Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
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Research in cell and developmental biology requires the application of three-dimensional model systems that reproduce the natural environment of cells. Processes in developmental biology are therefore studied in entire systems like insects or plants. In cell biology, three-dimensional cell cultures (e.g. spheroids or organoids) model the physiology and pathology of cells, tissues or organs. In all systems, the cellular neighborhood and interactions, but also physicochemical influences, are realistically presented. The production and handling of these model systems is rather simple and allows for reproducible characterization.
Confocal and light sheet-based fluorescence microscopy (LSFM) enable the observation of these systems while maintaining their three-dimensional integrity. LSFM is applicable to imaging live samples at high spatio-temporal resolution over long periods of time. The quality of the acquired datasets enables the extraction of quantitative features about morphology, functionality and dynamics in the context of the complete system. This approach is referred to as image-based systems biology. Exploiting the potential of the generated datasets requires an image analysis pipeline for data management, visualization and the retrieval of biologically meaningful values.
The goal of this thesis was to identify, develop and optimize modules of the image analysis pipeline. The modules cover data management and reduction, visualization, reconstruction of multiview image datasets, the segmentation and tracking of cell nuclei and the extraction of quantitative features. The modules were developed in an application-driven manner to test and ensure their applicability to real datasets from three-dimensional fluorescence microscopy. The underlying datasets were taken from research projects in developmental biology in insects and plants, as well as from cell biology.
The datasets acquired in fluorescence microscopy are typically complex and require common image processing steps in order to manage, visualize, and analyze the datasets. The first module accomplishes automatic structuring of large image datasets, reduces the data amount by image cropping and compression and computes maximum projection images along different spatial directions. The second module corrects for intensity variations in the generated maximum projection images that occur as a function of time. The program was published as a part of an article in Nature Protocols. Another developed module named BugCube provides a web-based platform to visualize and share the processed image datasets.
In LSFM, samples can be rotated in-between two acquisitions enabling the generation of multiview image datasets. Prior to my work, Frederic Strobl and Alexander Ross acquired the complete embryogenesis of the red flour beetle, Tribolium castaneum, and the field cricket, Gryllus bimaculatus, with LSFM. I evaluated a plugin for the software FIJI as a module for the reconstruction of such datasets. The plugin was optimized for automation and efficiency. We obtained the first high quality three-dimensional reconstructions of Tribolium and Gryllus datasets.
Optical clearing increases the penetration depth into samples, thus providing endpoint images of entire three-dimensional objects with cellular detail. This work contributes a quantitative characterization module that was applied to endpoint images of optically cleared spheroids. A program for the generation of ground truth datasets was developed in order to evaluate the cell nuclei segmentation performance. The program was part of a paper that was published in BMC Bioinformatics. Using the program, I could show that the cell nuclei segmentation is robust and accurate. Approaches from computational topology and graph theory complete the segmentation of cell nuclei. Thus, the developed module provides a comprehensive quantitative characterization of spheroids on the level of the individual cell, the cell neighborhood and the whole cell aggregate. The module was employed in four applications to analyze the influence of different stress conditions on the morphology and cellular arrangement of cells in spheroids. The module was accepted for publication in Scientific Reports along with the results for one application. The cell nuclei segmentation further provided a data source for simulation models that used correlation functions to identify structural zones in spheroids. These results were published in Royal Society Interface.
The final part of this work presents a module for cell tracking and lineage reconstruction. In collaboration with Dr. Alexis Maizel, Dr. Jens Fangerau and Dr. Daniel von Wangenheim, I developed a module to track the positions of all cells involved in lateral root formation in Arabidopsis thaliana and used the extracted positions for extensive data analysis. We reconstructed the cell lineages and established the first atlas of all founder cells that contribute to the formation. The analysis of the retrieved data allowed us to study conserved and individual patterns in lateral root formation. The atlas and parts of the analysis presented in this thesis were published in Current Biology.
In this thesis, I developed modules for an image analysis pipeline in three-dimensional fluorescence microscopy and applied them in interdisciplinary research projects. The modules enabled the organization, processing, visualization and analysis of the datasets. The perspective of the image analysis pipeline is not restricted to image-based systems biology. With ongoing development of the image analysis pipeline, it can also be a valuable tool for medical diagnostics or industrial high-throughput approaches.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Dynamik zweier grundlegend verschiedener, deaktivierender Mechanismen von Retinalproteinen untersucht. In einem dritten Projekt wurde die Photodynamik einer Dreifachmutante von visuellem Rhodopsin erforscht, von der eine Mutation zu kongenitaler (angeborener) Nachtblindheit führt und zwei andere Mutationen das Protein über eine Disulfidbrücke stabilisieren. Die Ergebnisse dieser drei Projekte sind im Folgenden zusammengefasst.
Die Aktivität des mikrobiellen Proteorhodopsins als lichtgetriebene Protonenpumpe kann photoinduziert unterbunden werden. Dies erfolgt durch die Absorption von blauem Licht durch das Retinal bei deprotonierter Schiff‘schen Base. Vor dieser Arbeit war allerdings nur wenig über den Mechanismus und die Kinetik dieses Effekts bekannt. Das einzige Retinalprotein, an dem diese Deaktivierungsdynamik auf molekularer Ebene zeitaufgelöst untersucht wurde, ist Bakteriorhodopsin. Doch auch an diesem System wurde die ultraschnelle Primärreaktion in der photoinduzierten Deaktivierungsdynamik - die Photoisomerisierung des 13-cis-Retinals - bisher nicht zeitaufgelöst gemessen.
In dieser Arbeit wurde ein Weg gefunden, diesen Prozess auf einer Sub-Pikosekundenzeitskala zu detektieren. Dazu wurde eine Proteorhodopsinmutante genutzt, in der der primäre Protonendonor E108 durch Glutamin ersetzt ist. Diese Mutante weist eine signifikante Erhöhung der Lebensdauer des M-Intermediats auf. Im photostationären Gleichgewicht führt diese veränderte Kinetik zu einer erheblich erhöhten Akkumulation des Proteins im M-Zustand, die ausreicht, um photoinduzierte Absorptionsänderungen der Deaktivierungsdynamik sowohl im sichtbaren als auch im mittleren Infrarotbereich auf ultrakurzer Zeitskala zu detektieren. Dieses Projekt erfolgte in Kooperation mit dem Arbeitskreis Glaubitz (Goethe-Universität Frankfurt am Main).
Es zeigte sich, dass die Anregung des Retinals von Proteorhodopsin im M-Zustand zur Isomerisierung von 13-cis zu all-trans führt, die nach wenigen Pikosekunden abgeschlossen ist. Der zweite und abschließende Schritt ist die Reprotonierung der Schiff'schen Base. Es stellte sich heraus, dass dieser Prozess auf einer Nanosekundenzeitskala abläuft und über einen Protonentransfer vom primären Protonenakzeptor D97 zur Schiff'schen Base ermöglicht ist.
Die in dieser Arbeit vorgestellte Methodik zur Untersuchung der deaktivierenden Photodynamik von Proteorhodopsin auf ultraschneller Zeitskala, könnte in Zukunft auf weitere mikrobielle Rhodopsine angewandt werden. So ist die Studie der Deaktivierungsdynamik von Channelrhodopsinen von großem Interesse für optogenetische Anwendungen. Eine lichtgesteuerte Kontrolle der Ionenkanalöffnung und -schließung sollte die Präzision in der Regulierung ionischer Permeation erheblich verbessern.
Die Proteorhodopsinmutante E108Q wurde außerdem in ihrer primären Photodynamik sowohl bei grünem als auch blauem Anregungslicht untersucht. Es zeigte sich in beiden Fällen eine Dynamik, die der des Wildtyps sehr ähnlich ist. Eine Beobachtung unterscheidet sich jedoch wesentlich vom Wildtyp. Das K-Intermediat der E108Q-Mutante scheint nach einigen hundert Pikosekunden zumindest partiell zu zerfallen, woraufhin sich eine Signatur im blauen Spektralbereich bildet. Blitzlichtphotolysemessungen lassen vermuten, dass diese blau absorbierende Species im zwei- bis dreistelligen Nanosekundenbereich wieder zerfallen sein muss.
Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit dem Photozerfall von visuellem Rhodopsin. Es ist bekannt, dass die Signaltransduktion durch Wechselwirkung zwischen aktiviertem Rhodopsin und Arrestin unterbunden wird. Im ersten Abschnitt wurde der Einfluss der Arrestin-1-Variante p44 auf die Photodynamik visuellen, bovinen Rhodopsins untersucht. In einer Kooperation mit dem Arbeitskreis Schwalbe (Goethe-Universität Frankfurt am Main) konnte gezeigt werden, dass Arrestin erheblichen Einfluss auf die Zerfallsdynamik von Meta II und Meta III hat. Es wurde festgestellt, dass die Wechselwirkung von p44 mit photoaktiviertem Rhodopsin eine erhöhte Population des Intermediats Meta III bewirkt, mit der Folge einer zweifach langsameren Freisetzungskinetik des all-trans-Retinals. Diese Beobachtung weist auf eine physiologische Rolle des Zustands Meta III in der Retinalhomöostase hin.
Gegenstand einer zweiten Studie mit dem Arbeitskreis Schwalbe ist zum einen die Rhodopsinmutation G90D, die mit kongenitaler (angeborener) stationärer Nachtblindheit zusammenhängt, und zum anderen die Doppelmutation N2C und D282C, die zur Ausbildung einer stabilisierenden Disulfidbrücke zwischen den im extrazellulären Bereich eingeführten Cysteinen führt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Photodynamik des Wildtyps, der Doppelmutante und der stabilisierten G90D-Mutante (Mutationen G90D, N2C und D282C) sowohl auf einer ultrakurzen Zeitskala als auch auf einer Minutenskala untersucht.
Structural biology often employs a combination of experimental and computational approaches to unravel the structure-function paradigm of biological macromolecules. This thesis aims to approach this combination by the application of Pulsed Electron-Electron Double Resonance (PELDOR/DEER) spectroscopy and structural modelling. In this respect, PELDOR spectroscopy in combination with site-directed spin labelling (SDSL) of proteins is frequently used to gain distance restraints in the range from 1.8 to 8 nm. The inter-spin distance and the flexibility of the spin labelled protein domains are encoded in the oscillation and the dampening of the PELDOR signal. The intrinsic flexibility of the commonly used MTSSL (1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrroline-3-methyl) spin label itself can be an obstacle for structural modelling if the flexibility of the label is large compared to the flexibility of the protein domains. In this thesis the investigation of two multi-domain proteins by the 4-pulse PELDOR sequence is presented. At first, the N-terminal polypeptide transport-associated (POTRA) domains of anaOmp85, a rigid three domain protein, giving well-defined PELDOR distance restraints, is investigated. The experimental restraints are used for structure refinement of the X-ray structure and reveal a strong impact of the intrinsic flexibility of MTSSL on the accuracy of structural refinement. The second example, K48-linked diubiquitin, is a highly flexible multi-domain protein on which the flexibility of MTSSL is of minor impact on structural modelling. In this case, the distance restraints are utilized to determine conformational ensembles. Due to the high intrinsic flexibility already characterizing diubiquitin the recently developed 7-pulse Carr-Purcell (CP) PELDOR sequence was applied to investigate longer ubiquitin chains. This sequence enables to measure dipolar oscillations with an extended time window, allowing a good separation between inter- and intramolecular contributions even for long distance and broad conformational distributions, thereby providing an increased accuracy of the obtained distance distributions.
This thesis reports on the results obtained by expression photoactivatable adenylyl cyclase from Beggiatoa spp. (bPAC) in cholinergic neurons from Caenorhabditis elegans (C. elegans) and the characterization of the role of a single neuron, RIS, during locomotion in the adult animal.
Pharmacological activation of adenylyl cyclases through Forskolin is known to induce increased neuronal output in diverse model organisms through a protein kinase A (PKA) dependent mechanism. Nevertheless, pharmacological assays are not spatially restricted, do not allow for precise and acute activation nor to cessation of the signal. Thus, an optogenetic approach for was selected trough the expression of photoactivatable adenylyl cyclase from Beggiatoa spp. (bPAC) in cholinergic neurons of Caenorhabditis elegans (C. elegans). This model organism was chosen due to its transparency, ease of maintenance, fast generation cycles as well as for being an eutelic animal. Further, its genome has been fully sequenced and the connectome of the neuronal network is known, thus allowing for precise analysis of neuronal function. Furthermore, the molecular mechanisms governing neuronal functions are well conserved up to primates. Mainly two optogenetical tools were applied, bPAC and the light gated cation channel channelrhodopsin 2 (ChR2).
Behavioral assays of bPAC photostimulation in cholinergic neurons recapitulated previous work performed with the photoactivatable adenylyl cyclase from Euglena gracilis (EuPACa), in which swimming frequency and speed on solid substrate were increased. Electrophysiological recordings of body wall muscle (BWM) cells by Dr. Jana F. Liewald showed that bPAC photoactivation led to an increase in miniature postsynaptic current (mPSC) rate and, in contrast to ChR2 invoked depolarization, also amplitude. Analysis of mutants deficient in neuropeptidergic signaling (UNC- 31) via electrophysiology performed by Dr. Jana F. Liewald showed that the increase in mPSC amplitude due to bPAC photoactivation requires neuropeptide release. This was confirmed by co-expression of bPAC with the neuropeptide marker NLP-21::Venus and subsequent fluorescence analysis of release, exploiting the fact that released neuropeptides are ultimately degraded by scavenger cells (coelomocytes). These were enriched with NLP-21::Venus after bPAC photostimulation, but no fluorescence could be observed in the UNC-31 mutants.
Additional analysis of the electrophysiological data performed by myself showed no modulation of mPSC kinetics dues to neuropeptidergic release induced by bPAC. Hence, neuropeptide release and action sites were in the cholinergic neurons, the latter including cholinergic motoneurons.
Dr. Szi-chieh Yu provided electron microscopy images of high pressure frozen, bPAC or ChR2 expressing animals. These were tagged by myself for automatic analysis of ultrastructural properties of the cholinergic presynapse, also during photoactivation of both optogenetic tools. Photoactivation of both induced a reduction of synaptic vesicles, with ChR2 showing a more severe effect. In contrast to ChR2, though, bPAC also reduced the amount of dense core vesicles (DCV), the neuropeptide transporters. Additionally, long bPAC photoactivation as well as ChR2 photoactivation led to the appearance of large vesicles (LV), presumably in response to the increased SV fusion rate. bPAC photostimulation also induced an increase in SV size, not observed after ChR2 photostimulation. In UNC-31 mutants, bPAC photostimulation could not lead to the SV size increase, a further argument for the presynaptic effect of the released neuropeptide. Additional analysis of electrophysiology paired with pharmacology, performed by Dr. Jana F. Liewald, showed that mPSC amplitude increase requires the function of the vesicular acetylcholine transporter.
A further effect observed in the ultrastructure of bPAC photostimulated cholinergic presynapses was a shift in the distribution of SV regarding the dense projection. An analysis of cAMP pathway mutants showed that synapsin is required for bPAC induced behavior effects. Synapsin is known to mediate SV tethering to the cytoskeleton. Here, I show evidence for a new role of synapsin in controlling the availability of DCVs for fusion and thus, in neuropeptidergic signaling.
In the second part of my thesis I characterized the function of the GABAergic interneuron RIS in the neuronal network of C. elegans. RIS was shown to induce lethargus, a sleep-like state, during all larval molts, but its function in the adult animal was not yet described. Specific RIS expression of ChR2 achieved by a recombinase based system allowed to acutely depolarize the neuron during locomotion, which led to an acute behavioral stop. Diverse signal transduction pathway mutants were analyzed showing that the phenotype was induced by neuropeptidergic signaling. Through mutagenesis followed by whole genome sequencing data analysis as well as analysis of RIS specific RNA sequencing data further narrowed the signal transduction pathway to mediate the locomotion stop behavior. Since the neuropeptide and, to some extent, the neuron are conserved across nematodes, an argument is outlined in favor of the conservation of this sleep-like state.
In addition, since ChR2 could induce neuropeptidergic signaling from RIS, secretion of vesicles is regulated by variable pathways depending on the neuronal identity. Nevertheless, expression of bPAC in RIS allowed to optogenetically increase the probability of short stops, as observed by expression of a calcium sensor (GCaMP) in RIS and analysis of its intrinsic activity in the adult animal.
Taxonomy, phylogeny and zoogeography of the hexaploid Torini of the Middle East and North Africa
(2017)
Fishes of the tribe Torini Karaman, 1971 (Teleostei: Cyprinidae) are a diverse group of primary freshwater fishes, distributed in Africa, the Middle East, and Indomalaya. They are an important component of the native freshwater-fish fauna of the Middle East and North Africa, and occur in most large river systems of the Levant, Arabia, Mesopotamia, southern Iran, and Morocco. They belong to the subfamily Cyprininae, are characterised by being tetraploid or hexaploid, having large scales, and a smooth and ossified last unbranched ray in the dorsal fin. As primary freshwater fishes they are not able to tolerate marine conditions and depend on direct freshwater connections for their dispersal. This makes them an ideal model for zoogeographic studies.
Prior to this study, the diversity of the Torini species in the Middle East and North Africa was not well understood. The validity of several genera and species was unclear, and the generic assignment of several species changed frequently.
In this PhD project the taxonomy, phylogeny, and zoogeography of the Torini of the Middle East and North Africa were investigated with morphological, as well as molecular methods. More than 1550 fish specimens were examined morphologically. Some of the specimens, including the types of most nominal species, were already available from museum collections. The remaining specimens were collected during expeditions to Ethiopia, Iran, Jordan, Morocco and Syria. Tissue samples were collected for molecular genetic analyses. The mitochondrial genes for cytochrome b, NADH dehydrogenase subunit 4 and the tRNAs for serine and histidine were sequenced from more than 120 specimens, representing 20 species of Torini and two small, diploid African barbs (Cyprinidae, tribe Smiliogastrini). Molecular data were analysed with Bayesian inference and other methods.
The analyses confirmed that the hexaploid Torini of Africa and the Middle East form a monophyletic group. In the Middle East and North Africa the Torini are represented by the genera Arabibarbus, Carasobarbus, Mesopotamichthys, and Pterocapoeta. These genera are each morphologically diagnosable, monophyletic, and genetically distinct. The species 'Labeobarbus' reinii cannot be assigned to any of these genera, because it is morphologically dissimilar and genetically clearly separated from each of them. A generic name for this species is presently not available and until the description of a new genus it is preliminarily assigned to the genus 'Labeobarbus'.
Out of the 28 species-group taxa described from the Middle East and North Africa until now, 15 are valid: Arabibarbus arabicus, A. grypus, A. hadhrami, Carasobarbus apoensis, C. canis, C. chantrei, C. exulatus, C. fritschii, C. harterti, C. kosswigi, C. luteus, C. sublimus, Mesopotamichthys sharpeyi, Pterocapoeta maroccana, and 'Labeobarbus' reinii.
The phylogenetic relationships between the Middle Eastern and North African Torini are well resolved, based on the analysis of mitochondrial DNA sequences from nearly all relevant species.
The interspecific and intraspecific morphological and genetic diversity is shaped by the zoogeographic history. Conclusions can be drawn about the events that shaped the evolution of this group. The Torini originated in the Indomalayan biogeographical realm and colonised the Middle East and Africa during the Miocene via the Gomphotherium landbridge. The Indomalayan Torini are tetraploid, whereas those of the Middle East and Africa are hexaploid. Molecular phylogenetic analyses showed that the hexaploid Torini cluster within the tetraploid Torini. This makes the tetraploid Torini a paraphyletic group with respect to the hexaploid Torini. Morocco was colonised in two independent waves. The first came from sub-Saharan Africa and is represented by Pterocapoeta maroccana. The second originated in the Middle East and gave rise to C. fritschii, C. harterti, and probably 'L.' reinii. The Tigris-Euphrates system is the largest freshwater system in the Middle East. Its central position between the Orontes River and Jordan River in the West, the Iranian tributaries to the Persian Gulf in the East, and the Arabian Peninsula in the South made it an important crossroad for the colonisation of the Middle East by Torini and other freshwater biota. During the Miocene the predecessors of the Jordan and Orontes rivers were connected to the Tigris-Euphrates system. The Jordan River was separated from the Euphrates before the Orontes. Arabia was colonised in two waves. The first (A. arabicus, A. hadhrami, C. exulatus) dates to the Pliocene, whereas the second (C. apoensis) ended as recently as the late Pleistocene or early Holocene.
The process of urbanization is one of the major causes of the global loss of biodiversity; however, cities nowadays also have the potential to serve as new habitats for wildlife. The European rabbit (Oryctolagus cuniculus, L. 1758) is a typical example of a wildlife species that reaches stable population densities in cities. Due to intense plant and soil damages, German city authorities aim to control high rabbit densities through the application of a yearly hunting regime (e. g., in Munich, Berlin or Frankfurt am Main). In contrast, population densities of O. cuniculus are on decline in German rural areas, i. e., numbers of yearly hunting bags decreased. The aim of my doctoral thesis was to answer the following research questions: Do population densities of the European rabbit correlate with the intensity of urbanization in and around Frankfurt am Main and if so, which factors play a role in varying densities? How are burrow construction behaviors and group sizes, daytime activity patterns and anti-predator behaviors as well as communication behaviors of this mammal affected by urbanization?
In my first study, I focused on population dynamics across 17 different study sites in and around Frankfurt. As one of yet few studies, I invented an approach that quantified the intensity of urbanization (degree of urbanity) of each study site base on four variables: (1) intensity of anthropogenic disturbance per min and ha, (2) number of residents within a radius of 500 m, (3) proportion of artificial ground cover and (4) numbers of anthropogenic objects per ha. Spearman rank correlations confirmed that with increasing degree of urbanity also rabbit and burrow densities increased. The access to dense shrubs, bushes etc. as suitable sites for burrow construction is the most determining factor for rabbit abundances, and therefore I presumed different densities along the rural-to-urban gradient to be driven by shifts in the availability of thick vegetation.
In the second study, I calculated two indices that in both cases classified burrows to be either accumulated, evenly or randomly distributed within study sites. Additionally, in cooperation with local hunters the number of burrow entrances and animals that occupy the same burrow had been determined during the hunting season. With increasing degree of urbanity burrow distribution patterns shifted from accumulated in rural areas towards more evenly distributed within the city center of Frankfurt. This is a clear sign for an increasing access to sites suitable for burrow construction along the rural to-urban gradient. Additional Spearman rank correlations revealed that the external dimensions of burrows decreased (shorter distances between entrances) and that burrows became less complex (fewer entrances) along the rural-to-urban gradient. In accordance, the number of rabbits that commonly shared the same burrow system was highest within rural areas, whereas I found mainly pairs and single individuals within highly urbanized study sites.
In the last study I compared activity patterns, burrow use and percentages of anti-predator behaviors from one hour before sunrise until one hour after sunset of rural, suburban and urban rabbit groups. A linear mixed model (LMM) and Spearman rank correlations confirmed that rabbits located at urban and suburban sites spent more time outside their protective burrows compared to their rural conspecifics. At suburban sites, individuals invested the least amount of time in anti-predator behavior. Results of this third study gave evidence that suburban rabbit populations on one hand benefit from less predation pressure by natural predators in comparison to rural sites, whereas on the other hand are exposed to less intense disturbance by humans compared to urban study sites.
The last study focused on the effects that urbanization had on the latrine-based communication behavior of rabbits. As many other mammals, O. cuniculus exchange information via the deposition of excreta in latrines, and depending on the intended receiver(s), latrines are either formed in central areas for within-group communication or at territorial boundaries, e. g., for between-group communication. The relative importance of within- vs. between-group communication depends on, amongst other factors, population densities and group sizes which I proved both to shift along the considered rural-to-urban gradient. I determined latrine sizes, latrine densities and latrine utilization frequencies relative to their distance to the nearest burrow at 15 different study sites. Latrine densities and utilization frequencies increased with increasing distance from the burrow in suburban and urban populations whereas at rural sites, largest latrines and those containing the most fecal pellets were close to the burrow, suggesting that within-group communication prevailed.
To sum up, for the first time, I was able to relate shifts in the ecology and behavior of the European rabbit as adaptations to a gradual anthropogenic habitat alteration that are typical for “urban exploiters”. Especially the suburban habitat provides high landscape heterogeneity (“edge habitat“) which is essential for high and stable rabbit populations. Moreover, here, comparably low human disturbance and predation pressure are given in contrast to the agriculturally transformed, open landscapes which are nowadays typical for most rural areas in central Europe. I argue that this mainly leads to the observed behavioral changes along the rural-to-urban gradient. Future plans for rural land management actions should aim to increase refuge availability by generating networks of ecotones. This would also benefit species that depend on similar ecosystem structures as the European rabbit and are on decline in Germany.
Die Verarbeitung während des Hörprozesses von Säugetieren verläuft von der Kochlea mit den inneren und äußeren Haarsinneszellen (äHZ) über afferente Nervenbahnen bis zum auditorischen Kortex (AK). Die daran beteiligten Schaltstationen und deren Funktion sind überwiegend aufgeklärt. Die Hörbahn ist zudem in besonderer Weise durch efferente Rückkopplungen gekennzeichnet, die interne Modulationen sowie sekundäre Reaktionen auf den Reiz ermöglichen. Anatomisch betrachtet verlaufen efferente Projektionen vom AK zu sämtlichen am Hörprozess beteiligten Kerngebieten. Vom Olivenkomplex erfolgt über mediale und laterale Fasern eine Innervation der äHZ bzw. des Hörnervs. Trotz der gut beschriebenen Anatomie ist die funktionelle Beziehung zwischen dem AK und der Peripherie weitgehend ungeklärt. In der vorliegenden Arbeit wurde der funktionelle Zusammenhang vom AK zu den äHZ in der mongolischen Wüstenrennmaus untersucht. Dafür wurde entweder eine pharmakologische Blockierung der Kortexaktivität durch den Natriumkanalblocker Lidocain erzeugt oder eine Aktivierung der Kortexaktivität durch die Anwendung elektrischer Reize ausgelöst. Der Einfluss der Manipulationen wurde in der Kochlea mittels Messungen von Distorsionsprodukt-otoakustischen Emissionen (DPOAE) erfasst. Diese entstehen durch die nichtlineare Verstärkung leiser Schallsignale durch die äHZ zur Erzielung hoher Sensitivität und Frequenzauflösung. Die DPOAE treten als kubische (z. B. 2f1-f2) und quadratische (z. B. f2-f1) Verzerrungen auf und geben Aufschluss über unterschiedliche Parameter der äHZ-Verstärkungsfunktion.
Die Lidocainversuche wurden entweder kontra- oder ipsilateral zur DPOAE-Messung durchgeführt. In beiden Konstellationen traten nach der Lidocaininjektion Erhöhungen und Verringerungen der DPOAE-Pegel im Vergleich zur Basismessung oder unveränderte DPOAE-Pegel auf. Im Mittel lagen die Pegeländerungen bei ca. 11 dB, in Einzelfällen betrugen sie bis zu 44,8 dB. In den Gesamtdaten waren die Effekte nach kontralateraler Injektion oft signifikant größer als nach ipsilateraler Injektion. Ebenso waren die Effekte in der 2f1-f2 Emission meist signifikant größer als in der f2-f1 Emission. Zudem wurde beobachtet, dass signifikant größere Effekte bei einer Stimulation mit Pegeln von 60/50 dB SPL im Vergleich zu 40/30 dB SPL erreicht wurden. Grundsätzlich trat in allen Datensätzen eine Reversibilität der DPOAE-Pegel mit zunehmender Versuchsdauer auf. Die Effekte waren direkt nach der Injektion am größten und erreichten je nach Stimuluspegel und Emissionstyp nach 28-100 min die Basispegel. In keinem der Datensätze lag eine Abhängigkeit der im Kortex gereizten charakteristischen Frequenz (CF) zum betroffenen Frequenzbereich in der Kochlea vor. Die Effekte waren über den gesamten gemessenen Frequenzbereich von 1-40 kHz nachweisbar. Allerdings waren die Frequenzbereiche von 1-10 kHz und 30,5-40 kHz besonders stark von der Lidocaininjektion betroffen.
Auch nach der elektrischen Reizung wurden die drei oben beschriebenen Effekttypen definiert. Mit 54,6 % war der Prozentsatz unveränderter DPOAE-Pegel allerdings sehr hoch. In den anderen beiden Kategorien konnten zusätzlich Differenzierungen im zeitlichen Verhalten der DPOAE-Pegel vorgenommen werden. In 21,6 % bzw. 16,5 % der Datensätze waren die Verringerungen bzw. Erhöhungen bis zum letzten gemessenen Zeitpunkt nach der elektrischen Reizung irreversibel und nur in jeweils 2,8 % der Datensätze war eine Reversibilität zu verzeichnen. In diesen Fällen war die Effektdauer mit im Mittel 31 bzw. 25 min kürzer als in den Lidocainversuchen. Auch die Effektstärken waren mit maximal 23,9 dB und je nach Effekttyp im Mittel 5,1-13,7 dB geringer als nach der Lidocaininjektion. Die größten Effekte traten in einem mittleren Stimuluspegelbereich von 45-55 dB SPL auf. Wiederum konnte keine Abhängigkeit des betroffenen Frequenzbereichs von der kortikal gereizten CF nachgewiesen werden. In Einzelfällen waren auf DPOAE-Ebene nur die Frequenzen ober- und unterhalb der kortikalen CF beeinflusst, wohingegen bei der CF selbst keine Effekte auftraten.
Durch Kontrollexperimente (Salineinjektion bzw. Einführen der Elektrode ohne elektrische Reizung) konnte nachgewiesen werden, dass die Effekte durch die Manipulation der Kortexaktivität hervorgerufen wurden. Somit liegt eine funktionelle Beziehung zwischen dem AK und der Peripherie vor, die langanhaltende massive Ausmaße annehmen kann. Die Effektrichtung ist vermutlich durch die exzitatorisch oder inhibitorisch wirkenden Neurone vom Colliculus inferior zum Olivenkomplex bedingt. Die größeren Effekte in der kontralateralen Konfiguration lassen sich durch die Diskrepanz in der Anzahl der gekreuzten (2/3) und ungekreuzten (1/3) medialen Efferenzen erklären. Die kubischen Komponenten der äHZ-Verstärkungsfunktion scheinen stärker beeinflusst zu sein als die quadratischen Komponenten, was in größeren Pegeländerungen in der 2f1-f2 Emission resultiert. Die teils großen Effektstärken sowie die nicht vorhandene Frequenzabhängigkeit zwischen AK und Kochlea sind vermutlich auf den großen Kortexbereich zurückzuführen, der von den gewählten Injektionsvolumina bzw. elektrischen Reizstärken betroffen war. Die großen Effekte im mittleren Stimuluspegelbereich lassen sich sowohl mit einer möglichen Schutzfunktion der Efferenzen vor zu lauten Schallereignissen als auch mit einer Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses zur erleichterten Detektion akustischer Signale in Einklang bringen. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die Aktivität des AK einen starken Einfluss auf periphere auditorische Mechanismen hat, wodurch die kochleäre Verarbeitung akustischer Signale je nach kortikalem Verarbeitungsstatus massiv modifiziert werden kann.
Gallery forests (GFs) are floristically and functionally distinct forests along rivers and watercourses. The GFs of the West African savannas form thin stripes with a particular, species-rich flora differing significantly from the surrounding vegetation. Due to their relative isolation in the savannas and their dependence on rivers, GFs are particularly endangered by the expected global climate changes in the 21st century. Despite their high diversity, little is known about the ecology and biogeography of GFs in West Africa. Especially, their response to climate changes and their vegetation dynamics remain largely unknown. This thesis combines floristic, phylo-geographic and ecological data to investigate the biodiversity, historical and recent biogeography and conservation status of GF species in Burkina Faso (BFA) as a model for West Africa.
Fossile Rohstoffe dienen in unserer heutigen Gesellschaft als Energiequelle und als Rohstofflieferant für Grund-, Feinchemikalien und Pharmazeutika. Sie tragen jedoch zum Klimawandel und Umweltverschmutzung bei. Lignocellulosische Biomasse ist eine erneuerbare und nachhaltige Alternative, die durch biotechnologische Prozesse erschlossen werden kann. Die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae ist ein sehr gut untersuchter Modellorganismus, für den es zahlreiche genetische Werkzeuge und Analysemethoden gibt. Zudem wird S. cerevisiae häufig in biotechnologischen Prozessen eingesetzt, da diese Hefe robust gegenüber industriellen Bedingungen wie niedrigen pH-Werten, toxischen Chemikalien, osmotischem und mechanischem Stress ist. Die Pentose D-Xylose ist ein wesentlicher Bestandteil von lignocellulosischer Biomasse, die aber nicht natürlicherweise von der Bäckerhefe verwerten werden kann. Für eine kommerzielle Herstellung von Produkten aus lignocellulosischer Biomasse muss S. cerevisiae D-Xylose effektiv verwerten. Für die Bäckerhefe konnten heterologe Stoffwechselwege etabliert werden, damit diese D-Xylose verwerten kann. Für eine effiziente Xyloseverwertung bleiben dennoch zahlreiche Herausforderungen bestehen. Unter anderem nehmen die Zellen D-Xylose über ihre endogenen Hexosetransporter nur langsam auf. Die heterologe Xylose-Isomerase (XI) besitzt in S. cerevisiae eine geringe Aktivität für die Isomerisierung von D-Xylose. Unspezifische Aldosereduktasen konkurrieren mit der Xylose-Isomerase um das gleiche Substrat und produzieren Xylitol, ein starker Inhibitor der Xylose-Isomerase. Eine Möglichkeit die Umsatzrate von Enzymen zu steigern und Substrate vor Nebenreaktionen zu schützen, ist die Anwendung von Substrate Channeling Strategien. Bei Substrate Channeling befinden sich die beteiligten Enzyme in einem Komplex, wodurch die Substrate lokal angereichert werden und von einem aktiven Zentrum zum nächsten weitergeleitet werden, ohne Diffusion in den restlichen Reaktionsraum. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob ein Komplex zwischen einem membranständigen Transporter und einem löslichen Enzym konstruiert werden kann, um durch Substrate Channeling eine verbesserte Substrat-Verwertung zu erreichen. Die Xylose-Isomerase aus C. phytofermentans und die endogene Hexose-Permease Gal2 sollten in dieser Arbeit als Modellproteine in S. cerevisiae-Zellen mit Hilfe von Protein-Protein-Interaktionsmodulen (PPIM) in räumliche Nähe zueinander gebracht werden.
Die Expression verschiedener PPIM konnte in S. cerevisiae mittels Western Blot nachgewiesen werden. Auch Fusionsproteine aus unterschiedlichen PPIM wurden in dieser Hefe exprimiert. Die PPIM binden komplementäre PPIM oder kurze Peptidliganden, welche an die Xylose-Isomerase und an den Gal2-Transporter fusioniert wurden. Die Funktionalität beider Proteine wurde mittels in vivo und in vitro Tests untersucht. Die Xylose-Isomerase mit N-terminalen Liganden des WH1-Protein-Protein-Interaktionsmoduls (WH1L-XI) und der Gal2-Transporter mit N-terminalen SYNZIP2-Protein-Protein-Interaktionsmodul (SZ2-Gal2) erwiesen sich als geeignete Kandidaten für weitere Untersuchungen. Mittels indirekter Immunfluoreszenz konnte die Ko-Lokalisierung von SZ2-Gal2 und WH1L-XI, die einander über ein Scaffold-Protein binden, nachgewiesen werden.
Transformanten, in denen ein Komplex aus Transporter, Scaffold-Protein und Xylose-Isomerase gebildet wurde, zeigten bessere Fermentationseigenschaften gegenüber der Scaffold-freien Kontrolle und dem Wildtyp: Sie verwerteten Xylose schneller, bildeten weniger vom unerwünschten Nebenprodukt Xylitol, produzierten mehr Ethanol und wiesen eine höhere Ethanolausbeute auf. Der beobachtete Substrate Channeling Effekt kompensierte die geringere Enzymaktivität der WH1L-XI im Vergleich zum Wildtyp-Protein. Die Wirksamkeit des Substrate Channeling wurde verringert, wenn die Bildung des Komplexes aus Transporter, Scaffold-Protein und Xylose-Isomerase gestört wurde, indem ein getaggtes GFP mit dem Scaffold-Protein um die Bindungsstelle an Gal2 konkurrierte. Dies zeigt, dass die positive Wirkung auf die Komplex-Bildung zwischen XI und Gal2 zurück zu führen ist. Die Fermentationseigenschaften konnten gesteigert werden, indem der zuvor zwischen SZ2-Zipper und Gal2-Transporter verwendete Linker, der aus zehn Aminosäuren von Glycin, Arginin und Prolin (GRP10) bestand, durch einen aus Glycin und Alanin (GA10) ersetzt wurde. Die verbesserten Fermentationseigenschaften beruhten auf einem Substrate Channeling Effekt und einer gesteigerten Aufnahmerate des SZ2-GA10-Gal2-Transporters. Ein Vergleich der Strukturvorhersagen von SZ2-GRP10-Gal2 und SZ2-GA10-Gal2 zeigte, dass der GRP10-Linker einen unstrukturierten, flexiblen Linker ausbildet, während der GA10-Linker eine starre α-Helix ausbildet. Die Struktur und der Transportprozess von Gal2 sind nicht aufgeklärt. Bei verwandten Transportern geht man davon aus, dass Substrate durch Konformationsänderungen ins Innere der Zelle transportiert werden, indem die beiden Domänen gegeneinander klappen. Die α-Helix könnte die Geschwindigkeit der Konformationsänderungen begünstigen.
Durch Kontrollexperimente konnte ausgeschlossen werden, dass die gesteigerten Fermentationseigenschaften eine Folge der Stabilisierung der XI- und Gal2-Fusionsproteine durch das Anfügen des Liganden oder durch Komplexbildung mit dem Scaffold-Protein waren. Substrate Channeling zwischen Gal2 und XI entsteht durch die Komplexbildung mit dem Scaffold-Protein, wodurch sich Gal2 und XI in räumlicher Nähe zueinander befinden. Dieser Effekt beruht möglicherweise zusätzlich aufgrund einer hohen örtlichen Ansammlung dieser Proteine, da die tetramere XI weitere Scaffold-Proteine binden könnte, welche weitere Gal2-Transporter binden könnte. Darüber hinaus sammeln sich Transporter an bestimmten Orten der Membran an und Transporter mit ähnlicher oder gleicher Transmembransequenz tendieren dazu zu ko-lokalisieren. Hierdurch könnten Gal2-XI-Agglomerate entstehen und Xylose wird mit hoher Wahrscheinlichkeit von einer der vielen Xylose-Isomerasen umgesetzt.
In dieser Arbeit wurde der Hefepilz Xanthophyllomyces dendrorhous als vielseitige biotechnologische Plattform für die Produktion von Carotinoiden verwendet. Durch genetische Modifikationen der Carotinoidbiosynthese wurde ein Astaxanthin-Hochproduzent zur Akkumulation des farblosen Phytoens, das die menschliche Haut vor der schädlichen Wirkung der UV-Strahlung schützt und des gelben Zeaxanthins, das zur Förderung und Erhalt der Sehfähigkeit beiträgt, befähigt. Zur Generierung eines Phytoen-Hochproduzenten wurde das Gen crtI (Phytoen-Desaturase) inaktiviert und der Phytoengehalt durch Überexpression der Gene HMGR, crtE und crtYB gesteigert. Die Generierung eines Zeaxanthin-Hochproduzenten beinhaltete die Inaktivierung des Gens asy (Astaxanthin-Synthase) und die heterologe Expression einer bakteriellen ß-Carotin-Hydroxylase CrtZoXd.
Die Inaktivierung der Gene erfolgte mit spezifischen Knock-Out-Konstrukten, die mittels homologer Rekombination in crtI oder asy integrierten. Nachdem die Transgene auf Vektoren mit verschiedenen Antibiotikaresistenzen kloniert wurden, wurde die Überexpression durch genomische Integration in die ribosomale DNA erreicht. Anschließend wurde die Carotinoidzusammensetzung der Zellextrakte durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie an einer C18-Trennsäule oder durch Dünnschichtchromatographie bestimmt. Der Knock-Out-Nachweis erfolgte mittels Polymerase-Kettenreaktion und Amplifikation der Genloci, während die Anzahl integrierter Carotinoidgene durch quantitative Real-Time-PCR bestimmt wurde. Die Kultivierungen von X. dendrorhous wurden sowohl in Schikanekolben als auch in einem 2L-Bioreaktor durchgeführt.
Im Zuge der genetischen Modifikationen konnte der Ploidiegrad des Wildtyps bestimmt werden, der bis dahin unbekannt war. Durch das Auftreten von instabilen heterozygoten Stämmen und deren Überführung zu stabilen Homozygoten wurde die Existenz eines diploiden Genoms nachgewiesen. Um die für die biotechnologische Anwendung notwendige Stabilität der Carotinoidbiosyntheseleistung zu erreichen, wurden zwei Strategien entwickelt. Hierbei erfolgte die Stabilisierung der Stämme als Folge mitotischer Rekombination nach Subkultivierung und anschließender Farbselektion oder durch Induktion des sexuellen Zyklus und Sporulation.
Der crtI-Knock-Out führte zur Akkumulation von 3,6 mg/g dw Phytoen. Anschließend wurde die Limitierung der Phytoensynthese durch crtYB-Überexpression aufgehoben und die Versorgung der Carotinoidbiosynthese mit Vorläufermolekülen durch HMGR- und crtE-Überexpression erhöht. Im Bioreaktor wurde durch die Anwendung eines dreistufigen Fed-Batch-Prozesses, der eine effiziente Glucoseverwertung sicherstellte, mit 10,4 mg/g dw die höchste bis dato publizierte zelluläre Phytoenkonzentration im stabilisierten Hochproduzenten erreicht.
Der asy-Knock-Out führte zur Akkumulation von 4,5 mg/g dw ß-Carotin, das anschließend durch heterologe Expression der codon-optimierten ß-3,3-ß-Hydroxylase crtZoXd im Hochproduzenten zu 3,5 mg/g dw Zeaxanthin umgesetzt wurde. Zur Optimierung des Vorgehens wurden Knock-In-Konstrukte entwickelt, mit denen beide Schritte (Knock-Out und Integration von Carotinoidgenen) in nur einem molekular-biologischen Schritt durchgeführt und 94 % des in einem Wildtypstamm vorhanden ß-Carotins zu Zeaxanthin umgesetzt wurden. Die Optimierung der Wachstumsbedingungen bei der Bioreaktor-Kultivierung des stabilisierten Zeaxanthinproduzenten führte mit 10,8 mg/L zu einem 5-fach höheren Zeaxanthingehalt im Vergleich zur Schikane-Kultivierung.
Durch den Einsatz der Pentosen Arabinose und Xylose als alternative Kohlenstoffquellen wurde der Carotinoidgehalt der Phytoen- und Zeaxanthin-Hochproduzenten um 70 bzw. 92 % im Vergleich zur Glucose-Kultivierung gesteigert, wobei die Gründe für diesen Effekt in einer stärkeren Kohlenstoffverwertung und der Hemmwirkung von Glucose vermutet wurden. Aus verschiedenen pflanzlichen Abfallstoffen kann Xylose durch Hydrolyse freigesetzt werden, deren Nutzung zum Aufbau einer nachhaltigen und kostengünstigen biotechnologischen Carotinoidproduktion beitragen kann.
Darüber hinaus wurden multioxigenierte Zeaxanthinderivate, von denen eine positive Wirkung auf die menschliche Gesundheit vermutet wird, durch kombinatorische Biosynthese erhalten. Durch die schrittweise Integration der Gene crtZoXd, crtG (ß-2,2-Hydroxylase) und bkt (ß-4,4-Ketolase) in eine ß-Carotinmutante wurde die Biosynthese von Zeaxanthin, Nostoxanthin und schließlich von 4-Keto-Nostoxanthin und 4,4-Diketo-Nostoxanthin erreicht. Anschließend erfolgte die chemische Reduktion zu den neuartigen Carotinoiden 4-Hydroxy-Nostoxanthin und 4,4-Dihydroxy-Nostoxanthin und der zweifelsfreie Nachweis aller vier Carotinoide anhand der mittels Massenspektrometrie bestimmten Molekülmassen und Fragmentierungsmuster.