Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
Refine
Year of publication
Document Type
- Doctoral Thesis (231)
- Article (3)
- Diploma Thesis (1)
Language
- German (235) (remove)
Has Fulltext
- yes (235)
Is part of the Bibliography
- no (235)
Keywords
- Elektrophysiologie (4)
- Molekularbiologie (4)
- Altern (3)
- Carotinoide (3)
- Cochlea (3)
- DPOAE (3)
- Mitochondrium (3)
- Mongolische Rennmaus (3)
- Phylogenie (3)
- West Africa (3)
Institute
- Biowissenschaften (235) (remove)
Der DNA-Translokator von T. thermophilus HB27, ebenso wie Typ-IV-Pili (T4P), sind Multiproteinkomplexe, die die Membranen und das Periplasma durchspannen. Sie sind ähnlich aufgebaut und enthalten identische Proteine. Der DNA-Translokator vermittelt Transport von DNA in das Zellinnere während der natürlichen Transformation. T4P sind filamentöse Zellorganellen, die an der inneren Membran assembliert werden und bis zu mehrere Mikrometer aus der Zelle hinausragen. Sie dienen der Anhaftung und Fortbewegung der Zellen auf Oberflächen.
Das Ziel dieser Arbeit war es, die Funktionen einzelner Komponenten der Komplexe und ihrer Proteindomänen bei der natürlichen Transformation, der T4P-Assemblierung und den durch T4P vermittelten Funktionen Adhäsion und „twitching motility“ aufzuklären.
Es sind neun Proteine bekannt, die eine duale Rolle als Komponenten des DNA-Translokators und des T4P spielen. Eines dieser Proteine ist die Assemblierungs-ATPase PilF, die Hexamere bildet. Diese cytoplasmatischen ATPase-Komplexe stellen die Energie für die Assemblierung der T4P bereit, ebenso wie für die Aufnahme freier DNA. Es ist jedoch bisher nicht geklärt, wie die durch PilF bereitgestellte Energie auf die anderen Komponenten des DNA-Translokators/T4P übertragen wird.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass PilF an das cytoplasmatische Protein PilM des T4P und DNA-Translokators bindet. Zudem konnten Proteinkomplexe bestehend aus den Proteinen PilM, PilN und PilO heterolog produziert und aus Zellmembranen koisoliert werden. PilF interagierte mit diesen PilMNO-Komplexen via PilM. Diese Interaktionen führt zur Stimulierung der ATPase-Aktivität von PilF. Dies deutet an, dass PilM ein Kupplungsprotein ist, welches die Assemblierungs-ATPase PilF physisch und funktionell mit dem T4P/DNA-Translokator über den PilMNO-Komplex verbindet.
Neben PilF standen Präpiline von T. thermophilus im Fokus dieser Arbeit. Präpiline sind Vorläuferproteine, die zu Pilinen prozessiert werden und als solche dann die Untereinheiten der Pilus-Strukturen bilden.
Zusammenfassend konnten die Rollen einzelner Präpilin-ähnlicher Proteine bei T4P-assoziierten Funktionen geklärt werden und es konnten erste Analysen zur Charakterisierung des weitestgehend unbekannten Proteins ComZ durchgeführt werden. Desweiteren liefert diese Arbeit Hinweise darauf, dass die membranassoziierten Proteine PilM, PilN und PilO Kupplungsproteine sind, die PilF mit den periplasmatischen Komponenten des T4P/DNA-Translokators verbinden und dadurch die ATPase-Aktivität von PilF stimulieren. Die Rollen einzelner Proteindomänen von PilF und PilM bei der Protein-Protein-Interaktion und der Bindung von Liganden wurden aufgeklärt, sowie ihre Funktionen bei den T4P-vermittelten Funktionen und der natürlichen Transformation.
Die Analyse von DNA-Sequenzen steht spätestens seit der Feststellung ihrer tragenden Rolle in der Vererbung organismischer Eigenschaften im Fokus biologischer Fragestellungen. Seit Kurzem wird mit modernsten Methoden die Untersuchung von kompletten Genomen ermöglicht. Dies eröffnet den Zugang zu genomweiten Informationen gegenüber begrenzt aussagekräftigen markerbasierten Analysen. Eine Genomsequenz ist die ultimative Quelle an organismischer Information. Allerdings sind diese Informationen oft aufgrund technischer und biologischer Gründe komplex und werfen meist mehr Fragen auf, als sie beantworten.
Die Rekonstruktion einer bislang unbekannten Genomsequenz aus kurzen Sequenzen stellt eine technische Herausforderung dar, die mit grundlegenden, aber in der Realität nicht zwingend zutreffenden Annahmen verbunden ist. Außerdem können biologische Faktoren, wie Repeatgehalt oder Heterozygotie, die Fehlerrate einer Assemblierung stark beeinflussen. Die Beurteilung der Qualität einer de novo Assemblierung ist herausfordernd, aber zugleich äußerst notwendig. Anschließend ist eine strukturelle und funktionale Annotation von Genen, kodierenden Bereichen und repeats nötig, um umfangreiche biologische Fragestellungen beantworten zu können. Ein qualitativ hochwertiges und annotiertes assembly ermöglicht genomweite Analysen von Individuen und Populationen. Diese Arbeit beinhaltet die Assemblierung und Annotation des Genoms der Süßwasserschnecke Radix auricularia und eine Studie vergleichender Genomik von fünf Individuen aus verschiedenen molekularen Gruppen (MOTUs).
Mollusken beherbergen nach den Insekten die größte Artenvielfalt innerhalb der Tierstämme und besiedeln verschiedenste, teils extreme, Habitate. Trotz der großen Bedeutung für die Biodiversitätsforschung sind verhältnismäßig wenige genomische Daten öffentlich verfügbar. Zudem sind Arten der Gattung Radix auch aufgrund ihrer großen geografischen Verbreitung in diversen biologischen Disziplinen als Modellorganismen etabliert. Eine annotierte Genomsequenz ermöglicht über bereits untersuchte Felder hinaus die Forschung an grundlegenden biologischen Fragestellungen, wie z.B. die Funktionsweise von Hybridisierung und Artbildung. Durch Assemblierung und scaffolding von sechs whole genome shotgun Bibliotheken verschiedener insert sizes und einem transkriptbasiertem scaffolding konnte trotz des hohen Repeatgehalts ein vergleichsweise kontinuierliches assembly erhalten werden. Die erhebliche Differenz zwischen der Gesamtlänge der Assemblierung und der geschätzten Genomgröße konnte zum Großteil auf kollabierte repeats zurückgeführt werden.
Die strukturelle Annotation basierend auf Transkriptomen, Proteinen einer Datenbank und artspezifisch trainierten Genvorhersagemodellen resultierte in 17.338 proteinkodierenden Genen, die etwa 12,5% der geschätzten Genomgröße abdecken. Der Annotation wird u.a. aufgrund beinhaltender Kernrthologen, konservierter Proteindomänenarrangements und der Übereinstimmung mit de novo sequenzierten Peptiden eine hohe Qualität zugesprochen.
Das mapping der Sequenzen von fünf Radix MOTUs gegen die R. auricularia Assemblierung zeigte stark verringerte coverage außerhalb kodierender Bereiche der nicht-Referenz MOTUs aufgrund hoher Nukleotiddiversität. Für 16.039 Gene konnten Topologien berechnet werden und ein Test auf positive Selektion ausgeführt werden. Insgesamt konnte über alle MOTUs hinweg in 678 verschiedenen Genen positive Selektion detektiert werden, wobei jede MOTU ein nahezu einzigartiges Set positiv selektierter Gene beinhaltet. Von allen 16.039 untersuchten Genen konnten 56,4% funktional annotiert werden. Diese niedrige Rate wird vermutlich durch Mangel an genomischer Information in Mollusken verursacht. Anschließende Analysen auf Anreicherungen von Funktionen sind deshalb nur bedingt repräsentativ.
Neben den biologischen Ergebnissen wurden Methoden und Optimierungen genomischer Analysen von Nichtmodellorganismen entwickelt. Dazu zählen eigens angefertigte Skripte, um beispielsweise Transkriptomalignments zu filtern, Trainings eines Genvorhersagemodells automatisiert und parallelisiert auszuführen und Orthogruppen bestimmter Arten aus einer Orthologievorhersage zu extrahieren. Zusätzlich wurden Abläufe entwickelt, um möglichst viele vorhandene Daten in die Assemblierung und Annotation zu integrieren. Etwa wurde ein zusätzliches scaffolding mit eigens assemblierten Transkripten mehrerer MOTUs sequenziell und phylogenetisch begründet ausgeführt.
Insgesamt wird eine umfassende und qualitativ hochwertige Genomsequenz eines Süßwassermollusken präsentiert, welche eine Grundlage für zukünftige Forschungsprojekte z.B. im Bereich der Biodiversität, Populationsgenomik und molekularen Ökologie bietet. Die Ergebnisse dieser Arbeit stellen einen Wissenszuwachs in der Genomik von Mollusken dar, welche bisher trotz ihrer Artenvielfalt deutlich unterrepräsentiert bezüglich assemblierter und annotierter Genome auffallen.
Polyploidie in Prokaryoten
(2018)
Diese Arbeit teilt sich in drei Teile auf, die sich mit der Regulation der Polyploidie sowie mit der Genkonversion als evolutionären Vorteil von Polyploidie in Haloferax volcanii beschäftigen.
Im ersten Teil dieser Arbeit, wurde der Einfluss der DNA-Replikationsinitiatorproteine Orc1/Cdc6 auf das Ploidielevel untersucht. Hierbei konnte anhand von Deletionsmutanten zunächst gezeigt werden, dass lediglich drei der 16 Orc1/Cdc6-Proteine in H. volcanii essentiell sind. Bestimmung des Ploidielevels mittels qPCR-Analyse ergab, dass jedes der 12 untersuchten Orc1/Cdc6-Proteine das Ploidielevel mindestens eines Replikons beeinflusst und dementsprechend sowohl die mit einem Replikationsursprung assoziierten als auch die „verwaisten“ Orc1/Cdc6-Proteine eine Funktion haben. Die mit einem Replikationsursprung assoziierten Orc1/Cdc6-Proteine hatten hierbei keinen größeren Einfluss auf das Ploidielevel als die „verwaisten“. Zusätzlich konnte durch Wachstumsanalysen in Mikrotiterplatten gezeigt werden, dass die meisten Deletionsmutanten unter allen getesteten Bedingungen ein mit dem Wildtyp vergleichbares oder besseres Wachstum zeigen. Eine Deletionsmutante eines Orc1/Cdc6-Proteins hingegen zeigte nur verbessertes Wachstum bei Glukose als Kohlenstoffquelle, was ein Hinweis auf die Verwendung verschiedener Orc1/Cdc6-Proteine unter verschiedenen Bedingungen sein könnte. Zusätzlich wurden zwei mit dem Replikationsursprung assoziierte Orc1/Cdc6-Proteine überexprimiert und via ihres N-terminalen His-Tag im Western-Blot nachgewiesen, sodass diese nun für Co-Affinitätsaufreinigungen zur weiteren Charakterisierung des komplexen Zusammenspiels der Orc1/Cdc6-Proteine zur Verfügung stehen.
Im Rahme des zweiten Teils der Arbeit wurde der Einfluss der in der 5‘-Region der der Replikationsursprünge ori1 und ori2 kodierten Proteine auf Wachstum und die Kopienzahl des Hauptchromosoms bestimmt. Zunächst wurde die Expression der drei in Haloarchaea hoch-konservierten oap-Gene upstream von ori1 mittels Nothern-Blot untersucht und es konnte gezeigt werden, dass das oap-Operon tatsächlich als Operon abgelesen wird. Um alle Gene in den 5‘-Regionen von ori1 und ori2 genauer zu charakterisieren, wurden induzierbare Überexpressionsmutanten im Wildtyp-Hintergrund angefertigt. Es konnte mittels Wachstumsversuchen in Mikrotiterplatten gezeigt werden, dass bei Induktion von Beginn an die Überexpression der Hef-Helikase und des oapB-Proteins zu einem starken Wachstumsdefekt führen, die von oapC und HVO_1724 zu einem moderaten Wachstumsdefekt, wohingegen für die Überexpressionsmutante von oapA vergleichbares Wachstum zum Wildtyp und für die Überexpression der Rad25d-Helikase verbessertes Wachstum beobachtet werden konnte. Es konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass sowohl die Deletion als auch die Überexpression der Helikasen keinen Einfluss auf das Ploidielevel hat; die Deletion von oapC führt jedoch zu einer Reduktion der Genomkopienzahl in exponentieller und stationärer Phase, was ein erster Hinweis darauf ist, dass das oap-Operon eine Rolle bei der Regulation des Ploidielevels spielen könnte.
Im dritten Teil der Arbeit wurde eine Methode entwickelt, um Genkonversion farblich sichtbar zu machen. Hierbei wurde sich H. volcaniis Carotinoidbiosynthese zu Nutze gemacht. Es wurden zwei verschiedene, auxotrophe Elternstämme mittels Protoplastenfusion verschmolzen, um eine heterozygote Tochterzelle zu erzeugen. Ein Genkonversionsereignis wurde durch einen roten Keil angezeigt, der aus einer weißen Kolonie wuchs und durch die erfolgreiche Reparatur des Carotinoidbiosynthesegens entstand. Es wurden insgesamt 8525 Klone ausgestrichen und 0,14 % der Kolonien zeigten eine entsprechende rote Färbung. Das Proof-of-Principle dieser Methode ist in damit in dieser Arbeit gelungen. Um die Genkonversion in den weißen Kolonien auf genetischer Ebene genauer zu untersuchen, wurde PCR verwendet. Es konnte gezeigt werden, dass in den Zellen aller 135 untersuchten Kolonien Genkonversion stattgefunden hatte und zwar so effizient, dass nur in seltenen Fällen Heterozygotie vorlag. Unter Selektionsdruck stehende Loci hatten in beiden untersuchten Fällen eine starke Präferenz in Richtung Homozygotie und Erhalt der Prototrophie. Für nicht unter Selektionsdruck stehende Loci konnte gezeigt werden, dass die Hälfte der untersuchten Kolonien dem Elternstamm 1 glich, während die andere Hälfte dem Elternstamm 2 glich. Auch hier waren die Zellen nur in seltenen Fällen homozygot.
Hämophilie A ist eine X-chromosomal rezessiv vererbte Krankheit, die aufgrund von Mutationen innerhalb des Gens von Gerinnungsfaktor VIII (FVIII) zum funktionellen Defekt oder zum Fehlen des körpereigenen FVIII führt. FVIII zirkuliert als Heterodimer und besteht aus einer schweren Kette mit der Domänenstruktur A1-A2-B und einer leichten Kette mit der Domänenstruktur A3-C1-C2. Bei Patienten unter Prophylaxe wird durch regelmäßige Substitution mit rekombinanten oder aus Plasma gewonnenen FVIII-Präparaten die Hämostase wiederhergestellt. Allerdings entwickeln hierbei etwa 30% der Patienten mit einer schweren Hämophilie eine FVIII-spezifische Immunantwort in Form von neutralisierenden Antikörpern (Inhibitoren). Die sogenannte Immuntoleranz-Therapie (engl. immune tolerance induction therapy, ITI) ist bisher die einzige etablierte Therapie, die zu einer dauerhaften Eradikation der FVIII-Inhibitoren und Induktion von Toleranz gegenüber FVIII führen kann. Die Therapie beruht auf einer meist täglichen Gabe hoher FVIII-Dosen, welche sich, je nach Behandlungsdauer, über Wochen bis hin zu Jahren erstrecken kann. Bei etwa 30% der Patienten ist diese Therapie nicht erfolgreich. Für solche Patienten besteht die Gefahr lebensbedrohlicher, unkontrollierbarer Blutungen und erheblicher Gelenkschäden.
Die spezifische Ansteuerung des Membran-gebundenen Immunglobulin G (mIg) des B-Zellrezeptors (BZR) mithilfe von Immuntoxinen ist eine mögliche Option zur selektiven Eliminierung FVIII-spezifischer B-Zellen und somit zur Eradikation von FVIII-Inhibitoren. Solche Immuntoxine bestehen aus einer zellbindenden und einer zytotoxischen Domäne, welche nach Internalisierung zur Apoptose der Zielzelle führen soll. Da FVIII aufgrund der Größe als zellbindende Domäne ungeeignet ist, beschäftigt sich die vorliegende Arbeit mit der Entwicklung und Evaluierung alternativer Immuntoxine zur selektiven Eliminierung FVIII-spezifischer B-Zellen. Die FVIII-spezifische Immunantwort ist zwar polyklonal, jedoch vor allem gegen A2- und die C2-Domäne gerichtet. Aus diesem Grund wurden die humane A2- und C2-Domäne (hA2, hC2) als zellbindende Domäne verwendet und jeweils genetisch an eine verkürzte Version des Exotoxin A (ETA) aus Pseudomonas aeruginosa fusioniert, bei welcher die natürliche zellbindende Domäne entfernt wurde. Die rekombinanten Proteine wurden bakteriell produziert und im Anschluss an die Aufreinigung biochemisch charakterisiert. Während das bakterielle Expressionssystem für hA2-ETA nicht geeignet war, konnte hC2-ETA neben weiteren Kontrollproteinen mit korrekter Konformation der hC2-Domäne hergestellt und aufgereinigt werden.
Die Fähigkeit zur selektiven Eliminierung hC2-spezifischer B-Zellen wurde im weiteren Verlauf sowohl in vitro mithilfe einer hC2-spezifischen Hybridomazelllinie als auch ex vivo und in vivo mithilfe von Splenozyten aus FVIII-immunisierten FVIII-knockout Mäusen untersucht.
Durch Inkubation der hC2-spezifischen Hybridomazelllinie mit hC2-ETA konnten ca. 38 % der Zellen eliminiert werden. Weitere Untersuchungen der Zelllinie ergaben, dass diese keinen vollständigen funktionalen B-Zellrezeptor auf der Oberfläche exprimierte, welcher für die Bindung und die korrekte Internalisierung des Immuntoxins notwendig ist. Aufgrund dessen eignet sich diese Zelllinie nicht als Modell für eine genauere Analyse der in vitro Eliminierungseffizienz von hC2-ETA.
Weitere Analysen mithilfe von Splenozyten aus FVIII-immunisierten FVIII-knockout Mäusen haben jedoch gezeigt, dass durch ex vivo Inkubation der Splenozyten mit hC2-ETA, alle hC2-spezifischen B-Zellen vollständig, selektiv und konzentrations-abhängig eliminiert werden konnten. Auch die mehrfache Applikation von hC2-ETA in FVIII-immunisierten FVIII-knockout Mäusen führte bei der Hälfte der Tiere zur vollständigen Eliminierung aller hC2-spezifischen B-Zellen. Eine Reduktion des hC2-spezifischen Antikörpersignals konnte nach Gabe von hC2-ETA in allen behandelten Tieren beobachtet werden. Die unvollständige Eliminierung in der Hälfte der Tiere ist vermutlich auf die Präsenz hC2-spezifischer Antikörper zurückzuführen, die einen Teil des applizierten Immuntoxins neutralisiert haben, sodass nicht alle hC2-spezifischen Gedächtnis-B-Zellen erreicht und eliminiert werden konnten. Um die Eliminierungseffizienz von hC2-ETA weiter zu erhöhen, müsste das Behandlungsprotokoll geändert werden. Sowohl eine Verlängerung des Behandlungszeitraums als auch eine kombinierte Therapie aus FVIII und hC2-ETA sollte zu einer erhöhten Bioverfügbarkeit des Toxins und dadurch zu einer gesteigerten Eliminierungseffizienz führen.
Die Ausweitung des hier vorgestellten Ansatzes auf weitere FVIII-Domänen ist generell möglich, jedoch muss hierzu ein alternatives Expressionssystem aufgrund des eukaryotischen Ursprungs von FVIII in Betracht gezogen werden. Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen dennoch, dass FVIII-Domänen-Immuntoxine ein wirkungsvolles Mittel sind, um FVIII-spezifische B-Zellen selektiv zu eliminieren. Die Anpassung der Gabe von FVIII-Domänen-Immuntoxinen an die individuelle Immunantwort des Patienten könnte das Auftreten von Nebenwirkungen minimieren. Außerdem könnte eine kombinierte Therapie aus ITI und FVIII-Domänen-Immuntoxinen die Zeit bis zur Induktion von Toleranz verkürzen und die Chancen für den generellen Therapieerfolg erhöhen.
In den letzten Jahren findet die Wirkung von Polyphenolen auf den Alterungsprozess oder zur Behandlung von Krankheiten immer mehr Beachtung. Das Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung der Wirkmechanismen der Polyphenole Gossypol, Curcumin und Quercetin, um Hinweise für neue oder verbesserte Therapieansätze zu erhalten. Die dazu durchgeführten Untersuchungen lieferten folgende Ergebnisse:
1. Der Ascomycet "P. anserina" eignet sich als Modellorganismus zur Untersuchung der Wirkmechanismen verschiedener Polyphenole, da die bereits aus der Literatur bekannten Effekte auf das Überleben höherer Organismen auch in "P. anserina" beobachtet wurden.
2. Die Mitochondrienfunktion spielt auf unterschiedliche Art eine Rolle in der Kompensation von Dysfunktionen oder Stressbedingungen in der Zelle und wirkt somit positiv auf die Regulation der Lebensspanne von "P. anserina". In der "PaSod3"-Deletionsmutante wurde eine Verschiebung der mitochondrialen Atmung von einer Komplex I-abhängigen hin zu einer vermehrt Komplex II-abhängigen Atmung festgestellt. Die damit verbundene Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials dient neben der bereits bekannten hohen Superoxid-Menge als Signal zur Mitophagie-Induktion. Auch die Anpassung der Mitochondrienfunktion durch die erhöhte Bildung von mtRSCs, wie im Falle von Gossypol oder Quercetin, kann zur Kompensation von Dysfunktionen beitragen bzw. sie abschwächen.
3. Es gibt keinen grundlegenden gemeinsamen Wirkmechanimus der drei untersuchten Polyphenole. Zwar spielt Wasserstoffperoxid bei verschiedenen Stoffen eine Rolle, aber nicht bei allen. Zusätzlich wurde gezeigt, dass Wasserstoffperoxid abhängig von der vorherrschenden Konzentration wirkt und daher auch keine Allgemeingültigkeit des Effektes vorherzusagen ist. In niedrigen Konzentrationen sorgt Wasserstoffperoxid z. B. für eine Induktion der Autophagie und damit einhergehende eine Lebensverlängerung. Im Gegensatz dazu wirken hohe Wasserstoffperoxid-Konzentrationen lebensverkürzend und lösen verschiedene Formen von Zelltod aus.
4. Die Curcumin-vermittelte Langlebigkeit wurde das erste Mal in Verbindung mit einer funktionellen Autophagie gebracht. Im Detail führt die Behandlung mit Curcumin durch eine PaSOD1-abhängige leichte Erhöhung der Wasserstoffperoxid-Menge zu einer Induktion von nicht-selektiver Autophagie. Die induzierte Autophagie ist Ursache der Lebensverlängerung durch Curcumin.
5. Gossypol wirkt in Abhängigkeit der mitochondrialen Permeabilitäts-Transitionspore bzw. von ihrem Regulator Cyclophilin D. Hierbei verstärkt die deutlich erhöhte Wasserstoffperoxid-Menge wahrscheinlich die Induktion von programmiertem Zelltod. Gleichzeitig wird eine cytoprotektive Form von Autophagie und ein scheinbar ATG-unabhängiger Abbau von Mitochondrien induziert.
6. Quercetin wirkt in "P. anserina" abhängig vom Methylierungs-Status. Untersuchungen mit Mutanten der "O"-Methyltransferase PaMTH1 ergaben die Notwendigkeit der Anwesenheit von PaMTH1 für den lebensverlängernden Effekt von Quercetin. Analysen mit dem methylierten Derivat Isorhamnetin verdeutlichten diese Abhängigkeit und zeigten zudem, dass Quercetin sowohl in der methylierten als auch unmethylierten Form Effekte hervorruft. Jedoch sind nur die Effekte des unmethylierten Quercetin unabhängig von der Lebensverlängerung und eher schädlich für die Zelle.
Die forensische Entomologie nutzt nekrophage Insekten, hauptsächlich Dipteren und ihre juvenilen Stadien, zur Schätzung der minimalen Leichenliegezeit. Dem liegt zugrunde, dass nekrophage Dipteren binnen Minuten nach dem Todeseintritt potentiell in der Lage sind, einen Leichnam zu detektieren und zu besiedeln. Das anschließende Wachstum und die Entwicklung der juvenilen Stadien erfolgt als Funktion von der Art und der Umgebungstemperatur.
Mit Hilfe von Laborstudien konnten bislang für einige forensisch relevante Fliegenarten Entwicklungsdaten erhoben werden, die eine Altersbestimmung der sich an einem Leichnam entwickelnden Larven und Puppen erlauben und so eine Schätzung der minimalen Leichenliegezeit ermöglichen. Als Nährsubstrat für Laborstudien werden tierische Gewebe verwendet. Eine Übertragbarkeit der Daten auf humanes Gewebe wurde aber bislang nicht verifiziert. In der vorliegenden Arbeit wurde das larvale Wachstum und die juvenile Entwicklungsgeschwindigkeit der forensisch relevanten Schmeißfliege Calliphora vicina (Diptera: Calliphoridae) auf humanem Muskelgewebe untersucht und mit dem Wachstum auf Schweineleber, magerem Schweinemuskelfleisch und Schweinehackfleisch verglichen. Die auf humanem Gewebe heranwachsenden Individuen waren mit bis zu 3,5 mm signifikant länger als die Individuen, die sich auf Leber und dem mageren Schweinemuskelfleisch entwickelten. Bei der Verwendung von Hackfleisch vom Schwein zeigte sich kein Unterschied. Darauf basierend wird die Empfehlung ausgesprochen, für zukünftige Entwicklungsstudien Schweinehackfleisch als Ersatz für humanes Gewebe zu verwenden.
Zahlreiche Anleitungen zur Asservierung forensisch-entomologischer Spuren empfehlen das Sammeln getrennt nach Körperregionen eines Leichnams. Dies soll eine mögliche gewebespezifische Entwicklungsrate berücksichtigen. Das für die vorliegende Arbeit durchgeführte systematische Absammeln von Fliegenlarven von 51 Leichnamen getrennt nach Körperregionen zeigte keine artspezifischen Präferenzen für bestimmte Gewebe oder Körperregionen. Das Artenspektrum entsprach größtenteils dem aufgrund von Studien an Schweinekadavern zu erwartendem Artenspektrum für Deutschland und Mitteleuropa. Insgesamt konnten 15 Schmeißfliegenarten nachgewiesen werden, von denen in der Regel mehrere gleichzeitig an einem Leichnam zu finden waren. Dies zeigt, dass ein Faktor wie interspezifische Konkurrenz in Zukunft mehr Beachtung in der Forschung erhalten sollte.
Bislang wurde in der forensischen Entomologie die minimale Leichenliegezeit durch die Untersuchung juveniler Stadien von Fliegen eingegrenzt. Eine eventuell mögliche Ausweitung dieses Zeitfensters könnte durch eine Altersbestimmung der adulten Fliegen oder der leeren Puparien gelingen. Der Nachweis, dass die dafür untersuchten Fliegen bzw. Puparien tatsächlich von dem fraglichen Leichnam stammen, war bislang nicht möglich. Die forensische relevante Schmeißfliege Lucilia sericata wurde in der vorliegenden Arbeit auf humanem Gewebe und Gewebe von elf weiteren Tierarten großgezogen. Durch die Analyse stabiler Kohlen- und Stickstoffisotope konnte ein von diesen elf Tierarten abgrenzbares humanes Isotopenprofil sowohl für die adulten Fliegen von L. sericata, als auch für ihre leeren Puparien detektiert werden. Dieses Profil spiegelte die Nahrungszusammensetzung der Wirte wider.
Die vorliegende Arbeit erhebt Daten zur Entwicklung einer forensisch relevanten Schmeißfliegenart auf humanem Gewebe, belegt das bislang lediglich am tierischen Modell erhobene Schmeißfliegeninventar als für menschliche Leichen relevant und hinterfragt die gewebespezifische Asservierungsempfehlung als ein akademisches Artefakt. Auf dieser Basis konnten Empfehlungen für die Weiterzucht fallrelevanter entomologischer Spuren ausgesprochen werden, die gerichtsverwertbar sind und die Verwendung von tierischem Gewebe oder Tierkadaver in der forensisch-entomologischen Forschung legitimieren. Die Analyse stabiler Isotope legt darüber hinaus einen neuen, innovativen Grundstein für die routinemäßige Spurenzuordnung älterer Entwicklungsstadien und ist damit Vorreiter auf dem Gebiet der forensischen Entomologie.
Modellierung der klimatischen Habitateignung verschiedener krankheitsübertragender Vektorarten
(2018)
Der Klimawandel hat einen starken Einfluss auf die Verbreitungsgebiete von Arten. Infolgedessen kann sich das Verbreitungsgebiet von Arten verschieben, einschränken oder ausweiten. Bei thermophilen Arten wird vermutet, dass sie von den klimatischen Änderungen profitieren und sie sich wahrscheinlich ausbreiten werden. Eine solche Ausbreitung, wozu auch die Einwanderung von gebietsfremden Arten zählt, hätte nicht nur zahlreiche Konsequenzen für diese Ökosysteme, sondern könnte sich auch zu einem ernsten Gesundheitsrisiko entwickeln, wenn es sich bei den einwandernden Neobiota um Vektorarten handelt.
Stechmücken und Sandmücken, als blutsaugende Insekten, zählen zu den bekanntesten Vektorarten. Sie sind in der Lage, eine Vielzahl von Infektionskrankheiten wie das Denguefieber oder das Gelbfieber, aber auch protozoische Parasiten wie "Leishmania"-Arten zu übertragen. Als thermophile Arten sind viele dieser Vektoren aktuell in ihrer Verbreitung weitgehend auf tropische und subtropische Gebiete beschränkt. Eine Einwanderung in gemäßigtere Gebiete kann zu einer Einschleppung der durch sie übertragenden Erreger führen und damit zum Ausbruch von Infektionskrankheiten. Aufgrund der medizinischen Relevanz dieser Arten ist es essentiell, die räumliche Verbreitung, sowie die abiotischen Ansprüche der Vektorarten zu kennen, um deren mögliche Ausbreitung nachzuvollziehen.
Vor diesem Hintergrund beschäftigte sich die vorliegende kumulative Dissertation mit den klimawandelinduzierten Änderungen der Habitateignung verschiedener medizinisch relevanter Vektorarten. Dabei wurden die zwei invasiven Stechmückenarten "Aedes albopictus" (I-III) und "Aedes japonicus" (III), sowie zehn in Europa bereits vorkommende Sandmückenarten der Gattung "Phlebotomus" (IV), untersucht. Die Arbeit basiert auf vier (ISI-) Publikationen. Unter Verwendung ökologischer Nischenmodellierung wurden geeignete Gebiete unter aktuellen und zukünftigen Klimabedingungen bestimmt. Um dabei sowohl räumliche als auch zeitliche Aspekte zu berücksichtigen, wurden mehrere räumliche Skalen (Deutschland und Europa), sowie Zeitperioden (2030, 2050 und 2070) betrachtet. Des Weiteren wurden verschiedene Ansätze (einzelne Algorithmen und Ensemble-Modelle) zur Modellierung der Habitateignung verwendet.
Die Ergebnisse dieser Dissertation zeigen eine zukünftige klimawandelbedingte Ausweitung der geeigneten Gebiete für viele der betrachteten Vektorarten. So konnte gezeigt werden, dass die Habitateignung für "Aedes albopictus" in Deutschland (I) und in Europa (III) zukünftig deutlich zunimmt. Auch für die Sandmückenarten "Phlebotomus alexandri", "Phlebotomus neglectus", "Phlebotomus papatasi", "Phlebotomus perfiliewi" und "Phlebotomus tobbi" konnte eine deutliche Zunahme der klimatisch geeigneten Gebieten projiziert werden (IV).
Lediglich Arten, wie die Asiatische Buschmücke "Aedes japonicus" (III) und auch kältetolerantere Sandmücken, wie "Phlebotomus ariasi" und "Phlebotomus mascittii" (IV) scheinen weniger von diesen klimatischen Veränderungen zu profitieren und könnten in Zukunft sogar aktuell geeignete Gebiete verlieren (klimawandelinduzierte Arealverkleinerung). Bei "Aedes japonicus" konnte dies auf eine engeren Nische mit einem Optimum bei vergleichsweise niedrigen Temperaturen zurückgeführt werden (III).
Am Beispiel von "Aedes albopictus" wurden ferner Umweltfaktoren identifiziert, die die Verbreitung der Art limitieren (II). Als wärmeliebende Art spielen bei "Aedes albopictus" in Mitteleuropa insbesondere die niedrigen Temperaturen eine Rolle, während in Zukunft die Sommertrockenheit in Südeuropa zunehmend eine Rolle spielen könnte.
Nischenmodellierung stellt trotz ihrer vereinfachenden Annahmen und Unsicherheiten, eine hilfreiche Methode zur Untersuchung klimawandelinduzierter Arealverschiebungen dar. Mit Hilfe der Modellierungsergebnisse konnten Gebiete mit einem hohen Etablierungsrisiko für die Vektorarten identifiziert werden, welche daher im Fokus künftiger Überwachungsprogramme stehen sollten. In Zukunft könnten mehr Vektorarten geeignete Bedingungen in Mitteleuropa finden, wodurch die Vektordiversität zunehmen wird. Dadurch könnte auch das Risiko für einen Ausbruch der durch die Vektoren übertragenen Krankheiten steigen.
Auch wenn das Vorhandensein eines kompetenten Vektors eine unerlässliche Voraussetzung für den Ausbruch einer Infektionskrankheit darstellt, gibt es noch weitere Faktoren, wie das Vorhandensein des Erregers. In Bezug auf die Risikoabschätzung vektorassoziierter Krankheiten sollten neben der Verbreitung des Vektors und des Erregers auch die abiotischen Bedingungen für die Entwicklung des Erregers berücksichtigt werden. Neben neu eingewanderten Arten sollten zudem auch die heimischen Arten in Bezug auf ihre Vektorkompetenz untersucht werden, da diese ebenfalls als potentielle Vektoren dienen und somit das Gesundheitsrisiko weiter erhöhen könnten.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden sRNAs des halophilen Archaeons Haloferax volcanii hinsichtlich ihrer biologischen und ihrer regulatorischen Funktion charakterisiert.
Um einen Überblick über die biologischen Funktionen archaealer sRNAs zu erhalten, wurde eine umfassende phänotypische Charakterisierung von 27 sRNA-Deletionsmutanten im Vergleich zum Wildtyp ausgewertet. Im Zuge dieser phänotypischen Charakterisierungen wurden zehn verschiedene Wachstumsbedingungen, morphologische Unterschiede und Veränderungen in der Zellmotilität untersucht. Hierbei zeigten nahezu alle Deletionsmutanten unter mindestens einer der getesteten Bedingungen phänotypische Unterschiede. Durch den Verlust von sRNAs wurden sowohl sogenannte Gain-of-function als auch Loss-of-function Phänotypen beobachtet. Haloarchaeale sRNAs spielen eine wichtige Rolle beim Wachstum mit verschiedenen Salzkonzentrationen, mit verschiedenen Kohlenstoffquellen und beim Schwärmverhalten, sind jedoch weniger in die Adaptation an diverse Stressbedingungen involviert.
Zur näheren Charakterisierung der regulatorischen Funktion archaealer sRNAs wurden sRNA362, sRNAhtsf468 und sRNA479 mittels molekulargenetischer Methoden wie Northern Blot-Analyse und DNA-Mikroarray sowie bioinformatischer in silico-Analyse untersucht. Das Expressionslevel von sRNA362 konnte bestimmt und potentielle Zielgene für sRNAhtsf468 und sRNA479 identifiziert werden.
Eine vorangegangene Studie zeigte den Einfluss von sRNA30 unter Hitzestress und führte zur Identifikation differentiell produzierter Proteine in Abwesenheit der sRNA. In dieser Arbeit wurde mittels Northern Blot-Analysen die Expression der sRNA30 charakterisiert. Das Wachstum in An- und Abwesenheit von sRNA30 wurde bei 42°C und 51°C phänotypisch charakterisiert und der regulatorische Einfluss der sRNA auf die mRNA differentiell regulierter Proteine durch Northern Blot-Analyse überprüft. Eine Transkriptomanalyse mittels DNA-Mikroarray nach Hitzeschock-Induktion führte zur Identifikation differentiell regulierter Gene involviert in Transportprozesse, Metabolismus, Transkriptionsregulation und die Expression anderer sRNAs. Die differentielle Regulation des Proteoms nach Hitzeschockinduktion in An- und Abwesenheit von sRNA30 konnte bestätigt werden.
Desweiteren wurde in dieser Arbeit sRNA132 und deren phosphatabhängige Regulation der Ziel-mRNA HVO_A0477-80 näher charakterisiert. Eine Induktionskinetik nach Phosphatentzug bestätigte die Bedeutung von sRNA132 für die verstärkte Expression des Operons HVO_A0477-80 unter Phosphatmangel-Bedingungen und verwies auf die Existenz weiterer Regulationsmechanismen. Während vor und nach Phosphatentzug kein Unterschied bezüglich der Zellmorphologie von Wildtyp und Deletionsmutante zu erkennen war, führte das Wachstum mit einem starken Phosphatüberschuss von 5 mM zu einer Zellverlängerung der Deletionsmutante. Die Kompetition der nativen 3‘-UTR des Operons HVO_A0477-80 mit einer Vektor-kodierten artifiziellen 3‘-UTR legt eine Regulation über die Bindung von sRNA132 an die 3‘-UTR nahe. Der Transkriptomvergleich nach Phosphatentzug in An- und Abwesenheit von sRNA132 führte zur Identifikation des Phosphoregulons der sRNA. Zu diesem Phosphoregulon gehören unter anderem zwei Glycerinphosphat-Dehydrogenasen, Transkriptionsregulatoren, eine Polyphosphatkinase und eine Glycerolphosphodiesterase. Zudem waren die Transkriptlevel der beiden ABC-Transporter HVO_A0477-80 und HVO_2375-8 für anorganisches Phosphat und des Transporters HVO_B0292-5 für Glycerinaldehyd-3-Phosphat in Abwesenheit der sRNA verringert. Die beiden ABC-Transportsysteme für anorganisches Phosphat wurden im Rahmen dieser Arbeit deletiert und weiter charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass das ABC-Transportsystem HVO_2375-8 bei geringen Phosphatkonzentrationen leicht induziert wird und das Transkriptlevel in Anwesenheit von sRNA132 erhöht ist. Wachstumsversuche der jeweiligen Deletionsmutante in direkter Konkurrenz mit dem Wildtyp zeigten, dass keiner der beiden ABC-Transporter den anderen vollständig ersetzen kann und der Wildtyp mit beiden intakten ABC-Transportern unter phosphatlimitierenden Bedingungen einen Wachstumsvorteil besitzt. In silico-Analysen der Promotorbereiche von sRNA und ABC-Transporter legen zudem die Existenz von P-Boxen nahe.
In der vorliegenden dreiteiligen Studie werden Mongolische Wüstenrennmäuse untersucht, deren Hörspektren im tieffrequenten Bereich und deren Unterscheidungsfähigkeiten von Kommunikationsrufen denen des Menschen ähneln. Die extrazelluläre Aktivität im primären auditorischen Kortex (AI) der narkotisierten Versuchstiere, evoziert durch Reintöne und arteigene Kommunikationsrufe, wird in der linken (LH) und rechten Gehirnhemisphäre (RH) aufgenommen. Es werden Multikanalelektroden (16 Eingangskanäle) verwendet, welche eine simultane Aufnahme der neuronalen Aktivitäten aller kortikalen Schichten ermöglichen. Zur Analyse der neuronalen Mechanismen werden Wellenformen einzelner Elektrodenkanäle und Aktivitätsprofile, bestehend aus den Wellenformen aller Elektrodenkanäle in einem Zeitfenster von 600 ms, auf Ebene von Aktionspotentialen (MUA), lokalen Feldpotentialen (LFP) und Current-source-density (CSD) Analysen, untersucht. Während MUAs die neuronalen Aktionspotentiale im Nahfeld der Elektrode reflektieren, umfassen die LFPs die summierten Potentiale (inhibitorisch und exzitatorisch) von Neuronen eines größeren Areals. Die CSDs hingegen werden durch die Integration von LFP-Wellenformen benachbarter, linear angeordneter Elektrodenkanäle berechnet und ermöglichen so eine Lokalisation der Ursprünge geräuschspezifischer Aktivitätsflüsse.
Im ersten Teilprojekt werden CSD-Profile in Antwort auf unterschiedliche Reintöne untersucht, um die Aktivitätskomponenten, die so genannten Sinks, für weiterführende Analysen zu quantifizieren. Es können zwei primäre (s1 und s2), drei mittlere (s3-s5) und vier späte (s6-s9) Sinks in einem Zeitfenster von 600 ms definiert werden. Eine Veränderung der Stimulusfrequenz eine Oktave über und unter der charakteristischen Frequenz (CF), beziehungsweise des Lautstärkepegels = 24 dB über der minimalen Schwelle, führt zu qualitativen Veränderungen in der CSD-Profilstruktur. Die Sink s7 wird durch Stimuli mit niedrigem Lautstärkepegel weniger verlässlich evoziert, wohingegen die Sink s9 bei Stimuli eine Oktave über der CF verlässlicher evoziert wird. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass im AI die spektralen Informationen eine Oktave über und unter der CF asymmetrisch integriert werden.
Auf Einzelschichtebene konnte bereits gezeigt werden, dass spektrotemporale Eigenschaften von Stimuli durch MUAs schlechter reflektiert wurden als durch LFPs, was vermutlich eine direkte Konsequenz der unterschiedlichen Ursprünge der Signaltypen ist. Daher werden im zweiten Teilprojekt die spezifischen Unterschiede der MUA-, LFP- und CSD-Antworten auf Ebene kortikaler Schichten und kompletter laminarer Profile untersucht, um die Unterschiede und den Informationsgehalt der drei Signaltypen zu charakterisieren. Signifikante Unterschiede, welche durch zwei Reintöne und sieben Kommunikationssignale evoziert werden, können verstärkt im mittleren und späten Latenzbereich und in granulären und infragranulären Schichten vorgefunden werden. Der Grad der Rufspezifizität ist in LFP und CSD-Antworten im Vergleich zu demjenigen in MUA-Antworten größer. Die Segregationsleistung ist im Vergleich zu einzelnen kortikalen Schichten in den von kortikalen Kolumnen abgeleiteten laminaren Profilen um den Faktor 1,8-2,6 erhöht. Die Neuronenpopulationen einzelner kortikaler Kolumnen sind vermutlich wichtig für die Kodierung von Geräuschen, welche sich in ihren spektrotemporalen Eigenschaften unterscheiden.
Viele vorangegangene Studien konnten zeigen, dass die Gehirnhemisphären akustische Signale asymmetrisch verarbeiten. Daher werden im dritten Hauptteil die laminaren Profile der LH und RH quantitativ und statistisch verglichen. Die MUA-, CSD-Profile und im geringeren Maße auch die LFP-Profile zeigen systematische Unterschiede auf signifikantem Niveau in der Dauer, Onset Latenz und vertikalen Ausdehnung bestimmter Aktivitäten. Kommunikationsrufe evozieren in der LH, welche beim Menschen auf Sprachstimuli spezialisiert ist, im Vergleich zur RH komplexere CSD-Profile. Die neuronale MUA-, LFP- und CSD-Aktivitätsstärke ist in der RH für weniger komplexe Stimuli teilweise signifikant erhöht. Die Asymmetrie in der Auftrittsverlässlichkeit der Sink s6 lässt vermuten, dass sich die intrakolumnäre Vernetzung in Schicht VIa zwischen der LH und RH unterscheidet. Die wenigen, signifikanten und nicht systematischen Unterschiede zwischen den Sink-Parametern der LH und RH nach kortikaler Ausschaltung mit dem GABAA-Rezeptor Agonist Muscimol weisen darauf hin, dass die Hemisphärenasymmetrie durch Prozesse des ipsilateralen Kortex maßgeblich beeinflusst wird.
Die Verarbeitung während des Hörprozesses von Säugetieren verläuft von der Kochlea mit den inneren und äußeren Haarsinneszellen (äHZ) über afferente Nervenbahnen bis zum auditorischen Kortex (AK). Die daran beteiligten Schaltstationen und deren Funktion sind überwiegend aufgeklärt. Die Hörbahn ist zudem in besonderer Weise durch efferente Rückkopplungen gekennzeichnet, die interne Modulationen sowie sekundäre Reaktionen auf den Reiz ermöglichen. Anatomisch betrachtet verlaufen efferente Projektionen vom AK zu sämtlichen am Hörprozess beteiligten Kerngebieten. Vom Olivenkomplex erfolgt über mediale und laterale Fasern eine Innervation der äHZ bzw. des Hörnervs. Trotz der gut beschriebenen Anatomie ist die funktionelle Beziehung zwischen dem AK und der Peripherie weitgehend ungeklärt. In der vorliegenden Arbeit wurde der funktionelle Zusammenhang vom AK zu den äHZ in der mongolischen Wüstenrennmaus untersucht. Dafür wurde entweder eine pharmakologische Blockierung der Kortexaktivität durch den Natriumkanalblocker Lidocain erzeugt oder eine Aktivierung der Kortexaktivität durch die Anwendung elektrischer Reize ausgelöst. Der Einfluss der Manipulationen wurde in der Kochlea mittels Messungen von Distorsionsprodukt-otoakustischen Emissionen (DPOAE) erfasst. Diese entstehen durch die nichtlineare Verstärkung leiser Schallsignale durch die äHZ zur Erzielung hoher Sensitivität und Frequenzauflösung. Die DPOAE treten als kubische (z. B. 2f1-f2) und quadratische (z. B. f2-f1) Verzerrungen auf und geben Aufschluss über unterschiedliche Parameter der äHZ-Verstärkungsfunktion.
Die Lidocainversuche wurden entweder kontra- oder ipsilateral zur DPOAE-Messung durchgeführt. In beiden Konstellationen traten nach der Lidocaininjektion Erhöhungen und Verringerungen der DPOAE-Pegel im Vergleich zur Basismessung oder unveränderte DPOAE-Pegel auf. Im Mittel lagen die Pegeländerungen bei ca. 11 dB, in Einzelfällen betrugen sie bis zu 44,8 dB. In den Gesamtdaten waren die Effekte nach kontralateraler Injektion oft signifikant größer als nach ipsilateraler Injektion. Ebenso waren die Effekte in der 2f1-f2 Emission meist signifikant größer als in der f2-f1 Emission. Zudem wurde beobachtet, dass signifikant größere Effekte bei einer Stimulation mit Pegeln von 60/50 dB SPL im Vergleich zu 40/30 dB SPL erreicht wurden. Grundsätzlich trat in allen Datensätzen eine Reversibilität der DPOAE-Pegel mit zunehmender Versuchsdauer auf. Die Effekte waren direkt nach der Injektion am größten und erreichten je nach Stimuluspegel und Emissionstyp nach 28-100 min die Basispegel. In keinem der Datensätze lag eine Abhängigkeit der im Kortex gereizten charakteristischen Frequenz (CF) zum betroffenen Frequenzbereich in der Kochlea vor. Die Effekte waren über den gesamten gemessenen Frequenzbereich von 1-40 kHz nachweisbar. Allerdings waren die Frequenzbereiche von 1-10 kHz und 30,5-40 kHz besonders stark von der Lidocaininjektion betroffen.
Auch nach der elektrischen Reizung wurden die drei oben beschriebenen Effekttypen definiert. Mit 54,6 % war der Prozentsatz unveränderter DPOAE-Pegel allerdings sehr hoch. In den anderen beiden Kategorien konnten zusätzlich Differenzierungen im zeitlichen Verhalten der DPOAE-Pegel vorgenommen werden. In 21,6 % bzw. 16,5 % der Datensätze waren die Verringerungen bzw. Erhöhungen bis zum letzten gemessenen Zeitpunkt nach der elektrischen Reizung irreversibel und nur in jeweils 2,8 % der Datensätze war eine Reversibilität zu verzeichnen. In diesen Fällen war die Effektdauer mit im Mittel 31 bzw. 25 min kürzer als in den Lidocainversuchen. Auch die Effektstärken waren mit maximal 23,9 dB und je nach Effekttyp im Mittel 5,1-13,7 dB geringer als nach der Lidocaininjektion. Die größten Effekte traten in einem mittleren Stimuluspegelbereich von 45-55 dB SPL auf. Wiederum konnte keine Abhängigkeit des betroffenen Frequenzbereichs von der kortikal gereizten CF nachgewiesen werden. In Einzelfällen waren auf DPOAE-Ebene nur die Frequenzen ober- und unterhalb der kortikalen CF beeinflusst, wohingegen bei der CF selbst keine Effekte auftraten.
Durch Kontrollexperimente (Salineinjektion bzw. Einführen der Elektrode ohne elektrische Reizung) konnte nachgewiesen werden, dass die Effekte durch die Manipulation der Kortexaktivität hervorgerufen wurden. Somit liegt eine funktionelle Beziehung zwischen dem AK und der Peripherie vor, die langanhaltende massive Ausmaße annehmen kann. Die Effektrichtung ist vermutlich durch die exzitatorisch oder inhibitorisch wirkenden Neurone vom Colliculus inferior zum Olivenkomplex bedingt. Die größeren Effekte in der kontralateralen Konfiguration lassen sich durch die Diskrepanz in der Anzahl der gekreuzten (2/3) und ungekreuzten (1/3) medialen Efferenzen erklären. Die kubischen Komponenten der äHZ-Verstärkungsfunktion scheinen stärker beeinflusst zu sein als die quadratischen Komponenten, was in größeren Pegeländerungen in der 2f1-f2 Emission resultiert. Die teils großen Effektstärken sowie die nicht vorhandene Frequenzabhängigkeit zwischen AK und Kochlea sind vermutlich auf den großen Kortexbereich zurückzuführen, der von den gewählten Injektionsvolumina bzw. elektrischen Reizstärken betroffen war. Die großen Effekte im mittleren Stimuluspegelbereich lassen sich sowohl mit einer möglichen Schutzfunktion der Efferenzen vor zu lauten Schallereignissen als auch mit einer Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses zur erleichterten Detektion akustischer Signale in Einklang bringen. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die Aktivität des AK einen starken Einfluss auf periphere auditorische Mechanismen hat, wodurch die kochleäre Verarbeitung akustischer Signale je nach kortikalem Verarbeitungsstatus massiv modifiziert werden kann.
Fossile Rohstoffe dienen in unserer heutigen Gesellschaft als Energiequelle und als Rohstofflieferant für Grund-, Feinchemikalien und Pharmazeutika. Sie tragen jedoch zum Klimawandel und Umweltverschmutzung bei. Lignocellulosische Biomasse ist eine erneuerbare und nachhaltige Alternative, die durch biotechnologische Prozesse erschlossen werden kann. Die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae ist ein sehr gut untersuchter Modellorganismus, für den es zahlreiche genetische Werkzeuge und Analysemethoden gibt. Zudem wird S. cerevisiae häufig in biotechnologischen Prozessen eingesetzt, da diese Hefe robust gegenüber industriellen Bedingungen wie niedrigen pH-Werten, toxischen Chemikalien, osmotischem und mechanischem Stress ist. Die Pentose D-Xylose ist ein wesentlicher Bestandteil von lignocellulosischer Biomasse, die aber nicht natürlicherweise von der Bäckerhefe verwerten werden kann. Für eine kommerzielle Herstellung von Produkten aus lignocellulosischer Biomasse muss S. cerevisiae D-Xylose effektiv verwerten. Für die Bäckerhefe konnten heterologe Stoffwechselwege etabliert werden, damit diese D-Xylose verwerten kann. Für eine effiziente Xyloseverwertung bleiben dennoch zahlreiche Herausforderungen bestehen. Unter anderem nehmen die Zellen D-Xylose über ihre endogenen Hexosetransporter nur langsam auf. Die heterologe Xylose-Isomerase (XI) besitzt in S. cerevisiae eine geringe Aktivität für die Isomerisierung von D-Xylose. Unspezifische Aldosereduktasen konkurrieren mit der Xylose-Isomerase um das gleiche Substrat und produzieren Xylitol, ein starker Inhibitor der Xylose-Isomerase. Eine Möglichkeit die Umsatzrate von Enzymen zu steigern und Substrate vor Nebenreaktionen zu schützen, ist die Anwendung von Substrate Channeling Strategien. Bei Substrate Channeling befinden sich die beteiligten Enzyme in einem Komplex, wodurch die Substrate lokal angereichert werden und von einem aktiven Zentrum zum nächsten weitergeleitet werden, ohne Diffusion in den restlichen Reaktionsraum. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob ein Komplex zwischen einem membranständigen Transporter und einem löslichen Enzym konstruiert werden kann, um durch Substrate Channeling eine verbesserte Substrat-Verwertung zu erreichen. Die Xylose-Isomerase aus C. phytofermentans und die endogene Hexose-Permease Gal2 sollten in dieser Arbeit als Modellproteine in S. cerevisiae-Zellen mit Hilfe von Protein-Protein-Interaktionsmodulen (PPIM) in räumliche Nähe zueinander gebracht werden.
Die Expression verschiedener PPIM konnte in S. cerevisiae mittels Western Blot nachgewiesen werden. Auch Fusionsproteine aus unterschiedlichen PPIM wurden in dieser Hefe exprimiert. Die PPIM binden komplementäre PPIM oder kurze Peptidliganden, welche an die Xylose-Isomerase und an den Gal2-Transporter fusioniert wurden. Die Funktionalität beider Proteine wurde mittels in vivo und in vitro Tests untersucht. Die Xylose-Isomerase mit N-terminalen Liganden des WH1-Protein-Protein-Interaktionsmoduls (WH1L-XI) und der Gal2-Transporter mit N-terminalen SYNZIP2-Protein-Protein-Interaktionsmodul (SZ2-Gal2) erwiesen sich als geeignete Kandidaten für weitere Untersuchungen. Mittels indirekter Immunfluoreszenz konnte die Ko-Lokalisierung von SZ2-Gal2 und WH1L-XI, die einander über ein Scaffold-Protein binden, nachgewiesen werden.
Transformanten, in denen ein Komplex aus Transporter, Scaffold-Protein und Xylose-Isomerase gebildet wurde, zeigten bessere Fermentationseigenschaften gegenüber der Scaffold-freien Kontrolle und dem Wildtyp: Sie verwerteten Xylose schneller, bildeten weniger vom unerwünschten Nebenprodukt Xylitol, produzierten mehr Ethanol und wiesen eine höhere Ethanolausbeute auf. Der beobachtete Substrate Channeling Effekt kompensierte die geringere Enzymaktivität der WH1L-XI im Vergleich zum Wildtyp-Protein. Die Wirksamkeit des Substrate Channeling wurde verringert, wenn die Bildung des Komplexes aus Transporter, Scaffold-Protein und Xylose-Isomerase gestört wurde, indem ein getaggtes GFP mit dem Scaffold-Protein um die Bindungsstelle an Gal2 konkurrierte. Dies zeigt, dass die positive Wirkung auf die Komplex-Bildung zwischen XI und Gal2 zurück zu führen ist. Die Fermentationseigenschaften konnten gesteigert werden, indem der zuvor zwischen SZ2-Zipper und Gal2-Transporter verwendete Linker, der aus zehn Aminosäuren von Glycin, Arginin und Prolin (GRP10) bestand, durch einen aus Glycin und Alanin (GA10) ersetzt wurde. Die verbesserten Fermentationseigenschaften beruhten auf einem Substrate Channeling Effekt und einer gesteigerten Aufnahmerate des SZ2-GA10-Gal2-Transporters. Ein Vergleich der Strukturvorhersagen von SZ2-GRP10-Gal2 und SZ2-GA10-Gal2 zeigte, dass der GRP10-Linker einen unstrukturierten, flexiblen Linker ausbildet, während der GA10-Linker eine starre α-Helix ausbildet. Die Struktur und der Transportprozess von Gal2 sind nicht aufgeklärt. Bei verwandten Transportern geht man davon aus, dass Substrate durch Konformationsänderungen ins Innere der Zelle transportiert werden, indem die beiden Domänen gegeneinander klappen. Die α-Helix könnte die Geschwindigkeit der Konformationsänderungen begünstigen.
Durch Kontrollexperimente konnte ausgeschlossen werden, dass die gesteigerten Fermentationseigenschaften eine Folge der Stabilisierung der XI- und Gal2-Fusionsproteine durch das Anfügen des Liganden oder durch Komplexbildung mit dem Scaffold-Protein waren. Substrate Channeling zwischen Gal2 und XI entsteht durch die Komplexbildung mit dem Scaffold-Protein, wodurch sich Gal2 und XI in räumlicher Nähe zueinander befinden. Dieser Effekt beruht möglicherweise zusätzlich aufgrund einer hohen örtlichen Ansammlung dieser Proteine, da die tetramere XI weitere Scaffold-Proteine binden könnte, welche weitere Gal2-Transporter binden könnte. Darüber hinaus sammeln sich Transporter an bestimmten Orten der Membran an und Transporter mit ähnlicher oder gleicher Transmembransequenz tendieren dazu zu ko-lokalisieren. Hierdurch könnten Gal2-XI-Agglomerate entstehen und Xylose wird mit hoher Wahrscheinlichkeit von einer der vielen Xylose-Isomerasen umgesetzt.
In dieser Arbeit wurde der Hefepilz Xanthophyllomyces dendrorhous als vielseitige biotechnologische Plattform für die Produktion von Carotinoiden verwendet. Durch genetische Modifikationen der Carotinoidbiosynthese wurde ein Astaxanthin-Hochproduzent zur Akkumulation des farblosen Phytoens, das die menschliche Haut vor der schädlichen Wirkung der UV-Strahlung schützt und des gelben Zeaxanthins, das zur Förderung und Erhalt der Sehfähigkeit beiträgt, befähigt. Zur Generierung eines Phytoen-Hochproduzenten wurde das Gen crtI (Phytoen-Desaturase) inaktiviert und der Phytoengehalt durch Überexpression der Gene HMGR, crtE und crtYB gesteigert. Die Generierung eines Zeaxanthin-Hochproduzenten beinhaltete die Inaktivierung des Gens asy (Astaxanthin-Synthase) und die heterologe Expression einer bakteriellen ß-Carotin-Hydroxylase CrtZoXd.
Die Inaktivierung der Gene erfolgte mit spezifischen Knock-Out-Konstrukten, die mittels homologer Rekombination in crtI oder asy integrierten. Nachdem die Transgene auf Vektoren mit verschiedenen Antibiotikaresistenzen kloniert wurden, wurde die Überexpression durch genomische Integration in die ribosomale DNA erreicht. Anschließend wurde die Carotinoidzusammensetzung der Zellextrakte durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie an einer C18-Trennsäule oder durch Dünnschichtchromatographie bestimmt. Der Knock-Out-Nachweis erfolgte mittels Polymerase-Kettenreaktion und Amplifikation der Genloci, während die Anzahl integrierter Carotinoidgene durch quantitative Real-Time-PCR bestimmt wurde. Die Kultivierungen von X. dendrorhous wurden sowohl in Schikanekolben als auch in einem 2L-Bioreaktor durchgeführt.
Im Zuge der genetischen Modifikationen konnte der Ploidiegrad des Wildtyps bestimmt werden, der bis dahin unbekannt war. Durch das Auftreten von instabilen heterozygoten Stämmen und deren Überführung zu stabilen Homozygoten wurde die Existenz eines diploiden Genoms nachgewiesen. Um die für die biotechnologische Anwendung notwendige Stabilität der Carotinoidbiosyntheseleistung zu erreichen, wurden zwei Strategien entwickelt. Hierbei erfolgte die Stabilisierung der Stämme als Folge mitotischer Rekombination nach Subkultivierung und anschließender Farbselektion oder durch Induktion des sexuellen Zyklus und Sporulation.
Der crtI-Knock-Out führte zur Akkumulation von 3,6 mg/g dw Phytoen. Anschließend wurde die Limitierung der Phytoensynthese durch crtYB-Überexpression aufgehoben und die Versorgung der Carotinoidbiosynthese mit Vorläufermolekülen durch HMGR- und crtE-Überexpression erhöht. Im Bioreaktor wurde durch die Anwendung eines dreistufigen Fed-Batch-Prozesses, der eine effiziente Glucoseverwertung sicherstellte, mit 10,4 mg/g dw die höchste bis dato publizierte zelluläre Phytoenkonzentration im stabilisierten Hochproduzenten erreicht.
Der asy-Knock-Out führte zur Akkumulation von 4,5 mg/g dw ß-Carotin, das anschließend durch heterologe Expression der codon-optimierten ß-3,3-ß-Hydroxylase crtZoXd im Hochproduzenten zu 3,5 mg/g dw Zeaxanthin umgesetzt wurde. Zur Optimierung des Vorgehens wurden Knock-In-Konstrukte entwickelt, mit denen beide Schritte (Knock-Out und Integration von Carotinoidgenen) in nur einem molekular-biologischen Schritt durchgeführt und 94 % des in einem Wildtypstamm vorhanden ß-Carotins zu Zeaxanthin umgesetzt wurden. Die Optimierung der Wachstumsbedingungen bei der Bioreaktor-Kultivierung des stabilisierten Zeaxanthinproduzenten führte mit 10,8 mg/L zu einem 5-fach höheren Zeaxanthingehalt im Vergleich zur Schikane-Kultivierung.
Durch den Einsatz der Pentosen Arabinose und Xylose als alternative Kohlenstoffquellen wurde der Carotinoidgehalt der Phytoen- und Zeaxanthin-Hochproduzenten um 70 bzw. 92 % im Vergleich zur Glucose-Kultivierung gesteigert, wobei die Gründe für diesen Effekt in einer stärkeren Kohlenstoffverwertung und der Hemmwirkung von Glucose vermutet wurden. Aus verschiedenen pflanzlichen Abfallstoffen kann Xylose durch Hydrolyse freigesetzt werden, deren Nutzung zum Aufbau einer nachhaltigen und kostengünstigen biotechnologischen Carotinoidproduktion beitragen kann.
Darüber hinaus wurden multioxigenierte Zeaxanthinderivate, von denen eine positive Wirkung auf die menschliche Gesundheit vermutet wird, durch kombinatorische Biosynthese erhalten. Durch die schrittweise Integration der Gene crtZoXd, crtG (ß-2,2-Hydroxylase) und bkt (ß-4,4-Ketolase) in eine ß-Carotinmutante wurde die Biosynthese von Zeaxanthin, Nostoxanthin und schließlich von 4-Keto-Nostoxanthin und 4,4-Diketo-Nostoxanthin erreicht. Anschließend erfolgte die chemische Reduktion zu den neuartigen Carotinoiden 4-Hydroxy-Nostoxanthin und 4,4-Dihydroxy-Nostoxanthin und der zweifelsfreie Nachweis aller vier Carotinoide anhand der mittels Massenspektrometrie bestimmten Molekülmassen und Fragmentierungsmuster.
Die mitochondriale Innenmembran (IM) besteht aus zwei Subkompartimenten. Der Cristae Membran (CM) und der inneren Grenzmembran (IBM), welche durch die runden und schlitzartige Strukturen der Christa Junctions (CJs) verbunden werden Der MICOS-Komplex ist an den CJs lokalisiert und besteht aus mindestens 6 Komponenten, Mic60, Mic27, Mic26, Mic19, Mic12 und Mic10. Es ist bekannt, dass der MICOS-Komplex essentiell für die Stabilität der CJs ist. Die in dieser Arbeit gezeigten Ergebnisse, geben Aufschluss darüber, wie sich einzelne MICOS-Komponenten auf die Stabilität von Cristae und CJs im Modellsystem Hefe (S cerevisiae) auswirken. Zu Beginn dieser Arbeit war zum einen bekannt, dass die MICOS-Komponente Mic60 essentiell für die Bildung von CJs ist. Zum Anderen wurden im Vorfeld dieser Arbeit Interaktionen von Mic60 mit Proteinen in der mitochondrialen Außenmembran, vor allem Proteinkomplexe mit β-barrel-Proteinen identifiziert. Diese Interaktionen werden über den evolutionär, konservierten C-Terminus von Mic60 vermittelt.
β-barrel Proteine besitzen eine charakteristische Peptidsequenz, die β-Sequenz. Diese dient nach dem Import der β-barrel Proteine in die Mitochondrien als Signalpeptid für den SAM-/TOB-Komplex, welcher daraufhin die Proteine in die Außenmembran insertiert. In dieser Arbeit wurde ebenfalls eine β-Sequenz im C-Terminus von Mic60 identifiziert, diese zeigte einen Einfluss auf die Cristae-Stabilität. Zellen die eine Mic60-Variante mit einer Deletion oder Punktmutation der β- Domäne exprimieren, zeigten eine reduzierte Anzahl an CJs. Auch das Verkürzen des C-Terminus von Mic60 hatte diesen Effekt auf die mitochondriale Ultrastruktur. So konnte gezeigt werden, dass die β-Domäne und die Integrität des C-Terminus essentiell für die Stabilität von CJs sind.
Der Fokus dieser Arbeit lag in der Charakterisierung der MICOS-Komponenten Mic26 und Mic27. Es konnte bewiesen werden, dass beide Proteine genetisch mit der MICOS-Kernkomponente Mic60 interagieren. Die Untersuchung der mitochondrialen Ultrastruktur von Δmic26- und Δmic27-Zellen zeigte, dass eine Deletion vom Mic26 keinen Einfluss auf die Organisation der mitochondrialen Innenmembran hat. Im Gegensatz dazu, ist im Vergleich zum Wildtyp die Anzahl an CJs in Δmic27-Zellen um zwei Drittel reduziert. Auch die Innenmembranoberfläche ist in diesen Zellen stark vergrößert. Die Untersuchung der Morphologie der mitochondrialen Innenmembran in Zellen ohne Mic27 durch Kryo-Elektronentomographie isolierter Mitochondrien, veranschaulichte die Struktur der CJs in diesen Zellen genauer. Es zeigten sich hier breitere CJs, und der Übergang von der Cristaemembran in den Bereich der inneren Grenzmembran ist sehr flach und undefiniert. In Wildtyp-Mitochondrien waren die CJs schmal und schlitzartig und haben einen scharfkantigen Übergang von der Cristaemembran zur inneren Grenzmembran. Des Weiteren wies die Cristaemembran in Δmic27-Zellen unregelmäßige zackige Strukturelemente auf, was auf eine Anhäufung an Dimeren der F1FO-ATP Synthase hinweist.
Diese Beobachtungen in den Kryo-Tomogrammen, wurde durch Analysen des Oligomerisierungszustands der F1FO-ATP Synthase in Δmic27-Zellen, bestätigt. Hier fanden sich deutlich weniger höhere Oligomere und vermehrt Dimere. So kann aus diesen Befunden geschlossen werden, dass Mic27 die Oligomere der F1FO-ATP Synthase stabilisiert.
Um zu untersuchen, wie der MICOS-Komplex mit der F1FO-ATP Synthase in Verbindung steht, wurde mittels 2D-BNE-Analysen und einem Complexome Profiling die Komplexierung der nativen Komplexe in Wildtyp- und Δmic27-Mitochondrien analysiert. Zum einen konnte durch diese Untersuchungen gezeigt werden, dass Mic27 neben der F1FO-ATP Synthase auch stabilisierend auf den MICOS-Komplex wirkt. Die Komplexe im hochmolekularen Bereich der MICOS-Komponenten zerfielen in Δmic27-Zellen, was darauf hinweist, dass die anderen MICOS-Komponenten hier nicht mehr assemblieren können. Mic10 war die einzige MICOS-Komponente die in Δmic27-Zellen noch stabile Komplexe im hohen Massenbereich ausbildete. Mic10 findet sich zudem nicht nur in Klustern mit anderen MICOS-Komponenten sondern auch mit der F1FO-ATP Synthase.
Die Interaktion von Mic10 und der F1FO-ATP Synthase wurde auch biochemisch, mittels chemischer Quervernetzern und Ko-Immunpräzipitationsexperimenten bestätigt. Dies legt nahe, dass Mic10 die CJs mit hoher Wahrscheinlichkeit, durch die Verbindung mit der F1FO-ATP Synthase, mit der Cristaemembran verbindet und so stabilisiert.
Aufgrund der Erkenntnisse dieser Arbeit konnte ein neuartiges Modell postuliert werden. Die MICOS-Komponente Mic60 stabilisiert die CJs durch eine Interaktion seines C-Terminus mit Proteinen in der Außenmembran. Mic27 vermittelt über Mic10 die Interaktion zur F1FO-ATP Synthase. Somit ist diese neu identifizierte Interaktion des MICOS-Komplex zur F1FO-ATP Synthase essentiell für die Stabilität von CJs ist, indem es den MICOS-Komplex mit den Oligomeren der F1FO-ATP Synthase verbindet.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, vor- und nachbereitenden Unterricht zu Biodiversitätsführungen an den vier außerschulischen Lernorten Palmengarten, Senckenbergmuseum, Stadtwaldhaus und Zoo Frankfurt zu evaluieren. Durch den Unterricht mithilfe neu entwickelter Arbeitsmaterialien sollte die aktuelle Motivation der Schüler und weitere pädagogisch-psychologische Lernvariablen gefördert werden. Es stellte sich die Frage, ob so eine erhöhte Auseinandersetzung mit dem Themenkomplex Biodiversität erreicht werden kann und welche Einflussfaktoren dabei eine Rolle spielen.
Theoretische Grundlage war dabei das Risikowahlmodell der Leistungsmotivation nach Atkinson, das von Rheinberg zum handlungstheoretischen Modell der Motivation erweitert wurde (Rheinberg & Vollmeyer, 2012). Auf dieses bezieht sich der von Rheinberg et al. (2001) entwickelte und hier eingesetzte Fragebogen zur aktuellen Motivation (FAM).
Die Stichprobe setzte sich aus insgesamt 523 Schülern der Klassen 5 bis 9 zusammen. Davon nahm jeweils die Hälfte mit (Versuchsgruppe) und die andere ohne (Kontrollgruppe) vor- und nachbereitendem Unterricht an den Biodiversitätsführungen teil. Die Erhebung der aktuellen Motivation, des erworbenen Fachwissens und weiterer Variablen erfolgte in einem Pre/Post/Follow-Up-Design mit Fragebögen, deren Auswertung analytisch statistisch durgeführt wurde.
Es zeigte sich, dass in der Gesamtstichprobe die Teilnahme an der Biodiversitätsführung die aktuelle Motivation der Schüler erhöhte. Dauerhafte Lernparameter wie die Biologieeinstellung und die Interessenshandlung wurden jedoch nicht signifikant verändert. Ein eindeutiger Effekt der unterrichtlichen Vorbereitung konnte jedoch nicht ermittelt werden. Einzig beim gemessen Fachwissen zu den Führungsinhalten schnitt die Versuchsgruppe signifikant besser ab. Insgesamt wird angenommen, dass der Effekt des Besuchs des außerschulischen Lernortes an sich den Effekt der Vor- und Nachbereitung überdeckt oder vom Einfluss anderer Parameter beeinflusst wird. Hier stach besonders das Alter der Jugendlichen hervor, das vor allem in der hier evaluierten Schülergruppe bedingt durch die Pubertät eine große Rolle spielt. Weitere Einflussfaktoren waren die Biologieeinstellung und die Unterrichtsvariablen der Führung. In den Stichproben der einzelnen außerschulischen Lernorte zeigten sich leichte Abweichungen von der Gesamtstichprobe. Diese waren meist auf die leicht unterschiedliche Zusammensetzung der Stichproben zurückzuführen. Aber auch Besonderheiten der Lernorte hatten dabei ein bedeutendes Gewicht.
Bezüglich der Lernbedingungen für die Lernorte ließen sich aus den Ergebnissen vor allem zwei Komponenten ermitteln: Zum einen die Architektur/räumliche Struktur der Lernorte. Hier können Faktoren wie drinnen/ draußen, Größe und die räumliche Orientierung unterschieden werden. All dies hat Auswirkungen auf das physische Wohlbefinden der Schüler, was wiederum eine Voraussetzung für eine hohe Lernmotivation ist. Die andere Hauptkomponente ist das am Lernort behandelte Thema. Hier kann grob zwischen Pflanzen und Tieren unterschieden werden. Pflanzen wurden dabei in mehreren Studien von den Schülern als weniger attraktiv eingeschätzt. Trotzdem sollten aber die Möglichkeiten, auch botanische Themen außerhalb der Schule zu behandeln, von den Lehrkräften zur Vermittlung biologischer Vielfalt genutzt werden.
Als Konsequenz der Ergebnisse kann der Besuch eines außerschulischen Lernrotes im Biologieunterricht bezüglich der Förderung der Lernmotivation unbedingt empfohlen werden. Da kein klarer Effekt des vor- und nachbereitenden Unterrichts der Biodiversitätsführungen erkennbar war, wären hier weitere Untersuchungen vonnöten, um genauere Aussagen machen zu können. Hier böten sich Studien mit Schülern anderer Altersgruppen und der Vergleich nur zweier außerschulischer Lernorte an.
In der vorliegenden Arbeit werden funktionale Details der Okklusion während der Mastikation bei ausgewählten fossilen und rezenten Primaten quantitativ vergleichend untersucht. Dazu wurden die Okklusionsflächen von antagonistischen Molarenpaaren mit modernen virtuellen Verfahren eingescannt und anhand von 3D Kronenmodellen kartiert und funktional ausgewertet. Die in der Forschergruppe DFG FOR 771 entwickelte Software „Occlusal Fingerprint Analyser“ (OFA) kam erstmals bei einer großen Stichprobe von Primaten zum Einsatz.
Aus dem ursprünglichen tribosphenischen Molarentyp der frühen eozänen Primaten haben einige Nahrungsspezialisten im Laufe der Evolution Modifikationen entwickelt um ihre Nahrung mechanisch besser aufzubereiten. So sind neue Funktionselemente auf den Molaren entstanden, wie z.B. ein distolingualer Höcker (Hypoconus) auf den Oberkiefermolaren.
Die Auswertung der Parametermessungen, wie die Facettenlage und -größe, der Okklusale Kompass, der Mastikationskompass und die Messungen der Okklusionsreliefs ergaben, dass die basalen Primatenvertreter aus dem Eozän einen flachen Hypoconus als vergrößerte Fläche zum Quetschen der Nahrung genutzt haben. Das weist auf eine frugivore Nahrungspräferenz hin. Der distolinguale Höcker ist unter den rezenten Spezies mit insektivorer Nahrungspräferenz besonders häufig ausgebildet. Es konnte gezeigt werden, dass eine zweite Kauphase, die nach der maximalen Verzahnung mit der Öffnung des Kiefers eintritt, unter den rezenten Strepsirrhini mit Hypoconus nur sehr schwach ausgeprägt ist.
Eine weitere evolutionäre Modifikation sind buccolingual ausgerichtete komplementäre Kantenpaare auf den Molaren, die sogenannte Bilophodontie, die sich in der Familie der Cercopithecidae entwickelt hat. Die Unterfamilie der Colobinae zeigt eine besonders stark reliefgeführte Okklusion und hat deshalb während der Mastikation weniger Bewegungsspielraum als die der Cercopithecinae. Die zweite Kauphase der Cercopithecinae ist gegenüber den folivoren Colobinae zum Teil auffällig verlängert. Da die Colobinae Vormagenverdauer und die Cercopithecinae Monogastrier sind, kann vermutet werden, dass die Zahnmorphologie eng mit der entsprechenden chemischen Verdauungsweise verknüpft ist. Das dryopithecine Höckermuster der Hominoidea hat eine wesentlich flachere Höckermorphologie als die bilophodonten Molaren. Daher war ein höherer Bewegungsspielraum während der Mastikation beobachtbar. Es konnte gezeigt werden, dass steilere Facetten bei den folivoren Nahrungsspezialisten zu finden sind, wie den Colobinae bei den bilophodonten, oder den Gorillas unter dem dryopithecinen Molarentyp. Mit einem flacheren Molarenrelief kann auf ein breiteres Nahrungsspektrum zugegriffen werden.
Mit den OFA-Analysen und den Ergebnissen der Quantifizierung des Kronenreliefs von rezenten und fossilen Primatenzähnen konnte in der vorliegenden Untersuchung eine relevante Vergleichsbasis für ein funktionelles Verständnis der Evolution der vielfältigen Kronenformen bei Primaten erarbeitet werden. Für zukünftige Studien sollte die innerartliche Stichprobe erweitert werden um die Variabilität näher zu untersuchen.
Bei Cryptochromen handelt es sich um Blaulichtrezeptoren der Cryptochrom-Photolyase-Proteinfamilie (CPF). Mitglieder dieser Proteinfamilie sind in allen Domänen des Lebens zu finden und haben eine essentielle Rolle in der Reparatur der DNA sowie der lichtgesteuerten Regulation der Expression. Cryptochrome sind in der Regel keine DNA-reparierenden Proteine. Sie sind regulativ an der Steuerung der inneren Uhr und des Zellzyklus der Organismen beteiligt. In der Kieselalge Phaeodactylum tricornutum konnten bisher sechs phylogenetisch unterschiedliche Mitglieder der CPF identifiziert werden. Bei CryP handelt es sich um das einzige pflanzenähnliche Cryptochrom der photoautotrophen Diatomee. Für das Protein CryP konnte bereits ein blaulichtinduzierter Photozyklus durch die Absorption der Chromophore 5-Methenlytetrahydrofolat (MTHF) und Flavinadenindinukleotid (FAD) gezeigt werden. Außerdem ist eine regulative Wirkung des Proteins auf die Lichtsammelkomplexe (Lhc) der Diatomee bekannt. Für eine weitere Charakterisierung des CryPs wurde in dieser Arbeit zunächst das Absorptionsverhalten unter verschiedenen Wellenlängen beobachtet, um so einen Einblick in eine mögliche Aktivierung und Deaktivierung des Proteins durch Licht unterschiedlicher Wellenlängen zu erlangen. Es zeigte sich hierbei eine mit pflanzlichen Cryptochromen vergleichbare Anreicherung verschiedener Redoxzustände des FADs in Abhängigkeit von der Wellenlänge.
Für eine Aufklärung der Wirkungsweise des CryP-Proteins wurden verschiedene Hypothesen untersucht: Die phylogenetische Nähe und ein ähnliches Absorptionsverhalten des CryPs zu Cryptochromen mit Reparaturfähigkeit für einzelsträngige DNA (Cry-DASH) führte zu einer Untersuchung des Proteins als möglicher Transkriptionsfaktor. Hierfür konnte eine Kernlokalisation des Proteins nachgewiesen werden, was Rückschlüsse auf eine potentielle Regulation der Expression mittels DNA-Bindung zulässt. Außerdem wurde gezeigt, dass CryP DNA-Bindefähigkeit besitzt. Die bisher nachgewiesenen Bindungen waren jedoch unspezifischer Art. Dies konnte auch für die Promotersequenz eines der durch CryP regulierten Gene lhcf1 festgestellt werden. Auf Grund der unspezifischen DNA-Bindung wurde eine zweite Hypothese für CryP untersucht: CryP wirkt regulativ auf die Expression verschiedener Gene durch Protein-Protein-Interaktionen und ist Teil einer Reaktionskaskade zur Signalweiterleitung in P. tricornutum.
Durch die Untersuchung der zweiten Hypothese konnten drei Interaktionspartner für CryP identifiziert und eine Interaktion verifiziert werden. Hierbei handelt es sich um das Protein AAA mit einer bisher unbekannten Funktion und das Protein BolA, welches Teil der zuerst in Escherichia coli identifizierten BolA-like-Proteinfamilie ist. Außerdem konnte eine Interaktion mit dem Cold-Shock-Domänen-Protein CSDP gezeigt werden. Bei den Proteinen BolA und CSDP handelt es sich um potentiell regulierende Faktoren der Transkription und Translation, was Teil einer Reaktionskaskade sein kann. Die aus anderen Organismen bekannten Funktionen des BolA-Proteins überschneiden sich mit den in CryP-Knockdown-Mutanten beobachteten Effekten. Sie zeigen eine erhöhte Sensitivität für Stresssituationen wie abweichende Nährstoffkonzentration, Osmolaritäten und Temperaturen. Diese Beobachtungen stellen einen Zusammenhang der durch einen CryP-Knockdown beobachteten Effekte und der CryP-BolA-Interaktion her. Durch Homologien zu Cold-Shock-Proteinen aus Chlamydomonas reinhardtii gibt die CryP-Interaktion mit dem Protein CSDP Hinweise auf einen potentiellen Mechanismus zur Regulation der Lhc-Proteine, für welche zuvor ein CryP-abhängiger Effekt beschrieben war.
Über die Protein-Protein-Interaktionen hinaus wurde die Phosphorylierung des CryPs als Möglichkeit der Signalweiterleitung untersucht. Es konnte eine reversible Phosphorylierung des heterolog aus E. coli isolierten CryPs gezeigt werden. Diese zeigt Ähnlichkeiten zu bekannten Phosphorylierungen pflanzlicher Cryptochrome und gibt Hinweise auf einen Mechanismus der Signalweiterleitung.
Durch die Untersuchung der CryP-regulierten Transkription mit P. tricornutum CryP-Knockdown-Mutanten durch Next-Generation-Sequencing (NGS) konnte die Hypothese der regulativen Proteinkaskade und der Signalweiterleitung weiter bestätigt werden. Die Auswirkungen des CryPs auf die Transkription erwiesen sich als nicht auf einen Teilbereich des Metabolismus begrenzt, sondern sind in einem großen Teil der funktionellen Gengruppen in P. tricornutum zu sehen. Außerdem konnten drei Klassen CryP-regulierter Gene festgestellt werden. Kategorie 1: die ausschließlich unter Blaulicht regulierten Gene; Kategorie 2: die sowohl unter Blaulicht als auch im Dunkeln regulierten Gene und Kategorie 3: die ausschließlich im Dunkeln regulierten Gene. Ein im Dunkeln und unter Blaulicht jeweils unterschiedlicher regulativer Effekt deutet auf eine Doppelfunktion des CryPs hin. Möglicherweise hat das Cryptochrom unterschiedliche lichtabhängige und lichtunabhängige Funktionen.
Durch die Analyse der CryP-regulierten Genexpression konnte außerdem ein Zusammenhang zwischen CryP und weiteren Photorezeptoren gezeigt werden. Der CryP-Proteingehalt in der Zelle hat einen regulativen Einfluss auf das CPF1-Protein, eine Photolyase mit dualer Funktion aus der gleichen Proteinfamilie. Zusätzlich konnte auch ein Einfluss auf die Lichtsensitivität der Genexpression des Rotlichtrezeptors Phytochrom (DPH) durch CryP gezeigt werden. Vergleichbar mit höheren Pflanzen scheint ein regulatives Netzwerk der Photorezeptoren auch in der Diatomee P. tricornutum vorhanden zu sein.
Es wird davon ausgegangen, dass das ehemalige Larven-Mikrohabitat der Asiatische Tigermücke Aedes albopictus (synonym: Stegomyia albopicta) die Phytotelmata in den Waldgebieten von Südostasien darstellte. In den letzten vier Jahrzehnten adaptierte sich die Art jedoch an urbanere Regionen und ihre Antrotelmata. Dank ihrer Eigenschaft, Eier mit einer gewissen Trocken- und Kältetoleranz zu produzieren, verbreitete sich die Art zusammen mit den international gehandelten Waren weltweit. Zudem ist Ae. albopictus ein theoretischer Vektor für mindestens 27 Viren sowie Parasiten und spielt eine Hauptrolle bei der Übertragung von Dengue-Viren und Chikungunya-Viren und Zika-Vieren. Daher wird die Art als große Gefahr für die öffentliche Gesundheit betrachtet.
Die vorliegende Arbeit thematisiert drei Untersuchungen zum Anpassungs- und Etablierungs-potential der invasiven Asiatischen Tigermücke.
In einem ersten Ansatz wurde das Problem behandelt, dass es lediglich zwei standardisierte toxikologische Testverfahren für Culicidae gab. Daher wurde ein Dosis-Wirkungs-Testsystem entwickelt, das den Weg für weitere biologische Endpunkte und ihre integrativen Parameter freimachte und dadurch ein besseres Verständnis für die Wirkweisen von Insektiziden ermöglicht. Hierdurch konnte nun der Frage nachgegangen werden, ob es Unterschiede in der ökotoxikologischen Reaktion zwischen der invasiven tropisch-subtropischen Asiatischen Tigermücke und der einheimischen nördlichen Hausstechmücke Culex pipiens auf das Insektizid λ-Cyhalothrin gibt. Weiter wurde der Einfluss von Temperatur und die Verfügbarkeit von Nahrung auf die Insektizidsensitivitäten der Arten getestet. Schließlich konnte in einer Risikobewertung festgestellt werden, dass bei falsch angewendeten Bekämpfungsmaßnahmen höhere Temperaturen sowie der Ausfall von aquatischen Top-Prädatoren zu Fitnessvorteilen für die Art führen können.
In einer zweiten Untersuchung wurde der Mechanismus der Kältetoleranz der Eier (Kälteakklimatisierung und Diapause) näher untersucht, da dieser für die erfolgreiche Invasion in gemäßigten Breitengraden verantwortlich gemacht wird. Nachdem eine lang vorherrschende Hypothese verworfen wurde, dass die Einlagerung von Polyolen die Frosttoleranz bewirken würde, war der aktuelle Stand der Wissenschaft, dass eine Verdickung der Wachsschicht des Chorions dafür verantwortlich sei. Jedoch lag keine detaillierte Evaluierung von Stechmücken-Eihüllen vor. Mittels einer transmissionselektronenmikroskopischen Studie konnte gezeigt werden, dass nicht nur die Wachsschicht nicht in der Serosa-Cuticula zu verorten ist, sondern im Endochorion und sie zudem im Zuge der Diapause in der Mächtigkeit schrumpft. Daher wird auf Basis der gewonnenen Erkenntnisse auf eine Kompaktierung der Schicht geschlossen.
Die dritte Untersuchung schließlich hatte das hohe Adaptationspotential in gemäßigten Breiten zum Gegenstand. Eine Adaptation auf genetischen Level gilt als unwahrscheinlich, da Gründerpopulationen in den neu besiedelten Gebieten eine niedrige genetische Diversität aufwiesen und ein regelmäßiger Neueintrag von Allelen unwahrscheinlich ist. Jedoch bietet das Konzept der epigenetischen Temperatur-Adaptation einen Erklärungsansatz für dieses Phänomen. Daher wurde die Frage gestellt, ob es möglich ist, eine vererbbare Diversifizierung dieses kältetoleranten Phänotyps nach einer randomisierten epigenetischen Behandlung der DNA zu detektieren. Es wurde eine transgenerationale Untersuchung der Effekte von zwei epigenetischen Agenzien (und einem Lösemittel) auf die Kältetoleranz der Eier durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten ein Korrelationsmuster, das den durch die Agenzien veränderten Methylierungsgrad der DNA mit der Forsttoleranz verband, was die gestellte Hypothese unterstützte.
In Folge dieser drei Untersuchungen wurde festgestellt, dass Ae. albopictus ein hohes Potential hat, in weiteren Ländern – vor allem in gemäßigten Breiten – ein Gesundheitsrisiko darzustellen. Da die Art einerseits Fitnessvorteile durch falsche Bekämpfungsmaßnahmen und andererseits möglicherweise eine hohes epigenetisches Adaptationspotential besitzt, kann zusammenfassend empfohlen werden, dass der Fokus für weitere Forschung maßgeblich auf der Entwicklung von Impfstoffen für die übertragenen Viren und Pathogene liegen sollte. Dadurch kann die Bevölkerung geschützt werden, ohne Ökosysteme und ihre Dienstleistungen zu gefährden, und dies wäre zudem ökonomisch gesehen die effektivere Lösung.
In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals die Interaktion von A. baumannii mit humanem Plasminogen untersucht. Mit dem Translations-Elongationsfaktor TufAb, dem äußeren Membranprotein OmpW sowie dem Lipoprotein p41 konnten insgesamt drei Plasminogen-bindende Proteine von A. baumannii identifiziert werden. Außerdem wurde ein grundlegender Beitrag zur funktionellen Charakterisierung von TufAb sowie p41 von A. baumannii erbracht.
Es konnte nachgewiesen werden, dass gereinigtes TufAb humanes Plasminogen bindet und diese Interaktion teilweise durch Lysin-Reste vermittelt und von der Ionenstärke beeinflusst ist. An TufAb-gebundenes Plasminogen war für den Plasminogen-Aktivator u-PA zugänglich und konnte zu Plasmin aktiviert werden, welches das chromogene Substrat S-2251, das physiologische Substrat Fibrinogen und die zentrale Komplementkomponente C3b proteolytisch spaltete. Schließlich konnte TufAb als „Moonlighting“-Protein auf der Zelloberfläche von A. baumannii identifiziert werden.
Für das Lipoprotein p41 konnte ebenfalls gezeigt werden, dass dieses an Plasminogen bindet. Die Bindung von Plasminogen an p41 erfolgte ebenfalls über Lysin-Reste, zeigte sich allerdings von der Ionenstärke unbeeinflusst. Im Fall von p41 konnte mit Hilfe von C-terminal verkürzten p41-Konstrukten gezeigt werden, dass C-terminale Lysin-Reste an der Bindung von Plasminogen beteiligt sind. Weitere Versuche mit p41-Proteinen, bei welchen vier C-terminale Lysin-Reste durch Alanin-Reste substituiert wurden, ergaben, dass die beiden Lysin-Reste K368 und K369 essentiell für die Bindung von Plasminogen an p41 sind. Zudem konnte gezeigt werden, dass sowohl Kringle-Domäne 1 als auch Kringle-Domäne 4 von Plasminogen bei der Interaktion mit p41 involviert sind. An p41 gebundenes Plasminogen ließ sich durch u-PA zu Plasmin aktivieren, welches Fibrinogen sowie die zentrale Komplementkomponente C3b degradierte. p41 ist außerdem in der Lage, die Komplementkomponenten C3, C3b und C5 zu binden und den alternativen Weg zu inhibieren. Zudem ergaben Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit erste Hinweise darauf, dass zumindest die Plasminogen-bindende Region auf der Zelloberfläche von A. baumannii lokalisiert ist.
Die Inaktivierung des p41-kodierenden Gens führte zu einer signifikanten Abnahme im Überleben von A. baumannii-Zellen in der Gegenwart von NHS. Zudem zeigte die Mutante Δp41 einen Defekt in der Plasmin-abhängigen Transmigration durch einen Endothelzell-Monolayer. Beide Versuche untermauern die physiologische Relevanz für die Interaktion von A. baumannii mit Plasminogen.
Heutzutage unterliegen insbesondere aquatische Ökosysteme durch den permanenten Anstieg nicht-heimischer Arten einem folgenreichen Wandel. Dabei stellt der Biodiversitätsverlust nur den Endpunkt einer biologischen Invasion dar. Dazwischen wirken sich Faktoren wie Konkurrenz-, Prädationsdruck oder die Übertragung von Krankheitserregern wie z.B. Parasiten auf den Rückgang der Arten aus. Als integraler Bestandteil eines jeden Ökosystems spielen Parasiten bei Invasionsprozessen eine entscheidende Rolle und können durch ihren Einfluss auf heimische und nicht-heimischen Arten Invasionen begünstigen. Fische übernehmen aufgrund ihrer vielseitigen Bedeutung im Nahrungsnetz eine Schlüsselfunktion als Wirte diverser Parasitenarten und sind deshalb ausgezeichnete Untersuchungsobjekte, um durch nicht-heimische Arten verursachte Veränderungen in Nahrungsnetzstrukturen oder Parasitenfaunen aquatischer Ökosysteme aufzudecken.
Vor diesem Hintergrund wurde die vorliegende kumulative Dissertation angefertigt, welche auf drei (ISI-) Einzelpublikationen basiert. Die Arbeit beschäftigte sich unter Verwendung morphologischer und molekularbiologischer Methoden schwerpunktmäßig mit der Parasitendiversität und Nahrungsökologie zweier eingeschleppter Fischarten in stark anthropogen beeinflussten deutschen Fließgewässern. Dabei handelte es sich um die hauptsächlich durch das Ballastwasser von Schiffen verbreitete invasive Schwarzmundgrundel Neogobius melanostomus aus den Flüssen Rhein und Main sowie den von Hobby-Aquarianern in den durch Industrieabwässer thermisch belasteten Gillbach ausgesetzten Zebrabuntbarsch Amatitlania nigrofasciata. Unter Berücksichtigung nahrungsökologischer und räumlich-zeitlicher Aspekte sollten die parasitologischen Risiken und Konsequenzen, welche durch das Einschleppen nicht-heimischer Fischarten auftreten, aufgezeigt werden, um übergeordnet die Folgenabschätzung auf dem Gebiet der Invasionsbiologie zu verbessern. Das Nahrungsspektrum beider Fischarten wies sowohl räumliche (zwischen den Flüssen und Standorten), als auch zeitliche (monatlich) Variationen auf, was die Anpassungsfähigkeit bzw. die optimale Nutzung zur Verfügung stehender Ressourcen von invasiven Arten verdeutlicht. Ebenso wurden Unterschiede in der Parasitierung nachgewiesen, was die Notwendigkeit räumlicher und zeitlicher Analysen zur Erfassung der vollständigen Parasitenfauna einer invasiven Art, inklusive aller Variationen der Befallszahlen, unterstreicht. Beide Fischarten bilden zudem Zwischenwirte für heimische, als auch nicht-heimische Parasitenarten, wobei die direkte Einschleppung von nicht-heimischen Parasiten aus dem ursprünglichen Verbreitungsgebiet der Fische auszuschießen ist und somit die Enemy-Release-Hypothese (Verlust ursprünglicher Gegenspieler wie Prädatoren oder Parasiten) unterstützt. Dies könnte zusammen mit der opportunistischen Ernährungsweise ein Grund für die starke Ausbreitung sowie die anhaltend hohen Individuenzahlen dieser Arten im jeweils betrachteten Verbreitungsgebiet (Rhein, Main sowie Gillbach) sein.
Besonders hervorzuheben ist der Nachweis der nicht-heimischen Nematoden Anguillicoloides crassus und Camallanus cotti. Durch die Aufdeckung einer besonderen Form von Hyperparasitismus konnten erstmalig hohe Befallszahlen von A. crassus in N. melanostomus dokumentiert werden. Die hoch abundante Grundelart gilt somit potentiell als entscheidender Überträger des invasiven Parasiten auf den Europäischen Aal. Der durch seine hohe Virulenz in der Aquaristik bekannte C. cotti gelangte durch das Aussetzen von Zierfischen in den Gillbach und trat mit hohen Befallszahlen in A. nigrofasciata auf und wird bereits auf die heimische Fischfauna übertragen (z.B. auf den Gründling Gobio gobio und den Döbel Squalius cephalus). Ebenso ist der starke Befall der heimischen Parasiten Pomphorhynchus sp. (Acanthocephala) und Raphidascaris acus (Nematoda) bei N. melanostomus sowie A. anguillae (Acanthocephala) bei A. nigrofasciata zu nennen. Durch die zusätzliche Wirtfunktion der Neozoen und die hohen Befallsintensitäten ist mit einem verstärkten Spillback-Effekt (Rückinfizierung) auf heimische Fischarten zu rechnen.
Die stetig steigende Anzahl biologischer Invasionen führt zu immer weitreichenderen Veränderungen heimischer Ökosysteme. Für den Erhalt der Biodiversität sowie einhergehender Ökosystemfunktionen rückt auch die Forschung über Neobiota immer mehr in den Mittelpunkt. In diesem Zusammenhang gewinnen auch Pathogene wie Parasiten immer mehr an Bedeutung, welche durch gebietsfremde Arten eingeschleppt werden und die bestehende Biodiversität gefährden können. Die Ergebnisse der durchgeführten Studien haben gezeigt, dass die Verknüpfung von parasitologischen und nahrungsökologischen Untersuchungen Einblicke in die hoch dynamischen Prozesse der Invasionsbiologie geben können, was ein Vorantreiben der Forschung und Folgenabschätzungen auf diesem Gebiet ermöglicht.
Die vorliegende Studie vermittelt einen epidemiologischen Überblick über das mit Haut- und Nagelläsionen assoziierte Pilzspektrum im Westen Panamas. Hierzu wurden Proben von vermutlich durch Pilzinfektionen verursachten Haut- sowie Nagelläsionen gesammelt und zum Anlegen von Kulturen verwendet. Die isolierten Pilze wurden basierend auf dem D-H-S System (Rieth), anhand morphologischer Merkmale, rDNA Sequenzdaten sowie phylogenetischen Analysen klassifiziert und mit Hilfe von Literaturdaten sowie physiologischen Eigenschaften als saprotrophe, opportunistische oder pathogene Organismen beurteilt. In Panama wurden 52 Proben von 51 Personen gesammelt, wobei das Material von 42 Haut- und Nagelläsionen der Füße, vier Läsionen der Fingernägel, zwei Chromomykosen, einer Tinea nigra und drei sonstigen Hautläsionen stammt. Bei 75 Prozent (n = 39) der Proben konnten Pilze kultiviert und insgesamt 201 Pilzstämme isoliert und subkultiviert werden. Hiervon wurden 50 Isolate (24,9 %) als Dermatophyten, 24 Stämme (11,9 %) als Hefen und 127 Isolate (63,2 %) als Schimmelpilze klassifiziert. Bei 19 Probanden (48,7 %) konnten Dermatophyten isoliert werden, wobei aus dem Probenmaterial von 12 Personen (63,2 %) ebenfalls andere Pilzarten nachgewiesen wurden. Von zwei Läsionen (5,1 %) wurden nur Hefen isoliert, wobei einmal eine Schwarze Hefe kultiviert wurde. In dem Material acht weiterer Proben (20,5 %) wurden Schimmelpilze und Hefestämme nachgewiesen und bei zehn Probanden (25,6 %) konnten aus dem Probenmaterial nur Schimmelpilze kultiviert werden. 172 Isolate wurden taxonomisch klassifiziert und 44 Arten aus 25 Gattungen, 17 Familien, 15 Ordnungen, sechs Klassen sowie den Abteilungen Ascomycota oder Basidiomycota zugeordnet. Die Ascomyceten stellen mit 164 Stämmen 40 verschiedener Arten aus 23 Gattungen, 15 Familien, 11 Ordnungen und vier Klassen die am häufigsten isolierte und vielfältigste Gruppe dar, während die Basidiomycota nur mit acht Isolaten vier verschiedener Arten zwei unterschiedlicher Gattungen, Familien, Ordnungen und Klassen nachgewiesen wurden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden in Panama die anthropophilen Dermatophyten Trichophyton rubrum und T. interdigitale dokumentiert, wobei T. rubrum die am häufigsten isolierte Art darstellt. Kultivierte Hefen waren Candida albicans, C. duobushaemulonii, C. tropicalis, Hortaea werneckii, Sporobolomyces sp., Trichosporon asahii, T. japonicum und T. montevideense. Die Schimmelpilze stellen die größte und ökologisch diverseste Organismengruppe der kultivierten Pilze dar. So wurden von den untersuchten Läsionen sowohl humanpathogene Erreger, als auch opportunistische Arten und rein saprotrophe Pilze sowie mehrere Vertreter wahrscheinlich bisher nicht wissenschaftlich beschriebener Arten bzw. Gattungen nachgewiesen. Aus dem Probenmaterial wurden die Pilze Acremonium collariferum, Aspergillus awamori, A. clavatus, A. flavus, A. giganteus, A. heteromorphus, A. niger, A. ochraceus, A. sclerotiorum, A. versicolor, Chaetomium globosum, Chrysosporium tuberculatum, Cladosporium sphaerospermum, C. tenuissimum, Curvularia geniculata, C. lunata, Fonsecaea pedrosoi, Fusarium oxysporum, F. solani, Lophotrichus bartlettii, Microascus cinereus, Neoscytalidium dimidiatum, Penicillium commune, Scolecobasidium sp., Scopulariopsis carbonaria, S. croci, Verticillium cf. epiphytum und Wardomycopsis litoralis isoliert. Zudem wurden vier Isolate von zwei vermutlich neuen Arten der Gattung Acremonium (Bionectriaceae, Hypocreales), zwei Stämme mit einer genetischen Affinität zu der Gattung Cryptendoxyla (Cephalothecaceae, Sordariales) und jeweils ein mit den Gattungen Fusicladium (Venturiaceae, Venturiales), Knufia (Trichomeriaceae, Chaetothyriales) bzw. Rhexothecium (Eremomycetaceae, Dothideomycetidae) assoziierter Stamm kultiviert. Im Rahmen dieser Studie wurden A. giganteus, C. tenuissimum, L. bartlettii, S. carbonaria, S. croci, V. epiphytum und W. litoralis erstmalig von Mykosen des Menschen dokumentiert und die in der Literatur als Verursacher sowie Besiedler von Haut- und Nagelläsionen beschriebenen Organismen A. clavatus, A. flavus, A. niger, A. ochraceus, C. tropicalis, C. globosum, C. sphaerospermum, C. lunata, F. oxysporum, M. cinereus, P. commune, T. asahii, T. japonicum und T. montevideense wurden das erste Mal in klinischem Probenmaterial aus Panama nachgewiesen. Die Arten A. awamori, A. heteromorphus, C. globosum, C. tenuissimum, L. bartlettii, M. cinereus, P. commune, S. croci, T. asahii, T. japonicum, T. montevideense, V. epiphytum, W. litoralis und die Gattung Scolecobasidium wurden zudem erstmalig für Panama dokumentiert. Die Isolation von W. litoralis ist ebenfalls der erste Nachweis dieses Pilzes außerhalb von Spanien und auf dem amerikanischen Kontinent. Die große Anzahl im Rahmen dieser Arbeit beschriebener, bisher für die Wissenschaft unbekannter bzw. nicht in Panama dokumentierter Pilzarten lässt auf eine große mykologische Biodiversität in Panama schließen und zeigt den Bedarf weiterer Forschung.