Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
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Der suprachiasmatische Nucleus (SCN) des Hypothalamus enthält die zentrale innere Uhr der Säugetiere. Diese innere Uhr besteht aus einem Verbund von untereinander gekoppelten Neuronen, die durch ein intrinsisches molekulares Uhrenwerk eine selbsterhaltende Oszillation mit einer Periode von circa einem Tag (circadian) aufrechterhalten. Diese Oszillation dient dem Organismus als innere Uhr und muss, da ihre Periode nicht exakt 24 Stunden beträgt, durch Zeitgeber mit der Umwelt synchronisiert werden. Der wichtigste circadiane Zeitgeber ist das Licht. Die Lichtsignale gelangen von der Retina über den retinohypothalamischen Trakt (RHT) direkt zum SCN. Von dort werden circadiane Informationen an zentrale und periphere Effektoren weitergeleitet, unter anderem an das Pinealorgan, welches zyklisch das Hormon Melatonin als Dunkelheitssignal ausschüttet. Melatonin kann wiederum auf die circadiane Uhr zurückkoppeln und in einem engen, sensitiven Zeitfenster die Phasen des SCN verschieben. Neben diesem Regelkreis gibt es direkte Verbindungen vom SCN zum lateralen Hypothalamus (LH), der eine zentrale Rolle bei der Regulation des Schlafes und der Energiehomöostase innehat. Ein spezieller Neuronentyp des LH schüttet das Neuropeptid Orexin aus, das große Bedeutung bei der Schlafregulation und der Appetitbildung besitzt. Diese orexinergen Neurone projizieren in weite Teile des Gehirns, unter anderem in die Region des SCN, was aufgrund der bekannten Wechselbeziehungen zwischen circadianer Aktivität, Schlaf und Appetit auf eine Rückkoppelung auf das circadiane System schließen lässt. In der vorliegenden Arbeit wurden mit Hilfe von Multielektroden-Ableitungen (MEAs) die neuronalen Signale einzelner Zellen des SCN, die zusammen ein komplexes Netz für die Steuerung der Effektormechanismen bilden, analysiert. Es standen dabei folgende Fragestellungen im Vordergrund: Bieten primäre Zellkulturen von SCN-Neuronen ein ausreichendes Modell für die Untersuchung der zellulären Kommunikation und der neuronalen Ausgangssignale der circadianen Uhr? Wirken Zeitgebersignale direkt auf die primären Oszillatoren oder sind Phasenverschiebungen eine Eigenschaft des gesamten Netzwerkes im SCN? Besteht ein Einfluss der orexinergen Neurone des lateralen Hypothalamus auf die Uhren-Neurone im SCN? Auf Multielektrodenplatten kultivierte SCN Neurone sind spontanaktiv und zeigen über Tage und Wochen ausgeprägte circadiane Rhythmen in ihrer Spikerate. In der Regel sind diese Aktivitäts-Rhythmen einzelner Neurone nicht synchronisiert, obwohl die Zellkulturen zahlreiche synaptische Verbindungen und korrelierte Aktivität aufweisen Um die Interaktion der verschiedenen Neuronen innerhalb des Uhrennetzwerkes aufzuklären, wurde eine Methode basierend auf Kreuzkorrelationen entwickelt. Mit dieser Methode konnte gezeigt werden, dass korrelierte Aktivität in SCN-Zellkulturen verbreitet ist, die stabilen Oszillatoren davon jedoch immer ausgenommen waren, obwohl eine durchgehende Vernetzung innerhalb der Kulturen bestand. Somit bilden Zellkulturen von SCN Neuronen ein sehr heterogenes Netzwerk mit stabilen Oszillatoren, schwachen Oszillatoren und nicht rhythmischen Neuronen, das viele einzelne Uhren elastisch miteinander koppelt und mit verarbeiteten Informationen über äußere und innere Zustände versorgt. Stabile Oszillatoren können direkt durch Zeitgeber-Stimuli, wie zum Beispiel Melatonin, beeinflusst und in ihren Aktivitäts-Phasen verschoben werden. Die Phasen-Antwortkurven sind im Vergleich zu in vivo Untersuchungen jedoch variabler, was für eine starke Beteiligung des neuronalen Netzwerkes bei der Verarbeitung und Stabilisierung der Antworten auf die Zeitgeber-Stimuli spricht. Phasenverschiebungen als Reaktion auf einen Zeitgeber-Stimulus sind demnach eine Eigenschaft der einzelnen Oszillatorzelle, die aber durch die Interaktion der verschiedenen Uhren-Neurone in ein stabiles Ausgangssignal umgesetzt werden müssen. Kultivierte SCN-Neurone reagieren auf Applikation von Orexin A mit kurzzeitigen Änderungen der Spikerate, sowie mit deutlichen Phasenverschiebungen, die in Zellkulturen sehr variabel ausfallen, während sie in Ableitungen von organotypischen Hirnschnitten stabil und reproduzierbar sind. Dies unterstreicht wiederum die Bedeutung des neuronalen Netzwerkes im SCN. Orexin A scheint zwar direkt auf stabile Oszillatorzellen einzuwirken, aber auch auf die synaptische Übertragung zwischen den SCN-Neuronen. Sein Wirkungsmechanismus könnte dabei in einer Hemmung der GABAergen und in einer Verstärkung der glutamatergen synaptischen Übertragung liegen. Die Wirkung von Orexin A im SCN spricht für eine vielfältige Rückkoppelung des orexinergen Systems auf den circadianen Schrittmacher.
Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen führten zu folgenden Ergebnissen: 1. Eindimensionale Gelelektrophoresen Die Analyse mitochondrialer Proteine aus juvenilen und seneszenten P. anserina-Wildstämmen mit Hilfe von eindimensionalen SDS- und eindimensionalen Blau-Nativen-Gelelektrophoresen zeigt keine deutlichen, seneszenzspezifischen Unterschiede. Im Gegensatz dazu werden in initialen Versuchen der nicht-radioaktiven 2D-PAGE differentiell gebildete Proteine visualisiert. 2. 2D-PAGE mit radioaktiv-markierten, mitochondrialen Proteinen aus jungen und alten P. anserina-Wildstämmen In der ungerichteten Proteomanalyse wurden 29 differentiell-gebildete Proteine identifiziert und zusätzlich zahlreiche Isoformen einiger Proteine gezeigt. Von der ß-ATPase wurden modifizierte Isoformen gefunden. Außerdem wurde eine seneszenspezifisch verringerte Bildung von ROS-Abwehr-Proteinen in den Mitochondrien detektiert. Im Gegensatz dazu wurde eine größere Menge eines Chaperons gefunden, das bei der Proteinsynthese eine Rolle spielt: eine Protein-Disulfid-Isomerase, die die Umlagerung und Neubildung von Di-Sulfid-Brücken bei der Faltung von Proteinen katalysiert. Zusätzlich wurde eine erhöhte Menge des Proteins SSC1 identifiziert. Dieses gehört zur Hsp70-Hitzeschock-Proteinfamilie. Es wurde ebenfalls eine erhöhte Menge des Apoptosefaktors Cyclophilin D in den mitochondrialen Proben aus den seneszenten Wildstämmen identifiziert. Die Identifizierung dieses Proteins in Mitochondrien von P. anserina stellt neben der Charakterisierung der Metacaspasen (Hamann et al., 2007) einen weiteren Ansatzpunkt für die Apoptoseforschung in P. anserina dar. Die molekularbiologische Analyse dieses Proteins wurde aufgrund dieser Proteomanalyse im Arbeitskreis aufgenommen (Dissertation D. Brust). Ein weiteres Protein, das in stark erhöhter Menge in den Proteinisolaten identifiziert wurde, ist PaMTH1. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die Struktur und die Funktion dieser neu identifizierten differentiell-gebildeten Methyltransferase während der Alterung in P. anserina mit Hilfe molekularbiologischer, biochemischer und physiologischen Analysen untersucht. 3. Charakterisierung von PaMTH1 Im Rahmen von Northernblot-Analysen wurde gezeigt, dass die PaMth1-Transkriptmenge in drei unabhängigen alten Wildstämmen im Vergleich zu den entsprechenden jungen Wildtsämmen deutlich erhöht ist. In einer Westernblot-Analyse von Gesamtproteinen und Mitochondrien aus jungen und seneszenten Wildstämmen wird der seneszenzspezifische Anstieg der Proteinmenge verifiziert. Die genauere Einordnung von PaMTH1 in die Klasse I der Methyltransferasen und die Ergebnisse der Analyse der Substratspezifizität geben einen Hinweis auf eine Schutzfunktion durch die Verhinderung einer ROS-Entstehung unter der Beteiligung von Substanzen mit einer Catecholgruppe. Die Ergebnisse der Analyse der Modulation der PaMth1-Expression in P. anserina deuten ebenfalls auf eine Schutzwirkung von PaMTH1 hin: PaMth1-Überexpressionsstämme zeigen eine verbesserte Wuchsrate auf stress-induzierenden Medien, weniger carbonylierte Proteine und vor allem eine verlängerte Lebensspanne ohne physiologische Nachteile im Vergleich zum Wildstamm. Dagegen lebt die PaMth1-Deletionsmutante kürzer und wächst schlechter auf ROS-induzierenden Medien, sie zeigt allerdings keine erhöhte Menge von carbonylierten Proteinen im eindimensionalen „Oxyblot“. Die beobachtete Lebensspannenverkürzung der PaMth1-Deletionsmutante wird jedoch durch die Reversion dieser Stämme wieder aufgehoben, sodass die Hypothese des Schutzes vor der ROS-Generierung durch die Methylierung von Dihydroxylgruppen anhand der erhaltenen Daten unterstützt wird.
Die mechanische Streckung hat einen großen Einfluss auf Keratinozyten und bei der Transduktion dieses Reizes nehmen ßl-integrine, E-Cadherine und EGF-Rezeptoren eine zentrale Rolle ein: Eine einfache mechanische Dehnung von HaCaT-Zellen um 10% fuhrt innerhalb von 5min zu einer schnellen Umorientierung der ßl-Integrine auf der Zellmembran, ohne dass sich dabei die Menge dieser Oberflächenrezeptoren ändert. Die Integrine sammeln sich in der basalen Membran zu größeren Adhäsionskomplexen. Dies hat Auswirkungen auf das Adhäsionsverhalten der Zellen. Eine Streckung bewirkt, dass die mechanisch stimulierten Zellen gegenüber den Kontrollzellen sowohl schneller an das Substrat anheften als auch eine stärkere Zell-Matrix-Adhäsion aufweisen. Das unterschiedliche Adhäsionsverhalten auf den verschiedenen Substraten (Arginin+Serum, Fibronektin, Kollagen) und Experimente mit funktionsblockierenden Antikörpern gegen ßl-Integrine sind Beweise für die Beteiligung dieser Oberflächenrezeptoren an diesem Vorgang. Da adhärente Zellen, wie Keratinozyten. neben Wachstumsfaktoren den Zell-Matrix-Kontakt benötigen, um in die S-Phase eintreten zu können, hat das unterschiedliche Adhäsionsverhalten von gestreckten und ungestreckten Zellen wiederum Einfluss auf die Proliferation. Diese ist bei den mechanisch gereizten Zellen im Vergleich zu den Kontrollzellen gesteigert und zwar im direkten Verhältnis zu der mechanisch induzierten Steigerung der Adhäsion. Im Rahmen einer Rezeptor-Transaktivierung (siehe vorne) kooperieren ßl-Integrine und E- Cadherine sowohl räumlich als auch funktionell mit dem EGF-Rezeptor bei der Übermittlung des Dehnungsreizes: Räumliche Interaktionen: Eine Koclusterung von ßl-Integrinen mit dem EGF-Rezeptor tritt bereits nach 5minütiger mechanischer Reizung an den Zell-Zell-Grenzen und den Fokalkontakten auf. Eine Kolokalisation zwischen E-Cadherinen und EGF-Rezeptoren besteht ebenfalls, wobei sich allerdings Kontrolle und Streckung nicht unterscheiden. Funktionelle Interaktionen: Eine mechanische Stimulation führt zu einer transienten Aktivierung des EGF-Rezeptors (Aktivitätsmaximum: 5min) und der MAP-Kinase ERK1/2 (Aktivitätsmaximum: 15min). Diese streckungsinduzierte Aktivierung von ERK1/2 wird sowohl durch die Blockierung der ßl-Integrine und E-Cadherine als auch durch die Inhibition des EGF-Rezeptors unterbunden. Weiterhin hemmt die Blockierung der Adhäsionsmoleküle die Aktivierung des EGF-Rezeptors. Dies spricht für die Transaktivierungs-Theorie des EGF- Rezeptors durch die ß1-Integrine und E-Cadherine. Die Zellstrukturen und viele zelluläre Prozesse werden durch eine zellintern erzeugte Grundspannung im Zytoskelett aufrechterhalten. Ohne eine Verankerung der Zelle an der ECM oder den Nachbarzellen, was durch die Blockierung der ßl-Integrine und E-Cadherine erreicht wird, bricht dieses fein ausbalancierte System zusammen; die Zytoskelett-Elemente F-Aktin, Intermediär-Filamente und Mikrotubuli zerfallen. Anhand der Ergebnisse dieser Arbeit wird ersichtlich, welche enorme Bedeutung den Adhäsionsrezerptoren - ßl-Integrine und E-Cadherine - für die Formstabilität und die funktionellen Eigenschaften der Zelle zukommt. Ein Ausfall dieser Adhäsionsmoleküle beeinträchtigt sowohl die Form der Zelle (Adhäsionsvorgänge und Tensigrity-Modell) als auch die Transduktion von Umweltreizen durch die Plasmamembran, z.B. einer mechanischen Stimulation, die letztendlich das Überleben der Zelle und die Proliferation bestimmt. Daher wäre denkbar, das die Ergebnisse dieser Grundlagenforschung in Zukunft zur Behandlung von Hautkrankheiten herangezogen werden können.
Arten von Aschersonia Mont. (Anamorphe von Hypocrella spp., Clavicipitaceae, Hypocreales, Sordariomycetidae, Askomycota) parasitieren Weiße Fliegen und Schildläuse. Petch (1921) stellte eine Monographie über Hypocrella und Aschersonia vor. Seit dieser Zeit wurden einige Arten neu beschrieben und vereinzelte Artkomplexe revidiert. Die vorgestellte Arbeit ist seit rund 80 Jahren das umfassendste Werk über die Gattung Aschersonia. Hierfür wurden Proben in Kuba, Malaysia, Mexico, Panama, Taiwan und Thailand gesammelt und z.T. kultiviert. Es werden 20 Arten detailliert vorgestellt und illustriert. Die Arten sind: A. acutispora, A. aurantiaca, A. australiensis, A. badia, A. basicystis, A. blumenaviensis, A. caespiticia [A. insperata, syn. nov.], A. columnifera, A. crenulata, A. duplex, A. hypocreoidea [A. goldiana, syn. nov.; A. confluens, syn. nov.], A. marginata, A. oxystoma, A. philippinensis, die Anamorphe von H. rhombispora, A. samoensis, A. taitensis [A. aleyrodis, syn. nov.; A. placenta, syn. nov.; A. tamurai, syn. nov.], die Anamorphe von H. tubulata, A. turbinata [A. coffeae, syn. nov.] und A. viridans. Hierzu wurden auch wichtige Merkmale wie Stromataform und Konidiengröße in situ und in vitro charakterisiert. Mit anderen gültigen Beschreibungen von Arten, die nicht untersucht werden konnten, gibt es 32 Arten. Zum ersten Mal wurden ausführliche Daten über die Wirtsinsekten sowie die Trägerpflanzen berücksichtigt. Erstmals wurde die Verbreitung der Aschersonia-Arten kritisch beleuchtet. Die Funde von A. acutispora, A. basicystis, A. hypocreoidea, A. oxystoma, A. turbinata und A. viridans sind Erstnachweise für Panama. Die Funde von A. australiensis, A. hypocreoidea, A. marginata und A. tubulata sind Erstnachweise für Taiwan. Zum ersten Mal wird für Arten der Gattung Aschersonia ein dichotomer Bestimmungsschlüssel vorgestellt. Es werden drei Hypothesen zur Phylogenie der Aschersonia spp. vorgestellt: 1. Die Stellung der Aschersonia spp. innerhalb der Clavicipitaceae basierend auf Sequenzdaten des LSU-Gens: Aschersonia bildet eine schwach unterstützte Paraphylie, dabei steht A. badia basaler als die übrigen Aschersonia-Arten. 2. Die Beziehung der Aschersonia spp. zueinander: A. badia und eng verwandte Arten parasitieren ausschließlich Weiße Fliegen und stehen basal. Arten einer zweiten Gruppe parasitieren Arten der Aleurodidae und Coccidae und Arten einer dritten Gruppe parasitieren ausschließlich Arten der Coccidae. 3. Eine phylogenetische Hypothese basierend auf Sequenzdaten der ITS: Es gibt noch zu wenig Sequenzen um eine eindeutige Aussage treffen zu können.
Eine überlebenswichtige Eigenschaft von Mensch und Tier ist es, sich bei Gefahr durch eine Schreckreaktion in Sicherheit zu bringen. Doch woran erkennt ein Organismus, in welcher Situation es „sinnvoll“ wäre, sich zu erschrecken und welche Eigenschaften sensorischer Stimuli tragen zu dem Gefahreneindruck bei? Bei plötzlich eintretenden, lauten auditorischen Reizen kann es zur Auslösung der akustischen Schreckreaktion kommen. Dies führt bei Menschen, aber auch bei kleineren Säugetieren zu einer reflexartigen Kontraktion der Nacken-, Gesichts- und Skelettmuskulatur. Die Erforschung der akustisch evozierten Schreckreaktion (ASR) dient dem besseren Verständnis der neurobiologischen Grundlagen sensorischer Verarbeitung. Modulationen der ASR mithilfe von Präpulsen (Präpulsinhibition) ermöglichen Einblicke in die Funktion der Kochlea, des Hörnervs, der Hirnstammstrukturen und anderer beteiligter Gehirnregionen.
In dieser Arbeit wurden kurzzeitige Änderungen von Frequenz oder Intensität des akustischen Hintergrundes als neuartige Präpulse untersucht. Die Bedeutung verschiedener Reizparameter dieser Präpulse wurde in der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal systematisch erforscht. Um zu prüfen, welche Präpulsstimulationen eine Inhibition der ASR auslösen können, wurde eine Reihe von Parametern umfassend getestet. In einem weiteren Schritt wurde analysiert, ob es mithilfe von gezielten Änderungen von Frequenz oder Intensität möglich sein könnte, Unterscheidungsschwellen, oder gar Hörschwellen von Versuchstieren zu bestimmen.
Die Experimente zur Modulation der ASR wurden mit weiblichen Sprague Dawley-Ratten durchgeführt. Dabei wurde eine Vielzahl von Verhaltensparadigmen untersucht. Dazu zählten Präpulse mit unterschiedlichem Frequenzgehalt und variabler Dauer. Zusätzlich wurden neuartige Paradigmen etabliert, um die Fähigkeit zur Frequenz- und Intensitätsdiskriminierung zu untersuchen. Hierbei wurde der Frequenzgehalt oder die Intensität einer kontinuierlichen Hintergrundstimulation verändert, um eine Präpulswirkung zu erzeugen. Um die Möglichkeiten der Bestimmung von Hörschwellen mittels der Präpulsinhibition (PPI) zu ergründen, wurde die Intensität von Präpulsen systematisch verändert. Die so generierten Schwellenwerte wurden durch die Messung früher akustisch evozierter Hirnstammpotenziale verifiziert. Schließlich sollten, unter Zuhilfenahme der Signaldetektionstheorie, aus den erhobenen Daten diverse Schwellen bestimmt werden: Für die Intensitätsänderungen der Präpulse in Stille wurden Hörschwellen bestimmt, während bei Änderungen der Frequenz und Intensität Unterscheidungsschwellen bestimmt werden sollten.
Mit steigender Größe eines Frequenzsprungs in einer kontinuierlichen Hintergrundstimulation war eine stärkere Inhibition der ASR feststellbar; ein Effekt, der stark von der Hintergrundfrequenz abhängig war. Bei einer Stimulation mit 8 kHz konnten signifikant höhere Inhibitionswerte erzielt werden als mit 16 kHz. Bei der Untersuchung des Zeitablaufs der Stimulation ergab sich, dass eine abgesetzte Stimulation mit einer Abweichung von 80 ms Dauer bis 50 ms vor dem Schreckreiz für die höchsten Inhibitionen sorgte.
Die durch eine Intensitätsänderung einer kontinuierlichen Hintergrundstimulation ausgelöste PPI hing primär von der Größe und Richtung des Intensitätssprungs ab. Mit zunehmender Sprunggröße stiegen die Inhibitionswerte an. Eine Erhöhung der Hintergrundintensität um 10 dB hatte einen signifikanten Einfluss auf die Inhibitionswerte. Auch hier zeigte sich eine höhere Sensitivität in Form von höheren Inhibitionen für Stimuli mit einer Hintergrundfrequenz von 8 kHz als für alle anderen getesteten Hintergrundfrequenzen.
Die Bestimmung von Hörschwellen mittels intensitätsabhängiger PPI wies im Vergleich mit den elektrophysiologisch bestimmten Hörschwellen ein heterogenes Bild mit starken individuellen Schwankungen auf: Bei etwa der Hälfte der Tiere waren die Hörschwellen beider Messungen sehr vergleichbar, bei den übrigen Tieren konnten mittels PPI für eine oder mehrere Frequenzen keine aussagekräftigen Hörschwellen erzielt werden. Die elektrophysiologisch bestimmten Hörschwellen waren am sensitivsten, während PPI-Stimulationen signifikant höher waren. Außerdem bewirkten PPI-Stimulationen mit Reintönen signifikant sensitivere Hörschwellen im Vergleich zu einem Schmalbandrauschen.
Für die Bestimmung der Unterscheidungsschwellen von Frequenzänderungen konnte beobachtet werden, dass die Tiere auf Frequenzsprünge hin zu niedrigeren Frequenzen signifikant sensibler reagierten, als hin zu Aufwärtssprüngen (-1.2 bzw. +4.5%). Bei der Intensitätsunterscheidung hingegen konnte beobachtet werden, dass die Tiere signifikant sensitiver auf Intensitätserhöhungen als auf Erniedrigungen reagierten (-5.9 bzw. +2.7 dB).
Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit festgestellt werden, dass die PPI zur Bestimmung von absoluten Hörschwellen starken Schwankungen unterlag, sodass diese Methode nur eingeschränkt als Alternative zu operanter Konditionierung oder elektrophysiologischen Ableitungen in Frage kommt. Des Weiteren erzeugten bereits kleine Änderungen des Frequenzgehalts oder der Intensität einer Hintergrundstimulation eine robuste PPI. Somit können reflexbasierte Messungen mit überschwelligen Stimuli genutzt werden, um Unterscheidungsschwellen in Versuchstieren zu bestimmen. Diese Herangehensweise stellt also eine vielversprechende Methode dar, um Hörstörungen zu untersuchen, die nach einem Schalltrauma auftreten können. In einem nächsten Schritt könnte sie zur weiteren Charakterisierung von verstecktem Hörverlust beitragen.
Modellierung der klimatischen Habitateignung verschiedener krankheitsübertragender Vektorarten
(2018)
Der Klimawandel hat einen starken Einfluss auf die Verbreitungsgebiete von Arten. Infolgedessen kann sich das Verbreitungsgebiet von Arten verschieben, einschränken oder ausweiten. Bei thermophilen Arten wird vermutet, dass sie von den klimatischen Änderungen profitieren und sie sich wahrscheinlich ausbreiten werden. Eine solche Ausbreitung, wozu auch die Einwanderung von gebietsfremden Arten zählt, hätte nicht nur zahlreiche Konsequenzen für diese Ökosysteme, sondern könnte sich auch zu einem ernsten Gesundheitsrisiko entwickeln, wenn es sich bei den einwandernden Neobiota um Vektorarten handelt.
Stechmücken und Sandmücken, als blutsaugende Insekten, zählen zu den bekanntesten Vektorarten. Sie sind in der Lage, eine Vielzahl von Infektionskrankheiten wie das Denguefieber oder das Gelbfieber, aber auch protozoische Parasiten wie "Leishmania"-Arten zu übertragen. Als thermophile Arten sind viele dieser Vektoren aktuell in ihrer Verbreitung weitgehend auf tropische und subtropische Gebiete beschränkt. Eine Einwanderung in gemäßigtere Gebiete kann zu einer Einschleppung der durch sie übertragenden Erreger führen und damit zum Ausbruch von Infektionskrankheiten. Aufgrund der medizinischen Relevanz dieser Arten ist es essentiell, die räumliche Verbreitung, sowie die abiotischen Ansprüche der Vektorarten zu kennen, um deren mögliche Ausbreitung nachzuvollziehen.
Vor diesem Hintergrund beschäftigte sich die vorliegende kumulative Dissertation mit den klimawandelinduzierten Änderungen der Habitateignung verschiedener medizinisch relevanter Vektorarten. Dabei wurden die zwei invasiven Stechmückenarten "Aedes albopictus" (I-III) und "Aedes japonicus" (III), sowie zehn in Europa bereits vorkommende Sandmückenarten der Gattung "Phlebotomus" (IV), untersucht. Die Arbeit basiert auf vier (ISI-) Publikationen. Unter Verwendung ökologischer Nischenmodellierung wurden geeignete Gebiete unter aktuellen und zukünftigen Klimabedingungen bestimmt. Um dabei sowohl räumliche als auch zeitliche Aspekte zu berücksichtigen, wurden mehrere räumliche Skalen (Deutschland und Europa), sowie Zeitperioden (2030, 2050 und 2070) betrachtet. Des Weiteren wurden verschiedene Ansätze (einzelne Algorithmen und Ensemble-Modelle) zur Modellierung der Habitateignung verwendet.
Die Ergebnisse dieser Dissertation zeigen eine zukünftige klimawandelbedingte Ausweitung der geeigneten Gebiete für viele der betrachteten Vektorarten. So konnte gezeigt werden, dass die Habitateignung für "Aedes albopictus" in Deutschland (I) und in Europa (III) zukünftig deutlich zunimmt. Auch für die Sandmückenarten "Phlebotomus alexandri", "Phlebotomus neglectus", "Phlebotomus papatasi", "Phlebotomus perfiliewi" und "Phlebotomus tobbi" konnte eine deutliche Zunahme der klimatisch geeigneten Gebieten projiziert werden (IV).
Lediglich Arten, wie die Asiatische Buschmücke "Aedes japonicus" (III) und auch kältetolerantere Sandmücken, wie "Phlebotomus ariasi" und "Phlebotomus mascittii" (IV) scheinen weniger von diesen klimatischen Veränderungen zu profitieren und könnten in Zukunft sogar aktuell geeignete Gebiete verlieren (klimawandelinduzierte Arealverkleinerung). Bei "Aedes japonicus" konnte dies auf eine engeren Nische mit einem Optimum bei vergleichsweise niedrigen Temperaturen zurückgeführt werden (III).
Am Beispiel von "Aedes albopictus" wurden ferner Umweltfaktoren identifiziert, die die Verbreitung der Art limitieren (II). Als wärmeliebende Art spielen bei "Aedes albopictus" in Mitteleuropa insbesondere die niedrigen Temperaturen eine Rolle, während in Zukunft die Sommertrockenheit in Südeuropa zunehmend eine Rolle spielen könnte.
Nischenmodellierung stellt trotz ihrer vereinfachenden Annahmen und Unsicherheiten, eine hilfreiche Methode zur Untersuchung klimawandelinduzierter Arealverschiebungen dar. Mit Hilfe der Modellierungsergebnisse konnten Gebiete mit einem hohen Etablierungsrisiko für die Vektorarten identifiziert werden, welche daher im Fokus künftiger Überwachungsprogramme stehen sollten. In Zukunft könnten mehr Vektorarten geeignete Bedingungen in Mitteleuropa finden, wodurch die Vektordiversität zunehmen wird. Dadurch könnte auch das Risiko für einen Ausbruch der durch die Vektoren übertragenen Krankheiten steigen.
Auch wenn das Vorhandensein eines kompetenten Vektors eine unerlässliche Voraussetzung für den Ausbruch einer Infektionskrankheit darstellt, gibt es noch weitere Faktoren, wie das Vorhandensein des Erregers. In Bezug auf die Risikoabschätzung vektorassoziierter Krankheiten sollten neben der Verbreitung des Vektors und des Erregers auch die abiotischen Bedingungen für die Entwicklung des Erregers berücksichtigt werden. Neben neu eingewanderten Arten sollten zudem auch die heimischen Arten in Bezug auf ihre Vektorkompetenz untersucht werden, da diese ebenfalls als potentielle Vektoren dienen und somit das Gesundheitsrisiko weiter erhöhen könnten.
Der tägliche und jahreszeitliche Wechsel in den Lichtverhältnissen bedeutet für alle Lebewesen eine regelmäßige und fundamentale Veränderung ihrer Lebensbedingungen. Mit Hilfe einer Inneren Uhr können Lebewesen regelmäßige Veränderungen ihrer Umwelt antizipieren. Diese Innere Uhr gewährleistet die Generierung eines endogenen, zirkadianen Rhythmus und dessen Synchronisation mit der Umwelt. Bei Wirbeltieren werden diese Funktionen durch einen spezifischen neuronalen Schaltkreis im Gehirn, dem photoneuroendokrinen System (PNS), erfüllt. Das Pinealorgan ist ein essenzieller Bestandteil des PNS. Dort werden photoperiodische Reize und Signale vom endogenen Oszillator in die Synthese des Neurohormons Melatonin umgesetzt. Die vom zentralen Oszillator im SCN gesteuerte Freisetzung von Noradrenalin (NA) aus sympathischen-postganglionären Nervenfasern in das Pinealorgan ist der entscheidende Reiz zur nächtlichen Ankurbelung der Melatoninbiosynthese. Melatonin wird ausschließlich in der Nacht gebildet und fungiert daher als ein Zeithormon. Unmittelbar nach der Synthese wird das Melatonin in die Blutbahn abgegeben und liefert allen Zellen, die mit spezifischen Melatoninrezeptoren ausgestattet sind, die entsprechenden Licht- und Zeitinformationen. NA bewirkt in allen untersuchten Säugetierarten die Aktivierung des Schlüsselenzyms der Melatoninbiosynthese, der AANAT. Die zellulären und molekularen Regulationsmechanismen für die AANAT unterscheiden sich jedoch artspezifisch. So ruft NA in Pinealozyten der Ratte die cAMP/PKA/pCREB-vermittelte Aktivierung der Transkription des Aanat Gens hervor, wogegen in Pinealozyten des Rindes NA die Regulation der proteasomalen Proteolyse des AANAT Proteins kontrolliert. Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit war es, zelluläre und molekulare Mechanismen der noradrenergen Signaltransduktionskaskade zu identifizieren, welche für die Steuerung der Melatoninbiosynthese im Pinealorgan von Säugetieren verantwortlich sind. Deshalb wurden in kultivierten Pinealozyten der Ratte und des Rindes sowohl transkriptionale als auch posttranslationale Regulationsmechanismen untersucht, welche durch NA gesteuert und an der Regulation des Schlüsselenzyms der Melatoninbiosynthese, der AANAT, beteiligt sind. Mit Hilfe der Immunzytochemie konnte erstmalig das subzelluläre Verteilungsmuster sämtlicher bekannter regulatorischer (R)-Untereinheiten der PKA Typ I und II in Pinealozyten der Ratte nachgewiesen werden. Ebenso wurden die A Kinase Anker Proteine (AKAP) 95 und 150 immunzytochemisch dargestellt, wobei zwischen der AKAP 150-Immunreaktivität (IR) und der IR von RII alpha bzw. RII beta eine weitgehende Kolokalisation in der Nähe der Zellmembran der Pinealozyten vorlag. Diese Kolokalisationen deuten eine funktionelle Interaktion der PKA Typ II mit AKAP 150 in Pinealozyten der Ratte an. Keine Funktion bei der Steuerung der Melatoninbiosynthese scheinen der cAMPregulierte Austauschfaktor EPAC und die monomere GTPase Rap zu besitzen. So konnte eine Stimulation kultivierter Pinealorgane mit 8-CPT-2'-O-Me-cAMP, einem EPAC-spezifischen cAMP-Analog, einzeln oder in Kombination mit Noradrenalin (NA) weder den AANAT Proteingehalt noch die Freisetzung von Melatonin beeinflussen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit belegen, dass die cAMP-vermittelte Aktivierung der Melatoninbiosynthese ausschließlich auf die PKA zurückzuführen ist. Ebenso beeinflussten weder NA noch 8- CPT-2'-O-Me-cAMP den Aktivitätszustand von ERK 1 und 2. Eine Erhöhung des cAMP-Spiegels in Pinealozyten der Ratte scheint somit keinen Einfluss auf den Aktivitätszustand von ERK 1 und 2 im Pinealorgan der Ratte auszuüben. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die schnelle Dephoshorylierung von pCREB eine entscheidende Funktion bei der akuten Herabregulation des CRE-tragenden Aanat Gens darstellt und somit eine wichtige Rolle für die Beendigung der Melatoninbiosynthese im Pinealorgan der Ratte spielt. Nach Entzug des NA-Stimulus kam es innerhalb von 30 Minuten zu einer fast vollständigen pCREB Dephosphorylierung, die mit einer Abnahme der Aanat mRNA, des AANAT Proteingehalts und der Melatoninbiosynthese einherging. Die pCREB Dephosphorylierung und die Abnahme der Melatoninbiosynthese konnten durch PSP-Inhibitoren verhindert werden. Aufgrund der pharmakologischen Untersuchungen und des intrazellulären Verteilungsmusters scheint die PSP 1 die pCREB Dephosphorylierung im Zellkern der Rattenpinealozyten zu steuern. Mit Hilfe eines Ko-Immunpräzipitationsansatzes wurde erstmalig eine NA-abhängige Komplexbildung von AANAT und Protein 14-3-3 in Pinealozyten der Ratte und des Rindes dargestellt. Die vorliegenden Untersuchungen belegen somit, dass Tierarten, welche generell eine unterschiedliche molekulare Strategie zur Regulation der Melatoninbiosynthese entwickelt haben, mit der NA-abhängigen Ausbildung des AANAT/Protein 14-3-3 Komplexes jedoch einen gemeinsamen Mechanismus zur Regulation des AANAT Proteins besitzen. Ferner wurde die funktionelle Bedeutung des Cannabinoidsystems für die Steuerung der Melatoninbiosynthese im Pinealorgan der Ratte untersucht. Mit Hilfe der Immunhistochemie und des Immunoblotverfahrens konnten erstmalig CB 1- und 2 Rezeptorproteine im Pinealorgan der Ratte dargestellt werden. Die Stimulation kultivierter Pinealorgane der Ratte mit THC hatte keinen Einfluss auf den pCREB- und AANAT Proteingehalt, konnte jedoch die NA-induzierte Aktivierung des AANAT Proteins und die Melatoninfreisetzung hemmen. Das Pinealorgan der Ratte und des Rindes dient als ein gut geeignetes Modellsystem zum Studium von Signalskaskaden, da hier Noradrenalinreize in ein definiertes, einfach messbares Endprodukt, die Biosynthese und Sekretion des Neurohormons Melatonin, umgewandelt werden. Die in dieser Arbeit aufgedeckten Signaltransduktionsprozesse liefern daher nicht nur neue Einblicke in die Regulationsprozesse der Melatoninbiosynthese, sondern dienen ebenso dem besseren Verständnis von Signalübertragungs- und Signalverarbeitungsprozessen in komplexeren neuronalen und neuroendokrinen Systemen.
In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals die Interaktion von A. baumannii mit humanem Plasminogen untersucht. Mit dem Translations-Elongationsfaktor TufAb, dem äußeren Membranprotein OmpW sowie dem Lipoprotein p41 konnten insgesamt drei Plasminogen-bindende Proteine von A. baumannii identifiziert werden. Außerdem wurde ein grundlegender Beitrag zur funktionellen Charakterisierung von TufAb sowie p41 von A. baumannii erbracht.
Es konnte nachgewiesen werden, dass gereinigtes TufAb humanes Plasminogen bindet und diese Interaktion teilweise durch Lysin-Reste vermittelt und von der Ionenstärke beeinflusst ist. An TufAb-gebundenes Plasminogen war für den Plasminogen-Aktivator u-PA zugänglich und konnte zu Plasmin aktiviert werden, welches das chromogene Substrat S-2251, das physiologische Substrat Fibrinogen und die zentrale Komplementkomponente C3b proteolytisch spaltete. Schließlich konnte TufAb als „Moonlighting“-Protein auf der Zelloberfläche von A. baumannii identifiziert werden.
Für das Lipoprotein p41 konnte ebenfalls gezeigt werden, dass dieses an Plasminogen bindet. Die Bindung von Plasminogen an p41 erfolgte ebenfalls über Lysin-Reste, zeigte sich allerdings von der Ionenstärke unbeeinflusst. Im Fall von p41 konnte mit Hilfe von C-terminal verkürzten p41-Konstrukten gezeigt werden, dass C-terminale Lysin-Reste an der Bindung von Plasminogen beteiligt sind. Weitere Versuche mit p41-Proteinen, bei welchen vier C-terminale Lysin-Reste durch Alanin-Reste substituiert wurden, ergaben, dass die beiden Lysin-Reste K368 und K369 essentiell für die Bindung von Plasminogen an p41 sind. Zudem konnte gezeigt werden, dass sowohl Kringle-Domäne 1 als auch Kringle-Domäne 4 von Plasminogen bei der Interaktion mit p41 involviert sind. An p41 gebundenes Plasminogen ließ sich durch u-PA zu Plasmin aktivieren, welches Fibrinogen sowie die zentrale Komplementkomponente C3b degradierte. p41 ist außerdem in der Lage, die Komplementkomponenten C3, C3b und C5 zu binden und den alternativen Weg zu inhibieren. Zudem ergaben Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit erste Hinweise darauf, dass zumindest die Plasminogen-bindende Region auf der Zelloberfläche von A. baumannii lokalisiert ist.
Die Inaktivierung des p41-kodierenden Gens führte zu einer signifikanten Abnahme im Überleben von A. baumannii-Zellen in der Gegenwart von NHS. Zudem zeigte die Mutante Δp41 einen Defekt in der Plasmin-abhängigen Transmigration durch einen Endothelzell-Monolayer. Beide Versuche untermauern die physiologische Relevanz für die Interaktion von A. baumannii mit Plasminogen.
Das humane Genom besteht zu etwa 8% aus retroviralen Sequenzen. Davon sind ca. 1-2% dem humanen endogenen Retrovirus K (HERV-K) zuzuordnen. Das Virus ist mit ca. 30-50 Proviren und ca. 10.000 sLTRs im humanen Genom vertreten. HERV-K besitzt intakte ORFs für alle retroviralen Proteine und zusätzlich ein ORF für das akzessorische Protein Rec. Obwohl eine basale Transkription in verschiedenen Geweben nachgewiesen werden konnte, ist eine Expression von HERV-K Proteinen und Viruspartikeln nur in Keimzelltumoren nachgewiesen worden. In dieser Arbeit wurde die transkriptionelle Regulation des gewebespezifischen Promotors von HERV-K näher charakterisiert. Hierbei wurden regulatorisch wichtige Sequenzen mit Hilfe des Luziferase-Assays eingegrenzt. Transkriptionell sensitive Regionen wurden daraufhin im EMSA auf die Bindung von Transkriptionsfaktoren untersucht. Durch transiente Transfektionen von Luziferasereporterkonstrukten in verschiedenen Zelllinien stellte sich heraus, dass HERV-K LTRs in Keimzelltumorzellen aktiv sind, dass es aber auch inaktive LTRs gibt, die im Zuge der Evolution durch Punktmutationen ihre transkriptionelle Aktivität verloren haben. Aktive und inaktive LTRs unterscheiden sich durch Punktmutationen, die sich in verschiedenen Sequenzabschnitten häufen. Chimäre Konstrukte aus aktiven und inaktiven Sequenzabschnitten und gezielte Mutationen und Deletionen in aktiven HERV-K LTRs enthüllten verschiedene DNA-Bereiche, die transkriptionelle Sensitivität aufweisen. Die LTR-Bereiche bps 572-578, bps 757-798 und bps 809-823 waren im Aktivitäts-Assay besonders empfindlich gegenüber Mutation. In diesen Bereichen liegen zum einen GC/GT-Boxen, also Konsensussequenzen für die Transkriptionsfaktoren Sp1 und Sp3, zum anderen Konsensussequenzen für ein Inr und ein DPE. Das Binden von Sp1 und Sp3 auf den GC/GT-Boxen der bps 757-798 konnte durch eine EMSA-Analyse bewiesen werden. Der transkriptionell sensitive Bereich der bps 572-578 weist eine weitere putative GC/GT-Box auf. Die TATA-Box bei bp 532 zeigte sich unempfindlich gegenüber Mutation. Eine Beteiligung dieser Konsensussequenz am basalen Promotor wurde deshalb ausgeschlossen. Unterstützt durch die Ergebnisse einer 5’-RACE, ein Verfahren, dass den Transkriptionsstart eines bestimmten Gens bestimmen kann, konnte gezeigt werden, dass der basale HERV-K Promotor aus Konsensusequenzen für die Transkriptionsfaktoren Sp1 und Sp3 , einem Inr und einem DPE besteht. Sp1 und Sp3 sind ubiquitäre Transkriptionsfaktoren, die durch ihr Mengenverhältnis in einem bestimmten Gewebe oder durch posttranslationale Modifikationen unterschiedliche Auswirkungen auf die Transkription haben können. Diese Eigenschaften könnten zur Gewebespezifität von HERV-K beitragen. Die Core Promotor Komponenten Inr und DPE sind für die korrekte Positionierung von TFIID und damit der PolII verantwortlich. Des weiteren wurde eine starke Beteiligung des Testis-spezifischen Transkriptionsfaktors SRY an der Transkription von HERV-K belegt. Im Luziferase-Assay konnte ein SRY-Expressionsplasmid die Transkription eines aktiven LTRs in GH- wie auch in HeLa-Zellen steigern. Ein Indiz dafür, dass es sich um einen für die Transkription von HERV-K essentiellen Faktor handelt. Verschiedene SRY-Konsensussequenzen auf der HERV-K LTR machen eine Wirkung in cis wahrscheinlich, doch könnte auch in trans ein für die Transkription wichtiger Transkriptionsfaktor in seiner Expression verstärkt werden. Ebenfalls konnte bewiesen werden, dass epigenetische Mechanismen eine starke Rolle bei der Transkription von HERV-K spielen. Die Methylierung eines LTR-haltigen Luziferase-Reportervektors führte zum fast vollständigen Verlust der transkriptionellen Aktivität. Es bleibt abzuwarten, in welcher Weise die Schlüsselkomponenten Sp1, Sp3, SRY und Hypermethylierung des HERV-K Genoms zur Gewebespezifität von HERV-K beitragen.
Daphnien sind ein wichtiger Bestandteil des Süßwasserzooplanktons und in einer Vielzahl von biologischen Disziplinen als Modellorganismus etabliert. Ihr zyklisch parthenogenetischer Lebenszyklus und die hohen Raten von interspezischer Hybridisierung mancher Artkomplexe machen sie zu einem interessanten Forschungsobjekt. Die vorliegende Arbeit bietet Einblicke in die Populationsstruktur einer dieser Komplexe, des D. longispina-Artkomplexes, und testete ein neu entwickeltes Markersystem bei diesen Tieren auf gesamteuropäischer Ebene (33 Sammelorte, 1155 Individuen). Es wurden dazu molekulare Analysetechniken mit zwölf polymorphen Mikrosatelliten-Markern mit etablierten ITS-RFLP-Analysen verglichen.
Durch statistische Auswertemethoden mit den Programmen NewHybrids und Structure konnten Elternarten gut zugeordnet werden. Die Betrachtung der Kullback-Leibler Divergenzen in den Analysen durch NewHybrids deuten sogar darauf hin, dass die Anzahl der Mikrosatellitenmarker auf wenige besoders informative Loci reduziert werden kann, was bei Fragestellungen zur Art- und Hybrididentifizierung Zeit und Kosten spart. Ein Protokoll zur Vorgehensweise bei der Art- und Hybrididentifizierung wurde entwickelt.
Die Arten und Populationen selbst waren hoch differenziert. Zwischen den drei untersuchten Arten wurde ein FST von 0,29 gefunden. Ergebnisse aus einer AMOVA zeigten sogar, dass die Differenzierung zwischen den Populationen innerhalb der Arten leicht über dieser interspezifischen Differenzierung liegt (D galeata 0,40; D. longispina 0,52 und D. cucullata 0,42). Da auch keine isolation by distance gefunden wurde, lassen die Ergebnisse meiner Analysen auf „Provinzialismus“ schließen – ein Konzept, das genau dieses Muster voraussagt. Erklärt wird dieser Provinzialismus durch die Monopolisierungshypothese. Die Beobachtung, dass in der Regel in den untersuchten Populationen ein Heterozygotendefizit vorliegt, obwohl klonale Vermehrung oft zu einem Heterozygotenüberschuss führt (Meselson-Effekt), zeigt häufig vorkommende sexuelle Vermehrung an. Das Heterozygotendefizit deutet ebenfalls auf einen Wahlund-Effekt hin.
Es wurde weiterhin getestet, ob das Vorkommen von introgressiver, interspezifischer Hybridisierung in bestimmten Lokalitäten im Vergleich mit Lokalitäten, in denen ein Taxon allopatrisch lebt, einen Einfluss auf die Populationsstruktur hat. Die klonale Diversität sowie die beobachtete Heterozygotie standen dabei im Mittelpunkt der Analysen. Es wurde kein statistisch signifikanter Einfluss der Hybridisierung auf die Diversität gefunden.
Eine Reihe kurzer synthetischer Peptide, die auf verschiedenen Ebenen während des mehrstufigen Infektions-Prozesses HIV-1 hemmen konnten, wurden in unserer Gruppe über Phage-Display identifiziert. Diese Peptide hatten allerdings nur geringe Affinitäten zu gp120 und eine kurze Halbwertszeit. In der vorliegenden Arbeit wurden diese und andere HIV-1 „Entry“ hemmende Peptide über gentechnische Methoden in eukaryotischen Zellen exprimiert, um ihre Stabilität und antivirale Aktivität zu verbessern. Durch die angeknüpfte Multimerisierungsdomäne C4bp sind die therapeutischen Peptide groß genug, um von Zellen sekretiert zu werden. Die eukaryotisch sekretierten Multimere sind posttranslational modifiziert, besitzen eine höhere Stabilität und die Anzahl der funktionellen Valenzen ist erhöht. Außerdem bietet das System die Möglichkeit, auch Heteromultimere mit verschiedenen Teilstrukturen in einem Molekül zu kombinieren. Wir konnten zeigen, dass sich das C4bp-System zur Expression des Fusions-Inhibitorischen C46-Peptids in löslicher multimerer Form eignete, welches in monomerer Form nicht vollständig durch ER und den Golgi-Apparat geleitet und sekretiert werden konnte. Außerdem hatte multimeres C46 eine deutlich höhere Plasma-Halbwertszeit und wies eine höhere antivirale Aktivität gegenüber dem monomeren Peptid auf (Dervillez et al. 2006). In dieser Arbeit standen die hoch konservierten CD4i-Epitope von gp120, welche an die HIV Corezeptoren binden, als Target für die HIV-Inhibition im Mittelpunkt. Verschiedene Peptidliganden für diese Epitope, wie die zweite extrazelluläre Schleife und der N-Terminus des CCR5-Rezeptors, die sulfatierte CDR3-Domäne des E51-Antikörpers, sowie durch Phage Display gezielt selektionierte Peptide wurden in den C4bp-Expressionsvektor kloniert und nach Transfektion in 293T-Zellen als lösliche Multimere vom Überstand aufgereinigt und funktionell analysiert. Die Multimere waren sowohl in Protein-Protein-Interaktionsstudien als auch bei in vitro HIV-1 Neutralisationsversuchen funktionell aktiv. In den meisten Hemmversuchen war die HIV-1 Inhibition multimerer Peptide mindestens vergleichbar mit dem Fusionsinhibitor T20. Insbesondere im Hinblick auf eine in vivo Applikation ist zudem die verlängerte Halbwertszeit der Multimere im Plasma von Vorteil, da dadurch möglicherweise die Anzahl der Injektionen verringert werden könnte.
Es wird davon ausgegangen, dass das ehemalige Larven-Mikrohabitat der Asiatische Tigermücke Aedes albopictus (synonym: Stegomyia albopicta) die Phytotelmata in den Waldgebieten von Südostasien darstellte. In den letzten vier Jahrzehnten adaptierte sich die Art jedoch an urbanere Regionen und ihre Antrotelmata. Dank ihrer Eigenschaft, Eier mit einer gewissen Trocken- und Kältetoleranz zu produzieren, verbreitete sich die Art zusammen mit den international gehandelten Waren weltweit. Zudem ist Ae. albopictus ein theoretischer Vektor für mindestens 27 Viren sowie Parasiten und spielt eine Hauptrolle bei der Übertragung von Dengue-Viren und Chikungunya-Viren und Zika-Vieren. Daher wird die Art als große Gefahr für die öffentliche Gesundheit betrachtet.
Die vorliegende Arbeit thematisiert drei Untersuchungen zum Anpassungs- und Etablierungs-potential der invasiven Asiatischen Tigermücke.
In einem ersten Ansatz wurde das Problem behandelt, dass es lediglich zwei standardisierte toxikologische Testverfahren für Culicidae gab. Daher wurde ein Dosis-Wirkungs-Testsystem entwickelt, das den Weg für weitere biologische Endpunkte und ihre integrativen Parameter freimachte und dadurch ein besseres Verständnis für die Wirkweisen von Insektiziden ermöglicht. Hierdurch konnte nun der Frage nachgegangen werden, ob es Unterschiede in der ökotoxikologischen Reaktion zwischen der invasiven tropisch-subtropischen Asiatischen Tigermücke und der einheimischen nördlichen Hausstechmücke Culex pipiens auf das Insektizid λ-Cyhalothrin gibt. Weiter wurde der Einfluss von Temperatur und die Verfügbarkeit von Nahrung auf die Insektizidsensitivitäten der Arten getestet. Schließlich konnte in einer Risikobewertung festgestellt werden, dass bei falsch angewendeten Bekämpfungsmaßnahmen höhere Temperaturen sowie der Ausfall von aquatischen Top-Prädatoren zu Fitnessvorteilen für die Art führen können.
In einer zweiten Untersuchung wurde der Mechanismus der Kältetoleranz der Eier (Kälteakklimatisierung und Diapause) näher untersucht, da dieser für die erfolgreiche Invasion in gemäßigten Breitengraden verantwortlich gemacht wird. Nachdem eine lang vorherrschende Hypothese verworfen wurde, dass die Einlagerung von Polyolen die Frosttoleranz bewirken würde, war der aktuelle Stand der Wissenschaft, dass eine Verdickung der Wachsschicht des Chorions dafür verantwortlich sei. Jedoch lag keine detaillierte Evaluierung von Stechmücken-Eihüllen vor. Mittels einer transmissionselektronenmikroskopischen Studie konnte gezeigt werden, dass nicht nur die Wachsschicht nicht in der Serosa-Cuticula zu verorten ist, sondern im Endochorion und sie zudem im Zuge der Diapause in der Mächtigkeit schrumpft. Daher wird auf Basis der gewonnenen Erkenntnisse auf eine Kompaktierung der Schicht geschlossen.
Die dritte Untersuchung schließlich hatte das hohe Adaptationspotential in gemäßigten Breiten zum Gegenstand. Eine Adaptation auf genetischen Level gilt als unwahrscheinlich, da Gründerpopulationen in den neu besiedelten Gebieten eine niedrige genetische Diversität aufwiesen und ein regelmäßiger Neueintrag von Allelen unwahrscheinlich ist. Jedoch bietet das Konzept der epigenetischen Temperatur-Adaptation einen Erklärungsansatz für dieses Phänomen. Daher wurde die Frage gestellt, ob es möglich ist, eine vererbbare Diversifizierung dieses kältetoleranten Phänotyps nach einer randomisierten epigenetischen Behandlung der DNA zu detektieren. Es wurde eine transgenerationale Untersuchung der Effekte von zwei epigenetischen Agenzien (und einem Lösemittel) auf die Kältetoleranz der Eier durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten ein Korrelationsmuster, das den durch die Agenzien veränderten Methylierungsgrad der DNA mit der Forsttoleranz verband, was die gestellte Hypothese unterstützte.
In Folge dieser drei Untersuchungen wurde festgestellt, dass Ae. albopictus ein hohes Potential hat, in weiteren Ländern – vor allem in gemäßigten Breiten – ein Gesundheitsrisiko darzustellen. Da die Art einerseits Fitnessvorteile durch falsche Bekämpfungsmaßnahmen und andererseits möglicherweise eine hohes epigenetisches Adaptationspotential besitzt, kann zusammenfassend empfohlen werden, dass der Fokus für weitere Forschung maßgeblich auf der Entwicklung von Impfstoffen für die übertragenen Viren und Pathogene liegen sollte. Dadurch kann die Bevölkerung geschützt werden, ohne Ökosysteme und ihre Dienstleistungen zu gefährden, und dies wäre zudem ökonomisch gesehen die effektivere Lösung.
Die Physiologie des Schmerzes umfasst komplexe immunologische, sensorische und inflammatorische Prozesse im Rückenmark, im Gehirn und in der Peripherie. Wiederholte nozizeptive Stimulation induziert pathophysiologische Veränderungen bei der Schmerzweiterleitung, aus denen eine periphere oder zentrale Sensibilisierung resultiert. Diese kann bei dafür anfälligen Patienten zu der Ausbildung von chronischen Schmerzzuständen führen. Obwohl das Wissen über die genauen molekularen Vorgänge der Schmerz-Chronifizierung noch immer unvollständig ist, sind die Identifizierung von Risikofaktoren vernünftige Schritte, um die individuelle Anfälligkeit für die Entwicklung chronischer Schmerzen zu bestimmen. Das Hauptziel dieser Doktorarbeit bestand daher in der Identifikation humaner genetischer Biomarker für chronische Schmerzzustände.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde in den drei für die Weidewirtschaft Westafrikas wichtigsten Naturräumen das Umweltklassifikationssystem von Weidewirtschaft betreibenden und für die Region repräsentativen autochthonen und allochthonen Fulbegruppen erfaßt. Motiv für diese Untersuchung war dabei, im Zuge der derzeit stattfindenden Neubewertung mobiler pastoraler Betriebssysteme das diesen Strategien zugrundeliegende traditionelle Wissen zu dokumentieren und so einen Beitrag zum besseren Verständnis der jahrhundertealten Weidestrategien zu leisten. In den drei Gebieten wurden bei den autochthonen Gruppen jeweils zwischen 70 und 100 Einheiten erhoben, mittels derer die Fulbe die natürliche sowie die anthropogen beeinflußte Umwelt klassifizieren. Für jede Einheit wurde die genaue Beschreibung durch die Fulbe ermittelt. Der Klassifikation liegt ein dichtes Kriteriengefüge zugrunde, dessen Grundkriterien - Relief, Hydrologie, Böden, Vegetation, anthropogene und zoogene Beeinflussung - durch eine große Zahl weiterer Kriterien verfeinert werden. Das hieraus resultierende Gesamtsystem ist ein von allen Mitgliedern der jeweiligen Gemeinschaft geteiltes geoökologisches System, mit dem sich alle für einen Standort relevanten Umweltfaktoren präzise und vollständig beschreiben lassen, und das sämtliche Größenordnungen von Einheiten einbezieht. Gleichzeitig enthält es implizit die für Pastoralisten besonders wichtige Information über den Weidewert einer Einheit. Parallel zum Klassifikationssystem der Fulbe wurde mittels pflanzensoziologischer Aufnahmen die Vegetation der drei Untersuchungsgebiete dokumentiert. Die Aufnahmen wurden in allen traditionellen, von den Fulbe mit Namen bezeichneten Einheiten durchgeführt. Im Sahel wurden 4 Gehölz- und 22 Krautgesellschaften ausgeschieden, im Nordsudan 5 Gehölz- und 12 Krautgesellschaften und im Südsudan 7 Gehölz- und 12 Krautgesellschaften. Die pflanzensoziologischen Aufnahmen ermöglichen eine botanische Referenzierung der Fulbe-Einheiten: Ihnen konnten die jeweils für sie typischen Vegetationseinheiten zugeordnet werden. In zahlreichen Fällen zeigte sich eine hohe Wahrscheinlichkeit, daß einer Fulbe-Einheit eine oder einige wenige Pflanzengesellschaften entsprechen. Eine vollständige Übereinstimmung zwischen Fulbe-Einheiten und pflanzensoziologischen Gesellschaften, d.h., einer Fulbe-Einheit entspricht zu 100 % einer Pflanzengesellschaft und gleichzeitig tritt letztere ausschließlich in dieser Fulbe-Einheit auf, ist aber selten. Im Rahmen der ethnobotanischen Untersuchungen wurde die Bedeutung der Vegetation für die Bevölkerung der drei Regionen untersucht. Es wurden bei allen Fulbegruppen Namen und Nutzungen der angetroffenen Arten erhoben. Der Schwerpunkt lag dabei auf Weidearten, die für die Fulbe als Pastoralisten einen besonders wichtigen Aspekt darstellen, Medizinalpflanzen für human- und tiermedizinische Zwecke sowie sonstigen Verwendungen als Nahrungsmittel, Werkstoffe etc. Bei den Weidearten zeigte sich, daß der Anteil der auf diese Weise genutzten Arten und Pflanzenfamilien im artenarmen Sahel im Vergleich zu den anderen beiden Regionen am höchsten ist. Im artenreichen Südsudan umfaßt die Weidenutzung dagegen die wenigsten Arten. Dieses Ergebnis belegt die Bedeutung breitgefächerter Nutzungsstrategien gerade in Regionen mit prekärer Ressourcensituation. Die Erhebung der traditionellen Heilpflanzen stellt einerseits einen Beitrag zur Bewahrung traditionellen Wissens dar, das in allen drei Regionen durch sich rasch veränderte Lebensumstände bedroht ist. Außerdem hat sie gezeigt, daß eine traditionelle Lebensweise nicht immer den Erhalt dieser Kenntnisse garantiert. Im Rahmen der Arbeiten wurden 896 sicher bestimmte Arten und Unterarten aus insgesamt 104 Familien dokumentiert. Dies ist ein wichtiger Beitrag zur Erfassung der Biodiversität Westafrikas. Auch die Benennung der Arten wurde erhoben und analysiert: Für insgesamt 752 Arten konnte mindestens ein Vernakulärname erhoben werden. Im einzelnen wurden in den verschiedenen Dialekten erfaßt: Jelgoore (Sahel) 210 Vernakulärnamen, Jelgoore (Nordsudan) 259, Nommaare (Nordsudan) 348, Gu-urmaare (Südsudan) 97, Jugureere (Südsudan) 452. Anhand einer Analyse dieser Bezeichnungen sowie der bei den verschiedenen Fulbe-Gruppen gebräuchlichen Bezeichnungen der Umwelteinheiten wurde untersucht, wie bei Migration zwischen verschiedenen Naturräumen sprachlich mit der vorgefundenen neuen Umgebung und ihren Elementen (Landschaftseinheiten, Arten) umgegangen wird. Die Erhebungen zu Umweltwahrnehmung und -kenntnissen der Fulbe ergaben, daß diese die Standortansprüche zahlreicher Arten genau kennen und nach dem Prinzip der Indikatorarten anhand der Vegetation auf den Zustand des Bodens und sonstige Umweltbedingungen rückschließen. Gleichzeitig sind viele in der Umwelt ablaufenden Prozesse genau bekannt. Auch Faktoren, die die Böden von außen beeinflussen und unter deren Einwirkung es zu Degradationserscheinungen kommt, werden genau analysiert. Bezüglich der Degradation der Vegetation werden im Sahel mit Abstand die meisten zurückgehenden Arten genannt, die meisten von ihnen wichtige Nutzarten. Abschließend konnte durch den regionalen Vergleich der Weidepraktiken festgestellt werden, daß Umweltbedingungen und deren Wahrnehmung durch die Fulbe sich weniger als erwartet auf die Weidestrategien auswirken. Sie beeinflussen hauptsächlich Route und Dauer der Tageswanderungen. Ob und wie dagegen Transhumanz (saisonale Weidewanderungen) praktiziert wird, hängt mindestens ebenso sehr von sozialen und ökonomischen Faktoren wie von den ökologischen Bedingungen ab.
In der vorliegenden Arbeit wird die Identifizierung von Genen der Carotinoid Biosynthese (crt) aus den Coryneformen Bakterien Brevibacterium linens und Brevibacterium flavum beschrieben. Hierbei konnten sechs neue crt Gene durch funktionelle Komplementierung bestimmt werden. Außerdem wurde erstmalig die Carotinoid Biosynthese von B. flavum, darunter auch drei neue Carotinoide, beschrieben. Voraussetzung für die Klonierung der crt Gene aus B. linens war die Entwicklung eines geeigneten Komplementierungssystems. Dieses System wurde in Carotinoidmutanten von B. flavum entwickelt. So konnte eine B. linens ExpressionsBibliothek nach Passage durch mehrere E. coliStämme, unter Umgehung des starken B. flavumRestriktionssystems, in B. flavumCarotinoidmutanten auf crt Genexpression hin untersucht werden. . Durch Komplementierung der Carotinoidmutanten von B. flavum konnte das Gen der Phytoen Synthase (crtB) aus B. linens funktionell kloniert werden. Mit diesem Gen als Sonde wurde aus einer B. linensCosmid Bibliothek das gesamte crt Gencluster isoliert. Auf dem sequenzierten DNAFragment von B. linens befanden sich 14 offene Leseraster mit Ähnlichkeiten zu Sequenzen aus Datenbanken. Durch Sequenzähnlichkeiten zu bekannten Genen konnte die Gene einer GGPP Synthase (crtE), einer Phytoen Synthase (crtB) und einer Phytoen Desaturase (crtI) bestimmt werden. Außerdem wurden erstmalig die Gene einer IPP Isomerase und einer DNAPhotolyase in einem crt Gencluster identifiziert. Durch heterologe Expression in B. flavum konnte das neue Gen einer bCarotin Desaturase (crtU) funktionell nachgewiesen werden. Dieses Gen kodiert für ein Enzym, das bCarotin in das aromatische Carotin Isorenieraten umsetzt. Ebenfalls durch heterologe Expression in B. flavum wurden zwei neue Gene (crtYc und crtYd) gefunden, deren Genprodukte gemeinsam die Zyklisierung von Lycopin zu bCarotin katalysieren. Die errechnete Molmasse dieser beiden Lycopin Zyklasen ist mit 12,5 und 13,9 kDa ungewöhnlich klein. Die zwei Lycopin Zyklasegene aus B. linens kodieren für eine neue Klasse von Lycopin Zyklasen. Es bestehen keine Sequenzähnlichkeiten dieser neuen Gene zu bisher bekannten Lycopin Zyklasegenen oder zu anderen Genen bekannter Funktion. Durch die partielle Deletion einer cDNA mit Lycopin Zyklase und Phytoen Synthaseaktivität (crtYB) aus dem Pilz Xanthophyllomyces dendrorhous konnte gezeigt werden, daß die Zentren der beiden Aktivitäten in unterschiedlichen Regionen des gebildeten Polypeptids sitzen. Die Phytoen Synthaseaktivität des Genproduktes geht auf einen Bereich des Polypeptids zurück, der Sequenzähnlichkeiten zu Phytoen Synthasen anderer Organismen aufweist. Das Zentrum der Lycopin Zyklaseaktivität liegt in dem Nterminalen Bereich des Polypeptids, der interessanterweise Sequenzähnlichkeiten zu den beiden Lycopin Zyklasen aus B. linens aufweist. Dieses Fusionsgen crtYB ist das erste bekannte Gen einer pilzlichen Lycopin Zyklase. Die Entwicklung der pilzlichen crtYB Fusionsgene aus crtB und Lycopin Zyklasegenen des in B. linens gefundenen Typs wird diskutiert. Die Hauptcarotinoide von B. flavum wurden als die C 50 Carotinoide Decaprenoxanthin, Decaprenoxanthin Monoglucosid und Decaprenoxanthin Diglucosid bestimmt. Bei der Analyse von B. flavumPigmentmutanten wurden außerdem die neuen Carotinoide Nonapren [2(3Methyl2butenyl)e, ycarotin], Flavuxanthin [2,2'Bis(4hydroxy3 methyl2butenyl)y, ycarotin] und Nonaflavuxanthin [2(4Hydroxy3methyl2 butenyl)y, ycarotin] als Intermediate identifiziert. Basierend auf den nachgewiesenen Carotinoiden konnte der vermutliche C 50 Carotinoid Biosyntheseweg für B. flavum vorgeschlagen werden. Durch Sequenzanalyse von B. flavumTransposonmutanten konnten erstmalig crt Gene der C 50 Carotinoid Biosynthese isoliert werden. Auf dem crt Gencluster von B. flavum konnten die Gene crtE, crtB und crtI aufgrund von Sequenzähnlichkeiten zu bekannten Genen bestimmt werden. Heterologe Expression in E. coli und Geninaktivierung durch homologe Rekombination in B. flavum zeigten, daß die Produkte von drei weiteren Genen ausreichen, um die C 50 Carotinoide von B. flavum zu bilden. Das Produkt eines neuen Lycopin Elongasegens (crtEb) verlängert Lycopin an Position C2 und C2' um jeweils eine C 5 Isopreneinheit und bildet ein azyklisches C 50 Carotinoid. Dieses wird von den Produkten der neuen C 50 Zyklasegene crtYe und crtYf zu einem zyklischen C 50 Carotinoid umgesetzt. Die Ergebnisse zeigen, daß entgegen früherer Vorstellungen, die Addition einer Isopreneinheit und die Zyklisierung bei der Bildung von zyklischen C 50 Carotinoiden zwei getrennte Schritte sind.
Der DNA-Translokator von T. thermophilus HB27, ebenso wie Typ-IV-Pili (T4P), sind Multiproteinkomplexe, die die Membranen und das Periplasma durchspannen. Sie sind ähnlich aufgebaut und enthalten identische Proteine. Der DNA-Translokator vermittelt Transport von DNA in das Zellinnere während der natürlichen Transformation. T4P sind filamentöse Zellorganellen, die an der inneren Membran assembliert werden und bis zu mehrere Mikrometer aus der Zelle hinausragen. Sie dienen der Anhaftung und Fortbewegung der Zellen auf Oberflächen.
Das Ziel dieser Arbeit war es, die Funktionen einzelner Komponenten der Komplexe und ihrer Proteindomänen bei der natürlichen Transformation, der T4P-Assemblierung und den durch T4P vermittelten Funktionen Adhäsion und „twitching motility“ aufzuklären.
Es sind neun Proteine bekannt, die eine duale Rolle als Komponenten des DNA-Translokators und des T4P spielen. Eines dieser Proteine ist die Assemblierungs-ATPase PilF, die Hexamere bildet. Diese cytoplasmatischen ATPase-Komplexe stellen die Energie für die Assemblierung der T4P bereit, ebenso wie für die Aufnahme freier DNA. Es ist jedoch bisher nicht geklärt, wie die durch PilF bereitgestellte Energie auf die anderen Komponenten des DNA-Translokators/T4P übertragen wird.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass PilF an das cytoplasmatische Protein PilM des T4P und DNA-Translokators bindet. Zudem konnten Proteinkomplexe bestehend aus den Proteinen PilM, PilN und PilO heterolog produziert und aus Zellmembranen koisoliert werden. PilF interagierte mit diesen PilMNO-Komplexen via PilM. Diese Interaktionen führt zur Stimulierung der ATPase-Aktivität von PilF. Dies deutet an, dass PilM ein Kupplungsprotein ist, welches die Assemblierungs-ATPase PilF physisch und funktionell mit dem T4P/DNA-Translokator über den PilMNO-Komplex verbindet.
Neben PilF standen Präpiline von T. thermophilus im Fokus dieser Arbeit. Präpiline sind Vorläuferproteine, die zu Pilinen prozessiert werden und als solche dann die Untereinheiten der Pilus-Strukturen bilden.
Zusammenfassend konnten die Rollen einzelner Präpilin-ähnlicher Proteine bei T4P-assoziierten Funktionen geklärt werden und es konnten erste Analysen zur Charakterisierung des weitestgehend unbekannten Proteins ComZ durchgeführt werden. Desweiteren liefert diese Arbeit Hinweise darauf, dass die membranassoziierten Proteine PilM, PilN und PilO Kupplungsproteine sind, die PilF mit den periplasmatischen Komponenten des T4P/DNA-Translokators verbinden und dadurch die ATPase-Aktivität von PilF stimulieren. Die Rollen einzelner Proteindomänen von PilF und PilM bei der Protein-Protein-Interaktion und der Bindung von Liganden wurden aufgeklärt, sowie ihre Funktionen bei den T4P-vermittelten Funktionen und der natürlichen Transformation.
Die Identifizierung neuartiger Verbindungsklassen für ein pharmakologisches Zielsystem ist eine fordernde Aufgabe für die frühe präklinische Forschung, insbesondere wenn bereits vorherige umfangreiche Studien durchgeführt und viele Leitstrukturserien gefunden wurden. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Scaffold Hopping durch Methoden des Virtual Screenings auch für Systeme möglich ist, für die bereits eine Vielzahl von Referenzsubstanzen beschrieben ist und somit wenig freier chemischer Raum für Innovation zur Verfügung steht. Als Beispielsystem wurde die GlycinB-Bindungsstelle der NR1-Untereinheit des NMDA-Rezeptors betrachtet. Verschiedene zwei- und dreidimensionale Techniken des Virtual Screenings wurden einer umfangreichen retrospektiven Validierung unterworfen. Zur Durchführung der prospektiven Virtual-Screening-Studie wurde eine automatisierte in silico Plattform entwickelt, die 8,9 Millionen käufliche Substanzen aus 46 Substanzkatalogen von 33 verschiedenen Anbietern sammelte, um etwa 5 Millionen unterschiedliche Moleküle in zweidimensionaler Darstellung aufzuarbeiten. Diese Menge an Substanzen stellt den größten Teil der zurzeit kommerziell verfügbaren chemischen Verbindungen, also den „verfügbaren chemischen Raum“ dar. Anhand der retrospektiv validierten Virtual Screening Techniken konnten in einer prospektiven Suche 21 GlycinB-Antagonisten mit neuartigen, d.h. für GlycinB noch unbeschriebenen Scaffolds gefunden werden. Ausgehend von drei dieser Virtual Screening Hits wurden 53 weitere Verbindungen mit insgesamt fünf unterschiedlichen neuartigen Scaffolds und einem gemeinsamen Azo-Motiv identifiziert. Die Struktur-Wirkungsbeziehungen dieser fünf chemischen Serien wurden charakterisiert. Das Ergebnis dieser Arbeit zeigt eindeutig, dass es lohnend ist, alle vorhandenen Methoden auszuschöpfen, da sich die validierten Methoden komplementär zueinander verhielten und kein Virtual Screening Hit von mehr als einer Technik gefunden wurde. Die Flexibilität von Proteinen als Antwort auf die Bindung unterschiedlicher Liganden stellt ein bislang ungelöstes chemieinformatisches Problem dar, welches auch grundlegende pharmakologische Bedeutung hat. So verursachen z.B. bei NMDA/GlycinB agonistische Liganden eine Konformationsänderung des Rezeptors. Diese ruft dann eine direkte funktionale Antwort in Form der Öffnung des Ionenkanals hervor. Auch der Bindungsmodus der Antagonisten von GlycinB ist trotz Vorhandenseins von zwei Kristallstrukturen und mehreren Hundert zum Teil hochaffiner Referenzstrukturen zum großen Teil ungeklärt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde ein auf Moleküldynamiksimulationen basierendes Verfahren entwickelt, welches flexible Aminosäurereste im Rezeptor und damit induzierbare Bewegungen des Proteinrückgrates bestimmt. Die so identifizierten Reste wurden dann in einem erweiterten Verfahren des Induced-Fit-Dockings als explizit flexibel betrachtet. Hierdurch war die Berechnung verschiedener Bindungsmodi von Antagonisten möglich, die aufgrund ihrer Form und Größe nicht in die verfügbaren Kristallstrukturen von GlycinB passten. Diese benötigten somit einen Induced-Fit-Effekt des Rezeptors, um eine Bindung einzugehen. Für die im ersten Teil dieser Arbeit identifizierten Azo-Liganden wurde auf Basis dieser Methode ein gemeinsamer Bindungsmodus vorgeschlagen. Ebenso konnte anhand der Methodik eine Aussage über die funktionale Auswirkung der Proteinflexibilität beim Übergang vom antagonistischen zum agonistischen Rezeptorzustand von GlycinB getroffen werden. Ein großes Problem aktueller Dockingverfahren ist die mangelnde Verfügbarkeit von Scoringfunktionen, welche die tatsächliche biologische Bindungsaffinität eines Liganden berechnen. Hier wurde ein Verfahren für das Zielsystem GlycinB gezeigt, welches aufgrund der Berechnung des thermodynamischen Entropie- und Enthalpiegewinns durch Verdrängung von hydrophob eingeschlossenen Wasser aus der Bindungsstelle durch den Liganden eine Aussage über dessen zu erwartende Bindungsaffinität trifft. Dieses neuartige Scoringsystem wurde auf die im Virtual Screening identifizierten Serie von Azo-Liganden angewandt und verfügte über eine im Vergleich zu klassischen Scoringfunktionen des Molecular Dockings verbesserte Vorhersagekraft der biologischen Bindungsaffinität.
Adaptive Radiation und Zoogeographie anisakider Nematoden verschiedener Klimazonen und Ozeane
(2013)
Anisakide Nematoden sind Parasiten aquatischer Organismen und weltweit in marinen Habitaten verbreitet. Ihre Übertragungswege sind tief im marinen Nahrungsnetz verwurzelt und schließen ein breites Spektrum pelagisch/benthischer Invertebraten (z.B. Cephalopoda, Gastropoda, Crustacea, Polychaeta) und Vertebraten (z.B. Teleostei, Elasmobranchia, Cetacea, Pinnipedia, Aves) als Zwischen- bzw. Endwirte ein. Aufgrund der hohen Befallszahlen u.a. in der Muskulatur und Viszera kommerziell intensiv genutzter Fischarten (z.B. Clupea harengus, Gadus morhua, Salmo salar) sowie ihrer Rolle als Auslöser der menschlichen Anisakiasis nehmen die Vertreter der Gattung Anisakis unter den anisakiden Nematoden eine Sonderstellung ein. Anhand der verbesserten Diagnostik und der Etablierung sowie Weiterentwicklung molekularbiologischer Methoden ist es in den letzten zwei Dekaden gelungen, die bestehende Taxonomie und Systematik der Gattung Anisakis zu erweitern bzw. zu revidieren. Aktuelle molekulare Analysen weisen auf die Existenz von insgesamt neun distinkten Arten hin, welche eine hohe genetische Heterogenität und Wirtsspezifität aufweisen, äußerlich jedoch nahezu identisch sind (sog. kryptische Arten). Trotz kontinuierlicher Forschung auf dem Gebiet ist das Wissen über die Biologie von Anisakis immer noch unzureichend.
Die vorliegende Dissertation ist in kumulativer Form verfasst und umfasst drei (ISI-) Einzelpublikationen. Die Zielsetzung der durchgeführten Studien bestand unter anderem darin, unter Verwendung molekularbiologischer und computergestützter Analyseverfahren, Fragestellungen zur Zoogeographie, (Co-)Phylogenie, Artdiagnostik, Lebenszyklus-Ökologie sowie des bioindikatorischen Potentials dieser Gattung zu bearbeiten und bestehende Wissenslücken zu schließen.
Die Verbreitung von Anisakis, welche bisher ausschließlich anhand von biogeographischen Einzelnachweisen abgeschätzt wurde, konnte durch den angewandten Modellierungsansatz erstmalig interpoliert und in Kartenform vergleichend dargestellt werden. Dabei wurde gezeigt, dass die Verbreitung von Anisakis spp. in den Ozeanen und Klimazonen nicht gleichmäßig ist. Die Analysen deuten auf die Existenz spezies-spezifischer horizontaler und vertikaler Verbreitungsmuster hin, welche neben abiotischen Faktoren durch die Verbreitung und Abundanz der jeweiligen Zwischen- und Endwirte sowie deren Tiefenverteilung und Nahrungspräferenzen geprägt sind.
Durch die umfangreiche Zusammenstellung und anschließende Kategorisierung der (mit molekularen Methoden) geführten Zwischenwirtsnachweise konnten indirekte Rückschlüsse über die vertikale Verbreitung von Anisakis spp. entlang der Tiefenhabitate gezogen werden.
Während Anisakis auf Gattungsebene in der gesamten Wassersäule entlang verschiedener Tiefenhabitate abundant ist, wurde für die stenoxene Art Anisakis paggiae ein meso-/bathypelagisch orientierter Lebenszyklus postuliert. Durch den Einbezug eines breiten Spektrums (paratenischer) Zwischen- und Transportwirte aus unterschiedlichen trophischen Ebenen werden Transmissionslücken im Lebenszyklus der Gattung weitestgehend minimiert und der Transmissionserfolg auf den Endwirt, und damit die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Reproduktion, erhöht. Ausgeprägte Wirtspräferenzen sowie phylogenetische Analysen des ribosomalen ITS-Markers stützen eine Theorie zur co-evolutiven Anpassung der Parasiten an ihre Endwirte. Anisakis eignet sich daher unter Einschränkungen als Bioindikator für die vertikale und horizontale Verbreitung und Abundanz der Endwirte und lässt Rückschlüsse auf trophische Interaktionen im Nahrungsnetz zu. Durch die weitere Beprobung von Zwischenwirten aus verschiedenen trophischen Ebenen in zukünftigen Studien, kann eine genauere Bewertung potentiell abweichender Lebenszyklus-Strategien gewährleistet werden. Insbesondere ist die Datenlage zur Prävalenz und Abundanz anisakider Nematoden in Cephalopoda und Crustacea noch unzureichend. Die Probennahme sollte dabei unter besonderer Berücksichtigung bislang wenig oder unbeprobter geographischer Regionen, Tiefenhabitate und Wirtsarten durchgeführt werden.
In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass bestimmte neuronale microRNAs im Rückenmark und in den Spinalganglien konstitutiv exprimiert und nach peripherer Entzündung mit Formalin oder Zymosan differenziell reguliert werden. Bei der SNI-induzierten Neuropathie konnte indessen keine signifikante Regulation der untersuchten microRNAs nachgewiesen werden. Aufgrund der Lokalisation in den Neuronen der Schmerz-verarbeitenden Laminae I und II des Dorsalhorns des Rückenmarks und angesichts der Regulation in entzündlich stimulierten Neuronen und Mikroglia wurde der Fokus der Arbeit auf die Untersuchung von microRNA-124a gelegt. Anhand von Expressionsanalysen konnte gezeigt werden, dass eine periphere entzündliche Stimulation mit Formalin oder Zymosan microRNA-124a im Rückenmark inhibiert, die Expression pro-inflammatorischer und pro-nozizeptiver Gene hiernach ermöglicht und ein vermehrtes Schmerzverhalten bewirkt. Die funktionelle Relevanz von microRNA-124a wurde in vivo mittels intravenöser Applikation von microRNA-124a-Modulatoren bei einem Modell für entzündliche Schmerzen, dem Formalin-Modell untersucht. Dabei führte die Hemmung von microRNA-124a zu einem verstärkten Schmerzverhalten, welches mit einer Hochregulation verschiedener Entzündungsmarker einherging. Die Überexpression von microRNA-124a dagegen antagonisierte die Hochregulation entzündlicher Mediatoren und führte zu einer Schmerzhemmung. Darüber hinaus konnte in der vorliegenden Arbeit der antinozizeptive Effekt von microRNA-124a mit der Regulation der Epigenetik-regulierenden Targets MeCP2, HDAC5 und MYST2 assoziiert werden und u.a. über die Hemmung des neuromodulierenden, pro-inflammatorischen Peptids BDNF verifiziert werden. Die spezielle Darreichung von microRNA-124a könnte demzufolge einen vielversprechenden Ansatz zur Therapie chronisch-entzündlicher Schmerzen liefern. Zukünftig werden weitere Studien notwendig sein um die eindeutige Funktion, die individuelle Wirkung sowie die therapeutische Relevanz von microRNA-124a zu analysieren. Darüber hinaus müssten Dosis-Wirkungs-Beziehungen und Nebenwirkungsprofile für microRNA-124a erstellt werden, um potenzielle Risiken, Chancen und Vorteile der microRNA-Modulation hinsichtlich einer humanen Schmerztherapie bewerten zu können.
Bei Cryptochromen handelt es sich um Blaulichtrezeptoren der Cryptochrom-Photolyase-Proteinfamilie (CPF). Mitglieder dieser Proteinfamilie sind in allen Domänen des Lebens zu finden und haben eine essentielle Rolle in der Reparatur der DNA sowie der lichtgesteuerten Regulation der Expression. Cryptochrome sind in der Regel keine DNA-reparierenden Proteine. Sie sind regulativ an der Steuerung der inneren Uhr und des Zellzyklus der Organismen beteiligt. In der Kieselalge Phaeodactylum tricornutum konnten bisher sechs phylogenetisch unterschiedliche Mitglieder der CPF identifiziert werden. Bei CryP handelt es sich um das einzige pflanzenähnliche Cryptochrom der photoautotrophen Diatomee. Für das Protein CryP konnte bereits ein blaulichtinduzierter Photozyklus durch die Absorption der Chromophore 5-Methenlytetrahydrofolat (MTHF) und Flavinadenindinukleotid (FAD) gezeigt werden. Außerdem ist eine regulative Wirkung des Proteins auf die Lichtsammelkomplexe (Lhc) der Diatomee bekannt. Für eine weitere Charakterisierung des CryPs wurde in dieser Arbeit zunächst das Absorptionsverhalten unter verschiedenen Wellenlängen beobachtet, um so einen Einblick in eine mögliche Aktivierung und Deaktivierung des Proteins durch Licht unterschiedlicher Wellenlängen zu erlangen. Es zeigte sich hierbei eine mit pflanzlichen Cryptochromen vergleichbare Anreicherung verschiedener Redoxzustände des FADs in Abhängigkeit von der Wellenlänge.
Für eine Aufklärung der Wirkungsweise des CryP-Proteins wurden verschiedene Hypothesen untersucht: Die phylogenetische Nähe und ein ähnliches Absorptionsverhalten des CryPs zu Cryptochromen mit Reparaturfähigkeit für einzelsträngige DNA (Cry-DASH) führte zu einer Untersuchung des Proteins als möglicher Transkriptionsfaktor. Hierfür konnte eine Kernlokalisation des Proteins nachgewiesen werden, was Rückschlüsse auf eine potentielle Regulation der Expression mittels DNA-Bindung zulässt. Außerdem wurde gezeigt, dass CryP DNA-Bindefähigkeit besitzt. Die bisher nachgewiesenen Bindungen waren jedoch unspezifischer Art. Dies konnte auch für die Promotersequenz eines der durch CryP regulierten Gene lhcf1 festgestellt werden. Auf Grund der unspezifischen DNA-Bindung wurde eine zweite Hypothese für CryP untersucht: CryP wirkt regulativ auf die Expression verschiedener Gene durch Protein-Protein-Interaktionen und ist Teil einer Reaktionskaskade zur Signalweiterleitung in P. tricornutum.
Durch die Untersuchung der zweiten Hypothese konnten drei Interaktionspartner für CryP identifiziert und eine Interaktion verifiziert werden. Hierbei handelt es sich um das Protein AAA mit einer bisher unbekannten Funktion und das Protein BolA, welches Teil der zuerst in Escherichia coli identifizierten BolA-like-Proteinfamilie ist. Außerdem konnte eine Interaktion mit dem Cold-Shock-Domänen-Protein CSDP gezeigt werden. Bei den Proteinen BolA und CSDP handelt es sich um potentiell regulierende Faktoren der Transkription und Translation, was Teil einer Reaktionskaskade sein kann. Die aus anderen Organismen bekannten Funktionen des BolA-Proteins überschneiden sich mit den in CryP-Knockdown-Mutanten beobachteten Effekten. Sie zeigen eine erhöhte Sensitivität für Stresssituationen wie abweichende Nährstoffkonzentration, Osmolaritäten und Temperaturen. Diese Beobachtungen stellen einen Zusammenhang der durch einen CryP-Knockdown beobachteten Effekte und der CryP-BolA-Interaktion her. Durch Homologien zu Cold-Shock-Proteinen aus Chlamydomonas reinhardtii gibt die CryP-Interaktion mit dem Protein CSDP Hinweise auf einen potentiellen Mechanismus zur Regulation der Lhc-Proteine, für welche zuvor ein CryP-abhängiger Effekt beschrieben war.
Über die Protein-Protein-Interaktionen hinaus wurde die Phosphorylierung des CryPs als Möglichkeit der Signalweiterleitung untersucht. Es konnte eine reversible Phosphorylierung des heterolog aus E. coli isolierten CryPs gezeigt werden. Diese zeigt Ähnlichkeiten zu bekannten Phosphorylierungen pflanzlicher Cryptochrome und gibt Hinweise auf einen Mechanismus der Signalweiterleitung.
Durch die Untersuchung der CryP-regulierten Transkription mit P. tricornutum CryP-Knockdown-Mutanten durch Next-Generation-Sequencing (NGS) konnte die Hypothese der regulativen Proteinkaskade und der Signalweiterleitung weiter bestätigt werden. Die Auswirkungen des CryPs auf die Transkription erwiesen sich als nicht auf einen Teilbereich des Metabolismus begrenzt, sondern sind in einem großen Teil der funktionellen Gengruppen in P. tricornutum zu sehen. Außerdem konnten drei Klassen CryP-regulierter Gene festgestellt werden. Kategorie 1: die ausschließlich unter Blaulicht regulierten Gene; Kategorie 2: die sowohl unter Blaulicht als auch im Dunkeln regulierten Gene und Kategorie 3: die ausschließlich im Dunkeln regulierten Gene. Ein im Dunkeln und unter Blaulicht jeweils unterschiedlicher regulativer Effekt deutet auf eine Doppelfunktion des CryPs hin. Möglicherweise hat das Cryptochrom unterschiedliche lichtabhängige und lichtunabhängige Funktionen.
Durch die Analyse der CryP-regulierten Genexpression konnte außerdem ein Zusammenhang zwischen CryP und weiteren Photorezeptoren gezeigt werden. Der CryP-Proteingehalt in der Zelle hat einen regulativen Einfluss auf das CPF1-Protein, eine Photolyase mit dualer Funktion aus der gleichen Proteinfamilie. Zusätzlich konnte auch ein Einfluss auf die Lichtsensitivität der Genexpression des Rotlichtrezeptors Phytochrom (DPH) durch CryP gezeigt werden. Vergleichbar mit höheren Pflanzen scheint ein regulatives Netzwerk der Photorezeptoren auch in der Diatomee P. tricornutum vorhanden zu sein.