Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
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The rate of species extinctions due to anthropogenic activities has dramatically increased within the past few centuries (Dirzo & Raven, 2003; Novacek & Cleland, 2001). Although the mechanisms and ultimate causes leading to the extinction of species remain largely unclear (Frankham et al., 2002), five threats to global biodiversity have frequently been referred to as the most important: habitat destruction and fragmentation, global climate change, hunting and overuse of food resources, biological invasions and environmental pollution (Dudgeon et al., 2006; Lewis, 2006; Novacek & Cleland, 2001). Different research fields, as conservation biology, ecology and ecotoxicology, investigate the effects of these factors on organisms and found strong evidence for their negative impact on regional and global biodiversity.
In most cases, natural populations will be impacted not only by one threat, but rather a combination of them (Buckley & Roughgarden, 2004; Kappelle et al., 1999). Multiple environmental stress factors can have cumulative negative effects on the survival of populations (Sih et al., 2004). To understand, how natural populations respond to combinations of different stress factors is thus of crucial importance in order to understand our present and future impact on all scales of biodiversity (Warren et al., 2001).
The effects of anthropogenically introduced chemicals on organisms and ecosystems are investigated in the field of ecotoxicology. Research in this area has led to a large body of information concerning the impact of chemical stress on the fitness of model species in the laboratory. In contrast to this, there is an obvious lack of knowledge on the effects of contaminants on natural populations and communities (Bickham et al., 2000; Bourdeau et al., 1990). For instance, ecotoxicologists have just started to investigate the impact of environmental pollution on the genetic variability of natural populations (Bickham et al., 2000; Whitehead et al., 2003). Genetic variation provides the raw material for populations in order to adapt to changing environmental conditions and is thus the substrate for evolution and long-term survival of populations and species (Frankham, 2005). The amount of genetic variation in populations is positively correlated with the effective population size (Frankham, 1996). Habitat destruction and fragmentation has divided the ranges of many species into small and isolated refuges. Without migration from adjacent habitats, isolated populations will decrease in their level of genetic diversity through random loss of alleles (Hedrick, 2000). Frankham (1995) for instance, showed that 32 of the 37 endangered species (which occur in small populations per definition) of different animals and plant taxa display reduced levels of heterozygosity compared to closely related and more frequent species.
In strongly human impacted landscapes, both factors, environmental pollution and habitat destruction, can be expected to occur frequently together. It is thus of crucial importance to investigate the impact of reduced genetic diversity and inbreeding on the response to chemical stress. In addition, chemical exposure has frequently been discussed to have an impact on the extent of genetic variability in exposed populations (Guttman, 1994; Staton et al., 2001; van Straalen & Timmermans, 2002). However, evidence for this 'genetic erosion hypothesis' remained scarce to date, most likely because of the difficulty to single out the impact of pollution stress from a background of multiple factors which influence patterns of genetic variability in natural populations (Belfiore, 2001; Staton et al., 2001; van Straalen & Timmermans, 2002).
Präklinische Untersuchungen zur Gentherapie der HIV-Infektion mit dem retroviralen Vektor M87o
(2007)
Mit der Einführung der hochaktiven antiretroviralen Therapie (HAART) 1995 wandelte sich die HIV-Infektion in den Industrieländern von einer akut lebensbedrohlichen zu einer chronisch verlaufenden und scheinbar gut kontrollierten Erkrankung. Das Virus wird allerdings nie vollständig aus dem Körper eliminiert, sodass die Betroffenen zeitlebens Medikamente einnehmen müssen. Die Langzeit-Medikation wird häufig von schweren Nebenwirkungen begleitet, führt zur Selektion resistenter Viren und muss häufig umgestellt werden. Gentherapeutische Verfahren, die die CD4+ Zielzellen durch die Expression antiviraler Gene vor der Infektion durch HIV schützen („intrazelluläre Immunisierung“), stellen viel versprechende Therapiealternativen dar. Der in der Arbeitsgruppe von Laer entwickelte retrovirale Vektor M87o (EGELHOFER et al. 2004, EGELHOFER 2004) exprimiert das 46 Aminosäuren lange membran-verankerte Peptid C46, das in der Lage ist, die gp41-vermittelte Fusion von Virus- und Zellmembran zu inhibieren. In Zelllinien und primären Lymphozyten konnte gezeigt werden, dass M87o die Infektion durch unterschiedliche HIV-Isolate sehr effektiv verhindert. Im Rahmen vorklinischer Untersuchungen konnte in vitro gezeigt werden, dass die retrovirale Transduktion mit M87o das Transformationsrisiko und damit das Risiko der Entstehung von Neoplasien nicht steigert. An primären peripheren T-Zellen konnte zeigt werden, dass M87o die Zielzellen weder phänotypische noch funktionelle verändert. Für die Untersuchung der retroviralen Gentherapie im Rhesusaffenmodell wurde zunächst ein Gentransferprotokoll für periphere Affenlymphozyten entwickelt, mit dem in Vorversuchen Gentransferraten von ca. 50% erreicht werden konnten. Das Transduktionsprotokoll wurde anschließend im Rahmen einer präklinischen Studie zur Toxizität und Immunogenität der M87o-Gentherapie, bei der Herstellung zweier Studientransplantate angewandt. Beide Zellpräparate wurden den Versuchstieren transplantiert. Während des Eingriffs traten keine akuttoxischen Reaktionen auf. M87o+-Zellen konnten bis 140 Tage nach der Transplantation mittels PCR nachgewiesen werden. Immunologische Untersuchungen (Cytokinfärbung, Proliferationsassay, ELISPOT) ergaben keine Hinweise auf zelluläre oder humorale Immunreaktionen. M87o-spezifische Antikörper waren im Serum nicht nachweisbar. Für die Durchführung einer klinischen Studie zur Toxizität und Wirksamkeit (Phase I/II) an HIV-infizierten Probanden wurde ein Protokoll zur Produktion M87o-modifizierter T-Zellen (mindestens 5 × 108 M87o+ CD4-T-Zellen pro Spender) entwickelt. In die klinische Prüfung wurden Patienten aufgenommen, die nach multiplem Therapieversagen durch das Auftreten multiresistenter HIV eine CD4-Zellzahl von 50 bis 200 µl-1 Blut, sowie eine Viruslast von >5.000 Kopien ml-1 Blut aufwiesen. Im Versuchsmaßstab konnte ein Transduktionsprotokoll erarbeitet werden, mit dem im Mittel 46% der CD4+ T-Zellen mit M87o transduziert werden konnten. Innerhalb von 10 Tagen expandierte die Zellzahl im Mittel um den Faktor 153, wobei die HIV-Replikation vollständig inhibiert wurde. Das Protokoll wurde erfolgreich vom Versuchsmaßstab in den klinisch relevanten Produktionsmaßstab übersetzt. In drei Versuchsläufen wurde im Mittel eine Transduktionsrate von 29% erreicht und die Zellzahl um den Faktor 44 vermehrt. Der Anteil an CD3+/CD4+ Zellen an der Gesamtpopulation lag im Mittel bei 91%. Insgesamt konnten mit dem etablierten Protokoll durchschnittlich 2,3 × 109 CD3+/CD4+/M87o+ Zellen, bei gleichzeitig vollständiger Inhibition der HIV-Replikation, generiert werden. Im Rahmen einer klinischen Studie zur Toxizität und Wirksamkeit der M87o-Gentherapie wurden 10 Studientransplantate gemäß dem im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Protokoll hergestellt. Alle Transplantate wurden am Universitäts-Krankenhaus Eppendorf in Hamburg transfundiert und von den Patienten sehr gut vertragen.
Metabotropic glutamate receptor subtype 7 (mGluR7) belongs to the family of G-protein coupled receptors. mGluR7 is widely distributed in the brain and primarily localized at presynaptic terminals, where it is thought to regulate neurotransmitter release and synaptic plasticity. Studies have shown that the intracellular C-terminal tail of mGluR7 binds a variety of proteins in addition to trimeric G-proteins. These newly identified protein interactions are believed to play a key role in the synaptic targeting and G-protein dependent signaling of mGluR7. Protein interacting with C kinase 1 (PICK1), a PDZ-domain protein, is a strong interaction partner of mGluR7a. In order to investigate the role of PICK1 in the synaptic trafficking and signaling of mGluR7a, a knock-in mouse line in which the interaction of mGluR7a and PICK1 is disrupted was generated. Analysis of the mutant mice by immunocytochemistry and immunoelectron microscopy showed that the synaptic targeting and clustering of mGluR7a was not altered, indicating that PICK1 is not required for mGluR7a receptor membrane trafficking and synaptic localization. However, when the spontaneous synaptic activity of cerebellar granule cell cultures prepared from both wild-type and knock-in mice was monitored, and L-AP4 (400μm) was found to decrease the frequency, but not the amplitude, of spontaneous excitatory currents in wild-type neurons, while no effect of L-AP4 on spontaneous synaptic activity was observed in knock-in neurons. This indicates that PICK1 binding to the C-terminal region of mGluR7a plays an essential role in mGluR7a mediated G-protein signaling. We examined the threshold sensitivity for the convulsant pentetrazole (PTZ) in knock-in mice. It was found that mGluR7a knock-in mice had a greater sensitivity to PTZ than wild-type mice. Moreover, the surface parietal cortex EEG recordings of the mutant mice revealed spontaneous synchronous oscillation, or "spike-and-wave discharges" (SWD), which displayed similar characteristics to absence-like seizures. It was also observed that the knock-in mice responded to pharmacology as human absence epilepsy. These data suggests that the knock-in mice displayed the phenotype of absencelike epilepsy. Furthermore, the behavioral analysis of the mGluR7a knock-in mice showed no deficits in motor coordination, pain sensation, anxiety as well as spatial learning and memory, thus the interaction of mGluR7a and PICK1 appears not to contribute to these physiological processes. Taken together, our data provides evidence for an important role of PICK1 in Gprotein dependent signaling of mGluR7a, whereas PICK1 is not required for synaptic targeting and clustering of mGluR7a. Our results also provide an animal model of absencelike epilepsy generated by disruption of a single mGluR7a-PDZ interaction, thus creating a novel therapeutic target against this neurological disease.
Isolation des Carotinoidbiosynthese Genclusters aus Flavobacterium spec P99-3. Das isolierte Gencluster von 15 kb Größe zeigt 7 offene Leseraster, die auf Grund ihrer Sequenzhomologie Carotinoidgenen zugeordnet werden können oder anhand von Komplementationen in einem heterologen Expressionssystem in E. coli mit anschließender HPLC-Analayse eine eindeutige Funktion im Biosysnthesewegs des selten vorkommenden Myxols zugeordnet werden kann.
Obwohl für eine Vielzahl von Chemikalien Ergebnisse aus Standardtest vorliegen, gibt es relativ wenige Erkenntnisse über generationsübergreifende Substanzeffekte und die Auswirkungen von Chemikalien auf die genetische Diversität. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation werden generationsübergreifende Effekte des Modellschadstoffes Tributylzinn (TBT) bei drei subakuten Konzentrationen (4,46; 6,69 und 8,93 mikro g Sn/kg TG) auf Life-Cycle-Parameter und genetische Diversität der Zuckmücke Chironomus riparius untersucht. Dabei wird eine genetisch variable (GEN+) und eine genetisch verarmte (GEN-) Populationen betrachtet. Darüber hinaus wird das Anpassungspotential an den Stressor TBT abgeschätzt. Die genetische Variabilität von C. riparius wird mittels neu entwickelter Mikrosatellitenmarker bestimmt. Dabei werden geringfügige Längenunterschiede zwischen hochvariablen DNA-Fragmenten detektiert. Weiterhin werden Abweichungen vom Hardy-Weinberg-Gleichgewicht bestimmt. Für die Ermittlung von potentiellen Anpassungsprozessen an den Stressor TBT werden nach ausgewählten Generationen akute und chronische Anpassungstest durchgeführt. Um der Fragestellung nachzugehen, ob eine TBT-Vorexposition zu einer veränderten Sensitivität gegenüber einem Zweitstressor führt, werden Experimente mit Cadmium durchgeführt. Auch in den Zweitstressorstudien wird der Multigenerationsansatz gewählt, und es werden Life-Cycle-Experimente über drei weitere Generationen durchgeführt. Für die Experimente werden die mit 4,46 und 8,93 mikro g Sn/kg TG vorexponierten Tiere anschließend nach unterschiedlicher Generationenzahl einer umweltrelevanten Cadmiumkonzentration (1,2 mg/kg TG) ausgesetzt. Im Verlauf der Multigenerationsstudie mit 4,46 mikro g Sn/kg TG werden in beiden Populationen signifikante Effekte auf die Entwicklung und Reproduktion beobachtet. In den ersten Generationen ist der Schlupfzeitpunkt der Larven bei TBT-Exposition signifikant (p < 0,05, t-Test) verzögert. Die Reproduktion scheint ebenso ein sensitiver Parameter zu sein, wobei die Weibchen der genetisch variableren Population signifikant (p < 0,05, t-Test) größere Gelege in den späteren Generationen produzieren. Die niedrige TBT-Konzentration hat in beiden Populationen keinen signifikanten Effekt auf die durchschnittliche Populationswachstumsrate. In den letzten Generationen der Studie wird für die genetisch variablere Population eine Veränderung des Lebenszyklus festgestellt, wobei die Weibchen eine erhöhte Reproduktionsleistung aufweisen. Es werden keine Effekte auf die Heterozygotie festgestellt. Allerdings treten in beiden Populationen zahlreiche Abweichungen vom Hardy-Weinberg-Gleichgewicht auf. Weiterhin werden signifikante (Pearson-Korrelation, p < 0,05) Effekte der genetischen Diversität auf zahlreiche Life-Cycle-Parameter (Gelegeanzahl pro Weibchen, Gelegegröße) ermittelt. In den chronischen und akuten Anpassungsexperimenten gibt es deutliche Hinweise auf Adaptationsprozesse gegenüber dem Stressor TBT. In der TBT-Studie mit 8,93 mikro g Sn/kg TG werden in beiden Populationen signifikante Effekte auf zahlreiche Life-Cycle-Parameter festgestellt, wobei die Entwicklung und Reproduktion der Tiere negativ beeinflusst wird. Darüber hinaus werden in der genetisch variableren Population signifikante (p < 0,05, X2-Test) Effekte von TBT auf die genetische Diversität beobachtet. Diese nimmt im Verlauf der Studie ab. Nach der vierten Generation gibt es in der genetisch variableren Population Hinweise auf Anpassungsprozesse, die allerdings in den letzten Generationen nicht mehr nachzuweisen sind. Ähnlich wie in der ersten Multigenerationsstudie wird auch in dieser Studie ein signifikant (Pearson-Korrelation, p < 0,05) positiver Zusammenhang zwischen der genetischen Diversität und der Populationswachstumsrate bei TBT-Exposition festgestellt. In den Zweitstressorexperimenten wird der Effekt der Vorbelastung bei der genetisch variableren Population deutlich. Die mit 8,93 mikro g Sn/kg TG über neun Generationen exponierte Population reagiert dabei empfindlicher auf den Stressorwechsel als die dazugehörige Referenzpopulation. Innerhalb der Multigenerationsstudien werden zahlreiche Effekte der Organozinnverbindung TBT auf Life-Cycle-Parameter und die genetische Diversität von C. riparius deutlich. Diese Dissertation zeigt die hohe Bedeutung von Mehrgenerationenstudien für die Abschätzung und Bewertung eines Risikopotentials von Schadstoffen.
Koalas are popular zoo animals, but difficult in husbandry. In addition to their specialised diet of eucalyptus leaves, they are prone to “stress” and disease. Particularly in European zoos, themonitoring of theirwell-being has high priority and they are protected from possible stressors. However, stress signs in koalas are vague and monitoring techniques like weighing might result in discomfort itself. Additionally, husbandry routines are planned according to keeper’s schedule, not to the endogenous rhythms of the koalas. Therefore it is necessary to investigate activity pattern in captive koalas and the signals influencing them. These signals have to be assessed on the strength and quality of their impact. A total of 17 koalas have been observed in three zoological gardens in Australia and Europe. Koalas kept in outdoor enclosures with little human contact (Koala Walkabout, Taronga Zoo, Sydney) showed a uniform activity pattern, which was clearly entrained by light. Activity levels were higher during the night, and there was a pronounced resting period in the morning which corresponds with low body temperature measured by Degabriele and Dawson (1979). Activity peaks were related to twilight and changed during the year related to day lengths. However, there was a clear influence from the introduction of fresh browse which resulted in a distinct feeding peak in the afternoon. With short day lengths, this stimulus competed with dusk. Activity patterns from koalas in indoor enclosures (Zoo Duisburg, Vienna Zoo) varied between individuals and in some cases lacked a detectable rhythm. Though activity peaks were related to light, entrainment to sunlight was weak. In winter, koalas reacted primarily to the artificial light, but some also showed activity peaks related to sunlight. Activity patterns in these koalas were less structured and differed severely from patterns expected according to literature. Activity was often related to the keeper’s presence and food introduction. Frequency of feeding bouts was considerably higher at Vienna Zoo compared to the other zoos and the bouts were shorter in duration. Time budgets of the koalas were within the range given in free-range studies. Feeding showed seasonal changes and was increased in lactating females. Koalas at Vinna Zoo had a high level of locomotor activity compared to the size of the enclosure. Koalas at Koala Walkabout were not used to handling, so they resisted the keeper. The koalas at the two European zoos were handled regularly and settled down quickly. However, handling took place in the morning; in most koalas, there was no activity prior to it. In Vienna, resting periods were interrupted daily due to weighing. Food introduction at KoalaWalkabout took place in the afternoon. It was preceded by locomotor activity and triggered a long feeding bout in the koalas. It is not clear, whether food had true Zeitgeber properties or masked the endogenous rhythm. In the two European zoos, food was introduced in the morning. The peaks related to this were smaller than those at Koala Walkabout. Activity was rarely observed prior to food introduction. The koalas at Koala Encounter, Taronga Zoo (Sydney),were regularly confronted with visitors, though no contact was allowed. Direct observation by the keepers did rarely show any stress signs. Activity patterns at night were strikingly similar to Koala Walkabout, but differed dramatically during the day. Food was introduced three times a day, which usually resulted in activity that interrupted a resting period. Generally, the koalas at Koala Encounter were more active than those at KoalaWalkabout. They also displayed a high level of locomotor activity, especially on the ground, which is an accepted sign of discomfort in koalas (Wood 1978; Zoological Society of San Diego 2001; Yusuf& Rosenthal unpublished data). In summary, this chronoethological study of the captive koalas showed that there are several problems with koala husbandry. Artificial light regimes for koalas are not sufficient for entrainment and result in unstructured activity pattern. This is especially the case in winter, when the day in Europe is artificially extended. Due to the mainly nocturnal behaviour of koalas, such an extension might not be necessary and therefore should be avoided. Handling in Europe took place during the physiological resting time of the koalas. Interruptions of resting times are considered as stressors (Wood 1978) and should be avoided. Handling in the afternoon would be more suitable for the koalas and triggered activity in the two koalas at Vienna Zoo. It is also arguable if daily weighing is necessary to monitor health in captive koalas or if the frequent interruption of resting countervail the advantages of constant monitoring. Frequent contact with visitors, evenwithout the so-called cuddling, has a considerable impact on activity patterns and time budget of koalas, even if no immediate stress signs are displayed. Such contact should therefore be reduced to a minimum and chronoethological observations of the koalas should be used. A study on koalas with direct visitor contact is also advisable to revise the current legislation on “koala cuddling”. Koalas frequently rested in living trees if they had access to it. Since no food-poisoning has been reported from koalas using living non-food trees, the provision of living trees with an appropriate canopy should be included in the husbandry guidelines. Increased locomotor activity has been shown to be related to conditions of discomfort or stress and possibly to oestrus. This is in accordance with literature (Wood 1978; Zoological Society of San Diego 2001). Further observation, combined with hormone analysis, are advisable to establish this parameter for evaluation of well-being. Chronoethology has proven to be useful for the evaluation of husbandry conditions and group dynamics. Different to other, traditional ethologicalmethods, it indicated problems and enabled me to advise more appropriate times for handling and food introduction. It is desirable that zoos already using 24-hour video observation include chronoethological aspects into their analysis.
RNA-Interferenz (RNAi) erlangte eine herausragende Bedeutung zum Studium der Genfunktion, nachdem auch in Säugersystemen gezeigt wurde, daß durch Applikation von 21 nt langen siRNAs (small interfering RNAs) eine Sequenz-spezifische Degradierung der mRNA-Transkripte kognitiver Gene erreicht werden konnte. Im Gegensatz zur antisense-Technologie erwies sich die Wirkung von siRNA im Hinblick auf die Hemmung der Genexpression um ein Vielfaches potenter und hoch spezifisch. Für eine längerfristige Unterdrückung von Genen kristallisierte sich die Methode der Plasmid-Vektor-vermittelten intrazellulären Expression von shRNA (short hairpin RNA) heraus, welche transient oder stabil angewendet werden kann. Diese exprimierte shRNA wird intrazellulär enzymatisch zu wirksamer siRNA prozessiert, welche den eigentlichen Enzym-vermittelten RNAi-Mechanismus der Degradierung von mRNA-Transkripten kognitiver Gene auslöst. Die Anwendung von RNA-Polymerase III-abhängigen Promotoren für die stabile konstitutive Expression von shRNA stellte ein großes Problem für behandelte Zellen dar, wenn es sich bei dem zu unterdrückenden Zielgen um ein Gen mit essentiellen Funktionen für die Zelle handelte. Im Falle der Polo-like Kinase 1 (Plk1), einer in vielen Spezies hoch konservierten Serin/Threonin-Kinase mit essentiellen mitotischen Funktionen, bedeutete eine dauerhafte und stringente Unterdrückung einen veränderten Phänotyp beteiligter Zellen, welcher sich durch Defekte bei mitotischen Ereignissen bemerkbar machte. Plk1 ist in zahlreiche mitotische Prozesse, wie den Eintritt der Zellen in die Mitose, die Segregation der Chromosomen und die Aktivierung des APC/C (anaphase promoting complex / cyclosome), eingebunden. Darüber hinaus ist bekannt, daß Plk1 in nahezu allen Tumorarten überexprimiert vorliegt und die Prognose von Tumorwachstum und Metastasierungspotential über den Plk1-Gehalt definiert werden kann. Des weiteren bewirkte eine RNAi-vermittelte Unterdrückung der Plk1-Expression bei Tumorzellen eine Hemmung der Zellproliferation mit Auslösung der Apoptose. Hingegen konnte bei gesunden primären Zellen weder eine signifikante Hemmung der Proliferation noch die Auslösung der Apoptose beobachtet werden, was die große Bedeutung von Plk1 als Ansatzpunkt für eine Krebstherapie hervorhebt. Um die Funktion von Plk1 im Hinblick auf molekularbiologische Zusammenhänge besser studieren zu können, war es notwendig, den intrazellulären Plk1-Gehalt zu variieren. Im Rahmen dieser Promotionsarbeit wurden dazu induzierbare RNAi-Elemente entwickelt, mit deren Hilfe die intrazelluläre Plk1-Expression konditionell inhibiert werden konnte. Unter Verwendung des prokaryotischen Tet-Systems wurden auf Basis des RNA-Polymerase abhängigen H1-Promotors durch Insertion von einer oder zwei Operatorsequenzen (TetO) für den Tetrazyklin-Repressor (TetR) an verschiedene Orte innerhalb der Sequenz des H1-Promotors drei induzierbare Promotor-Derivate geschaffen. Die drei entwickelten H1-Promotor-Derivate wurden zur Expression von shRNA gegen Plk1 eingesetzt und in bezug auf die Auslösung der RNAi-Antwort getestet und untereinander verglichen. Zu diesem Zwecke wurde der endogene Plk1-Gehalt von HeLa-Tumorzellen auf Transkript- und auf Proteinebene bestimmt. Die Zellen wurden zuvor mit Plasmid-Vektoren für konstitutive TetR-Expression und jeweils einer der verschiedenen shRNA-Expressions-Kassetten ko-transfiziert. Als Kontrollen dienten dabei Wildtyp-H1-Promotoren, welche zur konstitutiven Expression von shRNA gegen Plk1 und einer unwirksamen Kontroll-shRNA eingesetzt wurden. Mit Hilfe des synthetischen Tetrazyklin-Analogons Doxyzyklin, welches einen potenten Aktivator für TetR darstellt, konnten die hergestellten Promotor-Derivate induziert werden, was durch einen reduzierten intrazellulären Plk1-Gehalt sichtbar wurde. Dabei fiel auf, daß alle drei Promotor-Typen unterschiedliche Eigenschaften im nichtinduzierten Zustand wie auch im induzierten Zustand unter Anwesenheit von Doxyzyklin aufwiesen. Für die Basalaktivität in Abwesenheit von Doxyzyklin (leakiness) war die relative Lage der TetO-Sequenz(en) innerhalb des Promotors verantwortlich. So veränderte die Insertion einer TetO-Sequenz in 3’-Richtung der TATA-Box die Eigenschaften des Wildtyp-H1-Promotors weniger als die Insertion einer TetO-Sequenz in 5’-Richtung der TATA-Box. Zum Studium von Plk1 als Zielgen in der Krebstherapie wurde das Proliferationsverhalten von HeLa-Tumorzellen als Antwort auf die Doxyzyklin-vermittelte Induktion der shRNAExpression unter Kontrolle eines der induzierbaren Promotoren ermittelt. Dabei konnte die Proliferation von Tumorzellen durch einen reduzierten Plk1-Gehalt, welcher durch die Doxyzyklin-induzierte Auslösung der RNAi-Antwort vermittelt wurde, erfolgreich inhibiert werden. Zur Überprüfung der Eignung entwickelter Systeme, Tumorwachstum in vivo inhibieren zu können, wurden die entwickelten RNAi-Kassetten in das Genom von TetRexprimierenden HeLa-Zellen integriert und so stabile Klone geschaffen. Stabile HeLa-Klone zur induzierbaren Expression von Plk1-spezifischer shRNA, wie auch zur induzierbaren Expression von einer Kontroll-shRNA, wurden in die gegenüberliegenden Flanken von immunsupprimierten Nacktmäusen inokuliert, um anhand von Xenograft-Modellen einen direkten Vergleich des Tumorwachstums unter gleichen äußeren Bedingungen zu ermöglichen. Einem Teil der Mäuse wurde Doxyzyklin ins Trinkwasser gegeben, während Kontrollmäuse kein Doxyzyklin verabreicht bekamen. Das Tumorwachstum von Xenograft-Tumoren, welche aus Klonen zur Expression von shRNA gegen Plk1 hervorgingen, konnte in Doxyzyklin-behandelten Mäusen um 53% auf 47% an Tag 51 nach Inokulierung der Zellen inhibiert werden. Tumoren nicht-induzierter Mäuse, sowie Tumoren aus induzierten Mäusen, welche Kontroll-shRNA exprimierten, wuchsen dagegen unverändert in gleichem Maße. Anhand der in dieser Arbeit entwickelten induzierbaren H1-Promotor-Derivate zur konditionellen Auslösung von RNAi wurden wertvolle genetische Werkzeuge geschaffen, welche für das Studium der Genfunktion eingesetzt werden können. Im Falle der Unterdrückung von Plk1 können mit ihrer Hilfe sowohl grundlegende molekularbiologische Zusammenhänge studiert als auch die Bewertung von Plk1 als Zielgen in der Krebstherapie bewertet werden. Im Gegensatz zu kürzlich entwickelten Kinase-Inhibitoren, welche auf Proteinebene gegen Plk1 gerichtet sind und aufgrund ihrer bislang nicht nachgewiesenen Spezifität verwandte Kinasen in ihrer Wirkungsweise beeinflussen könnten, ist eine RNAibasierte Strategie hoch spezifisch und verspricht eine große Relevanz für zukünftige therapeutische Ansätze. Vorraussetzung für erfolgversprechende RNAi-basierte Strategien ist eine hohe Konservierung der Sequenz beteiligter Zielgene. Im Falle von Plk1 konnte eine hohe Konservierung durch Sequenzanalyse der Plk1-Gene von 15 Mamma-Karzinomen, 11 Ovarial-Karzinomen und mehrerer Tumorzellinien bestätigt werden.
Synaptopodin is the founding member of a family of actin-associated proline-rich proteins. It is present in a subset of telencephalic dendritic spines, where it is tightly associated with the dendritic spine apparatus, a putative calcium store. Synaptopodin-deficient mice lack the spine apparatus and show deficits in long-term potentiation and spatial memory. Thus, synaptopodin appears to play a role in synaptic plasticity. In the present thesis, three major questions were addressed: (1) What is the distribution of synaptopodin and the spine apparatus in identified hippocampal neurons? (2) Is the distribution of synaptopodin affected by denervation? (3) Is synaptopodin involved in the regulation of denervation-induced spine loss? The major findings of this thesis are: (1) Immunohistochemistry in the hippocampus of wildtype and EGFP-transgenic mice revealed significant layer-specific differences in the prevalence of synaptopodin at the level of individual neurons. (2) Light and electron microscopic analysis also revealed the presence of synaptopodin in axon initial segments of cortical and hippocampal principal neurons. There, it was found to be an essential component of the cisternal organelle, a putative axonal homologue of the dendritic spine apparatus. (3) Immunohistochemistry in the rat fascia dentata before and following entorhinal deafferentation revealed changes in synaptopodin expression in denervated and non-denervated layers of the hippocampus, suggesting that the distribution of synaptopodin in hippocampal neurons is regulated by presynaptic signals. (4) The dynamics of denervation-induced spine plasticity were studied in vitro using confocal live imaging of organotypic entorhino-hippocampal slice cultures. Whereas spines were remarkably stable under control conditions, spine loss and spine formation were seen following denervation. No significant differences were observed between cultures from wildtype and synaptopodin-deficient mice, suggesting that synaptopodin is not involved in lesion-induced spine plasticity. (5) Finally, a set of transgenic mice expressing fluorescently tagged synaptopodin were generated to facilitate future experiments on the dynamics and function of synaptopodin. In summary, this thesis presents novel findings on (1) the subcellular distribution of synaptopodin in spines and the axon initial segment, (2) the molecular composition of the cisternal organelle, and (3) the dynamics of spines and the spine apparatus organelle following deafferentation in vivo and in vitro.
Compared to all other organisms with 1 to 3 heat stress transcription factors (Hsfs) or Hsf-related factors, plants have extraordinarily large Hsf families with more than 20 Hsfs. Plant Hsfs are classified into three classes according to their oligomerization domains which is built of hydrophobic heptad repeats (HR) in two parts, HR-A and HR-B. Both parts may be immediately adjacent (class B), or they are separated by insertion of 21 (class A) and 7 amino acid residues (class C). In plant Hsf family, detailed investigations are so far limited to Hsfs A1a, A2, A3, A4d, A9, and B1. They strongly indicate functional diversification to be the main reason for the coexistence of multiple Hsfs. As an example the functional triad of HsfA1a, HsfA2, and HsfB1 is essential for all three phases of the hs response, (i) the triggering of the response by HsfA1a as master regulator, (ii) the maintenance and high efficiency of hs gene transcription by cooperation of HsfA1a with Hsfs A2 and B1, and finally, (iii) the restoration of house-keeping gene transcription during the recovery phase mediated by HsfB1 in cooperation with house-keeping transcription factors. The results presented in this thesis for Hsfs A4 and A5 open completely different aspects of functional diversification and cooperation of Hsfs. HsfA4 and HsfA5 homooligomerize and bind to corresponding HSE motifs. But in contrast to the highly active HsfA4, HsfA5 is completely inactive as transcriptional activator. Yeast two hybrid and GST pull-down techniques showed that both Hsfs have strong tendency for heterooligomerization. Using fluorescence microscopy the HsfA4/A5 heterooligomers were found to localize in the nucleus. These complexes are transcriptionally inactive due to the impairment of DNA binding. The repressor function of HsfA5 requires only its OD and no additional factors, e.g. a putative co-repressor recruited by the C-terminal domain, are involved. Evidently, the repressor effect mainly results from the interference with the oligomeric state of HsfA4b, which is essential for efficient DNA binding and activator functions. EST database search revealed that plants have a single HsfA5 and usually two A4-type Hsfs. Using bioinformatics tools, Hsfs A4 and A5 were found to be phylogenetically closely related and clearly distinct from the other members of the Hsf family. On the basis of RT-PCR and Microarray data the representatives of the A4/A5 group are well expressed in different plant tissues albeit at very different levels which change with the developmental stages and stress conditions In rice and Arabidopsis, HsfA4 functions as an anti-apoptotic factor for stress induced oxidative damages. Based on my results, I hypothesize that HsfA5 functions as a novel type of selective repressor, regulating the function of A4-type Hsfs in plants. Considering the high sequence conservation with in plant Hsf family, it is tempting to speculate that this role of Hsf4/A5 pair is a fundamental feature of the Hsf system in plants.