Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
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Paradoxer Schlaf als Parameter zur Messung der Stressbelastung bei Giraffen (Giraffa camelopardalis)
(2012)
Das Wohlbefinden von Tieren zu schützen ist im Grundgesetz der Bundesrepublik Deutschland festgeschrieben. Das Wohlbefinden eines Tieres wissenschaftlich zu bewerten ist jedoch eine bislang ungelöste Herausforderung. Die Biologie nähert sich dem Problem, subjektive Empfindungen eines Tieres objektiv darzustellen, vorrangig über die Messung der Stressbelastung.
Die Stressantwort eines Organismus setzt sich allgemein aus einer Kombination von vier Systemen zusammen: einer Verhaltensreaktion, einer Antwort des vegetativen Nervensystems, einer neuroendokrinen Antwort und einer Immunantwort. Der in Zoos am häufigsten untersuchte Parameter zur Messung der Stressbelastung ist die Analyse der Cortisolmetaboliten-Konzentration im Kot der Tiere. Da jedoch nicht in jeder Stresssituation das „Stresshormon“ Cortisol ausgeschüttet wird, ist es für eine exakte Bewertung der Stressbelastung notwendig, weitere Systeme der Stressantwort wie beispielsweise das Verhalten zu erfassen. Die Chronoethologie verfolgt diesen Ansatz, indem sie Änderungen des Zeitmusters im Verhalten eines Tieres als Antwort auf Veränderungen in der Umwelt oder eines endogenen Faktors erfasst und diese nach Kriterien der Befindlichkeit bewertet. Hier könnte zukünftig das Schlafverhalten eine herausragende Stellung einnehmen, da es von allen vier Stressantwortsystemen beeinflusst wird. Zudem wird aus der medizinischen Schlafforschung berichtet, dass sich insbesondere die Dauer, die ein Organismus im Paradoxen Schlaf (PS) verbringt, durch Stress verändert. Dennoch fand das Schlafverhalten zur Messung der Stressbelastung bei Zoo- und Wildtieren bislang kaum Beachtung. Ziel dieser Arbeit war es daher, die Anwendbarkeit des PS als Parameter zur Messung der Stressbelastung bei Zoo- und Wildtieren zu erforschen, um letztlich die Beurteilung des Wohlbefindens von Tieren weiter zu objektivieren. Aufgrund ihrer einzigartigen Schlafstellung während des PS sowie ihrer hohen Sensibilität gegenüber Umweltveränderungen wurde die Giraffe (Giraffa camelopardalis) als Modelltier für diesen non-invasiven Forschungsansatz gewählt.
Im Rahmen der Arbeit wurde in 645 Nächten das Schlafverhalten von 17 Giraffen unterschiedlichen Alters und Geschlechts beobachtet und analysiert. Um stressbedingte Veränderungen im PS-Muster erkennen zu können, wurden die Giraffen zunächst unter „Normalbedingungen“ beobachtet, um hieraus Referenzwerte zu generieren. Anschließend wurden unterschiedliche als stressintensiv einzustufende Situationen wie Nahrungsmangel, Transport, Veränderungen in der Herdenstruktur, Auswirkungen einer Geburt auf das Muttertier sowie verschiedene singuläre Ereignisse hinsichtlich ihrer Auswirkungen auf das PS-Muster der Giraffen untersucht und den Referenzwerten gegenübergestellt. Um die Methode der Schlafbeobachtung als Parameter der Stressbelastung zu validieren, wurde zusätzlich ein bei Wiederkäuern etablierter, bereits genannter Stress-Parameter eingesetzt: die Messung der Cortisolmetaboliten-Konzentration im Kot mit Hilfe eines Enzymimmunoassays. Diese Methode wurde hier erstmalig an Giraffen angewendet.
Durchschnittlich hielt eine Giraffe unter Normalbedingungen 27 Minuten pro Nacht paradoxen Schlaf. Dabei war die nächtliche PS-Dauer in hohem Maße vom Alter abhängig. Während juvenile Giraffen im Mittel 63 Minuten PS pro Nacht aufwiesen, verbrachten gealterte Giraffen nur 4,5 Minuten pro Nacht in der PS-Stellung. Infolge eines Stressors veränderte sich die PS-Dauer der Tiere: So zeigten alle vier transportierten Giraffen in den ersten Nächten nach ihrem Transport keinen PS oder stark reduzierte PS-Zeiten. Parallel erhöhte sich nach dem Transport die Cortisolmetaboliten-Konzentration im Kot aller Giraffen für mehrere Tage. Auch die untersuchten Veränderungen in der Herdenstruktur hatten in den meisten Fällen signifikante Veränderungen der PS-Dauer zur Folge. Die stärkste im Rahmen dieser Arbeit beobachtete Veränderung des Schlafverhaltens bewirkte der Tod eines Giraffenbullen: Die adulte Giraffenkuh hielt in der Folge für eine Dauer von 21 Tagen keinen paradoxen Schlaf mehr. Ihre Cortisolmetaboliten-Konzentration im Kot stieg nach dem Tod des Bullen hingegen nicht an. Die beobachteten Giraffenmütter zeigten nach der Geburt ihrer jeweiligen Jungtiere ebenfalls eine reduzierte PS-Dauer. Hingegen hatten neugeborene Giraffen, die an Nahrungsmangel litten und innerhalb weniger Tage verstarben, eine höchst signifikant längere PS-Dauer als gleichalte Jungtiere, die überlebten.
Während bei Nahrungsknappheit eine erhöhte PS-Dauer helfen kann Energie zu sparen, ist eine Reduktion der PS-Dauer als Resultat erhöhter Aufmerksamkeit zu interpretieren, wie sie im Zuge der Feindvermeidung in Stress-Situationen sinnvoll ist.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die PS-Dauer im Gegensatz zur Cortisolmetaboliten-Konzentration von allen beobachteten Stressoren beeinflusst wurde. Dabei veränderte sich die PS-Dauer in Abhängigkeit des jeweiligen Stressors graduell unterschiedlich, was Rückschlüsse auf die Intensität des Stressors ermöglicht.
Der PS ist infolge dieser Ergebnisse hervorragend als Parameter zur Messung der Stressbelastung bei Giraffen geeignet. Die Analyse des PS kann dabei helfen, die Auswirkungen von subjektiv als stressintensiv oder stressarm eingestuften Situationen auf das Wohlbefinden eines Tieres objektiv zu bewerten. Darüber hinaus ermöglicht die kontinuierliche Überwachung des PS-Musters, z.B. mit Hilfe moderner Videosoftware, Beeinträchtigungen des Wohlbefindens, wie sie beispielsweise durch Unterernährung, Verletzung oder Krankheit hervorgerufen werden, frühzeitig zu erkennen, was ein zeitnahes Eingreifen zum Wohle des Tieres möglich macht.
Zelluläre Immuntherapien mit hochaufgereinigten allogenen NK-Zellen sind eine mögliche Therapieoption um den GvL/T-Effekt nach haploidenter SZT bei pädiatrischen Hochrisikopatienten mit malignen Erkrankungen zu verstärken. Im Rahmen der in Frankfurt a. M. laufenden klinischen Phase I/II NK-Zell-Studie wurden 16 pädiatrische Patienten sowohl mit unstimulierten (NK-DLI(unstim), 9 Patienten) als auch mit zehn Tage ex vivo IL-2 (1000 U/ml) stimulierten Spender-NK-Zellen (NK DLI(IL-2 stim), 9 Patienten) an den Tagen (+3), +40 und +100 nach haploidenter SZT behandelt. Bisher gibt es kaum Daten über den Verbleib der transfundierten Zellen und den Einfluss der NK-DLI Immuntherapie auf sowohl zelluläre als auch humorale Komponenten des Immunsystems der Patienten. Da die Patienten zudem nach haploidenter SZT zur GvHD-Prophylaxe das immunsuppressive Medikament Mycophenolat-Mofetil (MMF) erhalten, sind Untersuchungen zum Einfluss von MMF auf die Funktionalität der Spender-NK-Zellen von großem Interesse. In der vorliegenden Arbeit wurde mit Hilfe eines studienbegleitenden, nichtinvasiven in vivo Immunmonitorings erstmalig ein unterschiedlicher Einfluss von NK-DLI(unstim) im Vergleich zu NK-DLI(IL-2 stim) auf zelluläre Bestandteile und auf die Zytokin/Chemokin-Spiegel des peripheren Blutes der Patienten vor und 10 min, 1 h, 4 h und 24 h nach der Zelltherapie beschrieben. Mittels durchflusszytometrischen single platform Analysen konnten sowohl Spender-NK-Zellen als auch patienteneigene NK-Zellen phänotypisch und funktionell charakterisiert und unterschieden werden. So wurden neben einer gesteigerten zytotoxischen Aktivität IL-2 stimulierter NK-Zellen auch Unterschiede hinsichtlich der Expression des Oberflächenmoleküls CD56, des Aktivierungsmarkers CD69, des Natürlichen Zytotoxizitäts-Rezeptors (NCR) NKp44 und des Lymphknoten Homing Moleküls CD62L beobachtet. Des Weiteren führte die Applikation von NK-DLI(IL-2 stim) zu einer signifikanten Zellmigration in der peripheren Blutzirkulation der Patienten. Während sich die Zahl der neutrophilen Granulozyten innerhalb von 4 h im peripheren Blut vervierfachte wurde unmittelbar 10 min nach NK-DLI(IL-2 stim) ein massiver Zellverlust von eosinophilen Granulozyten, Monozyten, dendritischen Zellen und vor allem der NK-Zellen beobachtet. Eine ausgeprägtere Reduktion der immunregulatorischen CD56(bright)CD16(dim/-) NK-Zellen hatte zudem eine Verschiebung in der prozentualen Verteilung der NK-Zell-Subpopulationen zur Folge. In den folgenden 24 h normalisierten sich alle Zellzahlen wieder zu den Werten vor NK-DLI. Anhand der beschriebenen phänotypischen Unterscheidungsmerkmale konnte gezeigt werden, dass dabei nur patienteneigene NK-Zellen in die periphere Blutbahn zurückkehrten. Die Zellmigration war zudem in vivo von einem signifikanten Anstieg der proinflammatorisch- und chemotaktisch-wirkenden Zytokine/Chemokine IL-2, IL-6, IL-8, IFN-γ, MCP-1 und MIP-1β im peripheren Blut der Patienten 10 min nach NK-DLI(IL-2 stim) Applikation begleitet. Die Applikationen von NK-DLI(unstim) zeigten im Gegensatz dazu keine vergleichbaren Effekte. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war herauszufinden, ob eine Therapie mit dem Immunsuppressivum MMF nach haploidenter SZT die Funktionalität dieser hochaktivierten Spender-NK-Zellen beeinträchtigt und somit die Effektivität der Immuntherapie gefährdet. Es konnten Einschränkungen in der ex vivo Funktionalität der NK-Zellen durch therapeutisch relevante Konzentrationen (1 bis 10 µM) des aktiven Metaboliten Mycophenolsäure (MPA) gezeigt werden. Die MPA-Inkubation führte zu einer dosisabhängigen aber reversiblen Inhibition der IL-2 bedingten ex vivo NK-Zell-Proliferation. Auch die während des ex vivo Expansionsprozesses induzierte Zytokin/Chemokin-Sekretion wurde signifikant gehemmt. Eine 24-stündige MPA-Inkubation der IL-2 stimulierten NK-Zellen führte zudem zu einer eingeschränkten Mobilität der NK-Zellen. Dies korrelierte mit einer signifikant reduzierten zytotoxischen Aktivität gegen K-562 Tumorzellen, was jedoch nicht mit einer Oberflächenreduktion der NCRs und des NKG2D Rezeptors assoziiert war. Auch die durch die IL-2 Stimulation verursachte Hochregulierung der in Aktivierung und Migration involvierten Oberflächenmoleküle CD25, LFA-1, ICAM-1, CCR5, CXCR7, DNAM-1 und CD62L wurde durch MPA inhibiert. Im Gegensatz dazu hatte eine 24-stündige oder 4-tägige MPA-Behandlung bereits vorstimulierter NK-Zellen keinen Einfluss. Zudem konnte im Rahmen dieser Arbeit erstmalig gezeigt werden, dass die IL-2 induzierte intrazelluläre Signaltransduktion durch MPA beeinflusst wird. Dies äußerte sich in einer partiell bis vollständig inhibierten Phosphorylierung zentraler Signalmoleküle wie STAT-3, -4 und -5, der MAP-Kinase ERK1/2 und der Proteinkinase AKT. Dadurch wurden die durch IL-2 geförderten Zellprozesse wie das Überleben, die Proliferation und die zytotoxische Aktivität der NK-Zellen drastisch gehemmt. Dies steht vermutlich im Zusammenhang mit einer reduzierten Expression der IL-2R Untereinheit (CD25), wodurch die Ausbildung des hochaffinen IL-2-Rezeptors auf der Zelloberfläche verhindert wurde. Demzufolge scheint die eingeschränkte NK-Zell-Effektorfunktion Ursache einer durch MPA gestörten IL-2 Signaltransduktion zu sein. Zusammenfassend scheinen NK-DLI(IL-2 stim) durch die gesteigerte Zytotoxizität, die geringere Sensitivität gegenüber der MPA-Exposition sowie durch die mutmaßliche Extravasation der stimulierten NK-Zellen aus der peripheren Blutbahn einen Vorteil gegenüber NK-DLI(unstim) zu haben. Ob dies auch in einer Steigerung der Effektivität der Immuntherapie resultiert und damit die Prognose der Patienten verbessert werden kann, werden jedoch erst zukünftige Studien mit größeren Patientenkohorten abschließend zeigen können.
Die Makrophytenvegetation eines stillgelegten Kanalabschnittes ("Alte Fahrt") bei Senden in Westfalen hat sich seit Beginn der 90er Jahre drastisch verändert. Aus einem typischen Potamogetonetum lucentis sind Reinbestände von Myriophyllum spicatum geworden, denen stellenweise Ceratophyllum demersum beigemischt ist. Die Ursachen für diese gravierenden Vegetationsveränderungen sind nicht klar. Da es sich um einen der bedeutendsten westfälischen Standorte des Potamogetonetum lucentis, einer in Nordrhein-Westfalen stark gefährdeten Pflanzengesellschaft, handelte, sind weiterführende Untersuchungen und Versuche zur Wiederansiedlung zu fordern.
Die nicht-konventionelle Hefe P. ciferrii produziert große Mengen der tetra-acetylierten Sphingoidbase Phytosphingosin (TAPS). Sphingoidbasen sind essentielle Komponenten des stratum corneums, der multilamellaren Barriere der menschlichen Haut, und daher in der Kosmetik-Industrie von großem Interesse. Im Rahmen dieser Arbeit sollte die biotechnologische Produktion der Sphingoidbasen Phytosphingosin, Sphinganin und Sphingosin auf molekularbiologischer Ebene in P. ciferrii charakterisiert und optimiert werden. Die Hefe P. ciferrii konnte durch Etablierung einer einfachen und hoch-effizienten Transformations-Methode auf genetischer Ebene leicht zugänglich gemacht werden. Durch Inaktivierung des für NHEJ essentiellen PcLIG4 Gens konnte die Effizienz zielgerichteter genomischer Integrationen von transformierten DNA-Konstrukten von 1 % auf 87 % erhöht werden. Die Etablierung des Cre-loxP Systems erlaubte das mehrfache Verwenden eines Selektions-Markers wodurch sukzessiv mehrere genomische Integrationen in einem Stamm ermöglicht wurden. Durch diese Errungenschaften konnte das Ziel „Optimierung der Sphingoidbasen-Produktion der nicht-konventionellen Hefe P. ciferrii“ im Folgenden erfolgreich verfolgt werden. Der initiale Schritt der Sphingoidbasen-Biosynthese ist die von der Serin-Palmitoyl-Transferase katalysierte Kondensation von L-Serin und Palmitoyl-CoA. Durch die Deletion von Genen, die am L-Serin-Katabolismus von P. ciferrii beteiligt sind (PcSHM1, PcSHM2und PcCHA1), konnte die de novo Sphingoidbasen-Biosynthese optimiert werden und führte in einem lig4? Stamm zu einer etwa dreifachen Erhöhung der TAPS-Produktion. Weitere Ansätze den (vermutlich durch L-Serin feed back regulierten) L-Serin-Biosyntheseweg bzw. die in vivo L-Serin-Verfügbarkeit zu optimieren, führten nicht zu einer gesteigerten TAPS-Produktion. Durch weitere Deletion und Überexpression von Genen des Sphingolipid-Stoffwechsels konnte die TAPS-Produktion jedoch um ein Vielfaches verbessert werden. So konnte ein Stamm konstruiert werden, der die Gene PcLCB1, PcLCB2 und PcSYR2 überexprimiert und Deletionen der Gene PcSHM1, PcSHM2, PcCHA1, PcLCB4 und PcORM12 trägt. Dieser Stamm (CSS.L4.O.L2.L1.S2) wies eine mehr als fünffach erhöhte maximale spezifische TAPS-Produktbildungsrate (q Pmax ) auf und produzierte mit 2 g * L rund siebenmal mehr TAPS als der lig4? Ausgangsstamm, weshalb ein Einsatz dieses Stammes für die industrielle TAPS-Produktion denkbar wäre. Ausgehend von einem für die TAPS- (und somit Sphingoidbasen-) Produktion optimierten Stamm sollten Stämme mit optimierter TriASa- oder TriASo-Produktion für industrielle Zwecke generiert werden. Es stellte sich allerding heraus, dass erhöhte Mengen dieser Sphingoidbasen wahrscheinlich wachstumshemmend für P. ciferrii sind, weshalb eine weitere Produktions-Optimierung nicht ohne Weiteres möglich ist. In einem Laborstamm gelang es jedoch, durch Konstruktion und anschließende Transformation eines optimierten integrativen Plasmids (trägt die Gene, die für die Produktion von Sphingosin bzw. TriASo nötig sind) eine TriASo-Produktion von bis zu 30 mg * g (BTM) zu erzielen, wobei gleichzeitig die Bildung des Nebenprodukts TriASa auf weniger als 4 mg * g (BTM)reduziert wurde. Weiterhin konnte durch Deletion von PcSCS7 in einem TriASo-Produktionsstamm die TriASa-Produktion mehr als vierfach reduziert werden. Die Bildung eines weiteren von P. ciferrii gebildeten Nebenproduktes [Tri-Acetyl-Sphingadienin (TriASd)] konnte durch Deletion des PcSLD1 Gens unterbunden werden. Nach Inaktivierung von PcSCH9 konnte eine fast 20 %ige Verbesserung der TriASo-Produktion erreicht werden. Es konnten zwei putative Acetyl-Transferasen identifiziert werden (PcAft2 und PcSli1), die an der Acetylierung von Phytosphingosin (zu TAPS), Sphinganin (zu TriASa) und Sphingosin (zu TriASo) beteiligt sind. Die Aufklärung und Optimierung dieser von PcAtf2 und PcSli1 katalysierten Schritte sind vielversprechende Ansatzpunkte die Sphingoidbasen-Produktion in P. ciferrii weiter zu optimieren.
Einfluss des Transkriptionsfaktors Tal1 auf die Osteoklastogenese durch Regulation von DC-STAMP
(2012)
Das menschliche Knochengewebe unterliegt einem ständigen Auf- und Abbau. Der Knochenumbau, die so genannte Knochenremodellierung, findet stetig statt und etwa 10 % des gesamten Knochengewebes werden innerhalb eines Jahres erneuert (Lerner UH, 2006). Während der Knochenremodellierung befindet sich die Zellaktivität der Knochenaufbauenden Osteoblasten und der Knochen-abbauenden Osteoklasten in einem empfindlichen Gleichgewicht (Karsenty G und Wagner EF, 2002; Teitelbaum SL, 2000).
Durch Störung des Gleichgewichts zwischen Osteoblasten und Osteoklasten kann es zu Knochen-assoziierten Krankheiten wie Osteoporose oder Osteopetrose kommen (Helfrich MH, 2003; Sambrook P und Cooper C, 2006). Osteoklasten sind multinukleäre Zellen, die in der Lage sind die Knochenmatrix zu resorbieren (Teitelbaum SL, 2000). Sie entstehen aus pluripotenten, hämatopoetischen Stammzellen durch Differenzierung und Zellfusion von Monozyten/Makrophagen-Vorläuferzellen (Menaa C et al., 2000, Yavropoulou MP und Yovos JG, 2008). Die Osteoklasten-Differenzierung wird hauptsächlich durch die Zytokine M-CSF (macrophage colony stimulating factor) und RANKL (receptor activator of nuclear factor k b ligand) induziert. Sie initiieren ein spezifisches Expressionsmuster Osteoklasten-spezifischer Gene und aktivieren die Zellfusion in Osteoklasten-Vorläuferzellen zur Bildung reifer Osteoklasten (Boyle WJ et al., 2003; Asagiri M und Takayanagi H, 2007). Die RANKL-vermittelte Induktion der Osteoklastogenese beruht auf der Initiierung eines streng regulierten Netzwerks aus Transkriptionsfaktoren (Yang X und Karsenty G, 2002). Einige Transkriptionsfaktoren, die während der Osteoklasten-Differenzierung induziert und exprimiert werden, sind nicht auf Osteoklasten beschränkt. Sie erfüllen auch Aufgaben in anderen hämatopoetischen Differenzierungsprozessen (Engel I und Murre C et al., 1999), so dass vermutlich die Kombination der Transkriptionsfaktoren entscheidend für die Osteoklastogenese ist.
Der basic helix-loop-helix-Transkriptionsfaktor Tal1 (T-cell acute lymphocytic leukemia 1, auch Scl1, stem cell leukemia 1) ist ein entscheidender Faktor in der primitiven und der definitiven Hämatopoese (Bloor AJ et al., 2002; Shivdasani RA et al., 1996). Die Expression von Tal1 konnte bisher in verschiedenen hämatopoetischen Zelllinien gezeigt werden, u.a. in monozytischen Zellen (Elefanty AG et al., 1998; Green AR et al., 1992; Pulford K et al., 1995; Dey S et al., 2010).
In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss des Transkriptionsfaktors Tal1 in Monozyten und reifen Osteoklasten, vor allem in Bezug auf genregulatorische Prozesse während der Osteoklasten-Differenzierung, untersucht. Der Transkriptionsfaktor Tal1 wird in vitro und in vivo in Osteoklasten-Vorläuferzellen und reifen Osteoklasten exprimiert. Die Proteinexpression von Tal1 wird durch die Inkubation der Zellen mit RANKL induziert, jedoch wurde dies in Bezug auf die mRNA-Expression von Tal1 nicht beobachtet, so dass vermutlich eine posttranskriptionelle Regulation von Tal1 vorliegt.
Die Überexpression von Tal1 sorgte für eine Blockade der Differenzierung von Osteoklasten-Vorläuferzellen in reife Osteoklasten. Der Verlust von Tal1 in primären Monozyten/Makrophagen-Zellen führte zur veränderten Expression von über 1200 Genen, wobei jeweils etwa 600 Gene herauf- bzw. herabreguliert waren. Dies verdeutlicht, dass Tal1 sowohl an der Aktivierung als auch an der Reprimierung der Genexpression in Osteoklasten-Vorläuferzellen beteiligt ist. Die Liste der herabregulierten Gene beinhaltete u.a. das Osteoklasten-spezifische Enzym Acp5 (auch TRAP, tartrate resistant acid phosphatase), die Liste der herauf regulierten Gene beinhaltete u.a. DC-STAMP (dendritic cell specific transmembrane protein) und ATP6V0D2 (d2 isoform of vascuolar ATPase V0 domain), beide werden im Zusammenhang mit der Zellfusion während der Osteoklasten-Differenzierung beschrieben (Kim K et al., 2008; Kim T et al., 2010; Yagi M et al., 2005). Der Promotor von DC-STAMP beinhaltet mehrere potentielle Bindestellen für Tal1 und Osteoklastenspezifische Transkriptionsfaktoren. Es konnte gezeigt werden, dass Tal1, PU.1 und MITF im Bereich um 343 bp vor dem Transkriptionsstartpunkt des DC-STAMP-Promotors binden und dass Tal1 mit den Osteoklasten-spezifischen Transkriptionsfaktoren PU.1 und MITF interagiert. Der inhibitorische Effekt von Tal1 auf die Osteoklasten-Differenzierung kommt durch die Reprimierung der Aktivität der Osteoklasten-spezifischen Transkriptionsfaktoren PU.1 und MITF auf dem DC-STAMP-Promotor in Osteoklasten-Vorläuferzellen zustande. Während der Osteoklastogenese kommt es zu einer verringerten Tal1-Bindung auf dem DCSTAMP-Promotor, wodurch die Tal1-vermittelte Inhibierung der Expression aufgehoben wird.
Die Bindung von PU.1 und MITF auf dem Promotor von DC-STAMP nimmt während der Osteoklasten-Differenzierung zu. Die Expression von DC-STAMP wird im Verlauf der Osteoklastogenese induziert, wodurch es zur Zell-Zell-Fusion kommt.
Die Analyse des transkriptionellen Netzwerks, das die Fusion mononukleärer Zellen in reife Osteoklasten reguliert, vertieft das molekulare Verständnis der Osteoklasten-Differenzierung und kann zur Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze beitragen, die in der Behandlung von Osteoporose, Riesenzelltumoren und anderen Osteoklastenassoziierten Krankheiten verwendet werden können.
Das maligne Gliom, auch Glioblastom multiforme (GBM) genannt, ist der häufigste und gleichzeitig auch bösartigste hirneigene Tumor und macht rund 2% aller Krebsneuerkrankungen aus. Die Weltgesundheitsorganisation (world health organisation, WHO) stuft das GBM als Grad IV Tumor ein, was es als hochmalignen Tumor auszeichnet der infiltrativ in das umliegende Hirnparenchym einwandert und mit den gegenwärtigen Behandlungsmethoden, bestehend aus Resektion des Tumors, Chemotherapie und Strahlentherapie nicht kuriert werden kann. Das aggressive Wachstum und die ausgeprägte Resistenz dieses astrozytären Tumors gegenüber den verfügbaren Therapien der Bestrahlung und Chemotherapie sind Hauptgründe für die schlechte Prognose für Patienten mit Glioblastomen, deren medianes Überleben immer noch unter der Zwei-Jahres-Grenze liegt. Daher ist es von Nöten neue therapeutische Strategien auf Grundlage der Chemotherapie zu entwickeln, die selektiv wichtige, deregulierte Signalwege der Krebszelle angreifen. Einer dieser Signalwege in Gliomen ist der Stat3-Signalweg (signal transducer and activator of transcription). Stat3, ein latenter zytoplasmatischer Transkriptionsfaktor liegt in Gliomen oftmals konstitutiv aktiv vor. Diese Deregulation des Signalweges führt zur dauerhaften Transkription proonkogener Zielgene die in transformierten Zellen zu Proliferation, Apoptoseresistenz, Neoangiogenese und Immunsupprimierung führen können. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, inwiefern eine pharmakologische oder gentechnische Inhibierung von Stat3 molekulare und zelluläre Charakteristika von Gliomen beeinflusst. Dazu wurde für die in-vivo Versuche ein syngenes, murines Gliom-Transplantationsmodell verwendet dessen Pathologie der eines humanen Glioms gleicht und den Vorteil besitzt keine immunsupprimierten Tiere verwenden zu müssen. Die murinen Gliomzelllinien, gewonnen aus spontanen Gliomen von GFAP-v-Src überexprimierenden Mäusen, wurden vorher in-vitro und auch exvivo bezüglich ihres Verhaltens auf die pharmakologische oder gentechnische Inhibierung von Stat3 charakterisiert. Für die pharmakologische Inhibierung wurde Kurkumin gewählt, der biologische aktive Wirkstoff der Pflanze Curcuma longa. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine Behandlung mit Kurkumin konzentrationsabhängig die Phosphorylierung von Stat3 in drei murinen Gliomzelllinien hemmt. Des Weiteren zeigte sich, dass auch die Proliferation der untersuchten transformierten Zellen sowie ihre Fähigkeit zur Invasion und Migration konzentrationsabhängig durch den Einsatz von Kurkumin inhibiert werden konnte, ohne dabei allerdings die Proliferation von primären Astrozyten im gleichen Maße zu hemmen. Kurkumin induziert zusätzlich in den überaus aopotoseresistenten Gliomzellen einen G2/M Zellzyklusarrest. Diese beobachteten Effekte stehen im Zusammenhang mit der konzentrationsabhängigen transkriptionellen Beeinflussung Kurkumins der tumorpromotenden Stat3- Zielgene. Durch Einsatz einer Stat3-Mutante, Stat3C, die ohne Phosphorylierung konstitutiv aktiv in der Zelle vorliegt, konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass Kurkumin seinen Einfluss auf die Invasion und Migration der murinen Gliomzelllinien auch über den Stat3-Signalweg vermittelt, zeigte sich, dass durch Einbringung dieser Mutante trotz Kurkuminbehandlung die Migrations- und Invasionsfähigkeit partiell retabliert werden konnte. Durch dietätische Gabe von Kurkumin konnte in tumortragenden Mäusen gezeigt werden, dass die invitro ermittelten Effekte an einem längeren Überleben jener Mäuse beteiligt waren, deren Futter das Kurkumin enthielt. Die Administration des Kurkumins wurde entsprechend einer für die Klinik bevorzugten Darreichugsform gewählt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde Stat3 in den murinen Gliomzelllinien durch Transduktion mit shRNA gerichtet gegen die Stat3-mRNA stabil depletiert um im Folgenden untersuchen zu können, welche zellulären und molekularen Konsequenzen konstitutiv aktives Stat3 für die Gliomzellen hat. Es zeigte sich, dass der Wegfall von Stat3 das Migrations- und Invasionspotential signifikant verringerte und die Expression tumorfördernder Zielgene ebenfalls in den Stat3-defizienten Zellen auf Protein- und mRNA-Ebene signifikant reduziert war. Der Einfluss von Stat3 auf die Hif1α-Expression, ein Transkriptionsfaktor der die Anpassung der Gliomzellen an ein hypoxisches Milieu und damit verbunden auch Migration und Invasion induziert kann, macht deutlich, dass konstitutiv aktives Stat3 unter normoxischen sowie auch hypoxischen Bedingungen upstream entscheidender Transkriptionsfaktoren liegt und sich somit als Zielmolekül für eine therapeutische Intervention anbietet. Eine ex-vivo Applikation auf organotypischen Schnittkulturen zeigte, dass durch den Wegfall von Stat3 in den murinen Gliomzellen die Einzelzellinvasion unterbunden werden konnte was entscheidend für das klinisch hochrelevante Problem der Rezidive sein könnte. Transplantierte man nun Kontroll- und Stat3-defiziente Zellen orthotrop in die immunkompetenten Mäuse zeigte die Kaplan-Meier-Kurve, dass der Krankheitsbeginn so wie das mediane Überleben in den Mäusen mit Stat3-defizientem Tumor zeitlich deutlich nach hinten verschoben war. Neben den invitro und ex-vivo ermittelten Effekte des Stat3-Wegfalls ist anzunehmen, dass das verlängerte Überleben dieser Mäuse auch mit der fehlenden Immunsupprimierung der Stat3-defizienten Tumore zusammenhängt. Es zeigte sich, dass eine Intervention gegen Stat3, ob nun pharmakologisch oder gentechnisch, die malignen Charakteristika des Glioblastoms positiv beeinflussen kann. Stat3, bestätigt als onkogener Transkriptionsfaktor, stellt damit eine lohnenden Zielstruktur in Gliomen dar.
Eine verzögerte und mitunter unvollständige Immunrekonstitution nach allogener Stammzelltransplantation (SZT) birgt ein erhöhtes Risiko für Infektionen und das Auftreten eines Rezidivs. Adoptive Immuntherapien können dazu beitragen, die Immunrekonstitution zu beschleunigen. Die Indikation hierzu ist jedoch streng geregelt, da eine zusätzliche Immuntherapie mit Risiken, wie z.B. dem Auftreten einer Graft-versus-Host-Disease (GvHD), verbunden ist. Im Mittelpunkt dieser Arbeit steht die Untersuchung der Immunrekonstitution im Hinblick auf das Auftreten von Komplikationen und das Überleben nach SZT. Dazu wurde ein multivariates Normwertmodell entwickelt, das die Beurteilung der Rekonstitution verschiedener Leukozytensubpopulationen ermöglicht. Der Einfluss der Regeneration spezifischer Immunzellen wie Cytomegalievirus-spezifischer T-Zellen (CMV-CTLs) und regulatorischer T-Zellen (Tregs) auf den Verlauf nach SZT wurde insbesondere hinsichtlich CMV-bedingter Komplikationen, GvHD und Rezidiv untersucht.
RNA hat neben der Rolle als Informationsüberträger wichtige Aufgaben in regulatorischen Prozessen. Sie kann komplexe Strukturen ausbilden und ähnlich wie Proteine Liganden binden oder enzymatische Reaktionen katalysieren. Im Rahmen dieser Arbeit sollten zwei Beispiele von RNA-Liganden-Interaktionen untersucht werden. Im ersten Abschnitt wurde die Interaktion des TetR-bindenden Aptamers 12-1 mit dem Tetracyclin-Repressorprotein (TetR) biochemisch charakterisiert. Über Gelverzögerungs- experimente wurde gezeigt, dass das Aptamer 12-1K delta A TetR mit hoher Affinität und Spezifität bindet. Es wurde ein KD von 22 nM bestimmt. Die Bindung ist dabei ebenso stark wie die Bindung von TetR an die Operatorsequenz tetO. In Anwesenheit von Tetracyclin (Tc) nimmt die Affinität des TetR/Aptamer-Komplexes um das sechsfache ab. Des Weiteren konnten die Bindeepitope des Aptamers durch eine Analyse von verschiedenen TetR-Mutanten im DNA-Bindebereich bestimmt werden. Die Aminosäuren T27, N47 und K48 sind dabei essentiell für die RNA-Bindung und führen bei einem Austausch zum Verlust der RNA-Bindung. Der Bindebereich des Aptamers überlappt mit Aminosäureresten, die für die tetO-Bindung essentiell sind. Die Stöchiometrie der TetR/Aptamer-Bindung wurde durch LILBID-Messungen auf eine molare Verteilung von 2:1 festgelegt. Ein TetR-Dimer bindet dabei ein Aptamermolekül. Durch die umfassende biochemische Analyse der TetR/Aptamer-Bindung kann das Aptamer 12-1 nun als Expressionssonde für RNAs in bakteriellen Zellen genutzt werden. Des Weiteren kann das Aptamer als alternativer, artifizieller Transkriptionsregulator im tet on / tet off-System verwendet werden. Im zweiten Teil der Arbeit sollten miRNAs identifiziert werden, die an der posttrans- kriptionellen Regulation der 5-Lipoxygenase (5-LO) und der Cyclooxygenase-2 (COX-2) beteiligt sind. Mit bioinformatischen Vorhersageprogrammen wurden die 3’-UTR- Bereiche von 5-LO und COX-2 nach putativen Bindestellen abgesucht. Im Fall der 5-LO wurden durch eine zusätzliche Microarray-Expressionsanalyse miRNAs ausgewählt, welche in 5-LO positiven Zellen hoch exprimiert sind und Bindestellen im 3’-UTR aufweisen. Es konnten verschiedene miRNAs detektiert werden, jedoch keine Regulation der 5-LO Aktivität beobachtet werden. Für COX-2 wurde neben der Suche nach putativen miRNA-Bindestellen zudem die Stabilität des 3’-UTR untersucht. Mit Hilfe des auf Perl basierenden Programms SignificanceScoreAssignment (Florian Groher, Diplomarbeit 2011) konnte der 3’-UTR von COX-2 als generell destabilisierend analysiert werden. In Colonkarzinom- spezifischen HT-29-Zellen wurden miRNAs untersucht, welche Bindestellen im 3’-UTR von COX-2 aufweisen. In diesem Kontext sollte der Einfluss einer Interaktion von HT- 29-Zellen mit aktivierten Thrombozyten sowie daraus isolierten Bestandteilen wie Mikropartikeln und PDGF analysiert werden. MiR-16, miR-26b, miR-199a und miR- 199a* konnten in HT-29-Zellen nachgewiesen werden. Bei einer Stimulation von HT-29- Zellen mit PDGF-BB werden miR-16 und miR-26b konzentrationsabhängig stärker exprimiert, während die Expression von miR-199a und miR-199a* signifikant abnimmt. Eine direkte Regulation von COX-2 durch die untersuchten miRNAs konnte durch Überexpressions- und Reportergenanalysen jedoch nicht festgestellt werden. Die Analysen der 5-LO- und COX-2-Regulation durch miRNAs stellen Vorarbeiten dar. Die etablierten Methoden können nun für eine detaillierte Betrachtung weiterer miRNAs verwendet werden.
Die Bedeutung verschiedener CRASP-Proteine für die Komplementresistenz von Borrelia burgdorferi s.s.
(2010)
Die vorliegende Arbeit liefert einen wichtigen Beitrag zum Verständnis des molekularen Mechanismus der Immunevasion von B. burgdorferi s.s., insbesondere der Bedeutung einzelner CRASP-Proteine für die Komplementresistenz. Sie trägt dazu bei, die Relevanz dieser Proteine für die Pathogenese dieses Erregers zu untermauern. Im Rahmen dieser Arbeit gelang es, verschiedene Vektoren mit den ursprünglichen oder mutierten CRASP-kodierenden Genen cspA, cspZ, erpP und erpA aus B. burgdorferi s.s. zu generieren und diese in das CRASP-negative Isolat B. garinii G1 zu transformieren. Die Expression der speziesfremden Gene als auch der Transport der CRASP-Moleküle auf die Zelloberfläche von B. garinii G1 konnten nachgewiesen werden. Für die konstitutiv CRASP-1- oder CRASP-2-produzierenden Borrelienzellen konnte gezeigt werden, dass diese, auf der Zelloberfläche lokalisierten CRASP-Moleküle mit Faktor H und FHL-1 interagieren, die gebundenen Komplementregulatoren ihre funktionelle Aktivität zur C3b-Inaktivierung aufrechterhalten und die Zellen in Gegenwart von Komplement überleben. Damit wurde erstmals der Nachweis erbracht, dass beide CRASP-Moleküle unabhängig voneinander Schutz vor komplementvermittelter Lyse verleihen. Untersuchungen mit den veränderten CRASP-1-Molekülen ergaben, dass die Transformante G1/pCRASP-1 E147K eine verringerte Bindung von Faktor H und FHL-1 aufwies, welche sich jedoch nicht auf die Komplementresistenz der Zellen auswirkte. Im Gegensatz dazu führte eine Aminosäuresubstitution im C-Terminus des CRASP-1-Moleküls an Position 240 zum Verlust der Bindung von Faktor H und einer stark verminderten Bindung von FHL-1, so dass auch keine Kofaktoraktivität nachgewiesen werden konnte. Trotz des Bindungsverlustes beider Komplementregulatoren zeigte die Transformante G1/pCRASP-1 Y240A nur geringe Ablagerungen des lytischen, terminalen Komplementkomplexes (TCC) auf der Zelloberfläche und Wachstum in Gegenwart von aktiven Komplement. Mittels eines Hämolyse-Assays wurde schließlich festgestellt, dass CRASP-1 direkt mit Komponenten des Komplementsystems interagiert und dadurch die Assemblierung des TCC verhindert. Die Bedeutung der Aminosäuren an den Positionen 81, 139, 207 und 211 im CRASP-2-Molekül für die Faktor H / FHL-1-Bindung und die daraus resultierenden Auswirkungen auf die Komplementresistenz der Borrelien wurde gleichfalls nachgewiesen. Dabei wies insbesondere die Transformante G1/pCRASP-2 Y211A ein inhibiertes Wachstum in Humanserum und verstärkt Komplementablagerungen auf der Zelloberfläche auf, was auf den Verlust bzw. der sehr schwachen Bindung von FHL-1 und Faktor H zurückzuführen ist. Im Gegensatz zu den Transformanten, welche ein CRASP-2-Molekül mit nur einem Aminosäureaustausch produzierten, zeigten die Transformanten, deren CRASP-2-Molekül zwei Aminosäuresubstitutionen aufwies (G1/pCRASP-2 R139A-Y207A, G1/pCRASP-2 R139A-Y211A, G1/pCRASP-2 Y207A-Y211A) keine Bindung der beiden Regulatorproteine und keinen Schutz der Zellen vor der lytischen Wirkung von Komplement. Neue, unerwartete Erkenntnisse ergaben sich aus den Untersuchungen mit Borrelienzellen, welche das CRASP-3- oder CRASP-5-kodierende erpP- bzw. erpA-Gen enthielten. Obwohl gereinigtes als auch denaturiertes CRASP-3 und RASP-5 in der Lage war, Faktor H zu binden, wiesen die vitalen Zellen der Transformanten G1/pCRASP-3 und G1/pCRASP-5 keine Bindung von Faktor H und keinen Schutz der Zellen vor komplementvermittelter Lyse auf. Aus den durchgeführten Untersuchungen konnten für gereinigtes CRASP-3 und CRASP-5 als auch für die CRASP-3- und CRASP-5-produzierenden Transformanten neue Liganden, nämlich CFHR-2 und CFHR-5, aus Humanserum identifiziert werden. Zusammenfassend lassen sich folgende Aussagen hinsichtlich des molekularen Mechanismus der Komplementresistenz bei B. burgdorferi s.s. aus den erhobenen Daten dieser Arbeit mit transformierten Borrelienzellen formulieren: *Die Komplementresistenz der Borrelien wird durch die Faktor H- und FHL-1-bindenden Proteine CRASP-1 und CRASP-2, jedoch nicht durch CRASP-3 und CRASP-5 determiniert, *CRASP-1 als multifunktionelles Protein ist zusätzlich in der Lage, direkt mit Komplement zu interagieren, *Die C-terminalen Domänen von CRASP-1 und CRASP-2 sind für die Bindung der beiden Komplementregulatoren Faktor H und FHL-1 relevant, *CRASP-3 und CRASP-5 auf der Borrelienoberfläche lokalisiert, interagieren mit CFHR-1, CFHR-2 und CFHR-5, aber nicht mit Faktor H.
Das Prostatakarzinom (PCa) ist in Deutschland die häufigste bösartige Malignität beim Mann; jährlich erkranken etwa 58.000 Männer am PCa. Mit 11.000 Todesfällen pro Jahr liegt PCa in der Mortalitätsstatistik an dritter Stelle, hinter dem Bronchialkarzinom und dem Dickdarmkarzinom. Solange PCa auf die Vorsteherdrüse begrenzt ist, besteht die Möglichkeit einer Heilung über die Prostatektomie oder Bestrahlung. Bei etwa 15% der Neuerkrankungen tritt ein metastasierender PCa auf. Bei etwa 20% der Patienten mit organbegrenztem Tumor zeigen lokale Therapieformen keine Wirkung, so dass ebenfalls einer invasiven Ausbreitung Vorschub geleistet wird. Weitere Therapieformen bilden die Androgensuppression und die Chemotherapie. Bei der Androgensuppression kommt es sehr häufig zu einem hormonrefraktären Stadium, das über einen PSA-Anstieg definiert wird. Ist das hormonrefraktäre Stadium erreicht, stehen nur begrenzte Therapieoptionen zur Verfügung. In der jüngeren Vergangenheit wurden neue molekulare Substanzen entwickelt, die gezielt in den Metabolismus der Karzinomzellen eingreifen, die targeted therapy molecules. PCa ist eine sehr heterogene Karzinomentität. Das Verständnis des Zusammenspiels von parallelen und interagierenden mitogenen Signaltransduktionswegen beim PCa, die sein Wachstum, seine Differenzierung und seine Zellmotiliät regulieren, ist von enormer Bedeutung, um neue bzw. schon bestehende Inhibitoren gegen PCa erfolgreich zu entwickeln oder als Mono- bzw. Kombinationstherapie anzuwenden. Zu den beim PCa häufig überexprimierten Signalproteinen gehören der mammalian target of rapamycin (mTOR), die Rezeptor-Tyrosinkinasen (RTKs) und die Histondeacetylasen (HDACs). Ziel dieser Arbeit war es, die Effektivität von Inhibitoren auf diese Signalproteine als Einzel- und Kombinationstherapie im Hinblick auf das Zellwachstum und die Adhäsionseigenschaft der PCa-Zellen zu untersuchen. Zur Anwendung kamen RAD001, ein mTOR-Inhibitor, AEE788, ein Multikinaseinhibitor gegen den VEGF- und EGF-Rezeptor, die Valproinsäure (VPA), ein HDAC-Inhibitor und das Interferon-alpha-2a (IFNalpha2a), ein körpereigenes Zytokin. Die Untersuchungen basierten auf zellbiologischen und biochemischen Analysen in-vitro unter Verwendung der PCa-Zelllinien DU145, PC-3 und LNCaP und in-vivo mittels eines xenogenen Nacktmausmodells. Im Rahmen funktioneller Untersuchungen wurden unter den entsprechenden Therapien das Zellwachstum mit dem MTT-Test ermittelt, das Expressionsmuster der zellzyklusregulierenden Proteine durch die Western-Blot-Hybridisierung und die Progression des Zellzyklus mittels der Durchflusszytometrie untersucht. Im weiteren Verlauf wurden die Adhäsionsprozesse an Matrix und an Endothel analysiert und die Modulation der Integrinsubtypen mit Hilfe der fluorimetrischen und molekularbiologischen Methoden sowie deren Genaktivität evaluiert. Die Synthese der gebundenen und freien Form von PSA wurde mit dem ELISA-Verfahren gemessen. Zur detaillierten Aufklärung der Wirkmechanismen der Medikamente diente die nähere Untersuchung intrazellulärer Signalwege anhand molekularbiologischer Studien. AEE788, RAD001, VPA, nicht jedoch IFNalpha2a erzielten eine deutliche Reduktion im Zellwachstum und der Adhäsion der PCa-Zellen. Dabei war jede Substanz durch ein eigenes Wirkprofil charakterisiert und zeigte eine zelltypabhängige molekulare Aktivität. Während AEE788 und RAD001 eine direkte Wirkung auslösten, war der Effekt von VPA zeitversetzt. Im Gegensatz zu VPA und RAD001 beeinflusste AEE788 vor allem androgenresistente Zellen. Eine kombinierte Behandlung erwies sich nicht in allen Fällen als gleich effektiv. Letztendlich zeigten vor allem AEE788/RAD001, VPA/RAD001 und VPA/IFNalpha2a deutliche antitumorale Effekte. Dabei demonstrierten die Untersuchungen eine Verringerung des Zellwachstums, einhergehend mit einer deutlichen Modulation der relevanten regulatorischen Zellzyklusproteine, einer Zunahme der Tumorsuppressoren und einer deutlichen Verlangsamung der Zellzyklusprogression. AEE788/RAD001 und VPA/IFNalpha2a erzielten dabei eine effektive Reduktion von Wachstum und Adhäsion. In Analysen der Adhäsionsprozesse konnte die Modulation der Integrinsubtypen und der integrinassoziierenden Kinasen aufgrund der Substanzen demonstriert werden und zeigte bei androgenresistenen und androgensensitiven Zellen einen unterschiedlichen Wirkungseinfluss. Nur die Kombination von VPA/IFNalpha2a verringerte signifikant die PSA-Synthese und zeigte bei der Evaluation der intrazellulären Signalwege einen deutlichen Verstärkereffekt in der Regulation der Proteinexpression und der Aktivität von EGFR, ERK1/2 und P70S6K. In der darauffolgenden in-vivo-Untersuchung konnte der Verstärkereffekt von VPA/IFNalpha2a in einer effektiven Reduktion des Tumorvolumens demonstriert werden. Da insbesondere PCa einen sehr heterogenen Phänotyp aufweist, bietet vor allem die kombinierte targeted Therapie neue Hoffnung und vielversprechende Therapiemöglichkeiten. Die eigenen Daten demonstrieren, dass nur bestimmte Medikamenten-Kombinationen eine effektive Verstärkung der antikarzinogenen Effekte erzielen und eine wirksame Therapie des PCa ermöglichen. Bei der klinischen Anwendung ist zu beachten, dass abhängig von Geno- und Phänotyp individuelle Therapiekonzepte zu berücksichtigen sind.
Orthopockenviren sind große DNA-Viren, die im Zytoplasma der Wirtszelle replizieren und für über 200 Proteine kodieren. Sie besitzen ein breites Wirtszellspektrum (host-range) und modulieren auf komplexe Art und Weise zelluläre Prozesse, um ihre Replikation zu gewährleisten. Zu diesem Genus der Familie der Pockenviren gehört auch das modifizierte Vacciniavirus Ankara (MVA). MVA ist ein hoch attenuiertes, replikationsdefizientes Impfvirus, dem im Vergleich zu ursprünglichen Vacciniavirus-Stämmen viele virale Genfunktionen fehlen. Zu diesen verlorengegangenen Genen zählen so genannte host-range-Gene, die für das breite Wirtszellspektrum des Vacciniavirus (VACV) verantwortlich sind, deren molekulare Funktion aber größtenteils unbekannt ist. Diese Arbeit befasste sich zum einen mit der Untersuchung der Rolle der host-range-Gene K1L und C7L in der MVA-Infektion. Zum anderen sollte geprüft werden, ob der im MVA-Genom unvollständige Leserahmen F11L durch Wiederherstellung seiner Funktionalität den Wirtstropismus von MVA erweitern kann. Das Fehlen von K1L und C7L in MVA ist mit dem Verlust der späten viralen Genexpression verbunden. Als mögliche Ursache hierfür wurde in dieser Arbeit die Phosphorylierung des eukaryotischen Translationsinitiationsfaktors 2alpha (eIF2alpha) entdeckt, welche zum Abbruch der Proteinsynthese in der infizierten Zelle führt. Unter den möglichen Kinasen wurde die Proteinkinase R (PKR) als das verantwortliche Schlüsselenzym identifiziert und somit gezeigt, dass das K1- und C7-Protein den anti-viralen PKR-eIF2alpha-Signalweg inhibieren. Es stellte sich heraus, dass die eIF2alpha-Phosphorylierung alleine jedoch nicht für das Fehlen der späten Genexpression verantwortlich ist. Neben dem inhibitorischen Einfluss auf den PKR-eIF2alpha-Signalweg zeigte sich, dass C7 die Aktivierung des NFKB-Signalwegs reduziert, welcher für eine anti-virale Antwort der Wirtszelle wichtig ist. Ein weiterer Ansatz zur Aufklärung der K1- und C7-Funktion bestand darin, zelluläre Interaktionspartner zu identifizieren. Hierbei konnte das heterogene nukleäre Ribonukleoprotein K (HNRPK) als möglicher Interaktionspartner von C7 entdeckt werden. Neben den bisher bekannten host-range-Genen gibt es vermutlich weitere Gene, die den Wirtsbereich des VACV definieren. Das im MVA-Genom defekte F11L-Gen war ein guter Kandidat für eine solche Genfunktion, da es bei der Virionenmorphogenese, Virusausbreitung und der Migration VACV-infizierter Zellen eine Rolle zu spielen scheint. Deshalb wurde ein rekombinantes MVA mit vollständiger F11L-Gensequenz konstruiert und das Wirtszellspektrum dieses Virus untersucht. Die Reparatur des F11L-Gens ermöglichte MVA die Induktion von Zellbewegung nach Infektion, jedoch blieben seine unvollständige Morphogenese und eingeschränkte Vermehrungsfähigkeit in Säugetierzellen unbeeinflusst. F11L hat daher zumindest keine selbstständige Funktion als VACV host-range-Gen. Die Ergebnisse dieser Arbeit sind ein Beitrag zum besseren Verständnis der komplexen Virus-Wirts-Interaktionen des VACV sowie des eingeschränkten Wirtstropismus des Impfvirus MVA.
Die Zelle repliziert ihre DNA während der S-Phase und segregiert sie dann später in der M Phase des Zellzykluses. Kommt es während dieser Prozesse zu DNA Schädigungen, arretiert die Zelle den Zellzyklus mit Hilfe spezifischer Kontrollmechanismen und versucht den Schaden zu beheben. Der DNA Kontrollpunkt wird bei DNA Schädigungen aktiviert, um mit Hilfe der DNA Reparatur den Schaden zu beheben und somit dafür zu sorgen, dass die DNA fehlerfrei repliziert werden kann. Der zweite Zellzyklus Kontrollpunkt, der Spindel Kontrollpunkt, stellt sicher, dass die Chromosomen während der M Phase unter gleicher Spannung innerhalb der Äquatorialplatte der Metaphase Spindel angeordnet sind. Kann in der Zeit, in der der Zellzyklus Kontrollpunkt aktiv ist, der Schaden nicht behoben werden, so wird Apoptose ausgelöst und die Zelle wird aus dem Zellverband entfernt. Krebszellen haben Strategien entwickelt, Zellzyklus Kontrollpunkte zu umgehen und darüber hinaus normalen Mechanismen der Apoptose zu entkommen. Die genauen molekularen Vorgänge der Deregulierung der Apoptose sind weitestgehend unaufgeklärt. Procaspase 8 ist ein wichtiges Schlüsselenzym des extrinsischen Apoptose Signalweges. Der extrinsische Signalweg wird extrazellulär über die Bindung von Liganden an ihre korrespondierenden Rezeptoren ausgelöst. In dieser Studie wird gezeigt, dass Procaspase 8 an Ser-387 in vitro als auch in vivo von Cdk1/Cyclin B1 phosphoryliert wird. Darüber hinaus zeigt diese Phosphorylierungsstelle die typische Struktur einer Bindungsstelle für Plk1, einer weiteren mitotischen Kinase. Die Interaktion von Procaspase 8 mit Cdk1/Cyclin B1 wird über die DE Domäne („death-effector-domain“ DED) von Procaspase 8 vermittelt. Wird Procaspase 8 an Ser 387 zu Alanin (S387A) mutiert, so wird die Phosphorylierung durch Cdk1/Cyclin B1 fast vollständig verhindert. Wird zudem diese Mutante (S387A) in humanen Krebszellen überexprimiert, so hemmt dies die Apoptose nach Stimulation des Fas Rezeptors. Wird umgekehrt Cyclin B1 mittels RNA Interferenz depletiert und dadurch Cdk1 nicht aktiviert, wird extrinsische Apoptose verstärkt. Diese Studie zeigt erstmals eine gezielte Inhibierung des extrinsischen Apoptose Signalweges durch mitotische Kinasen und schlägt ein Modell vor, in dem Serin/Threonin Kinasen extrinsische Apoptose inhibieren und somit der Tumorzelle ermöglichen, der Apoptose zu entkommen. Darüber hinaus wird ein neuartiger Mechanismus der Inhibition der autokatalytischen Spaltung von Procaspase 8 durch eine mitotische Kinase gezeigt.
Die wichtigste Aufgabe der mitotischen Spindel ist die genaue Segregation der duplizierten Chromosomen in der Mitose. Diese dynamische Struktur wird von sich teilenden Zellen gebildet, um die Bewegung der Chromosomen, das Markenzeichen der Mitose, zu dirigieren. Trotz aller Unterschiede in Form und Größe der Spindeln unterschiedlicher Zelltypen, haben alle eukaryontischen Spindeln fundamentale strukturelle Eigenschaften gemeinsam. Eine der wichtigsten Eigenschaften ist die bipolare Symmetrie. Innerhalb der Spindel sind unterschiedliche Klassen der Mikrotubuli vorhanden, die durch ihre Organisation und durch ihre dynamischen Eigenschaften unterteilt sind. Alle Klassen der Mikrotubuli zeigen dynamische Instabilität. Dennoch weisen die Kinetochor-Mikrotubuli und die Spindel-Mikrotubuli zusätzlich ein anderes Verhalten auf, das als polwärts gerichteter Mikrotubuli-Flux ("Poleward Microtubule Flux") bezeichnet wird. Dabei werden die Tubulin-Untereinheiten stetig an den Plus-Enden der Mikrotubuli eingefügt und dann zu den Minus-Enden getragen, wo sie abgebaut werden. Dieser polwärts gerichtete Mikrotubuli-Flux ist für die Segregation der Chromosomen von großer Bedeutung. Mehrere regulatorische Proteine der Mikrotubuli, einschließlich der destabilisierenden und der depolymerisierenden Proteine, steuern die Dynamik dieser Mikrotubuli, um eine fehlerfreie Bildung der Spindel und eine korrekte Segregation der Chromosomen gewährleisten zu können. Die Kinesin-13 Familie der Depolymerasen gehört zu den prominentesten Modulatoren der Dynamik der Mikrotubuli. Das am Besten charakterisierte und intensiv studierte Mitglied dieser Familie ist das Protein KIF2C/MCAK. Aufgrund der unterschiedlichen Lokalisationen von MCAK während der Mitose, an den Spindelpolen, an den Chromosomen-Armen, an den Centromeren/Kinetochoren, kann MCAK eine Reihe an wichtigen Funktionen erzielen. Allerdings bleibt die Korrektur von Kinetochor-Mikrotubuli Fehlverknüpfungen die wichtigste Aufgabe von MCAK während der Mitose. Diese wesentliche Funktion steht unter der Kontrolle von Aurora B. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass MCAK während der Mitose auch von einem wichtigen Komplex, dem Cyclin B1/CDK1 Komplex, reguliert wird. In der Tat steuert die Kinase CDK1 sowohl die Lokalisation als auch die katalytische Aktivität von MCAK. Mit Hilfe einer systematischen Reihe an Experimenten konnte nachgewiesen werden, dass MCAK sowohl in vitro als auch in vivo von CDK1 phosphoryliert wird. CDK1 phosphoryliert den katalytischen Bereich von MCAK genau am Threonin 537 und führt zu einer deutlichen Abnahme der Depolymerisierungsaktivität von MCAK in vitro und in humanen Zellen. Diese Inhibition erfolgt wahrscheinlich durch eine Reduzierung der Affinität von MCAK zu den Mikrotubuli-Enden. Die Expression der Phosphostatus-vortäuschenden Mutante T537E in HeLa-Zellen verursachte eine fehlerhafte Verteilung der Chromosomen in der Mitose. Die Chromosomen waren in Anwesenheit der T537E Mutante nicht mehr in der Lage, sich auf der Metaphaseplatte anzuordnen. Darüber hinaus führte die Expression von T537E zu einer signifikanten Reduzierung des centromerischen Abstandes, was auf eine Anhäufung von Kinetochor-Mikrotubuli Fehlverknüpfungen hindeutet. Ferner zeigt die Expression der nichtphosphorylierbaren Mutante T537A in den HeLa-Zellen eine verstärkte Lokalisation an den Spindelpolen, was zum Auftreten von erheblichen Spindel-Aberrationen führte. Basierend auf den Daten der vorliegenden Arbeit wurde ein Modell entwickelt, in dem die Phosphorylierung von MCAK durch CDK1 früh in der Mitose stattfinden muss, um einerseits MCAK zu inaktivieren und andererseits diese Depolymerase aus den Spindelpolen zu verdrängen. Beide Ereignisse sind für den Aufbau einer bipolaren Spindel unentbehrlich. Zu späteren Zeitpunkten der Mitose muss das Threonin 537 dephosphoryliert werden, um eine Reaktivierung von MCAK an den Centrosomen/Kinetochoren zu ermöglichen. Dies wird die Korrektur-Funktion für Kinetochor-Mikrotubuli Fehlverknüpfungen von MCAK wiederherstellen, was eine korrekte Anordnung der Chromosomen auf der Metaphaseplatte fördert.
Neuere Daten weisen p53 eine wichtige Rolle in der Verarbeitung von Mangelsignalen zu und deuten darauf hin, dass p53-abhängige molekulare Mediatoren des Warburg-Effektes Glukoseverbrauch und mitochondriale Funktion regulieren. Wir stellten deshalb die Hypothese auf, dass p53-wildtyp (p53wt) in Gliomzellen den metabolischen Bedarf reduzieren kann, der durch deregulierte Signaltransduktionsprozessen unter Mangelbedingungen zu Stande kommt. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass sowohl die shRNA-vermittelte p53-Gensuppression als auch die Temperatur-sensitive dominant-negative p53V135A Mutante in humanen p53wt-Gliomzellen Glukoseverbrauch und Laktatproduktion erhöht, den Sauerstoffverbrauch reduziert und den Hypoxie-induzierten Zelltod steigert. Überdies konnte beobachtet werden, dass eine zelluläre p53-Suppression die Expression von Synthesis of Cytochrome c Oxidase 2 (SCO2), eines Effektors, der in der Atmungskette benötigt wird, reprimiert. Die Restoration von SCO2 in p53wt-defizient-Zellen konnte Glukoseverbrauch, Laktatproduktion und Sauerstoffverbrauch wieder normalisieren, und vermittelte zugleich eine Resistenz gegenüber Hypoxie von Rotenone, einem Inhibitor des Komplex I der Atmungskette, abhängige Weise. Dies zeigte, dass die SCO2-vermittelten Effekte von einer intakten oxidativen Phosphorylierung abhängig waren. Schließlich vermittelte eine Gensuppression von SCO2 in p53wt-Gliomzellen eine Sensibilisierung dieser Zellen gegenüber moderater Hypoxie. Es konnte auch gezeigt werden, dass p53 und HIF-1alpha miteinander kooperieren, um SCO2 unter Hypoxie zu induzieren, was suggeriert, dass i) SCO2 ein neues HIF-1alpha Zielgen sein könnte und ii) SCO2 ein neues Zielprotein darstellen könnte, um Atmung und ROS-Prävention über HIF-alpha zu modulieren. Diese Befunde deuten darauf hin, dass Gliomzellen einen Nutzen aus dem Aufrechterhalten eines p53wt-Status erzielen können, da dies ihre Vulnerabilität gegenüber moderater Tumor-Hypoxie reduzieren kann, und dass dieser Effekt SCO2-vermittelt ist. Dennoch konnte die Sensitivität von p53wt-defizient-Zellen gegenüber hochgradiger Hypoxie-induziertem Zelltod nicht über die Effekte von SCO2 erklärt werden, da diese Oxidase ihre Funktionen nur unter ausreichend oxyschen Bedingungen erfüllen kann. Um die Mechanismen aufzuklären, die p53wt-Zellen vor hochgradiger Hypoxie Schutz verleihen, wurde die Rolle von TIGAR (Tp53 Induced Glycolysis and Apoptosis Regulator), eines weiteren kürzlich charakterizierten metabolischen p53-Zielgens, untersucht. TIGAR zeigt Ähnlichkeit mit der Fruktose-Bisphosphatase-2-Domäne des bifunktionalen Enzyms 6-Phosphofrukto-2-Kinase/Fruktose-2,6-Biphosphatase 2, und reduziert die intrazellulären Konzentrationen von Fruktose-2,6-Bisphosphat (FBP-2). FBP-2 ist ein Glykolyse-Regulator, der in höheren Konzentrationen die Glykolyse hemmt und den Pentose-Phosphat-Weg (PPP) induziert, was zu einer Verringerung der intrazellulären reaktiven Sauerstoffspezies-Konzentrationen (ROS) führt. Die Überexpression von TIGAR in p53wt-Zellen verstärkte die Glykolyse-Hemmung unter normoxischen Bedingungen und erlaubte oxidative Phosphorylierung als kompensatorischen metabolischen Mechanismus. Zudem förderte TIGAR die Expression von Lon, einer Protease, die Untereinheiten der Atmungskette modulieren kann, und zugleich als Radikalfänger fungiert. Jedoch reduzierte TIGAR die Expression von SCO2. Die Restoration von TIGAR in p53wt-defizient-Zellen konnte die Sensibilität gegenüber hochgradiger Hypoxie aufheben. TIGAR reduzierte auch die ROS-Menge und verringerte die Sensitivität gegenüber oxidativen Stress. Zugleich sensibilisierte die Gensuppression von TIGAR in p53wt-Gliomzellen diese Zellen vor hochgradiger Hypoxie. Zudem korrelierte die Expression von HIF-1alpha mit der TIGAR-Expression, was eine neue Rolle von HIF-1alpha in der Regulation des Hypoxie-induzierten Zelltodes und der Protektion vor ROS vermuten ließ. Die Expression der Transketolase-Like-1 (TKTL1), eines Isoenzym der Transketolase im Pentose-Phosphat-Weg, ist in vielen Tumoren hochreguliert. Es wurde spekuliert, dass TKTL1 Zellen Schutz vor oxidativem Zellstress vermitteln kann. Zugleich ist bekannt, dass TKTL1 mit hohen phospho-Akt-Mengen in Gliomen korreliert. Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass TKTL1 ein indirektes p53-Zielgen ist, welches über TIGAR reguliert werden kann. Eine Suppression der TKTL1-Expression in TIGAR-exprimierenden Zellen konnte die über TIGAR vermittelten protektiven Effekte gegenüber endogenen ROS, oxidativem Stress und Hypoxie-induziertem Zelltod aufheben. Folglich wurde hier ein bis jetzt unbekannter Zusammenhang zwischen TIGAR, TKTL1 und HIF-1alpha entdeckt. Ebenso konnte eine TKTL1-Suppression mittels siRNA wie die TIGAR-Suppression die HIF1-alpha-Transaktivierungsfähigkeit reduzieren, was zu der Vermutung Anlass gab, dass TKTL1 HIF1-alpha unter Hypoxie reguliert.
Primäre Hirntumore des Zentralen Nervensystems (gehen aus Nervenzellen, Gliazellen, Hirnhäute (Meningen) und auch Hirngefäße aus. Das anaplastische Astrozytom, Oligodendrogliom und Oligoastrozytom (WHO-Grad III) und auch die bösartigste Form, das Glioblastoma multiforme (WHO-Grad IV) bilden den wesentlichen Anteil der astrozytären Tumoren. Bedingt durch die ungünstige Prognose für Patienten mit Glioblastomen bedarf es einer Optimierung der therapeutischen Maßnahmen. Die momentane Therapie besteht nach Konstitution des Patienten und der Lokalisation des Tumors meist aus der Operation mit angeschlossener Strahlen- und eventueller adjuvanten Chemotherapie. Die Prognose ist abhängig von verschiedenen Faktoren, wie der Ausbreitung und der Lokalisation des Tumors und hat sich in den letzten Jahren leider nur unwesentlich verbessert, da immer noch von einer medianen Überlebenszeit des Patienten zwischen 8 und 15 Monaten im Falle eines Glioblastoms ausgegangen werden kann. Die Entstehung und Progression von malignen Tumorerkrankungen sind eng mit Störungen und Defekten in Signalwegen, die das Zellüberleben und den Zelltod regulieren, verknüpft. Aberrationen, wie die Blockade von Tumorsuppressorgenen, oder die Aktivierung bzw. Überexpression von Onkogenen, führen zur veränderten Expression von Zelltod-inhibitorischen Genen wie den anti-apoptotischen Bcl-2 Familienmitgliedern, und letztendlich zu Abweichungen der normalen zellulären Homöostase. Veränderungen dieser Art bewirken, dass Tumorzellen die Fähigkeit erhalten, unkontrolliert zu proliferieren, infiltrativ zu wachsen und eine eigene Vaskularisierung zu initiieren. Tumorzellen besitzen eine erhöhte Apoptose- und Zelltodresistenz, die maßgeblich durch die stark erhöhte Expression von anti-apoptotischen Bcl-2-Proteinen gekennzeichnet ist. In der vorliegenden Arbeit stand daher die Fragestellung im Mittelpunkt, inwieweit anti-apoptotische Proteine der Bcl-2-Familie zur Resistenz von malignen Gliomzellen gegen die Apoptose und den autophagischen Zelltod beitragen und wie diese Mechanismen gezielt überwunden werden können. Die Blockade der vier Familienmitglieder der Bcl-2-Subfamilie (Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1, Bcl-w) wurde über den Einsatz von spezifischen Inhibitoren, den sogenannten BH3-Mimetika, vermittelt. BH3-Mimetika besitzen eine hohe Affinität zur Bindungstasche der Bcl-2-Proteine, wobei durch die Bindung eine Blockade des Proteins hervorgerufen wird. Die eingesetzten BH3-Mimetika haben unterschiedliche Bindungsprofile und können daher ein, zwei oder mehrere Proteine der Bcl-2-Familie inhibieren. Die verwendeten Inhibitoren BH3I-2, HA14-1 und ABT-737, die nur eine limitierte Wirkung auf den Zelltod von Gliomzellen entfalteten, sind allesamt nicht in der Lage, Mcl-1 zu blockieren. Deshalb wurde zusätzlich ein Pan-Bcl-2-Inhibitor, das (-)-Gossypol, verwendet. Dieser Inhibitor hemmt alle anti-apoptotischen Bcl-2-Familienmitglieder, und steigerte über die Inhibition und Degradation von Mcl-1 effizient den Zelltod von Gliomzellen. Dagegen zeigte die (-)-Gossypol-Behandlung in nicht transformierte Astrozytenkulturen keine zytotoxischen Effekte. Zusätzlich wurde nachgewiesen, dass durch das BH3-Mimetikum (-)-Gossypol ein autophagischer Zelltod induziert wird. Unter der Verwendung eines charakteristischen Markerproteins, dem LC3-Protein, konnte nach Induktion des nicht-apoptotischen, autophagischen Zelltodes durch (-)-Gossypol eine Translokation von GFP-LC3 in die Autophagosomen und Autolysosomen festgestellt werden. Viele Gliome weisen eine Methylierung des MGMT-Promotors auf, die es den Zellen erschwert, schnell DNA-Schäden zu reparieren. Aufgrund dieser Methylierung sind diese Tumoren sensitiv für eine Behandlung mit alkylierenden Substanzen (Temozolomid). Auf Grundlage dieser Beobachtungen wurden die kombinatorischen Effekte von BH3 Mimetika und Temozolomid in MGMT-positiven (U87) und MGMT-negativen (U343) Gliomzelllinien verglichen, wobei sich lediglich in MGMT-negativen U343-Gliomzellen signifikante, kombinierte Effekte ergaben. Dieser Zelltod war mit einer Potenzierung der Autophagie assoziiert, nicht jedoch mit einer Aktivierung von Caspasen und einer lysosomalen Dysfunktion. Die Depletion des endogenen Autophagieinhibitors mTOR bewirkte nach den Behandlungen mit (-)-Gossyol und TMZ einen zusätzlichen zytotoxischen Effekt. Im Gegensatz dazu wurde durch lentivirale RNA-Interferenz gegen die Autophagiegene ATG5 und Beclin1 eine potente Reduktion der zellulären Autophagie und des autophagischen Zelltodes erreicht. Insgesamt unterstreichen diese Daten die zentrale Rolle von Bcl-2 Proteinen für die Regulation der Autophagie und legen nahe, dass durch (-)-Gossypol und (-)-Gossypol in Kombination mit Temozlomid in Gliomzellen zytotoxische Autophagie induziert wird.
Im ersten Teil der Arbeit wurde eine genetische Disposition für Vorhofflimmern (VHF) untersucht. Der Einzelnukleotidpolymorphismus ("single nucleotide polymorphism", SNP) 38G/S befindet sich im N-Terminus der ß-Untereinheit KCNE1. Diese ß-Untereinheit konstituiert gemeinsam mit der alpha-Untereinheit KCNQ1 die langsame Komponente des verzögerten Gleichrichterstromes, IKs. Die ß-Untereinheit hat hierbei eine modulierende Funktion. Frühere Studien beschäftigten sich hauptsächlich mit der transmembranären Domäne und dem C-Terminus. Über die Rolle des N-Terminus war bislang wenig bekannt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Aufgabe des N-Terminus bei der Modulation der alpha-Untereinheit zu identifizieren. Außerdem sollte festgestellt werden, welche Aminosäuren hierbei besonders von Bedeutung sind. Zu diesem Zweck wurden diverse Konstrukte synthetisiert. Für das Konstrukt delta1-38’ wurden die Aminosäuren 1-38 und damit der Großteil des N-Terminus entfernt. Das Konstrukt "linker" enthält anstelle des Glyzins oder Serins an Position 38 fünf Alanine. In der Nähe der von dem SNP betroffenen Aminosäure befinden sich des Weiteren drei Arginine, die mit jeweils einem Alanin substituiert wurden. Für alle Versuche diente die nicht VHF-assoziierte Variante des SNPs als Kontrolle. Alle Konstrukte konnten erfolgreich heterolog exprimiert werden und gleichermaßen mit der alpha-Untereinheit immunopräzipitiert werden. Die aus der Co-Transfektion von KCNQ1 und KCNE1 resultierende Stromdichte wurde mittels "Patch-clamp"-Technik untersucht. Im Vergleich zum Kontrollstrom (KCNQ1 + KCNE1-38S) waren die Ströme aller anderen Gruppen während De- und Repolarisation signifikant kleiner. Zellfraktionierung und konfokale Mikroskopie zeigten, dass im Vergleich zur Kontrolle alle anderen Konstrukte eine verminderte Plasmamembranlokalisation aufwiesen. Die Aufgabe des N-Terminus liegt offensichtlich im Transport beider Untereinheiten an die Plasmamembran und/oder der Verankerung dort. Sowohl die Aminosäure in Position 38 als auch die drei N-terminalen Arginine in der Nähe scheinen für den hier gesuchten Mechanismus von Bedeutung zu sein. Zukünftige Experimente könnten beispielsweise 3D-Simulationen der Proteinfaltung beinhalten, um die potentielle Membranverankerung weiter zu untersuchen. Der zweite Teil der Arbeit untersuchte erworbene elektrophysiologische Veränderungen im Rahmen von VHF am Beispiel der einwärts gleichrichtenden Kaliumströme IK1 und IKACh. Es sollten die zugrunde liegenden regulatorischen Mechanismen für die Heraufregulierung von IK1 und IKACh bei VHF untersucht werden. Alle Experimente wurden an humanem Gewebe des linken Vorhofs durchgeführt. Das Gewebe stammt von VHF-Patienten, die sich einer Mitralklappen-Operation unterzogen. Als Kontrolle wurde Gewebe von Patienten im Sinusrhythmus (SR) verwendet. Zunächst wurde untersucht, ob transkriptionelle und/oder posttranskriptionelle Veränderungen oder funktionelle Effekte der Heraufregulierung der Ströme zugrunde liegen. Entsprechend wurde die Proteinexpression mittels Western Blot quantifiziert. Die Quantifizierung der mRNA erfolgte per Realtime-PCR. Veränderungen für IK1 konnten sowohl auf mRNA- als auch auf translationaler Ebene beobachtet werden. Protein- und mRNA-Expression von Kir2.1, der zugrunde liegenden Proteinuntereinheit, waren bei VHF signifikant erhöht; die Expression der inhibitorischen miR-1 war reduziert. Die Bestimmung der Protein- und mRNA-Expression der zugrunde liegenden Proteinuntereinheiten für den Strom IKACh zeigte dagegen keinen Unterschied zwischen Gewebe von Patienten mit VHF und SR. Eine funktionelle Regulierung schien daher möglich. Die Expression der IKACh modulierenden Proteine Calmodulin und G alpha i-3 unter VHF zeigte jedoch keinen signifikanten Unterschied zu der SR-Gruppe. Es war eine Tendenz zur Reduktion des inhibierenden G alpha i-3 zu beobachten. Die Regulierung von IKACh,c bei VHF bleibt in zukünftigen Arbeiten zu untersuchen. Ein möglicher Versuch wäre, therapeutisch in die Regulation der Kir-Untereinheiten einzugreifen, um das VHF-unterstützende, elektrische "Remodeling" des IK1 zu verhindern.
In dieser Arbeit wurde erstmals ein monokolonaler Antikörper gegen die GlyRbeta-Untereinheit (GlyRbeta) hergestellt. Zur Immunisierung der Mäuse wurde die 120 AS lange große cytoplasmatische Schleife (engl. loop) zwischen den transmembranen Domänen 3 und 4 von GlyRbeta gewählt, da diese nur geringe Sequenzhomologie zu GlyRalpha-Untereinheiten aufweist. Diese Schleifenregion wurde als GST-Fusionsprotein in Bakterien exprimiert und affinitätsgereinigt. Sowohl die Immunisierung der Mäuse als auch die Herstellung der Hybridoma-Klone wurde in Zusammenarbeit mit Synaptic Systems GmbH (Göttingen) durchgeführt. Die Spezifität der Antikörperbindung an GlyRbeta wurde zunächst in Western Blot-Experimenten mit affinitätsgereinigtem GlyR aus Rattenrückenmark demonstriert. Eine nachfolgende Untersuchung der Antikörperbindestelle führte zur Identifikation der ersten 20 AS des beta-loop (GlyRbeta336-355) als Epitop. Ein 20 AS kurzes, synthetisches Peptid, welches die Epitop-Sequenz enthielt, war ausreichend, um Färbungen von Western Blots und Gewebeschnitten durch den Antikörper effizient zu verhindern. Außerdem wurden Protokolle für die Antikörperfärbung von GlyRbeta in transfizierten Zelllinien und primären Neuronen aus Rattenrückenmark etabliert. Weiterhin ermöglichte die Herstellung dieses Antikörpers erstmals die direkte immunhistochemische Färbung von GlyRbeta-Protein im ZNS von Mäusen. GlyRbeta konnte hierbei im Hirnstamm, Rückenmark, dem Bulbus olfactorius und der Retina von Mäusen nachgewiesen werden, was zeigt, dass GlyRbeta-Protein weit weniger verbreitet ist als aufgrund von in situ Hybridisierungs-Studien vermutet. Die gefundene Verteilung von GlyRbeta-Protein unterscheidet sich demnach stark von der Verteilung der GlyRbeta-mRNA, was für eine posttranskriptionelle Regulation der GlyRbeta-Proteinmenge spricht. Weiterführende immunhistochemische Untersuchungen an der Retina von Mäusen zeigten, dass GlyRbeta in diesem Gewebe wie erwartet mit Gephyrin an inhibitorischen Synapsen kolokalisiert ist. In Bezug auf GlyRalpha-Untereinheiten geht man bislang davon aus, dass sie an Synapsen des adulten ZNS immer mit GlyRbeta assoziiert sind, und somit indirekt mit Gephyrin verbunden werden, wodurch das Clustering der Rezeptoren gewährleistet wird. Entgegen dieser Hypothese wurde in Doppelfärbungen von GlyRbeta und GlyRalpha-Untereinheiten gefunden, dass eine Ansammlung von GlyRalpha4-Clustern in der Retina adulter Mäuse vermutlich eine Ausnahme hierzu bildet. Für GlyRalpha4-Cluster in Stratum 3 und 4 der IPL konnte gezeigt werden, dass sie teilweise nicht mit GlyRbeta, und zu ebenso großem Teil nicht mit Gephyrin kolokalisiert sind. Dennoch scheinen diese GlyRalpha4-Untereinheiten in Clustern angereichert und zudem synaptisch lokalisiert zu sein. Der Mechanismus, durch den GlyRalpha4 in Abwesenheit dieser beiden Proteine an Synapsen immobilisiert wird, ist bislang völlig unklar. Funktionell wäre denkbar, dass derartige Rezeptorkomplexe den synaptischen Eingängen von ON-Starburst-Amakrinzellen besondere Leitungseigenschaften verleihen und somit maßgeblich an der Verarbeitung richtungsselektiver Signale in der Retina beteiligt sein könnten. In dieser Arbeit wurden außerdem Mutagenesestudien durchgeführt, um zu klären, über welchen Mechanismus die Inhibition der Proteinphosphatasen 1 und 2A (PP1 und PP2A) zum Verlust von synaptischem Gephyrin führt. Es konnte gezeigt werden, dass eine direkte Dephosphorylierung von Gephyrin durch PP1 hierfür wahrscheinlich nicht verantwortlich ist, da die Mutation etablierter Phosphorylierungsstellen von Gephyrin keinen, oder nur einen marginalen Einfluss auf dessen synaptische Lokalisation und das Clustering von GABAARs hatte. Dies spricht dafür, dass PP1/PP2A abhängige Dephosphorylierungs-/Phosphorylierungsprozesse wahrscheinlich andere Gephyrin- oder Cytoskelett-assoziierte Proteine beeinflussen, jedoch nicht direkt an Gephyrin wirken. Die Erstellung von genomweiten Expressionsprofilen ist eine effiziente Methode zur Identifikation neuer Regulationsmechanismen und potentieller Interaktionspartner von Genprodukten und wurde in dieser Arbeit auf Vorderhirnproben von WT- und Gephyrin-KO-Mäusen vergleichend angewendet. Hierbei wurde gefunden, dass die Transkription bekannter Gephyrin-Interaktionspartner durch den Verlust des Gephyrin-Gens nicht messbar verändert wird. Weil die ermittelten Unterschiede in Transkriptmengen generell sehr gering waren, ist zu vermuten, dass Gephyrin keine wesentlichen genregulatorischen Funktionen im Mausgehirn ausübt. Andererseits ergab die Expressionchip-Analyse Hinweise auf neue Genprodukte, für die in WT- und Gephyrin-KO-Mäusen signifikant verschiedene Transkriptionsmengen gefunden wurden. Die Validierung dieser Daten mit anderen Methoden steht jedoch noch aus.
Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen führten zu folgenden Ergebnissen: 1. Eindimensionale Gelelektrophoresen Die Analyse mitochondrialer Proteine aus juvenilen und seneszenten P. anserina-Wildstämmen mit Hilfe von eindimensionalen SDS- und eindimensionalen Blau-Nativen-Gelelektrophoresen zeigt keine deutlichen, seneszenzspezifischen Unterschiede. Im Gegensatz dazu werden in initialen Versuchen der nicht-radioaktiven 2D-PAGE differentiell gebildete Proteine visualisiert. 2. 2D-PAGE mit radioaktiv-markierten, mitochondrialen Proteinen aus jungen und alten P. anserina-Wildstämmen In der ungerichteten Proteomanalyse wurden 29 differentiell-gebildete Proteine identifiziert und zusätzlich zahlreiche Isoformen einiger Proteine gezeigt. Von der ß-ATPase wurden modifizierte Isoformen gefunden. Außerdem wurde eine seneszenspezifisch verringerte Bildung von ROS-Abwehr-Proteinen in den Mitochondrien detektiert. Im Gegensatz dazu wurde eine größere Menge eines Chaperons gefunden, das bei der Proteinsynthese eine Rolle spielt: eine Protein-Disulfid-Isomerase, die die Umlagerung und Neubildung von Di-Sulfid-Brücken bei der Faltung von Proteinen katalysiert. Zusätzlich wurde eine erhöhte Menge des Proteins SSC1 identifiziert. Dieses gehört zur Hsp70-Hitzeschock-Proteinfamilie. Es wurde ebenfalls eine erhöhte Menge des Apoptosefaktors Cyclophilin D in den mitochondrialen Proben aus den seneszenten Wildstämmen identifiziert. Die Identifizierung dieses Proteins in Mitochondrien von P. anserina stellt neben der Charakterisierung der Metacaspasen (Hamann et al., 2007) einen weiteren Ansatzpunkt für die Apoptoseforschung in P. anserina dar. Die molekularbiologische Analyse dieses Proteins wurde aufgrund dieser Proteomanalyse im Arbeitskreis aufgenommen (Dissertation D. Brust). Ein weiteres Protein, das in stark erhöhter Menge in den Proteinisolaten identifiziert wurde, ist PaMTH1. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die Struktur und die Funktion dieser neu identifizierten differentiell-gebildeten Methyltransferase während der Alterung in P. anserina mit Hilfe molekularbiologischer, biochemischer und physiologischen Analysen untersucht. 3. Charakterisierung von PaMTH1 Im Rahmen von Northernblot-Analysen wurde gezeigt, dass die PaMth1-Transkriptmenge in drei unabhängigen alten Wildstämmen im Vergleich zu den entsprechenden jungen Wildtsämmen deutlich erhöht ist. In einer Westernblot-Analyse von Gesamtproteinen und Mitochondrien aus jungen und seneszenten Wildstämmen wird der seneszenzspezifische Anstieg der Proteinmenge verifiziert. Die genauere Einordnung von PaMTH1 in die Klasse I der Methyltransferasen und die Ergebnisse der Analyse der Substratspezifizität geben einen Hinweis auf eine Schutzfunktion durch die Verhinderung einer ROS-Entstehung unter der Beteiligung von Substanzen mit einer Catecholgruppe. Die Ergebnisse der Analyse der Modulation der PaMth1-Expression in P. anserina deuten ebenfalls auf eine Schutzwirkung von PaMTH1 hin: PaMth1-Überexpressionsstämme zeigen eine verbesserte Wuchsrate auf stress-induzierenden Medien, weniger carbonylierte Proteine und vor allem eine verlängerte Lebensspanne ohne physiologische Nachteile im Vergleich zum Wildstamm. Dagegen lebt die PaMth1-Deletionsmutante kürzer und wächst schlechter auf ROS-induzierenden Medien, sie zeigt allerdings keine erhöhte Menge von carbonylierten Proteinen im eindimensionalen „Oxyblot“. Die beobachtete Lebensspannenverkürzung der PaMth1-Deletionsmutante wird jedoch durch die Reversion dieser Stämme wieder aufgehoben, sodass die Hypothese des Schutzes vor der ROS-Generierung durch die Methylierung von Dihydroxylgruppen anhand der erhaltenen Daten unterstützt wird.
Durch die Behandlung HIV-positiver Patienten mit einer Kombinationstherapie verschiedener antiviraler Substanzen (HAART = hochaktive antiretrovirale Therapie) kann die Virusreplikation über einen längeren Zeitraum unterdrückt werden. Allerdings hat diese Therapie Limitationen. Die Medikamente verursachen hohe Therapiekosten, haben zum Teil starke Nebenwirkungen und es entstehen mit der Zeit resistente Viren. Eine Alternative besteht in der somatischen Gentherapie der HIV-Infektion. Bei diesen Ansätzen werden Zellen der Patienten genetisch modifiziert, so dass sie ein antivirales Genprodukt exprimieren. In der vorliegenden Arbeit wurde ein membrangebundenes, antivirales C46 Peptid (maC46) sowohl in vitro in Zelllinien und primären humanen T-Zellen als auch in vivo in zwei humanisierten Mausmodellen getestet. Das C46 Peptid entstammt der C-terminalen "heptad repeat" Sequenz des HIV Hüllproteins gp41. C-Peptide wie C46 oder auch T20, welches bereits für die HAART Therapie zugelassen ist, binden während der Fusion des Virus mit der Zielzelle an gp41 und inhibieren so die Fusion. Werden T-Zelllinien oder primäre humane T-Zellen mit einem gammaretroviralen Vektor, der maC46 codiert, transduziert, können sie sehr effizient vor einer Infektion mit HIV geschützt werden [30]. Dieser Vektor wurde bereits in einer klinischen Studie mit T-Zellen von 10 HIV-positiven Patienten getestet [142]. Dabei konnte allerdings kein antiviraler Effekt der Gentherapie beobachtet werden. Hier wurde nun ein lentiviraler Vektor für maC46 (LV-maC46-GFP) verwendet. Lentivirale Vektoren transduzieren im Gegensatz zu gammaretroviralen auch ruhende Zellen, was ein kürzeres ex vivo Aktivierungs- und Transduktionsprotokoll ermöglicht. Außerdem ist für lentivirale Vektoren das Risiko der Transformation der Zelle niedriger als für gammaretrovirale. Für eine mögliche klinische Anwendung sollte es daher tolerierbar sein, für lentivirale Vektoren eine höhere MOI zu verwenden als für gammaretrovirale. Eine höhere Transduktionseffizienz sollte auf der anderen Seite auch eine effektive und langanhaltende Transgenexpression ermöglichen. Zunächst wurde gezeigt, dass sowohl die T-Zelllinie PM-1 als auch primäre humane T-Zellen nach Transduktion mit LV-maC46-GFP vor einer Infektion mit HIV geschützt waren und während der Infektion einer gemischten Kultur einen Selektionsvorteil gegenüber nicht-transduzierten Zellen hatten. Dabei konnte auch durch konfokale Mikroskopie gezeigt werden, dass das Virus die maC46-exprimierenden Zellen nicht injizieren konnte, sondern lediglich auf der Zelloberfläche gebunden wurde. Im Weiteren wurden zwei humanisierte Mausmodelle etabliert, um LV-maC46-GFP in vivo zu testen. Im humanen Immunsystem Mausmodell (HIS-Mausmodell) wurden immundefiziente Mäuse mit humanen Blutstammzellen repopuliert. In den Tieren kam es zu einer de novo Bildung von humanen, reifen T-Lymphozyten durch Thymopoese. Dabei wurden im Blut der Tiere humane, maC46- exprimierende CD4+ T-Zellen detektiert. Nach Infektion der Tiere mit HIV wurden diese T-Zellen depletiert. Es kam allerdings nicht zu einer Anreicherung oder einem selektiven Überleben der genmodifizierten T-Zellen. Eine Erklärung dafür könnte eine gestörte T-Zellhomeostase in den Tieren sein. Das zweite humanisierte Mausmodell (T-Zellmausmodell) verwendete immundefiziente Mäuse, die mit transduzierten humanen T-Zellen repopuliert wurden. Die Infektion mit HIV erfolgte entweder in vitro vor Transplantation der Zellen oder in vivo nach Repopulierung der Tiere. In beiden Fällen konnte ein selektives Überleben maC46-exprimierender CD4+ T-Zellen nach HIV-Infektion beobachtet werden. Im letzten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Weiterentwicklung von maC46, eine sekretierte Variante des C46-Peptids (iSAVE), im T-Zellmausmodell getestet. Ein sekretierter Fusionsinhibitor stellt insofern eine Weiterentwicklung des membrangebundenen dar, als nicht nur die genmodifizierten Zellen, sondern zusätzlich auch nicht-modifizierte Nachbarzellen vor einer Infektion mit HIV geschützt werden könnten. Dadurch erhöht sich auch das Spektrum an möglichen Produzentenzellen für den Fusionsinhibitor. In den hier beschriebenen Experimenten wurden humane T-Zellen entweder mit einem gammaretroviralen (RV-iSAVE) oder einem lentiviralen Vektor (LV-iSAVE) transduziert und die Experssion das iSAVE-Peptids wurde im Serum der Tiere gemessen. In beiden Ansätzen konnte iSAVE Peptid im Serum der Tiere detektiert werden. In weiteren Experimenten sollte nun untersucht werden, ob dieses in vivo sekretierte iSAVE Peptid antiviral aktiv ist und die humanisierten Mäuse vor einer Infektion mit HIV schützen kann.
Streptomyces coelicolor ist der Modellorganismus der GC reichen, Gram+ Actinomyceten, die mehr als zwei Drittel aller bekannten Antibiotika produzieren. Phänotypisch zeichnet er sich durch die Bildung eines Substrat- und eines Luftmyzels aus, welches im Laufe der weiteren Differenzierung Sporen bildet. Streptomyceten produzieren neben Antibiotika noch eine Vielzahl biotechnologisch interessanter Metaboliten. Der komplexe Lebenszyklus und Stoffwechsel erfordern eine genaue Regulation der Genexpression. Die letzten Jahre haben gezeigt, dass neben Proteinen auch die RNA eine regulatorische Funktion hat. Verschiedene regulatorisch aktive RNA Elemente wie Riboswitche, RNA-Thermometer und kleine nicht kodierende RNAs (small noncoding RNAs – sRNAs) wurden identifiziert. sRNAs wirken meist als antisense Riboregulatoren, indem sie ihre Ziel-mRNA binden und dadurch die Translation hemmen oder fördern. In dieser Arbeit wurden verschiedene bioinformatische Methoden verwendet, um sRNAs im Genom von S. coelicolor vorherzusagen. Es wurden Terminatorstrukturen und konservierte Sekundärstrukturen in den intergenen Regionen vorhergesagt, die keinem Gen zuzuordnen waren. In einem weiteren Ansatz wurden Bindestellen des Regulatorproteins DasR vorhergesagt, um DasR kontrollierte sRNAs zu identifizieren. Zusätzlich wurde mittels 454 Sequenzierung erstmalig das Transkriptom von S. coeliocolor analysiert. Auf diese Weise konnten etwa 500 sRNAs vorhergesagt werden. Eine der beiden charakterisierten sRNAs, sc32, ist 139 nt lang. Ihr Promoter liegt im kodierenden Bereich des Gens bldC und sie wird spezifisch durch Kälteschock induziert. Die zweite charakterisierte sRNA, sc1, ist 159 nt lang und in allen sequenzierten Streptomyceten konserviert. Ihre Expression wird nur bei Stickstoffmangel in der Stationärphase reprimiert. Durch molekularbiologische Analysen konnte ein Zielgen von sc1 identifiziert werden, die extrazelluläre Agarase DagA. Es konnte gezeigt werden, dass sc1 an die dagA-mRNA bindet und dadurch die Translation inhibiert. Als zweites mögliches Ziel von sc1 konnte die Histidinkinase SCO5239 identifiziert werden. Hier wurde gezeigt, dass Koexpression von sc1 die Expression einer SCO5239 Reportergenfusion um den Faktor acht steigert. Durch Analyse des Proteoms von sc1 Mutanten, konnte die differenzierte Expression von elf weiteren Proteinen gezeigt werden. Sc1 scheint als Regulator zu agieren, indem es auf die Stickstoffversorgung der Zelle reagiert und den Sekundärmetabolismus deaktiviert.
Echoortende Fledermäuse verfügen über ein hochauflösendes Gehör. Sie können anhand einer geringen Zeitverzögerung zwischen ausgesendetem Echoortungsruf und dem Echo die Entfernung von Objekten bestimmen. Je nach Spezies und deren spezifischer Ortungsstrategie gibt es unterschiedliche Typen von Ortungslauten. Die meisten Fledermäuse verwenden frequenzmodulierte (FM) Ortungssignale und zählen zu den FM-Fledermäusen. CF-FM-Fledermäuse verwenden dagegen zusätzlich zu FM-Komponenten konstantfrequente Signalelemente (CF-FM). Diese sind besonders zur Detektion flügelschlagender Beuteinsekten in dichter Vegetation von Vorteil. Im auditorischen Kortex (AC) von Fledermäusen existieren so genannte FM-FM-Neurone, die auf die Auswertung der Verzögerungszeiten zwischen Rufaussendung (FM-Ruf) und Echo (FM-Echo) spezialisiert sind. Eine Besonderheit von FM-FM-Neuronen ist, dass sie bei CF-FM-Fledermäusen systematisch, entsprechend ihrer bevorzugten Echoverzögerungen, im AC angeordnet sind. Somit sind die FM-FM-Neurone chronotop entlang einer rostro-kaudalen Achse organisiert. Solche FM-FM-Neurone wurden bislang auch in FM-Fledermäusen nachgewiesen, jedoch waren sie nicht chronotop organisiert. Ein Ziel dieser Promotionsarbeit war es, FM-FM-Neurone bei der FM-Fledermaus Carollia perspicillata hinsichtlich ihrer Eigenschaften und ihrer räumlichen Anordnung im AC zu untersuchen. Die Befunde der vorliegenden Studie an C. perspicillata zeigen, dass alle untersuchten Neurone im dorsalen AC sowohl auf hochfrequente Reintöne als auch auf FM-FM-Stimulation reagierten. Die Echoverzögerungen, auf welche die Neurone im Areal reagierten, lagen zwischen 1 und 32 ms, was einer Distanz zwischen Fledermaus und Objekt von 16 cm bis 5,3 m entspricht. Überraschenderweise waren die kortikalen FM-FM-Neurone bei C. perspicillata chronotop organisiert, ähnlich wie bei insektenfressenden CF-FM-Fledermäusen. Warum eine chronotope Anordnung von FM-FM-Neuronen im AC bei CF-FM-Fledermäusen von Nutzen sein kann, ist nicht geklärt. Bislang wurde vermutet, dass eine systematische Anordnung die Zeitverarbeitungsprozesse optimiert und vor allem beim Insektenjagen in dichter Vegetation vorteilhaft sein könnte. Der vorliegende Befund ist außergewöhnlich, da er zeigt, dass auch bei der überwiegend frugivoren Fledermaus C. perspicillata FM-FM-Neurone chronotop angeordnet sind, und damit verdeutlicht, dass der funktionelle Rückschluss hinsichtlich des Beutefangs neu diskutiert werden muss. Neben der Charakterisierung von FM-FM-Neuronen bei adulten C. perspicillata war Ziel der vorliegenden Arbeit, die postnatale Entwicklung des AC im Hinblick auf die Frequenzrepräsentation zu untersuchen. Während der Entwicklung von C. perspicillata wurden drei wichtige Veränderungen festgestellt: (1) Das Audiogramm zeigt, dass der Hörbereich von Neugeborenen charakteristische Frequenzen (CF) zwischen 15 und 80 kHz aufweist. Dieser Frequenzbereich entspricht etwa 72% des Hörbereichs von Adulten. Während der ersten vier postnatalen Entwicklungswochen findet eine Frequenzverschiebung um etwa 0,4 Oktaven hin zu höheren Frequenzen statt. Insgesamt erhöhen sich die CF der Neurone im dorsalen AC von Neugeborenen bis hin zu Adulten um 30 kHz. (2) Die Sensitivität der hochfrequenten Neurone nimmt während der ersten postnatalen Woche um 15 dB zu und bleibt ab dieser Entwicklungsphase relativ konstant. (3) Die Sensitivität der tieffrequenten Neurone im ventralen AC nimmt im Laufe der Entwicklung um etwa 30 dB zu. Die CF der tieffrequenten Neurone sinken unerwartet während der postnatalen Entwicklung von Juvenilen zu Adulten um etwa 10 kHz. Diese Ergebnisse könnten auf eine bidirektionale Ausreifung der Cochlea hinweisen. Eine dritte ontogenetische Teilstudie der vorliegenden Arbeit befasste sich erstmalig mit den FM-FM-Neuronen und deren Organisation während der postnatalen Entwicklung. Die Befunde zeigen, dass während der Ontogenese drei wichtige Modifikationen auftreten: (1) Bereits bei Neugeborenen liegt der Anteil an FM-FM-Neuronen bei 21% im Vergleich zur Aktivität auf Reintöne. Dieser Anteil nimmt in der ersten Entwicklungswoche auf 56% zu und steigt einhergehend mit der beginnenden Flugtüchtigkeit der Tiere in der dritten Entwicklungswoche abrupt auf 84%. (2) Bei Neugeborenen werden im Vergleich zu älteren Entwicklungsphasen ausschließlich Entfernungen zwischen Fledermaus und Objekt von 50 cm bis 2,5 m auf neuronaler Ebene mittels FM-FM-Neurone codiert. Bereits nach der ersten postnatalen Woche sind die CD ähnlich verteilt wie bei adulten Tieren. Die Sensitivität an den CD nimmt während der Entwicklung vom Neugeborenen zum Adulten um etwa 20 dB zu. (3) Bereits bei Neugeborenen sind die FM-FM-Neurone im dorsalen AC chronotop angeordnet und über alle Altersgruppen hinweg bleibt die Chronotopie bestehen. Die Befunde der vorliegenden Studie zeigen erstmalig, dass die kortikalen Zeitverarbeitungsareale und die Chronotopie pränatal angelegt werden.
Das Neuroblastom ist ein Tumor, der sich von sympathoadrenergen Vorläuferzellen ableitet und die häufigste solide Krebsform im Kindesalter darstellt. Das breite klinische Spektrum dieses Tumors, das von spontaner Regression zu fataler Progression reicht, spiegelt die außerordentliche biologische und genetische Heterogenität dieses Tumors wider. Polyploidie und Genexpressionsanalysen werden auf klinischer Seite zur Risiko- und Therapieeinschätzung eingesetzt. Genomweite Screeninganalysen identifizierten den Transkriptionsfaktor Phox2b als erstes Prädispositionsgen für NB. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass Phox2b absolut essentiell für die Entstehung aller Ganglien des autonomen NS aus Neuralleistenzellen ist. Ziel der Untersuchungen dieser Arbeit war es, die Auswirkungen der NB-assoziierten Phox2b-Mutationen auf Proliferations- und Differenzierungsverhalten sympathoadrenerger Vorläuferzellen zu untersuchen. Hierzu wurden paravertebrale, sympathische Grenzstränge aus Huhnembryonen des Embryonaltags 7 präpariert, dissoziiert und mit Expressionsplasmiden für Phox2bwt und NB-Phox2b-Mutationen transfiziert. Nach zwei Tagen in Kultur wurden mit molekularbiologische Methoden Veränderungen des Proliferations-und Differenzierungsverhalten untersucht. Die Analyse des Proliferationsverhaltens transfizierter Neurone mit BrdU-Proliferationsassays und Phospho-Histon-3-Antikörpern offenbarte einen stark antiproliferativen Effekt des Phox2bwt-Proteins, den die untersuchten NB-Phox2b-Mutationen nicht aufwiesen. NB-Phox2b-Patienten sind heterozygot, d.h. Träger eines gesunden und eines mutierten Phox2b-Allels. Um die genetische Situation im NB-Patienten nachzuahmen, wurde mit spezifischen siRNAs das endogene Phox2b-Protein-Niveau herunter reguliert. NB-Phox2b-Mutationen mit mis- oder nonsense Mutation in der Homöodomäne zeigten unter Phox2b-Knockdown-Bedingungen einen proliferationsstimulierenden Effekt. Diese Experimente warfen die Frage auf, über welche Mechanismen Phox2b und NB-Phox2b-Mutationen Einfluss auf die Zellzykluskontrolle nehmen. Die quantitative Analyse der Expression bekannter Zellzyklusregulatoren wie Zyklin D1, D2 und D3 und der Zyklin-abhängigen Kinase-Inhibitoren p18, p21 und p57kip2 verlief ergebnislos. Die Überexpression des Zyklin-abhängigen Kinase-Inhibitors p27kip1 wirkte antiproliferativ auf Kulturen sympathoadrenerger Vorläuferzellen und das p27kip1-Epxressionsniveau korrelierte mit dem Phox2b-Proteinniveau. P27kip1 scheidet jedoch als alleiniger Vermittler des antiproliferativen Effekts von Phox2b aus, da die ebenfalls antiproliferativ wirkende Phox2-Homöodomäne keinen Einfluss auf das p27kip1-Expressionsniveau besitzt. Vielmehr wurde der bHLH-Transkriptionsfaktor Hand2 als Mediator der Proliferationseffekte von Phox2b identifiziert. Die Proliferation sympathoadrenerger Vorläuferzellen ist abhängig von der Hand2-Proteinmenge, und Hand2-Überexpression ist ausreichend, den antiproliferativen Effekt von Phox2b aufzuheben. Damit im Einklang geht der proliferationsstimulierende Effekt der Phox2bHDmut bei siRNA-vermitteltem Hand2-Knockdown verloren. Weiterhin führt Phox2b-Überexpression zu verringertem Hand2-Expressionsniveau und Phox2b-Knockdown zu vermehrter Hand2-Transkription. In Protein-Protein-Interaktionsexperimenten konnte eine direkte Bindung von Hand2 an Phox2bwt und die untersuchten NB-Phox2b-Mutanten nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass Hand2 in der Vermittlung der Phox2b-Proliferationseffekte auf transkriptioneller und posttranskriptioneller Ebene involviert ist. Der Wirkungsmechanismus dieser Phox2b-Varianten / Hand2-Komplexe konnte nicht endgültig geklärt werden und wird in Form verschiedener Modelle diskutiert. In NB-Patienten korreliert ein hohes Expressionsniveau von Differenzierungsmarkern mit mildem Krankheitsverlauf. Die Rolle von Phox2b als Schlüsselgen in der Entstehung und Differenzierung autonomer Neurone und die genetische Heterogenität des NB legen eine Funktion von NB-Phox2b-Mutationen auf den Differenzierungsstatus sympathoadrenerger Vorläuferzellen nahe. In quantitativen Analysen wurde die Expression von Phox2b-Zielgenen und in NB-Diagnostik involvierten Genen untersucht. Phox2bK155X, eine C-terminal trunkierte NB-Phox2b-Mutation, wirkte dominant-negativ auf die Expression der noradrenergen Markergene Th und Dbh, Tlx3 und die Neurotrophinrezeptoren trkA und p75, deren reduzierte Expression mit schlechter Prognose und damit aggressiven NB-Formen korreliert ist. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, das NB-Phox2b-Mutationen in sympathoadrenergen Vorläuferzellen, den potentiellen Tumorentstehungszellen des NB, proliferationsstimulierend wirken und zumindest die C-terminal trunkierte Phox2bK155X-Mutation zur Dedifferenzierung dieser Zellen führt. Hereditäre Mutationen in Phox2b könnten im Patienten nicht nur die terminale Differenzierung sympathischer Neurone stören, sondern auch durch eine verlängerte Phase der Neurogenese die Empfänglichkeit für weitere Tumor-initiierende Mutation erhöhen.
Mesenchymale Stammzellen (MSC) rücken in der regenerativen Medizin und im Tissue Engineering immer mehr in den Vordergrund. Im Gegensatz zu embryonalen Stammzellen bergen sie keine ethischen Probleme und sind leicht zu isolieren. Die ursprünglich aus Knochenmark gewonnenen MSC können inzwischen aus vielen verschiedenen Quellen wie Nabelschnurblut [Kern et al. 2006], Dentalgewebe [Huang et al., 2009], Plazenta [Huang et al., 2009], Haut [Salvolini et al., 2009] und aus Fettgewebe isoliert werden [Zuk et al., 2001]. Der Immunphänotyp variiert zwischen den aus verschiedenen Quellen gewonnenen MSC nur gering. Die Gewinnung aus Fettgewebe hat den Vorteil, dass eine minimal invasive Prozedur und eine hohe Ausbeute zusammenkommen. Die Stammzellen aus Fettgewebe (ASC) können in der Therapie eingesetzt werden und zu der Regeneration von Geweben nach Verletzungen beitragen [Wong et al., 2008; Poulsom et al., 2001]. Der genaue Mechanismus mit dem die Stammzellen wirken ist allerdings noch nicht geklärt. Sowohl die Integration der MSCs in das Gewebe als auch ein rein parakriner Einfluss wurden nachgewiesen. Klar ist nur, dass ein positiver Effekt von einer Therapie mit MSC ausgeht [Mizuno et al., 2009]. In vivo sind Zellen verschiedenen Einflüssen ausgesetzt, die den Zustand einer Zelle bestimmen. Lösliche Faktoren wie Wachstumsfaktoren, Hormone oder Vitamine wirken dabei ebenso wie die extrazelluläre Matrix und Zell-Zell-Kontakte auf die Zelle ein, die mit Wachstum, Zellform, Differenzierung oder Ähnlichem antwortet. In meiner Arbeit wurden daher drei unterschiedliche Ansätze für die in vitro Differenzierung von ASC in epitheliale Tubuluszellen untersucht: (1) die Wirkung von löslichen Faktoren, die dem Medium zugesetzt wurden, (2) der Einfluss der extrazellulären Matrix aus zum einen Tubuluszellen und zum anderen Matrigel und (3) die Co-Kultur, bei der auch direkter Zell-Zell-Kontakt untersucht wurde. Damit, und mit einer Kombination der einzelnen Bereiche, sollte das natürliche Umfeld der Tubuluszellen simuliert werden und epitheliale Differenzierung initiieren. Die Zugabe von ATRA, ActA und BMP-7 führte zu einer Differenzierung in die epitheliale Richtung, während die extrazelluläre Matrix aus Tubuluszellen nicht dafür ausreichte. Matrigel hingegen, konnte besonders in der Verbindung mit konditioniertem Medium eine Differenzierung induzieren. Die indirekte Co-Kultur über Membraneinsätze, über die u. a. der parakrine Einfluss der Tubuluszellen untersucht werden sollte, führte zu morphologischen Veränderungen der ASC, die aber nicht mit den hier verwendeten epithelialen Markern nachgewiesen werden konnte. Der direkte Zell-Zell-Kontakt zeigte eine Reduktion des Oberflächen Markers CD90 verbunden mit einer Erhöhung der Expression von CK18. Die Differenzierung von ASC in epitheliale Zellen ist also auf drei verschiedenen Wegen möglich. Zwischen verschiedenen Isolationen von ASC traten hohe Schwankungen bezüglich der Expression von Oberflächenmarkern und Proliferation auf, was auch einen Einfluss auf die Differenzierung haben könnte. Ein Grund dafür könnte die Heterogenität von ASC sein. Zur Reduzierung dieser wurden daher ein Waschschritt eine Stunde nach Kulturbeginn und eine immunomagnetische Isolation mit CD49a, CD90, CD105 oder CD271 durchgeführt. Die immunomagnetische Aufreinigung führte nur zu einer leichten Verbesserung der Heterogenität, aber zu einer sehr geringen Zellausbeute. Für den Waschschritt konnte gezeigt werden, dass die Expression der Stammzellmarker Nestin, oct4 und sall1 signifikant erhöht und Desmin und smA Expression reduziert wurden, was auf eine Reduktion der Heterogenität hindeutete. Der zusätzliche Waschschritt kann also schnell und unkompliziert die Heterogenität der ASC reduzieren. Die Differenzierung von ASC in epitheliale Tubuluszellen durch den Einfluss von Zell-Zell-Kontakten zeigt vielversprechende Ansätze und sollte weiter verfolgt werden. Eine verlängerte Kulturdauer sollte dabei angestrebt werden, da auch die adipogene Differenzierung zumeist erst nach 14 bis 21 Tagen nachweisbar war. Dafür müsste die Markierung mit CellTracker länger nachweisbar sein. Eine Inhibierung der Proliferation könnte die Grundlage dazu liefern. Um den Stand der Differenzierung in die epitheliale Richtung nachzuweisen, könnten andere epitheliale Marker, Ionenkanäle, die erst spät in den Tubuluszellen angelegt werden, und funktionelle Mechanismen untersucht werden. Das Zusammenspiel der verschiedenen Einflüsse auf die Zelle könnte ebenfalls noch genauer untersucht werden. Für die Regenerative Medizin ist es aus Gründen der GMP sinnvoller, die Zellen nur mit dem Zusatz an löslichen Faktoren zu differenzieren. Der Ansatz mit ATRA, ActA und BMP-7 scheint sehr vielversprechend zu sein und könnte in dieser Hinsicht weiter ausgebaut werden.
Im adulten Säugerhirn findet Neurogenese in der SVZ der Seitenventrikel kontinuierlich statt. Eine Vielzahl von Signalsystemen steuert in komplexer Weise zelluläre Antworten und reguliert die Proliferation, Differenzierug und Wanderung NSZ. Gegenwärtig ist nur wenig über die zugrundeliegenden Signalwege bekannt. Zunehmend gibt es Hinweise darauf, dass Nukleotide an diesen Prozessen beteiligt sind. Frühere Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe zeigten, das die Nukleotide ADPbetaS und UTP in kultivierten NSZ der adulten SVZ einen schnellen Kalziumeinstrom induzieren und die Wachstumsfaktor-vermittelte NSZ-Proliferation steigern. In der vorliegenden Arbeit wurde ein System zur Kultivierung adhärenter adulter NSZ etabliert. Die Untersuchungen zeigen, dass adulte NSZ eine Vielzahl an P2Y- und P2X-Rezeptoren, sowie die Nukleotid-hydrolysierenden Enzyme NTPDase2 und TNAP exprimieren. Untersuchungen der ADPbetaS-, UTP- und EGF-vermittelten Signalwege zeigen, dass alle drei Agonisten eine ERK1/2- und CREB-Phosphorylierung induzieren, wobei sich die zeitlichen Charakteristika zwischen den Nukleotiden und EGF unterscheiden. Inhibierungsexperimente geben Einblicke in die dabei aktivierten Signalkaskaden und weisen auf eine ADPbetaS-induzierte Transaktivierung des EGF-Rezeptors hin. Während UTP über den P2Y2-Rezeptor wirkt, übt ADPbetaS seine Funktion über den P2Y1- und P2Y13-Rezeptor aus. Die Daten implizieren zudem, dass Nukleotide und EGF gleiche Zielproteine über verschiedene Signalwege induzieren und dass sie das Potenzial besitzen, bei der Kontrolle der Zellproliferation in der adulten Neurogenese synergistisch zu agieren. Vergleichende Analysen mit kultivierten NSZ aus Wildtyp-, P2Y1- und P2Y2-Rezeptor-Knockout-Mäusen belegen ein verändertes Antwortverhalten in Gegenwart von ADPbetaS, UTP und EGF und lassen kompensatorische Mechanismen vermuten. Die Resultate dieser Arbeit demonstrieren zudem, dass ATP, ADPbetaS, UTP und EGF die Migration von NSZ induzieren. Parallel dazu konnten Veränderungen des Aktinzytoskelletes, wie die Zunahme an F-Aktin, die Bildung von Stressfasern und eine Veränderung der Zellmorphologie gezeigt werden. Diese Prozesse gehen mit einer Aktivierung der Proteinkinasen Akt und FAK einher. Die Daten weisen darauf hin, dass Nukleotide und EGF für die Zytoarchitektur der SVZ und die Wanderung von Neuroblasten zum OB eine wichtige Rollen spielen könnten.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Funktion ausgewählter Gene näher charakterisiert und ihr globaler Einfluß auf die Regulation der Genexpression untersucht. Im Fokus der Untersuchungen stand ein Gen, welches im Rahmen der Promotion von Alexander Zaigler in der Arbeitsgruppe Soppa (Universität Frankfurt) zunächst als Transkriptionsregulator ähnlich zu rspA aus E. coli identifiziert wurde. Zu Beginn dieser Arbeit konnte durch in silico Analysen das entsprechende Genprodukt zur Enolase Superfamilie (COG1441) zugeordnet werden. Mit Hilfe der „pop-in/pop-out“ Methode wurde das Gen in H. volcanii in frame deletiert und durch Wachstumsversuche, Northern- sowie Westernblot Analysen näher charakterisiert. Bei der Untersuchung des Wachstums konnte ein bemerkenswerter Phänotyp entdeckt werden: nur der Wechsel der Nährstoffquelle von reichhaltigen zu armen Bedingungen resultierte in einer dreitägigen Lagphase. Darüber hinaus wurde die Genexpression im Laufe eines Wachstumzyklus mittels Northern- und Westernblot Analysen bestimmt. Während das Transkript in reichhaltigem Medium nur transient expremiert wurde, wurde es in nährstoffarmen Bedingungen in allen Wachstumsphasen sehr stark induziert. Durch die Ergebnisse konnte zudem eine translationale Regulation der Genexpression nachgewiesen werden. Die Resultate offenbarten eine wichtige Funktion bei der Transition von reichem zu ärmerem Nährstoffangebot und führten schließlich zur Genbezeichnung iftA („important for transition A“). Desweiteren wurden Transkriptomuntersuchungen der Deletionsmutante im Vergleich zum Wildtyp zum Zeitpunkt der höchsten transienten Expression von iftA durchgeführt. Dadurch konnte gezeigt werden, dass iftA etwa 1% aller Gene des Genoms beeinflußt und gleichzeitig die Zahl differentieller Funktionen dieser Gene sehr gering ist. Die Ergebnisse führten insgesamt zu der Annahme, dass iftA eine Doppelfunktion besitzt, sowohl als enzymatisches Protein im Energiestoffwechsel als auch als essentieller Regulator mit noch unbekannter Funktion. Neben iftA fiel das Augenmerk auf mehrere Gene, die im Rahmen der Promotion von Neta Altman-Price an der Universität in Tel-Aviv als Histon-Acetylasen und –Deacetylasen identifiziert wurden. Zudem konnte in H. volcanii ein essentielles Gen, welches für ein Histon kodiert, entdeckt werden. Das Histon besitzt konservierte Lysinreste, die im eukaryotischen Histon H3 Ziele für eine posttranslationale Acetylierung sind. Für die weiteren Untersuchungen wurden die Lysinreste irreversibel zum einen in Glutamin (acetylierter Zustand) und zum anderen in Arginin (deacetylierter Zustand) mutiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Funktionen und die Einflüsse der beiden Histonmutanten sowie einer Acetylase- (delta pat1) und einer Deacetylase-Deletionsmutante (delta sir2) auf die globale Genregulation analysiert. Dazu wurden zunächst Transkriptomuntersuchungen in der exponentiellen Wachstumsphase mittels Microarray Analysen an den Mutanten im Vergleich zum Wildytp durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten einen erheblich stärkeren Einfluß auf die Regulation der Genexpression durch das acetylierte Histon sowie der Deacetylase-Deletionsmutante im Vergleich zu den Ergebnissen des deacetylierten Histons und der Acetylase-Deletionsmutante. In der exponentiellen Wachstumsphase liegt das Histon in H. volcanii daher in überwiegend deacetylierter Form vor. Durch die Analysen konnte auch demonstrieren werden, dass Sir2 und das Histon eine regulatorische Wirkung auf exakt die gleichen Gene ausüben und daher unmittelbar miteinander in Verbindung stehen. Die experimentelle Bestätigung dieses Zusammenhangs stellt im Reich der Archaea bisher ein absolutes Novum dar. Die Untersuchungen des Transkriptoms der delta sir2 Mutante enthüllte zudem einen positiven Einfluß von Sir2 auf ein größeres Gencluster (HVO_1201-25). Die Gene dieses Clusters konnten durch in silico Analysen der Chemotaxis und der Flagellenbiosynthese zugeordnet werden. Für die weitere Charakterisierung der Deletionsmutante wurden daher Untersuchungen zur Bestimmung der Motilität von H. volcanii durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass die Deletion von Sir2 die Beweglichkeit und gerichtete Fortbewegung von H. volcanii in erheblichem Maße beeinflußte, während die Biosynthese der Flagellen nicht beeinträchtigt war. Die Deacetylierung spielt daher eine unmittelbar Rolle bei der Signaltransduktion und Motilität. Insgesamt konnte durch die Arbeit gezeigt werden, dass die Acetylierung und Deacetylierung von Proteinen durch Pat1 resp. Sir2 die Regulation der Genexpression beeinflußt. Dies geschieht in H. volcanii indirekt durch die posttranslationale Veränderung von internen Signalen oder direkt durch die Modulierung des Histons und die damit verbundene Änderung der DNA-Struktur.
Die Zellwand von Arabidopsis thaliana enthält große Menge an Hemicellulosen und Pektinen, deren Bestandteile sich hauptsächlich von UDP-Glucuronsäure ableiten. Die Bildung von UDP-Glucuronsäure wird in Pflanzen überwiegend durch die UDP-Glucose Dehydrogenase (UGD) katalysiert, die UDP-Glucose unter der Bildung von NADH in UDP-Glucuronsäure umwandelt. Arabidopsis thaliana besitzt vier UGD-Gene und ein Pseudogen, welche starke Homologien zu Genen anderer bekannter pflanzlicher UDP-Glucose Dehydrogenasen zeigen. Mit Hilfe von Promotor::GUS-Reportergenpflanzen und real time-PCR-Analysen konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die vier UGD-Gene nicht nur in verschiedenen Geweben und zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Morphogenese exprimiert werden, sondern auch in unterschiedlicher Stärke. Dabei scheint jedoch zu jedem Zeitpunkt der Morphogenese, bis auf die Samenentwicklung, eine der vier UGD-Isoformen in Arabidopsis thaliana exprimiert zu werden. Eine biochemische Charakterisierung der verschiedenen Isoformen zeigte einen sehr ähnlichen Km-Wert von ca. 43 µM für NAD+, während sich die Km-Werte für UDP-Glucose deutlich voneinander unterschieden (123 - 335µM). Alle Isoformen unterlagen einer feedback-Hemmung durch UDP-Xylose. Dabei war eine starke Hemmung durch UDP-Xylose korreliert mit einer hohen Affinität zu UDP-Glucose. Neben NAD+ konnten alle untersuchten Isoformen in geringem Maße auch NADP+ als Cofaktor verwenden. Allerdings verringerte sich die Enzymaktivität dadurch um etwa 80%. Alternative Zuckersubstrate konnten dagegen nicht umgesetzt werden. Die biochemischen Unterschiede zwischen den UGD-Isoformen und die differentielle Expression ihrer entsprechenden Genekönnten eine wichtige Rolle bei der Regulation der Zellwandbiosynthese spielen. Denn die irreversible Oxidation von UDP-Glucose zu UDP-Glucuronsäure durch UGD fungiert als eine der Schaltstellen, an welcher der Kohlenstofffluss derpflanzlichen Zelle in Richtung Zellwandbiosynthese gesteuert werden kann. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Analysen von Einfach-oder Doppel-knock out-Mutanten, bei denen durch eine T-DNA-Insertion ein oder zwei UGD-Gene ausgeschaltet waren, zeigte dementsprechend auch eine veränderte Zellwandzusammensetzung bei den Mutanten deltaUGD2, deltaUGD3 und deltaUGD1x deltaUGD4 und eine veränderte Funktion der Stomata bei deltaUGD1x deltaUGD4. Insgesamt waren die Phänotypänderungen gegenüber dem Wildtyp bei der Doppelmutante deltaUGD1x deltaUGD4 wesentlich ausgeprägter als bei den Einfachmutanten, was daran liegen könnte, dass der Ausfall eines UGD-Gens durch ein anderes kompensiert wird. Dafür sprechen auch die Ergebnisse der real time-PCR-Analyse, in der die Expression von UGD1, 2, 3 und 4 in sechs Tage alten Keimlingen des Wildtyps und der knock out-Mutanten untersucht wurde. Dort konnte nachgewiesen werden, dass sich das Ausschalten eines oder mehrerer UGD-Gene auf die Expression der übrigen UGD-Gene auswirkt.
Die funktionelle Integrität des Endothels ist von essentieller Bedeutung für den Organismus. Die Entstehung und Progression vaskulärer Erkrankungen, wie z.B. der Atherosklerose, ist daher oftmals ursächlich mit einer Dysfunktion des Endothels verbunden. Vor diesem Hintergrund ist insbesondere die Aufklärung der molekularen Grundlagen der Regulation von Endothelzellfunktionen, ein zentraler Aspekt heutiger Forschung. Homeobox- (Hox) Transkriptionsfaktoren nehmen eine Schlüsselposition bei der Regulation einer Vielzahl zellulärer Prozesse, wie Proliferation, Migration und Gewebe-spezifischer Differenzierung ein. Die Identifikation sowie die Analyse der Funktion und Regulation von Hox-Transkriptionsfaktoren in Endothelzellen, leistet deshalb einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der Endothelzellbiologie. Als ein zentraler Befund dieser Arbeit, konnte mit der Histon-Methyltransferase MLL erstmals die funktionelle Rolle eines epigenetischen Hox-Regulators auch in differenzierten Endothelzellen nachgewiesen werden. MLL erwies sich hierbei von essentieller Bedeutung für pro-angiogene Endothelzell-Funktionen. Die bedeutende Rolle von MLL bei der Migration von Endothelzellen konnte mit der transkriptionellen Regulation der beiden Hox-Transkriptionsfaktoren HoxA9 und HoxD3 in Verbindung gebracht werden, die hier erstmals als direkte Zielgene von MLL in Endothelzellen beschrieben wurden. Als funktionelle Mediatoren der MLLabhängigen Migration konnten zudem der EphB4-Rezeptor sowie die Integrine αVβ3 und α5β1, als Zielgene von HoxA9 bzw. HoxD3 nachgewiesen werden. Neben der Migration konnte für MLL auch eine essentielle Rolle für das Sprouting von Endothelzellen nachgewiesen werden, die sich im Gegensatz zur Migration, nicht auf die Regulation von HoxA9 oder HoxD3 zurückführen ließ. Diese Beobachtung lässt auf die Involvierung zusätzlicher MLLabhängiger Faktoren schließen, und verdeutlicht damit die zentrale Rolle von MLL bei der Regulation komplexer, pro-angiogener Prozesse in Endothelzellen. Über die genannte Rolle von MLL hinaus konnte im Rahmen dieser Arbeit das Wissen um Hox-Transkriptionsfaktoren mit funktioneller Relevanz für Endothelzellen, um die beiden Hox-Transkriptionsfaktoren HoxB4 und HoxB5 erweitert werden. Hier konnte für HoxB4 eine Rolle für die Fähigkeit von Endothelzellen zur Ausbildung zwei- und 3-dimensionaler Gefäßstrukturen nachgewiesen werden, während HoxB5 in die Proliferation, die Expression des endothelialen Markergens eNOS sowie die morphologische Beschaffenheit von Endothelzellen eingreift. Zusätzlich konnte die Rolle von transkriptionellen Hox Co-Faktoren, als Modulatoren von Hox-Funktionen, am Beispiel der Interaktion von Meis1 und HoxA9 bei der Transaktivierung des eNOS-Promoters aufgezeigt werden. Zusammenfassend leisten die hier gezeigten Daten einen Beitrag zum Verständnis der Rolle von Hox-Transkriptionsfaktoren als molekulare Regulatoren endothelialer Zellfunktionen.
Der suprachiasmatische Nucleus (SCN) des Hypothalamus enthält die zentrale innere Uhr der Säugetiere. Diese innere Uhr besteht aus einem Verbund von untereinander gekoppelten Neuronen, die durch ein intrinsisches molekulares Uhrenwerk eine selbsterhaltende Oszillation mit einer Periode von circa einem Tag (circadian) aufrechterhalten. Diese Oszillation dient dem Organismus als innere Uhr und muss, da ihre Periode nicht exakt 24 Stunden beträgt, durch Zeitgeber mit der Umwelt synchronisiert werden. Der wichtigste circadiane Zeitgeber ist das Licht. Die Lichtsignale gelangen von der Retina über den retinohypothalamischen Trakt (RHT) direkt zum SCN. Von dort werden circadiane Informationen an zentrale und periphere Effektoren weitergeleitet, unter anderem an das Pinealorgan, welches zyklisch das Hormon Melatonin als Dunkelheitssignal ausschüttet. Melatonin kann wiederum auf die circadiane Uhr zurückkoppeln und in einem engen, sensitiven Zeitfenster die Phasen des SCN verschieben. Neben diesem Regelkreis gibt es direkte Verbindungen vom SCN zum lateralen Hypothalamus (LH), der eine zentrale Rolle bei der Regulation des Schlafes und der Energiehomöostase innehat. Ein spezieller Neuronentyp des LH schüttet das Neuropeptid Orexin aus, das große Bedeutung bei der Schlafregulation und der Appetitbildung besitzt. Diese orexinergen Neurone projizieren in weite Teile des Gehirns, unter anderem in die Region des SCN, was aufgrund der bekannten Wechselbeziehungen zwischen circadianer Aktivität, Schlaf und Appetit auf eine Rückkoppelung auf das circadiane System schließen lässt. In der vorliegenden Arbeit wurden mit Hilfe von Multielektroden-Ableitungen (MEAs) die neuronalen Signale einzelner Zellen des SCN, die zusammen ein komplexes Netz für die Steuerung der Effektormechanismen bilden, analysiert. Es standen dabei folgende Fragestellungen im Vordergrund: Bieten primäre Zellkulturen von SCN-Neuronen ein ausreichendes Modell für die Untersuchung der zellulären Kommunikation und der neuronalen Ausgangssignale der circadianen Uhr? Wirken Zeitgebersignale direkt auf die primären Oszillatoren oder sind Phasenverschiebungen eine Eigenschaft des gesamten Netzwerkes im SCN? Besteht ein Einfluss der orexinergen Neurone des lateralen Hypothalamus auf die Uhren-Neurone im SCN? Auf Multielektrodenplatten kultivierte SCN Neurone sind spontanaktiv und zeigen über Tage und Wochen ausgeprägte circadiane Rhythmen in ihrer Spikerate. In der Regel sind diese Aktivitäts-Rhythmen einzelner Neurone nicht synchronisiert, obwohl die Zellkulturen zahlreiche synaptische Verbindungen und korrelierte Aktivität aufweisen Um die Interaktion der verschiedenen Neuronen innerhalb des Uhrennetzwerkes aufzuklären, wurde eine Methode basierend auf Kreuzkorrelationen entwickelt. Mit dieser Methode konnte gezeigt werden, dass korrelierte Aktivität in SCN-Zellkulturen verbreitet ist, die stabilen Oszillatoren davon jedoch immer ausgenommen waren, obwohl eine durchgehende Vernetzung innerhalb der Kulturen bestand. Somit bilden Zellkulturen von SCN Neuronen ein sehr heterogenes Netzwerk mit stabilen Oszillatoren, schwachen Oszillatoren und nicht rhythmischen Neuronen, das viele einzelne Uhren elastisch miteinander koppelt und mit verarbeiteten Informationen über äußere und innere Zustände versorgt. Stabile Oszillatoren können direkt durch Zeitgeber-Stimuli, wie zum Beispiel Melatonin, beeinflusst und in ihren Aktivitäts-Phasen verschoben werden. Die Phasen-Antwortkurven sind im Vergleich zu in vivo Untersuchungen jedoch variabler, was für eine starke Beteiligung des neuronalen Netzwerkes bei der Verarbeitung und Stabilisierung der Antworten auf die Zeitgeber-Stimuli spricht. Phasenverschiebungen als Reaktion auf einen Zeitgeber-Stimulus sind demnach eine Eigenschaft der einzelnen Oszillatorzelle, die aber durch die Interaktion der verschiedenen Uhren-Neurone in ein stabiles Ausgangssignal umgesetzt werden müssen. Kultivierte SCN-Neurone reagieren auf Applikation von Orexin A mit kurzzeitigen Änderungen der Spikerate, sowie mit deutlichen Phasenverschiebungen, die in Zellkulturen sehr variabel ausfallen, während sie in Ableitungen von organotypischen Hirnschnitten stabil und reproduzierbar sind. Dies unterstreicht wiederum die Bedeutung des neuronalen Netzwerkes im SCN. Orexin A scheint zwar direkt auf stabile Oszillatorzellen einzuwirken, aber auch auf die synaptische Übertragung zwischen den SCN-Neuronen. Sein Wirkungsmechanismus könnte dabei in einer Hemmung der GABAergen und in einer Verstärkung der glutamatergen synaptischen Übertragung liegen. Die Wirkung von Orexin A im SCN spricht für eine vielfältige Rückkoppelung des orexinergen Systems auf den circadianen Schrittmacher.
Degenerationsvorgänge am Innenohr und experimentelle Untersuchungen über Protektionsmöglichkeiten
(2000)
Hörverluste durch Innenohrschäden gelten beim Menschen und anderen Säugetieren als irreversibel. Deshalb wird es von vielen Wissenschaftlern versucht, eine Regeneration im Innenohr der Säugetiere zu induzieren oder das Ohr pharmakologisch vor Schädigung zu schützen. Ziel dieser Arbeit war es zu untersuchen, ob neurotrophe Wachstumsfaktoren Meerschweinchen vor experimentell ausgelösten Innenohrschäden schützen können. Als erstes wurde in dieser Arbeit ein Tiermodell zur akuten und frequenzspezifischen Hörschädigung entwickelt. Meerschweinchen wurden Kanamycin und Ethakrynsäure intravenös infundiert. Es wurde festgestellt, daß die erwünschten frequenzspezifischen Hörverluste durch 266 mg/kg Kanamycin kombiniert mit 30 mg/kg Ethakrynsäure reproduzierbar induziert werden konnten. Die Hörschwellen und ihre Verluste wurden anhand der Summenaktionspotentiale vom Hörnerv bestimmt. Anschließend wurde an Meerschweinchen eine Methode zur chronischen Applikation von Wachstumsfaktoren ausgearbeitet. Es wurden drei implantierbare Applikationssysteme getestet, das Mikrodosiersystem (MDS) aus der Tübinger HNO-Klinik, die wiederbefüllbaren ESOX-Pumpen und osmotische ALZET-Pumpen. Durch die osmotischen ALZET-Mikropumpen konnten neurotrophe Faktoren über einen Zeitraum von mehreren Wochen kontinuierlich und zuverlässig appliziert werden. Diese Pumpen wurden in Meerschweinchen implantiert und lieferten eine Lösung mit der Testsubstanz oder eine Kontrollösung, die an das runde Fenster der Cochlea oder in die Zerebrospinalflüssigkeit abgegeben wurden. Im dritten Teil der Arbeit wurden die beiden entwickelten Methoden miteinander kombiniert. Damit war es möglich zu testen, ob der durch die Mikropumpen applizierte neurotrophische Faktor-3 (NT-3) die durch Ototoxika ausgelösten Schwellenverluste vermindert, Argumente für die Wahl von NT-3 waren, daß NT-3 in vitro bereits eine starke protektive Wirkung an den Neuronen des Spiralganglions erwiesen hatte (Marzella et al., 1997). Außerdem sind Rezeptoren für NT-3 auch bei adulten Tieren in den cochleären Haarzellen vorhanden. Die physiologische Wirkung von NT-3 war aber in vivo noch nicht untersucht worden. Zu Beginn der Experimente wurden die Tiere mit Mikropumpen implantiert, die über 14 Tage eine NT-3-haltige oder Kontrollösung applizierten. Vier Tage nach Implantation der Pumpen wurden die Meerschweinchen durch die Infusion der oben genannten ototoxischen Arzneimitteln vertäubt. Die Hörschwellen wurden kurz bevor und über 32 Tage nach der Vertäubung gemessen. Die Hörschwellen der mit NT-3 behandelten Tiere wurden mit den Hörschwellen der Kontrolltiere verglichen. Durch die Infusion von Kanamycin und Ethakrynäure wurden bei Meerschweinchen Hörverluste in der Größenordnung von 40 dB induziert. Bei der Gabe von NT-3 an die rechten Cochleae wurden diese ototoxisch ausgelösten Schwellenverluste um 9 dB vermindert, und dies nicht nur auf der behandelten, sondern auch auf der kontralateralen Seite. Diese Befunde deuteten darauf hin. daß bei der lokalen Gabe die neurotrophen Faktoren auf systemischem Wege auch andere Seite erreichen und dort eine Wirkung ausüben. Ähnliche Effekte wurden auch bei lokaler Gabe von einem anderen neurotrophen Faktor, Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), beoobachtet (Shoji et al., 2000). Die kontralaterale Wirkung war hier aber schwächer (3 dB), als die ipsilaterale (5 dB). Die ins Ohr implantierten Pumpen verursachten per se Hörverluste von etwa 5 dB. NT-3 verminderte auch diese Hörverlustedurchschnittlich um 4 dB. In einer weiteren Versuchsreihe wurde der systemische Effekt von NT-3 geprüft. Dafür wurde NT-3 nicht lokal an das runde Fenster der Cochlea, sondern in die Zerebrospinalflüssigkeit appliziert. Die ototoxisch ausgelösten Hörverluste konnten durch den systemisch gegebenen NT-3 um 5 dB verringert werden. Relativ zu den ototoxisch ausgelösten Hörverlusten in der Größenordnung von 40 dB war die Protektion durch systemisch (5 dB) oder lokal (9 dB) applizierten NT-3 gering. Die stärkste otoprotektive Wirkung durch Wachstumsfaktoren, von 12-18 dB, wurde bis jetzt durch gentechnisch in die Cochlea eingebrachten GDNF erreicht (Yagi et al., 1999). Der Schutzeffekt durch den lokal am Ohr gegebenen GNDF (5 dB, Shoji et al., 2000) war aber geringer, als der vom identisch verabreichten NT-3 (9 dB, diese Arbeit, s. auch Sudavicius et al., 2000). Wenn durch gentechnische Art des Verabreichens die Wirkung von NT-3 im gleichen Maße potenziert werden sollte, wie es bei GDNF der Fall ist, wäre die protektive Wirkung von NT-3 stärker als die von GDNF.
Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde die Rolle des Transkriptionsfaktors Meis2 als Ko-Faktor in der Entwicklung des anterioren Neuralrohrs untersucht. Hierbei gaben funktionelle Untersuchungen durch Fehl- und Überexpressionsstudien mittels in ovo Mikroelektroporation im Hühnchenembryo, Aufschluss über eine besondere Rolle von Meis2 bei der Spezifizierung und Entwicklung des Tectum opticums. Überdies führten bio-chemische Untersuchungen zur Identifizierung neuer, bislang noch nicht beschriebener Interaktionspartner von Meis2 im sich entwickelnden optischen Tektum und in den Anlagen der Augen. Diese Untersuchungen geben einen weiteren Einblick in die Funktionsweise von Meis2 als Ko-Transkriptionsfaktor. Zusammengefasst lieferten die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit folgende Erkenntnisse: I) Im Mittelhirn ist Meis2-Expression unter den bislang beschriebenen Regulatoren der Mittelhirnentwicklung einzigartig: es ist von Beginn an nicht dynamisch und kennzeichnet ausschließlich die dorsalen Alarplatten des Mittelhirns, den Bereich des zukünftigen optischen Tektums (Kapitel 3.1). Diese Expression unterliegt einer strikten negativen Regulation durch sezernierte Moleküle und Transkriptionsfaktoren der benachbarten Regionen des Neuralrohrs (Kapitel 3.2). II) Meis2 ist für tektale Entwicklung erforderlich: Die Überexpression des dominant negativ wirkenden Konstruktes Meis2EnR störte die Entwicklung tektumspezifischer Strukturen sowohl in der frühen als auch in der späteren Entwicklung (Kapitel 3.3.1 und 3.3.2). Zudem kam es zur Unterdrückung der tektalen Gene ephrinB1 und Dbx1 (Kapitel 3.3.3 und 3.3.4). III) Meis2 ist für tektale Entwicklung ausreichend: Die Fehlexpression von Meis2 führte zur Induktion und Entwicklung ektopischer tektaler Strukturen im Dienzephalon (Kapitel 3.3.5). Dabei führte Meis2 bereits 24 h nach Fehlexpression zur Transdifferenzierung des dienzephalischen in mesenzephalisches Zellschicksal, veränderte jedoch nicht das Schick-sal des metenzephalischen Gewebes (Kapitel 3.3.7). IV) Bei der Induktion tektaler Strukturen ist Meis2 nicht Bestandteil des regulatorischen Netzwerks des Mittel-Hinterhirn Organisators (MHO), eines sekundären Organisators, welcher die Entwicklung der Mittel-Hinterhirn Region steuert (Kapitel 3.3.8). V) Meis2 bildet jedoch im Mittelhirn in vivo Komplexe mit Otx2, einem Schlüsselmolekül zur Spezifizierung des anterioren Neuralrohrs (Kapitel 3.4.1 - 3.4.3). VI) Meis2 kann in vitro durch Bindung an Otx2 einer Grg4/Tle4-vermittelten Unter-drückung der transkriptionellen Aktivität von Otx2 entgegenwirken (Kapitel 3.4.4). Otx2 kann, wie bereits in Arbeiten anderer Labors beschrieben, kontext-abhängig entweder als transkriptioneller Repressor oder Aktivator wirken. Die in dieser Arbeit dargestellten Ergebnisse zeigen daher einen möglichen molekularen Mechanismus auf, wie durch zeitlich und räumlich kontrollierte Bindung eines Ko-Aktivators an Otx2 dessen transkrip-tionelle Aktivität wieder hergestellt werden kann. Die Ergebnisse dieser Arbeit beschreiben zum ersten Mal einen Transkriptionsfaktor, der unabhängig vom regulatorischen Netzwerk des MHO, die Entwicklung des optischen Tektums induziert. Sie liefern somit ein neuartiges mögliches Modell zur Spezifizierung anteriorer Hirnstrukturen: Die Induktion tektaler Entwicklung erfolgt nach Etablierung der Mittel-Hinterhirn Region durch Meis2, einem tektumspezifischen Ko-Faktor von Otx2. VII) Meis2 bildet, im sich entwickelnden Mittelhirn, auch Komplexe mit den beiden Regulatoren der Tektumentwicklung Pax3 und Pax7 (Kapitel 3.4.5). VIII) Außerdem konnten im Rahmen dieser Arbeit zwei weitere mögliche Interaktions-partner von Meis2 in den Anlagen der Augen identifiziert werden: Pax6, einem „master control gene“ der Augenentwicklung (Kapitel 3.4.6) und das Enzym Parp-1 (Kapitel 3.4.7), einem weit verbreiteten und vielseitigen Regulator der Genexpression. Diese Ergebnisse liefern Hinweise auf weitere wichtige Funktionen des Ko-Transkriptions-faktors Meis2 in der Entwicklung des anterioren Zentralnervensystems.
Helicobacter pylori (H. pylori) ist ein gram-negatives, mikroaerophiles Bakterium. Es kolonisiert die menschliche Magenschleimhaut, wobei mehr als 50% der Menschheit befallen sind. Als Pathogen begünstigt es die Entstehung von Magengeschwüren und –krebs. Experimentelle Befunde deuten darauf hin, dass H. pylori während der Infektion Kontakt zu Membranproteinen der Wirtszellen aufnimmt, um ein Typ IV Sekretionssystem aufzubauen und den primären Virulenzfaktor CagA (Cytotoxin Associated Antigen A) in die Wirtszelle zu translokieren. Diese Integrine genannten Membranproteine werden bei polaren Epithelzellen allerdings bevorzugt basolateral expremiert. Außerdem können extrazellulär geschnittene E-Cadherinfragmente im Medium mit H. pylori infizierter Zellkulturen nachgewiesen werden. Beide Beobachtungen legen den Schluss nahe, dass eine Protease von H. pylori sekretiert wird und die Zell-Zell-Kontakte degradiert, um H. pylori den Zugang zur basolateralen Seite der Wirtszellen zu ermöglichen. Das vom Gen hp1019 des Stammes H. pylori 26695 codierte Protein HtrA konnte im Rahmen einer Kooperation mit dem Paul-Ehrlich-Institut in Langen im Überstand von H. pylori mit proteolytischer Aktivität nachgewiesen werden. Um den Einfluss dieser extrazellulären Protease auf die Infektion von Kulturzellen mir H. pylori zu untersuchen, sollte ein niedermolekularer Inhibitor für HtrA gefunden werden. Ein Homologiemodell als Grundlage für ein strukturbasiertes virtuelles Screening wurde berechnet, wobei die aktive Konformation der Protease DegP von Escherichia coli als Vorlage diente (PDB Identifikation 3cs0). Für einen neue, im Rahmen dieser Untersuchung entwickelten Methode wurde PocketPicker eingesetzt, um Größe und Form der die Bindetaschen auf der Proteinoberfläche vorherzusagen. Durch die komplementäre Projektion von Proteinatomtypen auf diese definierte Volumen kann so für eine von PocketPicker vorgesagte Bindetasche ein potentielles Pharmakophormodell berechnet und für Datenbanksuchen eingesetzt werden. In retrospektiven Studien konnte die Funktion dieser Berechungen für eine Auswahl an pharmakologisch wichtigen Proteinen aus verschiedenen Strukturklassen validiert werden. Dabei stellte sich vor allem eine Abhängigkeit der Güte der Modelle von der Güte der Vorhersage von PocketPicker heraus, was den Schluss zulässt, dass eine möglichst genaue Definition der Bindetasche für das Gelingen eines strukturbasierten virtuellen Screening unerlässlich ist. Für die Protease HtrA von H. pylori konnten erfolgreich drei strukturabgeleitete Pharmakophormodelle berechnet werden, wobei jeweils verschiedene von PocketPicker vorhergesagte Bindetaschen einbezogen wurden. Die Molekülkataloge der Firmen Asinex und Specs wurden nach Ähnlichkeit zu diesen Modellen sortiert und nach Begutachtung der jeweils ähnlichsten 100 Substanzen wurden 26 Substanzen ausgewählt und bestellt. In einem in vitro Assay mit der rekombinanten Protease HtrA inhibierten 6 Substanzen den Verdau eines rekombinanten Substrats. Die beste Verbindung erreichte in dem Assay eine maximale Inhibition von ca. 77 % bei einer mittleren inhibitorischen Konzentration bei halbmaximaler Inhibition (IC50) von ca. 26 µM.
Die Identifizierung neuartiger Verbindungsklassen für ein pharmakologisches Zielsystem ist eine fordernde Aufgabe für die frühe präklinische Forschung, insbesondere wenn bereits vorherige umfangreiche Studien durchgeführt und viele Leitstrukturserien gefunden wurden. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Scaffold Hopping durch Methoden des Virtual Screenings auch für Systeme möglich ist, für die bereits eine Vielzahl von Referenzsubstanzen beschrieben ist und somit wenig freier chemischer Raum für Innovation zur Verfügung steht. Als Beispielsystem wurde die GlycinB-Bindungsstelle der NR1-Untereinheit des NMDA-Rezeptors betrachtet. Verschiedene zwei- und dreidimensionale Techniken des Virtual Screenings wurden einer umfangreichen retrospektiven Validierung unterworfen. Zur Durchführung der prospektiven Virtual-Screening-Studie wurde eine automatisierte in silico Plattform entwickelt, die 8,9 Millionen käufliche Substanzen aus 46 Substanzkatalogen von 33 verschiedenen Anbietern sammelte, um etwa 5 Millionen unterschiedliche Moleküle in zweidimensionaler Darstellung aufzuarbeiten. Diese Menge an Substanzen stellt den größten Teil der zurzeit kommerziell verfügbaren chemischen Verbindungen, also den „verfügbaren chemischen Raum“ dar. Anhand der retrospektiv validierten Virtual Screening Techniken konnten in einer prospektiven Suche 21 GlycinB-Antagonisten mit neuartigen, d.h. für GlycinB noch unbeschriebenen Scaffolds gefunden werden. Ausgehend von drei dieser Virtual Screening Hits wurden 53 weitere Verbindungen mit insgesamt fünf unterschiedlichen neuartigen Scaffolds und einem gemeinsamen Azo-Motiv identifiziert. Die Struktur-Wirkungsbeziehungen dieser fünf chemischen Serien wurden charakterisiert. Das Ergebnis dieser Arbeit zeigt eindeutig, dass es lohnend ist, alle vorhandenen Methoden auszuschöpfen, da sich die validierten Methoden komplementär zueinander verhielten und kein Virtual Screening Hit von mehr als einer Technik gefunden wurde. Die Flexibilität von Proteinen als Antwort auf die Bindung unterschiedlicher Liganden stellt ein bislang ungelöstes chemieinformatisches Problem dar, welches auch grundlegende pharmakologische Bedeutung hat. So verursachen z.B. bei NMDA/GlycinB agonistische Liganden eine Konformationsänderung des Rezeptors. Diese ruft dann eine direkte funktionale Antwort in Form der Öffnung des Ionenkanals hervor. Auch der Bindungsmodus der Antagonisten von GlycinB ist trotz Vorhandenseins von zwei Kristallstrukturen und mehreren Hundert zum Teil hochaffiner Referenzstrukturen zum großen Teil ungeklärt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde ein auf Moleküldynamiksimulationen basierendes Verfahren entwickelt, welches flexible Aminosäurereste im Rezeptor und damit induzierbare Bewegungen des Proteinrückgrates bestimmt. Die so identifizierten Reste wurden dann in einem erweiterten Verfahren des Induced-Fit-Dockings als explizit flexibel betrachtet. Hierdurch war die Berechnung verschiedener Bindungsmodi von Antagonisten möglich, die aufgrund ihrer Form und Größe nicht in die verfügbaren Kristallstrukturen von GlycinB passten. Diese benötigten somit einen Induced-Fit-Effekt des Rezeptors, um eine Bindung einzugehen. Für die im ersten Teil dieser Arbeit identifizierten Azo-Liganden wurde auf Basis dieser Methode ein gemeinsamer Bindungsmodus vorgeschlagen. Ebenso konnte anhand der Methodik eine Aussage über die funktionale Auswirkung der Proteinflexibilität beim Übergang vom antagonistischen zum agonistischen Rezeptorzustand von GlycinB getroffen werden. Ein großes Problem aktueller Dockingverfahren ist die mangelnde Verfügbarkeit von Scoringfunktionen, welche die tatsächliche biologische Bindungsaffinität eines Liganden berechnen. Hier wurde ein Verfahren für das Zielsystem GlycinB gezeigt, welches aufgrund der Berechnung des thermodynamischen Entropie- und Enthalpiegewinns durch Verdrängung von hydrophob eingeschlossenen Wasser aus der Bindungsstelle durch den Liganden eine Aussage über dessen zu erwartende Bindungsaffinität trifft. Dieses neuartige Scoringsystem wurde auf die im Virtual Screening identifizierten Serie von Azo-Liganden angewandt und verfügte über eine im Vergleich zu klassischen Scoringfunktionen des Molecular Dockings verbesserte Vorhersagekraft der biologischen Bindungsaffinität.
Die Haarzellen des Innenohrs setzen durch Schallreize ausgelöste Schwingungen der Basilarmembran in elektrische Impulse um, die über Nerven an das Gehirn geleitet werden und dort nach komplexer neuronaler Verarbeitung die Hörwahrnehmung auslösen. Gleichzeitig erhalten die äußeren Haarzellen über absteigende Nervenverbindungen, die olivo-cochleären Neurone, auch Informationen vom Gehirn, durch die ihre Empfindlichkeit verändert werden kann. Über die Mechanismen dieser efferenten Beeinflussung der Reizverarbeitung im Innenohr ist noch wenig bekannt und auch ihre biologische Funktion ist noch nicht geklärt. Diskutiert wird eine Rolle bei der Verbesserung des Signal-Hintergrundrausch-Verhältnisses und im Zusammenhang mit selektiver Aufmerksamkeit, durch die relevante Anteile der akustischen Umwelt gezielt „herausgehört“ werden können. Ziel dieser Promotionsarbeit ist die Untersuchung der efferenten Beeinflussung der Vorgänge im Innenohr mithilfe der nicht-invasiven Messung von akustischen Beiprodukten der aktiven Reizverstärkung durch die äußeren Haarzellen, den otoakustischen Emissionen. Bei dieser Methode werden mit einem empfindlichen Mikrophon im Gehörgang Schallereignisse aufgenommen, die das Ohr selbst produziert. Die olivo-cochleären Efferenzen können experimentell durch Applikation von Rausch-Stimuli auf dem kontralateralen Ohr aktiviert werden und ihre Wirkung auf die Empfindlichkeit des Innenohrs anhand der Veränderungen der otoakustischen Emissionen auf dem anderen, ipsilateralen Ohr gemessen werden. In Messungen unterschiedlicher Typen von otoakustischen Emissionen am Menschen und an der Mongolischen Wüstenrennmaus konnten deutliche Veränderungen der otoakustischen Emissionen bei gleichzeitiger Beschallung des kontralateralen Ohrs gezeigt werden, die als Modulation der Haarzelleigenschaften und Beeinflussung der cochleären Verstärkung durch Aktivierung der absteigenden Nervenbahnen interpretiert werden können: Spontane otoakustische Emissionen (SOAE), die ohne jegliche akustische Stimulation vom Innenohr generiert werden, zeigten bei kontralateraler akustischer Stimulation eine Verminderung ihres Pegels und eine Erhöhung ihrer Frequenz. Die Pegelverminderung deutet auf eine Dämpfung der cochleären Verstärkungsmechanismen und die Frequenzerhöhung auf eine Erhöhung der Steifigkeit im Corti-Organ und hierdurch veränderte Resonanzeigenschaften nach Aktivierung der efferenten Neurone hin. Distorsionsprodukt-otoakustische Emissionen (DPOAE), die bei Stimulation mit zwei Reintönen (f1 und f2) in Folge der nichtlinearen Verstärkung durch die äußeren Haarzellen entstehen, waren durch kontralaterale akustische Stimulation ebenfalls klar in ihrem Pegel beeinflusst. Die Effekte, sowohl auf SOAE als auch auf DPOAE, waren abhängig vom Pegel des kontralateralen Stimulus und traten bereits bei niedrigen kontralateralen Stimuluspegeln, deutlich unter der Schwelle des Mittelohrreflexes, auf. Durch ihren Zeitverlauf konnten die Effekte den in der Literatur beschriebenen efferenten Vorgängen zugeschrieben werden. Bei anhaltender akustischer Stimulation traten Adaptationsphänomene auf. Weiterhin zeigte sich in Experimenten mit kontralateralem Schmalbandrauschen und Reintönen, dass die efferente Modulation selektiv auf bestimmte Bereiche des tonotop organisierten Innenohrs zielt, also frequenzspezifisch agiert, wobei Reintöne mit Frequenzen, die etwas tiefer als die Stimulationsfrequenz lagen, die größten Effekte erzielten. Dies steht in guter Übereinstimmung zu anatomischen Daten. Besonders interessant an den DPOAE-Messungen war, dass das quadratische Distorsionsprodukt der Frequenz f2-f1 wesentlich empfindlicher reagierte als das kubische Distorsionsprodukt der Frequenz 2f1-f2. Bisher gibt es kaum Daten zu Veränderungen der f2-f1-DPOAE durch efferente Mechanismen. Die beiden DPOAE-Typen sind durch unterschiedliche Parameter der dem Verstärkungsprozess zu Grunde liegenden Transferfunktion beeinflusst, und die experimentell nachgewiesenen Unterschiede deuten darauf hin, dass die Aktivierung der olivo-cochleären Efferenzen ihre dämpfende Wirkung auf die Schallverarbeitung im Innenohr durch eine Verschiebung des Arbeitspunktes der Transfercharakteristik des cochleären Verstärkers entfaltet. Diese Hypothese wurde an der Wüstenrennmaus durch einen ergänzenden methodischen Ansatz unterstützt, bei dem zusätzlich zur Evozierung und Messung von DPOAE mit und ohne gleichzeitiger kontralateraler Aktivierung der Efferenzen ein sehr tieffrequenter „Bias“-Ton mit hohem Pegel appliziert wurde, der das Corti-Organ und damit den Arbeitspunkt des cochleären Verstärkers periodisch auslenkte. Diese Tieftonstimulation hatte eine sehr starke, von der Phase des Bias-Tons abhängige Modulation des f2-f1-Pegels zur Folge, während 2f1-f2 kaum beeinflusst wurde. Das Muster der f2-f1-Pegelmodulation änderte bei zusätzlicher kontralateraler Schallapplikation deutlich seinen Charakter. Entsprechende Veränderungen in den Verzerrungsmustern konnten mithilfe eines einfachen Modells zur DPOAE-Generation, das auf der Beschreibung des Verstärkungsmechanismus durch eine Boltzman-Funktion basierte, simuliert werden. Die Befunde der vorliegenden Arbeit zeigen, dass die Schallverstärkung im Innenohr durch efferente Mechanismen moduliert wird und dies anhand der nicht-invasiven Messung von otoakustischen Emissionen nachweisbar ist. Dabei deuten die Ergebnisse auf eine Verschiebung des Arbeitspunktes der Transfercharakteristik des cochleären Verstärkers als Mechanismus der olivo-cochleären Modulation der Reizverarbeitung im Innenohr hin.
Kenntnisse über die dreidimensionale Struktur therapeutisch relevanter Zielproteine bieten wertvolle Informationen für den rationalen Wirkstoffentwurf. Die stetig wachsende Zahl aufgeklärter Kristallstrukturen von Proteinen ermöglicht eine qualitative und quantitative rechnergestützte Untersuchung von spezifischen Protein-Liganden Wechselwirkungen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden neue Algorithmen für die Identifikation und den Ähnlichkeitsvergleich von Proteinbindetaschen und ihren Eigenschaften entwickelt und in dem Programm PocketomePicker zusammengefasst. Die Software gliedert sich in die Routinen PocketPicker, PocketShapelets und PocketGraph. Ferner wurde in dieser Arbeit die Methode ReverseLIQUID reimplementiert und im Rahmen einer Kooperation für das strukturbasierte Virtuelle Screening angewendet. Die genannten Methoden und ihre wissenschaftliche Anwendungen sollte hier zusammengefasst werden: Die Methode PocketPicker ermöglicht die Vorhersage potentieller Bindetaschen auf Proteinoberflächen. Diese Technik implementiert einen geometrischen Ansatz auf Basis „künstlicher Gitter“ zur Identifikation zusammenhängender vergrabener Bereiche der Proteinoberfläche als Orte möglicher Ligandenbindestellen. Die Methode erreicht eine korrekte Vorhersage der tatsächlichen Bindetasche für 73 % der Einträge eines repräsentativen Datensatzes von Proteinstrukturen. Für 90 % der Proteinstrukturen wird die tatsächlich Ligandenbindestelle unter den drei wahrscheinlichsten vorhergesagten Taschen gefunden. PocketPicker übertrifft die Vorhersagequalität anderer etablierter Algorithmen und ermöglicht Taschenidentifikationen auf apo-Strukturen ohne signifikante Einbußen des Vorhersageerfolges. Andere Verfahren weisen deutlich eingeschränkte Ergebnisse bei der Anwendung auf apo-Strukturen auf. PocketPicker erlaubt den alignmentfreien Ähnlichkeitsvergleich von Bindetaschenfor-men durch die Kodierung berechneter Bindevolumen als Korrelationsdeskriptoren. Dieser Ansatz wurde erfolgreich für Funktionsvorhersage von Bindetaschen aus Homologiemodellen von APOBEC3C und Glutamat Dehydrogenase des Malariaerregers Plasmodium falciparum angewendet. Diese beiden Projekte wurden in Zusammenarbeit mit Kollaborationspartnern durchgeführt. Zudem wurden PocketPicker Korrelationsdeskriptoren erfolgreich für die automatisierte Konformationsanalyse der enzymatischen Tasche von Aldose Reduktase angewendet. Für detaillierte Analysen der Form und der physikochemischen Eigenschaften von Proteinbindetaschen wurde in dieser Arbeit die Methode PocketShapelets entwickelt. Diese Technik ermöglicht strukturelle Alignments von extrahierten Bindevolumen durch Zerlegungen der Oberfläche von Proteinbindetaschen. Die Überlagerung gelingt durch die Identifikation strukturell ähnlicher Oberflächenkurvaturen zweier Taschen. PocketShapelets wurde erfolgreich zur Analyse funktioneller Ähnlichkeit von Bindetaschen verwendet, die auf Betrachtungen physikochemischer Eigenschaften basiert. Zur Analyse der topologischen Vielfalt von Bindetaschengeometrien wurde in dieser Arbeit die Methode PocketGraph entwickelt. Dieser Ansatz nutzt das Konzept des sog. „Wachsenden Neuronalen Gases“ aus dem Bereich des maschinellen Lernens für eine automatische Extraktion des strukturellen Aufbaus von Bindetaschen. Ferner ermöglicht diese Methode die Zerlegung einer Bindestelle in ihre Subtaschen. Die von PocketPicker charakterisierten Taschenvolumen bilden die Grundlage für die Methode ReverseLIQUID. Dieses Programm wurde in dieser Arbeit weiterentwickelt und im Rahmen einer Kooperation zur Identifikation eines Inhibitors der Serinprotease HtrA des Erregers Helicobacter pylori verwendet. Mit ReverseLIQUID konnte ein strukturbasiertes Pharmakophormodell für das Virtuelle Screening erstellt werden. Dieser Ansatz ermöglichte die Identifikation einer Substanz mit niedrig mikromolarer Affinität gegenüber der Zielstruktur.
Mit der vorliegenden Arbeit wurde die Nutzbarkeit morphologischer und anatomischer Merkmale aus den Bereichen des Fruchtknotens und der Samenanlangen für die Systematik und Taxonomie der Bromelioideae (Bromeliaceae) untersucht. Hierzu wurden 30 Merkmale im Bereich des Fruchtknotens und der Samenanlagen definiert und anhand anatomischer Schnittpräparate die Verteilung der Merkmalsausprägungen an 102 Arten aus 28 (von 32) Gattungen der Unterfamilie Bromelioideae sowie zwei Vertretern der Unterfamilie Pitcairnioideae als Vergleichgruppe ermittelt. Allein 41 Taxa entstammten der größten und als polyphyletisch anzunehmenden Gattung Aechmea mit Vertretern aus allen sieben Untergattungen. Die Auswertung der Merkmalsverteilung erfolgte einerseits im Hinblick auf eine funktionale Deutung beobachteter Kopplungen bestimmter Strukturen im ökologischen Kontext und zum anderen unter taxonomischen Gesichtspunkten im Hinblick auf Beantwortung der Fragen, wieweit derzeitige Gattungsumgrenzungen von den hier untersuchten Merkmalen unterstützt werden, bzw. wie weit Anregungen zur Abänderung bestehender Konzepte abgeleitet werden können, welche Beziehungen zwischen den Untergattungen von Aechmea und anderen Gattungen der Bromelioideae bestehen und wodurch sich basale Linien der Bromelioideae von den abgeleiteten Formen der „Eu- Bromelioideae“ im Sinne von SCHULTE (2007) unterscheiden lassen. Um diese Fragen zu beantworten, wurden zwei unterschiedliche Ansätze kombiniert. Die Verteilung der Merkmalszustände wurde einerseits auf Topologien geplottet, die aus publizierte Phylogenien mit genetischen Merkmalen als Datenquelle beruhen. Desweiteren wurden neue Parsimonieanalysen durchgeführt a) auf der Grundlage einer morphologischen Datenmatrix mit den 30 selbst erhobenen Merkmalen aus dem Fruchtknoten- und Samenbereich, b) einer weiteren Matrix, in die fünf weitere selbst erhobene Merkmale aus dem floralen Bereich eingehen und schließlich c) einem Datensatz, in den zusätzlich acht aus der Literatur entnommene Angaben zur Morphologie und Ökologie der untersuchten Pflanzen eingingen. Die aus den molekularen Analysen von SCHULTE et al. (2005) hervorgehende Gliederung der Unterfamilie in eine paraphyletische Gruppe von basalen Linien und der von SCHULTE (2007) als „Eu-Bromelioideae“ bezeichneten monophyletischen Gruppe abgeleiteterer Gattungen findet eine deutliche Entsprechung in Merkmalen des Fruchtknotenbereichs und der Samenanlagen. Die untersuchten Vertreter der basalen Linien besitzen alle ± rechtwinklig von der Fruchtknotenachse abspreizende Samenanlagen, diese sind auf mehr als 70% der Fruchtknotenachse verteilt und die Mikropyle ist stets relativ lang ausgebildet (>100 micro m). Eine der Kerninnovationen der Eu-Bromelioiden scheint die Entwicklung des chalazalen Samenanhängsels als Hilfsinstrument bei der Besiedlung glatter Oberflächen gewesen zu sein. Diese Struktur findet sich nur bei Eu-Bromelioideae und ist stets bereits an der Samenanlage vorgebildet. Sekundär scheint dieses chalazale Anhängsel innerhalb der Eu-Bromelioideae allerdings auch immer wieder verloren gegangen zu sein. Die Umgrenzung der meisten Gattungen sowohl der basalen Linien als auch der Eu-Bromelioideae konnten in ihrer jetzigen Form anhand der Merkmale des Fruchtknotenbereichs und der Samenanlagen nachvollzogen werden. Eine Ausnahme hiervon stellt lediglich die hochgradig polyphyletische Gattung Aechmea s.l. dar. Für keine der untersuchten Gattungen konnten synapomorphe Merkmalszustände erkannt werden, vielmehr gibt es jeweils gattungsspezifische Kombinationen von Merkmalen. Die Ausprägungen der Einzelmerkmale dagegen sind stets auch in anderen Verwandschaftsgruppen zu beobachten. Die hier untersuchten Merkmale unterstreichen das für die Bromelioideae seit langem bekannte Phänomen eines extrem hohen Homoplasiegrades in nahezu allen morphologischen Strukturen. Selbst für den Fruchtknoten lassen sich klare Abhängigkeiten der Merkmalsausprägungen von ökologischen Selektionsfaktoren erkennen. Insbesondere scheinen funktionale Notwendigkeiten im Kontext der Nektarsekretion und der Bestäubungsökologie für die Merkmalsausprägung des Fruchtknotens eine wichtige Rolle zu spielen. Die Samenanlage ist zwar zum Zeitpunkt der Anthese noch nicht direkten Selektionsdrücken ausgesetzt, ihre Merkmale sind aber nur dann zu verstehen, wenn die Funktion hier bereits angelegter Strukturen (wie z.B. der chalazalen Samenanhängsel) im Kontext mit den reifen Samen gedeutet wird.
Entwicklung eines bioartifiziellen Nierentubuluskonstruktes auf Basis humaner Nierenepithelzellen
(2009)
Bei einem chronischen oder akuten Ausfall der Niere stehen im klinischen Alltag extrakorporale Nierenersatzverfahren, wie die Hämodialyse, Hämofiltration und Hämodiafiltration zur Verfügung. Die genannten medizinischen Verfahren bilden nur die physikalischen Prinzipien des Glomerulus ab und können die, über eine reine Stofftrennung hinausgehenden, im Besonderen die komplexen, physiologischen Funktionen des renalen Tubulussystems nicht nachbilden. Die mit dem Ausfall der Nierenfunktion verbundenen metabolischen und endokrinen Störungen werden somit nicht ausreichend korrigiert und sind Ursache der hohen Morbidität und Mortalität dieser Patientengruppe durch kardio-vaskuläre sowie inflammatorische Komplikationen. Mit der Anwendung des Tissue Engineerings, der Integration von Zellen bzw. Geweben und deren biologischer Funktionen in form- und funktionsgebende Substrate stünden für diese Problematik Methoden zur Verfügung, die fehlenden biologischen Funktionen der Tubulusepithelien der Niere in die bereits vorhandenen, modernen Nierenersatztherapien zu integrieren und den Patienten zur Verfügung zu stellen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Membranmaterialien, Kulturbedingungen wie Sauerstoffbedarf, Medienformulierungen und Strömungszustände identifiziert, Systeme und Methoden entwickelt, die es ermöglichen, ein BTK mit primären, humanen Tubuluszellen zu bilden und über mikroskopische Methoden den Differenzierungsstatus der Zellen innerhalb der Membrankapillaren zu erfassen. Der Sauerstoffbedarf distaler und proximaler Tubulusepithelzellen wurde unter verschiedenen Bedingungen ermittelt und führte zusammen mit einem Literaturvergleich sowie theoretischen Betrachtungen der maximalen Scherkräfte zur Auslegung der in vitro Perfusionsparameter des entwickelten Kultursystems. Es konnte ein klinisch etabliertes Membranmaterial identifiziert werden, welches den primären Zellen ohne vorherige Bioaktivierung als ein optimales Substrat dient und somit spätere Zulassungsverfahren für den klinischen Einsatz vereinfacht. Die Entwicklung eines serumarmen Mediums für die Kultur der primären Zellen stellte sich als wichtigster Schritt in der Übertragung der zuvor mit permanenten Zelllinien entwickelten Systeme und Methoden heraus. Mittels mikroskopischer Methoden (REM & CLSM) konnte die Differenzierung der verwendeten Tubulusepithelzellen innerhalb der Hohlfasermodule anhand spezifischer Marker nachgewiesen und somit der Erfolg der in dieser Arbeit entwickelten Systeme und Methoden dokumentiert werden. Trotz des Nachweises der prinzipiellen Machbarkeit im Labormaßstab, stellt die verwendete Zellquelle aufgrund der geringen Verfügbarkeit im Upscaling Prozess vom Labor hin zu einem klinischen Therapieverfahren, die größte Hürde dar. Aktuelle Entwicklungen bei der Identifizierung adulter Stammzellfraktionen der Niere, im Besonderen der Beitrag CD133+ Zellen bei der Tubulusregeneration wurden in dieser Arbeit aufgegriffen. Die Ergebnisse des durchgeführten CD133 Screenings der verwendeten Zellfraktionen zeigen, dass gerade die hochaufgereinigten, proximalen und distalen Fraktionen einen verminderten Anteil dieser potentiellen Stammzellfraktion enthalten. Weniger aufgereinigte Fraktionen könnten somit eine Alternative bei der zukünftigen Entwicklung von bioartifiziellen Tubuluskonstrukten darstellen.
In der äußeren plexiformen Schicht (OPL) der Säugetierretina sind die Photorezeptoren mit den Horizontal- und den Bipolarzellen verschaltet. Diese erste neuronale Verschaltungs-ebene des Sehsystems birgt eine hochkomplexe Architektur aus chemischen und elektrischen Synapsen. Sie ermöglicht die Modulation des Lichtsignals sowie die Aufspaltung der Signale in parallele Übertragungswege. In der vorliegenden Doktorarbeit wurden verschiedene Synapsensysteme in der OPL von Maus-, Kaninchen-, und Makakenretinae mittels immunhistochemischer Färbetechniken licht- und elektronen-mikroskopisch untersucht. In der Mausretina wurden die anatomischen Eigenschaften der Endfüßchen blau-empfindlicher (S-) Zapfen untersucht. Die S-Zapfenendfüßchen waren um 15 % kleiner als die der M-Zapfen, die Bereiche der Invaginierungen am S-Zapfenendfüßchen hingegen um 35 %. Eine deutliche Reduktion der Horizontalzellkontakte ging damit einher. Die Zahl der postsynaptisch von OFF-Bipolarzellen exprimierten Glutamatrezeptor- (GluR) Unterein-heiten GluR1 und GluR5 war am S-Zapfenendfüßchen um fast 50 % kleiner als an M-Zapfen. Dieser Befund spiegelte die geringe Anzahl synaptischer Kontakte von OFF-Bipolarzellen am S-Zapfen wider. Die OFF-Bipolarzelltypen 1 und/oder 2 waren für diese Reduktion verantwortlich. Diese Befunde sind ein erster Hinweis für den sogenannten Grün-OFF-Signalweg in der Mausretina. In der Makakenretina wurde die Verteilung von Protocadherin β16 (Pcdh β16) untersucht. Es konnte auf postsynaptischer Seite an den Photorezeptorterminalien gezeigt werden. Pcdh β16 lag auf den invaginierenden Spitzen von Dendriten der H1 Horizontalzellen sowie an ihren desmosome-like junctions unterhalb der Zapfenendfüßchen. An diesen Orten fielen die Pcdh β16-immunreaktiven Punkte mit den dort von H1 Zellen exprimierten GluR-Untereinheiten GluR2 - 4 und GluR6/7 zusammen. Im Zuge dieser Analyse wurde ebenfalls eine Kolokalisation dieser AMPA- (GluR2 - 4) und Kainat- (GluR6/7) Rezeptoren an den desmosome-like junctions festgestellt. Darüber hinaus zeigte eine elektronenmikroskopische Untersuchung, dass Pcdh β16 auch an flachen Synapsen in Triaden-assoziierter Position am Zapfenendfüßchen zu finden ist. Dies kann als Hinweis auf eine Expression durch flat midget Bipolarzellen oder Bipolarzellen des Typs DB3 gewertet werden. Dies lässt vermuten, dass dieses Protein an der Formation zelltypspezifischer Kontakte bzw. Synapsen beteiligt ist. In einer vergleichenden Studie der synaptischen Verteilung des zytoplasmatischen Gerüstproteins Zonula Occludens-1 (ZO-1) in Makaken-, Kaninchen- und Mausretinae zeigte sich ein sehr einheitliches sowie auch zelltypspezifisches Verteilungsmuster. ZO-1 fiel bei allen Spezies mit Connexin 36 (Cx36) an den gap junctions zwischen Photo-rezeptorterminalien und zwischen den Dendriten von OFF-Bipolarzellen zusammen. Außerdem ist ZO-1 mit gap junctions bestimmter Horizontalzellen assoziiert: In der OPL der Kaninchenretina fiel es mit Cx50 zusammen, dem Connexin der axonlosen A-Typ Horizontalzellen. An den großen gap junctions zwischen den Primärdendriten dieser Zellen bildete ZO-1 jedoch eine Zaun-ähnliche Struktur als Abgrenzung um die gap junctions herum, anstatt direkt mit den Connexinen kolokalisiert zu sein. Eine direkte Interaktion mit den Connexinen wird durch die räumliche Anordnung weitgehend ausgeschlossen, was auf eine Funktion von ZO-1 als tight- oder adherens junction Protein hindeutet. In der Mausretina fiel ZO-1 mit Cx57 an dendro-dendritischen gap junctions zwischen den Maus-Horizontalzellen zusammen. In der Makakenretina sind die Connexine der Horizontalzellen noch nicht bekannt. Trotzdem ließ sich ZO-1 den dendro-dendritischen gap junctions zwischen H1 Horizontalzellen zuordnen. Darüber hinaus zeigte sich eine enge Assoziation dieser dendro-dendritischen gap junctions mit den GluRs unterhalb der Zapfenendfüßchen an den desmosome-like junctions. Der von den GluRs ermöglichte Calcium-Einstrom könnte sich durch die räumliche Nähe zu den Connexinen modulierend auf die Leitfähigkeit der elektrischen Synapsen auswirken.
Die Onkogenese geht mit einer Deregulation des Zellzyklus einher. Dabei spielt unter anderem die Regulation verschiedener krebsrelevanter Transkriptionsfaktoren eine wichtige Rolle. Ein Interaktionspartner und Regulator vieler dieser Faktoren ist das LIM-only Protein FHL2. Es ist bereits bekannt, dass sich der FHL2-Status zwischen normalen und entarteten Zellen in allen bisher untersuchten Geweben unterscheidet. Im Rahmen dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass dies auch im Brustgewebe der Fall ist. FHL2 wird in fast allen aggressiven Mammakarzinomen überexprimiert, nicht aber im Normalgewebe und nur schwach in nicht-invasiven "DCIS". Dies weist darauf hin, dass die FHL2-Menge mit der Aggressivität des Tumors korreliert. Weiterhin konnte hier zum ersten Mal nachgewiesen werden, dass FHL2 in die Zellzyklusregulation involviert ist. Am G1/S-Übergang kann FHL2 die Cyclin D1-Expression induzieren, was letztendlich zu einer Phosphorylierung des RB-Proteins und zum Eintreten der Zelle in die S-Phase führt. Wichtiger aber ist die hier gezeigte FHL2-abhängige Induktion von p21CIP/WAF, ein Zellzyklusinhibitor, der unter anderem auch in der G2/M-Kontrollpunkregulation involviert ist und normalerweise über p53 reguliert wird. Diese Induktion resultiert dort in einem verlangsamten Kontrollpunktübergang, wogegen eine Reduktion des FHL2-Gehalts einen beschleunigten G2/M-Übergang zur Folge hat. Zusätzlich zeigten Expressionsanalysen mit synchronisierten Brustkrebszellextrakten dass FHL2 zellzyklusabhängig exprimiert wird, mit einem Maximum am G2/M-Kontrollpunkt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die p21-Expression in den hier verwendeten Brustkrebszelllinien p53-unabhängig ist und ausschließlich von FHL2 abhängt. Hierbei wird die FHL2-abhängige p21 Expression wahrscheinlich über die Aktivierung des c-jun-Transkriptionsfaktors im MAPK-Signaltransduktionsweg induziert. In vivo und in vitro Interaktionsstudien haben eine Interaktion von FHL2 mit c-jun gezeigt, wobei die Interaktion über die ersten beiden LIM-Domänen vermittelt wird. Der FHL2-c-jun-Komplex bindet an die AP-1-Sequenz innerhalb des p21-Promotors und induziert dadurch p21. Dies führt zu einer Inhibition verschiedener CDE/CHR-regulierter Proteine wie CDC25C oder Plk1 und zu einer verzögerten Zellzyklusprogression. In diesem Zusammenhang konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass die FHL2-Expression nicht nur zu einer verlangsamten Proliferation führt, sondern auch zur Fähigkeit der Zelle zum zellmatrixunabhängigen Wachstum beisteuert. Es scheint auf den ersten Blick widersprüchlich, dass FHL2 für einen intakten G2/M-Kontrollpunkt und eine geringere Proliferationsrate sorgt, gleichzeitig aber zur Tumorentwicklung beiträgt. Es ist allerdings bekannt, dass Tumore ihr Wachstum verlangsamen bevor sie metastasieren. Auch führt ein erhöhter p21-Gehalt im Cytosol zu einer Inhibition der Apoptose, einer weiteren Eigenschaft von Tumoren. FHL2 ist daher ein signifikanter Faktor in der Onkogenese des Mammakarzinoms und aufgrund der differentiellen Expression in vielen Tumoren ein interessantes Ziel für Krebstherapien.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Eignung von Pseudorezeptoren im virtuellen Screening untersucht. Hierzu wurde nach intensiver Auseinandersetzung mit bisher bekannten Konzepten ein neues Computerprogramm zur automatischen Konstruktion von Pseudorezeptormodellen entwickelt. Das Ziel von Pseudorezeptoren ist die Konstruktion eines alternativen, artifiziellen Wirtssystems aus bekannten Liganden eines Zielproteins, dessen dreidimensionale Struktur unbekannt ist. Der generierte Pseudorezeptor ist zu verstehen als die Menge aller Pseudoatome, die um die Ausgangssubstanz(en) projiziert werden. Bei multiplen Referenzliganden wird eine Gewichtung der Pseudoatome durchgeführt. Zudem wird ausschließlich von Distanz- und Winkelparametern Gebrauch gemacht, die aus Untersuchungen von Kokristall-strukturen gewonnenen wurden. Eine abschließende Kodierung generierter Pseudorezeptoren als 90-dimensionalen Korrelationsvektor wurde zum virtuellen Screening eingesetzt. In zwei retrospektiven Fallbeispielen wird gezeigt, dass die generierten Pseudorezeptoren für COX-2 und PPARα mit den realen Zuständen ihrer kokristallisierten Bindetaschen in den PDB Einträge 6cox und 2p54 kompatibel sind. Im retrospektiven virtuellen Screening in der Wirkstoffdatenbank COBRA (8.311 Moleküle) nach COX-2 Inhibitoren (136 Aktive) konnte eine Anreicherung der aktiven Strukturen in den ersten zwei Perzentilen gezeigt werden (54% der Aktiven). Zudem konnten 80% der aktiven Moleküle bereits nach Vorhersage von 10% Falsch-Positiven gefunden werden. Im Falle des retrospektiven Screenings nach 94 PPAR Liganden konnten 30% der aktiven Moleküle nach der Vorhersage von 10% Falsch-Positiven entdeckt. Nach 20% Falsch-Positiver wurden 46% der PPAR Liganden wieder gefunden. Weiterhin konnte mit den ligandenbasierten Informationen eines H4 Pseudorezeptors eine Justierung einer potentiellen Bindetasche des Histamin H4 Rezeptors aus einer molekularen Dynamiksimulation vorgenommen werden. Schließlich wurde in einem prospektiven virtuellen Screening nach Histamin H4 Liganden mit einem Pseudorezeptor zwei Strukturen mit unterschiedlichem Grundgerüst und einem Ki ~ 30 µM identifiziert.
Die Komplementarität der molekularen Oberflächen und der Pharmakophorpunkte ist ein verbreiteter Konzept im rechnergestützen Moleküldesign. Diesem Konzept folgend wurde die Software SQUIRREL neu entwickelt und in der Programmiersprache Java implemetiert. Die Software generiert die Vorschläge für den bioisosteren Ersatz von Molekülen und Molekülfragmenten. SQUIRREL kombiniert Oberflächen- und Pharmakophoreigenschaften bioaktiver Substanzen und kann im virtuellen Screening und fragment-basierten de novo Design eingesetzt werden. In einer prospektiven Studie wurde SQUIRREL verwendet, um neue selektive PPARalpha-Agonisten aus einer kommerziellen Moleküldatenbank zu identifizieren. Die Software lieferte eine potente Substanz (EC50 = 44 nM) mit über 100facher Selektivität gegenüber PPARgamma. In einer zweiten Studie wurde eine Leitstruktur de novo generiert und synthetisiert. Als Ausgangstruktur diente der bekannte PPARalpha-Agonist GW590735. Während des Designvorgangs wurden zwei Teilstrukturen, die für die Aktivität von GW590735 verantwortlich sind, durch bioisostere Gruppen ersetzt, die von SQUIRRELnovo vorgeschlagen wurden. Die neue Leitstruktur aktiviert PPARalpha in einem zellbasierten Reportergen-Testsystem bei einem EC50 von 0.51 µM.
Es ist bekannt, dass Curcumin in einer Vielzahl verschiedener Zellarten die Proliferation hemmt und Apoptose induziert. In der Literatur werden Konzentrationen von 10 bis 150 µM (3.7-55 µg/ml) als dafür notwendig beschrieben. Da Curcumin nach oraler Aufnahme, aufgrund seiner schlechten Resorption aus dem Magen-Darm-Trakt, eine geringe Bioverfügbarkeit im Organismus aufweist, sind therapeutische Lösungen erforderlich um Curcumin besser nutzen zu können. Aus diesem Grund wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit die Wirkung von geringen Mengen Curcumin, die allein keine Effekte zur Folge haben, in Zusammenwirkung mit Licht untersucht. Es wurde gezeigt, dass bereits Konzentrationen von 0,2-1 µg/ml in Keratinozyten die Proliferation hemmen, wenn sie mit UVA- oder sichtbarer Licht-Bestrahlung kombiniert werden. Desweiteren wurde belegt, dass diese Behandlung Apoptose in HaCaT-Zellen induziert, wobei der mitochondriale Apoptoseapparat aktiviert wird. Dies belegen die Freisetzung von Cytochrom c und die frühe Spaltung der Caspase-9 wohingegen Caspase-8 zeitverzögert aktiviert wurde. Weiterhin wurde dargelegt, dass Erk1/2, PKB/Akt und PKC durch Curcumin/Licht gehemmt werden, wohingegen p38 durch diese Behandlung eine Aktivierung erfährt. Zusätzlich ergab sich ein inhibierender Einfluss auf den EGF-Rezeptor, einem “upstream”-Regulator all dieser Kinasen, und den Transkriptionsfaktor NF-kappaB. Bei in vivo-Studien an immundefizienten Mäusen mit A431-Xenografts hatte eine Behandlung mit i.p. verabreichtem Curcumin und anschließender Bestrahlung mit sichtbarem Licht einen signifikanten inhibitorischen Effekt auf das Tumorwachstum zur Folge. In diesen Tumoren fand eine Reduktion der Ki-67-Expression sowie eine Induktion von „apoptotic bodies“ statt. Western Blot-Analysen bestätigten die Apoptoseinduktion durch eine verstärkte Aktivierung der Caspase-9. Zusätzlich zeigte sich auch eine Hemmung von Erk1/2 sowie EGF-R nach beschriebener Behandlung in den Tumoren. Die Wirkungsweise des Curcumins in Kombination mit Licht in vitro wie auch in vivo weisen auf einen neuen therapeutischen Ansatz einer photodynamischen Therapie hin. Dabei kann durch die Verwendung von sichtbarem Licht auf den Einsatz der karzinogenen UV-Bestrahlung, wie sie in üblichen Phototherapien angewandt wird, verzichtet werden.
Neuronale Repräsentation intrinsischer cochleärer Signale im Colliculus inferior der Wüstenrennmaus
(2008)
Die vorliegende Arbeit untersucht die neuronale Repräsentation von cochleären Verzerrungsprodukten im auditorischen Mittelhirn der Wüstenrennmaus. Die hohe Sensitivität und die gute Frequenzauflösung des Hörorgans der Säugetiere basiert auf einer aktiven mechanischen Verstärkung der schallinduzierten Basilarmembranschwingung im Innenohr. Die äußeren Haarsinneszellen, die während des Transduktionsprozesses zyklisch ihre Länge ändern und dabei zusätzliche Schwingungsenergie in das System zurückführen, sind der zugrunde liegende Motor des aktiven cochleären Verstärkers. Die stark nichtlinearen Eigenschaften dieses Verstärkers führen allerdings bei gleichzeitiger Verstärkung mehrerer Frequenzkomponenten zur Generierung von Kombinationsschwingungen, welche im Ursprungssignal nicht vorhanden sind. Wird das Ohr beispielsweise durch zwei Töne mit den Frequenzen f1 und f2 stimuliert (f1<f2), so entstehen verschiedene Kombinationsschwingungen, deren prominenteste das quadratische (f2-f1) und das cubische (2 f1-f2) Verzerrungsprodukt sind. Diese Verzerrungen des Ursprungssignals breiten sich von ihrem Entstehungsort im Innenohr, dem Überlappungsbereich der Stimuluswanderwellen, im Flüssigkeitsraum der Cochlea aus und werden über das Mittelohr in den Gehörgang übertragen. Im Gehörgang sind sie mit Hilfe eines sensitiven Mikrophons als otoakustische Emissionen (DPOAE - distortion product otoacoustic emissions) messbar. Zusätzlich bilden sie an ihrem Resonanzort auf der Basilarmembran, vergleichbar mit einem externen Stimuluston gleicher Frequenz, eine eigene Wanderwelle aus und aktivieren den Transduktionsprozess. Die neuronalen Korrelate der cochleären Verzerrungsprodukte sind auf verschiedenen Stationen der Hörbahn messbar und cochleäre Verzerrungsprodukte können als separate Töne wahrgenommen werden. In der vorliegenden Arbeit wurden die neuronalen Korrelate und otoakustischen Emissionen von cochleären Verzerrungsprodukten erstmals simultan bestimmt. Durch den direkten Vergleich der neuronalen Aktivität mit der peripheren Emissionsmessung sollen eventuelle zentralnervöse Veränderungen der Repräsentation der cochleären Verzerrungsprodukte untersucht werden. Dazu wurde die elektrische Aktivität von 91 Neuronen des Colliculus inferior der Wüstenrennmaus während der Stimulation durch zwei hochfrequente Stimulustöne gemessen. Die Frequenzen der Stimulustöne waren so gewählt, dass die Frequenz eines, durch sie evozierten Verzerrungsproduktes, mit der charakteristischen Frequenz des jeweiligen Neurons übereinstimmte. In 95 % aller Messungen konnte eine robuste neuronale Aktivität während Zweitonstimulation gemessen werden, die sich auf die Stimulation durch ein spezifisches cochleäres Verzerrungsprodukt zurückführen lässt. Bei einem Teil der Versuche wurden die Verzerrungsprodukte durch direkte intracochleäre Auslöschung mit einem dritten Tonstimulus eindeutig als Quelle der neuronalen Aktivität bestätigt. Für Verzerrungsproduktfrequenzen oberhalb 1,3 kHz lassen sich die Antworten der Neurone im schwellennahen Bereich gut mit den simultan im Gehörgang bestimmten DPOAE-Pegeln erklären, was einen engen Zusammenhang zwischen intracochleärem Verzerrungsproduktpegel und DPOAE-Pegel nahe legt. Bei höheren Stimuluspegeln konnten die maximalen neuronalen Antworten auf den intracochleären Verzerrungsproduktstimulus signifikant von der Einzeltonantwort abweichen, wobei sowohl eine Erhöhung als auch eine Reduktion der Maximalantwort möglich war. Ein inhibitorischer bzw. verstärkender Einfluss der Stimulustöne auf die neuronale Verzerrungsproduktantwort wird als mögliche Ursache der Unterschiede diskutiert. Für Verzerrungsproduktfrequenzen unterhalb 1,3 kHz wurde ein deutlicher Unterschied zwischen dem intracochleären Verzerrungsproduktpegel und dem im Gehörgang gemessenen Emissionspegel deutlich. Ein Teil der getesteten tieffrequenten Neurone antwortete während Zweitonstimulation bereits für Stimuluspegel, die unterhalb der Reintonschwelle des Neurons lagen. Eine frequenzspezifische Verschlechterung der Mittelohrübertragungsleistung bei tiefen Frequenzen wird als mögliche Ursache für die unterschwelligen Antworten der Neurone diskutiert. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass cochleäre Verzerrungsprodukte einen substanziellen Anteil an der neuronalen Repräsentation von komplexen Stimuli haben können. Im Besonderen machen die vorgestellten Daten deutlich, dass die neuronalen Repräsentation der Grundfrequenz eines komplexen Klangs wesentlich von cochleären Verzerrungsprodukten beeinflusst sein kann. Dies bedeutet, dass bereits im Innenohr Tonhöheninformation extrahiert werden kann und damit die Relevanz in der Literatur diskutierter neuronaler Mechanismen zur Berechnung von Tonhöhe relativiert wird.
Ziel der Arbeit war die Analyse von langen eukaryotischen Signalpeptiden, mit einer Länge von mindestens 40 Aminosäuren, und ihre Diskriminierung zu kurzen SP. Signalpeptide sind notwendig, um die im Cytosol translatierten Proteine zum Ort ihrer Funktion zu dirigieren. Sie spielen dadurch eine fundamentale Rolle bei der Entwicklung von Zellen. Signalpeptide weisen keine Sequenzhomologie, aber einen typischen, in drei Regionen gegliederten Aufbau (n-, h-, c-Region) auf. In den letzten Jahren wurden zunehmend Beispiele von Signalpeptiden gefunden, die neben dem Targeting zum endoplasmatischen Retikulum weitere Post-Targeting-Funktionen aufweisen. Auffällig ist hier die besondere Länge der Signalpeptide. Für die Analyse dieser langen Signalpeptide standen bis jetzt keine gezielt entwickelten Vorhersageprogramme zur Verfügung. Im Rahmen dieser Arbeit wurde diese Gruppe langer Signalpeptide untersucht und ein Modell zu deren interner Organisation entwickelt. Das entwickelte „NtraC“-Modell erweitert etablierte sequenzbasierte Ansätze für kurze SP um eine Sekundärstruktur-motivierte Perspektive für lange Sinalpeptide. Zuerst wird dabei ein Übergangsbereich (transition area, N„tra“C), der potentiell β-Turn bildende Aminosäuren enthält, identifiziert. Dieser dient im Modell zur Zerlegung des SP in zwei hinsichtlich ihrer Funktion unabhängige Domänen: eine N-terminale N-Domäne (‚N’traC) und eine C-terminale C-Domäne (Ntra‚C’). Diese mit bekannten Vorhersageprogrammen nicht identifizierbaren „kryptischen“ Domänen innerhalb der Signalpeptid-Sequenz können unterschiedliche Targeting-Kapazitäten aufweisen und entsprechen für sich genommen eigenständigen Protein-Targeting-Signalen. Im Fall einer ER-Targeting Kapazität z.B. weist eine Domäne für sich genommen eine n-, h-, und c-Region auf. 63% aller Vertebrata-Signalpeptide entsprechen der in dieser Arbeit vorgeschlagenen NtraC-Organisation. Eine basierend auf dem NtraC-Modell vorgeschlagene Architektur für die langen Signalpeptide von shrew-1 (43 Aminosäuren), DCBD2 (66 Aminosäuren) und RGMA (47 Aminosäuren) wurde vom Autor selbst in vitro überprüft. Für alle drei Proteine wurden eine N-Domäne mit mitochondrialer Targeting-Funktion und eine C-Domäne mit Signalpeptid-Funktion vorhergesagt. Die langen Signalpeptide der Proteine wurden bisher als reine ER-Targeting-Signale betrachtet. Die vorliegende Studie zeigt jedoch, dass in diesen langen Signalpeptiden multiple Targetingsignale kodiert sind. Die ER-Targeting-Kapazität der C-Domänen wurde durch SEAP-Assays überprüft, die mTP-Funktion der N-Domäne durch biochemische Aufreinigung von Mitochondrien. Die in silico-Vorhersagen konnten in vollem Umfang für alle drei Proteine in vitro bestätigt werden. Eine Untersuchung der semantischen Wolke aller Proteine mit NtraC-organisiertem Signalpeptid zeigte, dass eine NtraC-Organisation in mehr als 50% der Fälle im Zusammenhang mit Typ-I Transmembranproteinen auftritt. Auch die Proteine der hier experimentell untersuchten Signalpeptide von shrew-1, DCBD2, RGMA sind Typ-I Transmembranproteine. Des Weiteren weisen 15% aller langen Vertebrata-Signalpeptide eine Domänen-Kombination analog zu shrew-1, DCBD2 und RGMA auf. Der gefundene analoge Aufbau der langen Signalpeptide könnte somit funktionelle Gruppen von Proteinen zusammenführen, die bisher anderweitig nicht gruppiert werden konnten. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass bakterielle Autotransporter Gram-negativer Bakterien in Variation ebenfalls eine NtraC-Organisation in ihren Signalpeptiden aufweisen. Gleiches konnte für Gruppen langer viraler Signalpeptide gezeigt werden. Das NtraC-Modell ist somit nicht auf Vertebrata-Signalpeptide beschränkt. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Modell zur Domänen-Architektur langer Signalpeptide entwickelt und erfolgreich angewendet: das NtraC-Modell. Ein Vorhersage-Algorithmus zur in silico-Untersuchung langer Signalpeptide wurde implementiert und in einer webbasierten Benutzeroberfläche öffentlich zugänglich gemacht. Das Modell trifft auf 63% der annotierten langen Vertebrata-Signalpeptide zu. Des Weiteren wurden, basierend auf dem NtraC-Modell, für die langen Signalpeptide von drei Proteinen (shrew-1, DCBD2, RGMA) in vitro-Versuche durchgeführt. Die erhaltenen in vitro-Ergebnisse unterstützen klar die These, dass lange Signalpeptide eine aus definierten Domänen bestehende Organisation aufweisen können.
In der vorliegenden Studie wurde der modulierende Einfluss von Acetylcholin auf die Frequenzabstimmung der Neurone im primären Hörkortex untersucht. Im primären Hörkortex von betäubten Wüstenrennmäusen (Meriones unguiculatus) wurden Einzel- und Mehrzellableitungen in Elektrodenpenetrationen senkrecht zur Kortexoberfläche durchgeführt und die Antworteigenschaften der Neurone vor und während der iontophoretischen Applikation von Acetylcholin, dem Agonisten Carbachol bzw. dem muskarinischen Antagonisten Atropin gemessen. Bei rund der Hälfte der gemessenen Neurone konnte ein cholinerger Einfluss auf die Frequenz-Antwortbereiche gemessen werden. Dabei können sich die Frequenz-Antwortbereiche unter dem Einfluss von Acetylcholin sowohl vergrößern als auch verkleinern, so dass für die gesamte Neuronenpopulation keine signifikante gerichtete Veränderung auftrat. Bereits bei den niedrigsten verwendeten Dosen von Acetylcholin waren maximale Effekte zu beobachten. Cholinerge Einflüsse in Form von Veränderungen der Frequenz-Abstimmkurven von Neuronen konnten in allen kortikalen Schichten gemessen werden. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit werden die neuronalen Antworten auf repetitive Schallereignisse, d.h. einfache zeitliche Muster, beschrieben. Für die Versuche wurden drei unterschiedlich zeitlich strukturierte Reize ausgewählt. Es handelte sich um sinusamplituden-modulierte (SAM) Reize, sowie repetitive Ton- und Rauschpulse. SAM Reize und repetitive Tonpulse ähnelten sich in ihrem Frequenzgehalt. Die repetitiven Ton- und Rauschpulse wiesen ein identisches zeitliches Muster auf, das sich von SAM Reizen unterschied. Es wurden sowohl die Wiederholfrequenzen, als auch an der besten Wiederholfrequenz die Schalldruckpegel systematisch verändert. Zusätzlich erfolgte die iontophoretische Applikation von Bicucullin (BIC), um den möglichen Einfluss schneller GABAerger Inhibition zu ermitteln. Während die neuronale Aktivitätsrate mit höheren Wiederholfrequenzen annähernd konstant blieb, war die Stärke der zeitlichen Synchronisation der neuronalen Aktivität von der jeweiligen Wiederholfrequenz des repetitiven Reizes abhängig. Die zeitliche Synchronisation der neuronalen Aktivität sank in der Mehrheit der Neurone mit steigender Wiederholfrequenz drastisch ab (Tiefpasscharakteristik) und nur in einem Bruchteil der Neurone fanden sich einzelne Wiederholfrequenzen, die eine maximale Synchronisation auslösten (Bandpasscharakteristik). Die kortikalen Neurone zeigten unabhängig vom benutzten Reiztyp ein gutes neuronales Folgeverhalten auf repetitive Schallreize bis zu Wiederholfrequenzen von 15 – 30 Hz, mit besten Wiederholfrequenzen von 5 -10 Hz. Unter dem Einfluss von BIC war eine deutliche Veränderung der neuronalen Aktivitätsrate zu erkennen. Diese hatte jedoch weder einen Effekt auf die Synchronizität, noch auf die Repräsentation der Reiztypen. Eine einfache Inhibition im auditorischen Kortex fällt damit als Erklärung für die gemessenen neuronalen Aktivitätsmuster aus. In der realen Umwelt können komplexe akustische Reize in sehr unterschiedlichen Schallintensitäten auftreten. Die reizsynchronisierte neuronale Aktivität erlaubt, ein zeitliches Muster innerhalb eines komplexen Reizes zu kodieren. Es wurde untersucht, inwieweit diese zeitliche Kodierung von der Schallintensität abhängt und inwieweit schnelle GABAerge Inhibition darauf einwirkt. Es fand sich kein Zusammenhang zwischen der allgemeinen neuronalen Aktivitätsrate oder der neuronalen Synchronizität in Abhängigkeit vom Schalldruckpegel. Allerdings konnte bei verschiedenen Neuronenpopulationen ein unterschiedliches Verhalten in der Synchronisation mit höheren Schalldruckpegeln bei Stimulation der Neurone mit SAM Reizen und repetitiven Tonpulsen festgestellt werden, das im Hinblick auf die sich verändernde Flankensteilheit bei höheren Schalldruckpegeln und den daraus resultierenden veränderten Interstimulusintervallen diskutiert wird. Die Ergebnisse aus den Experimenten mit BIC und variierenden Schalldruckpegeln zeigten im Mittel keinen Einfluss der kortikalen Inhibition auf die Abhängigkeit der neuronalen Aktivitätsrate und der Synchronisation vom Schalldruckpegel. Allerdings fanden sich im Einzelfall Änderungen in der Synchronisation auf SAM Reize unter BIC. Insgesamt scheint der Einfluss der kortikalen Inhibition auf Veränderungen der neuronalen Antwort im Zusammenhang mit variierenden Schalldruckpegeln gering bzw. nicht vorhanden zu sein.
Die Maus hat wie die meisten Säugetiere zwei Zapfenopsine, das S-Opsin (UV-empfindlich) und das M-Opsin (grün-empfindlich). Die Zapfen werden nach dem jeweils exprimierten Opsin S-Zapfen oder M-Zapfen genannt. Bei der Maus wird die Zapfenzahl embryonal festgelegt, aber das Opsin-Expressionsmuster entwickelt sich erst postnatal (Szel et al. 1998). In der ersten Postnatalwoche (PWo 1) exprimieren alle Zapfen über die gesamte Retina das S-Opsin. Ab PWo 2 kann das M-Opsin immunzytochemisch nachgewiesen werden. Eine Besonderheit der adulten Maus ist die Koexpression beider Opsine in vielen Zapfen (Dualpigmentzapfen; Lukats et al. 2005). Außer einer geringen Zahl "echter" S-Zapfen exprimieren alle Zapfen das M-Opsin entweder allein oder zusammen mit dem S-Opsin (Szel 1993, Applebury 2000, Haverkamp et al. 2005). Das adulte wildtypische Zapfenmuster besteht aus gegenläufigen dorso-ventralen Gradienten der S- und M-Zapfen (Szel 1993, Applebury 2000). Das M-Opsin wird stärker in der dorsalen Retina exprimiert und die Expression nimmt zur ventralen Retina ab. In der ventralen Retina exprimieren alle Zapfen das S-Opsin, in der dorsalen Retina ist die Zahl der S-Zapfen sehr gering. Das adulte Zapfenmuster entsteht durch einen Wechsel von S- zu M-Opsinexpression in vielen Zapfen. Die Expression der Opsine wird während der postnatalen Entwicklung durch den Schilddrüsenhormonrezeptor beta 2 (TRbeta2) reguliert. Ein Fehlen des TRbeta2 (TRbeta2 -/-) führt zum Verlust des M-Opsins und zur Expression des S-Opsins in allen Zapfen (Ng et al. 2001). Auch das Schilddrüsenhormon und der Retinsäurerezeptor gamma (RXRgamma) sind Regulatoren in der postnatalen Entwicklung der Opsinexpression (Roberts et al. 2005, 2006). Die Pax8 -/- Maus hat durch den Verlust des Pax8-Gens eine mißgebildete Schilddrüse, die kein Schilddrüsenhormon produzieren kann (Mansouri et al. 1998). In der vorliegenden Studie wurde die Auswirkung der postnatalen Hypothyreose von Pax8 -/- auf die Entwicklung des Auges und der Retina im Alter von PWo 3 untersucht. Die Ergebnisse von Pax8 -/- wurden mit Pax8 +/- und +/+ Wurfgeschwistern verglichen. Die Hypothyreose von Pax8 -/- wurde durch Messung der Schilddrüsenhormonwerte im Blut bestätigt. Die Augenparameter unterscheiden sich nicht zwischen Pax8 -/- und den Kontrolltieren. Auch die Entwicklung der Retina ist bei allen drei Pax8-Genotypen gleich. Pax8 -/- zeigt keine Veränderungen in der Schichtung der Retina sowie der Morphologie untersuchter Zelltypen. In allen drei Pax8-Genotypen konnten die Transkripte der S- und M-Opsine und des Stäbchenopsins nachgewiesen werden. Auch die Transkripte des TRbeta2, der Deiodinase 2 und der Deiodinase 3 wurden ermittelt. Anhand dieser Ergebnisse kann die Aussage gemacht werden, daß die Hypothyreose von Pax8 -/- keinen Einfluß auf die generelle postnatale Entwicklung des Auges und der Retina zeigt. Im Gegensatz dazu ist die Auswirkung der Hypothyreose auf die Ausprägung des S- und M-Zapfenmusters gravierend. Sie wurde durch Dichtezählungen der S- und M-Zapfen analysiert. Zunächst wurde das Zapfenmuster der wildtypischen Maus-Stämme C57, Sv129 und Pax8 +/+ untersucht. Alle drei Wildtypen zeigen im Alter von PWo 3 und PWo 22 (adult) ein vergleichbares Zapfenmuster mit gegenläufigem dorso-ventralem Gradienten der S- und M- Zapfen. Auch die heterozygote Pax8 +/- Maus zeigt das wildtypische Zapfenmuster. Pax8 -/- hingegen hat ein verändertes Zapfenmuster. Die S-Zapfendichten sind bei PWo 3 und PWo 22 über die gesamte Retina gleich, so daß kein Gradient ausgebildet ist. Die Veränderung im M-Zapfenmuster von Pax8 -/- ist bei PWo 3 deutlich zu sehen, während das adulte M-Zapfenmuster wieder wildtypisch erscheint, hier scheint also eine verzögerte normale Entwicklung vorzuliegen. Durch eine Substitution mit Thyroxin (T4) ab P2 kann bei Pax8 -/- das wildtypische Zapfenmuster erzeugt werden, somit ist das Schilddrüsenhormon für die Ausprägung des Zapfenmusters während der postnatalen Entwicklung verantwortlich. Weitere Versuche zeigen, daß die Opsinexpression während des ganzen Lebens plastisch und Schilddrüsenhormon-abhängig ist. Eine Unterbrechung der T4-Substitution ab PWo 4 führt bei Pax8 -/- zum Rückgang auf das hypothyreote Zapfenmuster. Auch wenn Pax8 -/- erst im adultem Alter mit T4 substituiert wird, ist eine Veränderung des Zapfenmusters sichtbar. Eine künstlich durch Methimazol erzeugte Hypothyreose in adulten C57-Mäuse führt ebenfalls zu einer Veränderung des Zapfenmusters, das dann mit dem Zapfenmuster von Pax8 -/- identisch ist. Zusammenfassend erlauben die Ergebnisse den Schluß, daß das Schilddrüsenhormon über die Expression der Opsine die Ausprägung des Zapfenmusters sowohl während der Entwicklung reguliert, als auch für eine Aufrechterhaltung des Zapfenmusters während des ganzen Lebens benötigt wird. Dieser Befund hat auch klinische Relevanz. Die nicht seltene Neugeborenen-Hypothyreose beim Menschen wird heute durch eine direkt nach der Geburt beginnende lebenslange Thyroxin-Substitution therapiert. Nach unseren Befunden bei der Maus könnte dies auch für die Aufrechterhaltung einer normalen Zapfenopsin-Expression und damit eines normalen Sehvermögens notwendig sein.
H. salinarum ist einer von zwei archaealen Organismen, die synchronisiert werden können. Die Synchronisations-Methode konnte in dieser Arbeit optimiert werden. Nahezu 100 % aller Zellen teilen sich in einer Zeitspanne von einem Viertel der Generationszeit. Die Analyse zweier aufeinanderfolgender Zellzyklen zeigte, dass die Zellen sich auch im zweiten Zyklus synchron teilen. Die Zellsynchronisation wurde angewendet, um zellzyklusabhängige Vorgänge in H. salinarum auf unterschiedlichen Ebenen zu charakterisieren. Mittels DNA-Mikroarrays wurden Transkriptomänderungen untersucht. Nur 87 Gene zeigten zellzyklusspezifische Regulationen. Dies entspricht 3 % aller vorhergesagten offenen Leserahmen und ist somit im Vergleich zu allen anderen Organismen, deren Transkriptome untersucht wurden, deutlich geringer. Die Transkriptmengen von 15 ausgewählten Genen wurden mit Northern Blot Analysen verifiziert. Die regulierten Gene konnten in sieben Gruppen mit unterschiedlichen Transkriptprofilen eingeordnet werden. Gruppenspezifische DNA-Sequenzmotive wurden gefunden, von denen angenommen wird, dass sie in die zellzyklusspezifische Transkriptionsregulation involviert sind. Überraschenderweise wurden die meisten als Zellzyklusgene annotierten Gene konstitutiv transkribiert. Die Analyse zellzyklusabhängiger Proteomänderungen erfolgte mittels 2D-Gelelektrophorese. 1200 Proteine konnten reproduzierbar detektiert werden. Die meisten Proteine wurden konstitutiv exprimiert. Nur 30 Proteine zeigten eine zellzyklusabhängige Regulation. Dies entspricht 2,5 % der reproduzierbar detektierten Proteine. Es konnten unterschiedliche Expressionsprofile gefunden werden. Aus den Transkriptom- und Proteomanalysen folgt, dass auf Ebene der Genexpression nur wenige zellzyklusabhängige Regulationen existieren. Sekundäre Botenstoffe spielen eine wesentliche Rolle bei Signaltransduktionen und sind an Regulationen von Zellzyklen beteiligt. Eine Methode zur Messung intrazellulärer cAMP-Konzentration in H. salinarum konnte etabliert werden. Die basale cAMP-Konzentration von 200 µM in haloarchaealen Zellen ist bedeutend höher als die von Hefe. Synchrone Kulturen wurden auf die Oszillation des sekundären Botenstoffes hin untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Konzentration zellzyklusabhängig zweimal kurzfristig signifikant erhöht wird. Die cAMP-Konzentration steigt einmal vor und einmal direkt nach der Zellteilung an. cAMP könnte daher ein wichtiges Signal für das Fortschreiten des Zellzyklusses sein. Es konnte eine Methode zur Analyse der Replikation in H. salinarum entwickelt werden. Hierfür wurde das Basenanalogon BrdU und ein spezifischer Antikörper gegen dieses verwendet. Die Analyse synchroner Kulturen zeigte das überraschende Ergebnis, dass die Zellen ihre DNA während des gesamten Zellzyklusses zu replizieren scheinen. Vor allem die DNA-Synthese in synchronen Kulturen während der Teilungsphase der Zellen stellt einen völlig neuartigen Zellzyklusablauf dar. Für in vivo Analyse von Zellzyklusproteinen können diese mit GFP markiert und fluoreszenzmikroskopisch analysiert werden. Mit dieser Methode konnten wichtige zellzyklusabhängige Aspekte in anderen Arten aufgeklärt werden. Für einen GFP-Modellversuch wurde in dieser Arbeit ein Fusionsgen bestehend aus den offenen Leserahmen von bop (bacterio-opsin) und gfp (green fluorescent protein) erstellt. Die Expression des chromosomalen bop Gens und des plasmidkodierten bop-gfp Fusionsgens wurde mit Northern Blot Analysen nachgewiesen. Die Purpurmembranbiogenese wurde fluoreszenzmikroskopisch in lebenden H. salinarum Zellen untersucht. Es stellte sich heraus, dass die Bildung der Purpurmembran ca. 15 Stunden nach Eintritt der Zellen in die stationäre Wachstumsphase beginnt. Innerhalb der folgenden sieben Stunden stieg sowohl die Anzahl an Zellen mit fluoreszierenden Signalen als auch die durchschnittliche Anzahl an Signalen pro Zelle gleichmäßig an. Die Ergebnisse zeigen, dass GFP-Fusionsproteine in H. salinarum z. B. zur Charakterisierung von differentieller Genexpression verwendet werden können. Des Weiteren könnten sie für die Untersuchung zellzyklusabhängiger Proteinlokalisation und für die Analyse der intrazellulären Verteilung putativer Cytoskelettproteine eingesetzt werden.
Beta-Barrel-Membranproteine der Omp85-Familie besitzen essentielle Funktionen in der Lipidbiogenese und der Proteinintegration und -assemblierung in der äußeren Membran von Gram-negativen Bakterien. Auch in endosymbiotisch erworbenen Organellen der Eukaryoten übernahmen Vertreter dieser Proteinfamilie wichtige Rollen, wie bei der Translokation von Vorstufenproteinen durch die äußere Hüllmembran von Chloroplasten und der Assemblierung von Proteinkomplexen in der äußeren Hüllmembran von Mitochondrien. Eine phylogenetische Analyse der bekannten Vertreter dieser Proteinfamilie wies auf eine Aufspaltung der Omp85-Familie in zwei Hauptzweige hin. Während der Toc75-Zweig aus plastidären und cyanobakteriellen Omp85-Proteinen besteht, bilden mitochondrielle Proteine sowie die Omp85-Vertreter der Proteobakterien eine zweite Unterfamilie, den Sam50-Zweig. In dieser Arbeit wurden die elektrophysiologischen Eigenschaften von pro- und eukaryotischen Vertretern beider Unterfamilien verglichen. Zu diesem Zweck wurde ein elektrophysiologischer Messstand konstruiert, mit dem diese Kanalproteine mittels der Lipid-Bilayer-Technik untersucht werden konnten. Die Analyse der experimentellen Daten der verwendeten Omp85-Proteine zeigte deutliche Gemeinsamkeiten der gesamten Proteinfamilie hinsichtlich ihrer Kationenselektivität. Hingegen ergab ein Vergleich der Kanalleitwerte signifikante Unterschiede zwischen beiden Unterfamilien. So lagen die aus den Leitwerten berechneten Porendurchmesser bei den Mitgliedern des Toc75-Zweigs um das Zwei- bis Dreifache über den für die Vertreter des Sam50-Zweigs bestimmten Werten. Topologievorhersagen ergaben, dass die Mitglieder der Omp85-Familie aus zwei Domänen aufgebaut sind. Durch die Analyse der elektrophysiologischen Eigenschaften von Teilkonstrukten, die aufgrund dieser Vorhersagen erstellt wurden, konnte gezeigt werden, dass die C-terminale Domäne die Porenregion des beta-Barrel-Proteins bildet. Die elektrophysiologischen Eigenschaften der Omp85-Proteine werden allerdings durch die N-terminale Domäne moduliert. Aufgrund der in dieser Arbeit erzielten elektrophysiologischen Ergebnisse und unter Berücksichtigung der phylogenetischen Analyse der Omp85-Familie konnte eine Hypothese zur evolutionären Entwicklung dieser sehr alten Proteinfamilie aufgestellt werden.
Eine Reihe kurzer synthetischer Peptide, die auf verschiedenen Ebenen während des mehrstufigen Infektions-Prozesses HIV-1 hemmen konnten, wurden in unserer Gruppe über Phage-Display identifiziert. Diese Peptide hatten allerdings nur geringe Affinitäten zu gp120 und eine kurze Halbwertszeit. In der vorliegenden Arbeit wurden diese und andere HIV-1 „Entry“ hemmende Peptide über gentechnische Methoden in eukaryotischen Zellen exprimiert, um ihre Stabilität und antivirale Aktivität zu verbessern. Durch die angeknüpfte Multimerisierungsdomäne C4bp sind die therapeutischen Peptide groß genug, um von Zellen sekretiert zu werden. Die eukaryotisch sekretierten Multimere sind posttranslational modifiziert, besitzen eine höhere Stabilität und die Anzahl der funktionellen Valenzen ist erhöht. Außerdem bietet das System die Möglichkeit, auch Heteromultimere mit verschiedenen Teilstrukturen in einem Molekül zu kombinieren. Wir konnten zeigen, dass sich das C4bp-System zur Expression des Fusions-Inhibitorischen C46-Peptids in löslicher multimerer Form eignete, welches in monomerer Form nicht vollständig durch ER und den Golgi-Apparat geleitet und sekretiert werden konnte. Außerdem hatte multimeres C46 eine deutlich höhere Plasma-Halbwertszeit und wies eine höhere antivirale Aktivität gegenüber dem monomeren Peptid auf (Dervillez et al. 2006). In dieser Arbeit standen die hoch konservierten CD4i-Epitope von gp120, welche an die HIV Corezeptoren binden, als Target für die HIV-Inhibition im Mittelpunkt. Verschiedene Peptidliganden für diese Epitope, wie die zweite extrazelluläre Schleife und der N-Terminus des CCR5-Rezeptors, die sulfatierte CDR3-Domäne des E51-Antikörpers, sowie durch Phage Display gezielt selektionierte Peptide wurden in den C4bp-Expressionsvektor kloniert und nach Transfektion in 293T-Zellen als lösliche Multimere vom Überstand aufgereinigt und funktionell analysiert. Die Multimere waren sowohl in Protein-Protein-Interaktionsstudien als auch bei in vitro HIV-1 Neutralisationsversuchen funktionell aktiv. In den meisten Hemmversuchen war die HIV-1 Inhibition multimerer Peptide mindestens vergleichbar mit dem Fusionsinhibitor T20. Insbesondere im Hinblick auf eine in vivo Applikation ist zudem die verlängerte Halbwertszeit der Multimere im Plasma von Vorteil, da dadurch möglicherweise die Anzahl der Injektionen verringert werden könnte.