualifizierte Aussagen über die Bindungsverhältnisse zwischen Protein und Ligand.
Für zwei der synthetisierten Inhibitoren sollte untersucht werden, ob deren Aktivität in vitro auch in Bakterien erhalten bleibt. Dazu wurden pathogene klinische Isolate und Laborstämme, welche mit dem Resistenzplasmid transfiziert wurden, und gegen Imipenem resistent sind, herangezogen. Durch die Zugabe der Inhibitoren konnte die Wirksamkeit von Imipenem wiederhergestellt werden.
Es konnte eine HPLC-Methode etabliert werden, welche eine Abschätzung der Polaritäten in Abhängigkeit der Retentionszeiten erlaubt. Dadurch konnte ein direkter Zusammenhang zwischen der Polarität der Verbindungen und dem Grad der Wirksamkeit im MIC-Testsystem aufgezeigt werden.
Durch die Untersuchung der Inhibitoren auf die Proteine ACE und LTA4H, konnten zwei Ziel-Proteine der Captopril-Grundstruktur als unerwünschte Nebenziele ausgeschlossen werden. Des Weiteren führte die Behandlung von U937-Zellen, selbst bei einer hohen Konzentration von 100 µM, weder zu Auffälligkeiten in einem WST-1 Assay, noch zu einer erhöhten Freisetzung von LDH. Daher kann davon ausgegangen werden, dass die Verbindungen über keine zytotoxischen Eigenschaften verfügen.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Dynamik zweier grundlegend verschiedener, deaktivierender Mechanismen von Retinalproteinen untersucht. In einem dritten Projekt wurde die Photodynamik einer Dreifachmutante von visuellem Rhodopsin erforscht, von der eine Mutation zu kongenitaler (angeborener) Nachtblindheit führt und zwei andere Mutationen das Protein über eine Disulfidbrücke stabilisieren. Die Ergebnisse dieser drei Projekte sind im Folgenden zusammengefasst.
Die Aktivität des mikrobiellen Proteorhodopsins als lichtgetriebene Protonenpumpe kann photoinduziert unterbunden werden. Dies erfolgt durch die Absorption von blauem Licht durch das Retinal bei deprotonierter Schiff‘schen Base. Vor dieser Arbeit war allerdings nur wenig über den Mechanismus und die Kinetik dieses Effekts bekannt. Das einzige Retinalprotein, an dem diese Deaktivierungsdynamik auf molekularer Ebene zeitaufgelöst untersucht wurde, ist Bakteriorhodopsin. Doch auch an diesem System wurde die ultraschnelle Primärreaktion in der photoinduzierten Deaktivierungsdynamik - die Photoisomerisierung des 13-cis-Retinals - bisher nicht zeitaufgelöst gemessen.
In dieser Arbeit wurde ein Weg gefunden, diesen Prozess auf einer Sub-Pikosekundenzeitskala zu detektieren. Dazu wurde eine Proteorhodopsinmutante genutzt, in der der primäre Protonendonor E108 durch Glutamin ersetzt ist. Diese Mutante weist eine signifikante Erhöhung der Lebensdauer des M-Intermediats auf. Im photostationären Gleichgewicht führt diese veränderte Kinetik zu einer erheblich erhöhten Akkumulation des Proteins im M-Zustand, die ausreicht, um photoinduzierte Absorptionsänderungen der Deaktivierungsdynamik sowohl im sichtbaren als auch im mittleren Infrarotbereich auf ultrakurzer Zeitskala zu detektieren. Dieses Projekt erfolgte in Kooperation mit dem Arbeitskreis Glaubitz (Goethe-Universität Frankfurt am Main).
Es zeigte sich, dass die Anregung des Retinals von Proteorhodopsin im M-Zustand zur Isomerisierung von 13-cis zu all-trans führt, die nach wenigen Pikosekunden abgeschlossen ist. Der zweite und abschließende Schritt ist die Reprotonierung der Schiff'schen Base. Es stellte sich heraus, dass dieser Prozess auf einer Nanosekundenzeitskala abläuft und über einen Protonentransfer vom primären Protonenakzeptor D97 zur Schiff'schen Base ermöglicht ist.
Die in dieser Arbeit vorgestellte Methodik zur Untersuchung der deaktivierenden Photodynamik von Proteorhodopsin auf ultraschneller Zeitskala, könnte in Zukunft auf weitere mikrobielle Rhodopsine angewandt werden. So ist die Studie der Deaktivierungsdynamik von Channelrhodopsinen von großem Interesse für optogenetische Anwendungen. Eine lichtgesteuerte Kontrolle der Ionenkanalöffnung und -schließung sollte die Präzision in der Regulierung ionischer Permeation erheblich verbessern.
Die Proteorhodopsinmutante E108Q wurde außerdem in ihrer primären Photodynamik sowohl bei grünem als auch blauem Anregungslicht untersucht. Es zeigte sich in beiden Fällen eine Dynamik, die der des Wildtyps sehr ähnlich ist. Eine Beobachtung unterscheidet sich jedoch wesentlich vom Wildtyp. Das K-Intermediat der E108Q-Mutante scheint nach einigen hundert Pikosekunden zumindest partiell zu zerfallen, woraufhin sich eine Signatur im blauen Spektralbereich bildet. Blitzlichtphotolysemessungen lassen vermuten, dass diese blau absorbierende Species im zwei- bis dreistelligen Nanosekundenbereich wieder zerfallen sein muss.
Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit dem Photozerfall von visuellem Rhodopsin. Es ist bekannt, dass die Signaltransduktion durch Wechselwirkung zwischen aktiviertem Rhodopsin und Arrestin unterbunden wird. Im ersten Abschnitt wurde der Einfluss der Arrestin-1-Variante p44 auf die Photodynamik visuellen, bovinen Rhodopsins untersucht. In einer Kooperation mit dem Arbeitskreis Schwalbe (Goethe-Universität Frankfurt am Main) konnte gezeigt werden, dass Arrestin erheblichen Einfluss auf die Zerfallsdynamik von Meta II und Meta III hat. Es wurde festgestellt, dass die Wechselwirkung von p44 mit photoaktiviertem Rhodopsin eine erhöhte Population des Intermediats Meta III bewirkt, mit der Folge einer zweifach langsameren Freisetzungskinetik des all-trans-Retinals. Diese Beobachtung weist auf eine physiologische Rolle des Zustands Meta III in der Retinalhomöostase hin.
Gegenstand einer zweiten Studie mit dem Arbeitskreis Schwalbe ist zum einen die Rhodopsinmutation G90D, die mit kongenitaler (angeborener) stationärer Nachtblindheit zusammenhängt, und zum anderen die Doppelmutation N2C und D282C, die zur Ausbildung einer stabilisierenden Disulfidbrücke zwischen den im extrazellulären Bereich eingeführten Cysteinen führt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Photodynamik des Wildtyps, der Doppelmutante und der stabilisierten G90D-Mutante (Mutationen G90D, N2C und D282C) sowohl auf einer ultrakurzen Zeitskala als auch auf einer Minutenskala untersucht.
Die Verarbeitung während des Hörprozesses von Säugetieren verläuft von der Kochlea mit den inneren und äußeren Haarsinneszellen (äHZ) über afferente Nervenbahnen bis zum auditorischen Kortex (AK). Die daran beteiligten Schaltstationen und deren Funktion sind überwiegend aufgeklärt. Die Hörbahn ist zudem in besonderer Weise durch efferente Rückkopplungen gekennzeichnet, die interne Modulationen sowie sekundäre Reaktionen auf den Reiz ermöglichen. Anatomisch betrachtet verlaufen efferente Projektionen vom AK zu sämtlichen am Hörprozess beteiligten Kerngebieten. Vom Olivenkomplex erfolgt über mediale und laterale Fasern eine Innervation der äHZ bzw. des Hörnervs. Trotz der gut beschriebenen Anatomie ist die funktionelle Beziehung zwischen dem AK und der Peripherie weitgehend ungeklärt. In der vorliegenden Arbeit wurde der funktionelle Zusammenhang vom AK zu den äHZ in der mongolischen Wüstenrennmaus untersucht. Dafür wurde entweder eine pharmakologische Blockierung der Kortexaktivität durch den Natriumkanalblocker Lidocain erzeugt oder eine Aktivierung der Kortexaktivität durch die Anwendung elektrischer Reize ausgelöst. Der Einfluss der Manipulationen wurde in der Kochlea mittels Messungen von Distorsionsprodukt-otoakustischen Emissionen (DPOAE) erfasst. Diese entstehen durch die nichtlineare Verstärkung leiser Schallsignale durch die äHZ zur Erzielung hoher Sensitivität und Frequenzauflösung. Die DPOAE treten als kubische (z. B. 2f1-f2) und quadratische (z. B. f2-f1) Verzerrungen auf und geben Aufschluss über unterschiedliche Parameter der äHZ-Verstärkungsfunktion.
Die Lidocainversuche wurden entweder kontra- oder ipsilateral zur DPOAE-Messung durchgeführt. In beiden Konstellationen traten nach der Lidocaininjektion Erhöhungen und Verringerungen der DPOAE-Pegel im Vergleich zur Basismessung oder unveränderte DPOAE-Pegel auf. Im Mittel lagen die Pegeländerungen bei ca. 11 dB, in Einzelfällen betrugen sie bis zu 44,8 dB. In den Gesamtdaten waren die Effekte nach kontralateraler Injektion oft signifikant größer als nach ipsilateraler Injektion. Ebenso waren die Effekte in der 2f1-f2 Emission meist signifikant größer als in der f2-f1 Emission. Zudem wurde beobachtet, dass signifikant größere Effekte bei einer Stimulation mit Pegeln von 60/50 dB SPL im Vergleich zu 40/30 dB SPL erreicht wurden. Grundsätzlich trat in allen Datensätzen eine Reversibilität der DPOAE-Pegel mit zunehmender Versuchsdauer auf. Die Effekte waren direkt nach der Injektion am größten und erreichten je nach Stimuluspegel und Emissionstyp nach 28-100 min die Basispegel. In keinem der Datensätze lag eine Abhängigkeit der im Kortex gereizten charakteristischen Frequenz (CF) zum betroffenen Frequenzbereich in der Kochlea vor. Die Effekte waren über den gesamten gemessenen Frequenzbereich von 1-40 kHz nachweisbar. Allerdings waren die Frequenzbereiche von 1-10 kHz und 30,5-40 kHz besonders stark von der Lidocaininjektion betroffen.
Auch nach der elektrischen Reizung wurden die drei oben beschriebenen Effekttypen definiert. Mit 54,6 % war der Prozentsatz unveränderter DPOAE-Pegel allerdings sehr hoch. In den anderen beiden Kategorien konnten zusätzlich Differenzierungen im zeitlichen Verhalten der DPOAE-Pegel vorgenommen werden. In 21,6 % bzw. 16,5 % der Datensätze waren die Verringerungen bzw. Erhöhungen bis zum letzten gemessenen Zeitpunkt nach der elektrischen Reizung irreversibel und nur in jeweils 2,8 % der Datensätze war eine Reversibilität zu verzeichnen. In diesen Fällen war die Effektdauer mit im Mittel 31 bzw. 25 min kürzer als in den Lidocainversuchen. Auch die Effektstärken waren mit maximal 23,9 dB und je nach Effekttyp im Mittel 5,1-13,7 dB geringer als nach der Lidocaininjektion. Die größten Effekte traten in einem mittleren Stimuluspegelbereich von 45-55 dB SPL auf. Wiederum konnte keine Abhängigkeit des betroffenen Frequenzbereichs von der kortikal gereizten CF nachgewiesen werden. In Einzelfällen waren auf DPOAE-Ebene nur die Frequenzen ober- und unterhalb der kortikalen CF beeinflusst, wohingegen bei der CF selbst keine Effekte auftraten.
Durch Kontrollexperimente (Salineinjektion bzw. Einführen der Elektrode ohne elektrische Reizung) konnte nachgewiesen werden, dass die Effekte durch die Manipulation der Kortexaktivität hervorgerufen wurden. Somit liegt eine funktionelle Beziehung zwischen dem AK und der Peripherie vor, die langanhaltende massive Ausmaße annehmen kann. Die Effektrichtung ist vermutlich durch die exzitatorisch oder inhibitorisch wirkenden Neurone vom Colliculus inferior zum Olivenkomplex bedingt. Die größeren Effekte in der kontralateralen Konfiguration lassen sich durch die Diskrepanz in der Anzahl der gekreuzten (2/3) und ungekreuzten (1/3) medialen Efferenzen erklären. Die kubischen Komponenten der äHZ-Verstärkungsfunktion scheinen stärker beeinflusst zu sein als die quadratischen Komponenten, was in größeren Pegeländerungen in der 2f1-f2 Emission resultiert. Die teils großen Effektstärken sowie die nicht vorhandene Frequenzabhängigkeit zwischen AK und Kochlea sind vermutlich auf den großen Kortexbereich zurückzuführen, der von den gewählten Injektionsvolumina bzw. elektrischen Reizstärken betroffen war. Die großen Effekte im mittleren Stimuluspegelbereich lassen sich sowohl mit einer möglichen Schutzfunktion der Efferenzen vor zu lauten Schallereignissen als auch mit einer Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses zur erleichterten Detektion akustischer Signale in Einklang bringen. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die Aktivität des AK einen starken Einfluss auf periphere auditorische Mechanismen hat, wodurch die kochleäre Verarbeitung akustischer Signale je nach kortikalem Verarbeitungsstatus massiv modifiziert werden kann.
Fossile Rohstoffe dienen in unserer heutigen Gesellschaft als Energiequelle und als Rohstofflieferant für Grund-, Feinchemikalien und Pharmazeutika. Sie tragen jedoch zum Klimawandel und Umweltverschmutzung bei. Lignocellulosische Biomasse ist eine erneuerbare und nachhaltige Alternative, die durch biotechnologische Prozesse erschlossen werden kann. Die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae ist ein sehr gut untersuchter Modellorganismus, für den es zahlreiche genetische Werkzeuge und Analysemethoden gibt. Zudem wird S. cerevisiae häufig in biotechnologischen Prozessen eingesetzt, da diese Hefe robust gegenüber industriellen Bedingungen wie niedrigen pH-Werten, toxischen Chemikalien, osmotischem und mechanischem Stress ist. Die Pentose D-Xylose ist ein wesentlicher Bestandteil von lignocellulosischer Biomasse, die aber nicht natürlicherweise von der Bäckerhefe verwerten werden kann. Für eine kommerzielle Herstellung von Produkten aus lignocellulosischer Biomasse muss S. cerevisiae D-Xylose effektiv verwerten. Für die Bäckerhefe konnten heterologe Stoffwechselwege etabliert werden, damit diese D-Xylose verwerten kann. Für eine effiziente Xyloseverwertung bleiben dennoch zahlreiche Herausforderungen bestehen. Unter anderem nehmen die Zellen D-Xylose über ihre endogenen Hexosetransporter nur langsam auf. Die heterologe Xylose-Isomerase (XI) besitzt in S. cerevisiae eine geringe Aktivität für die Isomerisierung von D-Xylose. Unspezifische Aldosereduktasen konkurrieren mit der Xylose-Isomerase um das gleiche Substrat und produzieren Xylitol, ein starker Inhibitor der Xylose-Isomerase. Eine Möglichkeit die Umsatzrate von Enzymen zu steigern und Substrate vor Nebenreaktionen zu schützen, ist die Anwendung von Substrate Channeling Strategien. Bei Substrate Channeling befinden sich die beteiligten Enzyme in einem Komplex, wodurch die Substrate lokal angereichert werden und von einem aktiven Zentrum zum nächsten weitergeleitet werden, ohne Diffusion in den restlichen Reaktionsraum. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob ein Komplex zwischen einem membranständigen Transporter und einem löslichen Enzym konstruiert werden kann, um durch Substrate Channeling eine verbesserte Substrat-Verwertung zu erreichen. Die Xylose-Isomerase aus C. phytofermentans und die endogene Hexose-Permease Gal2 sollten in dieser Arbeit als Modellproteine in S. cerevisiae-Zellen mit Hilfe von Protein-Protein-Interaktionsmodulen (PPIM) in räumliche Nähe zueinander gebracht werden.
Die Expression verschiedener PPIM konnte in S. cerevisiae mittels Western Blot nachgewiesen werden. Auch Fusionsproteine aus unterschiedlichen PPIM wurden in dieser Hefe exprimiert. Die PPIM binden komplementäre PPIM oder kurze Peptidliganden, welche an die Xylose-Isomerase und an den Gal2-Transporter fusioniert wurden. Die Funktionalität beider Proteine wurde mittels in vivo und in vitro Tests untersucht. Die Xylose-Isomerase mit N-terminalen Liganden des WH1-Protein-Protein-Interaktionsmoduls (WH1L-XI) und der Gal2-Transporter mit N-terminalen SYNZIP2-Protein-Protein-Interaktionsmodul (SZ2-Gal2) erwiesen sich als geeignete Kandidaten für weitere Untersuchungen. Mittels indirekter Immunfluoreszenz konnte die Ko-Lokalisierung von SZ2-Gal2 und WH1L-XI, die einander über ein Scaffold-Protein binden, nachgewiesen werden.
Transformanten, in denen ein Komplex aus Transporter, Scaffold-Protein und Xylose-Isomerase gebildet wurde, zeigten bessere Fermentationseigenschaften gegenüber der Scaffold-freien Kontrolle und dem Wildtyp: Sie verwerteten Xylose schneller, bildeten weniger vom unerwünschten Nebenprodukt Xylitol, produzierten mehr Ethanol und wiesen eine höhere Ethanolausbeute auf. Der beobachtete Substrate Channeling Effekt kompensierte die geringere Enzymaktivität der WH1L-XI im Vergleich zum Wildtyp-Protein. Die Wirksamkeit des Substrate Channeling wurde verringert, wenn die Bildung des Komplexes aus Transporter, Scaffold-Protein und Xylose-Isomerase gestört wurde, indem ein getaggtes GFP mit dem Scaffold-Protein um die Bindungsstelle an Gal2 konkurrierte. Dies zeigt, dass die positive Wirkung auf die Komplex-Bildung zwischen XI und Gal2 zurück zu führen ist. Die Fermentationseigenschaften konnten gesteigert werden, indem der zuvor zwischen SZ2-Zipper und Gal2-Transporter verwendete Linker, der aus zehn Aminosäuren von Glycin, Arginin und Prolin (GRP10) bestand, durch einen aus Glycin und Alanin (GA10) ersetzt wurde. Die verbesserten Fermentationseigenschaften beruhten auf einem Substrate Channeling Effekt und einer gesteigerten Aufnahmerate des SZ2-GA10-Gal2-Transporters. Ein Vergleich der Strukturvorhersagen von SZ2-GRP10-Gal2 und SZ2-GA10-Gal2 zeigte, dass der GRP10-Linker einen unstrukturierten, flexiblen Linker ausbildet, während der GA10-Linker eine starre α-Helix ausbildet. Die Struktur und der Transportprozess von Gal2 sind nicht aufgeklärt. Bei verwandten Transportern geht man davon aus, dass Substrate durch Konformationsänderungen ins Innere der Zelle transportiert werden, indem die beiden Domänen gegeneinander klappen. Die α-Helix könnte die Geschwindigkeit der Konformationsänderungen begünstigen.
Durch Kontrollexperimente konnte ausgeschlossen werden, dass die gesteigerten Fermentationseigenschaften eine Folge der Stabilisierung der XI- und Gal2-Fusionsproteine durch das Anfügen des Liganden oder durch Komplexbildung mit dem Scaffold-Protein waren. Substrate Channeling zwischen Gal2 und XI entsteht durch die Komplexbildung mit dem Scaffold-Protein, wodurch sich Gal2 und XI in räumlicher Nähe zueinander befinden. Dieser Effekt beruht möglicherweise zusätzlich aufgrund einer hohen örtlichen Ansammlung dieser Proteine, da die tetramere XI weitere Scaffold-Proteine binden könnte, welche weitere Gal2-Transporter binden könnte. Darüber hinaus sammeln sich Transporter an bestimmten Orten der Membran an und Transporter mit ähnlicher oder gleicher Transmembransequenz tendieren dazu zu ko-lokalisieren. Hierdurch könnten Gal2-XI-Agglomerate entstehen und Xylose wird mit hoher Wahrscheinlichkeit von einer der vielen Xylose-Isomerasen umgesetzt.
In dieser Arbeit wurde der Hefepilz Xanthophyllomyces dendrorhous als vielseitige biotechnologische Plattform für die Produktion von Carotinoiden verwendet. Durch genetische Modifikationen der Carotinoidbiosynthese wurde ein Astaxanthin-Hochproduzent zur Akkumulation des farblosen Phytoens, das die menschliche Haut vor der schädlichen Wirkung der UV-Strahlung schützt und des gelben Zeaxanthins, das zur Förderung und Erhalt der Sehfähigkeit beiträgt, befähigt. Zur Generierung eines Phytoen-Hochproduzenten wurde das Gen crtI (Phytoen-Desaturase) inaktiviert und der Phytoengehalt durch Überexpression der Gene HMGR, crtE und crtYB gesteigert. Die Generierung eines Zeaxanthin-Hochproduzenten beinhaltete die Inaktivierung des Gens asy (Astaxanthin-Synthase) und die heterologe Expression einer bakteriellen ß-Carotin-Hydroxylase CrtZoXd.
Die Inaktivierung der Gene erfolgte mit spezifischen Knock-Out-Konstrukten, die mittels homologer Rekombination in crtI oder asy integrierten. Nachdem die Transgene auf Vektoren mit verschiedenen Antibiotikaresistenzen kloniert wurden, wurde die Überexpression durch genomische Integration in die ribosomale DNA erreicht. Anschließend wurde die Carotinoidzusammensetzung der Zellextrakte durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie an einer C18-Trennsäule oder durch Dünnschichtchromatographie bestimmt. Der Knock-Out-Nachweis erfolgte mittels Polymerase-Kettenreaktion und Amplifikation der Genloci, während die Anzahl integrierter Carotinoidgene durch quantitative Real-Time-PCR bestimmt wurde. Die Kultivierungen von X. dendrorhous wurden sowohl in Schikanekolben als auch in einem 2L-Bioreaktor durchgeführt.
Im Zuge der genetischen Modifikationen konnte der Ploidiegrad des Wildtyps bestimmt werden, der bis dahin unbekannt war. Durch das Auftreten von instabilen heterozygoten Stämmen und deren Überführung zu stabilen Homozygoten wurde die Existenz eines diploiden Genoms nachgewiesen. Um die für die biotechnologische Anwendung notwendige Stabilität der Carotinoidbiosyntheseleistung zu erreichen, wurden zwei Strategien entwickelt. Hierbei erfolgte die Stabilisierung der Stämme als Folge mitotischer Rekombination nach Subkultivierung und anschließender Farbselektion oder durch Induktion des sexuellen Zyklus und Sporulation.
Der crtI-Knock-Out führte zur Akkumulation von 3,6 mg/g dw Phytoen. Anschließend wurde die Limitierung der Phytoensynthese durch crtYB-Überexpression aufgehoben und die Versorgung der Carotinoidbiosynthese mit Vorläufermolekülen durch HMGR- und crtE-Überexpression erhöht. Im Bioreaktor wurde durch die Anwendung eines dreistufigen Fed-Batch-Prozesses, der eine effiziente Glucoseverwertung sicherstellte, mit 10,4 mg/g dw die höchste bis dato publizierte zelluläre Phytoenkonzentration im stabilisierten Hochproduzenten erreicht.
Der asy-Knock-Out führte zur Akkumulation von 4,5 mg/g dw ß-Carotin, das anschließend durch heterologe Expression der codon-optimierten ß-3,3-ß-Hydroxylase crtZoXd im Hochproduzenten zu 3,5 mg/g dw Zeaxanthin umgesetzt wurde. Zur Optimierung des Vorgehens wurden Knock-In-Konstrukte entwickelt, mit denen beide Schritte (Knock-Out und Integration von Carotinoidgenen) in nur einem molekular-biologischen Schritt durchgeführt und 94 % des in einem Wildtypstamm vorhanden ß-Carotins zu Zeaxanthin umgesetzt wurden. Die Optimierung der Wachstumsbedingungen bei der Bioreaktor-Kultivierung des stabilisierten Zeaxanthinproduzenten führte mit 10,8 mg/L zu einem 5-fach höheren Zeaxanthingehalt im Vergleich zur Schikane-Kultivierung.
Durch den Einsatz der Pentosen Arabinose und Xylose als alternative Kohlenstoffquellen wurde der Carotinoidgehalt der Phytoen- und Zeaxanthin-Hochproduzenten um 70 bzw. 92 % im Vergleich zur Glucose-Kultivierung gesteigert, wobei die Gründe für diesen Effekt in einer stärkeren Kohlenstoffverwertung und der Hemmwirkung von Glucose vermutet wurden. Aus verschiedenen pflanzlichen Abfallstoffen kann Xylose durch Hydrolyse freigesetzt werden, deren Nutzung zum Aufbau einer nachhaltigen und kostengünstigen biotechnologischen Carotinoidproduktion beitragen kann.
Darüber hinaus wurden multioxigenierte Zeaxanthinderivate, von denen eine positive Wirkung auf die menschliche Gesundheit vermutet wird, durch kombinatorische Biosynthese erhalten. Durch die schrittweise Integration der Gene crtZoXd, crtG (ß-2,2-Hydroxylase) und bkt (ß-4,4-Ketolase) in eine ß-Carotinmutante wurde die Biosynthese von Zeaxanthin, Nostoxanthin und schließlich von 4-Keto-Nostoxanthin und 4,4-Diketo-Nostoxanthin erreicht. Anschließend erfolgte die chemische Reduktion zu den neuartigen Carotinoiden 4-Hydroxy-Nostoxanthin und 4,4-Dihydroxy-Nostoxanthin und der zweifelsfreie Nachweis aller vier Carotinoide anhand der mittels Massenspektrometrie bestimmten Molekülmassen und Fragmentierungsmuster.
Die mitochondriale Innenmembran (IM) besteht aus zwei Subkompartimenten. Der Cristae Membran (CM) und der inneren Grenzmembran (IBM), welche durch die runden und schlitzartige Strukturen der Christa Junctions (CJs) verbunden werden Der MICOS-Komplex ist an den CJs lokalisiert und besteht aus mindestens 6 Komponenten, Mic60, Mic27, Mic26, Mic19, Mic12 und Mic10. Es ist bekannt, dass der MICOS-Komplex essentiell für die Stabilität der CJs ist. Die in dieser Arbeit gezeigten Ergebnisse, geben Aufschluss darüber, wie sich einzelne MICOS-Komponenten auf die Stabilität von Cristae und CJs im Modellsystem Hefe (S cerevisiae) auswirken. Zu Beginn dieser Arbeit war zum einen bekannt, dass die MICOS-Komponente Mic60 essentiell für die Bildung von CJs ist. Zum Anderen wurden im Vorfeld dieser Arbeit Interaktionen von Mic60 mit Proteinen in der mitochondrialen Außenmembran, vor allem Proteinkomplexe mit β-barrel-Proteinen identifiziert. Diese Interaktionen werden über den evolutionär, konservierten C-Terminus von Mic60 vermittelt.
β-barrel Proteine besitzen eine charakteristische Peptidsequenz, die β-Sequenz. Diese dient nach dem Import der β-barrel Proteine in die Mitochondrien als Signalpeptid für den SAM-/TOB-Komplex, welcher daraufhin die Proteine in die Außenmembran insertiert. In dieser Arbeit wurde ebenfalls eine β-Sequenz im C-Terminus von Mic60 identifiziert, diese zeigte einen Einfluss auf die Cristae-Stabilität. Zellen die eine Mic60-Variante mit einer Deletion oder Punktmutation der β- Domäne exprimieren, zeigten eine reduzierte Anzahl an CJs. Auch das Verkürzen des C-Terminus von Mic60 hatte diesen Effekt auf die mitochondriale Ultrastruktur. So konnte gezeigt werden, dass die β-Domäne und die Integrität des C-Terminus essentiell für die Stabilität von CJs sind.
Der Fokus dieser Arbeit lag in der Charakterisierung der MICOS-Komponenten Mic26 und Mic27. Es konnte bewiesen werden, dass beide Proteine genetisch mit der MICOS-Kernkomponente Mic60 interagieren. Die Untersuchung der mitochondrialen Ultrastruktur von Δmic26- und Δmic27-Zellen zeigte, dass eine Deletion vom Mic26 keinen Einfluss auf die Organisation der mitochondrialen Innenmembran hat. Im Gegensatz dazu, ist im Vergleich zum Wildtyp die Anzahl an CJs in Δmic27-Zellen um zwei Drittel reduziert. Auch die Innenmembranoberfläche ist in diesen Zellen stark vergrößert. Die Untersuchung der Morphologie der mitochondrialen Innenmembran in Zellen ohne Mic27 durch Kryo-Elektronentomographie isolierter Mitochondrien, veranschaulichte die Struktur der CJs in diesen Zellen genauer. Es zeigten sich hier breitere CJs, und der Übergang von der Cristaemembran in den Bereich der inneren Grenzmembran ist sehr flach und undefiniert. In Wildtyp-Mitochondrien waren die CJs schmal und schlitzartig und haben einen scharfkantigen Übergang von der Cristaemembran zur inneren Grenzmembran. Des Weiteren wies die Cristaemembran in Δmic27-Zellen unregelmäßige zackige Strukturelemente auf, was auf eine Anhäufung an Dimeren der F1FO-ATP Synthase hinweist.
Diese Beobachtungen in den Kryo-Tomogrammen, wurde durch Analysen des Oligomerisierungszustands der F1FO-ATP Synthase in Δmic27-Zellen, bestätigt. Hier fanden sich deutlich weniger höhere Oligomere und vermehrt Dimere. So kann aus diesen Befunden geschlossen werden, dass Mic27 die Oligomere der F1FO-ATP Synthase stabilisiert.
Um zu untersuchen, wie der MICOS-Komplex mit der F1FO-ATP Synthase in Verbindung steht, wurde mittels 2D-BNE-Analysen und einem Complexome Profiling die Komplexierung der nativen Komplexe in Wildtyp- und Δmic27-Mitochondrien analysiert. Zum einen konnte durch diese Untersuchungen gezeigt werden, dass Mic27 neben der F1FO-ATP Synthase auch stabilisierend auf den MICOS-Komplex wirkt. Die Komplexe im hochmolekularen Bereich der MICOS-Komponenten zerfielen in Δmic27-Zellen, was darauf hinweist, dass die anderen MICOS-Komponenten hier nicht mehr assemblieren können. Mic10 war die einzige MICOS-Komponente die in Δmic27-Zellen noch stabile Komplexe im hohen Massenbereich ausbildete. Mic10 findet sich zudem nicht nur in Klustern mit anderen MICOS-Komponenten sondern auch mit der F1FO-ATP Synthase.
Die Interaktion von Mic10 und der F1FO-ATP Synthase wurde auch biochemisch, mittels chemischer Quervernetzern und Ko-Immunpräzipitationsexperimenten bestätigt. Dies legt nahe, dass Mic10 die CJs mit hoher Wahrscheinlichkeit, durch die Verbindung mit der F1FO-ATP Synthase, mit der Cristaemembran verbindet und so stabilisiert.
Aufgrund der Erkenntnisse dieser Arbeit konnte ein neuartiges Modell postuliert werden. Die MICOS-Komponente Mic60 stabilisiert die CJs durch eine Interaktion seines C-Terminus mit Proteinen in der Außenmembran. Mic27 vermittelt über Mic10 die Interaktion zur F1FO-ATP Synthase. Somit ist diese neu identifizierte Interaktion des MICOS-Komplex zur F1FO-ATP Synthase essentiell für die Stabilität von CJs ist, indem es den MICOS-Komplex mit den Oligomeren der F1FO-ATP Synthase verbindet.
Die 5-LO ist ein Schlüsselenzym der LT-Biosynthese. Sie katalysiert in einem ersten Schritt zunächst die Umsetzung freigesetzter AA zu 5-HPETE und wandelt diese anschließend in LTA4 um. LT sind starke Entzündungsmediatoren, die an entzündlichen und allergischen Reaktionen des Körpers beteiligt sind. Sie lösen eine Immunantwort aus und können zur Entstehung von Asthma bronchiale, allergischer Rhinitis, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und verschiedenen Krebserkrankungen beitragen [28]. NFS gehören zur Klasse der michaelreaktiven Verbindungen und inhibieren die 5-LO durch Interaktion mit katalytisch aktiven Cysteinresten in der Nähe der Substrateintrittspforte. Diese Tatsache macht michaelreaktive Verbindungen innerhalb der Entzündungsforschung zu einer interessanten Substanzklasse. Michaelreaktive Verbindungen besitzen eine durch Elektronenzug aktivierte Doppelbindung. Hierdurch verfügen diese Wirkstoffe über elekrophile Eigenschaften, wodurch sie leicht mit Nukleophilen reagieren können. Cysteine bestehen aus nukleophilen Thiolgruppen, die mit einer positiv polarisierten Doppelbindung, wie sie in michaelreaktiven Verbindungen vorliegt, reagieren können. Diese Tatsache kann sie zu effektiven und nachhaltigen Enzymaktivitätsmodulatoren machen. In dieser Arbeit wurde eine große Bandbreite verschiedenster michaelreaktiver Verbindungen auf ihre Fähigkeit untersucht, die 5-LO über Michael-Addition an ihren Cysteinen zu inhibieren. Zum einen wurden Pflanzeninhaltsstoffe mit antiinflammatorischen Eigenschaften, zugelassenene Wirkstoffe mit Michael-Akzeptorfunktion und zum anderen Verbindungen, die durch gezielte Struktursuche ausgewählt wurden, untersucht. Die Testung verschiedenster Strukturen sollte Aufschluss über strukturelle Voraussetzungen für die 5-LO-Inhibition durch Interaktion mit Cysteinen liefern. Hierfür wurden die Substanzen zunächst im intakten Zellsystem und schließlich am aufgereinigten Enzym (r5LO-wt) auf ihre 5-LO-inhibierenden Eigenschaften untersucht. Nachfolgende Messungen an r5LO-4C, deren vier prominente Cysteine durch Serin mutiert wurden, zeigten an, ob die Inhibition der 5-LO-Produktbildung cysteinabhängig war. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass ganz bestimmte strukturelle Eigenschaften des Michael-Akzeptors, Voraussetzung für eine Interaktion mit den Cysteinen der 5-LO sind. Vor allem Verbindungen mit chinoidem Grundgerüst stellten sich als thiolreaktive Verbindungen heraus, die die 5-LO hauptsächlich über Interaktion mit ihren Cysteinen inhibierten. Weiterhin zeigten die erhaltenen Ergebnisse, dass die strukturelle Umgebung um die aktivierte Doppelbindung des Michael-Akzeptors enorme Auswirkungen auf die Thiolreaktivität hatte. TQ hemmte die 5-LO hauptsächlich über Interaktion mit Cysteinen, wohingegen die 5-LO-Inhibition durch Embelin unabhängig von Cysteinen zu sein schien. Eine daraufhin durchgeführte MALDI-MS-Analyse bestätigte die Bindung von NAPQI und TQ an die Cysteine 416 und 418. Durch diese Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass eine Reihe antiinflammatorisch wirksamer, natürlich vorkommender Verbindungen wie TQ, Plumbagin, Primin und auch synthetisch generierte Verbindungen wie AA861, CDDO, Methyl-BQ, Methoxy-BQ, Methoxy-Nitrostyren, NAPQI und OH-BQ die 5-LO über Interaktion mit ihren Cysteinen inhibieren.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, vor- und nachbereitenden Unterricht zu Biodiversitätsführungen an den vier außerschulischen Lernorten Palmengarten, Senckenbergmuseum, Stadtwaldhaus und Zoo Frankfurt zu evaluieren. Durch den Unterricht mithilfe neu entwickelter Arbeitsmaterialien sollte die aktuelle Motivation der Schüler und weitere pädagogisch-psychologische Lernvariablen gefördert werden. Es stellte sich die Frage, ob so eine erhöhte Auseinandersetzung mit dem Themenkomplex Biodiversität erreicht werden kann und welche Einflussfaktoren dabei eine Rolle spielen.
Theoretische Grundlage war dabei das Risikowahlmodell der Leistungsmotivation nach Atkinson, das von Rheinberg zum handlungstheoretischen Modell der Motivation erweitert wurde (Rheinberg & Vollmeyer, 2012). Auf dieses bezieht sich der von Rheinberg et al. (2001) entwickelte und hier eingesetzte Fragebogen zur aktuellen Motivation (FAM).
Die Stichprobe setzte sich aus insgesamt 523 Schülern der Klassen 5 bis 9 zusammen. Davon nahm jeweils die Hälfte mit (Versuchsgruppe) und die andere ohne (Kontrollgruppe) vor- und nachbereitendem Unterricht an den Biodiversitätsführungen teil. Die Erhebung der aktuellen Motivation, des erworbenen Fachwissens und weiterer Variablen erfolgte in einem Pre/Post/Follow-Up-Design mit Fragebögen, deren Auswertung analytisch statistisch durgeführt wurde.
Es zeigte sich, dass in der Gesamtstichprobe die Teilnahme an der Biodiversitätsführung die aktuelle Motivation der Schüler erhöhte. Dauerhafte Lernparameter wie die Biologieeinstellung und die Interessenshandlung wurden jedoch nicht signifikant verändert. Ein eindeutiger Effekt der unterrichtlichen Vorbereitung konnte jedoch nicht ermittelt werden. Einzig beim gemessen Fachwissen zu den Führungsinhalten schnitt die Versuchsgruppe signifikant besser ab. Insgesamt wird angenommen, dass der Effekt des Besuchs des außerschulischen Lernortes an sich den Effekt der Vor- und Nachbereitung überdeckt oder vom Einfluss anderer Parameter beeinflusst wird. Hier stach besonders das Alter der Jugendlichen hervor, das vor allem in der hier evaluierten Schülergruppe bedingt durch die Pubertät eine große Rolle spielt. Weitere Einflussfaktoren waren die Biologieeinstellung und die Unterrichtsvariablen der Führung. In den Stichproben der einzelnen außerschulischen Lernorte zeigten sich leichte Abweichungen von der Gesamtstichprobe. Diese waren meist auf die leicht unterschiedliche Zusammensetzung der Stichproben zurückzuführen. Aber auch Besonderheiten der Lernorte hatten dabei ein bedeutendes Gewicht.
Bezüglich der Lernbedingungen für die Lernorte ließen sich aus den Ergebnissen vor allem zwei Komponenten ermitteln: Zum einen die Architektur/räumliche Struktur der Lernorte. Hier können Faktoren wie drinnen/ draußen, Größe und die räumliche Orientierung unterschieden werden. All dies hat Auswirkungen auf das physische Wohlbefinden der Schüler, was wiederum eine Voraussetzung für eine hohe Lernmotivation ist. Die andere Hauptkomponente ist das am Lernort behandelte Thema. Hier kann grob zwischen Pflanzen und Tieren unterschieden werden. Pflanzen wurden dabei in mehreren Studien von den Schülern als weniger attraktiv eingeschätzt. Trotzdem sollten aber die Möglichkeiten, auch botanische Themen außerhalb der Schule zu behandeln, von den Lehrkräften zur Vermittlung biologischer Vielfalt genutzt werden.
Als Konsequenz der Ergebnisse kann der Besuch eines außerschulischen Lernrotes im Biologieunterricht bezüglich der Förderung der Lernmotivation unbedingt empfohlen werden. Da kein klarer Effekt des vor- und nachbereitenden Unterrichts der Biodiversitätsführungen erkennbar war, wären hier weitere Untersuchungen vonnöten, um genauere Aussagen machen zu können. Hier böten sich Studien mit Schülern anderer Altersgruppen und der Vergleich nur zweier außerschulischer Lernorte an.
Weltweit sind ca. 130–180 Millionen Menschen mit HCV infiziert und jährlich sterben etwa 500.000 Menschen an dessen Folgen. Die neuartigen Therapien versprechen zwar eine sehr hohe Heilungsrate, sind aber aufgrund ihrer enorm hohen Kosten nur in Industrieländern verfügbar. Noch immer gibt es keine prophylaktische Vakzinierung gegen HCV. Deshalb ist es wichtig, den HCV-Lebenszyklus und die Interaktion zwischen Wirtszelle und Virus detailliert zu verstehen, um die Entwicklung von Therapien und Impfungen zu ermöglichen. Außerdem kann ein fundiertes Wissen von HCV translatiert werden und auf neuartige Erreger der Familie der Flaviviridae, wie Denguevirus und Zikavirus, angewendet werden. Während der Zelleintritt und die Replikation von HCV relativ gut charakterisiert sind, bleiben die Assemblierung und Freisetzung der viralen Partikel schlecht verstandene Schritte des HCV-Lebenszyklus. In dieser Arbeit sollte die Rolle des zellulären Proteins α-Taxilin im Lebenszyklus von HCV untersucht werden. In einer späteren Phase der Arbeit wurde der endosomale Freisetzungsweg von HCV untersucht. Dazu wurden HCV Varianten generiert und charakterisiert, die Fluoreszenz-Proteine im NS5A- und E1-Protein enthalten, durch die es möglich ist, den Replikationskomplex und die Viruspartikel zu visualisieren und zu quantifizieren und den viralen Lebenszyklus dadurch besser untersuchen zu können...
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der vergleichenden funktionalen Charakterisierung der E.coli Transporter LacY, FucP und XylE und des Glucose-Transporters GlcP aus Staphylococcus epidermidis sowie funktionsrelevanter Mutanten. Sie katalysieren in vivo den PMF-gekoppelten Zuckertransport und repräsentieren die major facilitator superfamily (MFS), einer der größten Transporter-Familien überhaupt. Die Studien wurden mithilfe einer elektrophysiologischen Methode auf Basis Festkörper-unterstützter Membranen (SSM) durchgeführt. Komplementär dazu wurden radioaktive Transportassays, fluorometrische Messungen, kinetische Simulationen und theoretische Berechnungen auf Basis der 3D-Strukturen durchgeführt. Experimentell bestimmte Zucker- und pH-Abhängigkeiten elektrogener steady-state und pre steady-state Reaktionen wurden verwendet, um ein allgemeingültiges kinetisches Modell aufzustellen.
Insgesamt konnten bei allen Transportern zwei elementare elektrogene Reaktionen identifiziert werden. Eine schnelle Zucker-induzierte Konformationsänderung wurde dem induced fit des Zuckermoleküls zugeordnet. Die Elektrogenität im steady-state wird dagegen durch den langsamen Transfer der negativ geladenen Protonenbindestelle bestimmt. Die für den Symport ratenlimitierende Reaktion ist abhängig von den äußeren Bedingungen wie pH-Werten, Zuckerkonzentrationen, Substrat-Spezies und Membranpotential meist die Konformationsänderung des leeren (P) oder des beladenen (PSH) Carriers, welche die Substratbindestellen im Zuge des Alternating Access über die Membran transferieren. Ein Wechsel zwischen hohen Protonenbindungs-pK-Werten und niedrigen Protonenfreisetzungs-pK-Werten durch weitere lokale Konformationsänderungen ist zentraler Bestandteil des Transportmechanismus. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die Kopplung zwischen Zucker- und Protonen-Translokation, die sich zwischen E.coli Transportern und GlcP strikt unterscheidet. In E.coli Transportern erfolgt eine kooperative Bindung von Zucker und Proton. Zudem erfolgt keine Konformationsänderung im Zucker-gebundenen, unprotonierten Carrier (PS). In GlcP ist die Kopplung erheblich reduziert. Der Transport-Modus selbst ist abhängig von den äußeren Bedingungen. So katalysiert GlcP abhängig vom pH-Gradienten Uniport, Symport oder Antiport.
Die vorliegende Arbeit leistet einen wichtigen Beitrag zum Verständnis des PMF-gekoppelten Zuckertransports und zeigt die Grenzen des für LacY formulierten 6-Zustands-Modells mit nur zwei Konformationsänderungen auf. Ein erweitertes 8-Zustands-Modell mit vier Konformationsänderungen, die unterschiedliche Ratenkonstanten aufweisen können, erklärt sowohl Symport, Antiport als auch Uniport und berücksichtigt zudem die zahlreichen Ergebnisse für LacY aus der Literatur.
In der vorliegenden Arbeit werden funktionale Details der Okklusion während der Mastikation bei ausgewählten fossilen und rezenten Primaten quantitativ vergleichend untersucht. Dazu wurden die Okklusionsflächen von antagonistischen Molarenpaaren mit modernen virtuellen Verfahren eingescannt und anhand von 3D Kronenmodellen kartiert und funktional ausgewertet. Die in der Forschergruppe DFG FOR 771 entwickelte Software „Occlusal Fingerprint Analyser“ (OFA) kam erstmals bei einer großen Stichprobe von Primaten zum Einsatz.
Aus dem ursprünglichen tribosphenischen Molarentyp der frühen eozänen Primaten haben einige Nahrungsspezialisten im Laufe der Evolution Modifikationen entwickelt um ihre Nahrung mechanisch besser aufzubereiten. So sind neue Funktionselemente auf den Molaren entstanden, wie z.B. ein distolingualer Höcker (Hypoconus) auf den Oberkiefermolaren.
Die Auswertung der Parametermessungen, wie die Facettenlage und -größe, der Okklusale Kompass, der Mastikationskompass und die Messungen der Okklusionsreliefs ergaben, dass die basalen Primatenvertreter aus dem Eozän einen flachen Hypoconus als vergrößerte Fläche zum Quetschen der Nahrung genutzt haben. Das weist auf eine frugivore Nahrungspräferenz hin. Der distolinguale Höcker ist unter den rezenten Spezies mit insektivorer Nahrungspräferenz besonders häufig ausgebildet. Es konnte gezeigt werden, dass eine zweite Kauphase, die nach der maximalen Verzahnung mit der Öffnung des Kiefers eintritt, unter den rezenten Strepsirrhini mit Hypoconus nur sehr schwach ausgeprägt ist.
Eine weitere evolutionäre Modifikation sind buccolingual ausgerichtete komplementäre Kantenpaare auf den Molaren, die sogenannte Bilophodontie, die sich in der Familie der Cercopithecidae entwickelt hat. Die Unterfamilie der Colobinae zeigt eine besonders stark reliefgeführte Okklusion und hat deshalb während der Mastikation weniger Bewegungsspielraum als die der Cercopithecinae. Die zweite Kauphase der Cercopithecinae ist gegenüber den folivoren Colobinae zum Teil auffällig verlängert. Da die Colobinae Vormagenverdauer und die Cercopithecinae Monogastrier sind, kann vermutet werden, dass die Zahnmorphologie eng mit der entsprechenden chemischen Verdauungsweise verknüpft ist. Das dryopithecine Höckermuster der Hominoidea hat eine wesentlich flachere Höckermorphologie als die bilophodonten Molaren. Daher war ein höherer Bewegungsspielraum während der Mastikation beobachtbar. Es konnte gezeigt werden, dass steilere Facetten bei den folivoren Nahrungsspezialisten zu finden sind, wie den Colobinae bei den bilophodonten, oder den Gorillas unter dem dryopithecinen Molarentyp. Mit einem flacheren Molarenrelief kann auf ein breiteres Nahrungsspektrum zugegriffen werden.
Mit den OFA-Analysen und den Ergebnissen der Quantifizierung des Kronenreliefs von rezenten und fossilen Primatenzähnen konnte in der vorliegenden Untersuchung eine relevante Vergleichsbasis für ein funktionelles Verständnis der Evolution der vielfältigen Kronenformen bei Primaten erarbeitet werden. Für zukünftige Studien sollte die innerartliche Stichprobe erweitert werden um die Variabilität näher zu untersuchen.
Bei Cryptochromen handelt es sich um Blaulichtrezeptoren der Cryptochrom-Photolyase-Proteinfamilie (CPF). Mitglieder dieser Proteinfamilie sind in allen Domänen des Lebens zu finden und haben eine essentielle Rolle in der Reparatur der DNA sowie der lichtgesteuerten Regulation der Expression. Cryptochrome sind in der Regel keine DNA-reparierenden Proteine. Sie sind regulativ an der Steuerung der inneren Uhr und des Zellzyklus der Organismen beteiligt. In der Kieselalge Phaeodactylum tricornutum konnten bisher sechs phylogenetisch unterschiedliche Mitglieder der CPF identifiziert werden. Bei CryP handelt es sich um das einzige pflanzenähnliche Cryptochrom der photoautotrophen Diatomee. Für das Protein CryP konnte bereits ein blaulichtinduzierter Photozyklus durch die Absorption der Chromophore 5-Methenlytetrahydrofolat (MTHF) und Flavinadenindinukleotid (FAD) gezeigt werden. Außerdem ist eine regulative Wirkung des Proteins auf die Lichtsammelkomplexe (Lhc) der Diatomee bekannt. Für eine weitere Charakterisierung des CryPs wurde in dieser Arbeit zunächst das Absorptionsverhalten unter verschiedenen Wellenlängen beobachtet, um so einen Einblick in eine mögliche Aktivierung und Deaktivierung des Proteins durch Licht unterschiedlicher Wellenlängen zu erlangen. Es zeigte sich hierbei eine mit pflanzlichen Cryptochromen vergleichbare Anreicherung verschiedener Redoxzustände des FADs in Abhängigkeit von der Wellenlänge.
Für eine Aufklärung der Wirkungsweise des CryP-Proteins wurden verschiedene Hypothesen untersucht: Die phylogenetische Nähe und ein ähnliches Absorptionsverhalten des CryPs zu Cryptochromen mit Reparaturfähigkeit für einzelsträngige DNA (Cry-DASH) führte zu einer Untersuchung des Proteins als möglicher Transkriptionsfaktor. Hierfür konnte eine Kernlokalisation des Proteins nachgewiesen werden, was Rückschlüsse auf eine potentielle Regulation der Expression mittels DNA-Bindung zulässt. Außerdem wurde gezeigt, dass CryP DNA-Bindefähigkeit besitzt. Die bisher nachgewiesenen Bindungen waren jedoch unspezifischer Art. Dies konnte auch für die Promotersequenz eines der durch CryP regulierten Gene lhcf1 festgestellt werden. Auf Grund der unspezifischen DNA-Bindung wurde eine zweite Hypothese für CryP untersucht: CryP wirkt regulativ auf die Expression verschiedener Gene durch Protein-Protein-Interaktionen und ist Teil einer Reaktionskaskade zur Signalweiterleitung in P. tricornutum.
Durch die Untersuchung der zweiten Hypothese konnten drei Interaktionspartner für CryP identifiziert und eine Interaktion verifiziert werden. Hierbei handelt es sich um das Protein AAA mit einer bisher unbekannten Funktion und das Protein BolA, welches Teil der zuerst in Escherichia coli identifizierten BolA-like-Proteinfamilie ist. Außerdem konnte eine Interaktion mit dem Cold-Shock-Domänen-Protein CSDP gezeigt werden. Bei den Proteinen BolA und CSDP handelt es sich um potentiell regulierende Faktoren der Transkription und Translation, was Teil einer Reaktionskaskade sein kann. Die aus anderen Organismen bekannten Funktionen des BolA-Proteins überschneiden sich mit den in CryP-Knockdown-Mutanten beobachteten Effekten. Sie zeigen eine erhöhte Sensitivität für Stresssituationen wie abweichende Nährstoffkonzentration, Osmolaritäten und Temperaturen. Diese Beobachtungen stellen einen Zusammenhang der durch einen CryP-Knockdown beobachteten Effekte und der CryP-BolA-Interaktion her. Durch Homologien zu Cold-Shock-Proteinen aus Chlamydomonas reinhardtii gibt die CryP-Interaktion mit dem Protein CSDP Hinweise auf einen potentiellen Mechanismus zur Regulation der Lhc-Proteine, für welche zuvor ein CryP-abhängiger Effekt beschrieben war.
Über die Protein-Protein-Interaktionen hinaus wurde die Phosphorylierung des CryPs als Möglichkeit der Signalweiterleitung untersucht. Es konnte eine reversible Phosphorylierung des heterolog aus E. coli isolierten CryPs gezeigt werden. Diese zeigt Ähnlichkeiten zu bekannten Phosphorylierungen pflanzlicher Cryptochrome und gibt Hinweise auf einen Mechanismus der Signalweiterleitung.
Durch die Untersuchung der CryP-regulierten Transkription mit P. tricornutum CryP-Knockdown-Mutanten durch Next-Generation-Sequencing (NGS) konnte die Hypothese der regulativen Proteinkaskade und der Signalweiterleitung weiter bestätigt werden. Die Auswirkungen des CryPs auf die Transkription erwiesen sich als nicht auf einen Teilbereich des Metabolismus begrenzt, sondern sind in einem großen Teil der funktionellen Gengruppen in P. tricornutum zu sehen. Außerdem konnten drei Klassen CryP-regulierter Gene festgestellt werden. Kategorie 1: die ausschließlich unter Blaulicht regulierten Gene; Kategorie 2: die sowohl unter Blaulicht als auch im Dunkeln regulierten Gene und Kategorie 3: die ausschließlich im Dunkeln regulierten Gene. Ein im Dunkeln und unter Blaulicht jeweils unterschiedlicher regulativer Effekt deutet auf eine Doppelfunktion des CryPs hin. Möglicherweise hat das Cryptochrom unterschiedliche lichtabhängige und lichtunabhängige Funktionen.
Durch die Analyse der CryP-regulierten Genexpression konnte außerdem ein Zusammenhang zwischen CryP und weiteren Photorezeptoren gezeigt werden. Der CryP-Proteingehalt in der Zelle hat einen regulativen Einfluss auf das CPF1-Protein, eine Photolyase mit dualer Funktion aus der gleichen Proteinfamilie. Zusätzlich konnte auch ein Einfluss auf die Lichtsensitivität der Genexpression des Rotlichtrezeptors Phytochrom (DPH) durch CryP gezeigt werden. Vergleichbar mit höheren Pflanzen scheint ein regulatives Netzwerk der Photorezeptoren auch in der Diatomee P. tricornutum vorhanden zu sein.
Es wird davon ausgegangen, dass das ehemalige Larven-Mikrohabitat der Asiatische Tigermücke Aedes albopictus (synonym: Stegomyia albopicta) die Phytotelmata in den Waldgebieten von Südostasien darstellte. In den letzten vier Jahrzehnten adaptierte sich die Art jedoch an urbanere Regionen und ihre Antrotelmata. Dank ihrer Eigenschaft, Eier mit einer gewissen Trocken- und Kältetoleranz zu produzieren, verbreitete sich die Art zusammen mit den international gehandelten Waren weltweit. Zudem ist Ae. albopictus ein theoretischer Vektor für mindestens 27 Viren sowie Parasiten und spielt eine Hauptrolle bei der Übertragung von Dengue-Viren und Chikungunya-Viren und Zika-Vieren. Daher wird die Art als große Gefahr für die öffentliche Gesundheit betrachtet.
Die vorliegende Arbeit thematisiert drei Untersuchungen zum Anpassungs- und Etablierungs-potential der invasiven Asiatischen Tigermücke.
In einem ersten Ansatz wurde das Problem behandelt, dass es lediglich zwei standardisierte toxikologische Testverfahren für Culicidae gab. Daher wurde ein Dosis-Wirkungs-Testsystem entwickelt, das den Weg für weitere biologische Endpunkte und ihre integrativen Parameter freimachte und dadurch ein besseres Verständnis für die Wirkweisen von Insektiziden ermöglicht. Hierdurch konnte nun der Frage nachgegangen werden, ob es Unterschiede in der ökotoxikologischen Reaktion zwischen der invasiven tropisch-subtropischen Asiatischen Tigermücke und der einheimischen nördlichen Hausstechmücke Culex pipiens auf das Insektizid λ-Cyhalothrin gibt. Weiter wurde der Einfluss von Temperatur und die Verfügbarkeit von Nahrung auf die Insektizidsensitivitäten der Arten getestet. Schließlich konnte in einer Risikobewertung festgestellt werden, dass bei falsch angewendeten Bekämpfungsmaßnahmen höhere Temperaturen sowie der Ausfall von aquatischen Top-Prädatoren zu Fitnessvorteilen für die Art führen können.
In einer zweiten Untersuchung wurde der Mechanismus der Kältetoleranz der Eier (Kälteakklimatisierung und Diapause) näher untersucht, da dieser für die erfolgreiche Invasion in gemäßigten Breitengraden verantwortlich gemacht wird. Nachdem eine lang vorherrschende Hypothese verworfen wurde, dass die Einlagerung von Polyolen die Frosttoleranz bewirken würde, war der aktuelle Stand der Wissenschaft, dass eine Verdickung der Wachsschicht des Chorions dafür verantwortlich sei. Jedoch lag keine detaillierte Evaluierung von Stechmücken-Eihüllen vor. Mittels einer transmissionselektronenmikroskopischen Studie konnte gezeigt werden, dass nicht nur die Wachsschicht nicht in der Serosa-Cuticula zu verorten ist, sondern im Endochorion und sie zudem im Zuge der Diapause in der Mächtigkeit schrumpft. Daher wird auf Basis der gewonnenen Erkenntnisse auf eine Kompaktierung der Schicht geschlossen.
Die dritte Untersuchung schließlich hatte das hohe Adaptationspotential in gemäßigten Breiten zum Gegenstand. Eine Adaptation auf genetischen Level gilt als unwahrscheinlich, da Gründerpopulationen in den neu besiedelten Gebieten eine niedrige genetische Diversität aufwiesen und ein regelmäßiger Neueintrag von Allelen unwahrscheinlich ist. Jedoch bietet das Konzept der epigenetischen Temperatur-Adaptation einen Erklärungsansatz für dieses Phänomen. Daher wurde die Frage gestellt, ob es möglich ist, eine vererbbare Diversifizierung dieses kältetoleranten Phänotyps nach einer randomisierten epigenetischen Behandlung der DNA zu detektieren. Es wurde eine transgenerationale Untersuchung der Effekte von zwei epigenetischen Agenzien (und einem Lösemittel) auf die Kältetoleranz der Eier durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten ein Korrelationsmuster, das den durch die Agenzien veränderten Methylierungsgrad der DNA mit der Forsttoleranz verband, was die gestellte Hypothese unterstützte.
In Folge dieser drei Untersuchungen wurde festgestellt, dass Ae. albopictus ein hohes Potential hat, in weiteren Ländern – vor allem in gemäßigten Breiten – ein Gesundheitsrisiko darzustellen. Da die Art einerseits Fitnessvorteile durch falsche Bekämpfungsmaßnahmen und andererseits möglicherweise eine hohes epigenetisches Adaptationspotential besitzt, kann zusammenfassend empfohlen werden, dass der Fokus für weitere Forschung maßgeblich auf der Entwicklung von Impfstoffen für die übertragenen Viren und Pathogene liegen sollte. Dadurch kann die Bevölkerung geschützt werden, ohne Ökosysteme und ihre Dienstleistungen zu gefährden, und dies wäre zudem ökonomisch gesehen die effektivere Lösung.
Entwicklung neuer Multikomponentenreaktionen zur Synthese von Amin- und α-Aminosäurederivaten
(2016)
Die Entwicklung neuer Synthesemethoden ist von enormer Bedeutung hinsichtlich der Darstellung von neuen Verbindungen mit speziellen, anwendungsorientierten Eigenschaften und in Bezug auf die Suche nach ökologisch verträglicheren und effizienteren Herstellungsmethoden. Multikomponentenreaktionen (MCRs) bieten hierbei eine gute Ansatzmöglichkeit. Gegenüber den klassischen, linear verlaufenden 2-Stufen-Reaktionen weisen MCRs eine hohe Atom-Ökonomie und effiziente Bindungsbildung auf, können zur Minimierung von Zeit-, Energie-, Material- und Kostenaufwand sowie zur geringeren Generierung von Abfallmengen beitragen und ermöglichen einen schnellen Aufbau diverser Molekülstrukturen. Vor diesem Hintergrund gelang im Rahmen der vorliegenden Arbeit die Entwicklung mehrerer 3-Komponentenreaktionen basierend auf der nukleophilen Addition von Arylboronsäuren an in situ gebildete N-Acyl- bzw. N-Sulfonylimine, womit die Synthese von diversen alpha-substituierten Amiden, chiralen, alpha-substituierten Sulfonamiden, chiralen alpha-Arylglycinen sowie von Arylmethylsulfonamiden erfolgte. Der Schlüssel zu einer erfolgreichen Umsetzung hinsichtlich der Methode mit Amiden war die Verwendung eines dualen Katalysatorsystems aus Lewis-Säure und Pd(II) sowie die Anwesenheit von Wasser. Die enantioselektiven Varianten konnten mittels Sulfonamide anstelle der Amide sowie unter Einsatz von Pd(II) und einem chiralen Oxazolin-Liganden erreicht werden. Die neuen Methoden sind einfach in der Durchführung, weisen einen breiten Substrat-bereich auf und im Falle der asymmetrischen Varianten hohe Enantioselektivitäten.
Allerdings besitzt die Reaktionsführung über Organoboronsäuren zwei entscheidende Nachteile: Zum einen bedarf es der Verwendung vorfunktionalisierter Boronsäuren und zum anderen werden stöchiometrische Mengen borhaltiger Abfälle erzeugt. Daher wurden im Rahmen dieser Arbeit auch Prozesse untersucht, bei denen hinsichtlich der Atom-Ökonomie keine unnötig vorfunktionalisierten Startmaterialien eingesetzt werden und bei denen keine oder nur ökologisch vollkommen unbedenkliche Nebenprodukte entstehen. Ein erster Ansatz in diese Richtung gelang dabei mit der Entwicklung einer neuen 3-Komponentenreaktion basierend auf einer Brønsted-Säurekatalysierten, benzylischen C–H-Bindungsfunktionalisierung von 2-Alkylazaarenen.
In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals die Interaktion von A. baumannii mit humanem Plasminogen untersucht. Mit dem Translations-Elongationsfaktor TufAb, dem äußeren Membranprotein OmpW sowie dem Lipoprotein p41 konnten insgesamt drei Plasminogen-bindende Proteine von A. baumannii identifiziert werden. Außerdem wurde ein grundlegender Beitrag zur funktionellen Charakterisierung von TufAb sowie p41 von A. baumannii erbracht.
Es konnte nachgewiesen werden, dass gereinigtes TufAb humanes Plasminogen bindet und diese Interaktion teilweise durch Lysin-Reste vermittelt und von der Ionenstärke beeinflusst ist. An TufAb-gebundenes Plasminogen war für den Plasminogen-Aktivator u-PA zugänglich und konnte zu Plasmin aktiviert werden, welches das chromogene Substrat S-2251, das physiologische Substrat Fibrinogen und die zentrale Komplementkomponente C3b proteolytisch spaltete. Schließlich konnte TufAb als „Moonlighting“-Protein auf der Zelloberfläche von A. baumannii identifiziert werden.
Für das Lipoprotein p41 konnte ebenfalls gezeigt werden, dass dieses an Plasminogen bindet. Die Bindung von Plasminogen an p41 erfolgte ebenfalls über Lysin-Reste, zeigte sich allerdings von der Ionenstärke unbeeinflusst. Im Fall von p41 konnte mit Hilfe von C-terminal verkürzten p41-Konstrukten gezeigt werden, dass C-terminale Lysin-Reste an der Bindung von Plasminogen beteiligt sind. Weitere Versuche mit p41-Proteinen, bei welchen vier C-terminale Lysin-Reste durch Alanin-Reste substituiert wurden, ergaben, dass die beiden Lysin-Reste K368 und K369 essentiell für die Bindung von Plasminogen an p41 sind. Zudem konnte gezeigt werden, dass sowohl Kringle-Domäne 1 als auch Kringle-Domäne 4 von Plasminogen bei der Interaktion mit p41 involviert sind. An p41 gebundenes Plasminogen ließ sich durch u-PA zu Plasmin aktivieren, welches Fibrinogen sowie die zentrale Komplementkomponente C3b degradierte. p41 ist außerdem in der Lage, die Komplementkomponenten C3, C3b und C5 zu binden und den alternativen Weg zu inhibieren. Zudem ergaben Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit erste Hinweise darauf, dass zumindest die Plasminogen-bindende Region auf der Zelloberfläche von A. baumannii lokalisiert ist.
Die Inaktivierung des p41-kodierenden Gens führte zu einer signifikanten Abnahme im Überleben von A. baumannii-Zellen in der Gegenwart von NHS. Zudem zeigte die Mutante Δp41 einen Defekt in der Plasmin-abhängigen Transmigration durch einen Endothelzell-Monolayer. Beide Versuche untermauern die physiologische Relevanz für die Interaktion von A. baumannii mit Plasminogen.
Die Arachidonsäurekaskade spielt bei Entzündungsprozessen und der Schmerzentstehung eine wichtige Rolle. Deren primäre Produkte, die Leukotriene und die Prostaglandine, sind entzündungsfördernde Mediatoren und nehmen Einfluss auf den Entzündungs-auflösendenprozess und sind bei einer Dysregulation für diverse Erkrankungen wie z.B. Asthma bronchiale und allergische Rhinitis mitverantwortlich. Die Kaskade gliedert sich mit ihren beiden Hauptenzymen, Cyclooxygenase und 5-Lipoxygenase (5-LO), in zwei Wege auf. Beide Enzyme sind außerdem in der Lage entzündungsauflösenden Mediatoren zu bilden. Die Mediatoren wie z.B. Lipoxin können im Zellstoffwechsel einerseits über die Lipoxygenase-Route, oder andererseits wie „aspirin-triggered“-Lipoxin von der durch geeignete Wirkstoffe acetylierten Cyclooxygenase-2 (COX-2) katalysiert werden. Diese Mediatoren werden benötigt, um (chronische) Entzündungen und beschädigtes Gewebe zurück zur Homöostase zu führen.
Die Pharmakotherapie chronisch entzündlicher Erkrankungen mit guter Wirksamkeit und verträglichem Profil bei Langzeiteinnahme stellt jedoch eine Herausforderung dar. Die Therapie verzögern oft, z. B bei Einnahme von nicht-steroidalen Antirheumatika (NSAR), die Entzündungsauflösung, da die Bildung von entzündungshemmenden und entzündungs-auflösenden Lipidmediatoren gehemmt werden. Die gezielte Modulation und Einflussnahme auf die Arachidonsäurekaskade an einem der beiden Enzyme, stellt daher einen guten Ansatz für eine verbesserte Therapiemöglichkeit von (chronischen) entzündlichen Krankheiten dar. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Synthese von Modulatoren und Inhibitoren der Arachidonsäurekaskade. Zum einen befasst sie sich mit der Entwicklung von irreversiblen COX-2-acetylierenden Substanzen als neues anti-entzündliches und entzündungsauflösendes Prinzip. Zum anderen mit der Untersuchung der Struktur-Wirkungsbeziehung (SAR) von 2-Aminothiazolen als direkte 5-LO-Inhibitoren ausgehend von SKI-II, welches zuvor als Leitstruktur zur Entwicklung von 5-LO-Inhibitoren entdeckt wurde.
Als Leitstrukturen für die irreversiblen COX-2-acetylierenden Substanzen wurden bekannte COX-2 selektive Substanzen ausgewählt sowie vereinzelte nicht-selektive NSAR. Es wurden an der COX-2 Kristallstruktur Docking-Studien durchgeführt, um die geeignetsten Positionen für die Einführung einer (labilen) Acetylgruppe zu identifizieren. Aufgrund dieser Studien wurden drei Positionen ausgewählt zur Derivatisierung. Es wurden daraufhin zahlreiche Derivate synthetisiert von Celecoxib, Valdecoxib, Rofecoxib, Etericoxib, als Vertreter der (COX-2) selektive Inhibitoren, sowie von Acetylsalicylsäure, Diclofenac und Nimesulid-Analoga als Vertreter der nicht-selektiven NSARs. Zusätzlich wurden Derivate synthetisiert mit Michael-Akzeptoren als kovalente bindende Komponente. Alle synthetisierten Substanzen wurden sukzessiv auf ihre COX inhibitorischen Eigenschaften hin untersucht und auf COX-2 Selektivitäten überprüft. Weiterhin wurden von allen Derivaten Auswaschungs-Studien durchgeführt als Vorversuche welche Derivate eine irreversible COX-2-Inhibition hervorrufen. In den Vorversuchen zeigte die Verbindung ST-1650 am deutlichsten eine COX-2-Selektivität sowie eine starke irreversible Inhibition der COX-2. Die Verbindung ST-1650 wurde weiterhin auf indirekte Hinweise zur Entstehung von heilungsfördernden Mediatoren untersucht anhand von: M1-Macrophagen Polarisation und einem Schmerzmodell, dem Zymosan-Überempfindlichkeit Pfotenmodell. Im Makrophagen-Modell konnte ST-1650 keine Phänotypverschiebung hinzu entzündungsauflösenden M2-Makrophagen bewirken, sowie in den Schmerzmodellen leider keine schnellere Schmerzauflösung als die Kontrollgruppe. Ob diese Effekte durch mangelnde oder zu geringer Entstehung von entzündungshemmenden Mediatoren zurückzuführen ist, ist noch unklar.
Für die SAR der 2-Aminothiazole als direkte 5-LO-Inhibitoren wurden über 60 Verbindungen synthetisiert und untersucht. Zu Beginn erfolgte eine Optimierung der Grundstruktur als 5-LO-Inhibitor. Es wurden die Einflüsse der Substituenten des Thiazolsrings und des Aminolinkers auf die 5-LO-Aktivität ermittelt, um die SAR initialer Arbeiten zu vertiefen. Nach der SAR-Untersuchung im intakten Zellsystem konnten durch Kombination bevorzugter Strukturelemente die zwei Verbindungen ST-1853 und ST-1906, als neue potente 5-LO-Inhibitoren entwickelt werden, die sich als nicht-toxisch herausstellten. Diese beiden 5-LO-Inhibitoren wirken um einen Faktor 10 potenter und sind weniger toxisch verglichen mit der Leitstruktur SKI-II. ST-1853 wurde innerhalb der Arachidonsäurekaskade auch auf Off-targets getestet, deren Aktivitäten sie erst bei 100-fach höherer Konzentration beeinflusst, sowie in humanem Vollblut, wo sie sich ihre 10-fach bessere Wirksamkeit im Vergleich zu SKI-II bestätigte. Darüber hinaus erwies sich ST-1853 bei den ersten Überprüfungen seiner Stabilität unter physiologischen Bedingungen wie bei der in vitro Metabolisierung durch Rattenlebermikrosomen als ausreichend stabil und daher zur weiteren Charakterisierung gut geeignet.
Heutzutage unterliegen insbesondere aquatische Ökosysteme durch den permanenten Anstieg nicht-heimischer Arten einem folgenreichen Wandel. Dabei stellt der Biodiversitätsverlust nur den Endpunkt einer biologischen Invasion dar. Dazwischen wirken sich Faktoren wie Konkurrenz-, Prädationsdruck oder die Übertragung von Krankheitserregern wie z.B. Parasiten auf den Rückgang der Arten aus. Als integraler Bestandteil eines jeden Ökosystems spielen Parasiten bei Invasionsprozessen eine entscheidende Rolle und können durch ihren Einfluss auf heimische und nicht-heimischen Arten Invasionen begünstigen. Fische übernehmen aufgrund ihrer vielseitigen Bedeutung im Nahrungsnetz eine Schlüsselfunktion als Wirte diverser Parasitenarten und sind deshalb ausgezeichnete Untersuchungsobjekte, um durch nicht-heimische Arten verursachte Veränderungen in Nahrungsnetzstrukturen oder Parasitenfaunen aquatischer Ökosysteme aufzudecken.
Vor diesem Hintergrund wurde die vorliegende kumulative Dissertation angefertigt, welche auf drei (ISI-) Einzelpublikationen basiert. Die Arbeit beschäftigte sich unter Verwendung morphologischer und molekularbiologischer Methoden schwerpunktmäßig mit der Parasitendiversität und Nahrungsökologie zweier eingeschleppter Fischarten in stark anthropogen beeinflussten deutschen Fließgewässern. Dabei handelte es sich um die hauptsächlich durch das Ballastwasser von Schiffen verbreitete invasive Schwarzmundgrundel Neogobius melanostomus aus den Flüssen Rhein und Main sowie den von Hobby-Aquarianern in den durch Industrieabwässer thermisch belasteten Gillbach ausgesetzten Zebrabuntbarsch Amatitlania nigrofasciata. Unter Berücksichtigung nahrungsökologischer und räumlich-zeitlicher Aspekte sollten die parasitologischen Risiken und Konsequenzen, welche durch das Einschleppen nicht-heimischer Fischarten auftreten, aufgezeigt werden, um übergeordnet die Folgenabschätzung auf dem Gebiet der Invasionsbiologie zu verbessern. Das Nahrungsspektrum beider Fischarten wies sowohl räumliche (zwischen den Flüssen und Standorten), als auch zeitliche (monatlich) Variationen auf, was die Anpassungsfähigkeit bzw. die optimale Nutzung zur Verfügung stehender Ressourcen von invasiven Arten verdeutlicht. Ebenso wurden Unterschiede in der Parasitierung nachgewiesen, was die Notwendigkeit räumlicher und zeitlicher Analysen zur Erfassung der vollständigen Parasitenfauna einer invasiven Art, inklusive aller Variationen der Befallszahlen, unterstreicht. Beide Fischarten bilden zudem Zwischenwirte für heimische, als auch nicht-heimische Parasitenarten, wobei die direkte Einschleppung von nicht-heimischen Parasiten aus dem ursprünglichen Verbreitungsgebiet der Fische auszuschießen ist und somit die Enemy-Release-Hypothese (Verlust ursprünglicher Gegenspieler wie Prädatoren oder Parasiten) unterstützt. Dies könnte zusammen mit der opportunistischen Ernährungsweise ein Grund für die starke Ausbreitung sowie die anhaltend hohen Individuenzahlen dieser Arten im jeweils betrachteten Verbreitungsgebiet (Rhein, Main sowie Gillbach) sein.
Besonders hervorzuheben ist der Nachweis der nicht-heimischen Nematoden Anguillicoloides crassus und Camallanus cotti. Durch die Aufdeckung einer besonderen Form von Hyperparasitismus konnten erstmalig hohe Befallszahlen von A. crassus in N. melanostomus dokumentiert werden. Die hoch abundante Grundelart gilt somit potentiell als entscheidender Überträger des invasiven Parasiten auf den Europäischen Aal. Der durch seine hohe Virulenz in der Aquaristik bekannte C. cotti gelangte durch das Aussetzen von Zierfischen in den Gillbach und trat mit hohen Befallszahlen in A. nigrofasciata auf und wird bereits auf die heimische Fischfauna übertragen (z.B. auf den Gründling Gobio gobio und den Döbel Squalius cephalus). Ebenso ist der starke Befall der heimischen Parasiten Pomphorhynchus sp. (Acanthocephala) und Raphidascaris acus (Nematoda) bei N. melanostomus sowie A. anguillae (Acanthocephala) bei A. nigrofasciata zu nennen. Durch die zusätzliche Wirtfunktion der Neozoen und die hohen Befallsintensitäten ist mit einem verstärkten Spillback-Effekt (Rückinfizierung) auf heimische Fischarten zu rechnen.
Die stetig steigende Anzahl biologischer Invasionen führt zu immer weitreichenderen Veränderungen heimischer Ökosysteme. Für den Erhalt der Biodiversität sowie einhergehender Ökosystemfunktionen rückt auch die Forschung über Neobiota immer mehr in den Mittelpunkt. In diesem Zusammenhang gewinnen auch Pathogene wie Parasiten immer mehr an Bedeutung, welche durch gebietsfremde Arten eingeschleppt werden und die bestehende Biodiversität gefährden können. Die Ergebnisse der durchgeführten Studien haben gezeigt, dass die Verknüpfung von parasitologischen und nahrungsökologischen Untersuchungen Einblicke in die hoch dynamischen Prozesse der Invasionsbiologie geben können, was ein Vorantreiben der Forschung und Folgenabschätzungen auf diesem Gebiet ermöglicht.
Die vorliegende Studie vermittelt einen epidemiologischen Überblick über das mit Haut- und Nagelläsionen assoziierte Pilzspektrum im Westen Panamas. Hierzu wurden Proben von vermutlich durch Pilzinfektionen verursachten Haut- sowie Nagelläsionen gesammelt und zum Anlegen von Kulturen verwendet. Die isolierten Pilze wurden basierend auf dem D-H-S System (Rieth), anhand morphologischer Merkmale, rDNA Sequenzdaten sowie phylogenetischen Analysen klassifiziert und mit Hilfe von Literaturdaten sowie physiologischen Eigenschaften als saprotrophe, opportunistische oder pathogene Organismen beurteilt. In Panama wurden 52 Proben von 51 Personen gesammelt, wobei das Material von 42 Haut- und Nagelläsionen der Füße, vier Läsionen der Fingernägel, zwei Chromomykosen, einer Tinea nigra und drei sonstigen Hautläsionen stammt. Bei 75 Prozent (n = 39) der Proben konnten Pilze kultiviert und insgesamt 201 Pilzstämme isoliert und subkultiviert werden. Hiervon wurden 50 Isolate (24,9 %) als Dermatophyten, 24 Stämme (11,9 %) als Hefen und 127 Isolate (63,2 %) als Schimmelpilze klassifiziert. Bei 19 Probanden (48,7 %) konnten Dermatophyten isoliert werden, wobei aus dem Probenmaterial von 12 Personen (63,2 %) ebenfalls andere Pilzarten nachgewiesen wurden. Von zwei Läsionen (5,1 %) wurden nur Hefen isoliert, wobei einmal eine Schwarze Hefe kultiviert wurde. In dem Material acht weiterer Proben (20,5 %) wurden Schimmelpilze und Hefestämme nachgewiesen und bei zehn Probanden (25,6 %) konnten aus dem Probenmaterial nur Schimmelpilze kultiviert werden. 172 Isolate wurden taxonomisch klassifiziert und 44 Arten aus 25 Gattungen, 17 Familien, 15 Ordnungen, sechs Klassen sowie den Abteilungen Ascomycota oder Basidiomycota zugeordnet. Die Ascomyceten stellen mit 164 Stämmen 40 verschiedener Arten aus 23 Gattungen, 15 Familien, 11 Ordnungen und vier Klassen die am häufigsten isolierte und vielfältigste Gruppe dar, während die Basidiomycota nur mit acht Isolaten vier verschiedener Arten zwei unterschiedlicher Gattungen, Familien, Ordnungen und Klassen nachgewiesen wurden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden in Panama die anthropophilen Dermatophyten Trichophyton rubrum und T. interdigitale dokumentiert, wobei T. rubrum die am häufigsten isolierte Art darstellt. Kultivierte Hefen waren Candida albicans, C. duobushaemulonii, C. tropicalis, Hortaea werneckii, Sporobolomyces sp., Trichosporon asahii, T. japonicum und T. montevideense. Die Schimmelpilze stellen die größte und ökologisch diverseste Organismengruppe der kultivierten Pilze dar. So wurden von den untersuchten Läsionen sowohl humanpathogene Erreger, als auch opportunistische Arten und rein saprotrophe Pilze sowie mehrere Vertreter wahrscheinlich bisher nicht wissenschaftlich beschriebener Arten bzw. Gattungen nachgewiesen. Aus dem Probenmaterial wurden die Pilze Acremonium collariferum, Aspergillus awamori, A. clavatus, A. flavus, A. giganteus, A. heteromorphus, A. niger, A. ochraceus, A. sclerotiorum, A. versicolor, Chaetomium globosum, Chrysosporium tuberculatum, Cladosporium sphaerospermum, C. tenuissimum, Curvularia geniculata, C. lunata, Fonsecaea pedrosoi, Fusarium oxysporum, F. solani, Lophotrichus bartlettii, Microascus cinereus, Neoscytalidium dimidiatum, Penicillium commune, Scolecobasidium sp., Scopulariopsis carbonaria, S. croci, Verticillium cf. epiphytum und Wardomycopsis litoralis isoliert. Zudem wurden vier Isolate von zwei vermutlich neuen Arten der Gattung Acremonium (Bionectriaceae, Hypocreales), zwei Stämme mit einer genetischen Affinität zu der Gattung Cryptendoxyla (Cephalothecaceae, Sordariales) und jeweils ein mit den Gattungen Fusicladium (Venturiaceae, Venturiales), Knufia (Trichomeriaceae, Chaetothyriales) bzw. Rhexothecium (Eremomycetaceae, Dothideomycetidae) assoziierter Stamm kultiviert. Im Rahmen dieser Studie wurden A. giganteus, C. tenuissimum, L. bartlettii, S. carbonaria, S. croci, V. epiphytum und W. litoralis erstmalig von Mykosen des Menschen dokumentiert und die in der Literatur als Verursacher sowie Besiedler von Haut- und Nagelläsionen beschriebenen Organismen A. clavatus, A. flavus, A. niger, A. ochraceus, C. tropicalis, C. globosum, C. sphaerospermum, C. lunata, F. oxysporum, M. cinereus, P. commune, T. asahii, T. japonicum und T. montevideense wurden das erste Mal in klinischem Probenmaterial aus Panama nachgewiesen. Die Arten A. awamori, A. heteromorphus, C. globosum, C. tenuissimum, L. bartlettii, M. cinereus, P. commune, S. croci, T. asahii, T. japonicum, T. montevideense, V. epiphytum, W. litoralis und die Gattung Scolecobasidium wurden zudem erstmalig für Panama dokumentiert. Die Isolation von W. litoralis ist ebenfalls der erste Nachweis dieses Pilzes außerhalb von Spanien und auf dem amerikanischen Kontinent. Die große Anzahl im Rahmen dieser Arbeit beschriebener, bisher für die Wissenschaft unbekannter bzw. nicht in Panama dokumentierter Pilzarten lässt auf eine große mykologische Biodiversität in Panama schließen und zeigt den Bedarf weiterer Forschung.
Primäre Tumore werden nach ihrem Entstehungsort benannt. Selbst Metastasen zeigen eine gewisse Ähnlichkeit mit ihrem ursprünglichen Gewebe. Somit gehören alle Geschwülste, die ursprünglich der Harnblase entstammen, zu den Harnblasenkarzinomen.
Das Harnblasenkarzinom geht meist (90-95%) von der Schleimhaut der ableitenden Harnwege aus und wird als Urothel bezeichnet. Dementsprechend haben die meisten Patienten mit der Diagnose Blasenkarzinom ein Urothel-Blasenkarzinom. Die restlichen Blasenkarzinome entfallen auf Adenokarzinome, Plattenepithelkarzinome, kleinzellige Karzinome, Sarkome, Paragangliome, Melanome oder Lymphome (Humphrey A. et al. 2016, Moch H. et al 2016).
Die Urothel-Blasenkarzinome können sowohl flach, als auch warzenförmig wachsen. Je nach Diagnostik „oberflächlich“ oder „muskelinvasiv“ lassen sich die Urothel-Blasenkarzinome in zwei Hauptgruppen unterteilen;
Etwa 70% der Erkrankten haben dabei ein oberflächliches Urothel-Blasenkarzinom, das auf die Blasenschleimhaut begrenzt ist und durch eine Basistherapie, sog. Transurethrale Resektion (TUR-B) behandelt wird. Dabei werden die in der Schleimhaut gewachsenen Tumore getrennt reseziert. Therapieergänzend und/oder prophylaktisch wird die Blase danach mit einem Chemotherapeutikum gespült (intravesikale Instillation). Diese Zytostatika-Behandlung soll das Wiederauftreten eines Rezidivs verhindern bzw. eventuell verlangsamen (Iida K. et al. 2016, Celik O. et al. 2016).
Der Pilz Podospora anserina ist seit mehr als fünf Jahrzehnten ein wichtiger Modellorganismus für die Alternsforschung. Insbesondere die Mitochondrien, essentielle eukaryotische Zellorganellen – wegen ihrer Funktion im Energiestoffwechsel häufig auch als „zelluläre Kraftwerke“ bezeichnet, sind Schlüsselfaktoren für den Alterungsprozess dieses Organismus.
Im Rahmen einer vorangegangenen Diplomarbeit wurde daher der Einfluss der mitochondrialen CLPXP-Protease, einem bisher noch wenig erforschten Bestandteil der Proteinqualitätskontrolle in Mitochondrien, auf die Alterung von P. anserina untersucht. Mitochondriale CLPXP-Proteasen sind, wie auch ihre bakteriellen Pendants, aus zwei verschiedenen Untereinheiten aufgebaut: der Protease-Komponente CLPP und der Chaperon-Komponente CLPX. Die Deletion des Gens PaClpP, kodierend für CLPP in P. anserina, führte zu einer überraschenden Verlängerung der gesunden Lebensspanne der Mutante. Darüber hinaus war es möglich, den pilzlichen PaClpP-Deletionsstamm durch Einbringen von CLPP des Menschen zu komplementieren. Dies beweist, dass die Proteasen CLPP des Menschen und von P. anserina funktionell homolog sind. Dadurch eröffnete sich die Perspektive, diesen einfachen Modellorganismus für die Gewinnung potenziell auf den Menschen übertragbarer Erkenntnisse einzusetzen. Bedeutenderweise ist die menschliche CLPXP-Protease wahrscheinlich involviert in die Entstehung verschiedener Krankheiten, darunter das Perrault-Syndrom sowie einige Krebsarten. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind jedoch noch weitestgehend unverstanden.
Ziel des in dieser Dissertation beschriebenen Forschungsprojektes war daher die Gewinnung genauerer Einsichten in die molekulare Funktion und die daraus folgende biologische Rolle der mitochondrialen CLPXP-Protease von P. anserina. Der wohl wichtigste Punkt für das detaillierte Verständnis einer Protease ist die Kenntnis ihres Substratspektrums, d. h. der von ihr abgebauten Proteine. Tatsächlich wurde aber bis heute noch in keinem eukaryotischen Organismus eine umfassende Analyse der Substrate einer mitochondrialen CLPXP-Protease vorgenommen. Um diese Wissenslücke zu füllen, wurde in der vorliegenden Arbeit eine ursprünglich in Bakterien entwickelte Verfahrensweise, der sogenannte CLPP „Substrat-trapping Assay“, in P. anserina implementiert. Dafür mussten zunächst die notwendigen handwerklichen Voraussetzungen für den Assay geschaffen werden, insbesondere die effiziente Affinitätsaufreinigung von Proteinen aus isolierten Mitochondrien – einer bisher in P. anserina noch nicht angewandten Technik. Unter Verwendung verschiedener neu hergestellter Varianten der menschlichen Protease-Komponente CLPP, darunter einer proteolytisch inaktiven Variante zum „Einfangen“ von Substraten, konnte der CLPP „Substrat-trapping Assay“ in P. anserina erfolgreich durchgeführt werden. Insgesamt wurden, in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Julian D. Langer (Max-Planck-Institut für Biophysik; Durchführung von massenspektrometrischen Analysen) nahezu 70 spezifische Proteine erstmalig als potenzielle Substrate oder Interaktionspartner einer mitochondrialen CLPXP-Protease identifiziert. Bei einem Großteil dieser Proteine handelt es sich um Enzyme und Komponenten verschiedener Stoffwechselwege – vor allem um solche, die eine zentrale Rolle im mitochondrialen Energiestoffwechsel spielen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit legen somit folgende Arbeitsthese als Schlussfazit und gleichzeitig Ausganspunkt für zukünftige Untersuchungen nahe:
Die hauptsächliche molekulare Funktion der mitochondrialen CLPXP-Protease in P. anserina ist die Degradation von Stoffwechselenzymen und ihre biologische Rolle demnach die Kontrolle und Aufrechterhaltung des mitochondrialen und zellulären Energiestoffwechsels.
Insgesamt ist die auf Grundlage des CLPP „Substrat-trapping Assay“ in P. anserina anzunehmende Rolle der mitochondrialen CLPXP-Protease als regulatorische Komponente des mitochondrialen Energiestoffwechsels erstaunlich gut mit Beobachtungen in anderen eukaryotischen Organismen, gerade bezüglich der Relevanz der CLPXP-Protease des Menschen für diverse Krankheiten, zu vereinbaren. Somit erscheint es überaus sinnvoll und vielversprechend, dass in dieser Doktorarbeit erstellte und bisher beispiellose Kompendium potenzieller in vivo Substrate und Interaktionspartner dieser Protease auch als Referenz für zukünftige Untersuchungen außerhalb von P. anserina anzuwenden.
Das Hören hat für den Menschen eine maßgebliche Bedeutung hinsichtlich Kommunikation und Orientierung. Auch wenn sich der Mensch stark auf seinen visuellen Sinn verlässt, wird mit dem Ausfall des Hörvermögens deutlich, wie viele Informationen oft unterbewusst über die Analyse von Schallsignalen gezogen werden. Trotz dieser grundlegenden Relevanz sind bis heute noch nicht alle Komponenten, die dem Hörprozess zugrunde liegen, entschlüsselt.
Um sich diesen offenen Fragestellungen anzunähern, müssen Forscher oft auf Tiermodelle zurückgreifen. Auf Grund ihres exzellenten Gehörs haben sich hier in den letzten Jahrzehnten Fledermäuse als taugliche Versuchstiere qualifiziert. Diese Tiere sind in der Lage sich ohne Verwendung des visuellen Systems in absoluter Dunkelheit zu orientieren, indem sie mit Hilfe der wiederkehrenden Echos ihrer ausgesendeten Ultraschalllaute die Umgebungsstrukturen analysieren. Weiterhin umfasst der zur Kommunikation und Ortung verwendete Frequenzbereich bei Fledermäusen ein Vielfaches von dem des menschlichen, was ebenfalls verschiedene Aspekte der Hörforschung begünstigt. Die in dieser Studie verwendete fruchtfressende Fledermausart Carollia perspicillata eignet sich hervorragend für akustische Untersuchungen, da ihr Innenohr keine speziellen morphologischen Spezialisierungen aufweist.
Anhand der Fledermausart C. perspicillata sollen innerhalb der vorliegenden Studie verschiedene offene Fragestellungen bezüglich der Innenohrmechanik näher beleuchtet werden. Um sich diesen Fragestellungen anzunähern, wurde eine Kombination aus zwei etablierten Methoden verwendet. Zum einen die Messung von Distortions-Produkt otoakustischen Emissionen (DPOAEs), welche auf Grund ihrer Generierung durch aktive Prozesse innerhalb der Kochlea die Möglichkeit bietet, Veränderungen im Innenohr festzustellen und zum anderen kontralaterale akustische Stimulation (KAS), welche eine erprobte Methode zur Aktivierung des efferenten Systems darstellt. Dadurch, dass die äußeren Haarsinneszellen in der Kochlea direkte synaptische Kontakte mit efferenten Fasern der absteigenden Hörbahn eingehen, kann eine Aktivierung des efferenten Systems Modulationen des kochleären Verstärkers bewirken, wodurch sich wiederum die Antworteigenschaften der Kochlea verändern. Mit einer Kombination dieser beiden Methoden lassen sich demnach zum einen höhere Zentren der Hörbahn aktivieren, die über efferente Fasern einen direkten Einfluss auf das Innenohr nehmen, zum anderen die induzierten Modulationen in Form von DPOAEs mit Hilfe eines sensitiven Mikrofons aufnehmen. Die Grundvoraussetzung für die Funktionalität dieser Methodenkombination ist das Vorhandensein von efferenten Fasern innerhalb der Kochlea. Da das efferente System verschiedener Säuger eine große Diversität aufweist, wurden innerhalb dieser Arbeit zusätzlich zu den akustischen Untersuchungen histologische Schnittserien der Kochlea von C. perspicillata angefertigt. Hierbei lag das Hauptaugenmerk auf dem Verlauf der efferenten Fasern innerhalb der Kochlea. Mit Hilfe der Thiocholinmethode wurde der Ort der Umsetzung des Achetylcholinabbauenden Enzyms Achetylcholin-esterase angefärbt. Achetylcholin ist der vorranig vorkommende Transmitter an den efferenten Synapsen.
Diese Studie untersucht weiter den Einfluss der Narkose auf das Innenohr. In zahlreichen Studien, die Innenohrmechanik betreffend, wurden die Untersuchungen an narkotisierten Tieren durchgeführt. Oftmals wird zwar die Problematik der möglichen Beeinflussung des Innenohres durch das verwendete Narkosemittel diskutiert, aber meisthin als unumgänglich eingestuft. Innerhalb der vorliegenden Studie wurde ein Großteil der Experimente an narkotisierten und auch wachen Tieren durchgeführt, um die Auswirkungen der häufig verwendeten Ketamin-Xylazin-Narkose auf die Innenohr-aktivität zu verdeutlichen.
In der Literatur lässt sich eine Vielzahl von akustischen Untersuchungen finden, in denen artifizielle Stimuli wie Reintöne oder Rauschen verwendet werden. Die Problematik dahinter ergibt sich daraus, dass diese Art der Töne in der Natur selten zu finden sind. Derartige Studien werfen daher die Frage auf, ob das Innenohr beispielsweise Rauschstimuli auf die gleiche Weise verarbeitet wie natürliche, komplexere Stimuli. Innerhalb der vorliegenden Studie wurden demzufolge im Vergleich zu artifiziellen Stimuli arteigene Rufe der Fledermausspezies C. perspicillata aufgenommen und als akustische Stimuli während der Messungen verwendet.
Im Zuge dieser Fragestellung wurde in einem weiteren Teilprojekt versucht ein neues Verfahren zur Messung von OAEs zu etablieren, mit dem es möglich ist das Ohr nicht ausschließlich mit den herkömmlich verwendeten Reintönen zu stimulieren, sondern ebenfalls mit komplexen Lauten, wie arteigenen Kommunikations- und Echo-ortungsrufen. Hierfür wurde ein von Douglas Keefe vorgestelltes Paradigma zur Messung von OAE-Residualen herangezogen, welches die am Trommelfell gemessenen akustischen Signale von den Trommelfellantworten auf einzelne Komponenten dieser Signale subtrahiert.
Anhand der in dieser Studie gewonnenen Ergebnisse kann deutlich gezeigt werden, dass eine akustische Stimulation der kontralateralen Kochlea mit verschiedenen artifiziellen sowie arteigenen Stimuli zuverlässig eine Änderung des Pegels der 2f1-f2 DPOAE von bis zu 37,3 dB in der ipsilateralen Kochlea bei wachen Tieren bewirkt. Dabei unterscheidet sich die Art der Beeinflussung deutlich je nach verwendetem kontralateralem Stimulus. Die Stimulation mit artifiziellem Breitbandrauschen supprimiert den Emissionspegel über den gesamten getesteten Frequenzbereich um etwa 11,6 dB, während die verwendeten arteigenen Laute eine vergleichbare Beeinflussung des DPOAE-Pegels ausschließlich in einem Frequenzbereich zwischen 50 und 70 kHz bewirken. Im Frequenzbereich von 20 bis 30 kHz verursachen die arteigenen Laute nahezu keine Pegelabsenkung, was im deutlichen Kontrast zu den Ergebnissen unter KAS mit Breitbandrauschen steht. Unter Narkoseeinfluss konnte, unabhängig vom verwendeten Stimulus, keine Beeinflussung des DPOAE-Pegels festgestellt werden, was die Annahme bestätigt, dass die verwendete Ketamin-Xylazin-Narkose einen drastischen Einfluss auf den Hörprozess und insbesondere auf das efferente System nimmt. Die Ursache dafür, dass arteigene Stimuli anders verarbeitet werden als artifizielle Stimuli (wie z. B. Breitbandrauschen) konnte zwar nicht abschließend geklärt werden, aber die Vermutung liegt nahe, dass in diesem Verarbeitungsprozess höhere Zentren der Hörbahn involviert sind und selektiven Einfluss auf die ablaufenden Prozesse nehmen.
Die Etablierung des OAE-Residual-Messparadigmas auf der Basis der Methode von Keefe und Ling (1998) sollte die Möglichkeit bieten sowohl Reintöne als auch komplexe, arteigene Stimuli zu verwenden und so eine Erweiterung des herkömmlich verwendeten Messverfahrens darstellen. Über verschiedene Vorversuche unter Anwendung einer Zweitonreizung konnte gezeigt werden, dass die Ergebnisse des neu entwickelten Paradigmas mit denen der herkömmlichen DPOAE-Messungen hinsichtlich Reintonstimuli vergleichbar sind. Anhand der gewonnenen Ergebnisse mit einer Stimulation mit komplexen Signalen zeigen sich allerdings die Schwierigkeiten der neuen Methode. Die bisher erhobenen Daten zeigen keine klaren, reproduzierbare Ergebnisse, sollten aber die Grundbedingungen für die weiterführenden Versuche ebnen.
Mikroalgen wird aufgrund ihrer photoautotrophen Lebensweise, ihrer meist einfachen Anzucht und ihres schnellen Wachstums ein großes Potential als Produzenten verschiedener Stoffe, wie beispielsweise den Sekundärmetaboliten der Carotinoidbiosynthese, zugesprochen. Zur Produktion solcher Stoffe bedarf es der Aufklärung der in einem Biosyntheseweg operierenden Enzyme und ihrer zugehörigen Gene.
In dieser Arbeit sollte einerseits durch genetische Modifikation der Carotinoidbiosynthese der Fucoxanthingehalt erhöht und andererseits die Produktion von Astaxanthin in P. tricornutum erreicht werden. Bisher fehlen experimentelle Nachweise über die Funktion, Regulation und die limitierenden Eigenschaften daran beteiligter Gene und deren Enzyme. Um dem Ziel der Arbeit näher zu kommen, wurden zuerst potentiell an der Regulation der Carotinoidbiosynthese beteiligte Gene ausgewählt und deren Enzyme funktionell charakterisiert. Eines dieser Enzyme ist das Eingangsenzym der Carotinoidbiosynthese, die Phytoen-Synthase. Die entsprechend annotierte putative Sequenz (psy #Pt56881) wurde zur Analyse herangezogen. Nachdem im Rahmen dieser Arbeit über die Komplementation in einem dafür ausgerichteten E. coli Stamm der funktionelle Nachweis der Phytoen-Synthase erbracht werden konnte, wurde untersucht, ob die Phytoen-Synthase einer lichtabhängigen Expression unterliegt und somit die Carotinoidsynthese im WT von P. tricornutum limitiert. Durch die Inhibierung der Phytoen-Desaturase mittels Norflurazon konnte die verstärkte Akkumulation des Produktes der Phytoen-Synthase, Phytoen, bei einem Transfer der P. tricornutum-Kulturen von Schwach- in Starklicht gezeigt werden. Die Expression der Phytoen-Synthase von P. tricornutum wird demnach durch die Lichtbedingungen reguliert und limitiert auch die Carotinoidsynthese. Ein weiteres an der Carotinoidsynthese beteiligtes Enzym ist die Zeaxanthin-Epoxidase. Sie bietet zugleich eine Möglichkeit, an dieser Stelle die Carotinoidsynthese in Richtung Astaxanthinproduktion umzulenken. Für P. tricornutum sind drei potentielle Genkandidaten (zep1: #Pt45845; zep2: #Pt56488; zep3: #Pt56792) annotiert, welche ebenfalls im Rahmen dieser Arbeit funktionell charakterisiert wurden. Der funktionelle Nachweis erfolgte dabei ebenfalls mittels eines Komplementationsansatzes in einem damit neu etablierten Expressionssystem mit npq2-Mutanten aus der Modellpflanze A. thaliana. Die Analyse der Transformanden zeigte eine Epoxidase-Aktivität des Produktes aus zep2 und zep3. Das Enzym Zeaxanthin-Epoxidase 2 weist dabei eine andere Spezifität auf als die Zeaxanthin-Epoxidase 3, welche funktionell betrachtet der Zeaxanthin-Epoxidase aus A. thaliana am nächsten kommt. Die Zeaxanthin-Epoxidase 2 akzeptiert im Unterschied zu Zeaxanthin-Epoxidase 3 neben Zeaxanthin auch andere Substrate wie Lutein mit nur einem 3 Hydroxy-β-Iononring und stellt damit einen validen Kandidaten für die Umwandlung von Diatoxanthin in Diadinoxanthin in P. tricornutum dar. Obwohl die Transkriptanalysen ausreichende Mengen an RNA von zep1 in A. thaliana zeigen und anhand eines zusätzlichen mit der Sequenz für GFP markierten zep1-Konstruktes in WT-Protoplasten von A. thaliana der Import in den Chloroplasten und die Expression nachgewiesen werden konnte, weist die Zeaxanthin-Epoxidase 1 zumindest in den A. thaliana-Transformanden keine Epoxidase-Aktivität auf. Des Weiteren zeigt die diurnale Expression in P. tricornutum, dass die Regulation der Zeaxanthin-Epoxidasen an den Bedarf photoprotektiver Pigmente angepasst wird. Während die Regulation des Transkript-Levels von zep2 und zep3 nahezu parallel laufen und ein gemeinsames Maximum aufweisen, zeigt das Transkript-Level von zep1 ein anderes Maximum.
Die gewonnenen Erkenntnisse wurden dann zur Steigerung der Synthesekapazität mittels genetischer Modifikation des Carotinoidsyntheseweges in P. tricornutum angewendet. Durch das Einbringen zusätzlicher Genkopien der Phytoen-Synthase in P. tricornutum konnte dabei eine deutliche Steigerung des Fucoxanthingehalts unter Schwachlichtbedingungen erreicht werden. Gleichzeitig konnte durch weitere inhibitorische Versuche mittels Norflurazon beim Transfer von Schwach- zu Starklicht demonstriert werden, dass die Carotinoidsynthese durch die Kombination der genetischen Modifikation mit der Phytoen-Synthase und Starklicht per se weiterhin gesteigert werden kann. Zusammen mit den Transkriptanalysen zeigen die Pigmentanalysen, dass es einen nicht-linearen Zusammenhang zwischen RNA-Menge und gebildeter Phytoenmenge gibt, welcher durch eine zusätzliche Substratlimitierung der Phytoen-Synthase erklärt werden kann.
Bevor das Herunterregulieren der Zeaxanthin-Epoxidasen in P. tricornutum durchgeführt und damit ein verstärkter Fluss zur Astaxanthinbildung erreicht werden sollte, wurde das Potential von P. tricornutum zur Astaxanthinproduktion überprüft. Hierfür wurde die β-Carotin-Ketolase (bkt #CrAEA35045.1) aus C. reinhardtii einmal ohne und zusätzlich mit verschiedenen Präsequenzen fusioniert separat in P. tricornutum eingebracht. Astaxanthin konnte trotz Nutzung funktionell bestätigter Präsequenzen aus der Literatur nicht nachgewiesen werden. Die Versuche zeigen damit, dass hier noch weitere Untersuchungen nötig sind, um mittels eines geeigneten Transportsystems Fremd-Proteine in den Chloroplasten von P. tricornutum einzubringen. Das Ausbleiben der Astaxanthinproduktion konnte an dieser Stelle nicht hinreichend geklärt werden.
Insgesamt schaffen die Ergebnisse dieser Arbeit eine weitere Grundlage, um die Carotinoidbiosynthese in P. tricornutum besser zu verstehen und diese mittels genetischer Modifikationen biotechnologisch nutzbar zu machen.
Seit mehr als 200 Jahren gibt es durch die Wissenschaftler der Wetterstation auf dem Hohenpeißenberg systematische Wetterbeobachtungen, doch erst seit wenigen Jahren gibt es unter den Klimaforschern einen Konsens, dass sich das Klima durch anthropogene Einflüsse schon verändert hat – und weiter verändern wird. Die bisherigen Auswirkungen, wie zum Beispiel ein globaler Temperaturanstieg von 0,85°C seit Beginn der Industrialisierung, sind heute gut belegbar. Mögliche zukünftige Entwicklungen des Klimas werden heute ebenso erforscht wie die Auswirkungen des Klimawandels auf Mensch und Umwelt. Zu diesen Auswirkungen gehören unter anderem Folgen für die Landwirtschaft. Durch veränderte Niederschläge und den Temperaturanstieg werden sich die Lebensbedingungen von Bodenorganismen und Anbaubedingungen für Pflanzen ändern. Letztendlich ist aufgrund dieser Veränderungen auch ein verstärkter Einsatz von Pestiziden zu erwarten. Allerdings wurde bisher kaum untersucht, ob der Einsatz von Pestiziden in der Landwirtschaft unter den Bedingungen des Klimawandels (konkret durch die Interaktion von klimatischen und chemischen Faktoren) ein erhöhtes Umweltrisiko für Bodenorganismen darstellt. Bisher werden klimatische Faktoren bei den Tests für die Zulassung von Pestiziden nicht berücksichtigt.
Daher wurde diese Fragestellung in der hier vorliegenden Dissertation am Beispiel der Effekte von zwei zugelassenen Pestiziden auf Bodenorganismen unter verschiedenen klimatischen Bedingungen untersucht. Konkret wurden dazu mit Labor- und Halbfreilandversuchen die Wirkung eines Insektizids und eines Fungizids in Interaktion von Temperatur und Bodenfeuchte auf Vertreter zweier Invertebratengruppen (Collembola: zwei Arten; Enchytraeidae: eine Art) untersucht.
In einem modifizierten Standardtest mit Collembolen erhöhte sich die Toxizität des Insektizids Lambda-Cyhalothrin, wenn die Exposition der beiden Arten bei einer erhöhten Bodenfeuchte stattfindet. Die kühl adaptierte Art Folsomia candida reagierte bei erhöhter Testtemperatur am empfindlichsten auf diese Testsubstanz: Die EC50 aus diesem Experiment lag bei 2,84 mg (a.s.)/kg Boden Trockengewicht (dw). Unter Standardbedingungen, wie sie in Tests für die Zulassung von Pestiziden angewandt werden, lag die EC50 von F. candida dagegen bei 8,65 mg a.s./kg dw.
Unter den gleichen Versuchsbedingungen wurde auch das Fungizid Pyrimethanil an Collembolen getestet. Hier erwies sich die Testsubstanz für beide Arten bei
gleichzeitigem Trockenstress und / oder erhöhter Temperatur als toxischer im Vergleich zu den Standard-Testbedingungen. Dabei zeigte F. candida mit einer EC50 von 28,3 mg a.s./kg dw die höchste Empfindlichkeit. Ohne die veränderten klimatischen Faktoren, betrug die EC50 von F. candida 52,3 mg a.s./kg dw.
In Reproduktionstests mit der Enchytraeen-Art Enchytraeus bigeminus wurde die Bodenfeuchte als klimatischer Faktor in Kombination mit jeweils einer Testsubstanz untersucht. Bei beiden Chemikalien reagierte E. bigeminus in trockenem Boden empfindlicher. Die ermittelten EC50 betrugen 1,34 mg a.s./kg dw für Lambda-Cyhalothrin und 437 mg a.s./kg dw für Pyrimethanil. Getestet unter Standardbedingungen lagen die EC50-Werte bei 3,79 bzw. 499 mg a.s./kg dw.
Neben den Laborexperimenten wurden Tests in „Terrestrischen Modellökosystemen“ (TME) mit den gleichen Chemikalien in Kombination mit variierender Bodenfeuchte als klimatischer Faktor vorgenommen. Diese Experimente wurden in Deutschland und in Portugal durchgeführt, um die Reaktion einer zentraleuropäischen und einer mediterranen Artengemeinschaft zu untersuchen. Aus der terrestrischen Lebensgemeinschaft wurden verschiedene Organismengruppen untersucht. Die Effekte auf Enchytraeen aus dem Experiment mit Pyrimethanil waren als Veröffentlichung Teil dieser Dissertation. In der portugiesischen Halbfreilandstudie wurden keine Effekte auf die Enchytraeen durch Pyrimethanil bei umweltrelevanten Konzentrationen festgestellt, jedoch beeinflusste die Bodenfeuchte die Zusammensetzung der Artengemeinschaft. Im deutschen TME-Experiment wurde eine verstärkte Wirkung des Fungizids in trockenem Boden festgestellt, d.h. die jeweiligen Effektkonzentrationen (niedrigste EC50 3,48 mg a.s./kg dw für Fridericia connata in trockenem Boden) lagen deutlich unterhalb der aus den Labortests mit Enchytraeus bigeminus bekannten Werten (499 mg a.s./kg dw).
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass klimatische Faktoren die Effekte von Pflanzenschutzmittel auf Bodenorganismen beeinflussen können. Für Laborversuche ist eine generelle Berücksichtigung von klimatischen Faktoren im Zulassungsverfahren aus heutiger Sicht zu weit gegriffen. Die TME-Versuche zeigten sich als geeignetes Testverfahren, interaktive Effekte von Pestiziden und Klima bzw. multiplen Stressoren generell auf Artengemeinschaften zu untersuchen. Für TME-Experimente wäre unter Beachtung der Vielzahl möglicher Fragestellungen, Endpunkte und moderner statistischer Auswerteverfahren eine internationale Richtlinie wünschenswert.
Effekte von Neonikotinoiden auf die Aktivität des Muskels M17 und das Lernverhalten der Honigbiene
(2015)
Im Rahmen dieser Arbeit wurden Untersuchungen zur Auswirkung von Neonikotinoiden auf die Muskelspikeaktivität des Muskels M17 und auf das Lernvermögen in einer komplexen Aufgabe an der Honigbiene (Apis mellifera carnica) durchgeführt. Dabei wurden drei verschiedene Substanzen verwendet: Clothianidin, Thiacloprid und Imidacloprid. Neonikotinoide stehen häufig im Verdacht, für das Sterben von Bienenvölkern verantwortlich zu sein, da die Bienen bei ihrer Nahrungssuche an behandelten Pflanzen den Substanzen ausgesetzt sind und diese möglicherweise damit auch an ihr Volk weitergeben. Die vorliegende Arbeit soll dazu beitragen, diese mögliche Gefährdung der Honigbiene durch Neonikotinoide weiter aufzuklären und deren Risiken zu beurteilen. Der Hintergrund für die Versuche zur Muskelspikeaktivität waren vorangegangene Versuche, die Auswirkungen von Neonikotinoiden auf die Motorik von sich frei bewegenden Individuen dokumentierten. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob sich diese Effekte auch an der Spikeaktivität des Muskels M17 widerspiegeln. Dafür wurden Elektromyogramme des Muskels M17 zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Gabe der Substanzen erstellt und deren mediane Anzahl mit einer Kontrollgruppe verglichen.
In einem ersten Versuch wurden Clothianidin (1 µM), Thiacloprid (1 µM), Imidacloprid (1 µM) oder eine Kontrollsubstanz (PBS) in die Kopfkapsel appliziert. Beim Vergleich mit der Kontrollgruppe zeigten sich für Imidacloprid keine Auswirkungen. Clothianidin verursachte eine deutlich erhöhte mediane Spikerate des Muskels M17, während Thiacloprid diese absenkte, beides im Vergleich zur Kontrollgruppe. Auch bei einer um 30 Minuten versetzten Doppelapplikation von Clothianidin (1 µM) und Thiacloprid (10 µM) stellten sich diese Effekte ein, wobei Clothianidin eine dominante Rolle einzunehmen scheint. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit Untersuchungen zur Laufaktivität, welche sich ebenfalls durch Clothianidin erhöhte und durch Thiacloprid absenkte.
Ein weiteres Experiment untersuchte die Auswirkung einer akuten Fütterung mit Clothianidin (1 ng in 1 µl) bzw. Thiacloprid (250 ng in 1 µl) auf die Anzahl der Muskelaktionspotenziale. Auch hier zeigt sich eine deutliche Erhöhung der Spikeanzahl durch Clothianidin und eine Absenkung der Spikeanzahl durch Thiacloprid, was die Ergebnisse des ersten Versuchs nochmals bestätigt.
Des Weiteren wurden Untersuchungen zur Auswirkung einer chronischen Fütterung mit Clothianidin (50 ppb) bzw. Thiacloprid (5000 ppb) auf die Anzahl an Spikes durchgeführt. Die Bienen wurden dabei über mehrere Wochen im Volk mit den jeweiligen Substanzen gefüttert. Dabei zeigte sich, dass auch eine chronische Fütterung der Bienen mit Clothianidin ihre Anzahl an Muskelaktionspotenzialen deutlich erhöht, während eine chronische Fütterung mit Thiacloprid diese absenkt. In einer Kombination der chronischen Fütterung mit einer zusätzlichen akuten Fütterung des jeweils anderen Neonikotinoids zeigte sich, dass auch hier Clothianidin eine dominante Rolle gegenüber Thiacloprid einnimmt und auch keine synergistischen oder Gewöhnungseffekte der beiden Substanzen eintreten. Die chronisch eingefütterten Völker entwickelten sich dagegen wie die Kontrollvölker, sodass die hier beschriebenen Auswirkungen auf die Einzelbiene keine sichtbaren Effekte auf ganze Völker zu haben scheinen.
Zusätzlich wurden Versuche zum Duftlernen in einer komplexen Lernaufgabe, dem positiven Patterning, unter Einfluss von Clothianidin durchgeführt. Die Bienen müssen dabei zwischen unbelohnten Einzeldüften und einem belohnten Duftgemisch, bestehend aus den beiden Einzeldüften, unterscheiden. In verschiedenen Versuchsdurchläufen wurden 0,25 ng oder 1 ng Clothianidin (jeweils 1 µl) in den Thorax injiziert, entweder vor der Akquisitionsphase oder vor dem ersten Abruftest nach drei Stunden. In keinem der Versuchsdurchläufe zeigten sich Effekte des Clothianidins auf den Lernvorgang, weder in der Akquisitionsphase noch in den Abruftests. Somit wurden weder das Lernen an sich, noch die Konsolidierung und damit die Überführung des Gelernten in das Langzeitgedächtnis durch das Clothianidin beeinflusst. Allerdings könnte die Immunabwehr der Bienen nach längerer Einwirkung des Clothianidins (24 h) in der höheren Konzentration herabgesetzt sein, da viele Bienen starben.
Insgesamt ergaben sich Effekte von Clothianidin und Thiacloprid auf die Anzahl der Aktionspotenziale des Muskels M17, die sich aber im gesamten Volk nicht widerspiegeln. Der Lernvorgang in der hier durchgeführten komplexen Lernaufgabe wird durch Clothianidin nicht beeinflusst. Möglicherweise entsteht dieser Unterschied in den Ergebnissen durch eine Bindung der Substanzen an verschiedene Rezeptorsubtypen, die pharmakologisch unterschiedliche Eigenschaften besitzen und somit auch unterschiedliche Auswirkungen zeigen.
Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss sowohl akuter als auch chronischer Aufnahme subletaler Mengen des Insektizids Thiacloprid auf Einzelbienen und Bienenvölker untersucht. Anlass für diese Art an Untersuchungen gibt ein seit Jahren in Nordamerika und Europa auftretendes unerklärliches Phänomen, „Colony Collapse Disorder“ genannt, bei dem Bienenvölker durch einen plötzlichen Verlust der Flugbienen zusammenbrechen. Als Ursache für das Völkersterben stehen neben anderen Faktoren wie Parasiten, Pathogenen und Umweltfaktoren die Insektizide aus der Gruppe der Neonikotinoide und deren Auswirkungen auf Bienen in subletalen Mengen im Verdacht. Basierend auf Studien der Europäischen Behörde für Lebensmittelsicherheit (EFSA) wurde der zugelassene Einsatz der drei Neonikotinoide Clothianidin, Imidacloprid und Thiamethoxam im Pflanzenschutz für zunächst zwei Jahre durch die EU-Kommission stark eingeschränkt.
Thiacloprid, ein weiteres Insektizid, welches zur Gruppe der Neonikotinoide gehört, ist weiterhin für den Einsatz im Pflanzenschutz zugelassen. Es wirkt in ähnlicher Weise wie die zuvor genannten Neonikotinoide als Agonist am nikotinischen Acetylcholinrezeptor, wobei es jedoch als weniger toxisch für Bienen gilt. Trotzdem sind subletale Auswirkungen dieses Neonikotinoids auf Bienen denkbar, die sich in Verhaltensänderungen der Bienen äußern und als Folge Einfluss auf das gesamte Bienenvolk nehmen könnten.
In der hier vorliegenden Arbeit wurden in chronisch mit Thiacloprid eingefütterten Völkern über mehrere Monate regelmäßige Populationsschätzungen durchgeführt, um die Entwicklung der Bienenvölker unter Aufnahme von Thiacloprid festzustellen. In einem weiteren Versuch wurde die Entwicklung der Brut unter chronischer Fütterung mit Thiacloprid beobachtet. Zusätzlich wurde eine große Zahl an Bienen mit RFID-Transpondern ausgestattet, um das Flugverhalten zu dokumentieren. Insbesondere wurden hier der Zeitpunkt des ersten Ausflugs und die Lebensdauer der Bienen zu Vergleichen herangezogen. Nach akuter Fütterung einer subletalen Einzeldosis Thiacloprid wurden Versuche zum Heimkehrvermögen von Bienen durchgeführt.
Unter feldrelevanten und bis zu zehnfach höheren Thiacloprid-Konzentrationen wurden keine beeinträchtigenden Einflüsse auf die Volksentwicklung beobachtet. Bei Konzentrationen, die um ein 25faches bzw. ein 40faches höher als die feldrelevante Konzentration waren, wurde festgestellt, dass die Brutzellenanzahl im Verhältnis zur Bienenanzahl verringert war. Bienen aus chronisch mit Thiacloprid eingefütterten Völkern starteten mit höherem Alter zu ihrem ersten Flug aus dem Bienenstock. Die Zeit, die die Bienen als Sammlerinnen verbrachten, änderte sich nicht. Durch Beobachtungen der Brutflächen konnte festgestellt werden, dass sich die Brut in Thiacloprid-gefütterten Völkern entsprechend der Brut in Kontrollvölkern entwickelte. Aufgrund weiterer Ergebnisse wurde eine Störung der olfaktorischen Wahrnehmung von Bienen aus Thiacloprid-gefütterten Völkern vermutet. Die akut verabreichte subletale Dosis an Thiacloprid führte zu einem erheblichen Verlust an heimkehrenden Bienen und deutet auf eine Beeinträchtigung des Orientierungs- bzw. Navigationsvermögens der Bienen hin.
In den durchgeführten Versuchen wurden sowohl direkte Auswirkungen von chronischer und akuter Aufnahme subletaler Mengen an Thiacloprid, als auch indirekte Auswirkungen auf Honigbienen beobachtet. Da teilweise erst bei hohen, nicht feldrelevanten Konzentrationen in den Versuchen Effekte beobachtet wurden, kann nur bedingt durch die Verhaltensänderung von Einzelbienen auf daraus resultierende Auswirkungen auf ein gesamtes Bienenvolk unter realistischen Bedingungen geschlossen werden.
Habituation ist eine der einfachsten Formen des Gedächtnisses. Hierbei handelt es sich um die erlerne Gewöhnung an einen harmlosen Reiz. Dies bedeutet, dass nach mehrfacher wiederholter Repräsentation eines harmlosen Reizes die Reaktion darauf stetig abnimmt, bis sie völlig zum erliegen kommt. Je nach Trainingsprotokoll kann diese Gewöhnung bis zu mehren Tagen andauern. Habituation ist hoch konserviert und ein Verhaltensmuster, dass auch bei sehr einfachen vielzelligen Organismen zu finden ist und untersucht werden kann. Zur Untersuchung des Zusammenspiels innerhalb eines neuronalen Netzwerkes, welches für die Habituation des Rückzugsreflexes (Ausweichreaktion nach Berührung) verantwortlich ist wurde hier der Fadenwurm Caenohabditis elegans (C. elegans) als Modell Organismus verwendet. Aufgrund seines einfachen, nur 302 Zellen umfassenden, Nervensystems eignet sich C. elegans sehr gut für Grundlagenforschung in diesem Bereich. Das neuronale Netzwerk, das verantwortlich ist für den Rückzugsreflex ist in drei Ebenen organisiert. Wahrgenommen wird der Reiz von sensorischen Neuronen (ASH, ALM, AVM, PLM, PVM). Die Weiterleitung erfolgt über verschiedene Interneuronen (AVA, AVB, AD, AVE, PVC) hin zu den Motorneuronen, welche die Muskeln enervieren und somit die Reaktion auf den in erster Ebenen wahrgenommen Reiz auslösen.
Mit Hilfe von optogenetischen Werkzeugen wurde hier Untersucht welche Rolle einzelne Zellen innerhalb dieses Netzwerkes innehaben und an welcher Stelle innerhalb des Netzwerkes die kurzzeitige Habituation des Reizes, nach einem Einfachen Lernprotokoll stattfindet. Zuerst musste eine Möglichkeit gefunden werden die zur Verfügung stehenden optogenetischen Werkzeuge zellspezifisch zu exprimieren. In dieser Arbeit wurden hierfür Rekombinasesysteme verwendet, die es ermöglichten zur Expression eine Kombination aus 2 verschiedenen Promotoren zu verwenden. Beide Promotoren dürfen hierbei nur in einer Zelle, der Zielzelle, überlappen. Es konnte zellspezifische Expression des Kationenkanals Chanelrhodopsin 2 (ChR2) in den beiden Zellparen AVAL/R und ASHL/R (nimmt aversive Reize wahr) erreicht werden.
Zur Untersuchung der Habituation wurde zusätzlich noch ein Wurmstamm verwendet, welcher ChR2 unter dem mec-4 Promotor exprimiert. ChR2 ist hier in den Mechanorezeptorneuronen (MRN) ALM, AVM, PLM und PVM exprimiert. Die hier durchgeführten Experimente deuten darauf hin das den MRNs die Größte Rolle bei der Ausbildung einer Habituation zukommt. Es gibt jedoch auch Hinweise darauf, dass AVA zusätzlich eine Rolle spielt.
Im weiteren Verlauf der Arbeit wurde die Rolle von AVA genauer untersucht. AVA gilt als der Hauptsignalgeber für eine Rückwärtsbewegung (spontan und nach Reizempfang). Es konnte gezeigt werden dass eine Unterbrechung der ’Gap Junktionen’ zwischen AVA und PVC eine stärkere Reaktion zur Folge haben. AVA scheint also durch PVC inhibiert zu werden. Ebenfalls mit AVA direkt interagierende Neuronen sind AVD und AVE. Mit den hier zur Verfügung stehenden Mitteln konnte die genaue Modulation von AVA durch diese Zellen jedoch nicht gezeigt werden.
In dieser Arbeit konnte der Grundstein für eine funktionale Aufklärung des Nervensystems von C. elegans gelegt werden. Vor allem durch die Möglichkeit der zellspezifischen Expression kann es zukünftig gelingen das Zusammenspiel der einzelnen Nervenzellen und ihren Anteil an einem bestimmtem Verhalten zu Untersuchen.
Photosynthese zwischen Überfluss und Mangel : wie Kieselalgen sich Lichtintensitäten anpassen
(2015)
Kieselalgen können auf hocheffiziente Weise Energie aus dem Sonnenlicht gewinnen. So überleben sie selbst lange Dunkelphasen im Meer. Doch wie schützen sie sich vor zu viel Strahlung, wenn Wind und Strömung sie in seichtes Wasser oder an die Oberfläche treiben? Dahinter steckt ein cleverer Regulations-Mechanismus.
Der unscheinbare Fadenwurm "C. elegans" ist einer der ersten und bis heute wichtigsten Modellorganismen der Optogenetik. Zwei Frankfurter Arbeitsgruppen gelang es vor zehn Jahren erstmals, das Tier genetisch mit lichtaktivierbaren Ionenkanälen auszustatten und seine Bewegungen mit Licht zu steuern. Inzwischen studieren Forscher an dem durchsichtigen Wurm auch Prozesse, die für die medizinische Forschung bedeutsam sind – etwa die Entstehung und Behandlung genetisch bedingter Herz-Rhythmus-Störungen.
Die Endometriose ist eine gynäkologische Erkrankung, bei der epitheliale und stromale Zellen des Endometriums Läsionen außerhalb des Uterus bilden, die in ihrem Aufbau dem Endometrium gleichen. Diese Läsionen, sowie deren zyklische Proliferation, führen zu Schmerzen bei betroffenen Frauen. In isolierten, invasiven Epithelzellen (EEC145T) einer Endometriose-Läsion konnte die Expression von Shrew-1 gezeigt werden. Auch in anderen zellulären Zusammenhängen fördert die Expression von Shrew-1 den invasiven Phänotyp. Shrew-1 ist ein Transmembranprotein, das in Epithelzellen mit den Adhärenzverbindungen assoziiert ist und Interaktionen mit β-Catenin und E-Cadherin eingeht. In MCF7-Zellen fördert die Expression von Shrew-1 die EGF-induzierte Internalisierung von E-Cadherin, welche zur Verminderung der Zell-Zell-Adhäsion führt. In 12Z- und HT1080-Zellen konnte eine Interaktion mit CD147 gezeigt werden. CD147 fördert die Aktivität von MMPs und in Shrew-1-überexprimierenden HT1080-Zellen konnte eine erhöhte Aktivität der MMP9 gezeigt werden. Shrew-1 wirkt somit auf die Invasivität von Zellen und ist gleichzeitig Teil der Adhärenzverbindung. Aus diesem Grund wird Shrew-1 eine modulatorische Rolle in diesem Kontext zugeschrieben.
In immunhistologischen Färbungen von Shrew-1 und E-Cadherin konnte in Adenomyose-Läsionen eine inverse Expression der beiden Proteine in einigen epithelialen Zellen gezeigt werden, die im Endometrium nicht detektiert werden konnten. In den epithelialen Endometriose-Zelllinien 12Z und 49Z, die kein E-Cadherin exprimieren und äquivalent zu der Zelllinie EEC145T sind, führte die Herunterregulation von Shrew-1 (Shrew-1 KD) zur Reexpression von E-Cadherin. E-Cadherin ist in den 12Z Shrew-1 KD-Zellen an der Plasmamembran lokalisiert und interagiert mit β-Catenin, wodurch seine Assoziation mit den Adhärenzverbindungen wahrscheinlich ist. Die Herunterregulation von Shrew-1 führt zu einer verminderten Motilität und Invasivität der 12Z-Zellen, wobei die reduzierte Invasivität nicht alleine auf die Reexpression von E-Cadherin zurückgeführt werden kann. Es ist zu vermuten, dass das verminderte invasive Verhalten mit der ausbleibenden Interaktion von Shrew-1 mit CD147 zusammenhängt, welches die Aktivität von MMPs fördert.
Da Shrew-1 eine direkte Interaktion mit β-Catenin eingehen kann, ist es möglich, dass die Herunterregulation von Shrew-1 zu Veränderungen in der Lokalisation von β-Catenin und weiteren Proteinen, die mit den Adhärenzverbindungen assoziiert sind (p120 Catenin und Aktin), führen. Dies konnte jedoch nicht beobachtet werden. Eine verstärkte Lokalisation von Vinculin an den Enden von Aktin-Stressfasern sowohl in Zellausstülpungen als auch an Zell-Zell-Kontakten konnte in 12Z-Zellen nach der Herunterregulation von Shrew-1 beobachtet werden. Dies könnte eine Folge der E-Cadherin-Reexpression oder entscheidend für die Lokalisation von E-Cadherin an der Membran sein.
Die Reexpression von E-Cadherin, die in den 12Z Shrew-1 KD-Zellen auf mRNA- und Protein-Ebene nachgewiesen werden kann, erfolgt in den 12Z-Zellen vermutlich hauptsächlich über Veränderungen von Histon-Acetylierungen, da die Behandlung mit dem HDAC-Inhibitor TSA die Expression von E-Cadherin in den 12Z-Zellen induziert. Eine verstärkte H3K9-Acetylierung am CDH1-Promotor konnte in ChIP-Analysen in den 12Z Shrew-1 KD-Zellen gezeigt werden. Die gesteigerte Acetylierung resultiert vermutlich aus der verminderten Assoziation von HDAC1 und HDAC2 mit dem CDH1-Promotor in diesen Zellen. Eine Beteiligung der Repressoren Snail, Slug, Twist und ZEB1 an der Reexpression von E-Cadherin in den 12Z Shrew-1 KD-Zellen konnte nicht gezeigt werden. Ebenso scheinen Veränderungen am Methylierungsstatus des CDH1-Promotors nach der Herunterregulation von Shrew-1 nicht zu erfolgen.
TSA induziert auch in weiteren epithelialen Endometriose-Zelllinien (10Z und 49Z) die Expression von E-Cadherin. In stromalen Zellen führt hingegen weder TSA noch die Herunterregulation von Shrew-1 zur Expression von E-Cadherin (17B, 18B und 22B). Dies weist darauf hin, dass die Herunterregulation von Shrew-1 über die Veränderungen von Histon-Acetylierungen wirkt und dass dieser Mechanismus in epithelialen Endometriose-Zellen entscheidend ist. In den stromalen Zellen muss die Expression von E-Cadherin über einen anderen und/oder weitere Mechanismen blockiert sein.
Auch der Wnt-Signalweg scheint an der Reexpression von E-Cadherin in 12Z-Zellen beteiligt zu sein. Die Inhibierung der GSK3β (LiCl und SB216763) führt zur Expression von geringen Mengen an E-Cadherin. In 12Z Shrew-1 KD-Zellen führt die Stabilisierung von Axin (XAV939) zur verminderten Expression von E-Cadherin. Dies lässt darauf schließen, dass Shrew-1 auch einen Einfluss auf den Wnt-Signalweg hat, was vor allem durch dessen Interaktion mit β-Catenin wahrscheinlich ist.
Terrestrische Säugetiere werden von unterschiedlichen Parasiten als Wirte genutzt. Dabei kann ihre Parasitenfauna je nach Art, Lebensweise, Verbreitung, Gesundheitszustand und Reproduktionsstatus des Wirts abweichen. Ein weiterer bestimmender Faktor, ist der Einfluss des Menschen in Form von Regulierungsmaßnahmen und Schaffung urbaner Lebensräume. Domestizierte Haustiere bzw. Nutztiere weisen daher in der Regel andere Parasiten auf als ihre wildlebenden Artgenossen. Gleichzeitig können sich sowohl Wildtiere als auch domestizierte Tiere und Menschen gegenseitig Parasitenarten teilen und wechselseitig aufeinander übertragen. Daraus resultierende Krankheiten werden als Zoonosen bezeichnet.
Insbesondere Fledermäuse (Unterordnung Microchiroptera) zeigen weltweit eine enorme Parasitendiversität, die noch weitgehend unerforscht ist. Ebenfalls Forschungsbedarf besteht für die Sandfloh-Gattung Tunga in Süd- und Mittelamerika in Hinblick auf ihr Wirtsspektrum, welches auch Menschen einschließt. Die Art Tunga penetrans und zahlreiche weitere Parasitenarten, parasitieren gleichzeitig auch bei Hunden. Daher stellen diese Wirte eine direkte Gesundheitsgefahr für Menschen in ihrer unmittelbaren Umgebung dar.
Die vorliegende Dissertation ist in kumulativer Form zusammengefasst und beinhaltet drei Einzelpublikationen sowie einen Reviewartikel.
Ziel war es, die Parasitendiversität von Hunden aus urbanen tropischen Gebieten und die Parasitendiversität des Großen Ameisenbären (Myrmecophaga tridactyla) mit Hilfe morphologischer und molekularbiologischer Methoden zu analysieren. Die jeweiligen Parasitenfaunen wurden in Hinblick auf die soziale bzw. solitäre Lebensweise der beiden Wirtsarten verglichen und ihr zoonotisches Potenzial bewertet.
Ein weiteres Ziel war die Zusammenfassung der Ektoparasitennachweise süd- und mittelamerikanischer Microchiroptera und für die europäischen Arten der Fledermaus-Gattung Myotis (hier Endo- und Ektoparasiten) auf Basis der verfügbaren Literatur. Des Weiteren sollten eigene Parasitennachweise aus Bolivien bzw. Deutschland erfolgen. Für die Nachweise aus Deutschland wurden M. myotis untersucht, deren Artzugehörigkeit vorher bestimmt wurde. Zusätzlich wurden diese Individuen auf humanpathogene Lyssaviren untersucht.
Die Nachweise erfolgten über molekularbiologische und morphologische Methoden.
Die Substitution von klassischen, mit der Nahrungsmittelproduktion in Konkurrenz stehenden, Substraten wie Glukose durch alternative Kohlenstoffquellen in der Biotechnologie ist sowohl aus ethischer, als auch aus ökonomischer Sicht erstrebenswert. Diese Arbeit beschreibt die Synthese von Bulkchemikalien in Form zweier Dicarboxylsäuren und einer Feinchemikalie in Form eines Sesquiterpens aus dem alternativen Substrat Methanol mit Hilfe genetisch veränderter Stämme des methylotrophen α-Proteobakteriums Methylobacterium extorquens.
Mesacon- und (2S)-Methylsuccinsäure sind Dicarboxylsäurederivate der CoA-Ester Mesaconyl- und (2S)-Methylsuccinyl-CoA, die als Intermediate im Ethylmalonyl-CoA- Weg (EMCP) vorkommen. M. extorquens nutzt den EMCP für die Regeneration von Glyoxylat, das für das Wachstum auf C1-Substraten wie Methanol obligatorisch ist. In dieser Arbeit konnte erstmals Mesacon- und (2S)-Methylsuccinsäure de novo durch die Expression einer für die Vorstufen Mesaconyl- und (2S)-Methylsuccinyl-CoA aktiven Thioesterase produziert werden. Ein kobaltlimitiertes Wachstum von M. extorquens führte aufgrund mangelnder Cofaktorversorgung zweier Vitamin-B12-abhäniger Mutasen im EMCP zu einer Akkumulation der beiden CoA-Ester-Vorstufen, womit eine Produktion von 0.65 g/l Mesacon- und (2S)-Methylsuccinsäure erreicht wurde. Weitergehende Untersuchungen belegten außerdem einen positiven Effekt eines ausgeschalteten PHB-Zyklusses auf die Produktion der beiden EMCP- Dicarboxylsäurederivate.
Diese Arbeit beinhaltet zusätzlich grundlagenwissenschaftliche Untersuchungen zur Substitution der EMCP-katalysierten Glyoxylatregeneration durch einen heterologen Glyoxylatzyklus in EMCP-negativen M. extorquens-Stämmen. Dabei konnte erstmals ein methanolverwertendes, methylotrophes Bakterium identifiziert werden, das einen Serin-Zyklus in Kombination mit dem Glyoxylat-Zyklus zur Kohlenstoffassimilation verwendet, ohne dabei zusätzliche Stoffwechselwege zur CO2-Fixierung wie den EMCP, RuMP oder CBB-Zyklus zu verwenden.
Die Präsenz einer nativen C30-Carotinoidbiosynthese, ausgehend von der Vorstufe Farnesylpyrophosphat (FPP), empfiehlt M. extorquens als Produktionsorganismus für (Sesqui-)Terpene. In dieser Arbeit wurde mit Hilfe einer induzierbar gesteuerten Expression einer Terpensynthase in Form einer α-Humulen-Synthase, einer FPP-Synthase und eines prokaryontischen Mevalonatweges, erstmals die de novo Synthese eines Terpens aus Methanol am Beispiel des α-Humulens etabliert. Durch optimierte Expressionen der Terpensynthase, FPPS und einzelner MVA-Gene mit Hilfe angepasster Translationsinitiationsraten der jeweiligen ribosomalen Bindestellen und der Verwendung eines in der nativen Carotinoidbiosynthese inhibierten M. extorquens-Stammes wurden finale Produkttiter von bis zu 1.65 g/l α-Humulen in Fed-Batch-Fermentationen erreicht.
Diese kumulative Dissertation beinhaltet außerdem einen Reviewartikel, in dem der verwendete Mikroorganismus M. extorquens in mikrobiologischer, genetischer, biochemischer und auch biotechnologischer Hinsicht ausführlich beschrieben wird. Zudem gibt ein Buchkapitel eine Übersicht über die Verwendung von Methanol in der Biotechnologie.
In der vorliegenden Doktorarbeit zur Untersuchung der Rolle der Superoxid-Dismutasen in P. anserina lieferten die durchgeführten Analysen folgende Ergebnisse:
1)Sowohl in P. anserina als auch in S. cerevisiae wurde eine gemeinsame Regulation von SODs nachgewiesen: Stämme, die die mitochondriale MnSod (PaSod3 bzw. ScSod2) überexprimieren zeigen eine erhöhte Cu/ZnSOD-Aktivität (PaSOD1 bzw. ScSOD1).
2)Es konnte keine SOD-Aktivität für die putativen SODs Pa_1_10620, Pa_1_10630 und Pa_1_6300 detektiert werden. Für Pa_1_10620, dessen Überexpression unter Standardbedingungen zu einer Lebensverlängerung führt, wird eine Funktion als mitochondriales ribosomales Protein angenommen.
3)Der ∆PaSod3-Stamm weist keinen Unterschied im Phänotyp, der Wuchsrate und der Lebensspanne unter Standardbedingungen zum Wildtyp auf. Paraquat-Stress führt allerdings zu einer Kurzlebigkeit des ∆PaSod3-Stammes, wohingegen diese Mutante eine höhere Resistenz gegenüber Wasserstoffperoxid aufweist als der Wildtyp.
4)Transkriptomanalysen des Wildtyps und der ∆PaSod3-Mutante lassen vermuten, dass eine Hochregulation von Detoxifizierungs- und Energie-abhängigen Prozessen die durch den Verlust der mitochondrialen PaSOD3 vermuteten negativen Auswirkungen kompensieren.
5)PaSod3_OEx-Stämme weisen unter Standardbedingungen aufgrund der erhöhten intrazellulären Wasserstoffperoxid-Menge, bedingt durch die vermehrte Umsetzung von Superoxid, diverse negative Auswirkungen auf: Eine reduzierte Wuchsrate, verkürzte Lebensspanne, geringere Fertilität, stärkere Pigmentierung, vermehrt fragmentierte Mitochondrien, mehr unprozessierte mitochondriale Proteine und weniger Komplex IV der Atmungskette als der Wildtyp. Zusätzlich wird vermehrt über die alternative Oxidase geatmet, um die ROS-Generierung zu reduzieren.
6)Oxidativer Stress in Form von Paraquat führt in PaSod3_OEx-Stämmen zu einer weiteren Verkürzung der medianen Lebensspanne, während die maximale Lebensspanne von PaSod3_OEx3-Stämmen im Vergleich zum Wildtyp sogar verlängert ist. Wasserstoff-peroxid resultiert in stark verringerten medianen und maximalen Lebensspannen beider PaSod3-überexprimierenden Stämme.
7)Die Anzucht auf Medium mit zusätzlichem Mangan (80 µM MnSO4) kann die beobachteten Defekte der PaSod3_OEx-Stämme fast vollständig auf Wildtyp-Niveau revertieren: Die Wuchsrate, die Lebensspanne, der Phänotyp, die Mitochondrien-morphologie, die Prozessierung mitochondrialer Proteine und die Atmung entsprechen dem Wildtyp. Lediglich die Fertilität erreicht nicht das Wildtyp-Niveau. Diese positiven Effekte von Mangan werden erzielt, da die erhöhte Wasserstoffperoxid-Menge in PaSod3_OEx-Stämmen entsprechend ihrer Entstehung detoxifiziert wird, denn Mangan führt zu einer gesteigerten Transkription bzw. Aktivität von Katalasen und Peroxidasen sowie zu einer erhöhten Peroxiredoxin-Menge.
8)Die Anzucht des Wildtyps unter Wasserstoffperoxid-Stress resultiert in einer Lebens-spannenverkürzung. Diese kann durch Supplementation mit Mangan revertiert werden. Unter diesen Bedingungen weisen u. a. Peroxidasen eine erhöhte Aktivität auf.
Insgesamt ließen die gewonnenen Daten den Schluss zu, dass das Genom von P. anserina für drei aktive SODs kodiert. Ein Verlust der einzigen mitochondrial lokalisierten SOD kann durch die Induktion von Energie-abhängigen Prozessen sowie von Detoxifizierungsprozessen kompensiert werden. Ferner weisen die durchgeführten Studien darauf hin, dass PaSod3_OEx-Stämme als Modell für erhöhte intrazelluläre Wasserstoffperoxid-Mengen in P. anserina verwendet werden können. Darüber hinaus wurde ein Zusammenhang zwischen Mangan und dem Detoxifizierungs-netzwerk in P. anserina nachgewiesen. Dabei können zwei Mechanismen zur Reduktion der Wasserstoffperoxid-Mengen unterschieden werden: Bei Vorhandensein ausreichender Mengen Mangan kommt es zu einer stärkeren Detoxifizierung von Wasserstoffperoxid. Ist Mangan allerdings limitiert und die Detoxifizierung kann nicht gesteigert werden, wird eine Umstellung der Atmung eingeleitet, um die neu entstehende ROS-Menge zu minimieren.
Evaluierung der zellfreien Produktion sekundär aktiver Transporter für die Proteinkristallisation
(2013)
Stechmücken (Dipteren: Culicidae) sind weltweit mit über 3500 Arten und mit Ausnahme der arktischen Regionen ubiquitär vertreten. Die medizinische Relevanz dieser Tiergruppe, begründet durch die hämatophage Lebensweise der Weibchen, erschloss sich bereits Ende des 19. Jh. und hat bis heute Bestand. Jedes Jahr sterben rund 600.000 Menschen an den Folgen der Malaria und fast 100 Mio. Menschen infizieren sich mit dem Denguefieber. Zwar beziehen sich diese Zahlen fast ausschließlich auf die Entwicklungsländer, aber im Zuge des Klimawandels und des immer stärkeren Welthandels kommt es auch in Europa und den USA immer wieder zu Ausbrüchen vorher nicht relevanter Krankheiten. So hat sich das West-Nil- Virus seit 1999 in Nordamerika rasant verbreitet. Im Jahr 2013 gab es dort rund 2500 Fälle, von denen 119 zum Tod führten. In Europa traten hingegen Krankheiten wie das Chikungunyafieber (Italien 2007) oder das Denguefieber (Frankreich 2010/2013) auf. Die Gründe für diese Ausbrüche sind vor allem in der Einschleppung neuer Vektorspezies und Krankheitserreger sowie in den veränderten Wirtspräferenzen einheimischer Stechmückenarten zu suchen. Das Wissen um das Vektorpotential der in Deutschland heimischen Stechmücken konnte vor allem durch die seit 2009 initiierten Monitoring-Programme stetig erweitert werden. Auch die Veränderung der heimischen Fauna durch invasive Arten wie Ochlerotatus japonicus japonicus oder Aedes albopictus wird intensiv erforscht. Dennoch ist hinsichtlich der Biologie, Ökologie sowie Genetik vieler Arten noch immer wenig bekannt.
Die vorliegende Dissertation, welche auf Basis von vier (ISI-) Einzelpublikationen kumulativ angefertigt wurde, beschäftigte sich mit der Analyse der genetischen Variabilität sowie der Zoogeographie der untersuchten Arten und der Etablierung einer schnellen und kostengünstigen Methode zur Artdiagnostik. Besonderes Augenmerk wurde bei den Analysen auf die beiden heimischen Arten Culex pipiens und Culex torrentium sowie die invasive Art Ochlerotatus japonicus japonicus gelegt. Ziel war es, die noch bestehenden Wissenslücken zu füllen, um zukünftige Monitoring-Programme besser koordinieren sowie Analysen zur Vektorkompetenz und Genetik dieser Arten gezielter durchführen zu können.
Es konnte gezeigt werden, dass Cx. pipiens und Cx. torrentium deutliche Unterschiede in ihren Populationsstrukturen aufwiesen welche auf verschiedene evolutive Prozesse hindeuten. Die geringere genetische Variabilität in Cx. pipiens lässt auf positive Selektion durch z.B. Insektizidresistenz im Zuge durchgeführter Bekämpfungsmaßnahmen oder die Infektion mit Wolbachien schließen. Die analysierte Populationsstruktur von Cx. torrentium spricht hingegen für eine geringe Ausbreitung, wodurch der genetische Austausch reduziert wurde und so die untersuchten Populationen genetisch stärker voneinander abwichen. Des Weiteren ließen die Analysen des Cytochrom c Oxidase Untereinheit 1-Fragmentes (cox1) Rückschlüsse auf die Zoogeographie dieser Arten in Deutschland zu - wobei beide Arten über das Untersuchungsgebiet verteilt waren, Cx. torrentium jedoch in den neuen Bundesländern weniger häufig nachgewiesen wurde als in den alten und eine geringere gefangene Individuenzahl aufwies. Basierend auf der ökologischen Nischenmodellierung konnten potentiell neue Verbreitungsgebiete für die Art Ochlerotatus japonicus japonicus identifiziert werden. Als klimatisch besonders günstig zeigten sich dabei Südhessen, das Saarland sowie nördliche Teile Nordrhein-Westfalens. Mit Hilfe der etablierten Methode der direct-PCR wird in Zukunft eine schnellere und kostengünstigere Identifizierung von Stechmücken erfolgen können, welche aufgrund bestimmungsrelevanter Merkmale nicht mehr morphologisch zu identifizieren sind.
Um das Wissen über die Stechmücken in Deutschland fortlaufend zu intensivieren, ist sowohl das Weiterführen der Monitoring-Programme als auch die molekularbiologische Aufarbeitung der Proben nötig. Durch die Anwendung neuer Techniken und weiterer molekularer Marker wird es möglich sein, weitere Krankheitserreger sowie genetische Besonderheiten der heimischen Stechmückenfauna nachzuweisen. Aber auch die Überwachung invasiver Stechmückenarten durch die Modellierung potentieller Verbreitungsgebiete und die Anwendung molekularbiologischer Analysemethoden zum Detektieren der Arten und möglicher Krankheitserreger wird ein wichtiger Bestandteil der weiteren Forschung sein.