Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
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Glioblastoma is the most common and most aggressive type of brain tumor in adults. In contrast to epithelial cancers, glioblastomas do not metastasize. While the major treatment challenge in epithelial cancers is not the primary tumor but metastasis, glioblastoma patients die of the primary tumor.
However, there is a common theme which underlies the malignant properties of progressed epithelial cancers and glioblastoma: invasion from the primary tumor into the surrounding tissue. In the case of epithelial cancers this is the first and necessary step to metastasis, whereas invasion leads inevitably to tumor recurrence after resection in the case of glioblastoma, causing it to be incurable.
A cellular program which has been described in detail to promote the invasive phenotype in epithelial tumors, is the epithelial-mesenchymal-transition (EMT). Differentiated neural cells are not epithelial, thus, strictly speaking, EMT does not occur in glioblastoma. However, the traits acquired in the process of EMT, especially invasiveness and stemness, are highly relevant to glioblastoma. One of the key transcription factors known to induce EMT in epithelial cancers is ZEB1, which has been described only marginally in the central nervous system so far. Here, I investigate the expression and function of ZEB1 in glioblastoma and during human fetal neural development.
ZEB1 mRNA was significantly upregulated in all histological types of glioma, including glioblastoma, when compared to normal brain. There was no correlation between ZEB1 mRNA levels and tumor grade. Immunohistochemical staining of glioma samples demonstrated that ZEB1 was highly expressed in the great majority of tumor cells. In the developing human brain, intense staining for ZEB1 could be observed in the ventricular and subventricular zone, where stem- and progenitor cells reside. ZEB1 positive cells included cells stained with stem- and progenitor markers like PAX6, GFAP and Nestin. In contrast, ZEB1 was never found in early neuronal cells as identified by TUBB3 staining.
To gain insight into ZEB1 function I generated a human fetal neural stem cell line and a glioblastoma cell line with ZEB1 knockdown, which were compared with their respective control cell lines. First, I found that ZEB1 does not regulate the micro RNA 200 family in either cell line, which has been described as an essential ZEB1 target in epithelial cancers. Second, regulated target genes were identified with a genome wide microarray. The third approach was to directly identify genomic binding sites of ZEB1 by chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq). All three approaches showed that the ZEB1 transcriptional program is surprisingly similar in the neural stem cell line and the glioblastoma cell line. In contrast, it bears only little resemblance to the program described in epithelial cancers.
The most interesting, previously unrecognized ZEB1 target gene identified in this study is integrin b1. It was regulated after ZEB1 knockdown detected by microarray analysis, and has a ZEB1 binding site in its promoter region detected by ChIP-seq. Finally, I addressed the question whether ZEB1 influences tumor growth and invasiveness in a glioblastoma model. After intracranial xenotransplantation in mice, ZEB1 knockdown glioblastoma cells formed significantly smaller and less invasive tumors than control glioblastoma cells.
This study demonstrates that ZEB1 is widely expressed in glioma and relevant for glioblastoma growth and invasion. In contrast to what is known about ZEB1 function in epithelial cancers, ZEB1 is not associated with glioma progression, but instead seems to be an early and necessary event in tumorigenesis. Also with regard to ZEB1 target genes, ZEB1 functions differently in glioblastoma than in epithelial cancers. The two most important ZEB1 targets in epithelial cancers are E-cadherin and the miR-200 family members. Both are not relevant to ZEB1 function in glioblastoma. Interestingly, while the ZEB1 transcriptional program is different from the one described in epithelial cancers, it is highly similar in glioblastoma cells and fetal neural stem cells. This suggests that an embryonic pathway restricted to stem- and progenitor cells during development is reactivated in glioblastoma.
Previously known ZEB1 target genes were tissue specific and therefore seemed unlikely to mediate ZEB1 function in the central nervous system. However, the newly identified ZEB1 target gene integrin b1 is well known to play pivotal roles in both glioblastoma tumorigenesis and invasion as well as in neural stem cells. Additionally, integrin b1 is widely expressed and seems a likely ZEB1 target in other organs than the brain.
Taken together, I demonstrate that ZEB1 is a new regulator of glioblastoma growth and invasion. The transcriptional program of ZEB1 differs from the one in epithelial cancers but is strikingly similar to the one in neural stem cells. The newly identified ZEB1 target gene integrin b1 is likely to mediate crucial ZEB1 functios. Thus, this study identifies ZEB1 as a yet unrecognized player in glioblastoma and neural development. Furthermore, it sets the stage for more research which will help to deepen our understanding of ZEB1 function in the central nervous system and beyond.
Wie andere Vögel auch, verfügen Hühner über zwei verschiedene Magnetfeldrezeptoren. In der vorliegenden Arbeit werden diese beiden Rezeptoren, vor allem unter dem Aspekt Verhaltensontogenie eingehender untersucht. Meine Ergebnisse werden durch histologische Untersuchungen gestützt. Ich untersuchte zwei Hühnerrassen, einen braunen und einen weißen Legehuhn Stamm. Mit der Standardmethode konnte ich die Befunde der Literatur bestätigen. Zur Untersuchung des Magnetkompasses im Auge, habe ich Hühner darauf trainiert einen roten Tischtennisball, auf den sie geprägt wurden, in einer bestimmten magnetischen Richtung zu suchen. Im unbelohnten“ Test ist das Magnetfeld um 90 Grad gedreht, so dass der magnetische Norden nun im geographischen Osten liegt. Die braunen Hühner benutzen den Magnetkompass zum Lösen der gestellten Aufgabe, die weißen Hühner wählen zufällig eine Richtung. Eine Veränderung der Trainingsmethode, ein Training im gedrehten Magnetfeld und eine „Bestrafung“, haben das Ergebnis verändert. Die weißen Hühner sind nun in der Lage, die magnetisch richtige Richtung zu finden, die braunen Hühner reagieren verängstigt und wählen nur zufällig eine Richtung. Beide Hühnerrassen können also - unter verschiedenen Voraussetzungen - einen magnetischen Kompass für die Orientierung benutzen.
The spider genus Eusparassus Simon, 1903 (Araneae: Sparassidae: Eusparassinae; stone huntsman spider) is revised worldwide to include 30 valid species distributed exclusively in Africa and Eurasia. The type species E. dufouri Simon, 1932 is redescribed and a neotype is designated from Portugal. An extended diagnosis for the genus is presented. Eight new species are described: Eusparassus arabicus Moradmand, 2013 (male, female) from Arabian Peninsula, E. educatus Moradmand, 2013 (male, female) from Namibia, E. reverentia Moradmand, 2013 (male, female) from Burkina Faso and Nigeria, E. jaegeri Moradmand, 2013 (male, female) from South Africa and Botswana, E. jocquei Moradmand, 2013 (male, female) from Zimbabwe, E. borakalalo Moradmand, 2013 (female) from South Africa, E. schoemanae Moradmand, 2013 (male, female) from South Africa and Namibia and E. mesopotamicus Moradmand and Jäger, 2012 (male and female) from Iraq, Iran and Turkey. 22 species are re-described six of them are transferred from the genus Olios Walckenaer, 1837. Six species-groups are proposed: the dufouri-group [8 species: E. dufouri, E. levantinus Urones, 2006, E. barbarus (Lucas, 1846), E. atlanticus Simon, 1909, E. syrticus Simon, 1909, E. oraniensis (Lucas, 1846), E. letourneuxi (Simon, 1874), E. fritschi (Koch, 1873); Iberian Peninsula to parts of north-western Africa], walckenaeri-group [3 species: E. walckenaeri (Audouin, 1826), E. laevatus (Simon, 1897), E. arabicus; eastern Mediterranean to Arabia and parts of north-eastern Africa], doriae-group [7 species: E. doriae (Simon, 1874), E. kronebergi Denis, 1958, E. maynardi (Pocock, 1901), E. potanini (Simon, 1895), E. fuscimanus Denis, 1958, E. oculatus (Kroneberg, 1846) and E. mesopotamicus; Middle East to Central and South Asia], vestigator-group (3 species: E. vestigator (Simon, 1897), E. reverentia, E. pearsoni (Pocock, 1901); central to eastern Africa and an isolated area in NW India], jaegeri-group [4 species: E. jaegeri, E. jocquei, E. borakalalo, E. schoemanae; southern and south-eastern Africa], tuckeri-group [2 species: E. tuckeri (Lawrence, 1927), E. educatus; south-western Africa). Two species, E. pontii Caporiacco, 1935 and E. xerxes (Pocock, 1901) cannot be placed in any of the above groups. Two species are transferred from Eusparassus to Olios: O. flavovittatus (Caporiacco, 1935) and O. quesitio Moradmand, 2013. 14 species are recognized as misplaced in Eusparassus, thus nearly half of the described species prior to this revision were placed mistakenly in this genus. Neotypes are designated for E. walckenaeri from Egypt, E. barbarus, E. oraniensis and E. letourneuxi (all three from Algeria) to establish their identity. The male and female of Cercetius perezi Simon, 1902, which was known only from the immature holotype, are described for the first time. It is recognized that the monotypic and little used generic name Cercetius Simon, 1902 — a species, which had been known only from the immature holotype — as a synonym of the widely used name Eusparassus. The case proposal 3596 (conservation of name Eusparassus) is under consideration by ICZN.
The first comprehensive molecular phylogeny of the family Sparassidae with focus on the genus Eusparassus is investigated using four molecular markers (mitochondrial COI and 16S; nuclear H3 and 28S). The monophyly of Eusparassus and the dufouri, walckenaeri and doriae species-groups are recovered with the latter two groups more closely related. The monophyly of the tuckeri-group is not supported and the position of E. jaegeri as the only available member of the jaegeri-group is not resolved within the Eusparassus clade. DNA samples of the vestigator-group were not accessible for this study. The origination of the genus Eusparassus around 70 million years ago (MA) is estimated according to molecular clock analyses. Using this recent result in combination with some biogeographic and geological data, the Namib Desert is proposed as the place of ancestral origin for Eusparassus and putative Eusparassinae genera.
Further analyses are done on the phylogenetic relationships of Sparassidae and its subfamilies. The Eusparassinae are not confirmed as monophyletic, with the two original genera Eusparassus and Pseudomicrommata in separate clades and only the latter clusters with most other assumed Eusparassinae, here termed the "African clade". Monophyly of the subfamilies Sparianthinae, Heteropodinae sensu stricto, Palystinae and Deleninae is recovered. The Sparianthinae are supported as the most basal clade, diverging considerably early (143 MA) from all other Sparassidae. The Sparassinae and genus Olios are found to be polyphyletic. The Sparassidae are confirmed as monophyletic and as most basal group within the RTA-clade. The divergence time of Sparassidae from the RTA-clade is estimated with 186 MA in the Jurassic. No affiliation of Sparassidae to other members of the "Laterigradae" (Philodromidae, Selenopidae and Thomisidae) is observed, thus the crab-like posture of this group was proposed a result of convergent evolution. Only the families Philodromidae and Selenopidae are found members of a supported clade. Including a considerable amount of RTA-clade representatives, the higher-level clade Dionycha is not but monophyly of the RTA-clade itself is supported.
Es ist wohl unumstritten, dass das Leben, wie wir es kennen, ohne die sauerstoffproduzierenden Organismen unserer Erde nicht möglich wäre. Zu ihnen gehören nicht nur die Landpflanzen, deren mannigfaltige Nutzung wichtiger Bestandteil unseres Alltags ist. Auch mikroskopisch kleine Algenarten leisten einen entscheidenden Beitrag zu den Stoffwechselkreisläufen dieser Welt. Unter ihnen befinden sich die Kieselalgen (Diatomeen), die mit einer Varietät von bis zu 10000 Spezies etwa 40 % der marinen Primärproduktion verantworten. Der Ursprung der heutigen zur oxygenen Photosynthese befähigten Eukaryoten geht auf Endosymbioseereignisse zurück, von denen aus sich diese Organismen ausgesprochen vielfältig entwickelt haben. Diese Vielfalt wird dabei nicht nur anhand ihrer äußeren Morphologie, sondern auch auf subzellulärer Ebene, deutlich. So zum Beispiel durch die unterschiedlichen Strukturen der Thyakoidmembranen, die sich in Kieselalgen wie Cyclotella meneghiniana in dreilagigen Bändern arrangieren. In Pflanzen wie Nicotiana tabacum (Tabak) hingegen bilden sie große, stapelartige Bereich aus, die zur räumlichen Separation der in den Thylakoiden eingebetteten Photosystemen beitragen. Auch die an die Photosysteme (PS) gebundenen Lichtsammelproteine (Lhcs) haben sich in Tabak und Cyclotella unterschiedlich entwickelt. Gemäß ihrem Namen zeichnen sie sich zwar allesamt durch die Sammlung und Weiterleitung der Lichtenergie an die Photosysteme aus, grenzen sich aber in Hinblick auf Proteingröße und Pigmentierung voneinander ab.
Die Lhcs der höheren Pflanzen werden entsprechend ihrer Zuordnung zu den Photosystemen in den aus zwei Heterodimeren bestehenden LHCI des PSI und die Lhcb-Antennenproteine des PSII unterschieden. Zu letzteren gehören der trimere Hauptantennenkomplex LHCII und die monomeren, minoren Antennenproteine. Die Lhcs binden die zur Lichtsammlung benötigten Pigmente, vor allem Chlorophyll a und Chlorophyll b, aber auch primäre Carotinoide wie Violaxanthin, Lutein und Neoxanthin, in unterschiedlichen Stöchiometrien. Es ist bereits bekannt, dass die Pigmentierung entscheidend zur Stabilität der Lichtsammelproteine beiträgt, wenngleich zum Teil auch eine gewisse Flexibilität in Bezug auf die Art der gebundenen Pigmente an den entsprechenden Bindestellen der Proteine besteht.
Im Rahmen dieser Arbeit liegt der Fokus auf der Fragestellung inwieweit die in der Regel nicht in Pflanzen vorkommenden Ketocarotinoide die Struktur und Funktion des LHCII aus einer Ketocarotinoide produzierenden N. tabacum - Transformante (bkt-Linie) beeinflussen und welche Auswirkungen sie auf dessen Photosyntheseapparat im Allgemeinen haben. Die bkt-Linie bildet dabei zum Teil auf Kosten ihrer primären Carotinoide sowohl das als antioxidativ und als anti-kanzerogen beschriebene Astaxanthin, als auch dessen Vorstufe Canthaxanthin und einige Derivate dieser Pigmente, die, nach vergleichenden HPLC-Analysen von Blättern und Thylakoidfraktionen, zu einem großen Teil mit der Thylakoidmembran assoziiert sind. Durch spektroskopische Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass diese Ketocarotinoide in Hinblick auf die Energieweiterleitung zum Chlorophyll a nicht funktionell an den LHCII binden, ihre Produktion aber die Trimerisierung dieses Lichtsammelkomplexes in N. tabacum nachhaltig beeinträchtigt. Auch die Assemblierung der PSII-LHCII-Superkomplexe wird dadurch maßgeblich gestört. Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Chloroplasten der bkt-Linie verdeutlichten zudem die Beeinträchtigung der Granathylakoid-Stapelung: Sie fällt ungeordneter aus als im Wildtyp, was durch den Mangel an intakten LHCII-Trimeren begründet sein kann.
In funktioneller Hinsicht stören die Ketocarotinoide die Energieweiterleitung innerhalb des PSII und bewirken die Reduktion der photoprotektorischen, nicht-photochemischen Fluoreszenzlöschung des Wirtsorganismus nachhaltig. Zeitgleich reduzieren sie durch einen abschirmenden Effekt auf Grund ihrer Assoziation mit der Thylakoidmembran und/oder durch einen eventuellen S1-S1-Energietransfer von Chl a auf die Ketocarotinoide aber auch die Menge der Lichtenergie, die über die Lhcs an die Photosysteme weitergeleitet wird. Dadurch kommt ihnen neben dem nachhaltig störenden Einfluss auf die Intaktheit des Photosyntheseapparats zugleich auch eine schützende Wirkung vor einem Übermaß an Lichtenergie zu.
Aus Cyclotella meneghiniana sind zwei Hauptantennenkomplexe bekannt: FCPa und FCPb. Im Gegensatz zu den Lhcs der Chl a/b-haltigen Organismen binden die Lichtsammelproteine der Diatomeen das Xanthophyll Fucoxanthin anstelle des Luteins, und Chlorophyll c anstelle des Chlorophyll b. Im Gegensatz zu der bereits sehr detailliert aufgeklärten Struktur des trimeren LHCII in höheren Pflanzen, existieren für den Aufbau des FCPb in C. meneghiniana bisher nur fundierte Modellvorschläge. Diese postulieren eine homotrimere Grundstruktur für den FCPb, die zu höheren Oligomeren assembliert.
In der vorliegenden Arbeit konnte anhand elektronenmikroskopischer Aufnahmen und der anschließenden Einzelpartikelanalyse nun erstmalig die Struktur des etwa 6-7 nm großen, trimeren FCPb gezeigt und die Richtigkeit der bisher postulierten Modellvorschläge in Hinblick auf die Struktur des Trimers bewiesen werden. Nach den hier dargelegten Erkenntnissen gleicht die Anordnung der Untereinheiten des FCPb-Trimers der des LHCII. Zudem ergibt sich aus dem Zusammenhang der hier erhobenen Daten und den in der Fachliteratur veröffentlichten Ergebnissen zum Thema FCPb ein klares Bild über die Anordnung der höheren Oligomere in Form von Nonameren. Auch diese Erkenntnisse unterstützen das ursprünglich von C. Büchel vorgeschlagene Modell für die oligomere Struktur des FCPb in C. meneghiniana.
Angiogenesis, the formation of new blood vessels from existing ones, is a fundamental biological process required for embryonic development; it also plays an important role during postnatal organ development and various physiological and pathological remodeling processes in the adult organism. Vascular endothelial growth factor (VEGF) and its main receptor, VEGF receptor-2 (VEGFR-2), play a central role in angiogenesis. VEGFR-2 expression is strongly upregulated in angiogenic vessels, but the mechanisms regulating VEGFR-2 expression are not well understood. We found in this study that the G-protein α subunit Gα13 plays an important role in the regulation of VEGFR-2 expression. In vitro, we found that knockdown of Gα13 reduced VEGFR-2 expression in human umbilical vein endothelial cells and impaired responsiveness to VEGF-A. This phenotype was rescued by adenoviral normalization of VEGFR-2 expression. Gα13-dependent VEGFR-2 expression involved activation of the small GTPase RhoA and transcription factor NF-κB; it was abrogated by deletion of the NF-κB binding site at position -84 of the VEGFR-2 promoter. In vivo, endothelial cell-specific loss of Gα13 resulted in reduced VEGFR-2 expression, impaired responsiveness towards VEGF-A in Matrigel assays, and reduced retinal angiogenesis. Importantly, also tumor vascularization was diminished in the absence of endothelial Gα13, resulting in reduced tumor growth. Taken together, we identified Gα13-dependent NF-κB activation as a new pathway underlying the transcriptional regulation of VEGFR-2 during retinal and tumor angiogenesis.
By far not all genetic information is expressed by mRNA coding regions of the DNA. 98% of the human genome is not encoding for proteins. Therefore, these non-coding regions have been considered as “junk DNA” for a long time [1, 2]. The last years, new high throughput sequencing techniques have allowed the elucidation of the heterogeneous population of non-coding RNAs (ncRNAs, Table 1). RNAs longer than 200 nucleotides (nt) belong to the family of long non-coding RNAs (lncRNAs). They can exhibit numerous functions: The biggest family of RNAs is represented by the ribosomal RNAs (rRNAs). Together with the transfer RNAs (tRNAs) they are essential for the translation of mRNA into an amino acid sequence.
Long-distance seed dispersal is a crucial process allowing the dispersal of fleshy-fruited tree species among forest fragments. In particular, large frugivorous bird species have a high potential to provide inter-patch and long-distance seed transport, both important for maintaining fundamental genetic and demographic processes of plant populations in isolated forest fragments. In the face of increasing worldwide forest fragmentation, the investigation of long-distance seed dispersal and the factors influencing seed dispersal processes has recently become a central issue in ecology. In my thesis, I studied the movement behaviour and the seed dispersal patterns of the trumpeter hornbill (Bycanistes bucinator), a large obligate frugivorous bird, in KwaZulu-Natal, South Africa. I investigated (i) the potential of trumpeter hornbills to provide long-distance seed dispersal within different landscape structures, (ii) seasonal variations in ranging behaviour of this species, and (iii) the potential of this species to enhance the functional connectivity of a fragmented landscape. I used highresolution GPS-data loggers to record temporally and spatially fine-scaled movement data of trumpeter hornbills within both continuous forests and fragmented agricultural landscapes during the breeding- and the non-breeding season. First, combining these data with data on seed-retention times, I calculated seed dispersal kernels, able to distinguish between seed dispersal kernels from the continuous forests and those from the fragmented agricultural landscapes. The seed dispersal distributions showed a generally high ability of trumpeter hornbills to generate seed transport over a distance of more than 100 m and for potential dispersal distances of up to 14.5 km. Seed dispersal distributions were considerably different between the two landscape types, with a bimodal distribution showing larger dispersal distances for fragmented agricultural landscapes and a unimodal one for continuous forests. My results showed that the landscape structure strongly influenced the movement behaviour of trumpeter hornbills, and this variation in behaviour is likely reflected in the shape of the seed dispersal distributions. Second, for each individual bird I calculated daily ranges and investigated differences in daily ranging behaviour and in the process of range expansion comparatively between the breeding- and the non-breeding season. I considered differences in habitat use and possible consequences resulting for seed dispersal function during different seasons. I found that within the breeding season multi-day ranges were built from strongly overlapping and nearly stationary daily ranges which were almost completely restricted to continuous forest. In the non-breeding season, however, birds assembled multi-day ranges by shifting their range site to a generally different area, frequently utilizing the fragmented agricultural landscape. Thereby, several small daily ranges and few large daily ranges composed larger multi-day ranges within the non-breeding season. Seasonal differences in ranging behaviour and range assembly processes resulted in important consequences for seed dispersal function, with short distances and less spatial variation during the breeding season and more inter-patch dispersal across the fragmented landscape during the non-breeding season. Last, I used a projection of simulated seed dispersal events on a high-resolution habitat map to assess the extent to which trumpeter hornbills potentially facilitate functional connectivity between plant populations of isolated forest fragments. About 7% of dispersal events resulted in potential between-patch dispersal and trumpeter hornbills connected a network of about 100 forest patches with an overall extent of about 50 km. Trumpeter hornbills increased the potential of functional connectivity of the landscape more than twofold and seed dispersal pathways revealed certain forest patches as important stepping-stones for seed dispersal among forest fragments. Overall, my study highlights the overriding role that large frugivorous bird species, like trumpeter hornbills, play in seed dispersal in fragmented landscapes. In addition, it shows the importance of fine-scaled movement data combined with high-resolution habitat data and consideration of different landscape structures and seasonality for a comprehensive understanding of seed dispersal function.
C-Typ Lektin-ähnliche Rezeptoren (CTLRs) auf Lymphozyten des Immunsystems modulieren deren Effektorfunktionen wie Zytotoxizität oder Zytokinsekretion. Die Gene dieser Immunrezeptoren befinden sich in einer definierten genomischen Region, dem Natürlichen Killer Genkomplex (NKC), welcher im Menschen auf Chromosom 12 und in der Maus auf Chromosom 6 lokalisiert ist. Namensgebend für diesen Gencluster ist die erste Beschreibung von CTLRs auf Natürlichen Killerzellen (NK-Zellen), den Effektorlymphozyten des angeborenen Immunsystems. Einige NKC-kodierte CTLR, insbesondere Vertreter der C-Typ Lektin Familie 2 (CLEC2)-Rezeptorfamilie, werden jedoch auch in nicht-lymphozytären Zellen (z.B. humanes KACL in Keratinozyten, Maus Clr-f in Darmepithelzellen) vorgefunden und in Zusammenhang mit einer gewebsspezifischen Immunüberwachung gebracht. Bemerkenswerterweise sind die Lymphozytenassoziierten Rezeptoren dieser CLEC2-Proteine ebenso CTLRs, welche zudem eng benachbart zu den CLEC2-Proteinen im NKC kodiert sind, sodass es sich um genetisch gekoppelte Rezeptor-Liganden-Paare mit immunologischer Funktion handelt.
Zu Beginn der vorliegenden Arbeit richtete sich das Interesse auf ein bislang uncharakterisiertes Mitglied der CLEC2-Proteinfamilie (CLEC2L), das jedoch außerhalb des NKC und in unmittelbarer Nachbarschaft zu einem weiteren und ebenso uncharakterisierten CTLR (KLRG2) kodiert ist. Im Unterschied zu anderen Mitgliedern der CLEC2-Familie ist CLEC2L (wie auch KLRG2) in Säugetieren hochkonserviert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Frage nachgegangen, ob CLEC2L wie andere Mitglieder der CLEC2-Proteinfamilie eine gewebsspezifische Expression aufweist, mit einem genetisch gekoppelten CTLR, d. h. mit KLRG2, interagiert und funktionell in Verbindung mit dem Immunsystem gebracht werden kann. Ziel dieser Arbeit war es somit, eine detaillierte Expressions- und Funktionsstudie zu CLEC2L durchzuführen.
Mittels quantitativer Echtzeit-PCR und in situ Hybridisierung konnte CLEC2L-RNA im humanen und Maus-Gehirn nachgewiesen werden. Da die Mengen dort das Expressionsniveau in anderen Organen bei Weitem überstiegen, wurde das CLEC2L-kodierte Protein als BACL (engl. Brain-Associated C-type Lectin) neu benannt. Ektop exprimiertes BACL bildet ähnlich wie viele andere CLEC2-Mitglieder ein disulfid-verknüpftes Homodimer auf der Zellmembran von Säugetierzellen. Um die endogene Proteinexpression dieses gehirnassoziierten „Waisen"-Rezeptors zu charakterisieren, wurde die BACL-Ektodomäne rekombinant produziert und als Immunogen zur Herstellung BACLspezifischer Antikörper eingesetzt. Mit diesen Antikörpern und einer Kombination immunologischer Techniken wie Immunhistochemie, Immunfluoreszenz und Immunpräzipitation konnte die Präsenz von BACL auf humanen und Maus-Neuronen des Gehirns mit einer besonders ausgeprägten Expression in Purkinje-Zellen zum ersten Mal gezeigt werden. Neben dem Gehirn wurden andere Bereiche des Nervensystems, darunter Spinalganglien und Retina, auf die Expression des BACL-Proteins untersucht. Hierbei konnte mittels Immunfluoreszenz und hochauflösender konfokaler Mikroskopie gezeigt werden, dass BACL mit Neuronenmembranen assoziiert ist. Die durchflusszytometrische Analyse von in vitro kultivierten Neurosphären untermauerte die Expression von endogenem BACL als membranständiges Oberflächenprotein.
Diverse Ansätze zur Identifizierung von Interaktionspartnern von BACL erbrachten letztlich keine eindeutigen Ergebnisse. KLRG2 wurde ursprünglich aufgrund seiner benachbarten genomischen Lokalisation als möglicher Rezeptor von BACL favorisiert, jedoch konnten weder Reporterassays noch durchflusszytometriebasierte Bindungsanalysen eine Interaktion dieser beiden Proteine aufzeigen. Auch die aus den massenspektrometrischen Analysen von humanen und Maus BACL-Immunpräzipitaten erhaltenen Kandidatenproteine konnten letztendlich nicht als Interaktionspartner von BACL eindeutig verifiziert werden.
Eine mögliche immunologische Bedeutung von BACL in vivo wurde im Rahmen von Tumorimplantationsexperimenten mit BACL-exprimierenden Tumorzellen untersucht. Hierbei wurde das Tumorwachstum von BACL- mit Kontroll-Transfektanten in C57BL/6 Mäusen verglichen. Der beobachtete Effekt des verlangsamten Tumorwachstums nach BACL-Überexpression war jedoch nicht auf BACL-Erkennung durch Lymphozyten zurückzuführen, wie anhand von immundefizienten Rag1-k.o. und NOD-SCID-gammak.o. Mäusen gezeigt werden konnte.
Insgesamt liefert diese Arbeit die Erstbeschreibung des bislang uncharakterisierten CTLRs BACL. Das Protein teilt strukturelle Merkmale mit Mitgliedern der CLEC2-Familie, unterscheidet sich jedoch deutlich durch (i) seine hohe Konservierung in Säugetieren, (ii) seine Kodierung außerhalb des NKC und (iii) seine pan-neuronale Expression. Die Erkenntnis, dass BACL in Maus- und in humanen Neuronen exprimiert wird, wirft die Frage nach seiner funktionellen Relevanz auf. Als Membranprotein könnte es eine wichtige Rolle in der neuronalen Kommunikation und bei zellulären Kontakten spielen. Die Frage nach der Funktion von BACL wird in zukünftigen Forschungsarbeiten zu klären sein.
In the past century, scientists have realized that venoms are a source of a number of natural substances presenting a wide range of pharmacological properties and often displaying a high specificity for their targets. Thus, the field of toxinology came into being, which is defined as the study of toxic substances of biological origin. Toxins are found in a wide variety of animals, including fish, cone snails, scorpions, snakes, and even some mammals. To be classified as venom, these must contain substances, i.e. toxins, which disturb physiological processes and must be deliberately delivered to the target animal. Snakes have evolved one of the most sophisticated mechanisms for venom delivery. Envenomation by snakebite can induce and inhibit aggregation/agglutination of platelets as well as inhibit/activate hemostasis, but also disrupt other physiological functions via neurotoxins and angioneurin growth factors. Snake venoms contain a substantial amount of C-type lectin-related proteins (CLRPs) which are known to function, notably, as integrin inhibitors. CLRPs are heterodimers composed of homologous α and β subunits which can assemble either covalently or noncovalently to oligomers, resulting in αβ, (αβ)2 and (αβ)4 structures. Some of the main targets of CLRPs are membrane receptors, coagulation factors, and proteins essential to hemostasis. The platelet collagen receptors GPVI and α2β1 integrin as well as the von Willebrand factor receptor GPIb play important roles in platelet activation and aggregation and are considered main targets of antithrombotic drugs. In this thesis, the integrin α2β1 is particularly considered as it is the sole collagen-binding integrin on platelets. Reduced expression of this platelet receptor results in dysfunction of platelet responses. Equivalently, overexpression of α2β1 integrin results in an increased risk of thrombosis. As a result, selective inhibitors of the collagen-α2β1 interaction could give rise to effective antithrombotic drugs. Integrins are large receptors which mediate cell-cell contacts and the binding of cells to the extracellular matrix (ECM). Therefore, they play a role in physiological processes, e.g. hemostasis and immunity, as well as in pathological processes, e.g. tumor angiogenesis and atherosclerosis. 18 α and 8 β integrin subunits, with nine α subunits containing an additional A domain, associate non-covalently to form 24 heterodimers with distinct binding specificities. Integrin collagen receptors are a subclass of four receptors which all utilize the β1 subunit. The α2β1 integrin is a collagen-binding receptor expressed not only on platelets, but also on endothelial and epithelial cells. Consequently, this integrin is also essential for cell adhesion and migration playing a role in angiogenesis as well as tumor metastasis. To date, there are five known antagonists of α2β1 integrin: EMS16, rhodocetin, vixapatin, and most recently rhinocetin and flavocetin-A. The first four have been shown to be specific for the integrin α2A domain, the major collagen-binding domain. All these antagonists are CLRPs and present new leads for drug design. In the past few years, many insights into the structure and function of rhodocetin were obtained. Monoclonal antibodies proved to be advantageous in disclosing this information, making them not only useful as therapeutic agents, but also as tools for protein characterization. The venom of the Vipera palaestinae snake was recently shown to contain an α2β1 integrin inhibitor, which prevented the integrin from binding collagen. This inhibitor, called vixapatin, was the initial focus of this dissertation. Vixapatin’s interaction with the α2β1 integrin needed further characterization on a molecular and cellular level to assess its medical potential and monoclonal antibodies were to be used as a tool. Originally, vixapatin had been isolated by reversed-phase high-performance liquid chromatography. To avoid the stringency of this method, for this study, it was replaced with gentler chromatographic methods. First, the α2β1 integrin inhibitor was isolated from the crude snake venom with affinity chromatography using the α2A domain as bait, establishing a method to quickly screen venoms for α2β1-binding proteins which affect the collagenintegrin interaction. The applicability of this method to other snake venoms was shown by isolating an α2A domain-specific toxin from the venom of Trimeresurus flavoviridis. To allow further characterization of both these toxins, gel filtration and ion exchange chromatography were employed to purify the protein without the α2A domain. These classical protein purification methods resulted in similar separation patterns of both the V. palaestinae and T. flavoviridis venom proteins. Purified proteins exhibiting the potential of inhibiting integrinbinding to collagen were analyzed by two-dimensional gel electrophoresis. Both VP-i and flavocetin-A, the integrin inhibitors from V. palaestinae and T. flavoviridis, respectively, were shown to have more complex structures than was evident from the purification. Each consisted of four low-molecular-weight proteins which assembled into two bands (for VP-i) or one single band (for flavocetin-A) under non-reducing conditions. Mass spectrometry analyses revealed VP-i to belong to the family of CLRPs, just like vixapatin does. However, these two proteins differed in their primary sequences and only showed homology to one another. The toxin purified from T. flavoviridis revealed this toxin to be flavocetin-A, a heterodimeric CLRP which had so far only been shown to have GPIb-binding activity. At the time of flavocetin-A’s purification, flavocetin-B was co-purified; flavocetin-B consists of the same two α and β subunits, plus an additional γ subunit. As no sequence information is known to date for the γ subunit, it may be one of the additional proteins purified here, along with an additional δ subunit. Therefore, the toxin isolated here may actually consist of four different subunits forming a tetramer of two different heterodimers, generating an (αβ)2(γδ)2 structure. This proposed (αβ)2(γδ)2 flavocetin-A structure has binding sites for both α2β1 integrin and GPIb, with no sterical overlap, as shown by affinity chromatography using the α2A domain and the extracellular domain of the GPIb receptor. The potential of VP-i and flavocetin-A to inhibit integrin-binding to type I collagen was shown during purification: Both toxins efficiently bind to the integrin α2A domain; also, VP-i and vixapatin bind to the A domain with the same affinity. Surface plasmon resonance showed the interaction of flavocetin-A with the α2β1 integrin to be extremely strong and association to be very fast. Furthermore, both toxins were shown to inhibit binding of the wildtype integrin to collagen: VP-i and flavocetin-A acted antagonistically on cell adhesion and cell migration. Initially, the interaction between VP-i and α2β1 integrin was to be further characterized with the help of monoclonal antibodies. However, this proved problematic, the procedure requiring various optimizations. Although, after expert consultation, some monoclonal antibodies could be obtained, the cells were extremely sensitive and gave unsatisfactory results when tested as detection tools in Western blot and immunoassays. Concluding, two novel α2β1 integrin inhibitors were discovered: VP-i and flavocetin-A, which were purified using the same procedure and which have similar functions. Both are Ctype lectin-related proteins which effectively inhibit cell adhesion and migration. This underlines that nature has instrumentalized CLRPs to specifically inhibit α2β1 integrin. Further characterization of VP-i and flavocetin-A will be able to provide leads for future drug development.
Die phylogenetisch hochkonservierte Jak/Stat‐Signaltransduktionskaskade repräsentiert eines der zentralen Säulen zellulärer Signalübertragung eukaryotischer Organismen. Ubiquitär im Organismus exprimiert und über eine Vielzahl von Zytokinen, Hormonen und Wachstumsfaktoren aktiviert, sind Stat‐Transkriptionsfaktoren maßgeblich an dem Erhalt der Physiologie und Homöostase von Organen und Geweben beteiligt. So sind die Mitglieder Stat5A und Stat5B (als homologe Proteine im Verbund als Stat5 bezeichnet) entscheidende Regulatoren des Immunsystems und der Hämatopoese, der Funktion und Entwicklung des Prostata‐ und Brustdrüsengewebes (Mammogenese) oder bestimmter Funktionen der Leber. Wie auch Stat3, konnten Stat5 Proteine in aberrant aktiver Form in verschiedensten Typen und Stadien humaner Tumore nachgewiesen werden, wo sie über die Expression ihrer Zielgene sowie über weitere nicht‐kanonische Funktionen im Zytoplasma und im Zellkern einer fortschreitend malignen Entartung entscheidend beitragen. Als Folge der Unterstützung essentieller Tumorgenese‐
Mechanismen, wie gesteigertes Zellwachstum, Apoptosehemmung, Migration und Metastasierung, Sauerstoff‐unabhängiger Energiestoffwechsel, Angiogenese oder Umgehung der Immunabwehr, entwickeln Tumore häufig eine Abhängigkeit gegenüber der gesteigerten Aktivität dieser Vertreter der Stat‐Proteinfamilie und reagieren mit einem Wachstumsstopp und Apoptoseinduktion auf ihre Inhibierung. Perspektivisch stellt die gezielte Interferenz mit aberranten, Tumortyp‐spezifischen Stat5‐Aktivitäten einen relevanten Ansatz in der personalisierten Therapie Stat5‐abhängiger Tumore, vorrangig leukämischen Ursprungs, dar. ...
In den vergangenen Jahren haben ökologische Fragen in der Naturstoffforschung mehr und mehr an Bedeutung gewonnen. Naturstoffe bilden dabei einen wichtigen Aspekt in der Aufrechterhaltung symbiotischer Systeme.
Symbiosen stellen eine der treibenden Kräfte der Evolution dar. Diese artenübergreifende Interaktion zweier Organismen ermöglicht die Evolution in wechselseitiger Anpassung, wobei per Definition in die Kategorien Mutualismus, Kommensalismus und Parasitismus unterschieden wird. Teilweise führt die obligatorische Abhängigkeit eines Organismus zum partiellen Merkmals- und Stoffwechselwegverlust, der durch seinen Symbiose-Partner kompensiert wird. In den meisten Fällen stellt Symbiose ein komplexes Netzwerk aus mehr als zwei Lebewesen dar.
Diese Arbeit beschreibt die Anwendung der Klonierungsmethode ExRec ("overlap extension PCR-yeast homologous recombination") für die vereinfachte Bereitstellung von Naturstoffen. Es konnte ein 45 kb großes Gencluster erfolgreich kloniert und zwei neue Peptide Ambactin und Xenolindicin aus Xenorhabdus charakterisieren werden, wobei letztgenanntes von einem stillen Gencluster stammt. ExRec stellt eine sehr effiziente und wichtige Methode für die Klonierung großer Gencluster als auch für die Klonierung aus Metagenombibliotheken und RNA Pools dar...
Fungal organisms, including the most common human pathogens Candida spp., are commensal organisms that are widely present as part of the human flora. Fungal infections are, most frequently, local infections that do not compromise the life of patients. However, mycotic diseases can be life-threatening if they become systemic infections. Systemic fungal infections have risen over the last three decades in parallel to the increased immune-compromised population as a consequence of diseases (e.g. HIV/AIDS) or therapeutic interventions that affect the immune system (e.g. chemotherapy for cancer treatment and immunosuppressors used for patients with organ transplants). This has resulted in the demand of new antifungal drugs that can eradicate the new infections caused by these opportunistic fungal pathogens. However, most of the current compounds have poor pharmaceutical properties such as narrow spectrum of activity, susceptibility to be extruded by efflux pumps or lack of specificity, which make them not suitable for human clinical applications. The treatment of fungal and parasitic infections has been traditionally difficult because the infective organisms are eukaryotic cells that share most of the pathways and enzymes with human cells. To avoid side effects and to develop a targeted therapy, the research has traditionally been centered on the very few enzymes and pathways existing in the infectious organism but absent in humans. Until now, antifungal therapeutic options are limited and are almost dominated by azole class of sterol biosynthesis inhibitors affecting the synthesis of ergosterol, a major constituent of the fungal cell membrane. Because human cells do not have a cell wall, the development of effective and safe antifungal agents has also been directed to enzymes required for the synthesis of the cell wall. Alternatively, it is theoretically possible to target enzymes that are present in fungal organisms and in humans, when: 1) sufficient selectivity can be achieved, and 2) inhibition of the fungal enzyme is lethal to the fungus but does not produce major side effects to humans. In this line, it would be ideal to evaluate the development of selective inhibitors of enzymes which are already known to be drug targets, like protein kinases.
Es gibt für die Orientierung von Vögel ein allgemeingültiges Konzept, das Karte-Kompass-Prinzip (Kramer 1953, 1957): Der Karten-Schritt besteht darin, den eigenen Standort zu ermitteln und mit dem Ziel in Beziehung zu setzten. Damit wird die geografische Richtung bestimmt, die im Kompass-Schritt in eine konkrete Richtung umgesetzt wird. Für Beides nutzen Vögel auch das Magnetfeld der Erde; in der Karte als einen Faktor den Verlauf der Intensität, im Magnetkompass die Achse der Feldlinien. Der Magnetrezeptor, der die Karte mit Informationen versorgt, ist im Schnabel lokalisiert, der des Kompasses im Auge. Ich habe mich in meiner Arbeit darauf konzentriert, die zwei potenziellen Magnetrezeptoren der Vögel feinstrukturell und immunhistologisch weiter zu charakterisieren.
Für den Magnetkompass wird auf Grund des Radikalpaar-Modells angenommen, dass Cryptochrome die Rezeptormoleküle sein könnten (Ritz et al. 2000). Bei Vögeln sind vier Cryptochrome bekannt, allerdings muss das Rezeptormolekül des Magnetkompasses auch in seiner Lokalisation bestimmte Kriterien erfüllen. Die für meine Arbeit bedeutsamen Kriterien sind: (1) die gleiche Ausrichtung der Proteine in einer Rezeptorzelle und (2), dass die einzelnen Rezeptorzellen alle Raumrichtungen abdecken. Ich habe in meiner Arbeit Cryptochrom 1a (Cry1a) und Cryptochrom 1b (Cry1b) auf ihr Vorkommen in der Retina von Rotkehlchen (Erithacus rubecula) und Hühnern (Gallus gallus) untersucht. Cry1b befindet sich bei Rotkehlchen während der Zugzeit in den Ganglienzellen, in denen es teilweise an Membranen gebunden vorliegt, die jedoch keine bevorzugte Richtung haben. Somit erscheint mir Cry1b als Rezeptormolekül für den Magnetkompass als eher ungeeignet. Cry1b könnte, wie viele Cryptochrome, an der Steuerung von circadianen Rhythmen beteiligt sein. Cry1a hingegen ist bei beiden untersuchten Vogelarten in den UV/V-Zapfen an die Diskmembranen gebunden, was eine Ausrichtung ermöglicht. Die UV/V-Zapfen sind über die gesamte Retina gleichmäßig verteilt, und durch die sphärische Form des Auges decken die einzelnen Rezeptoren jede Raumrichtung ab. Somit erfüllt Cry1a die Bedingungen des Radikalpaar-Modells, und ich schließe daraus, dass es sich hierbei um das Rezeptormolekül des Magnetkompasses handeln könnte. Cry1a ändert nach Lichtabsorption wie viele Cryptochrome seine Konformation. Der von mir verwendete Antikörper bindet nur die lichtaktivierte Form des Proteins. In Versuchen, in denen Hühner verschiedenen monochromatischen Lichtern ausgesetzt wurden, zeigt sich, dass sich Cry1a in UV bis Gelb in lichtaktiviertem Zustand befindet. Dies stimmt sowohl mit der spektralen Empfindlichkeit des Magnetkompasses der Vögel als auch mit der des Flavins, des lichtsensitiven Teils des Cryptochroms, überein. Versuche mit grünem Licht lassen vorsichtige Rückschlüsse auf das für den Magnetkompass relevante Radikalpaar zu: so ist das Flavin erst im zweiten Oxidationsschritt grünlicht-sensitiv, und Cry1a ist nur nachweisbar, also lichtaktiviert, wenn der erste Schritt bereits im Hellen abgelaufen ist. Versuche in denen die Tiere vorab im Dunkeln waren, führen nicht zur erneuten Lichtaktivierung unter grünem Licht. Dies macht nur eines der beiden im Flavinzyklus entstehenden Radikalpaare wahrscheinlich, nämlich das in der Reoxidation entstehende, da das Radikalpaar im ersten Schritt der Oxidation unter Grün nicht entsteht.
In Bezug auf den Magnetrezeptor im Schnabel konnte bereits bei Tauben eine detaillierte Struktur beschrieben werden, die als Magnetrezeptor geeignet ist, nämlich Magnetit- bzw. Maghemit-Teilchen in Dendriten der Nerven (Fleissner et al. 2003). Auch Hühner haben eisenhaltige Strukturen im Oberschnabel, die in ihrer Eisenoxid-Zusammensetzung denen der Tauben entsprechen (Falkenberg et al. 2010). Ich konnte in meiner Arbeit zeigen, dass die eisenhaltigen Strukturen im Oberschnabel der adulten Hühner an oder in Nervenfasern liegen. Elektronenoptisch bestehen diese eisenhaltigen Strukturen im Nervengewebe bei Hühnern, wie bei Tauben beschrieben, aus einem 3-5 µm großen Vesikel, der von eisenhaltigen ‘Schuppen’ besetzt ist, aus circa 1 µm langen Plättchen und Kugeln mit einem Durchmesser von etwa 1 µm. Sie sind in Feldern angeordnet, in denen diese Zellstrukturen gleich ausgerichtet sind. In der Anzahl und Lokalisation der Felder der eisenhaltigen Dendriten gibt es Unterschiede zwischen Hühnern und Tauben, allerdings ist unklar, inwie¬weit dies zu Unterschieden in der Verarbeitung im Gehirn führt. Die Entwicklung der eisenhaltigen Dendriten der Hühner beginnt erst nach dem Schlupf, am Tag des Schlupfes haben Küken noch keine eisenhaltigen Strukturen, abgesehen von roten Blutkörperchen. In den ersten 5 Tagen werden eisenhaltige Makrophagen im frontalen Bereich des Schnabels gebildet, die anschließend wieder reduziert werden. Bei 12 Tage alten Hühnern werden diese auch im lateralen Bereich des Oberschnabels angelegt und ebenfalls dort bis Tag 21 wieder reduziert. 21 Tage alte Hühner haben nur noch wenige eisenhaltige Makrophagen, allerdings ein erstes Feld von eisenhaltigen Dendriten. Die Röntgenabsorption zeigt einen Unterschied in der Eisenoxid-Zusammensetzung zwischen eisenhaltigen Makrophagen und eisenhaltigen Dendriten. Es könnte sein, dass die eisenhaltigen Makrophagen an der Synthese der eisenhaltigen Dendriten beteiligt sind, da sie Eisen aufnehmen, aber auch wieder abgeben können und in demselben Zeitraum reduziert werden, wie die eisenhaltigen Dendriten aufgebaut werden.
Sowohl Tauben als auch Rotkehlchen haben sich phylogenetisch bereits vor 95 Millionen Jahren von den Hühnern abgespalten. Es gibt sowohl in der Lokalisation von Cry1a als auch in der Struktur der einzelnen eisenhaltigen Dendriten keine Unterschiede, so dass es sich bei den beiden Magnetrezeptoren der Vögel vermutlich um sehr alte Mechanismen handelt, die sich in der Evolution kaum verändert haben. Vermutlich sind sie vogelspezifisch, da es in dieser Hinsicht keine erkennbare Gemeinsamkeit mit anderen Wirbeltieren gibt.
Evaluierung der zellfreien Produktion sekundär aktiver Transporter für die Proteinkristallisation
(2013)
Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand die Untersuchung der Reaktivität von Chlorsilanen gegenüber Elektronenpaardonoren. Als Basis hierfür diente die Alkylamin-katalysierte (NMe3, NMe2Et, NEt3) quantitative Disproportionierung von Si2Cl6 bzw. Si3Cl8 zum Neopentasilan 3 und SiCl4 (T ≤ RT, Schema 40). Obwohl diese Reaktion bereits seit über 60 Jahren bekannt ist, sind für ihren Mechanismus nur Vermutungen aufgestellt worden. In Kooperation mit der Gruppe um M. Holthausen ist es hier gelungen, das SiCl2-Amin-Addukt 57 als entscheidende Zwischenstufe zu identifizieren (1H29Si-HMBC-NMR-Experiment sowie DFT-Rechnungen). Si(SiCl3)4, die thermodynamische Senke des Systems, entsteht durch anschließende Insertion des Dichlorsilylens in Si−Cl-Bindungen – bevorzugt am höchst substituierten Si-Zentrum (es bilden sich keine linearen bzw. weniger verzweigten Oligosilane). Zudem lässt sich das koordinierte Amin vom SiCl2-Addukt wieder abspalten, was die Si(SiCl3)4-Synthese überhaupt erst ermöglicht. Dieses Verhalten unterscheidet sich grundlegend vom jenen literaturbekannter stabilisierter Chlorsilylene: hier bindet der Donor so stark an das Si-Atom, dass er den ambiphilen Charakter des Silylens zugunsten der Lewis-basischen Funktion einschränkt. Daher kann man mit diesen Addukten auch keine Oligosilane aufbauen, die mittlerweile auch das Interesse der chemischen Industrie erweckt haben...
Die Transkription ist ein entscheidender Schritt in der Transition der genetischen Information, welche durch die DNA codiert und im Genom hinterlegt ist, zu dreidimensionalen Funktionseinheiten in der Zelle, den Proteinen. Während der Transkription wird die Information von der Ebene der DNA in RNA umgewandelt, welche in der Zelle zusätzlich zu dessen Rolle als Informationsmediator in Form der mRNA eine Vielzahl von Funktionen ausübt. Die Transkription benötigt in Hinblick auf ihre essentielle Rolle in der Errichtung des Proteoms und der notwendigen Adaption von Genexpressionsprogrammen an externe zelluläre Stimuli, den Zellzyklus etc. eine präzise und gleichzeitig flexible Regulation. Besonders für die Transkription von mRNA dient die eukaryotische RNA-Polymerase II (RNAP II) in diesem Prozess als eine zentrale Einheit, die einer Vielzahl regulativer Mechanismen wie post-translationaler Modifikationen und der Assemblierung dynamischer Proteinkomplexe unterliegt. Während Komponenten dieser Regulation wie die Zusammensetzung und Dynamik des Prä-Initiationskomplex bereits seit Jahrzehnten beschrieben sind, ist eine besondere Form der RNAP II-abhängigen Regulation erst in den letzten Jahren Gegenstand genauerer Untersuchungen geworden. So erfährt die RNAP II bei einer Vielzahl von Genen unmittelbar nach der Initiation einen Arrest, der das Enzym nicht weiter über die DNA prozessieren lässt und somit die produktive Elongation des Gens blockiert. Die Aufhebung dieser Blockade wird durch den positiven Transkriptions-elongationsfaktor b (P-TEFb) dominiert, der durch distinkte post-translationale Modifikationen der C-terminalen Domäne der RNAP II und assoziierter Faktoren die produktive Elongation ermöglicht. P-TEFb selbst unterliegt dabei einer strengen Regulation durch eine inaktivierende Assoziation mit Speicherkomplexen. P-TEFb wurde abseits dieser Komplexe in einer Vielzahl von Elongations-assoziierten Proteinkomplexen identifiziert, der Mechanismus der Transition aus dem inaktiven Speicherkomplex zur aktiven Form an der RNAP II war jedoch unbekannt.
Ein zentrales Element aller aktiven Komplexe ist die Anwesenheit von Proteinen der AF4/FMR2-Familie, darunter das AF4 Protein. Bemerkenswerterweise war die genaue Rolle dieses Proteins in den Komplexen bisher unbekannt oder wurde lediglich auf die strukturelle Integrität der Komplexe beschränkt. AF4 und speziell dessen N-Terminus ist über diese Rolle hinaus als Bestandteil des Fusionsproteins AF4-MLL eng mit der onkogenen Zelltransformation im Falle einer durch die t(4;11)(q21;q23) chromosomalen Translokation bedingter, akuter lymphoblastischer Leukämie assoziiert.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das AF4 Protein und im Speziellen sein N-Terminus in der Lage ist, die zelluläre Transkription durch die Aktivierung und Rekrutierung von P-TEFb zu aktivieren. In Anwesenheit von AF4 wird die Kinase-Untereinheit CDK9 des P-TEFb post-translational an Lysinresten modifiziert und damit aktiviert sowie die C-terminale Domäne der RNAP II im Kontext stärker phosphoryliert. Gleichzeitig wurde das P-TEFb inaktivierende Protein HEXIM1 stärker exprimiert. AF4 und AF4-MLL waren weiterhin in der Lage ein Elongations-kontrolliertes Reportergen zu aktivieren. Gleichzeitig führte die Überexpression des AF4 zu einer Erhöhung der zellulären RNA Menge. Zur genaueren Untersuchung der AF4-abhängigen Mechanismen wurden zwei Zelllinien erstellt, die zum Einen eine induzierbare und reproduzierbare Überexpression und Reinigung des AF4 erlaubten (TCZP-AF4ST) und zum Anderen durch lentiviralen knock-down eine an AF4-Mangelsituation nachstellten (AF4kd V100). Es konnte so gezeigt werden, dass AF4 über P-TEFb hinaus eine regulative Funktion gegenüber Transkription-assoziierten Faktoren wie CDK7, MENIN und NF?B besitzt und dass diese Faktoren vorrangig, analog zu P-TEFb, mit dem N-Terminus des AF4 interagieren. Die Überexpression von AF4 führte über die Bindung an die 7SK snRNA und deren Degradation zur Rekrutierung des P-TEFb aus den Speicherkomplexen in distinkte AF4-assoziierte Komplexe und zu einer Umverteilung des Faktors auf distinkte Loci im Zellkern, wobei der AF4 N-Terminus für sich alleine jedoch nicht in der Lage war, diese Funktion auszuüben. Im Falle eines Mangels an AF4 kam es zur Wachstumsretardierung der Zellen sowie zu einem völligen Aktivitätsverlust in Reportergenversuchen.
Die Tatsache, dass AF4 ein zentrales Element in der Elongationskontrolle darstellt führte zu der weitergehenden Vermutung, dass virale immediate early (IE) Proteine zur Kontrolle viraler Genexpression auf der Ebene der Elongation ebenfalls auf dieses Wirtsprotein zugreifen können. Es konnte vor diesem Hintergrund gezeigt werden, dass AF4 tatsächlich mit den IE-Proteinen IE1 (HCMV) und Zta (EBV) aus der Familie der Herpesviren interagiert und durch die Stabilisierung des AF4 Proteins eine kooperative, transaktivierende Funktion auf ein ALOX5 Reportergen ausgeübt wurde. Es wurde gezeigt, dass die viralen IE-Proteine dabei Komponenten der AF4 Komplexe sind und in der Zelle zur epigenetischen Regulation des ALOX5 Gens führen. Weiterhin konnte in diesen Experimenten dargestellt werden, dass AF4 über seine Rolle in der Elongationskontrolle hinaus auch distinkte Effekte in der Aktivierung von Promotoren und damit in der Initiation der Transkription zeigt. Damit konnte in dieser Arbeit zum ersten Mal die essentielle Rolle des AF4 Proteins in der Elongationskontrolle und der Initiation der Transkription als auch in der Infektion durch Herpesviren gezeigt werden.
In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass bestimmte neuronale microRNAs im Rückenmark und in den Spinalganglien konstitutiv exprimiert und nach peripherer Entzündung mit Formalin oder Zymosan differenziell reguliert werden. Bei der SNI-induzierten Neuropathie konnte indessen keine signifikante Regulation der untersuchten microRNAs nachgewiesen werden. Aufgrund der Lokalisation in den Neuronen der Schmerz-verarbeitenden Laminae I und II des Dorsalhorns des Rückenmarks und angesichts der Regulation in entzündlich stimulierten Neuronen und Mikroglia wurde der Fokus der Arbeit auf die Untersuchung von microRNA-124a gelegt. Anhand von Expressionsanalysen konnte gezeigt werden, dass eine periphere entzündliche Stimulation mit Formalin oder Zymosan microRNA-124a im Rückenmark inhibiert, die Expression pro-inflammatorischer und pro-nozizeptiver Gene hiernach ermöglicht und ein vermehrtes Schmerzverhalten bewirkt. Die funktionelle Relevanz von microRNA-124a wurde in vivo mittels intravenöser Applikation von microRNA-124a-Modulatoren bei einem Modell für entzündliche Schmerzen, dem Formalin-Modell untersucht. Dabei führte die Hemmung von microRNA-124a zu einem verstärkten Schmerzverhalten, welches mit einer Hochregulation verschiedener Entzündungsmarker einherging. Die Überexpression von microRNA-124a dagegen antagonisierte die Hochregulation entzündlicher Mediatoren und führte zu einer Schmerzhemmung. Darüber hinaus konnte in der vorliegenden Arbeit der antinozizeptive Effekt von microRNA-124a mit der Regulation der Epigenetik-regulierenden Targets MeCP2, HDAC5 und MYST2 assoziiert werden und u.a. über die Hemmung des neuromodulierenden, pro-inflammatorischen Peptids BDNF verifiziert werden. Die spezielle Darreichung von microRNA-124a könnte demzufolge einen vielversprechenden Ansatz zur Therapie chronisch-entzündlicher Schmerzen liefern. Zukünftig werden weitere Studien notwendig sein um die eindeutige Funktion, die individuelle Wirkung sowie die therapeutische Relevanz von microRNA-124a zu analysieren. Darüber hinaus müssten Dosis-Wirkungs-Beziehungen und Nebenwirkungsprofile für microRNA-124a erstellt werden, um potenzielle Risiken, Chancen und Vorteile der microRNA-Modulation hinsichtlich einer humanen Schmerztherapie bewerten zu können.
Die Funktion der äußeren Haarsinneszellen geht weit über die normale Rezeptoreigenschaft der Kategorie Mechanorezeptor hinaus. Äußere Haarzellen mit ihrer reichhaltigen efferenten Innervierung sind nicht nur für die sensorische Aufnahme mechanischer Bewegung zuständig, sondern ermöglichen aufgrund ihrer motorischen Funktionen die mechanische Verstärkung der Wanderwelle in der Cochlea. Äußere Haarzellen sind eine maßgebliche Komponente des ´cochleären Verstärkers` und ihr Ausfall führt zur Schwerhörigkeit. Beiprodukte des cochleä-ren Verstärkers sind otoakustische Emissionen, deren Messung Aufschluss über aktive mechanische Prozesse im Innenohr gibt.
Die äußeren Haarsinneszellen bilden Synapsen mit dem olivo-cochleären efferenten System, welches im Zentrum der vorliegenden Untersuchung steht. Es vermittelt den Einfluss des Zentralnervensystems auf das Corti-Organ des Innenohrs. Über die akustische Reizung des olivo-cochleären Reflexbogens ist man in der Lage, das efferente System zu aktivieren und gleichzeitig die Antworteigenschaften der Cochlea zu verändern. Efferente Modulationen des cochleären Verstärkers können sich z. B. in einer Veränderung des Emissionspegels bemerk-bar machen. Die Fledermausspezies Carollia perspicillata ist aufgrund ihres Echoortungs-systems mit einem sehr sensitiven und hochauflösenden Hörvermögen ausgestattet und eignet sich hervorragend als Modelltier in der Hörforschung, insbesondere auch deshalb, da oto-akustische Emissionen sehr gut messbar sind.
Das efferente System von C. perspicillata wurde in dieser Untersuchung durch akustische Stimulation der kontralateralen Cochlea angeregt. Die Stimuli, die nicht nur in ihrem Pegel sondern auch in ihrer Bandbreite und in der Mittelfrequenz in Relation zu den ipsilateralen Stimulusfrequenzen variierten, beeinflussten dabei die Generierung der otoakustischen Emis-sionen (DPOAE, engl: distortion product otoacoustic emissions) im ipsilateralen Ohr: akustische Stimulation der kontralateralen Cochlea bewirkte zuverlässig eine Änderung der DPOAE- Amplitude im kontralateralen Ohr. Vor allem eine Suppression des cochleären Verstärkers in Form von DPOAE-Pegelverminderungen wurde beobachtet. Die supprimieren-den Effekte erreichten trotz leiser bis moderater kontralateraler Rauschpegel (bis maximal 54 dB SPL) Werte von bis zu 14, 17.1 und 13.9 dB SPL (bei f2 = 20, 40 und 60 kHz und effek-tivstem kontralateralen Rauschstimulus) und waren damit deutlich größer als in vorangegang-enen Studien an anderen Spezies. Die DPOAE-Pegelverminderungen waren positiv mit dem x Pegel der kontralateralen akustischen Stimulation, ebenso wie seiner Bandbreite und der Mittelfrequenzen in Relation zu den ipsilateralen Stimulusfrequenzen korreliert. Es gab keinen absoluten Frequenzbereich, in dem die efferenten Effekte am größten gewesen wären. Vielmehr traten maximale Effekte immer durch etwas oberhalb der ipsilateralen Stimulusfre-quenzen gelegene kontralaterale Rauschstimuli auf. Die Effekte waren auch abhängig von der Bandbreite des kontralateralen Rauschstimulus und maximal bei einer relativen Bandbreite von 1.5 Oktaven. Die Verschiebung des efferenten Effekts hin zu hohen Frequenzen und die Bandbreitenabhängigkeit sind vereinbar mit den anatomischen Eigenschaften der Projektio-nen der medialen olivo-cochleären Efferenzen in der Säugetiercochlea. Kontralaterale akusti-sche Reizung bewirkte auch eine Verschiebung der Wachstumsfunktionen der 2f1-f2 -DPOAE in einen unsensitiven Bereich und außerdem eine Verformung der Wachstumsfunktion. Bei-des könnte durch Beeinträchtigung des cochleären Verstärkers verursacht sein. Eine Beteili-gung des Mittelohrmuskels an den Effekten kann nahezu ausgeschlossen werden und die beobachteten Effekte sind höchstwahrscheinlich dem olivo-cochleären System zuzuschreiben.
Funktionell ist denkbar, dass bei C. perspicillata das mediale olivo-cochleäre System im Kontext einer Frequenzverschärfung bei der cochleären Verstärkung der Basilarmembranbe-wegung aktiv wird. Aus diesem Grund wurden ipsilateral sogenannte DPOAE-Suppressions- Abstimmkurven gemessen, welche die mechanische Abstimmschärfe im Innenohr beschrei-ben. Während und nach kontralateraler Reizung kam es zu Veränderungen der Abstimmkur-ven. Signifikante Effekte konnten allerdings nicht festgestellt werden, da die Veränderungen der Suppressions-Abstimmkurven variabel und schlecht kategorisierbar war.
Die vorliegenden Ergebnisse unterstützen weit verbreitete Hypothesen zur Funktion der medialen olivo-cochleären Effernzen in Bezug auf mechanische Suppression, Verbesserung des cochleären Signal-Rauschverhältnisses und einer generellen frequenzspezifischen Wirkung.
Autophagie ist ein evolutionär stark konservierter Degradationsmechanismus für geschädigte Proteine bis hin zu ganzen Organellen eukaryotischer Zellen. Dabei umhüllt eine Doppelmembran, bisher unbekannten Ursprungs, das zu degradierende Material und bildet das Autophagosom. Dies fusioniert später mit Lysosomen, wodurch dessen Inhalt proteolytisch zersetzt und die Bestandteile der Zelle wieder zur Verfügung gestellt werden kann.
In dieser Abeit wurde der Fokus auf den mitochondrialen Abbau über Autophagie (Mitophagie) und dessen Funktion als ein mitochondrialer Qualitätsmechanismus gesetzt. Als Zellmodell wurden primäre humane Endothelzellen der Nabelschnurvene (HUVEC) verwendet. Diese zeichenen sich durch einen Übergang von einer mitotischen, jungen in eine lange postmitotische, seneszente Phase während der Kultiverungszeit aus. Dabei durchlaufen sie einer zelluläre und mitochondriale Morphologieänderung. , wodurch sich die Möglichkeit bot , die Autophagie unter verschiedenen Parametern zu betrachten.
So wird generell eine Abnahme des autophagosomalen / lysosomalen Weges mit dem Alter beschrieben und die Abhängigkeit der Mitophagie von der mitochondrialen Länge.
Mitophagie ist unter normalen Kultivierungsbedingungen ein mikroskopisch selten zu beobachtender Vorgang. Daher wurde ein mitochondriales Schädigungsystem etabliert, welches die photosensibiliesierende Wirkung des Farbstoffs MitoTracker Red Cmx Ros (MTR) nutzt, um Mitochondrien gezielt oxidativ zu schädigen und die Mitophagie zu aktivieren.
Mitotische HUVEC zeigten 2 h – 8 h nach oxidativer Schädigung eine mitochondriale Fragmentierung größtenteils begleitet von einem Verlust des Membranpotentials. Über einen Zeitraum von 72h-120h kam es zur Regeneration des mitochondrialen Netzwerks durch Neusynthese mitochondrialer Biomoleküle. Entgegen der rescue Hypothese konnten oxidativ geschädigte Mitochondrien nicht durch eine Fusion mit funktional intakten Mitochondrien gerettet werden und wurden über den autophagosomalen / lysosomalen Weg abgebaut, gekennzeichnet durch die Ubiquitin-Ligase Parkin vermittelte Markierung und finaler Kolokalisation mit den autophagosomalen und lysosomalen Markerproteinen LC3B und LAMP-2A. Auf mRNA- und Proteinebene zeigte sich in diesem Zeitraum eine erhöhte Expression autophagie-relevanter Gene (ATGs) ATG5, ATG12 und LC3B.
Der Vergleich von mitotischen mit postmitotischen HUVEC nach oxidativer Schädigung wies zwei grundlegende Unterschiede auf.
Zum einem behielten, in Gegensatz zu jungen Zellen, die Mitochondrien alter HUVEC ihre Morphologie und ihr Membranpotential bei. Diese erhöhte Widerstandfähigkeit gegenüber oxidativem Stress konnte auf die erhöhte Expression der mitochondrial lokalisierten Serin / Threonin Kinase PINK1 zurückgeführt werden, ein Schlüsselgen in Parkinson.
Die PINK1-Transkription stand invers zu der Expression der mitochondrialen Teilungsfaktoren Fis1- und Drp1, welche in postmitotischen HUVEC stark vermindert war.
Andererseits wiesen alte Zellen eine verminderte Degradationsfähigkeit geschädigter Mitochondrien auf. Dieser Umstand war durch eine verminderte lysosomale Azidität bedingt. Eine externe ATP-Zugabe förderte die Azidität der Lysosomen alter Zellen und die Fusion mit Autophagosomen, wodurch Mitochondrien und ihre geringere ATP-Produktion im Alter als ein Faktor der Autophagie ermittelt weden konnte.
Die Autophagierate steht in Verbindung mit der Lebensspanne von Zellen bis hin zu ganzen Organismen. Durch die Überexpression autophagie-relevanter GFP-Fusions-Proteine ATG5, ATG12 und LC3B, welche nach oxidativer Schädigung in ihrer Expression verstärkt wurden, förderten die Mitophagie und wurden stabil in junge HUVEC exprimiert. Diese Überexpressionen bewirkten eine verbesserte mitochondriale Qualität, veranschaulicht durch ein erhöhtes Membranpotential und die ATP-Bereitstellung, einer besseren mtDNA Integrität und sie verlängerten die Lebensspanne signifikant, wobei die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezien (ROS), entgegen der von Harman aufgestellten Alterungstheorie, keine Verminderung zeigte. Dennoch wiesen sie einen erhöhten Gehalt oxidativ modifizierter Proteine auf, welche letztendlich auf die erhöhten Autophagosomenanzahl zurückgeführt werden konnte, in denen höchstwahrscheinlich das oxidativ geschädigte Material gelagert wird.
In dieser Arbeit kann gezeigt werden, dass Mitochondrien nach oxidativer Schädigung eine Teilung vollziehen und geschädigte Mitochondrien selektiv über Autophagie abgebaut werden. Dabei fungiert Mitophagie als ein mitochondrialer Qualitätmechanismus und steht unmittelbar mit der Lebensspanne in Verbindung.