Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
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Mit der vorliegenden Arbeit wurde die Nutzbarkeit morphologischer und anatomischer Merkmale aus den Bereichen des Fruchtknotens und der Samenanlangen für die Systematik und Taxonomie der Bromelioideae (Bromeliaceae) untersucht. Hierzu wurden 30 Merkmale im Bereich des Fruchtknotens und der Samenanlagen definiert und anhand anatomischer Schnittpräparate die Verteilung der Merkmalsausprägungen an 102 Arten aus 28 (von 32) Gattungen der Unterfamilie Bromelioideae sowie zwei Vertretern der Unterfamilie Pitcairnioideae als Vergleichgruppe ermittelt. Allein 41 Taxa entstammten der größten und als polyphyletisch anzunehmenden Gattung Aechmea mit Vertretern aus allen sieben Untergattungen. Die Auswertung der Merkmalsverteilung erfolgte einerseits im Hinblick auf eine funktionale Deutung beobachteter Kopplungen bestimmter Strukturen im ökologischen Kontext und zum anderen unter taxonomischen Gesichtspunkten im Hinblick auf Beantwortung der Fragen, wieweit derzeitige Gattungsumgrenzungen von den hier untersuchten Merkmalen unterstützt werden, bzw. wie weit Anregungen zur Abänderung bestehender Konzepte abgeleitet werden können, welche Beziehungen zwischen den Untergattungen von Aechmea und anderen Gattungen der Bromelioideae bestehen und wodurch sich basale Linien der Bromelioideae von den abgeleiteten Formen der „Eu- Bromelioideae“ im Sinne von SCHULTE (2007) unterscheiden lassen. Um diese Fragen zu beantworten, wurden zwei unterschiedliche Ansätze kombiniert. Die Verteilung der Merkmalszustände wurde einerseits auf Topologien geplottet, die aus publizierte Phylogenien mit genetischen Merkmalen als Datenquelle beruhen. Desweiteren wurden neue Parsimonieanalysen durchgeführt a) auf der Grundlage einer morphologischen Datenmatrix mit den 30 selbst erhobenen Merkmalen aus dem Fruchtknoten- und Samenbereich, b) einer weiteren Matrix, in die fünf weitere selbst erhobene Merkmale aus dem floralen Bereich eingehen und schließlich c) einem Datensatz, in den zusätzlich acht aus der Literatur entnommene Angaben zur Morphologie und Ökologie der untersuchten Pflanzen eingingen. Die aus den molekularen Analysen von SCHULTE et al. (2005) hervorgehende Gliederung der Unterfamilie in eine paraphyletische Gruppe von basalen Linien und der von SCHULTE (2007) als „Eu-Bromelioideae“ bezeichneten monophyletischen Gruppe abgeleiteterer Gattungen findet eine deutliche Entsprechung in Merkmalen des Fruchtknotenbereichs und der Samenanlagen. Die untersuchten Vertreter der basalen Linien besitzen alle ± rechtwinklig von der Fruchtknotenachse abspreizende Samenanlagen, diese sind auf mehr als 70% der Fruchtknotenachse verteilt und die Mikropyle ist stets relativ lang ausgebildet (>100 micro m). Eine der Kerninnovationen der Eu-Bromelioiden scheint die Entwicklung des chalazalen Samenanhängsels als Hilfsinstrument bei der Besiedlung glatter Oberflächen gewesen zu sein. Diese Struktur findet sich nur bei Eu-Bromelioideae und ist stets bereits an der Samenanlage vorgebildet. Sekundär scheint dieses chalazale Anhängsel innerhalb der Eu-Bromelioideae allerdings auch immer wieder verloren gegangen zu sein. Die Umgrenzung der meisten Gattungen sowohl der basalen Linien als auch der Eu-Bromelioideae konnten in ihrer jetzigen Form anhand der Merkmale des Fruchtknotenbereichs und der Samenanlagen nachvollzogen werden. Eine Ausnahme hiervon stellt lediglich die hochgradig polyphyletische Gattung Aechmea s.l. dar. Für keine der untersuchten Gattungen konnten synapomorphe Merkmalszustände erkannt werden, vielmehr gibt es jeweils gattungsspezifische Kombinationen von Merkmalen. Die Ausprägungen der Einzelmerkmale dagegen sind stets auch in anderen Verwandschaftsgruppen zu beobachten. Die hier untersuchten Merkmale unterstreichen das für die Bromelioideae seit langem bekannte Phänomen eines extrem hohen Homoplasiegrades in nahezu allen morphologischen Strukturen. Selbst für den Fruchtknoten lassen sich klare Abhängigkeiten der Merkmalsausprägungen von ökologischen Selektionsfaktoren erkennen. Insbesondere scheinen funktionale Notwendigkeiten im Kontext der Nektarsekretion und der Bestäubungsökologie für die Merkmalsausprägung des Fruchtknotens eine wichtige Rolle zu spielen. Die Samenanlage ist zwar zum Zeitpunkt der Anthese noch nicht direkten Selektionsdrücken ausgesetzt, ihre Merkmale sind aber nur dann zu verstehen, wenn die Funktion hier bereits angelegter Strukturen (wie z.B. der chalazalen Samenanhängsel) im Kontext mit den reifen Samen gedeutet wird.
Entwicklung eines bioartifiziellen Nierentubuluskonstruktes auf Basis humaner Nierenepithelzellen
(2009)
Bei einem chronischen oder akuten Ausfall der Niere stehen im klinischen Alltag extrakorporale Nierenersatzverfahren, wie die Hämodialyse, Hämofiltration und Hämodiafiltration zur Verfügung. Die genannten medizinischen Verfahren bilden nur die physikalischen Prinzipien des Glomerulus ab und können die, über eine reine Stofftrennung hinausgehenden, im Besonderen die komplexen, physiologischen Funktionen des renalen Tubulussystems nicht nachbilden. Die mit dem Ausfall der Nierenfunktion verbundenen metabolischen und endokrinen Störungen werden somit nicht ausreichend korrigiert und sind Ursache der hohen Morbidität und Mortalität dieser Patientengruppe durch kardio-vaskuläre sowie inflammatorische Komplikationen. Mit der Anwendung des Tissue Engineerings, der Integration von Zellen bzw. Geweben und deren biologischer Funktionen in form- und funktionsgebende Substrate stünden für diese Problematik Methoden zur Verfügung, die fehlenden biologischen Funktionen der Tubulusepithelien der Niere in die bereits vorhandenen, modernen Nierenersatztherapien zu integrieren und den Patienten zur Verfügung zu stellen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Membranmaterialien, Kulturbedingungen wie Sauerstoffbedarf, Medienformulierungen und Strömungszustände identifiziert, Systeme und Methoden entwickelt, die es ermöglichen, ein BTK mit primären, humanen Tubuluszellen zu bilden und über mikroskopische Methoden den Differenzierungsstatus der Zellen innerhalb der Membrankapillaren zu erfassen. Der Sauerstoffbedarf distaler und proximaler Tubulusepithelzellen wurde unter verschiedenen Bedingungen ermittelt und führte zusammen mit einem Literaturvergleich sowie theoretischen Betrachtungen der maximalen Scherkräfte zur Auslegung der in vitro Perfusionsparameter des entwickelten Kultursystems. Es konnte ein klinisch etabliertes Membranmaterial identifiziert werden, welches den primären Zellen ohne vorherige Bioaktivierung als ein optimales Substrat dient und somit spätere Zulassungsverfahren für den klinischen Einsatz vereinfacht. Die Entwicklung eines serumarmen Mediums für die Kultur der primären Zellen stellte sich als wichtigster Schritt in der Übertragung der zuvor mit permanenten Zelllinien entwickelten Systeme und Methoden heraus. Mittels mikroskopischer Methoden (REM & CLSM) konnte die Differenzierung der verwendeten Tubulusepithelzellen innerhalb der Hohlfasermodule anhand spezifischer Marker nachgewiesen und somit der Erfolg der in dieser Arbeit entwickelten Systeme und Methoden dokumentiert werden. Trotz des Nachweises der prinzipiellen Machbarkeit im Labormaßstab, stellt die verwendete Zellquelle aufgrund der geringen Verfügbarkeit im Upscaling Prozess vom Labor hin zu einem klinischen Therapieverfahren, die größte Hürde dar. Aktuelle Entwicklungen bei der Identifizierung adulter Stammzellfraktionen der Niere, im Besonderen der Beitrag CD133+ Zellen bei der Tubulusregeneration wurden in dieser Arbeit aufgegriffen. Die Ergebnisse des durchgeführten CD133 Screenings der verwendeten Zellfraktionen zeigen, dass gerade die hochaufgereinigten, proximalen und distalen Fraktionen einen verminderten Anteil dieser potentiellen Stammzellfraktion enthalten. Weniger aufgereinigte Fraktionen könnten somit eine Alternative bei der zukünftigen Entwicklung von bioartifiziellen Tubuluskonstrukten darstellen.
Photosystem II (PSII) is a polypeptide-cofactor complex organised as a homodimeric multisubunit protein embedded in the thylakoid membrane. PSII monomers are heterooligomers related to each other by a pseudo-twofold axis perpendicular to the membrane plane (Loll et al. 2005). PSII acts as a photochemical enzyme that through the chlorophylls and the other cofactors catalyses photon capture and electron transfer from water to the plastoquinone pool with concomitant evolution of oxygen. Photon capture and charge separation take place in the PSII core which consists of the D1 and D2 proteins, the cytochrome b559 alpha- and beta-chains (PsbE and F subunits) and the chlorophyll a-binding antenna proteins CP43 and CP47 (Loll et al. 2005). The remaining polypeptides are low molecular mass proteins with not clearly understood fuctions; they include chloroplast-encoded (PsbH, I, J, K, L, M, N, T and Z) and nucleus-encoded (PsbR, S, W and X) proteins consisting of one to four transmembrane helices (Barber et al. 1997). The oxygen-evolving part of PSII consists of a Mn-Ca transition complex called Mn cluster or oxygen evolving complex that is situated on the luminal side of PSII. In higher plants it is stabilised by the PsbO (33 kDa), PsbP (23 kDa) and PsbQ (17 kDa) extrinsic subunits (Soursa et al. 2006; Ifuku et al. 2005). The structure and mechanisms related to the oxygen evolving complex of PSII are not completely clarified. Currently two high resolution structures from the cyanobacteria S. elongatus are available (Loll et al. 2005; Ferreira et al. 2004) Nevertheless structural information is not as well defined in green algae and higher plants as in cyanobacteria. In fact the 8Å structure available from spinach has too low resolution for addressing questions such as the structural and functional differences in respect to PSII from cyanobateria (Rhee et al. 1997).. Therefore it is obvious that for PSII from higher plants the main general questions are still open: is the structure of PSII from higher plants equivalent to the structures observed in cyanobacteria? Is the typical higher plants subunit PsbS stably or transiently bound to PSII? Finding an answer to these questions was the main focus of this work. In this work a simple and rapid protocol to isolate the oxygen-evolving photosystem II (PSII) core complex from Nicotiana tabacum was developed. A PSII having a His-tag extension made of six or ten consecutive histidine residues at the N-terminus of the PsbE subunit was purified by a single-step Ni2+ NTA-affinity column chromatography after solubilisation of the thylakoid membranes using different mild detergents. Characterization of the oxygen evolution and the subunit composition by immunoblotting and mass spectroscopy revealed that the His-tagging did not affect the functional integrity of the PSII reaction center. The final PSII core complex was purified in a single step from solubilised thylakoids in less than 14 hours getting a very pure sample in high amount. The isolated core complex was in a dimeric form as demonstrated by Blue Native PAGE, analytical gel filtration and single particles analysis; with a molecular mass of about 500 kDa, consisting of D1, D2, CP43, CP47, 33 kDa and low molecular weight proteins. The preparation retains a high rate of oxygen-evolving activity but showed different stabilities of the binding of the three extrinsic proteins. The subunit of 33 kDa was always present in the preparations with a constant amount, whereas the 23 and 17 kDa subunits were always in less and unconstant amounts. Nevertheless the oxygen evolution was not depending on the amount of the 23 and 17 kDa subunits. Furthermore the preparation showed a high oxygen-evolving activity of 1390 micromol/mg Chl·h-1 in presence of betaine, while its activity was 440-680 micromol/mg Chl·h-1 in its absence. The presence of 1.0 mol/L betaine during the isolation of PSII increased the preservation of the photochemical activity hence the oxygen evolution. It was inferred from these results that His-tagging does not affect the functional and structural integrity of the PSII core complex and that the “Histag strategy” is highly useful for biochemical, physicochemical and structural studies of higher plant PSII. PSII is directly involved in two essential processes, the efficient capture and funnelling of light energy to the reaction centre and the controlled dissipation of excess excitation energy. Those functions require structural and functional flexibility in order to be performed with high efficiency. Moreover light-harvesting proteins respond to an external signal, the thylakoid pH, to induce feedback control regulating those activities in every moment. This process called non-photochemical quenching (NPQ) is mainly depending on the xanthophyll cycle and the PsbS protein (Szabo et al. 2005). In this work several new evidences related with those two processes were found. The subunit PsbS is a polypeptide whose involvement in the NPQ processes is debated. Nevertheless, its position in the PSII complex and the mechanisms by which this subunit contributes to carry out the NPQ functions are not definitely known. In addition it is not sure if it is a pigment binding protein or not. Currently several lines of evidence indicate that this subunit is able to bind two molecules of zeaxanthin, one of the pigments involved in the xanthophyll cycle. In this work immunolabelling indicated that PsbS is tightly bound to the PSII core dimer, monomer and incomplete PSII particles as Reaction Centre-CP47 (RC-CP47). Furthermore qualitative HPLC indicates a complete absence of zeaxanthin in the sample and the presence of violaxanthin, another pigment involved in the xanthophyll cycle. The absence of zeaxanthin was expected considering that the plants were harvested after the dark period and that the particles were purified in complete dark (or in green light), whereas the presence of violaxanthin was unexpected considering that so far no evidence of violaxanthin bound to PSII cores devoid of LHC proteins was reported. Furthermore the amount of chlorophyll b was not relevant for suspecting this pigment bound to PsbS. Therefore we conclude that if PsbS is able to bind chlorophyll it has to be a chlorophyll a. The results indicate that PsbS could be able to bind not only zeaxanthin but also violaxanthin. The extrinsic subunit Psb27 was also found in this preparation. The presence and the amount of this subunit, reported to be involved in the repair of damaged PSII, was not constant and therefore behaving as the other two extrinsic proteins 23kDa (PsbP) and 17kDa (PsbQ). Electron crystallography studies on spinach PSII particles purified by differential solubilisation resulted in crystalline tubes with new unit cell constants. From data analysis a density map at 15Å resolution was obtained with a P22121 symmetry. However, at this resolution it cannot be said if the internal symmetry axis is related with the two-fold axis of the dimer or the pseudo two-fold axis of the monomer. In conclusion a method to isolate functional, pure PSII core complexes was developped. These samples, together with the improved 2d crystallisation protocol could lead to crystals with higher quality hence better resolution density maps in the future.
Global warming is expected to be associated with diverse changes in freshwater habitats in north-western Europe. Increasing evaporation, lower oxygen concentration due to increased water temperature and changes in precipitation pattern are likely to affect the survival ratio and reproduction rate of freshwater gastropods (Pulmonata, Basommatophora). This work is a comprehensive analyse of the climatic factors influencing their ranges both in the past and in the near future. A macroecological approach showed that for a great proportion of genera the ranges were projected to contract by 2080, even if unlimited dispersal was assumed. The forecasted warming in the cooler northern ranges predicted the emergence of new suitable areas, but also reduced drastically the available habitat in the southern part of the studied region. In order to better understand the ranges dynamics in the past and the post glacial colonisation patterns, an approach combining ecological niche modelling and phylogeography was used for two model species, Radix balthica and Ancylus fluviatilis. Phylogeographic model selection on a COI mtDNA dataset confirmed that R. balthica most likely spread from two central European disjunct refuges after the last glacial maximum. The phylogeographic analysis of A. fluviatilis, using 16S and COI mtDNA datasets, also inferred central European refugia. The absence of niche conservatism (adaptive potential) inferred for A. fluviatilis puts a cautionary note on the use of climate envelope models to predict the future ranges of this species. However, the other model species exhibited strong niche conservatism, which allow putting confidence into such predictions. A profound faunal shift will take place in Central Europe within the next century, either permitting the establishment of species currently living south of the studied region or the proliferation of organisms relying on the same food resources. This study points out the need for further investigations on the dispersal modes of freshwaters snails, since the future range size of the species depend on their ability to establish in newly available habitats. Likewise, the mixed mating system of these organisms gives them the possibility to fund a new population from a single individual. It will probably affect the colonisation success and needs further investigation.
In der äußeren plexiformen Schicht (OPL) der Säugetierretina sind die Photorezeptoren mit den Horizontal- und den Bipolarzellen verschaltet. Diese erste neuronale Verschaltungs-ebene des Sehsystems birgt eine hochkomplexe Architektur aus chemischen und elektrischen Synapsen. Sie ermöglicht die Modulation des Lichtsignals sowie die Aufspaltung der Signale in parallele Übertragungswege. In der vorliegenden Doktorarbeit wurden verschiedene Synapsensysteme in der OPL von Maus-, Kaninchen-, und Makakenretinae mittels immunhistochemischer Färbetechniken licht- und elektronen-mikroskopisch untersucht. In der Mausretina wurden die anatomischen Eigenschaften der Endfüßchen blau-empfindlicher (S-) Zapfen untersucht. Die S-Zapfenendfüßchen waren um 15 % kleiner als die der M-Zapfen, die Bereiche der Invaginierungen am S-Zapfenendfüßchen hingegen um 35 %. Eine deutliche Reduktion der Horizontalzellkontakte ging damit einher. Die Zahl der postsynaptisch von OFF-Bipolarzellen exprimierten Glutamatrezeptor- (GluR) Unterein-heiten GluR1 und GluR5 war am S-Zapfenendfüßchen um fast 50 % kleiner als an M-Zapfen. Dieser Befund spiegelte die geringe Anzahl synaptischer Kontakte von OFF-Bipolarzellen am S-Zapfen wider. Die OFF-Bipolarzelltypen 1 und/oder 2 waren für diese Reduktion verantwortlich. Diese Befunde sind ein erster Hinweis für den sogenannten Grün-OFF-Signalweg in der Mausretina. In der Makakenretina wurde die Verteilung von Protocadherin β16 (Pcdh β16) untersucht. Es konnte auf postsynaptischer Seite an den Photorezeptorterminalien gezeigt werden. Pcdh β16 lag auf den invaginierenden Spitzen von Dendriten der H1 Horizontalzellen sowie an ihren desmosome-like junctions unterhalb der Zapfenendfüßchen. An diesen Orten fielen die Pcdh β16-immunreaktiven Punkte mit den dort von H1 Zellen exprimierten GluR-Untereinheiten GluR2 - 4 und GluR6/7 zusammen. Im Zuge dieser Analyse wurde ebenfalls eine Kolokalisation dieser AMPA- (GluR2 - 4) und Kainat- (GluR6/7) Rezeptoren an den desmosome-like junctions festgestellt. Darüber hinaus zeigte eine elektronenmikroskopische Untersuchung, dass Pcdh β16 auch an flachen Synapsen in Triaden-assoziierter Position am Zapfenendfüßchen zu finden ist. Dies kann als Hinweis auf eine Expression durch flat midget Bipolarzellen oder Bipolarzellen des Typs DB3 gewertet werden. Dies lässt vermuten, dass dieses Protein an der Formation zelltypspezifischer Kontakte bzw. Synapsen beteiligt ist. In einer vergleichenden Studie der synaptischen Verteilung des zytoplasmatischen Gerüstproteins Zonula Occludens-1 (ZO-1) in Makaken-, Kaninchen- und Mausretinae zeigte sich ein sehr einheitliches sowie auch zelltypspezifisches Verteilungsmuster. ZO-1 fiel bei allen Spezies mit Connexin 36 (Cx36) an den gap junctions zwischen Photo-rezeptorterminalien und zwischen den Dendriten von OFF-Bipolarzellen zusammen. Außerdem ist ZO-1 mit gap junctions bestimmter Horizontalzellen assoziiert: In der OPL der Kaninchenretina fiel es mit Cx50 zusammen, dem Connexin der axonlosen A-Typ Horizontalzellen. An den großen gap junctions zwischen den Primärdendriten dieser Zellen bildete ZO-1 jedoch eine Zaun-ähnliche Struktur als Abgrenzung um die gap junctions herum, anstatt direkt mit den Connexinen kolokalisiert zu sein. Eine direkte Interaktion mit den Connexinen wird durch die räumliche Anordnung weitgehend ausgeschlossen, was auf eine Funktion von ZO-1 als tight- oder adherens junction Protein hindeutet. In der Mausretina fiel ZO-1 mit Cx57 an dendro-dendritischen gap junctions zwischen den Maus-Horizontalzellen zusammen. In der Makakenretina sind die Connexine der Horizontalzellen noch nicht bekannt. Trotzdem ließ sich ZO-1 den dendro-dendritischen gap junctions zwischen H1 Horizontalzellen zuordnen. Darüber hinaus zeigte sich eine enge Assoziation dieser dendro-dendritischen gap junctions mit den GluRs unterhalb der Zapfenendfüßchen an den desmosome-like junctions. Der von den GluRs ermöglichte Calcium-Einstrom könnte sich durch die räumliche Nähe zu den Connexinen modulierend auf die Leitfähigkeit der elektrischen Synapsen auswirken.
Lentiviral vectors mediate gene transfer into dividing and most non-dividing cells. Thereby, they stably integrate the transgene into the host cell genome. For this reason, lentiviral vectors are a promising tool for gene therapy. However, safety and efficiency of lentiviral mediated gene transfer still needs to be optimised. Ideally, cell entry should be restricted to the cell population relevant for a particular therapeutic application. Furthermore, lentiviral vectors able to transduce quiescent lymphocytes are desirable. Although many approaches were followed to engineer retroviral envelope proteins, an effective and universally applicable system for retargeting of lentiviral cell entry is still not available. Just before the experimental work of this thesis was started, retargeting of measles virus (MV) cell entry was achieved. This virus has two types of envelope glycoproteins, the hemagglutinin (H) protein responsible for receptor recognition and the fusion (F) protein mediating membrane fusion. For retargeting, the H protein was mutated in its interaction sites for the native MV receptors and a ligand or a single-chain antibody (scAb) was fused to its ectodomain. It was hypothesised that the retargeting system of MV can be transferred to lentiviral vectors by pseudotyping human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) derived vector particles with the MV glycoproteins. As the unmodified MV glycoproteins did not pseudotype HIV vectors, two F and 15 H protein variants carrying stepwise truncations or amino acid (aa) exchanges in their cytoplasmic tails were screened for their ability to form MV-HIV pseudotypes. The combinations Hcd18/Fcd30, Hcd19/Fcd30 and Hcd24+4A/Fcd30 led to most efficient pseudotype formation with titers above 10exp6 transducing units /ml, using concentrated particles. The F cytoplasmic tail was truncated by 30 aa and the H cytoplasmic tail was truncated by 18, 19 or 24 residues with four added alanines after the start methionine in the latter case. Western blot analysis indicated that particle incorporation of the MV glycoproteins was enhanced upon truncation of their cytoplasmic tails. With the MV-HIV vectors high titers on different cell lines expressing one or both MV receptors were obtained, whereas MV receptor-negative cells remained untransduced. Titers were enhanced using an optimal H to F plasmid ratio (1:7) during vector particle production. Based on the described pseudotyping with the MV glycoprotein variants, HIV vectors retargeted to the epidermal growth factor receptor (EGFR) or the B cell surface marker CD20 were generated. For the production of the retargeted vectors MVaEGFR-HIV and MVaCD20-HIV, Fcd30 together with a native receptor blind Hcd18 protein, displaying at its ectodomain either the ligand EGF or a scAb directed against CD20 were used. With these vectors, gene transfer into target receptor-positive cells was several orders of magnitude more efficient than into control cells. The almost complete absence of background transduction of non-target cells was e.g. demonstrated in mixed cell populations, where the CD20-targeting vector selectively eliminated CD20-positive cells upon suicide gene transfer. Remarkably, transduction of activated primary human CD20-positive B cells was much more efficient with the MVaCD20-HIV vector than with the standard pseudotype vector VSV-G-HIV. Even more surprisingly, MVaCD20-HIV vectors were able to transduce quiescent primary human B cells, which until then had been resistant towards lentiviral gene transfer. The most critical step during the production of MV-HIV pseudotypes was the identification of H cytoplasmic tail mutants that allowed pseudotyping while retaining the fusion helper function. In contrast to previously inefficient targeting strategies, the reason for the success of this novel targeting system must be based on the separation of the receptor recognition and fusion functions onto two different proteins. Furthermore, with the CD20-targeting vector transduction of quiescent B cells was demonstrated for the first time. Own data and literature data suggest that CD20 binding and hyper-cross-linking by the vector particles results in calcium influx and thus activation of quiescent B cells. Alternatively this feature may be based on a residual binding activity of the MV glycoproteins to the native MV receptors that is insufficient for entry but induces cytoskeleton rearrangements dissolving the post-entry block of HIV vectors. Hence, in this thesis efficient retargeting of lentiviral vectors and transduction of quiescent cells was combined. This novel targeting strategy should be easily adaptable to many other target molecules by extending the modified MV H protein with appropriate specific domains or scAbs. It should now be possible to tailor lentiviral vectors for highly selective gene transfer into any desired target cell population with an unprecedented degree of efficiency.
Das Ziel dieser Arbeit war es, RNA-Strukturen als potentielle Zielstrukturen für die Medikamentenentwicklung zu untersuchen. Hierbei ging es im Speziellen um die Anwendung Virtueller Screening Verfahren für die RNA-Liganden-Vorhersage. Hierzu wurde die als TAR-Motiv (transactivating response element) bekannte RNA-Struktur der mRNAs des HI-Virus ausgewählt. Diese Struktur wurde gewählt, da mit den vier PDB-Einträgen 1ANR, 1ARJ, 1LVJ und 1QD3 bereits experimentell motivierte Strukturmodelle zum Beginn der Untersuchung vorlagen. Ausschlaggebend war hierbei auch das Vorhandensein eines Tat-TAR-FRET-Assays im Rahmen des SFB 579, in welchem diese Arbeit angefertigt wurde. Die Aufmerksamkeit, welche dem HI-Virus im Rahmen der Bekämpfung der Immunschwächekrankheit bereits zukam, führte bei dem gewählten Testmodell ebenfalls zu einem, wenn auch immer noch überschaubaren Datensatz bereits getesteter Substanzen, der als Grundlage für einen Liganden-basierten Ansatz als erste Basis dienen konnte. Basierend auf diesen Voruntersuchungen ergaben sich die weiteren Schritte dieser Arbeit. Die Arbeit lässt sich zusammenfassend in vier zum Teil parallel verlaufende Phasen einteilen: Phase 1:Bestandsaufnahme bekannter Informationen über die Zielstruktur · experimentell bestimmte Zielstrukturen · experimentell bestimmte Liganden/Nichtliganden der Zielstruktur Phase 2: Ableiten eines ligandenbasierten Ansatzes zur Vorhersage von potentiellen Bindern der Zielstruktur aus Substanzbibliotheken, der nicht auf Strukturdaten der Zielstruktur beruht. Phase 3: Analyse der bekannten Konformere der Zielstruktur auf konstante Angriffspunkte für ein spezielles Liganden-Design. Phase 4: Einbinden der bekannten Strukturinformationen der Zielstruktur zur weiteren Verfeinerung der Auswahlverfahren neuer Kandidaten für die weitere experimentelle Bestimmung des Bindeverhaltens. Im Rahmen dieser Arbeit konnten mittels der Anwendung von künstlichen neuronalen Netzen in einem ligandenbasierten Ansatz durch virtuelles Screening der Chemikalien-Datenbanken verschiedener Lieferanten fünf neue potentielle TAR-RNA-Liganden identifiziert werden (drei davon mit einem Methylenaminoguanidyl-Substrukturmotiv), sowie als „Spin-Off“ durch die Anwendung der ursprünglich nur für den Tat-TAR-FRET-Assay vorgesehenen Testsubstanzen in einem Kooperationsprojekt (mittels CFivTT-Assay) zwei neue potentiell antibakterielle Verbindungen identifiziert werden. Die Beschäftigung mit der offensichtlichen Flexibilität der TAR-RNA und damit einer nicht eindeutig zu definierenden Referenz-Zielstruktur für das Liganden-Docking führte zur Erstellung eines Software-Pakets, mit dem flexible Zielstrukturen – basierend auf den Konformer-Datensätzen von MD-Simulationen – auf konstante Angriffspunkte untersucht werden können. Hierbei wurde ausgehend von der Integration eines Taschenvorhersage-Programms (PocketPicker) eine Reihe von Filtern implementiert, die auf den hierzu in einer MySQL-Datenbank abgelegten Strukturinformationen eine Einschränkung des möglichen Taschenraums für das zukünftige Liganden-Design automatisiert vornehmen können. Des Weiteren ermöglicht dieser Ansatz einen einfachen Zugriff auf die einzelnen Konformere und die Möglichkeit Annotationen zu den Konformeren und den daraus abgeleiteten Tascheninformationen hinzuzufügen, so dass diese Informationen für die Erstellung von Liganden-Docking-Versuchen verwendet werden können. Ferner wurden im Rahmen dieser Arbeit ein neuer Deskriptor für die Beschreibung von Taschenoberflächen eingeführt: der auf der „Skalierungs-Index-Methode“ basierende molekulare SIMPrint. Die Beschäftigung mit der Verteilung der potentiellen Bindetaschen auf der Oberfläche der Konformerensemble führte ferner zur Definition der Taschenoberflächenbildungswahrscheinlichkeit (Pocket Surface Generation Probability – PSGP) für einzelne Atome einer Zielstruktur, die tendenziell für die Einschätzung der Ausbildung einer potentiell langlebigen Interaktion eines Liganden mit der Zielstruktur herangezogen werden kann, um beispielsweise Docking-Posen zu bewerten.
The NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) is a large membrane bound protein complex coupling the redox reaction of NADH oxidation and quinone reduction to vectorial proton translocation across bioenergetic membranes. The mechanism of proton pumping is still unknown; it seems however that the reduction of quinone induces conformational changes which drive proton uptake from one side and release at the other side of the membrane. In this study the proposed quinone and inhibitor binding pocket located at the interface of the 49-kDa and PSST subunits was explored by a large number of point mutations introduced into complex I from the strictly aerobic yeast Yarrowia lipolytica. Point mutations were systematically chosen based on the crystal structure of the hydrophilic domain of complex I from Thermus thermophilus. In total, the properties of 94 mutants at 39 positions which completely cover the lining of the large putative quinone and inhibitor binding cavity are described and discussed here. A structure/function analysis allowed the identification of functional domains within the large putative quinone binding cavity. A possible quinone access path ranging from the N-terminal beta-sheet of the 49-kDa subunit into the pocket to tyrosine 144 could be defined, since all exchanges introduced here, caused an almost complete loss of complex I activity. A region located deeper in the proposed quinone binding pocket is apparently not important for complex I activity. In contrast, all exchanges of tyrosine 144, even the very conservative mutant Y144F, essentially abolished dNADH:DBQ oxidoreductase activity of complex I. However, with higher concentrations of Q1 or Q2 the dNADH:Q oxidoreductase activity was largely restored in the mutants with the more conservative exchanges. Proton pumping experiments showed that this activity was also coupled to proton translocation, indicating that these quinones were reduced at the physiological site. However, the apparent Km values for Q1 or Q2 were drastically increased, clearly demonstrating that tyrosine 144 is central for quinone binding and reduction. These results further prove that the enzymatically relevant quinone binding site of complex I is located at the interface of the 49-kDa and PSST subunits. The quinone binding pocket is thought to comprise the binding sites for a plethora of specific complex I inhibitors that are usually grouped into three classes. The large array of mutants targeting the quinone binding cavity was examined with a representative of each inhibitor class. Many mutants conferring resistance were identified which, depending on the inhibitor tested, clustered in well defined and partially overlapping regions of the large putative quinone and inhibitor binding cavity. Mutants with effects on type A (DQA) and type B (rotenone) inhibitors were found in a subdomain corresponding to the former [NiFe] site in homologous hydrogenases, whereby the type A inhibitor DQA seems to bind deeper in this domain. Mutants with effects on the type C inhibitor (C12E8) were found in a narrow crevice. Exchanging more exposed residues at the border of these well defined domains affected all three inhibitor types. Therefore, the results as a whole provide further support for the concept that different inhibitor classes bind to different but partially overlapping binding sites within a single large quinone binding pocket. In addition, they also indicate the approximate location of the binding sites within the structure of the large quinone and inhibitor binding cavity at the interface of the 49 kDa and the PSST subunit. It has been proposed earlier that the highly conserved HRGXE-motif in the 49-kDa subunit forms a part of the quinone binding site of complex I. Mutagenesis of the HRGXE-motif, revealed that these residues are rather critical for complex I assembly and seem to have an important structural role. The question why iron-sulfur cluster N1a is not detectable by EPR in many models organisms is not solved yet. Introducing polar and positively charged amino acid residues close to this cluster in order to increase its midpoint potential did not result in the appearance of the cluster N1a EPR signal in mitochondrial membranes from the mutants. Clearly, further research will be necessary to gain insights to the function of this iron-sulfur cluster in complex I. In an additional project, a new and simple in vivo screen for complex I deficiency in Y. lipolytica was developed and optimized. This assay probes for defects in complex I assembly and stability, oxidoreductase activity and also proton pumping activity by complex I. Most importantly, this assay is applicable to all Y. lipolytica strains and could be used to identify loss-of-function mutants, gain-of-functions mutants (i.e. resistance towards complex I inhibitors) and revertants due to mutations in both nuclear and mitochondrially encoded genes of complex I subunits.
Die Onkogenese geht mit einer Deregulation des Zellzyklus einher. Dabei spielt unter anderem die Regulation verschiedener krebsrelevanter Transkriptionsfaktoren eine wichtige Rolle. Ein Interaktionspartner und Regulator vieler dieser Faktoren ist das LIM-only Protein FHL2. Es ist bereits bekannt, dass sich der FHL2-Status zwischen normalen und entarteten Zellen in allen bisher untersuchten Geweben unterscheidet. Im Rahmen dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass dies auch im Brustgewebe der Fall ist. FHL2 wird in fast allen aggressiven Mammakarzinomen überexprimiert, nicht aber im Normalgewebe und nur schwach in nicht-invasiven "DCIS". Dies weist darauf hin, dass die FHL2-Menge mit der Aggressivität des Tumors korreliert. Weiterhin konnte hier zum ersten Mal nachgewiesen werden, dass FHL2 in die Zellzyklusregulation involviert ist. Am G1/S-Übergang kann FHL2 die Cyclin D1-Expression induzieren, was letztendlich zu einer Phosphorylierung des RB-Proteins und zum Eintreten der Zelle in die S-Phase führt. Wichtiger aber ist die hier gezeigte FHL2-abhängige Induktion von p21CIP/WAF, ein Zellzyklusinhibitor, der unter anderem auch in der G2/M-Kontrollpunkregulation involviert ist und normalerweise über p53 reguliert wird. Diese Induktion resultiert dort in einem verlangsamten Kontrollpunktübergang, wogegen eine Reduktion des FHL2-Gehalts einen beschleunigten G2/M-Übergang zur Folge hat. Zusätzlich zeigten Expressionsanalysen mit synchronisierten Brustkrebszellextrakten dass FHL2 zellzyklusabhängig exprimiert wird, mit einem Maximum am G2/M-Kontrollpunkt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die p21-Expression in den hier verwendeten Brustkrebszelllinien p53-unabhängig ist und ausschließlich von FHL2 abhängt. Hierbei wird die FHL2-abhängige p21 Expression wahrscheinlich über die Aktivierung des c-jun-Transkriptionsfaktors im MAPK-Signaltransduktionsweg induziert. In vivo und in vitro Interaktionsstudien haben eine Interaktion von FHL2 mit c-jun gezeigt, wobei die Interaktion über die ersten beiden LIM-Domänen vermittelt wird. Der FHL2-c-jun-Komplex bindet an die AP-1-Sequenz innerhalb des p21-Promotors und induziert dadurch p21. Dies führt zu einer Inhibition verschiedener CDE/CHR-regulierter Proteine wie CDC25C oder Plk1 und zu einer verzögerten Zellzyklusprogression. In diesem Zusammenhang konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass die FHL2-Expression nicht nur zu einer verlangsamten Proliferation führt, sondern auch zur Fähigkeit der Zelle zum zellmatrixunabhängigen Wachstum beisteuert. Es scheint auf den ersten Blick widersprüchlich, dass FHL2 für einen intakten G2/M-Kontrollpunkt und eine geringere Proliferationsrate sorgt, gleichzeitig aber zur Tumorentwicklung beiträgt. Es ist allerdings bekannt, dass Tumore ihr Wachstum verlangsamen bevor sie metastasieren. Auch führt ein erhöhter p21-Gehalt im Cytosol zu einer Inhibition der Apoptose, einer weiteren Eigenschaft von Tumoren. FHL2 ist daher ein signifikanter Faktor in der Onkogenese des Mammakarzinoms und aufgrund der differentiellen Expression in vielen Tumoren ein interessantes Ziel für Krebstherapien.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Eignung von Pseudorezeptoren im virtuellen Screening untersucht. Hierzu wurde nach intensiver Auseinandersetzung mit bisher bekannten Konzepten ein neues Computerprogramm zur automatischen Konstruktion von Pseudorezeptormodellen entwickelt. Das Ziel von Pseudorezeptoren ist die Konstruktion eines alternativen, artifiziellen Wirtssystems aus bekannten Liganden eines Zielproteins, dessen dreidimensionale Struktur unbekannt ist. Der generierte Pseudorezeptor ist zu verstehen als die Menge aller Pseudoatome, die um die Ausgangssubstanz(en) projiziert werden. Bei multiplen Referenzliganden wird eine Gewichtung der Pseudoatome durchgeführt. Zudem wird ausschließlich von Distanz- und Winkelparametern Gebrauch gemacht, die aus Untersuchungen von Kokristall-strukturen gewonnenen wurden. Eine abschließende Kodierung generierter Pseudorezeptoren als 90-dimensionalen Korrelationsvektor wurde zum virtuellen Screening eingesetzt. In zwei retrospektiven Fallbeispielen wird gezeigt, dass die generierten Pseudorezeptoren für COX-2 und PPARα mit den realen Zuständen ihrer kokristallisierten Bindetaschen in den PDB Einträge 6cox und 2p54 kompatibel sind. Im retrospektiven virtuellen Screening in der Wirkstoffdatenbank COBRA (8.311 Moleküle) nach COX-2 Inhibitoren (136 Aktive) konnte eine Anreicherung der aktiven Strukturen in den ersten zwei Perzentilen gezeigt werden (54% der Aktiven). Zudem konnten 80% der aktiven Moleküle bereits nach Vorhersage von 10% Falsch-Positiven gefunden werden. Im Falle des retrospektiven Screenings nach 94 PPAR Liganden konnten 30% der aktiven Moleküle nach der Vorhersage von 10% Falsch-Positiven entdeckt. Nach 20% Falsch-Positiver wurden 46% der PPAR Liganden wieder gefunden. Weiterhin konnte mit den ligandenbasierten Informationen eines H4 Pseudorezeptors eine Justierung einer potentiellen Bindetasche des Histamin H4 Rezeptors aus einer molekularen Dynamiksimulation vorgenommen werden. Schließlich wurde in einem prospektiven virtuellen Screening nach Histamin H4 Liganden mit einem Pseudorezeptor zwei Strukturen mit unterschiedlichem Grundgerüst und einem Ki ~ 30 µM identifiziert.