Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
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Weiterentwicklung und Evaluation eines drei-dimensionalen Hautmodelles zur pharmakologischen Testung
(2008)
Der Typ I Interferonrezeptor, der aus den Transmembranproteinen ifnar1 und ifnar2 besteht, nimmt eine wichtige Rolle bei der angeborenen und erworbenen Immunantwort ein. Durch Bindung von Typ I Interferonen werden antivirale, antiproliferative und immunmodulatorische Aktivitäten in der Zelle induziert. Die Wirkung der Interferone wird bereits bei der Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten eingesetzt. Es ist bislang nicht bekannt, wie die verschiedenen Typ I Interferone nach Bindung an einen gemeinsamen Rezeptor, unterschiedliche Zellantworten induzieren. So unterscheiden die Typ I Interferone sich nicht hinsichtlich ihrer Bindungsstelle oder der Stöchiometrie der Bindung an ifnar1 bzw. ifnar2. Sie weisen jedoch unterschiedliche Affinitäten zu den Rezeptoruntereinheiten auf, wobei ihnen eine niedrigere Affinität zu ifnar1 gemeinsam ist. Bislang konnte keine Interaktion zwischen den Rezeptoruntereinheiten nachgewiesen werden. Es wird angenommen, dass bei der Rezeptorassemblierung das Interferon zunächst an ifnar2 bindet und anschließend ifnar1 rekrutiert. Es wird postuliert, dass die unterschiedlichen Zellantworten für verschiedene Typ I Interferone auf Unterschieden in der Stabilität der ternären Komplexe beruhen könnten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden daher die Struktur und Dynamik des Interferonrezeptors in vitro für die Typ I Interferone IFNa2 und IFNb charakterisiert. Die Struktur des ternären Komplexes aus den extrazellulären Domänen von ifnar1 und ifnar2 mit IFNa2 wurde mittels Elektronenmikroskopie untersucht. Über Einzelpartikelanalyse aufgereinigter Komplexe von IFN mit den extrazellulären Domänen von ifnar1 (ifnar1-EC) und ifnar2 (ifnar2-EC) konnte ein Strukturmodell des ternären Komplexes erstellt werden. Dieses zeigte eine Verschiebung der membranproximalen Domänen von ifnar1-EC und ifnar2-EC wie sie bereits für den Rezeptor für Erythropoietin und den Wachstumsfaktor beobachtet wurden, welche zu den Typ I Zytokinrezeptoren gehören. Die Struktur des ternären Komplexes ermöglicht als erste Struktur eines Typ II Zytokinrezeptors einen Einblick in die Architektur des Komplexes und mögliche Aktivierungsmechanismen. Die Strukturen der Komplexe für die verschiedenen Typ I Interferone IFNa2 und IFNb wiesen keine fundamentalen Unterschiede auf, was auf einen gemeinsamen Aktivierungsmechanismus hinweist. Temperatur-abhängige Messungen von Bindungskinetik und –affinität ergaben sehr unterschiedliche Energiehyperflächen für die Ligandenbindung an ifnar1- und ifnar2-EC, und wiesen auf einen mehrstufigen Prozess und mögliche Konformationsänderungen bei der Bindung an ifnar1-EC hin. Zur Analyse der Dynamik von ifnar1-EC wurden daher verschiedene fluoreszenzbasierte Assays etabliert. Eine besondere Herausforderung bestand darin, das Protein ortsspezifisch und stöchiometrisch mit zwei verschiedenen Fluorophoren zu koppeln. Ifnar1-EC wurde an verschiedenen Stellen kovalent mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Es wurde gezeigt, dass nach Bindung eines geeigneten tris-NTA-Fluorophor-Konjugats an den C-terminalen His-Tag die Fluoreszenz abstandsabhägig durch Förster-Resonanz-Energie-Transfer gelöscht wurde. Für ifnar1-EC wurde eine ligandeninduzierte Abstandsänderung detektiert. Die detaillierte Analyse ergab nach Bindung von IFNa2 eine Abstandszunahme von 13 A vom N- zum C-Terminus. Durch die Interferonbindung nimmt demnach ifnar1-EC eine gestrecktere Konformation ein. Ähnliche Ergebnisse wurden auch in Anwesenheit von ifnar2-EC und für IFNb erhalten. Die Einzelmolekülanalysen mittels Fluoreszenz Korrelationsspektroskopie (FCS) zeigten sowohl einen Verlust der Flexibilität von ifnar1-EC nach Ligandenbindung als auch ein ligandeninduziertes Rearangement der Ig-ähnlichen Domänen. Die Änderung der Flexibilität wurde durch Messungen der Fluoreszenzlebensdauer bestätigt. Untersuchungen der Kinetik der Ligand-induzierten Konformationsänderung mittels Stopped-Flow Messungen bestätigten eine mehrstufige Umorientierung der Ig-ähnlichen Domänen nach Ligandenbindung. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass sich nach Ligandenbindung die Zugänglichkeit des Tryptophans in der membranproximalen Domäne von ifnar1-EC ändert. Da die membranproximale Domäne nicht bei der Ligandenbindung beteiligt ist, deutet dieser Effekt auf eine Propagation der Ligand-induzierten Konformationsänderung in diese Domäne hin. Das Tryptophan könnte mit der Membran interagieren, was auf eine wichtige Rolle der membranproximalen Domäne für die korrekte Orientierung von ifnar1 in der Membran hindeut. Die Stopped-Flow Analyse zeigte, dass es sich hierbei um einen einstufigen Prozess handelt, der mit der Interferonbindung korreliert. Die Ergebnisse wiesen insgesamt auf eine Ligand-induzierte Flexibilitätsänderung und Umorientierung der Ig-ähnlichen Domänen bei ifnar1-EC hin. Vermutlich wird nach Ligandenbindung das Signal in die membranproximale Domäne von ifnar1-EC propagiert. Die Strukturen der ternären Komplexe mit den verschiedenen Typ I Interferonen wiesen keine fundamentalen Unterschiede auf. Auch die Ergebnisse der fluoreszenzbasierten Assays zeigten keine Unterschiede für IFNa2 und IFNb, was die Hypothese stützt, dass die differentielle Aktivität der Interferone nicht auf grundsätzlichen Unterschieden in der Architektur des ternären Komplexes beruht, sondern in der unterschiedlichen Dynamik der Komplexe codiert sein könnte.
Reziproke chromosomale Translokationen sind häufig mit Leukämien und Lymphomen assoziiert und gelten in vielen Fällen als Ursache der Erkrankung. Die reziproke Translokation t(4;11) findet man hauptsächlich bei Kleinkindern, die an einer akuten lymphatischen Leukämie erkrankt sind, aber auch bei älteren Patienten mit einer Sekundärleukämie. Die leukämischen Blasten dieser Patienten sind meist gegen konventionelle Therapiekonzepte resistent, was zu einer ungewöhnlich schlechten Prognose führt. Die Chromosomenbande 11q23 ist an einer Vielzahl chromosomaler Translokationen beteiligt. Die dadurch erzeugten reziproken MLL-Fusiongene sind alle mit der Entstehung einer Hochrisikoleukämie korreliert. Für einige der dabei entstehenden Fusionsproteine konnte nach retroviraler Transduktion in hämatopoietische Vorläuferzellen gezeigt werden, dass sie onkogenes Potential besitzen und eine myeloische Leukämie in transgenen oder transienten Mausmodellen initiieren können. Für die Produkte einer Translokation t(4;11) konnte dies bislang nicht erfolgreich untersucht werden. Bei der Translokation t(4;11) werden die beiden Partnergene MLL und AF4 so miteinander verknüpft, dass auf den neu gebildeten Derivatchromosomen zwei Fusionsgene (MLL•AF4 und AF4•MLL) mit einem intakten Leserahmen entstehen. Da man in den leukämischen Blasten im Regelfall beide Fusionstranskripte findet, nehmen wir an, dass beide Genprodukte zur Fehlregulation und Entartung der Zelle beitragen. Um den potentiell onkogenen Wirkmechanismus der t(4;11) Translokation zu untersuchen, wurde ein induzierbares Expressions-System in murinen embryonalen Fibroblasten (MEF) etabliert. Anhand dieses Zellsystems gelang es das potententielle onkogene Potential der Fusionsproteine MLL•AF4 und AF4•MLL, bzw.des Wildtyp AF4 Proteins in Focus Formation Assays sichtbar zu machen. Dabei konnte die Bildung zellulärer Foci eindrucksvoll für das Wildtyp AF4 Protein und das AF4•MLL Fusionsprotein dargestellt werden. Das MLL•AF4 Fusionsprotein war nicht in der Lage den Verlust der Kontaktinhibition und damit Focus-Bildung in den Zellen zu initiieren. Die anschließende Definition des AF4 Wildtyp- und AF4•MLL Fusionsproteins als Proto-/Onkoprotein, führte zu der Arbeitshypothese, dass der Nterminale Bereich des AF4 Proteins (AF4•N) Wachstums-transformierendes Potential besitzt. Aufgrund der vorliegenden Daten und zur genaueren Charakterisierung des AF4 Proteins wurden anschließend Interaktions-Studien mit dem AF4•N Protein durchgeführt, wobei die beiden E3 Ubiquitin Ligasen SIAH1 und SIAH2 als Interaktionspartner des AF4•N Proteins identifiziert wurden. E3 Ubiquitin Ligasen sind wichtige Bestandteile der Ubiquitinylierungs-Maschinerie und der damit verbundenen proteasomalen Degradation. Dabei sind die SIAH Proteine, wie alle E3 Ubiquitin Ligasen, für die Spezifität der Proteasom-abhängigen Degradation verantwortlich, indem sie über ihre Substrat-Binde Domäne im C-Terminus mit den abzubauenden Targetproteinen interagieren. Die spezifische Interaktion der SIAH Proteine mit dem AF4•N Protein konnte in unabhängigen Experimenten sowohl in vitro als auch in vivo bestätigt werden. Durch den Einsatz des Proteasom-Inhibitors MG132 konnte zudem der effiziente, SIAH1-vermittelte und Proteasom-abhängige Abbau von AF4•N demonstriert werden. Mit weiterführenden Experimenten konnte auch für das Wildtyp AF4 Protein und für das AF4•MLL Fusionsprotein eine Regulation der Proteinstabilität über das SIAH1 Protein festgestellt werden. Eine SIAH1-vermittelte Degradation ist jedoch nur auf das AF4•MLL full-length Fusionsprotein beschränkt. Eine proteolytische Spaltung des AF4•MLL Fusionsproteins durch die Protease Taspase1 innerhalb des MLL Fusionsanteils führte zur Bildung eines stabilen der4•N/MLL•C Proteinkomplexes und dessen Akkumulation in den Zellen. Basierend auf diesen Ergebnissen konnte für t(4;11) Translokationen ein erster pathomolekularer Mechanismus zur Leukämie-Entstehung aufgezeigt werden. Dieser beruht im wesentlichen auf der Akkumulation des der4•N/MLL•C Proteinkomplexes, welcher sich der effizienten Kontrolle durch die E3 Ubiquitin Ligase SIAH1 entzieht. Dadurch wird der Wachstums-transformierende AF4•N Proteinanteil in die Lage versetzt sein onkogenes Potential zu vermitteln.
Die Arbeit überprüft die Zusammensetzung der F1FO-ATP-Synthase in Säugetiermitochondrien, dem Enzymkomplex, der das meiste ATP für den Energiebedarf einer Zelle liefert. Es sind zwei neue Proteine identifiziert und als ATP-Synthase assoziiert verifiziert worden, das sog. dapit protein (diabetes-associated protein in insulin-sensitive tissue; Datenbanknummer in NCBI für Rattus norvegicus, gi|19424210) bzw. 6.8 kDa mitochondrial proteolipid (Datenbanknummer in NCBI für Rattus norvegicus, gi|109478763). Bis jetzt sind beide Proteine nicht zusammen mit dem Komplex V detektiert worden, da es sich bei beiden Proteinen um sehr kleine Membranproteine (kleiner 7 kDa) handelt und sie sehr leicht in Gegenwart von Detergenzien verloren gehen. Die etablierte Strategie zur milden Aufreinigung von Komplex V, die eingesetzte gelelektrophoretische Trennung und die gewonnenen Erkenntnisse zur Identifizierung solch kleiner Proteine können sicherlich auch Lösungsansätze für andere ungelöste Problemfälle in der Proteinkomplexanalytik liefern. Da beide neuen Proteine in die Modulation des metabolischen Zellzustandes involviert sein könnten, sind die erarbeiteten Daten für weitere funktionelle und biochemische Untersuchungen der ATP-Synthase äußerst nützlich. Außerdem könnten die Ergebnisse für neurologische und klinische Studien hinsichtlich der Ursachenforschung von Funktionsstörungen in den Mitochondrien von Interesse sein, da eines der zwei neuen Proteine früher schon mit Diabetes in Zusammenhang gebracht worden ist (dapit, diabetesassociated protein in insulin-sensitive tissue). Für ein bakterielles Multihäm c-Typ Cytochrom konnte massenspektrometrisch gezeigt werden, dass es auf eine unkonventionelle Weise Häm bindet. Durch massenspektrometrische Charakterisierung des Proteins konnte erstmals nachgewiesen werden, dass es nicht nur die Häm c-Bindemotive CX2-4CH und CXXCK, sondern auch Häm c-Bindemotive der Form CXnCH in Bakterien gibt. Diese Erkenntnis führt in der Molekularbiologie zu neuen Fragen, z. B. welche speziellen Lyasen (cytochrome c haem lyases) letztendlich für das Einfügen der Häm-Gruppe an solche neuen Motive verantwortlich sind. Auch die computerbasierte Vorhersage von c-Typ Cytochromen wird dieses Wissen wohl zukünftig in Suchstrategien umsetzen, um die neuen Häm c-Bindemotive bei der Genomanalyse von Organismen nicht zu übersehen. In dem Feld der Identifizierung und Charakterisierung von Membranproteinen im Allgemeinen konnten grundlegende Erkenntnisse zum Umgang mit alternativen Enzymen und deren Potential für einen zukünftigen Einsatz erarbeitet werden. Schwerpunktmäßig wurden die Enzyme Chymotrypsin, Elastase und Pepsin untersucht. Es konnte für alle drei Kandidaten gezeigt werden, dass sie bevorzugt an einer begrenzten Anzahl von Aminosäuren spalten. Besonders für Elastase ist diese Erkenntnis neu, da sie in der Literatur bisher als unspezifisches Enzym wie Proteinase K geführt wurde. Auch wenn die Spezifität der drei Enzyme nicht zu 100% wie bei Trypsin festgelegt werden kann, sondern es sich nur um eine Bevorzugung gewisser Aminosäuren handelt, sind die enzymatischen Spaltungen reproduzierbar. Selbst eine Auswertung der MS-Spektren mittels Peptide Mass Fingerprint (PMF) ist deshalb auch bei diesen weniger spezifischen Enzymen möglich. Die Intensität der MS-Signale muss aber berücksichtigt werden, was bei bisherigen PMF-Suchen jedoch nicht in der Art und Weise geschieht, wie es für diese Enzyme nötig wäre. An einigen Membranproteinen konnte letztendlich bereits beispielhaft gezeigt werden, dass der Einsatz von weniger spezifischen Enzymen für die Identifizierung des Proteins und der nachfolgenden Charakterisierung (z. B. Identifizierung von posttranslationale Modifikationen) vorteilhaft ist. Für Elastase konnte in diesem Zusammenhang auch demonstriert werden, dass sie problemlos in Lösungsmittelsystemen mit einem hohen organischen Anteil (Acetonitril, Isopropanol, Methanol) einsetzbar ist. 100% Sequenzabdeckung lassen sich aber auch bei weniger spezifischen Enzymen trotz der größeren Anzahl an Schnittmöglichkeiten nur erahnen. Zwei Hauptursachen hierfür sind wahrscheinlich die schlechte Zugänglichkeit des Enzyms zum Membranprotein bzw. die Bevorzugung bestimmter enzymatischer Fragmente in MALDI und ESI. Polyacrylamidgele mit alternativen Quervernetzern, bei denen sich die Geldichte vor dem Verdau verringern lässt, könnten die Zugänglichkeit zum Membranprotein zukünftig vielleicht positiv beeinflussen. Der Einsatz von organischen Lösungsmitteln und bestimmter Detergenzien beim Verdau verbessert ebenfalls die Zugänglichkeit zum Membranprotein. Die Zahl der Tenside, die mit der Massenspektrometrie sehr gut kompatibel sind, ist aber sehr gering, wie Untersuchungen in dieser Arbeit ebenfalls ergeben haben. Außerdem beschränkt sich die Anwendung von diesen Detergenzien ausschließlich auf MALDI. Die zu erwartenden Fortschritte bei der Identifizierung und Charakterisierung von Membranproteinen umschreibt daher besonders gut ein Aphorismus von Christian Morgenstern (deutscher Schriftsteller; 1871 – 1914): „Es gibt nur ein Neues: Die Nuance.“ Einige Nuancen sind in dieser Arbeit enthalten. In der Zukunft werden aber viele weitere solcher Nuancen das Überwinden der Hürde „Membran Proteomics“ immer realistischer werden lassen.
Anti-T-Lymphozyten-Globuline (ATG) sind Immunglobuline zur Anwendung am Menschen. Sie werden aus den Seren von Kaninchen oder Pferden gewonnen, die zuvor mit humanen Thymozyten oder einer etablierten humanen T-Zell-Linie immunisiert wurden. ATG besitzen ein sehr starkes immunsuppressives Potenzial. In der klinischen Anwendung werden sie überwiegend bei Organtransplantationen, Knochenmarktransplantationen und zur Behandlung einzelner Autoimmunerkrankungen, wie z. B. der aplastischen Anämie, eingesetzt. Wissenschaftliches Ziel der Arbeit war, einen umfangreichen Beitrag zur immunologischen Charakterisierung und Spezifizierung unterschiedlicher ATG-Präparate zu erbringen. Dies ist eine wesentliche Voraussetzung für die Entwicklung und Validierung experimenteller Methoden, sodass die bisher verwendeten Praktiken der Wirksamkeitsprüfung von ATG entsprechend dem Stand der Wissenschaft abgelöst und der Tierversuch (Affenhaut-Transplantationstest; Balner H et al., 1968) ersetzt werden können. Darüber hinaus wurde in diesem Zusammenhang der Entwurf einer Arzneibuch-Monografie für ATG vorgelegt. Der immunsuppressive Wirkmechanismus von ATG ist selbst nach 40 Jahren klinischer Erfahrung nicht eindeutig geklärt. Ihre Wirksamkeit vermitteln sie über ihre spezifische Bindung an Lymphozyten, woraus sich modellhaft vier Effekte unterscheiden lassen: Die Reihe der Fc-abhängigen zytotoxischen Mechanismen, eine von ATG ausgelöste Aktivierung, eine über Todesrezeptoren (z.B. Fas/Apo-1) von ATG direkt induzierte Apoptose sowie die Maskierung von Rezeptoren. Die zytotoxische Wirkung von ATG und die Induktion des programmierten Zelltodes (Apoptose) wurde am Durchflusszytometer (FACS) nach Färbung der toten Zellen bzw. durch den Nachweis von DNA-Fragmentierung analysiert. Der Einfluss von ATG auf die Lymphozyten-Aktivierung in vitro sowie auf die gemischte Lymphozyten-Reaktion (mixed lymphocyte reaction, MLR) wurde durch Messung der Lymphozyten-Proliferation anhand des Einbaus von radioaktiv markiertem Thymidin bestimmt. Biochemisch wurden die in ATG enthaltenen anti-Lymphozyten-Antikörper durch den sog. Kinase-Assay charakterisiert. In einer nicht radioaktiven Methode wurden Zelloberflächenmoleküle zunächst biotinyliert. Nach Lyse der Zellen wurden die Proteine mit ATG präzipitiert, gelelektrophoretisch aufgetrennt sowie mittels Streptavidin und Chemilumineszenz im Westernblot nachgewiesen. Für das Verständnis der klinischen Wirksamkeit von ATG ist die Aufklärung der molekularen Mechanismen der komplement-unabhängigen, zytotoxischen Wirkung von erheblicher Bedeutung, da die enorme zytolytische, aber auch die breite immunsuppressive Wirkung von ATG nicht allein durch die Fc-abhängige Zytotoxizität erklärt werden kann. ATG können bei bestimmten Zielzellen Fas-abhängige Apoptose auslösen; darüber hinaus sind ATG aber auch in der Lage, einen komplement-unabhängigen Zelltod in Fas-resistenten Zell-Linien und T-Zell-Klonen, die resistent gegenüber aktivierungsinduziertem Zelltod (AICD) sind, auszulösen. In Kompetitionsversuchen konnte gezeigt werden, dass ATG entsprechende Antikörper-Spezifitäten gegen das Molekül CD95 (Fas/Apo-1) enthalten. Ferner konnten wir nachweisen, dass die durch ATG initiierte Fas-abhängige Apoptose und/oder der AICD durch Fas-neutralisierende Antikörper inhibiert werden können, was auch von anderen Arbeitsgruppen gezeigt wurde (Genestier L et al., 1998). Die DNA-Fragmentierung, als Nachweis von Apoptose, lässt sich nach der ATG-Inkubation von Fas-sensitiven Zielzellen durch Inhibitoren der Caspase-1 (Z-VAD-FMK) komplett sowie durch Inhibitoren der Caspase-3 (Ac-DMQD-CHO) und -6 (Ac-VEID-CHO) teilweise inhibieren. Die zytotoxische Wirkung von ATG lässt sich jedoch nicht in gleichem Maße durch Inhibitoren der Caspase-1 reduzieren, wie bei einem Apoptose induzierenden mAk gegen Fas. Es wird deutlich, dass ATG eine breit gefächerte zytotoxische Wirkung auf verschiedene Zellpopulationen ausüben, die alle mehr oder weniger eine Rolle in der klinischen Wirksamkeit von ATG spielen können. ATG sind in der Lage, periphere blutmononukleäre Zellen (PBMC) zu aktivieren, wobei der Proliferationsindex in etwa dem eines Standardmitogens, wie z. B. Phytohämagglutinin (PHA), entspricht. Isolierte T-Lymphozyten werden ebenfalls aktiviert, zeigen jedoch eine geringere Proliferationsrate. In PHA-Blasten lassen sich schwache Veränderungen im Muster der Protein-Tyrosin-Phosphorylierung erkennen, wobei eine gewisse Ähnlichkeit im Bandenmuster sowie in der Intensität zwischen der Stimulation mit ATG und dem anti-CD2 mAk zu erkennen ist. Im Unterschied zu publizierten Studien konnte in dieser Arbeit kein spezifisch hemmender Effekt der ATG auf die MLR nachgewiesen werden. Aus den Untersuchungen zur Charakterisierung der ATG hat sich der komplement-abhängige Zytotoxizitätstest, gemessen am Durchflusszytometer, als die Methode herausgestellt, die, bezogen auf den Wirkmechanismus der ATG und im Hinblick auf eine Routineanwendung in der Chargenprüfung, am besten geeignet ist. Eine Evaluierung der Methode wurde im Rahmen eines Ringversuches, an dem sich sieben verschiedene Labore beteiligten, durchgeführt. Die mittlerweile gültige Arzneibuch-Monografie für ATG (Ph. Eur.: 1928) sieht diese in vitro Methode zur Wirksamkeitsprüfung von ATG vor, womit die Voraussetzungen zur Abschaffung des Affenhaut-Transplantationstests geschaffen wurden. Neben einer zellulären Charakterisierung der ATG konnte gezeigt werden, dass sich insbesondere biochemische Methoden, wie z. B. der Kinase-assay oder die Biotinylierung von Zelloberflächenmolekülen, sehr gut zur Identitätsprüfung von ATG eignen. Mit beiden Methoden ließen sich produktspezifische Bande nachweisen. Im Rahmen der Entwicklung von ATG sind diese Methoden geeignet, die Konsistenz der Chargenproduktion zu überprüfen, sodass auch hier Alternativen zum Tierversuch vorhanden sind.
Resistenz polyklonaler, reifer T-Zellen gegenüber der Transformation durch retrovirale Transduktion
(2008)
Nach den ersten Erfolgen der Gentherapie bei angeborenen Immundefekten wurden einige Fälle von Leukämie nach gammaretroviralem Gentransfer in Blutstammzellen bei Patienten mit „severe combined immunodeficiency“ (SCID-X1) veröffentlicht. Diese entfachten eine Diskussion über das Risiko der Insertionsmutagenese bei der Verwendung gammaretroviraler Vektoren. Durch eine insertionsbedingte Transaktivierung potentieller Onkogene und damit verbundenen malignen Veränderungen können gammaretroviral transduzierte Blutstammzellen Leukämien hervorrufen. Aber nicht nur Blutstammzellen werden als Zielzellen in der Gentherapie genutzt. In der Gruppe von Laer wurde in den letzten Jahren eine neue Gentherapie der HIV-1 Infektion entwickelt. Hierbei werden dem Patienten genetisch geschützte, autologe T-Lymphozyten infundiert. Die Gefahr einer Leukämie durch Insertionsmutagenese sollte im Zuge dieser Studie für reife T-Lymphozyten evaluiert werden. In einer vergleichenden Analyse wurde untersucht, ob der gammaretrovirale Gentransfer in reife T-Lymphozyten die gleiche Genotoxizität birgt wie in hämatopoetische Stammzellen. Hierzu wurden reife T-Lymphozyten und hämatopoetische Progenitoren von C57BL/6(Ly5.1)-Mäusen mit multiplen Kopien gammaretroviraler Vektoren transduziert, die für die potenten T-Zell Onkogene LMO2, TCL1, dTrkA oder das Kontrollgen GFP kodierten. Es wurden sehr hohe Transduktionseffizienzen mit bis zu 70% für reife T-Lymphozyten und bis zu 98% für hämatopoetische Progenitoren erzielt, um möglichst leukämiefördernde Bedingungen zu schaffen. Nach Transplantation in kongene Rag-1 defiziente Empfängertiere (Ly5.2) entwickelten Onkogen-modifizierte Stammzellen nach einer charakteristischen Latenzperiode Leukämien/Lymphome. Am häufigsten wurden unreife, CD8+CD4+ doppelpositive T-Vorläufer Leukämien/Lymphome beobachtet. In einigen Rezipienten führte außerdem eine Überexpression von TCL1 in hämatopoetischen Stammzellen zu der Entwicklung von reifzelligen T-Zell Leukämien/Lymphomen und B-Zell Leukämien/Lymphomen. Die Integrationsanalyse ergab oligo- bis monoklonale Tumore, wobei keine offensichtlich tumorfördernden, die gammaretroviralen Insertionen flankierenden Gene identifiziert werden konnten. Bemerkenswerterweise entwickelte keines der T-Zell transplantierten Empfängertiere ein/e Lymphom/Leukämie, obwohl auch diese Zellen mit den gleichen Vektoren modifiziert wurden und über einen sehr langen Zeitraum persistierten. Um die Kontrollmechanismen dieser Resistenz näher zu untersuchen, wurde eine für den TCR monoklonale, adulte T-Zell Population mit dTrkA transduziert. Nach einer kurzen Latenzperiode entwickelten sich reifzellige T-Zell Leukämien/Lymphome. Anscheinend existiert eine Verbindung zwischen der relativen Transformationsresistenz reifer T-Lymphozyten und dem Konkurrenzverhalten verschiedener T-Zell Klone um stimulatorische MHC-TCR Nischen. Weiterhin wurde in vitro durch gammaretroviralen Transfer von LMO2 ein immortalisierter T-Zell Klon generiert. Dieser zeigte zwar nach einer langen Beobachtungszeit einen CD8-CD4-doppelnegativen Phänotyp, aber auch einen rekombinierten TCR. In vitro überwuchs er eine unmanipulierte Kompetitorpopulation, konnte jedoch nach Transplantation kein/e T-Zell Lymphom/Leukämie induzieren. Die LM-PCR Analyse des Klons lieferte eine sehr interessante Integration zwischen den Genen für die alpha-Ketten des IL-2 und des IL-15 Rezeptors, welche dadurch konstitutiv exprimiert wurden. Dies könnte das erste Beispiel für eine insertionsbedingte Immortalisierung eines adulten T-Zell Klons sein. In der vorliegenden Arbeit konnte zum ersten Mal eindeutig gezeigt werden, dass polyklonale, reife T-Zell Populationen in vivo eine hohe Transformationsresistenz aufweisen. Durch bestimmte Bedingungen können jedoch durchaus maligne Veränderung adulter, reifer T-Lymphozyten induziert werden. Für die Sicherheitsabschätzung gammaretroviraler Gentherapie-Studien mit reifen T-Lymphozyten sind die vorgestellten Ergebnisse von großer Bedeutung und könnten darüber hinaus Aufschluss über die populationsdynamischen Kontrollmechanismen reifer T-Zell Leukämien/Lymphome geben.
Identifizierung und Charakterisierung von Liganden für Faktor VIII neutralisierende Antikörper
(2008)
Das Fehlen von funktionellem Blutgerinnungsfaktor VIII (FVIII) in Hämophilie A- (HA-) Patienten wird durch Substitution mit FVIII-Präparaten therapiert. Die wesentlichste gegenwärtige Komplikation der FVIII-Ersatz-Therapie besteht in dem Auftreten von FVIII neutralisierenden Antikörpern (Inhibitoren) gegenüber exogenem FVIII. Diese können mittels verschiedener, kostenintensiver Therapien zur Induktion einer Immuntoleranz (ITI) mit unterschiedlichem Erfolg eliminiert werden. Für Patienten mit persistierenden Inhibitoren bedeuten diese nicht nur eine drastische Verminderung der Lebensqualität sondern ein lebensbedrohliches Szenario. Eine Liganden-vermittelte Blockierung von neutralisierenden anti-FVIII Antikörpern sowie die zielgerichtete Ansteuerung des Rezeptors FVIII-spezifischer Gedächtnis-B-Zellen stellen mögliche Ansätze zur Verwirklichung antigenspezifischer ITI-Strategien für eine dauerhafte, vollständige Eliminierung von FVIII-Inhibitoren dar. Zu diesem Zweck wurden in dieser Arbeit durch Screening von phagenpräsentierten, randomisierten Peptidbibliotheken mit Inhibitor-positiven Patientenplasmen Peptidliganden selektioniert. Diese wiesen eine spezifische Bindung von anti-FVIII Antikörpern in den verwendten Plasmen auf. Durch den Einsatz entsprechender Software konnten AS-Konsensusmotive der Peptidsequenzen möglichen, konformationellen, funktionellen Inhibitorepitopen in der A2- sowie C2-Domäne von FVIII zugeordnet werden. Die von in silico-Analysen vorgegebene Domänenspezifität der anti-FVIII Antikörper wurde in Bindungsstudien mit rekombinant exprimierten FVIII-Domänen verfiziert. Die korrespondierenden, synthetischen Peptidliganden blockierten die IgG-Bindung an FVIII und regenerierten partiell dessen Aktivität im Plasma. Die Peptide stellten funktionelle Mimotope der möglichen Inhibitorepitope in der A2- und C2-Domäne dar. Da FVIII neutralisierende Antikörper zumeist Epitope in beiden Domänen erkennen, wurden die Mimotope kombiniert, was in einer noch effektiveren Blockierung von FVIII-Inhibitoren resultierte. Weiterhin wiesen Mimotopkombinationen Kreuzreaktivität mit anti-FVIII IgG in heterologen Patientenplasmen auf. Durch Fusion der Peptide an die Multimerisierungsdomäne der alpha-Kette des humanen C4-Bindeproteins konnten in Zellkultur heptamere Proteine generiert werden. Gegenüber den synthetischen Peptiden wiesen die Multimere aufgrund ihrer Multivalenz sowie der strukturellen Integrität eine deutlich verbesserte Blockierung von anti-FVIII IgG auf. Das Multimerisierungskonzept erlaubte ferner die Kombination unterschiedlicher Peptidliganden in einem Heteromultimer, was anhand der selektierten, funktionellen Mimotope für mögliche A2- und C2-Epitope getestet wurde. Weiterhin zeichneten sich die Inhibitor-spezifischen Multimere gegenüber den synthetischen Peptiden durch deutlich verlängerte Halbwerstzeiten aus. In Präparationen peripherer mononuklearer Zellen (PBMCs) von Patienten färbten synthetische Peptide sowie Fluoreszenz-markierter FVIII B-Zellsubpopulationen mit einem Gedächntis-B-Zell Phänotyp (CD19+IgG+). Gedächtnis-B-Zellen in PBMCs wurden polyklonal stimuliert. Im ELISPOT-Verfahren konnten Tetanusspezifische, jedoch keine FVIII-spezifischen Zellen, detektiert werden. Im Gegensatz zu den verwandten Kontrollen bewirkte eine Präinkubation der Zellen mit dem Peptid 12C6, welches an das toxische D-AS-Peptid (KLAKLAK)2 gekoppelt war, allerdings eine Reduktion von anti-FVIII IgG in den Überständen stimulierter Zellen.
Chlamydomonas reinhardtii ist eines der bekanntesten Modellsysteme der Forschung, um photo-, zell- und molekularbiologische Fragestellungen zu untersuchen. Die phototaktischen Reaktionen dieser einzelligen Grünalge werden durch mikrobielle Rhodopsine, sogenannte Photorezeptoren initiiert, deren Chromophor all-trans-Retinal ist. Eines dieser Rhodopsine ist Channelrhodopsin 2 (ChR2). Ein Sequenzvergleich mit anderen mikrobiellen Rhodopsinen aus Archaebakterien, wie z.B. der lichtgetriebenen Protonenpumpe Bakteriorhodopsin, zeigt eine Homologie von bis zu 20 %. Aus diesem Grund kann angenommen werden, dass die hydrophobe N-terminale Hälfte mit circa 300 von 737 Aminosäuren ebenso aus einem Siebentransmembranhelixmotiv besteht, wie dies für Rhodopsinmoleküle typisch ist. Seit der Entdeckung 2003 durch Nagel et al. ist bekannt, dass es sich bei ChR2 um einen lichtgetriebenen, kationenselektiven Ionenkanal handelt, der in dieser Form bisher nicht bekannt war. Diese biophysikalische Charakteristik konnte durch detaillierte elektrophysiologische Daten erhoben werden. Sie lieferten zudem die Erkenntnis, dass ChR2 als „Werkzeug“ in der Neurobiologie verwendet werden kann, da die lichtinduzierte Depolarisation zum Feuern von Aktionspotentialen in ChR2-exprimierenden Neuronen führt. Die vorliegende Arbeit sollte dazu beitragen, die molekularen Mechanismen von ChR2 aufzuklären, indem elektrophysiologische, spektroskopische und biochemische Daten miteinander korreliert wurden. Dazu wurde ChR2 funktionell in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris exprimiert. Ein Glykosylierungstest konnte belegen, dass Pichia pastoris in der Lage ist, die für ChR2 erforderliche N-Glykosylierung durchzuführen. Mit einer 90%igen Expression war es somit möglich, ausreichend Protein für eine Metallchelat-Affinitätschromatographie zu gewinnen. Weiterhin konnte die bestehende Funktionalität nach der Isolierung von ChR2 nachgewiesen werden. Dies erfolgte zum einen über Messungen des charakteristischen Photostroms mittels der BLM-Technik. Zum anderen konnte dies durch spektroskopische Messungen der spezifischen Absorption von ChR2 bei 480 nm bestätigt werden. Die zeitaufgelöste Laserblitzabsorptionsspektroskopie lieferte zudem Differenzspektren des isolierten ChR2, die erstmalig das Vorhandensein eines spektral verschiedenen Intermediats bei 540 nm zeigten. Zusammen mit dem Zeitverlauf aller vier korrespondierenden Intermediate und der Hinzunahme elektrophysiologischer Daten konnte somit ein linearer Photozyklus bestehend aus vier Zuständen erstellt werden (erstellt durch Dr. Christian Bamann). Die ersten drei Intermediate des Photozyklus P1-P3 werden demnach durch die rotverschobene Spezies beschrieben, mit einer Relaxationszeit von unter einer Millisekunde. Dieses rote Intermediat spiegelt die Konformationsänderung des Retinals wider und geht mit dem Öffnen des Kanals einher. Die Zustände P2 und P3 konnten beide als kationenleitende Zustände identifiziert werden. Das Schließen des Kanals wird durch den Übergang von P3 zu P4 (spektral mit dem Grundzustand gleich) vermittelt. Das Zurückkehren in den Grundzustand folgt einem langsamen Prozess im Bereich von mehreren Sekunden. Biochemische, spektroskopische und elektrophysiologische Daten haben damit erfolgreich zur weiteren Aufklärung der molekularen Funktionsweise von ChR2 beigetragen. Mit diesen Ergebnissen ist nun die Erschließung neuer Informationen über die verschiedenen Signaltransduktionswege von Membranproteinen möglich.
Intrinsic response properties of auditory thalamic neurons in the Gerbil (Meriones unguiculatus)
(2007)
Neurons in the medial geniculate body (MGB) have the complex task of processing the auditory ascending information from the periphery and a more extensive descending input from the cortex. Differences in the pattern of afferent and efferent neuronal connections suggest that neurons in the ventral and dorsal divisions of the MGB take different roles in this complex task. The ventral MGB (vMGB) is the primary, tonotopic, division and the dorsal MGB (dMGB) is one of the higher order, nontonotopic divisions. The vMGB neurons are arranged tonotopically, have sharp tuning properties, and a short response delay to acoustic stimuli. The dMGB neurons are not tonotopically arranged, have broad tuning properties, and a long response delay to acoustical stimuli. These two populations of neurons, with inherently different tasks, may display differences in intrinsic physiological properties, e.g. the capacity to integrate information on a single cell level. Neurons of the ventral and dorsal divisions of the MGB offer an ideal system to explore and compare the intrinsic neuronal properties related to auditory processing. Coronal slices of 200 μm thicknesses were prepared from the thalamus of 4 - 5 week old gerbils. The current-clamp configuration of the patch-clamp technique was used to do experiments on the dorsal and ventral divisions of the medial geniculate body. Slices were subsequently Nissl stained to verify the location of recording. Recordings from the dorsal and ventral divisions exhibited differences in response to depolarizing current injections. The ventral division responded with significantly shorter first spike latency (vMGB = 41.50 ± 7.7, dMGB = 128.43 ± 16.28; (p < 0.01)) and rise time constant (vMGB = 6.95 ± 0.90, dMGB = 116.67 ± 0.13; (p < 0.01)) than the dMGB. Neurons in the dorsal division possessed a larger proportion of slowly accommodating neurons (rapidly accommodating: vMGB: 89%, dMGB: 64%), including a subpopulation of neurons that fired at resting membrane potential. Neurons in the vMGB are primarily responsible for relaying primary auditory input. Dorsal MGB neurons relay converging multimodal input. A comparative analysis with the primary auditory neurons, the Type I and Type II spiral ganglion neurons, reveals a similar pattern. Type I neurons relay primary auditory input and exhibit short first spike latencies and rise time constants. The Type II neurons relay converging input from many sources, while possessing significantly slower response properties and a greater subpopulation of slowly accommodating neurons. Hence, accommodation, first spike latency, and rise time constant are suggested to be a reflection of the amount of input that must be integrated before an action potential can be fired. More converging input correlates to slower accommodation, a longer first spike latency and rise time. Conversely, a greater capacity to derive discrete input is associated with rapid accommodation, along with a short first spike latency and rise time.
Optimierung Apolipoprotein-modifizierter Albumin-Nanopartikel zur Überwindung der Blut-Hirn-Schranke
(2007)
Das Gehirn höherer Säugetiere ist durch die Blut-Hirn-Schranke vor dem Eindringen toxischer und schädlicher Substanzen geschützt. Allerdings bildet diese Barriere auch ein Hindernis für die gezielte medikamentöse Therapie von Erkrankungen des zentralen Nervensystems wie zum Beispiel Alzheimer, Gehirntumore oder Parkinson. Leider sind nur wenige potentielle Arzneistoffe für die Therapie dieser Krankheiten in der Lage die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden. Somit stellt die Blut-Hirn-Schranke einen limitierenden Faktor für die Arzneimitteltherapie dar. Diese Doktorarbeit beschäftigt sich mit der Herstellung, Charakterisierung, in vitro und in vivo Testung Liganden-modifizierter Nanopartikel auf Proteinbasis zur Überwindung der Blut-Hirn-Schranke. Als Ligand wurde das Apolipoprotein E, ein Bestandteil von physiologisch vorkommenden HDL, VLDL und LDL-Partikel, verwendet, welches sich in vorangegangenen Untersuchungen als potentieller Ligand zum Transport von Nanopartikeln ins Gehirn erwiesen hat. Diese so mit Apolipoprotein modifizierten Nanopartikel wurden mit dem Modellarzneistoff Loperamid, einem nicht gehirngängigen Opioid, beladen. Diese Zubereitung wurde Mäusen injiziert und der analgetische Effekt mittels des Tail-Flick-Tests bestimmt. Um auch eine therapeutische Anwendung zu erzielen, wurden Apolipoprotein modifizierte Partikel beladen mit dem Zytostatikum Doxorubicin entwickelt und die chemotherapeutische Effizienz an Gehirntumor tragenden Ratten getestet.