Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
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Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der vergleichenden funktionalen Charakterisierung der E.coli Transporter LacY, FucP und XylE und des Glucose-Transporters GlcP aus Staphylococcus epidermidis sowie funktionsrelevanter Mutanten. Sie katalysieren in vivo den PMF-gekoppelten Zuckertransport und repräsentieren die major facilitator superfamily (MFS), einer der größten Transporter-Familien überhaupt. Die Studien wurden mithilfe einer elektrophysiologischen Methode auf Basis Festkörper-unterstützter Membranen (SSM) durchgeführt. Komplementär dazu wurden radioaktive Transportassays, fluorometrische Messungen, kinetische Simulationen und theoretische Berechnungen auf Basis der 3D-Strukturen durchgeführt. Experimentell bestimmte Zucker- und pH-Abhängigkeiten elektrogener steady-state und pre steady-state Reaktionen wurden verwendet, um ein allgemeingültiges kinetisches Modell aufzustellen.
Insgesamt konnten bei allen Transportern zwei elementare elektrogene Reaktionen identifiziert werden. Eine schnelle Zucker-induzierte Konformationsänderung wurde dem induced fit des Zuckermoleküls zugeordnet. Die Elektrogenität im steady-state wird dagegen durch den langsamen Transfer der negativ geladenen Protonenbindestelle bestimmt. Die für den Symport ratenlimitierende Reaktion ist abhängig von den äußeren Bedingungen wie pH-Werten, Zuckerkonzentrationen, Substrat-Spezies und Membranpotential meist die Konformationsänderung des leeren (P) oder des beladenen (PSH) Carriers, welche die Substratbindestellen im Zuge des Alternating Access über die Membran transferieren. Ein Wechsel zwischen hohen Protonenbindungs-pK-Werten und niedrigen Protonenfreisetzungs-pK-Werten durch weitere lokale Konformationsänderungen ist zentraler Bestandteil des Transportmechanismus. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die Kopplung zwischen Zucker- und Protonen-Translokation, die sich zwischen E.coli Transportern und GlcP strikt unterscheidet. In E.coli Transportern erfolgt eine kooperative Bindung von Zucker und Proton. Zudem erfolgt keine Konformationsänderung im Zucker-gebundenen, unprotonierten Carrier (PS). In GlcP ist die Kopplung erheblich reduziert. Der Transport-Modus selbst ist abhängig von den äußeren Bedingungen. So katalysiert GlcP abhängig vom pH-Gradienten Uniport, Symport oder Antiport.
Die vorliegende Arbeit leistet einen wichtigen Beitrag zum Verständnis des PMF-gekoppelten Zuckertransports und zeigt die Grenzen des für LacY formulierten 6-Zustands-Modells mit nur zwei Konformationsänderungen auf. Ein erweitertes 8-Zustands-Modell mit vier Konformationsänderungen, die unterschiedliche Ratenkonstanten aufweisen können, erklärt sowohl Symport, Antiport als auch Uniport und berücksichtigt zudem die zahlreichen Ergebnisse für LacY aus der Literatur.
Die humane 5-LO ist das Schlüsselenzym in der LT-Biosynthese. LTs sind wichtige Entzündungsmediatoren und sind in einer Vielzahl von Krankheiten involviert, u. a. Asthma, Atherosklerose, rheumatische Arthritis, Sepsis, allergischen Reaktionen und in vielen Krebsarten. Die Struktur der 5-LO besteht aus 673 Aminosäuren und besitzt ein Molekulargewicht von 78 kDa. Sie ist in zwei Domänen unterteilt: die kleinere C2-ähnliche regulatorische Domäne (C2ld) und der größeren katalytischen Domäne. Die 5-LO besitzt NIS und NES, die für die zelluläre Lokalisation der 5-LO verantwortlich sind. Außerdem wird die Lokalisation noch von Phosphorylierungsstellen reguliert, die auf der katalytischen Domäne identifiziert werden konnten. 2011 konnten Häfner et al. zeigen, dass die 5-LO in der Lage ist Homodimere zu bilden.
Wie für die meisten anderen humanen Gene konnten auch bei der 5-LO alternative Spleißvarianten identifiziert werden. Schon 1992 konnten die ersten unterschiedlich gesüleißten Transkripte in Hirntumoren und differenzierten HL-60-Zellen gefunden werden. Später konnten weitere Isoformen in verschiedenen Zelllinien entdeckt werden.
In der vorliegenden Arbeit wurden die alternativen Spleißvarianten 5-LO∆13, 5-LO∆4 und 5-LOp12 untersucht und charakterisiert. Auf mRNA-Ebene wurde die Expression des 5-LO-WT und deren Isoformen sowohl in B- und T-Zelllinien als auch primären B- und T-Zellen, monozytären Zelllinien und primäre Monozyten aus Patientenproben (RA und Sepsis) untersucht. Es wurde festgestellt, dass das Expressionsprofil der 5-LO-Varianten zellspezifisch ist. Im Vergleich zu den T-Zellen konnte in B-Zelllinien ein höheres Expressionslevel detektiert werden. Des Weiteren zeigte sich interessanterweise ein stark erhöhtes Expressionslevel in primären Monozyten von RA- und Sepsis-Patienten.
Untersuchungen der 5-LO-Aktivität ergaben unterschiedliche Ergebnisse, abhängig von der Transfektionsmethode. Als transiente Transfektion diente die Calciumphosphat-Methode. Für die stabile Integration der HEK293T-Zellen wurde die Sleeping Beauty-Methode gewählt. Hierfür wurden Proteine mit einem GFP bzw. mCherry-Tag (GFP-5-LO-WT, mCherry∆13, mCherry∆4, mCherryp12) verwendet, um diese mittels Konfokalmikroskop visualisieren zu können. Nach transienter Transfektion konnte eine Inhibition der 5-LO-Aktivität nach Kotransfektion mit jeweils einer Isoform gemessen werden. Nach stabiler Integration jedoch zeigte sich eine Steigerung der 5-LO-Produktbildung. Mit Hilfe von Western Blots wurden Expressionskontrollen angefertigt und die Menge des 5-LO-WT quantifiziert. In transient transfizierten Zellen wurde eine Erniedrigung der Expression des 5-LO-WT bestimmt, wohingegen in stabil integrierten Zellen ein Anstieg des 5-LO-WT als auch der Isoformen beobachtet werden konnte. Einerseits könnte dies einem Artefakt der Transfektionmethode zugrunde liegen, andererseits könnte es ein Hinweis darauf sein, dass sich die Proteine gegenseitig in ihrer Expression beeinflussen.
Ebenso wurde die Lokalisation der 5-LO und deren Isoformen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die 5-LO überwiegend im Zellkern lokalisiert ist, während alle alternativen Protein-Isoformen im Zytosol zu finden waren. Durch Ionophor-Behandlung wurde eine Translokation des 5-LO-WT an die Kernmembran detektiert, die Isoformen verblieben im Zytosol. Überraschenderweise konnte beobachtet werden, dass die Spleißvariante 5-LO∆13 mit höherer Ionophor-Konzentration ebenso in der Lage ist an die Kernmembran zu translozieren. Um eine mögliche Interaktion der 5-LO mit den Isoformen zu untersuchen, sollten alle Proteine im selben Zellkompartiment lokalisiert sein. Dafür wurden verschiedene Stimuli und Mutationen getestet. Mit der Mutante GFP-5-LO-S271A und dem Stressstimulus Sorbitol und den CaMKII/p38-Inhibotoren KN-93/SB203580 konnte eine Translokation in das Zytosol erreicht werden. Die Ergebnisse der anschließenden Aktivitätsassays zeigten, dass die Isoformen keinen Einfluss auf die Aktivität der 5-LO ausüben.
Des Weiteren wurden die Phosphorylierungen an S523 und S271 von 5-LO-WT, 5-LO∆13, 5-LO∆4 und 5-LOp12 untersucht. Es wurde herausgefunden, dass die 5-LO-Proteine unterschiedliche Phosphorylierungsmuster aufweisen. Während 5-LO-WT und 5-LO∆4 eine schwache Phosphorylierung an S271 aufzeigen, konnte eine starke Phosphorylierung der 5-LO∆13 und 5-LOp12 detektiert werden. Im Vergleich dazu zeigte lediglich die Isoform 5-LOp12 eine sehr starke Bande an der Phosphorylierungsstelle S523. Bei beiden Phosphorylierungen konnten deutlich stärkere Signale nach Kotransfektion gemessen werden. Durch Klonierung eines P2A-Linkers zwischen 5-LO und des GFP-Tags, konnten die Isoformen vom 5-LO-WT in Western Blots voneinander getrennt werden. Dies zeigte, dass es zu einer Hochregulation der Expression der alternativen 5-LO-Varianten nach Kotransfektion mit dem WT führte, aber auch, dass die stärkere Phosphorylierung nach Kotransfektion unabhängig von der Proteinmenge ist.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Inhibitoren der bakteriellen Resistenzproteine New Delhi Metallo-β-Lactamase 1 (NDM-1), die beiden Mutanten der Verona-Integron Encoded Metallo-β-Lactamase 1 und 2 (VIM-1, bzw. -2), sowie die Imipenemase 7 (IMP-7) entwickelt.
Auf Grund natürlicher Selektion, aber vor allem auch bedingt durch den unüberlegten und verschwenderischen Einsatz von β-Lactam-Antibiotika, ist eine weltweite Zunahme an multiresistenten Erregern zu beobachten. Einer der Hauptgründe dieser Resistenzen sind die Metallo- β-Lactamsen (MBL), welche vor allem in Gramnegativen Bakterien vertreten sind und für die Hydrolyse und damit der Desaktivierung der β-Lactam-Wirkstoffe verantwortlich sind. Neben der Suche nach anderweitig wirkenden Antibiotika, ist die Entwicklung von Inhibitoren der MBLs von vordringlicher Bedeutung.
Basierend auf der Grundstruktur des ACE-Hemmers Captopril, wurden trotz synthetischer Herausforderungen erfolgreich mehrere Strukturen mit inhibitorischer Aktivität gegenüber den MBLs synthetisiert. Der Prolinring von Captopril wurde in einer neuen Variante der Captopril-Synthese durch verschiedene Ring- und nicht cyclische Teilstrukturen ersetzt. Durch die Entwicklung einer Schutzgruppenstrategie, konnte die Ringstruktur durch einen Piperazin-Rest ersetzt werden. Dies erlaubt es, die Molekülstruktur auf dieser Seite zu erweitern. Des Weiteren wurde eine neue Syntheseroute etabliert, welche es auf elegante Weise ermöglicht, weitere Derivatisierungen an der Methylgruppe des Captoprils durchzuführen.
In einem proteinbasierten Testsystem wurden die synthetisierten Substanzen auf ihr inhibitorisches Potential hin untersucht. Dabei wurden IC50-Werte im niedrig einstelligen mikromolaren, für drei Verbindungen sogar im sub-mikromolaren Bereich ermittelt. Die erhaltenen Ergebnisse wurden für die drei aktivsten Inhibitoren durch eine Erhöhung des Schmelzpunktes in einem TSA-Testsystem erfolgreich verifiziert. Mittels ITC-Untersuchungen konnte die unterschiedlichen Gewichtungen der entropischen und enthalpischen Beiträge zur Bindung der Inhibitoren an die untersuchten MBLs aufgezeigt werden. Hierdurch konnten die scheinbar widersprüchlichen Ergebnisse der ermittelten IC50-Werte und Schmelzpunktverschiebungen für die Verbindung DBDK48 bezüglich der NDM-1 aufgeklärt werden.
Die Strukturen DB320 konnte erfolgreich mit VIM-2 co-kristallisiert werden. Dies ermöglicht eine genauere Untersuchung und qualifizierte Aussagen über die Bindungsverhältnisse zwischen Protein und Ligand.
Für zwei der synthetisierten Inhibitoren sollte untersucht werden, ob deren Aktivität in vitro auch in Bakterien erhalten bleibt. Dazu wurden pathogene klinische Isolate und Laborstämme, welche mit dem Resistenzplasmid transfiziert wurden, und gegen Imipenem resistent sind, herangezogen. Durch die Zugabe der Inhibitoren konnte die Wirksamkeit von Imipenem wiederhergestellt werden.
Es konnte eine HPLC-Methode etabliert werden, welche eine Abschätzung der Polaritäten in Abhängigkeit der Retentionszeiten erlaubt. Dadurch konnte ein direkter Zusammenhang zwischen der Polarität der Verbindungen und dem Grad der Wirksamkeit im MIC-Testsystem aufgezeigt werden.
Durch die Untersuchung der Inhibitoren auf die Proteine ACE und LTA4H, konnten zwei Ziel-Proteine der Captopril-Grundstruktur als unerwünschte Nebenziele ausgeschlossen werden. Des Weiteren führte die Behandlung von U937-Zellen, selbst bei einer hohen Konzentration von 100 µM, weder zu Auffälligkeiten in einem WST-1 Assay, noch zu einer erhöhten Freisetzung von LDH. Daher kann davon ausgegangen werden, dass die Verbindungen über keine zytotoxischen Eigenschaften verfügen.
Photolabile Schutzgruppen haben sich im Laufe der letzten Jahre als wertvolle Werkzeuge für die Untersuchung und Regulation biologischer Prozesse etabliert. Dabei wird die photolabile Schutzgruppe auf geeignete Weise mit Biomolekülen verknüpft, sodass deren Funktion temporär deaktiviert wird. Durch Bestrahlen mit Licht geeigneter Wellenlängen wird die photolabile Schutzgruppe entfernt und die Aktivität des Biomoleküls bzw. des zu beobachtenden Prozesses wiederhergestellt. Die Grundlagen der Verwendung photolabiler Schutzgruppen im biologischen Kontext wurden in zwei Pionierarbeiten 1977 von J.W. ENGELS und 1978 von J.F. HOFFMAN gelegt. Davon ausgehend haben sich zahlreiche Anwendungen photolabiler Schutzgruppen für biologisch interessante Molekülklassen entwickelt. Auf dem speziellen Gebiet der Nukleinsäuren wurden in den letzten Jahren einige fundamentale Mechanismen entdeckt und aufgeklärt, die nicht zuletzt auch therapeutisch interessante Anwendungsmöglichkeiten für photolabile Schutzgruppen bieten. Hierbei stellt das An-/Aus-Schaltverhalten von Nukleinsäuren jedoch ein nicht-triviales Problem dar. Selbst der gezielte Einbau einer einzelnen photolabilen Schutzgruppe in ein multifunktionales Oligonukleotid führt in der Regel nämlich nicht zu einer vollständigen Deaktivierung dessen. Ein multipler Einbau photolabiler Schutzgruppen entlang der Sequenz eines funktionellen Oligonukleotids schaltet die Hintergrundaktivität im deaktivierten Zustand zwar vollständig aus, allerdings müssen in diesem Fall hohe Bestrahlungsintensitäten bzw. –dauern für das Entfernen aller photolabilen Modifikationen angewendet werden. Dadurch geht zum einen die Zeitauflösung der lichtgeschalteten Prozesse verloren, nicht zuletzt erhöht sich dabei aber auch das Risiko von lichtinduzierten Schäden am biologischen System. Das Kernthema der vorliegenden Dissertation war es daher, neue Architekturen für den Aufbau photoaktivierbarer Oligonukleotide zu entwickeln.
Das erste große Projekt basierte auf der Annahme, dass sich Duplexstrukturen, die für die Funktion vieler Nukleinsäuremechanismen fundamental sind, durch Zyklisierung von Oligonukleotiden global destabilisieren und damit effizienter photoaktivieren lassen, als durch lokalen Einbau einzelner photolabiler Schutzgruppen in Oligonukleotide. Hierzu wurden geeignete Alkin-Modifikationen an photolabile Nitrobenzyl- und Cumarin-Schutzgruppen angebracht und diese an die Nukleobasen verschiedener DNA-Bausteine geknüpft. Es ist daraufhin gelungen, Oligonukleotide mit je zwei photolabilen Alkin-Modifikationen herzustellen und diese intrasequentiell über eine Cu(I)-katalysierte Click-Reaktion mit einem Bisazid-Linker zu zyklisieren. Die so erhaltenen Oligonukleotide wiesen dramatisch erniedrigte Schmelzpunkte gegenüber den nativen Duplexen, sowie gegenüber den zweifach photolabil geschützten Oligonukleotiden auf. Dabei wurde außerdem festgestellt, dass Zyklisierungsparameter wie die Linkerlänge, -polarität und –flexibilität und die Wahl der photolabilen Schutzgruppe keinen signifikanten Einfluss auf die Duplexstabilität hat. Über einen Bereich von Ringgrößen zwischen ca. 11-21 Nukleotiden wurden die niedrigsten Duplexstabilitäten beobachtet. Sehr kleine, sowie große Ringe ab 30 Nukleotiden wiesen dagegen höhere Stabilität auf.
Da mit dem entwickelten Zyklisierungskonzept auch mehrere Ringstrukturen innerhalb einer Oligonukleotidsequenz aufgebaut werden können, wurde im nächsten Schritt eine photoaktivierbare Variante des C10-Aptamers hergestellt, welches selektiv gegen Burkitt’s Lymphomzellen bindet. Dieses 90-mer DNA-Oligonukleotid wurde an drei Stellen photolabil Alkin-modifiziert und infolge mit einem Trisazid-Linker zu einer bizyklisierten Struktur verknotet. Mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie-Experimenten konnte demonstriert werden, dass das durch eine solche „Photo-Klammer“ deaktivierte C10-Aptamer keine Bindungsaffinität gegenüber Burkitt’s Lymphomzellen aufweist, die Bindungsaktivität jedoch nach Belichten wiederhergestellt werden kann. Mit Atomkraftmikroskopie-Experimenten ist es darüber hinaus gelungen, die Photoaktivierung des verknäuelten C10-Aptamers mit molekularer Auflösung abzubilden. Mit diesem Ergebnis können nun lange funktionelle Oligonukleotide auf definierte Weise photoaktivierbar gestaltet werden, insbesondere auch dann, wenn keine (Informationen über) funktionelle Sekundärstrukturen existieren.
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Verschiedene physikalische Effekte erlauben es Licht so zu führen und zu verändern, dass es Einblicke in für Menschen sonst unzugängliche Bereiche gewährt. Eines von insgesamt drei Elementen dieser Dissertationsschrift ist der Aufbau eines Multiphotonen-Mikroskops. Dieses fortschrittliche Werkzeug erweitert das zur Verfügung stehende Instrumentarium um verschiedene Analysemethoden, allen voran die 2-Photonen-Fluoreszenz-Mikroskopie. Durch geringfügige Modifikationen können auch weitere Methoden, wie beispielsweise stimulierte Raman-Streuung realisiert werden.
Insbesondere die 2-Photonen-Fluoreszenz-Mikroskopie war für das zweite Element dieser Dissertationsschrift von großer Bedeutung. In dieser Studie wurde das Bleichverhalten von Spinach bei 2-Photonen-Absorption untersucht, sowohl an frei in Lösung befindlichen als auch auf einem Träger immobilisierten Spinach-Komplexen. Die Ergebnisse zu den frei in Lösung befindlichen Spinach-Komplexen zeigen, dass die Verstärkung der Fluoreszenz von DFHBI grundsätzlich auch im Fall der 2-Photonen-Absorption eintritt. Dabei wurde ein Ausbleichen der 2-Photonen-induzierten Fluoreszenz für frei in Lösung befindliche Spinach-Komplexe erst bei außerordentlich hohen Intensitäten der Anregungsstrahlung beobachtet. Dieser Befund kann zumindest teilweise auf das Eindiffundieren fluoreszenter Spinach-Komplexe in das sehr kleine Fokalvolumen innerhalb der 2-Photonen-Anregung stattfindet zurückgeführt werden. Für immobilisierte Spinach-Komplexe konnte gezeigt werden, dass eine kontinuierliche Bildaufnahme gegenüber einer Bildaufnahme in Intervallen mit jeweils zusätzlichen Dunkelphasen zur Erholung des reversiblen Bleichens der 2-Photonen-induzierten Fluoreszenz, sowie der generelle Verzicht auf spezielle Belichtungsschemata und Methoden der Datenakquise mit keinen besonderen Nachteilen verbunden ist. Abschließend betrachtet erweist sich Spinach bei 2-Photonen-Anregung als ausgesprochen resistent gegenüber einem irreversiblem Ausbleichen des Fluoreszenzsignals.
Als drittes Element dieser Dissertationsschrift wurde die Dynamik von Chrimson, einem Kanalrhodopsin mit rot-verschobener Absorption mittels zeitaufgelöster Spektroskopie im sichtbaren Spektralbereich untersucht. Sowohl die Anregungswellenlänge als auch der pH-Wert bzw. der Protonierungszustand des Gegenions haben einen messbaren Einfluss auf die Primärreaktion. Diese verlangsamt sich, sobald der pH-Wert abgesenkt oder die Anregungswellenlänge rot-verschoben wird. Darüber hinaus führt eine Rot-Verschiebung der Anregungswellenlänge zu einer geringeren Effizienz der Isomerisation des Retinal-Chromophors. Die Primärreaktion von Chrimson entspricht dabei einem Reaktionsmodell mit einer Verzweigung des Reaktionspfades auf der Energiehyperfläche des angeregten Zustandes. Ein Reaktionspfad führt dabei durch ein lokales Minimum, welches in seiner Ausprägung stark von der elektrostatischen Umgebung des Retinal-Chromophors abhängt. Je nach ursprünglichem Protonierungszustand des Gegenions der Retinal-Schiff-Base wurden große Unterschiede hinsichtlich der beobachteten transienten Absorptionsmuster für den im Anschluss von Chrimson durchlaufenen Photozyklus gefunden. Bei pH 6,0 weist der Photozyklus von Chrimson eine insgesamt deutlich schnellere Kinetik auf, als es für den Photozyklus bei pH 9,5 beobachtet wurde. Es ist bemerkenswert, dass in elektrophysiologischen Messungen für beide Photozyklen eine Öffnung des Ionenkanals gefunden wurde. Die Kanalfunktion von Chrimson ist somit grundsätzlich nicht vom Protonierungszustand des Gegenions abhängig, wenngleich die Kinetik des Ionenkanals durchaus davon beeinflusst wird. Dies deutet auf Unterschiede in den Wechselwirkungen zwischen dem Ionenkanal und dem Gegenion der Retinal-Schiff-Base hin.
Gegenstand der vorliegenden Arbeit sind die Untersuchungen lichtgesteuerter Reaktionen der zwei Retinalproteine Channelrhodopsin-2 (ChR-2) und Proteorhodopsin (PR) mit Hilfe zeitaufgelöster Laserspektroskopie.
Da der Mechanismus der Kanalöffnung des ChR-2 bis heute nicht vollständig aufgeklärt werden konnte, beschäftigt sich diese Arbeit insbesondere mit den Prozessen, die direkt nach der Photoanregung des Retinals stattfinden und die Kanalöffnung vorbereiten. Es wurde dabei gezielt auf für die Funktion des Proteins wichtige Faktoren wie strukturelle Besonderheiten des Chromophors und seiner Umgebung eingegangen und deren Auswirkung auf die Dynamik der Photoreaktionen sowie die Veränderungen im Protein nach der Anregung untersucht.
Zunächst wurden die Ergebnisse der vis-pump-IR-probe-Experimente an ChR-2 im Bereich der Carbonylschwingungsbanden protonierter Glutamat- und Aspartat-Reste dargestellt. Dabei wurde insbesondere die Bildungsdynamik der Differenzbanden in diesem Spektralbereich untersucht und in Anlehnung an die vorhandene Literatur eine Bandenzuordnung der für die Funktion des Proteins wichtigen Aminosäurereste vorgenommen. Aus den Messergebnissen konnte geschlossen werden, dass die mit der Kanalöffnung einhergehenden Konformationsänderungen in ChR-2 durch eine effektive Aufnahme der Überschussenergie durch das Protein auf einer sub-Pikosekunden-Zeitskala vorbereitet werden.
Des Weiteren wurden spektroskopische Untersuchungen an der R120H-Mutante des ChR-2 vorgestellt. Da diese Mutante bei elektrophysiologischen Messungen keine Kanalaktivität zeigte, sollte zunächst geklärt werden, ob die Mutation einen Einfluss auf die Retinalisomerisierung und den nachfolgenden Photozyklus hat. Dabei stellte sich heraus, dass die Retinalisomerisierung bei der R120H-Mutante zwar im Vergleich zum Wildtyp etwas verzögert stattfindet, der Einfluss der Punktmutation auf den weiteren Photozyklus jedoch insgesamt gering ist. Mit Hilfe der Kurzzeit-IR-Spektroskopie im Bereich der Amid I-Schwingung des Proteinrückgrats konnten für die Mutante allerdings signifikante Veränderungen der Bildungsdynamik sowie eine deutliche Abnahme der Amplitude des Amid I-Signals detektiert werden. Anhand weiterer Experimente an den Mutanten E123T und D253N in diesem Spektralbereich konnte anschließend ein Zusammenhang zwischen der Intensität der Amid I-Bande und der Kanalaktivität von ChR-2 festgestellt werden. Diese Ergebnisse ließen somit die Schlussfolgerung zu, dass die Aminosäurereste R120 und D253 eine entscheidende Rolle beim schnellen Transfer der Überschussenergie an das Protein nach der Retinalanregung und der so initiierten Kanalöffnung spielen.
Zusätzlich wurde der Frage nachgegangen, inwieweit Veränderungen am Chromophor die Isomerisierungsreaktion, den nachfolgenden Photozyklus sowie die Funktion des ChR-2 als Ionenkanal beeinflussen können. Zu diesem Zweck wurden spektroskopische Untersuchungen an einem mit 9-12-Phenylretinal (PheRet) rekonstituierten ChR-2 vorgestellt. Es konnte gezeigt werden, dass die Isomerisierung des PheRet zu seiner 13-cis-Form in ChR-2 stark verlangsamt ist und verglichen mit dem nicht modifizierten Chromophor deutlich ineffizienter abläuft. Es wurde außerdem festgestellt, dass die Veränderungen am Retinal zu deutlichen Beeinträchtigungen des Photozyklus führen. Zum einen wurde ein sehr schneller Zerfall des ersten Photoprodukts sowie die Bildung eines zusätzlichen, blauverschobenen Px-Zustands detektiert. Außerdem wurde festgestellt, dass nach der Deprotonierung des isomerisierten PheRet der Großteil der modifizierten Retinale in den Ausgangszustand zurückkehrt und der P3-Zustand nur in geringen Mengen gebildet wird. Die Messergebnisse führten somit zu der Schlussfolgerung, dass die all-trans-Konformation des PheRet in ChR-2 deutlich bevorzugt wird. Da elektrophysiologische Untersuchungen des Retinal-Analogons jodach keine signifikanten Verminderungen der Photoströme im Vergleich zum ATR in ChR-2 zeigten, ließ sich schließlich festhalten, dass die vorgenommenen Veränderungen am Chromophor, die zu einer deutlichen Hemmung der Isomerisierungsreaktion führen und einen starken Einfluss auf den nachfolgenden Photozyklus haben, nicht ausreichend sind, um die Kanalaktivität von ChR-2 komplett zu blockieren, solange noch ein kleiner Anteil der Retinale isomerisieren kann.
Der abschließende Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Absorption des UV-Lichts durch das Retinal mit deprotonierter Schiff-Base im grünabsorbierenden Proteorhodopsin, welches in einem alkalischen Medium im Dunkelzustand akkumuliert werden kann. Die Untersuchungen der Primärreaktion zeigten einen langsamen biexponentiellen Zerfall des angeregten Zustands der UV-absorbierenden Spezies mit anschließender Bildung des 13-cis-Photoprodukts. Aufgrund dieser Ergebnisse konnte ein Reaktionsmodell für die ersten Prozesse nach der UV-Anregung des Retinals im GPR aufgestellt werden, welches möglicherweise für weitere UV-Rezeptoren genutzt werden kann.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Dynamik zweier grundlegend verschiedener, deaktivierender Mechanismen von Retinalproteinen untersucht. In einem dritten Projekt wurde die Photodynamik einer Dreifachmutante von visuellem Rhodopsin erforscht, von der eine Mutation zu kongenitaler (angeborener) Nachtblindheit führt und zwei andere Mutationen das Protein über eine Disulfidbrücke stabilisieren. Die Ergebnisse dieser drei Projekte sind im Folgenden zusammengefasst.
Die Aktivität des mikrobiellen Proteorhodopsins als lichtgetriebene Protonenpumpe kann photoinduziert unterbunden werden. Dies erfolgt durch die Absorption von blauem Licht durch das Retinal bei deprotonierter Schiff‘schen Base. Vor dieser Arbeit war allerdings nur wenig über den Mechanismus und die Kinetik dieses Effekts bekannt. Das einzige Retinalprotein, an dem diese Deaktivierungsdynamik auf molekularer Ebene zeitaufgelöst untersucht wurde, ist Bakteriorhodopsin. Doch auch an diesem System wurde die ultraschnelle Primärreaktion in der photoinduzierten Deaktivierungsdynamik - die Photoisomerisierung des 13-cis-Retinals - bisher nicht zeitaufgelöst gemessen.
In dieser Arbeit wurde ein Weg gefunden, diesen Prozess auf einer Sub-Pikosekundenzeitskala zu detektieren. Dazu wurde eine Proteorhodopsinmutante genutzt, in der der primäre Protonendonor E108 durch Glutamin ersetzt ist. Diese Mutante weist eine signifikante Erhöhung der Lebensdauer des M-Intermediats auf. Im photostationären Gleichgewicht führt diese veränderte Kinetik zu einer erheblich erhöhten Akkumulation des Proteins im M-Zustand, die ausreicht, um photoinduzierte Absorptionsänderungen der Deaktivierungsdynamik sowohl im sichtbaren als auch im mittleren Infrarotbereich auf ultrakurzer Zeitskala zu detektieren. Dieses Projekt erfolgte in Kooperation mit dem Arbeitskreis Glaubitz (Goethe-Universität Frankfurt am Main).
Es zeigte sich, dass die Anregung des Retinals von Proteorhodopsin im M-Zustand zur Isomerisierung von 13-cis zu all-trans führt, die nach wenigen Pikosekunden abgeschlossen ist. Der zweite und abschließende Schritt ist die Reprotonierung der Schiff'schen Base. Es stellte sich heraus, dass dieser Prozess auf einer Nanosekundenzeitskala abläuft und über einen Protonentransfer vom primären Protonenakzeptor D97 zur Schiff'schen Base ermöglicht ist.
Die in dieser Arbeit vorgestellte Methodik zur Untersuchung der deaktivierenden Photodynamik von Proteorhodopsin auf ultraschneller Zeitskala, könnte in Zukunft auf weitere mikrobielle Rhodopsine angewandt werden. So ist die Studie der Deaktivierungsdynamik von Channelrhodopsinen von großem Interesse für optogenetische Anwendungen. Eine lichtgesteuerte Kontrolle der Ionenkanalöffnung und -schließung sollte die Präzision in der Regulierung ionischer Permeation erheblich verbessern.
Die Proteorhodopsinmutante E108Q wurde außerdem in ihrer primären Photodynamik sowohl bei grünem als auch blauem Anregungslicht untersucht. Es zeigte sich in beiden Fällen eine Dynamik, die der des Wildtyps sehr ähnlich ist. Eine Beobachtung unterscheidet sich jedoch wesentlich vom Wildtyp. Das K-Intermediat der E108Q-Mutante scheint nach einigen hundert Pikosekunden zumindest partiell zu zerfallen, woraufhin sich eine Signatur im blauen Spektralbereich bildet. Blitzlichtphotolysemessungen lassen vermuten, dass diese blau absorbierende Species im zwei- bis dreistelligen Nanosekundenbereich wieder zerfallen sein muss.
Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit dem Photozerfall von visuellem Rhodopsin. Es ist bekannt, dass die Signaltransduktion durch Wechselwirkung zwischen aktiviertem Rhodopsin und Arrestin unterbunden wird. Im ersten Abschnitt wurde der Einfluss der Arrestin-1-Variante p44 auf die Photodynamik visuellen, bovinen Rhodopsins untersucht. In einer Kooperation mit dem Arbeitskreis Schwalbe (Goethe-Universität Frankfurt am Main) konnte gezeigt werden, dass Arrestin erheblichen Einfluss auf die Zerfallsdynamik von Meta II und Meta III hat. Es wurde festgestellt, dass die Wechselwirkung von p44 mit photoaktiviertem Rhodopsin eine erhöhte Population des Intermediats Meta III bewirkt, mit der Folge einer zweifach langsameren Freisetzungskinetik des all-trans-Retinals. Diese Beobachtung weist auf eine physiologische Rolle des Zustands Meta III in der Retinalhomöostase hin.
Gegenstand einer zweiten Studie mit dem Arbeitskreis Schwalbe ist zum einen die Rhodopsinmutation G90D, die mit kongenitaler (angeborener) stationärer Nachtblindheit zusammenhängt, und zum anderen die Doppelmutation N2C und D282C, die zur Ausbildung einer stabilisierenden Disulfidbrücke zwischen den im extrazellulären Bereich eingeführten Cysteinen führt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Photodynamik des Wildtyps, der Doppelmutante und der stabilisierten G90D-Mutante (Mutationen G90D, N2C und D282C) sowohl auf einer ultrakurzen Zeitskala als auch auf einer Minutenskala untersucht.
Entwicklung von Immunisierungsstrategien zur Induktion hoher funktionaler Antikörperantworten
(2018)
Neuartige Viren und Erreger, die sich antigenetisch tiefgreifend von bekannten Varianten unterscheiden, können verheerende Epidemien auslösen, da weder gegen diese Erreger eine Immunität in der Bevölkerung besteht, noch prophylaktische oder therapeutische Maßnahmen verfügbar sind. Eine prophylaktisch vermittelte Immunität durch Impfung stellt die bei Weitem effektivste Methode zur Vorbeugung viraler Infektionen dar, jedoch sind die Entwicklungs- und Herstellungszeiten eines neuen Impfstoffs in der Regel mit der Ausbruchsdynamik nicht kompatibel. Inzwischen steht zwar eine überschaubare Anzahl antiviraler Medikamente zur Verfügung, doch ist die Wahrscheinlichkeit gering, dass diese meist hoch spezifischen Wirkstoffe gegen neu auftretende Viren aktiv sind. Das beispiellose Ausmaß der Ebola-Epidemie 2014 führte zum Einsatz experimenteller antikörperbasierter Therapien, welche das Potential der passiven Vermittlung von temporärem Immunschutz naiver Personen verdeutlicht. Für viele neuartige Viren ist die Entwicklung von Therapieansätzen allerdings noch nicht entsprechend weit fortgeschritten. Zudem bedingt eine Verwendung des eigentlichen Erregers oft hohe Sicherheitsmaßnahmen, was die Arbeit erschwert. Aus diesem Grund werden Notfalltherapien benötigt, die schnell in klinisch relevanter Qualität und Quantität unter niedrigen biologischen Sicherheitsmaßnahmen produziert werden können.
Diese Arbeit basiert auf der zentralen Hypothese, dass die Induktion von hohen Titern funktioneller Antikörperantworten die Basis für einen breiteren Schutz gegen antigenetisch entferntere Virusstämme sowie für die schnelle Produktion von therapeutischen Antiseren darstellt.
Um diese Hypothese zu testen und Einblicke in verschiedene Aspekte dieses Prozesses zu bekommen, wurde zunächst die Nutzung von Adjuvanzien als Zusätze für Impfstoffe am Beispiel des pandemischen A(H1N1)pdm09-Impfstoffs untersucht. Neben den alljährlichen Epidemien, die von saisonalen Influenza-A-Viren der Subtypen H1N1 oder H2N3 verursacht werden, können neuartige Subtypen zu weltweiten Pandemien führen. Während die saisonalen Influenza-Impfstoffe in der Regel keine Adjuvanzien enthalten, wurden einige pandemische H1N1-Impfstoffe aus 2009 mit einem reduzierten Antigengehalt formuliert und mit squalenbasierten Adjuvanzien kombiniert, um eine ausreichende Wirksamkeit bei größerer Verfügbarkeit zu gewährleisten. Zur Charakterisierung des Effekts dieser Adjuvanzien auf die Immunantworten wurden Frettchen mit 2 µg des kommerziellen H1N1pmd09-Impfstoffes alleine sowie in Kombination mit verschiedenen Adjuvanzien immunisiert, die Antikörpertiter gegen homologe und heterologe Influenzastämme untersucht und mit dem Schutz vor einer Infektion korreliert. Dabei zeigte sich, dass die Verwendung squalenbasierter Adjuvanzien die funktionalen Antikörperantworten um das 100-fache erhöhte und zu einer signifikant reduzierten Viruslast nach der Infektion mit dem homologen pandemischen Virus führte. Während in keiner Gruppe Antikörper gegen die heterologen Hämagglutinin-(HA-)Proteine H3, H5, H7 und H9 nachweisbar waren, induzierten mit squalenbasierten Adjuvanzien kombinierte Impfstoffe subtypenspezifische Antikörper gegen das N1 Neuraminidase-(NA-)Protein einschließlich H5N1. Darüber hinaus führte die Immunisierung mit squalenbasierten Adjuvanzien zu einer besseren Kontrolle der Influenzavirus-Replikation in den oberen Atemwegen.
Anschließend wurde im zweiten Teil dieser Arbeit unter Einbeziehung der gewonnenen Erkenntnisse eine Immunisierungsstrategie zur schnellen Produktion therapeutischer Hyper-immunseren entwickelt, wobei unterschiedliche Antigenexpressionssysteme miteinander verglichen wurden. Während in den frühen Stadien eines Ausbruchs Rekonvaleszenzseren nicht ohne weiteres verfügbar sind, können Antiseren tierischen Ursprungs innerhalb eines kurzen Zeitraums hergestellt werden. Die Herausforderung liegt in der schnellen Induktion einer schützenden Immunität, wobei die effiziente Produktion und Reinigung von Hyperimmunserum in klinisch relevanten Mengen ebenso essenziell ist wie die Anpassungsfähigkeit der Immunisierungsstrategie an neue oder hinsichtlich ihrer Antigenizität veränderte Viren. Hierzu wurden verschiedene Immunisierungsstrategien in Mäusen und Kaninchen verglichen, die unterschiedliche Expressionssysteme für das Modellantigen Ebolavirus-Glykoprotein (EBOV-GP) verwenden: (i) Ebolavirus-ähnliche Partikel (VLP), (ii) das rekombinante modifizierte Vacciniavirus Ankara (MVA) sowie (iii) das rekombinante Virus der vesikulären Stomatitis (VSV). Im Ergebnis induzierte eine dreimalige Immunisierung mit VLPs in Kombination mit squalenhaltigem Adjuvans neutralisierende Antikörpertiter, die vergleichbar mit der Immunisierung mit replikationskompetentem VSVΔG/EBOV-GP waren. Dies deutet darauf hin, dass nicht die De-novo-Antigenexpression, sondern vielmehr die mehrfache Präsentation des Antigens in nativer Konformation für die Produktion von neutralisierenden Antikörpern essenziell ist. Darüber hinaus waren die funktionalen Antikörpertiter aller Kaninchenseren in der In-vitro-Analyse gegen das Wildtypvirus 10- bis 100-fach höher als der Durchschnitt, der in mit VSVΔG/EBOV-GP geimpften Probanden beobachtet wurde. Die Etablierung eines optimierten mehrstufigen Reinigungsverfahrens unter Verwendung einer zweistufigen Ammoniumsulfat-Präzipitation, gefolgt von einer Protein-A-Affinitätschromatographie, führte zu aufgereinigten IgG-Präparationen mit nahezu unveränderter neutralisierender Aktivität, die über neun Tage im xenogenen In-vivo-Modell stabil waren. Die signifikante Erhöhung von totalen und funktionalen Antikörpertitern in Kombination mit einer größeren Breite der Antikörperantwort im Kontext von squalenbasierten Adjuvanzien stützt die Hypothese dieser Arbeit. Adjuvantierte Immunisierungsstrategien sind damit ein vielversprechender Ansatz nicht nur zur Wirksamkeitssteigerung von Subunit- und Proteinimpfstoffen, sondern auch zur schnellen Herstellung von therapeutischen Antiseren.
Ribonukleinsäure (ribonucleic acid, RNA) wirkt bei der Proteinbiosynthese nicht nur als Informationsüberträger, sondern kann auch beispielsweise durch sogenannten Riboschalter (auch Riboswitches) regulatorische Funktionen übernehmen. Riboschalter sind komplett aus RNA aufgebaut und man kann sie sich als molekulare Schalter vorstellen, die die Genexpression kontrollieren. Konzeptionell besteht ein Riboswitch aus zwei Untereinheiten, dem Aptamer und der Expressionsplattform. Das Aptamer bindet, üblicherweise sehr spezifisch, kleine organische Moleküle, aber auch Ionen. Diese Ligandenbindung induziert Änderungen in der Struktur des Riboswitches, welche wiederum die Expressionsplattform beeinflussen. Je nach Riboswitch ermöglicht oder verhindert dies schließlich die Genexpression. Die vorliegende Doktorarbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung und Etablierung von Methoden der optischen Spektroskopie zur Aufklärung von RNA-Dynamiken und -Strukturen im Allgemeinen und der Erforschung von Aptamerbindungsmechanismen im Besonderen.
Eine der dazu verwendetet Methoden ist die FTIR-Spektroskopie. Hierfür wurden zunächst kritische Parameter wie verschiedenste Messeinstellungen oder die Probenpräparation ausgiebig an RNA-Modellsträngen getestet. Dabei war es möglich, eine kleine Spektrenbibliothek als internen Standard aufzubauen. Gleichzeitig konnte gezeigt werden, dass kleinere RNA-Oligonukleotide (< ca. 20 Nukleobasen) gut mittels FTIR-Methoden untersucht werden können. Anschließend wurde eine statische Bindungsstudie am adenosin- sowie am guanosinbindenden Aptamer vorgenommen.
Die zweite hier vorgestellte Methode zur Untersuchung von RNA-Molekülen ist die Fluoreszenzspektroskopie. Im Gegensatz zur FTIR-Spektroskopie ist dazu allerdings eine Modifizierung der RNA durch ein Fluoreszenzlabel nötig. Deshalb beschäftigt sich der Hauptteil dieser Doktorarbeit mit der Charakterisierung und der Anwendung des quasi bifunktionellen RNA-Markers (auch RNA-Labels) Çmf. So wurden zunächst die photophysikalischen und photochemischen Eigenschaften des Markers untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass Çmf sich als lokale Sonde eignet, da es empfindlich auf Änderungen der Mikroumgebung in Lösung reagiert. Durch direkten Vergleich der optischen Eigenschaften von Çmf mit den entsprechenden Eigenschaften des Spinlabels Çm war es möglich, den starken Fluoreszenzlöschungseffekt (sog. quenching) des Çm aufzuklären. So kann davon ausgegangen werden, dass die Fluoreszenz des Çm durch eine sehr schnelle interne Konversion (IC) in einen dunklen Dublettzustand (D1) gelöscht wird.
Im nächsten Schritt wurde Çmf in RNA-Modellstränge eingebaut, um den Einfluss der RNA auf die Photochemie des Markers zu untersuchen. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich dessen Fluoreszenzsignal abhängig von den direkten Nachbarbasen sowie abhängig vom Hybridisierungszustand signifikant ändert. Gleichzeitig konnte keine deutliche Veränderung der Stabilität der Modellstränge festgestellt werden. So konnte also nachgewiesen werden, dass sich Çmf sehr gut als lokale Sonde in RNA eignet. Im Speziellen wurde aus den Ergebnissen geschlossen, dass der Fluorophor für Ligandenbindungsstudien herangezogen werden kann.
Deshalb wurde Çmf schließlich an mehreren verschiedenen Stellen in das neomycinbindende Aptamer (N1) eingebaut, um dessen Bindungskinetik zu untersuchen. Mittels Stopped-Flow-Messungen war es möglich, die Bindungsdynamik des Aptamers zu beobachten. Anhand dieser transienten Daten konnte ein Zweischrittbindungsmodell abgeleitet werden. Dabei bindet Neomycin zunächst unspezifisch an das weitgehend vorgeformte Aptamer. Anschließend kommt es durch die Ausbildung von Wasserstoffbrücken zu einer spezifischen Bindung des Liganden am Aptamer.
Im dritten Teil dieser Arbeit geht es ebenfalls um die Entwicklung und Etablierung eines spektroskopischen Werkzeuges. Dabei stehen allerdings Rhodopsine im Mittelpunkt der Aufmerksamkeit. Hierbei handelt es sich um Membrantransportproteine, die nach optischer Anregung einen sehr schnellen Photozyklus mit mehreren Intermediaten durchlaufen. Es ist möglich, diese Intermediate dank transienter Absorptionsmessungen mit sehr guter zeitlicher und spektraler Auflösung zu beobachten. Allerdings besteht der Bedarf, diese Intermediate statisch zu präparieren, um sie näher charakterisieren und mit anderen Methoden, wie z.B. der Festkörper-NMR, vergleichen zu können.
Ein spektroskopisches Werkzeug zum Präparieren von frühen Photointermediaten ist kryogenes Einfangen (sog. Cryotrapping) dieser Intermediate. Im Rahmen dieser Arbeit wurden das Cryotrapping und die anschließende statische UV/vis-Absorptionsspektroskopie der fixierten (getrappten) Zustände optimiert und an einer Reihe von Rhodopsinen (ChR2, GPR) demonstriert.
Der ligandaktivierte Transkriptionsfaktor Farnesoid X Rezeptor (FXR) ist neben seiner Funktion als Regulator des Gallensäurehaushaltes auch in vielen anderen metabolischen Prozessen wie Glukose- und Lipidhomöostase involviert und besitzt antiinflammatorische Eigenschaften. Gerade bei hepatischen, gastrointestinalen und systemischen Erkrankungen erscheint FXR daher als interessante Zielstruktur zur Behandlung metabolischer Erkrankungen. Basierend auf den natürlichen Liganden von FXR, den Gallensäuren, wurde Obeticholsäure (OCA) als seminsynthetisches Derivat der endogenen Chenodesoxycholsäure zu einem potenten FXR-Agonisten entwickelt. OCA wurde in mehreren Studien auf seine therapeutische Wirkung bei hepatisch-entzündlichen Krankheitsbildern wie der primären biliären Cholangitis (PBC), der nicht-alkoholischen Fettleber (engl: non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD) und der daraus folgenden nicht-alkoholischen Steatohepatitis (NASH) getestet. Mittlerweile ist OCA als Zweitlinientherapie der PBC auf dem Arzneimittelmarkt zuge-lassen. Neben OCA gibt es noch eine große Anzahl an weiteren FXR-Liganden, deren strukturelle Diversität von Steroiden bis nicht-steroidalen kleinen Molekülen (engl: small molecules) reicht. Trotz dieser Erfolge muss das Therapiepotential von FXR noch weiter ausgebaut werden. Die meisten verfügbaren Liganden besitzen in vitro zwar eine hohe Potenz, können in ihrem pharmakokinetischen Profil oder ihrer Selektivität gegenüber anderen nukleären Rezeptoren aber nicht überzeugen.
Die hier vorliegende Arbeit hat sich mit der Entwicklung unterschiedlicher Liganden für FXR beschäftigt und diese in vitro und teilweise auch in vivo charakterisiert, um sie entsprechend ihrer Wirkungsweise einzuordnen und ein besseres Verständnis der regulatorischen Funktion von FXR zu erlangen.
Modulation von FXR bezieht sich nicht nur auf die agonistische Aktivierung, sondern setzt sich auch mit Antagonismus auseinander. Neben einigen Krankheitsbildern, die aus einer Überexpression von FXR resultieren, werden Antagonisten als Werkzeug (engl: tool compound) zur Aufklärung von konformellen Veränderungen von FXR und deren Auswirkung auf bestimmte Signalwege benötigt. Für die Erforschung solcher FXR-Antagonisten sollte das Potential nicht-steroidaler Antirheumatika (engl: non-steroidal anti-rheumatic drugs, NSAIDs) als etwaige Leitstrukturen untersucht werden, da in einer Veröffentlichung von Lu et al. ein FXR-Antagonismus durch NSAIDs postuliert wurde. Beim Versuch der Reproduktion der Ergebnisse von Lu et al. mit den drei NSAIDs Ibuprofen, Indometacin und Diclofenac wurde festgestellt, dass die Effekte auf den ersten Blick antagonistisch erscheinen, aber bei genaueren biochemischen Untersuchungen zweifelsfrei als Zytotoxizität identifiziert wurden.
FXR-Antagonisten wie Guggulsteron oder Gly-MCA sind auf ihre therapeutische Wirksamkeit unter-sucht worden, aber die genaue Wirkweise ist noch nicht aufgeklärt. Aufgrund ihrer steroidalen Grundstruktur ist ihre Selektivität gegenüber anderen nukleären Rezeptoren fraglich. Die überschaubare Anzahl an publizierten nicht-steroidalen FXR-Antagonisten besitzt zwar moderate IC50-Werte, ihre strukturelle Diversität und Selektivität ist aber limitiert. Zur Entwicklung neuer potenter FXR-Antagonisten, die aus kleinen Molekülen (engl: small molecules) aufgebaut sind, wurde eine N-Phenylbenzamid-Leitstruktur ausgewählt. Diese Leitstruktur wurde im Rahmen der SAR-Unter-suchungen zur Entwicklung von Anthranilsäurederivaten als FXR-Partialagonisten innerhalb des Arbeitskreises entdeckt. Ausgehend von dieser Leitstruktur wurde eine mehrstufige, systematische SAR-Untersuchung durchgeführt, wodurch ein sehr potenter FXR-Antagonist entwickelt werden konnte, der anschließend umfangreich biochemisch auf FXR-Modulation, Selektivität, Löslichkeit, Toxizität und metabolische Stabilität charakterisiert wurde.
Neben dem Verständnis eines Modulationsmechanismus ist die konkrete Anwendung eines FXR-Liganden zu therapeutischen Zwecken von großem Interesse. Die Beteiligung von FXR in unterschiedlichen metabolischen Prozessen macht den Rezeptor zu einem begehrten Ansatzpunkt für die Wirkstoffentwicklung. Doch die Behandlung eines multifaktoriellen Krankheitsbildes (z.B. metabolisches Syndrom, NASH) sollte sich nicht nur auf einen der gestörten Signalwege beziehen, da diese Erkrankungen durch mehrere Faktoren ausgelöst oder beeinflusst werden. Der semisynthetische FXR-Agonist OCA zeigte innerhalb der FLINT-Studie sowohl antientzündliche und antifibrotische Effekte, als auch eine Verbesserung der metabolischen Parameter mit Blick auf NAFLD und NASH. Die lösliche Epoxidhydrolase (engl: soluble epoxidhydrolase, sEH) besitzt nachweislich anti-inflammatorische und antisteatotische Effekte in der Leber. Aus diesem Grund wurde eine Leitstruktur entwickelt, die eine duale Modulation aus FXR-Aktivierung und sEH-Inhibition erzeugt. Dafür wurden die Pharmakophore eines im Arbeitskreis entwickelten FXR-Partialagonisten sowie eines potenten sEH-Inhibitors miteinander verknüpft. Zur Weiterentwicklung einer ausgewogenen hohen Potenz beider Modulationsfaktoren wurden mehrere unterschiedliche SAR-Untersuchungen als translationales Projekt in mehreren Arbeiten durchgeführt. In der hier vorliegenden Arbeit konnten dieses SAR-Untersuchungen zusammengeführt und weiterentwickelt werden. Dabei wurde ein ausgewogener und hochpotenter dualer Modulator erhalten, der umfassend in vitro und in vivo charakterisiert wurde. Die gezielte duale Aktivität, die mit dieser Substanz erreicht wurde, führt in einem Krankheitsbild zu synergistischer Ergänzung zweier Therapieoptionen. Jedoch kann eine unerwünschte Promiskuität über verwandten nukleären Faktoren zu Nebenwirkungen führen. Die Ursache dafür kann eine saure Funktion darstellen. Ein sehr potenter nicht-azider FXR-Agonist mit einem subnanomolaren EC50-Wert konnte im Arbeitskreis entwickelt werden. Diese Verbindung ist FXR-selektiv, hat keinen toxischen Effekt auf HepG2-Zellen und eine moderate metabolische Halbwertszeit. Die qRT-PCR-Untersuchung direkter und indirekter FXR-Zielgene zeigte eine verstärkte Expression nach der Inkubation mit der nicht-aziden Substanz. Dadurch lässt sich das Prinzip der Nebenwirkungsminderung durch nicht-azide Verbindungen beweisen.
Insgesamt konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, wie vielfältig und vielversprechend eine FXR-Modulation aufgebaut sein kann. Zum einen konnte über eine ausgeprägte biochemische Evaluation eine Differenzierung zwischen FXR-Antagonismus und Zelltoxizität bewiesen werden, worauf sich aufbauend eine genaue in vitro-Charakterisierung von neuen N-phenylbenzamidbasierten FXR-Antagonisten durchführen ließ, die ausgehend von einer moderat potenten Leitstruktur zu einer sehr potenten optimierten Substanz entwickelt wurden. FXR-Antagonismus und die dazu passenden tool compounds sind nicht nur von Bedeutung zum besseren Verständnis der unterschiedlichen Bindungsmodi des FXR, sondern auch potentielle Therapieansätze zur Behandlung von Krankheiten, in denen eine FXR-Überexpression stattfindet. Die agonistische Modulation von FXR wurde genauer betrachtet in der in vitro-Untersuchung nicht-azider FXR-Agonisten, die durch das Fehlen einer sauren Funktion ein hohes Maß an Selektivität und dabei eine geringe Toxizität aufwiesen. Synergistische Effekte zur Behandlung eines multifaktoriellen Krankheitsbildes durch die Kombination von FXR-Partialagonismus und sEH-Inhibition konnte durch die Entwicklung der potenten und balancierten Substanz sowohl in vitro als auch in vivo bewiesen werden, wodurch diese Verbindung ein vielversprechender Kandidat für weitere klinische Entwicklung ist.