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Glutamat ist der häufigste Neurotransmitter im menschlichen Hirn. Die Konzentration des Glutamats in der extrazellulären Flüssigkeit wird durch Glutamat-Transporter (Sekundärtransporter) kontrolliert. Liegt es in zu hoher Konzentration im synaptischen Spalt vor, kommt es zur Schädigung von Nervenzellen, ein Prozess, der als Exzitotoxizität bezeichnet wird. Eine Fehlfunktion oder fehlerhafte Produktion der Glutamat-Transporter im zentralen Nervensystem wird bei verschiedenen Krankheiten, wie der amyotrophen Lateralsklerose, der Ischämie, der Epilepsie, der Schizophrenie und der Alzheimer-Krankheit vermutet. Ziel dieser Arbeit war die Funktions- und Strukturanalyse der Glutamat-Transporter GLT-1 aus Rattus norvegicus und GltP aus E. coli, um die Familie der Glutamat-Transporter und die Entstehung der mit diesen Transportern in Verbindung gebrachten Krankheiten besser zu verstehen. Um die für diese Analysen gebrauchten Mengen an Protein herzustellen, mussten die Proteine heterolog produziert werden, da sie in natürlichen Geweben nicht in ausreichender Menge vorkommen. In dieser Arbeit wurde Glutamat-Transporter GLT-1 aus Rattus norvegicus funktional mit dem Semliki Forest Virus Expressionssystem überproduziert. Dazu wurden verschiedene Vektorkonstrukte hergestellt. Die routinemäßige Überproduktion des Transporters wurde im 8 l - Maßstab durchgeführt. In Zellen, die für die Produktion von GLT-1 mit rekombinanten, aktiven SF-Viren infiziert wurden, konnte eine sehr hohe Aktivität des Glutamat-Transporters nachgewiesen werden. Die Menge des hergestellten GLT-1 wurde in Bindungsexperimenten mit (2S,4R)-4-Methylglutamat quantifiziert: jede Zelle enthielt 3,5 x 106 Transporter: 61,04 pmol GLT-1/mg Gesamtprotein. Das entspricht einer Ausbeute von etwa 2-3 mg/8 l Zellkultur. Die hier durchgeführte Überproduktion des GLT-1-Glutamat-Transporters ist die erste Überproduktion eines eukaryotischen Sekundärtransporters mit dem Semliki Forest Virus Expressionssystem, bei dem große Mengen an aktivem Protein hergestellt werden konnten. Zudem ist die Ausbeute an funktionalem GLT-1 mit 61 pmol/mg Gesamtprotein verglichen mit den in der Literatur vorliegenden Daten zur Überproduktion eukaryotischer sekundärer Transporter mit anderen Expressionssystemen die höchste, die bis dato erreicht werden konnte. Der größte Anteil des heterolog produzierten GLT-1 war glykosyliert. Die gelelektrophoretische Analyse des aufgereinigten Transporters ergab zwei Banden, die ein apparentes Molekulargewicht von etwa 70-75 kDa und etwa 53-58 kDa hatten. In einer Western-Blot-Analyse konnten beide Banden des GLT-1-Transporters mit einem anti-His-Antikörper und einem anti-GLT-1-Antikörper nachgewiesen werden. Durch Deglykosylierung mit PNGase F und einer Trennung beider Banden durch Lektin-Affinitätschromatographie konnte gezeigt werden, dass es sich bei der 70-75 kDa-Bande um die glykosylierte Form und bei der 53-58 kDa-Bande um die nicht glykosylierte Form des Glutamat-Transporters handelte. Es wurde gezeigt, dass zwischen der Aktivität des GLT-1 und dessen Glykosylierung kein Zusammenhang besteht. Denn beide Formen lagen als vollständige, funktionale Transporter vor und transportierten nach Rekonstitution in Liposomen Glutamat. Der prokaryotische Glutamat-Transporter GltP aus E. coli wurde in dem E. coli-Stamm C43 (DE3) überproduziert. Die Ausbeute war etwa 2 mg pro Liter Kultur. Die Funktionalität des Transporters nach Rekonstitution in Lipidvesikel wurde durch spezifische Aufnahme von Glutamat gezeigt. Für die Solubilisierung beider Transporter aus den Zellmembranen wurden verschiedene Detergentien getestet. GltP ließ sich am besten mit DM oder DDM aus der Membran extrahieren, für die Solubilisierung des GLT-1 wurde mit großer Effizienz DDM oder CYMAL-7 eingesetzt. GltP und GLT-1 wurden mit einer Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie in großer Menge und hoher Reinheit angereichert werden. Die Aufreinigungsprozedur beeinträchtigte nicht die Funktionalität des prokaryotischen GltP. Bei dem eukaryotischen Transporter GLT-1 war nach der Ni2+-NTA-Säule keine Transportaktivität mehr messbar. Durch Zusatz von Asolectin in den Wasch- und Elutionspuffern während der Aufreinigung konnte die Funktionalität des Transporters jedoch erhalten werden. Aufreinigungen mit anderen Lipiden unter anderem in Kombination mit Cholesterin lieferten einen Glutamat-Transporter, der in seiner Konformation stabilisiert, jedoch nach Rekonstitution nicht aktiv war. Eine weitere Steigerung der Ausbeute an aktivem GLT-1 konnte durch den Einsatz von Reduktionsmitteln, wie DTT oder b-Mercaptoethanol, die die Aggregation des Transporters verhinderten, erreicht werden. GltP katalysiert den elektrogenen Transport von Glutamat bzw. Aspartat unter Symport von mindestens zwei Protonen. GLT-1 transportiert ein Molekül Glutamat zusammen mit drei Na+-Ionen und einem Proton im Austausch gegen ein K+-Ion. Durch Transportmessungen konnte der hochspezifische Glutamat-Transport der aufgereinigten Transporter belegt werden. Der Glutamat-Transport des in Liposomen rekonstituierten GltP zeigte eine klare Abhängigkeit von einem anliegenden Protonengradienten. Aufgereinigtes und rekonstituiertes GLT-1 transportierte nur Aspartat bzw. Glutamat, wenn ein Na+ und ein K+-Gradient vorhanden waren. Die Aspartat- bzw. Glutamat-Aufnahme konnte bei beiden Transportern durch den kompetitiven nichttransportablen Inhibitor (2S,4R)-4-Methylglutamat blockiert werden. Der Assoziationsgrad der Glutamat-Transporter GltP und GLT-1 und das Gleichwicht zwischen den verschiedenen oligomeren Zuständen wurde in dieser Arbeit eingehend mit biochemischen Methoden untersucht: 1. „Cross-linking“-Studien, 2. Blaue Nativgelelektrophorese, 3. Analytische Ultrazentrifugation, 4. Laserlichtstreuung, 5. Gelfiltrationschromatographie. Die dabei erhaltenen Ergebnisse bewiesen eine tetramere Assoziierung beider Proteine. Die Gelfiltrationsexperimente zeigten, dass die Transporter in Detergenzlösung in unterschiedlichen Assoziationsgraden vorliegen. Das Gleichgewicht zwischen den oligomeren Formen war reversibel und abhängig von der Art und Konzentration des Detergenz, der Proteinkonzentration und der Temperatur. Zur Untersuchung der Struktur der Glutamat-Transporter wurden vor allem mit GltP zahlreiche 2D-Kristallisationsexperimente durchgeführt. Trotz Variation aller denkbar möglichen Parameter konnten keine Kristalle erhalten werden. Das beste Ergebnis war ein guter Einbau des Proteins in Lipidvesikel (etwa 80%). Da keine Kristalle erhalten wurden, wurde für beide Proteine eine Einzelpartikelanalyse durchgeführt. Dabei wurde nach zweidimensionaler Alignierung und Klassifizierung die „random conical tilt“-Methode angewendet. Die daraus resultierenden dreidimensionalen Dichtekarten des GltP und GLT-1 waren sehr ähnlich und wiesen vier nicht exakt symmetrische Massen in annähernd quadratischer Anordnung auf. Die Auflösung war 26 Å bzw. 36 Å. Die Größe der Einzelpartikel (für GltP: Höhe 37 Å, Breite 75 Å bzw. 86 Å, Länge 100 Å). ihre annähernd quadratische Anordnung und ihre Symmetrie lassen vermuten, dass es sich dabei um Tetramere der Glutamat-Transporter handelt, die aus zwei nicht symmetrischen Dimeren zusammengesetzt sind. Die hier präsentierten Daten sind die ersten zur dreidimensionalen Struktur von Glutamat-Transportern. Schließlich wurde nachgewiesen, dass der in BHK-Zellen heterolog exprimierte Glutamat-Transporter GLT-1 vorwiegend in „lipid rafts“ lokalisiert ist. Die Größe der „rafts“, die anhand der Größe der „Proteininseln“ in Gefrierbrüchen bestimmt wurde, war etwa 200 nm im Durchmesser. Die „GLT-1-Inseln“ bzw. „lipid rafts“ konnten durch das teilweise Entfernen von Cholesterin aus der Membran zerstört werden. Damit ging eine Reduktion der Glutamat-Transporter-Aktivität von etwa 20% einher. Es ist das erste Mal, dass „lipid rafts“ durch die natürliche Assemblierung von Proteinen mit Hilfe von Gefrierbruchanalysen und Elektronenmikroskopie beobachtet wurden.
In der vorliegenden Arbeit wurden zehn Substanzen, die im Rahmen des Projekts INTAFERE analytisch in verschiedenen Gewässersystemen des Hessischen Rieds nachgewiesen werden konnten, ökotoxikologisch charakterisiert. Neben der Bestimmung der Akut- und der chronischen Toxizität wurde auch das endokrine Potential mit Hilfe eines rekombinanten Hefe-Assays ermittelt.Die akute Toxizität zeigt zwischen den verschiedenen Substanzen große Differenzen. Die drei Organophosphate TCPP, TBEP und TCEP zeigen selbst bei hohen Konzentrationen keine oder nur sehr geringe Effekte, während 4-NP, 4-t-OP, BPA, TDCPP, AHTN und Terbutryn mit LC50-Werten bis zu 5 mg/l eine höhere Toxizität besitzen.Im Hefe-Assay kann in mehreren Versuchswiederholungen das östrogene Potential von 4-NP (MW: 6,71x10-6 M), 4-t-OP (MW: 7,16x10-6 M) und BPA (MW: 4,88x10-6 M), sowie die antiandrogene Wirkung des Bisphenols (5,29x10-5 M) bestätigt werden. Im Gegensatz dazu können im Yeast Antiestrogen Screen zum ersten Mal Hinweise auf die antiöstrogene Wirkung von TCPP (MW: 6,86x10-5 M), Terbutryn (MW: 3,99x10-5 M), TDCPP (MW: 2,65x10-6 M) und TBP (MW: 2,28x10-5 M) aufgezeigt werden.TBP und TDCPP führen auch in der chronischen Exposition bei Potamopyrgus antipodarum zu einer Reduktion in der Embryonenzahl (mehrfach beobachtete NOEC beider Substanzen: 6,25 mg/kg), ein Effekt, der zunächst nicht von einer toxischen Wirkung unterschieden werden kann. Allerdings scheint sich ein antiöstrogener Wirkmechanismus auf die Schnecken bei den Versuchen zur Mischtoxizität zu bestätigen, da die gleichzeitige Exposition gegenüber BPA und 4-tOP zu einer geringfügigen Aufhebung des Effekts führt. Potamopyrgus reagiert ebenfalls mit einer Reduktion der Embryonenzahl bei der Exposition gegenüber AHTN (mehrfach beobachtete NOEC: 2 mg/kg), zeigt sich aber insensitiv gegenüber der Belastung mit Terbutryn.Die Exposition von Chironomus riparius gegenüber den verschiedenen Substanzen führt bis auf eine Ausnahme zu keinen signifikanten substanzbedingten Beeinträchtigungen. Einzig das s-Triazin Terbutryn verursacht eine hohe Mortalität mit einer NOEC (28 d) von 250 μg/kg. Eine Toxizität auf den Anneliden Lumbriculus variegatus zeigt sich lediglich bei derExposition gegenüber BPA (NOEC: 10 mg/kg; Biomasse, 28 d) und 4-NP (EC10: 6,88 mg/kg; 95% KI: 3,97-11,9; Reproduktion, 28 d). Die durchgeführten Versuche zur Toxizität von Mischungen zeigen eine größere Gefährdung auf als bei Vorliegen der Einzelsubstanzen in Konzentrationen unterhalb ihres Schwellenwertes zu vermuten wäre. Allerdings lassen sich die mit dem Hefe-Assay erzielten Ergebnisse aufgrund großer Variabilitäten zwischen den einzelnen Versuchswiederholungen nicht immer eindeutig mit Hilfe des additiven oder des unabhängigen Modells beschreiben, zeigen dabei jedoch trotzdem ein gegenüber den Einzelsubstanzergebnissen verändertes Risiko auf. Um diesem in der Risikobewertung Rechnung zu tragen, wird ein Verfahrensvorschlag entwickelt, in dem durch zusätzliche Sicherheitsfaktoren für PNECs ein Überschreiten des risikoanzeigenden Werts von 1 des PEC/PNEC-Quotienten einer Mischung verhindert werden kann.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Vegetation der Savannenlandschaften der Sahelzone von Burkina Faso analysiert. Diese semiaride bis aride Region, die seit einigen Jahrzehnten von Landdegradation betroffen ist, ist als Untersuchungsgebiet u.a. deshalb besonders interessant, weil sie an einem Nutzungsübergang zwischen sesshafter Landwirtschaft und traditionell nomadischer Viehwirtschaft liegt. Im Vordergrund stand bei der Vegetationsanalyse ihre Klassifikation, die Frage nach der floristischen Struktur sowie dem aktuellen Zustand der Vegetation. Zu Beginn der Feldarbeiten wurde das Untersuchungsgebiet, das einen Niederschlagsgradienten von rund 200 mm umfasst, in geomorphologische Landschaftseinheiten (Inselberge, glacis, Niederungen, mares, Dünenzüge) stratifiziert. Innerhalb dieser Einheiten erfolgte die Vegetationsaufnahme mit Hilfe pflanzensoziologischer Aufnahmen. Die Arten der Gehölz- und Krautschicht wurden getrennt behandelt. Die Vegetationsaufnahmen wurden durch Strukturprofiltransekte in der brousse tigrée und Bodenuntersuchungen ergänzt. Auf verschiedenen Skalenebenen wurden die verschiedenen Vegetationsgesellschaften detailliert beschrieben und zu Standortfaktoren in Beziehung gesetzt. Außerdem wurden Vegetationsprofile zur Veranschaulichung der räumlichen Struktur der Vegetation abgeleitet. Bei der Analyse kamen auch computergestützte Methoden und statistische Verfahren (Tests der absichernden Statistik, Berechnung verschiedener Diversitätsindices, Ordinationsverfahren, numerische Klassifikation) zum Einsatz, um die Interpretation der Vegetationsstruktur zu unterstützen. Rund 320 Gefäßpflanzensippen aus 65 Familien konnten sicher bestimmt werden. Die artenreichste Familie sind die Poaceen. Insgesamt können 20 Gesellschaften der Gehölzschicht sowie 22 Gesellschaften der Krautschicht klassifiziert werden, die zur Mehrzahl weiter in Untereinheiten gegliedert sind. Innerhalb jeder Landschaftseinheit werden die Gesellschaften der Gehölzschicht, anschließend diejenigen der Krautschicht, vorgestellt. In der Regel sind sie in ihrer Verbreitung auf jeweils eine Landschaftseinheit beschränkt. Vor allem die Gesellschaften des glacis und der Niederungen besiedeln auch Habitate in Landschaftseinheiten außerhalb ihres Schwerpunktes. Daraus werden Schlüsse zum Ausbreitungsverhalten gezogen. In keinem Fall sind Einheiten der Krautschicht und der Gehölzschicht ausschließlich miteinander kombiniert; vielmehr sind Einheiten der Krautschicht jeweils mit mehreren Einheiten der Gehölzschicht kombiniert, was ihren selbständigen Charakter betont. Zehn Einheiten der Krautschicht sind überwiegend oder völlig gehölzfrei. Eine floristische Verwandtschaft besteht vor allem zwischen den Landschaftseinheiten glacis und Dünenzügen sowie zwischen mares, Niederungen und Dünenzügen; die Inselberge unterscheiden sich deutlich. Die Gehölzvegetation der Inselberge ist in Abhängigkeit von der menschlichen Nutzung in fünf Gesellschaften gegliedert. Während die Commiphora africana-Gesellschaft für wenig beeinflusste Bereiche typisch ist, hat die Combretum micranthum-Fragmentgesellschaft ihren Verbreitungsschwerpunkt in den intensiv genutzten Bereichen. Die Acacia raddiana-Zentralgesellschaft ist an den Unterhängen vertreten. Die Krautschicht der Inselberge gliedert sich in sechs, relativ artenreiche Gesellschaften mit Untereinheiten. Sie stellen zum Teil lokale Besonderheiten dar. Das räumliche Muster der Einheiten der Brachiaria lata-Gesellschaft lässt eine Abhängigkeit von der Art der Beweidung erkennen. Die Vegetation der Sandrampen wird oftmals von Einheiten gebildet, die ihren Verbreitungsschwerpunkt auf den Dünenzügen haben. Die Gehölzvegetation des glacis ist in drei relativ artenarme Gesellschaften gegliedert, die in Abhängigkeit der Lage zum lokalen Vorfluter zoniert und auch über das Untersuchungsgebiet hinaus weit verbreitet sind. Weite Bereiche des glacis sind völlig gehölzfrei. Die häufigste Gesellschaft ist die Acacia raddiana-Zentralgesellschaft. Die Ordination der Daten unterstützt die Klassifikation und zeigt Übergänge zwischen den Einheiten sowie Beziehungen zu den Standortparametern auf. Die Krautvegetation der glacis-Flächen ist relativ einheitlich; es gibt insgesamt nur zwei Gesellschaften. Der Anteil an Ruderalarten, Arten mit Pioniercharakter und solchen, die ihren Verbreitungsschwerpunkt auf Dünenzügen haben, ist relativ hoch. Bedeutendste Einheit ist die Tribulus terrestris-Untereinheit der Schoenefeldia gracilis-Gesellschaft, die eine weite ökologische Amplitude besitzt. Vor allem zu den Krautgesellschaften der Niederungen bestehen enge floristische und räumliche Beziehungen. Die krautigen Arten des glacis haben eine weite ökologische Amplitude. Es bestehen floristische Beziehungen zu Vegetationseinheiten der Sahara. Die Vegetation der mares und Niederungen hat die höchste β-Diversität. Die Gehölzvegetation der Niederungen ist in Abhängigkeit der Überflutungsdauer und -höhe zoniert und relativ struktur- und artenreich. In Galeriewäldern kommen sudanische Gehölzarten vor. Während von Viehherden stark frequentierte mares niedrige Gehölzdeckungen aufweisen oder komplett gehölzfrei sind, ist die Gehölzdeckung an den Ufern nur schwach besuchter mares geschlossen. Dies gilt auch für die artenreiche Krautvegetation. Insgesamt ist die Gehölzvegetation der Niederungen und mares in acht Gesellschaften gegliedert; die einzelnen Einheiten zeigen Übergänge miteinander. Die Krautvegetation der Niederungen enthält ebenfalls sudanische Arten. Sie lässt sich in drei Gesellschaften gliedern, die z.T. nur ein kleines Verbreitungsgebiet haben. Einige Uferabschnitte sind stark degradiert und vegetationslos. Die oftmals röhrichtartige Krautvegetation der mares ist ebenfalls in Abhängigkeit der Überflutungshöhe gegliedert, allerdings kommen an den einzelnen mares teilweise unterschiedliche Einheiten vor. Die Melochia corchorifolia-Gesellschaft steht im Mittelpunkt der Krautvegetation der mares, während die Brachiaria mutica-Gesellschaft für die nicht oder nur wenig überfluteten Bereiche typisch ist. Die Gehölzvegetation der Dünenzüge lässt sich im Untersuchungsgebiet in neun Gesellschaften gliedern. Diese gruppieren sich in einem artenreichen Block wenig beeinflusster Bereiche und in einem relativ artenarmen Block intensiv genutzter Dünenabschnitte. Bestände, die zur Pterocarpus lucens-Gesellschaft gestellt werden, bilden auf abgelegenen Dünenzügen kleine Wäldchen. In diese Gesellschaft werden auch die Bestände der brousse tigrée eingegliedert. Es sind in der Region nur noch wenige Flächen mit intakter brousse tigrée vorhanden. Anhand von zwei Strukturprofiltransekten wird ihre floristische und räumliche Struktur mit vier Zonen veranschaulicht. Pterocarpus lucens und Combretum micranthum sind die beiden dominanten Gehölzarten. Im Untersuchungsgebiet ist die Combretum glutinosum-Zentralgesellschaft weit verbreitet. Durch zwei Ordinationsdiagramme wird der ökologische Schwerpunkt wichtiger Dünenarten aufgezeigt. Die numerische Klassifikation lässt sich gut mit der manuellen Klassifikation in Übereinstimmung bringen. Die Krautvegetation der Dünen ist in sieben Gesellschaften mit vielen, z.T. relativ artenarmen Untereinheiten gegliedert, deren ökologische Bindung aufgrund eines starken, nivellierenden Beweidungseinflusses nicht immer geklärt werden kann. Es dominieren annuelle Arten; viele der Arten kommen in anderer Artenkombination auch in der Sudanzone vor. Daneben zeigt sich eine floristische Verwandtschaft zur Sahara. Unter Bäumen wächst die Achyranthes aspera-Gesellschaft. Krauteinheiten, die in anderen Landschaftseinheiten ihren Verbreitungsschwerpunkt haben, sind auf den Dünenzügen ebenfalls vorhanden, z.B. die Enteropogon prieurii-Gesellschaft der Inselberge und die Schoenefeldia gracilis-Gesellschaft des glacis. Es ist keine floristische Differenzierung entlang des Niederschlagsgradienten erkennbar. Hirsefelder sind mit Kulturbaumparks bestanden. Die Acacia raddiana-Zentralgesellschaft gewinnt auch auf den Dünenzügen an Bedeutung. Die Ergebnisse werden in Beziehung zu den in der Literatur vorhandenen, oftmals auf formationskundlichen Kriterien beruhenden Klassifikationen in Beziehung gesetzt. Je nach verwendetem Verfahren und Distanzmaß liefert die numerische Klassifikation unterschiedliche Ergebnisse, die sich nur zum Teil mit der Klassifikation in Deckung bringen lassen. Durch die Betrachtung der aktuellen Verjüngung, aus den Ergebnissen und ihrer Diskussion werden Aussagen über die aktuelle Vegetationsdynamik abgeleitet. Aktuelle Strukturveränderungen der Vegetation sind mit einem Landnutzungswandel verbunden. In erster Linie handelt es sich um Degradation, für die Beispiele auch aus der Literatur gegeben werden. Auf den Inselbergen gehen artenreiche Bestände zurück, gleichzeitig wandern Arten von den glacis-Flächen her ein. Auf dem glacis sind einerseits eine Artenverarmung, andererseits eine Verbuschung tiefliegender Bereiche sowie eine floristische Homogenisierung vieler Flächen zu beobachten, letzteres gilt auch für die Dünenzüge. An den mares und Niederungen findet ebenfalls eine floristische Verarmung statt, sudanische Arten sterben wie auch auf den Dünenzügen aus. Klimaungunst und vor allem Überbeweidung als mögliche Ursachen für den Vegetationswandel werden diskutiert.
In der vorliegenden Arbeit wurde die zelluläre Verteilung der beiden Ekto-Nukleotidasen TNAP (gewebeunspezifische Form der alkalischen Phosphatase) und NTPDase2 (Nukleosidtriphosphatdiphosphohydrolase) in den embryonalen, postnatalen und adulten neurogenen Zonen des Mäusehirns untersucht.
• Mittels enzym- und immunhistochemischer Markierungen wurde die TNAP erstmals auf den Zellen der SVZ (subventrikuläre Zone) und des RMS (rostraler Migrationsstrom) nachgewiesen.
• Immunhistochemische Doppelfärbungen von Gewebeschnitten und von akut isolierten Zellen aus der SVZ adulter und postnataler (P15) Mäuse zeigten, dass die TNAP von allen drei Typen neuronaler Vorläuferzellen (Typ B-, C- und A-Zellen) der SVZ exprimiert wird.
• Enzymatische Markierungen verschiedener Embryonal- und Postnatalstadien (ab Embryonalstadium14, E14) ergaben, dass die TNAP schon im Stadium E 14 im Bereich der Seitenventrikel exprimiert wird:
o In den frühen Embryonalstadien lag die TNAP über die gesamte Gewebedicke, von der ventrikulären bis zur pialen Oberfläche vor.
o Im Laufe der weiteren Entwicklung war eine im Kortex beginnende und sich später bis in das Striatum ausweitende Reduktion der TNAP-Aktivität zu beobachten. Mit zunehmender Reifung des Gehirns wurde die Schicht der TNAP-positiven Zellen dünner und beschränkte sich schließlich auf die SVZ.
• Die NTPDase2 war erst im Zeitraum zwischen E18 und P2 nachweisbar. Sie war im Bereich der Seitenventrikel lokalisiert und auf die an die Ventrikel angrenzenden Zellen beschränkt. Im Laufe der weiteren Entwicklung wandern die NTPDase2-positiven Zellen offensichtlich in die SVZ ein und ab P14 waren sie zu hüllartigen Strukturen angeordnet, die eine Doppelmarkierung für TNAP und NTPDase2 aufwiesen und Gruppen DCX-positiver Zellen (Typ-A Zellen, Neuroblasten) umschlossen.
• Die Markierung mit dem Neuroblastenmarker DCX war bereits zum Stadium E14 möglich. In diesem Altersstadium wurden lediglich die Zellen im Bereich des Kortex gefärbt. Im Laufe der postnatalen Entwicklung verlagerten sich die DCX-positiven Zellen ihren Schwerpunkt in den Bereich der SVZ. Bereits ab P10 lagen in der SVZ Gruppen von DCX/TNAP-doppelpositiven Zellen vor, Anzeichen für eine Konzentrierung der Neurogenese auf die SVZ.
• Die Ausschaltung des TNAP-Gens (TNAP-Knockout-Mäuse) hatte keinen offensichtlichen Einfluss auf die Ausbildung der Seitenventrikel oder die Ausbildung und zelluläre Zusammensetzung der SVZ.
• In der zweiten wesentlichen neurogenen Zone des Säugerhirns, dem Gyrus dentatus des Hippokampus, konnte die TNAP nicht nachgewiesen werden, obwohl die dortigen Vorläuferzellen NTPDase2 exprimieren.
Die vorliegenden Daten belegen erstmals eine Assoziation der TNAP mit neuronalen Vorläuferzellen und erlauben zusammen mit den Markierungen für NTPDase2 und weitere zelluläre Marker neue Einsichten in die zelluläre Entwicklung der adulten SVZ. Darüber hinaus stützen sie die Vorstellung einer Beteilung purinerger Signalwege an der Steuerung der embryonalen, postnatalen und adulten Neurogenese.
Traditionell-morphologisch begründete Hypothesen zur Großphylogenie der Metazoa sind im Verlauf der letzten Jahre durch molekularbiologische Untersuchungen grundsätzlich in Frage gestellt worden. Die molekularbiologisch begründete Metazoen-Großphylogenie wird seit einem Übersichtsartikel von ADOUTTE et al. (2000) meist als „New Animal Phylogeny“ bezeichnet (kurz: NAP); sie beinhaltet eine Restrukturierung des Stammbaumes (kladogenetischer Aspekt) und die Infragestellung einer morphologischen Komplexitätssteigerung nach dem Schema acoelomat-pseudocoelomat-coelomat (anagenetischer Aspekt). Hinsichtlich der Kladogenese steht die Neueinteilung der Bilateria in drei Superphyla Deuterostomia, Ecdysozoa und Lophotrochozoa im Vordergrund; die Genealogie innerhalb dieser drei Großgruppen ist aber z.Z. relativ schlecht aufgelöst, so daß sich Vergleichsmöglichkeiten mit morphologischen Vorgängermodellen schnell erschöpfen. Aus diesem Grunde wird in vorliegender Arbeit der anagenetische Aspekt als Ausgangspunkt für eine umfassende morphologische Interpretation der molekularbiologischen Resultate gewählt. Momentan wird auf molekularsystematischer und vergleichend-entwicklungsgenetischer Basis davon ausgegangen, daß die frühesten Bilaterier eine acoelomate Organisation aufwiesen, von hier aus eine relativ komplexe, polymer-coelomate Organisation erwarben, welche dann aber in zahlreichen Bilaterierlinien sekundär reduziert wurde. Die ursprünglich acoelomate Organisation wird rezent nur durch eine sehr isolierte Linie, die Acoela (ggf. auch Nemertodermatida) vertreten, während alle anderen Bilaterier von einem polymer-coelomaten „Urbilaterier“ abstammen sollen. In vorliegender Arbeit wird die Auffassung vertreten, daß die morphologische Deutung eines solchen anagenetischen Szenarios am ehesten anhand der Hydroskelett-Theorie von W. F. GUTMANN (1972 et mult.), sowie späteren auf diesem Entwurf aufbauenden Arbeiten (insbesondere der Gallertoid-Hypothese, BONIK et al. 1976) möglich ist, d.h. auf konstruktionsmorphologischer Grundlage. Um den Nachweis einer weitgehenden Übereinstimmung von NAP und Gallertoid-Hydroskelett-Theorie zu führen, werden für 36 Metazoenbaupläne (4 Nonbilaterier, 32 Bilaterier) aktuelle molekularphylogenetische Befunde den jeweiligen konstruktionsmorphologischen Interpretationen gegenübergestellt. Für die vier Nonbilateria-Linien ergibt sich eine Vereinbarkeit auf kladogenetischer Ebene insbesondere dann, wenn die Placozoa vor den Porifera abzweigen (z.Z. aufgrund von mtDNADaten anzunehmen); auf anagenetischer Ebene aufgrund von Studien, welche die „Diploblastica/ Triploblastica“-Unterteilung in Frage stellen (Mesoderm-Problem). Für die Bilateria ist u.a. festzuhalten, daß im Rahmen der Hydroskelett-Theorie kein Schwestergruppenverhältnis Annelida + Arthropoda angenommen wurde, so daß die umstrittene neue Großgruppe Ecdysozoa unproblematisch ist: Ecdysozoa werden durch Ableitung der „Aschelminthen“ von polymeren Vorformen einer Deutung zugänglich. Die Molekularsystematik der Annelida, aber auch der Deuterostomia ist mit konstruktionsmorphologischen Interpretationen vereinbar, bei den Deuterostomia v.a. der hochderivierte Status der Pterobranchia und Tunicata. Als kennzeichnendste Übereinstimmung ist die Einordnung der Tentaculata als hochabgeleitete Protostomier hervorzuheben, was sowohl als „Grundstein“ der NAP gilt (HALANYCH et al. 1995) als auch eine sehr spezifische Position der Hydroskelett-Theorie darstellt. Es wird gefolgert, daß die Gallertoid- Hydroskelett-Theorie zentrale Resultate der NAP besser zu integrieren vermag als andere Entwürfe. Konsequenzen für merkmalsmorphologische Deutungen werden aufgezeigt.
Das Leben aller Organismen wird grundlegend durch den tages- und jahreszeitlich bedingten Wechsel der Beleuchtungsverhältnisse geprägt. Die Anpassung der Stoffwechselprozesse und Verhaltensweisen an diese Oszillationen erfolgt nicht passiv, sondern wird durch eine innere Uhr gesteuert. Tageszeitliche Rhythmen, die auch ohne den Einfluss äußerer, periodisch verlaufender Umgebungsreize (Zeitgeber) ablaufen, werden als zirkadiane Rhythmen bezeichnet. Im Säugetier steuert ein endogener Rhythmusgenerator im Nucleus suprachiasmaticus (SCN) zirkadiane Rhythmen, indem er periphere Oszillatoren miteinander synchronisiert. Auf molekularer Ebene besteht dieser endogener Rhythmusgenerator aus Aktivatoren (BMAL1 und CLOCK/NPAS2) und Inhibitoren (PER1/2 und Cry1/2), die in Rückkopplungsschleifen die Grundlage für die Rhythmogenese steuern. Die Synchronisation dieses molekularen Uhrwerkes an die Umgebungszeit erfolgt durch Licht, das in der Retina wahrgenommen und an das SCN weitergeleitet wird. Die Signaltransduktionskaskaden nach einem Lichtpuls in der frühen und der späten Nacht unterscheiden sich dabei wesentlich: Ein Lichtpuls während der frühen Nacht führt zu einer erhöhten Freisetzung von Ca2+-Ionen über Ryanodin Rezeptoren (RYR), während ein Lichtpuls während der späten Nacht zu einer erhöhten Guanylylcyclase Aktivität führt. Um zu untersuchen, wie der endogene Rhythmusgenerator seinen Lichteingang reguliert, wurde die Licht-vermittelte Phasenverzögerung in BMAL1+/+- (profizienten) und BMAL1-/-- (defizienten) Mäusen untersucht. Die Befunde aus den in-situ Hybridisierungsstudien, RTQ-PCR und immunhistochemischen Untersuchungen dieser Arbeit zeigten, dass in BMAL1-/--Mäusen die Licht-induzierte mPer-Expression während der frühen Nacht selektiv beeinträchtigt ist. Zudem konnte gezeigt werden, dass die mRNA- und Proteinmengen von RYRs in BMAL1-/--Mäusen dramatisch reduziert waren. Ryr1:: und Ryr2::Luciferase-Reportersstudien zeigten darüber hinaus, dass die Ryr-Expression durch CLOCK/BMAL1 aktiviert und durch CRY1inhibiert werden kann. Diese Ergebnisse liefern den ersten Beweis dafür, dass der endogene Rhythmusgenerator des Säugers die Signalübertragung seines eigenen Lichteingangs regulieren kann. Weiterhin wurde in dieser Arbeit die ontogenetische Entwicklung des endogenen Rhythmusgenerators im SCN und in einem Melatonin-abhängigen peripheren Oszillator, der PT, untersucht und miteinander verglichen. Dazu wurden die Uhrengenproteine im fetalen (E18), postnatalen (P2 & P10) und adulten SCN und in der PT von C3H-Mäusen zu vier verschiedenen zirkadianen Zeitpunkten mittels Immunhistochemie untersucht. Die Anzahl immunreaktiver SCN-Zellen gegen alle untersuchten Uhrengenproteine (außer BMAL1) war im Fetus signifikant niedriger, als in der adulten Maus. Auch im SCN neonataler (P2) Mäuse erreichte die Anzahl immunreaktiver Zellen noch nicht das Niveau der adulten Maus. Erst 10 Tage nach der Geburt (P10) zeigen alle Uhrengenproteine im SCN ein adultes Verteilungsmuster. Offenbar reift das Uhrwerk im SCN von Mäusen graduell während der postnatalen Entwicklungsphase. Dabei besteht eine zeitliche Korrelation zwischen der Reifung des endogenen Rhythmusgenerators im SCN und der Ausbildung von inter-suprachiasmatischen und retino-suprachiaamatischen neuronalen Kontakten. Im Gegensatz zum SCN zeigte der Melatonin-abhängigen Oszilllator in der PT bereits im Fetus einen nahezu vollständig ausgeprägten Rhythmus der Uhrengenproteine. Da das fetale Pinealorgan noch nicht zur rhythmischen Melatonin-Synthese fähig ist, liegt es nahe, dass das mütterliche Melatonin die rhythmische Expression der Uhrengene in der fetalen PT reguliert. Wie in vitro Untersuchungen an PER2::LUCIFERASE-Mäusen zeigten, hat das mütterliche Melatonin offenbar auch einen modulierenden Einfluss auf den fetalen SCN. Bei diesen Mäusen konnte im fetalen und postnatalen SCN ein zirkadianer Rhythmus in der PER2-Synthese nachgewiesen werden, der eine relativ lange Periodenlänge aufwies und nach 3 Tagen zum Erliegen kam. Eine Stimulation mit Melatonin führte zu einer deutlichen Verkürzung der Periodenlänge im PER2-Rhythmus. Folglich scheint das mütterliche Melatonin eine wichtige Quelle für Informationen der Umgebungszeit im Fetus zu sein. Um die Uhrengenexpression während der Maus-Ontogenese in vitro auf zellulärer Ebene darzustellen, wurde in dieser Arbeit zudem ein vom murinen Per2-Promoter angetriebenes DsRed- Reportersystem etabliert und der Versuch begonnen, eine darauf basierende transgene Maus zu generieren.
Camponotus ist die erfolgreichste Ameisengattung der Welt. Neben Pheidole und Crematogaster weist sie die meisten Arten, die höchste Dispersion und die größte Variabilität in morphologischer, ethologischer und ökologischer Hinsicht auf. Die Ursachen dieses Erfolges zu erkennen, war bisher nicht möglich, da nur fragmentarische Ergebnisse aus Freiland- und Laboruntersuchungen zur Verfügung standen. Die vorliegende Arbeit untersucht die Biologie und Ökologie ausgewählter Arten und gibt einen Einblick in die Komplexität ihrer Lebensstrategien. Um zu klären, welche ethologischen und ökologischen Anpassungen zur Gesamtfitness der Arten beitragen, wurden acht Arten der Gattung Camponotus in vier unterschiedlichen Habitaten ausgewählt. C. vagus und C. ligniperda in Laubmischwäldern Deutschlands, C. cruentatus und C. truncatus im mediterranen Klima der Pyrenäenausläufer Südfrankreichs, C. gombaki und C. gigas in offenen Park- und Uferregionen Malaysias sowie C. texens und C. gombaki im tropischen Sekundärwald der malaiischen Halbinsel. Das Verhalten dieser Arten wurde in den für das Überleben einer Kolonie zentralen Bereichen, nämlich Nisten, Außenaktivität und Nahrungserwerb untersucht. Als soziale Insekten sind Ameisen auf permanente und effektive Kommunikationssysteme angewiesen. Deshalb wurde die Rekrutierung, die mit Nestumzug und Nahrungserwerb im Zusammenhang steht, in das Untersuchungsprogramm aufgenommen. Unter Einbeziehung bereits publizierter Daten wird es möglich, den Erfolg von Camponotus zu verstehen. ...
Untersuchungen zur ZNS-Bioverfügbarkeit wirksamkeitsbestimmender Inhaltsstoffe von Johanniskraut
(2007)
In der vorliegenden Arbeit wurde die ZNS-Bioverfügbarkeit der Quercetin-Flavone und der Naphthodianthrone aus Hypericum perforatum untersucht. Hierzu wurde jew. eine HPLC-gestütze Methode zur Quantifizierung der genannten Stoffe in ZNS und Plasma erstellt und in enger Anlehnung an internationale Richtlinien (ICH- u. FDAGuidelines) validiert. Mit Hilfe dieser Methoden wurden im Anschluss Rattenfütterungsstudien durchgeführt und ausgewertet. Im Falle der Quercetin-Flavone konnte eindeutig gezeigt werden, dass diese Stoffgruppe ZNS-bioverfügbar ist und bei wiederholter Gabe (1 x tgl.) über den beobachteten Zeitraum von 8 Tagen im ZNS kumuliert. Ferner ist es gelungen, erste ZNS-Spiegelkurven der Quercetin-Flavone nach Einmal- und Mehrfach-Gabe aufzuzeichnen. Im Gegensatz hierzu weisen die Naphthodianthrone, unter Berücksichtigung der analytischen Grenzen, keine ZNS-Bioverfügbarkeit auf. Betrachtet man diese Ergebnisse im Kontext der bisher erschienenen Publikationen zu Johanniskraut, lässt sich sagen, dass durch die vorliegende Arbeit die Rolle der Flavonoide eindeutig an Bedeutung gewinnt und die der Naphthodianthrone eindeutig an Bedeutung verliert. Schaut man auf die bisher untersuchten Inhaltsstoffe von Johanniskraut, wird deutlich, dass den Phloroglucinolen die wohl herausragendste Bedeutung zukommt, was nicht zuletzt durch Keller et al.[137] und Müller et al. [27,59,67] gezeigt werden konnte. Für die klinische Wirksamkeit des Hypericum-Extraktes sind jedoch auch die Flavonoide essentiell, was durch Tierstudien gezeigt und durch diese Arbeit unterstüzt werden konnte[114]. Der Mechanismus, durch den die Flavonoide zur antidepressiven Wirksamkeit beitragen, liegt, im Gegensatz zu dem der Phloroglucinole, jedoch noch im Dunklen. Durch die Präsenz von Quercetin bzw. dessen Metaboliten im ZNS auf der einen und den Ergebnissen von Tierstudien zur antidepressiven Wirksamkeit isolierter Flavonoide mit Hilfe des Porsolt-Tests auf der anderen Seite[33] lässt sich jedoch spekulieren, dass die Flavonoide einen direkten antidepressiven Effekt ausüben und nicht nur indirekt durch Verbesserung, beispielsweise der ZNS-Bioverfügbarkeit der Phloroglucinole o. ä., zu den antidepressiven Eigenschaften des Extraktes beitragen. Durch ihr Unvermögen, die Blut-Hirn-Schranke in nennenswerten Konzentrationen zu überschreiten, treten die Naphthodianthrone, die in der Vergangenheit als für die Wirksamkeit wichtigsten Inhaltsstoffe angesehen wurden, eindeutig in den Hintergrund. Als Beitrag dieser Stoffgruppe zur antidepressiven Wirksamkeit ist demnach erstens ein wie auch immer gearteter indirekter Effekt durch Verbesserung der ZNS-Bioverfügbarkeit der ZNS-gängigen Substanzen, zweitens ein wegen der bestenfalls möglichen, niedrigen Konzentrationen schwacher antidepressiver Effekt im ZNS, drittens ein antidepressiver Effekt durch aktive Metaboliten oder viertens ein antidepressiver Effekt, der sich in der Peripherie beispielsweise durch Beeinflussung der HPA-Achse abspielt, denkbar. Für ersteres existieren bis dato keinerlei Anhaltspunkte, für den zweiten Punkt existieren weder Beweis noch Gegenbeweis noch Spekulationen in der Literatur, dasselbe gilt für den dritten Punkt, der vierte Punkt wird hingegen kontrovers diskutiert[44,97,143]. In Publikationen wurde hierzu festgestellt, dass unter dem Einfluss von Hypericin sich die Blutspiegel an Cortisol und ACTH, die bei Depressiven erhöht bzw. gestört sind, wieder normalisieren. Der Einwand der Kritiker dieses Wirkmodells scheint hierbei aber plausibel, da es sich bei dem mit Hilfe von Hypericin beeinflussbaren, beobachteten Phänomen der Erhöhten Cortisol- und ACTH-Plasmaspiegel auch nur um ein Symptom einer Depression und nicht um einen für die Depression ursächlichen Vorgang handeln kann. Nicht jeder, bei dem erhöhte Cortisol- und veränderte ACTH-Spiegel vorliegen ist zwangsläufig depressiv. Das exakte Zusammenspiel der einzelnen Extrakt-Komponenten, von denen die bisher in den Focus der Untersuchungen geratenen Stoffe nur etwa 10 bis 15% ausmachen, bleibt jedoch auch weiterhin zum größten Teil im Unklaren, wenngleich gerade dieses Zusammenspiel die besonderen Eigenschaften des Extraktes und dessen Wirkung ausmachen. Unverzichtbare Bestandteile sind hierbei Phloroglucinole und Flavonoide, die in angemessenen Konzentrationen im Extrakt repräsentiert sein müssen, um ein klinisch hochwertiges Produkt zu gewährleisten. Inwieweit ein repräsentativer Gehalt an Hypericinen im Extrakt vorhanden sein sollte, ist nicht zuletzt auf Grund der Ergebnisse dieser Arbeit mit einem Fragezeichen zu versehen, wenngleich die Datenlage zur Zeit keinesfalls ausreicht, die Hypericine gänzlich aus dem Extrakt zu verbannen. In wie weit die An- oder Abreicherung einzelner Komponenten zu einer Verbesserung der klinischen Wirksamkeit führt, muss jedoch stets in zusätzlichen Studien eruiert werden. Insgesamt steht aber mit dem Johanniskraut-Extrakt für die erfolgreiche Therapie von milden bis mittelschweren Depressionen ein wichtiges, fast unverzichtbares Werkzeug zur Verfügung, das sich insbesondere durch sein verglichen mit synthetischen Antidepressiva, überaus günstiges Profil an unerwünschten Arzneimittel-Wirkungen auszeichnet. Trotz in jüngster Zeit propagierter Bedenken hinsichtlich der Unbedenklichkeit der Anwendung von Johanniskraut Extraktpräparaten besonders in Kombination mit anderen Arzneistoffen, was jedoch einer genaueren Betrachtung nur schwer standhält[144], stellt der Johanniskraut-Extrakt zur Behandlung milder bis mittelschwerer Depressionen ein unverzichtbares Werkzeug dar.
Das Y-Chromosom war, mit Ausnahme der Pseudoautosomalen Regionen, während der Genomevolution einer enormen Veränderung unterworfen, die zu einem weitesgehenden Verlust oder der Inaktivierung von Genen führte, die nicht in den Prozess der Geschlechtsdetermination bzw. –differenzierung, oder Spermatogenese involviert sind. Gleichzeitig kam es durch Amplifikation von funktionellen Kopien der Spermatogenesespezifischen Genen zu sog. amplifikonischen Genfamilien, die fast ausschliesslich im Testis exprimiert werden. TSPY (Testis Specific Protein Y-encoded) ist nach bisherigen Untersuchungen mit 35 Kopien, bestehend aus funktionellen Kopien und inaktiven Pseudogenen, die grösste und homogenste Protein-kodierende amplikonische Genfamilie auf dem Y-Chromosom und wurde im Rahmen dieser Arbeit genauer analysiert. Es wird unter normalen Bedingungen in den Spermatogonien des Testis exprimiert, aber es ist auch eine aberrante Expression in malignen Geweben, wie Gonadoblastom, Carcinoma in situ (CIS) des Testis oder in einer Fraktion von Prostatakarzinomen detektierbar. Aufgrund der Expression und der korrelierten Kopplungsanalyse wurde postuliert, dass es sich bei TSPY um ein Kandidatengen für den sog. Gonadoblastom-Locus auf dem Y-Chromosom (GBY) handelt. TSPY gehört ausserdem aufgrund einer evolutionär konservierten Domäne zur Familie der SET/NAP-Proteine. Andere Mitglieder dieser Familie sind z.B. in Proliferation, Zell-Zyklus-Regulation, Chromatin-Umbau und Kerntransport involviert. Durch die Analyse der TSPY-Transkription konnte anhand des LNCaP-Zellkultursystems die postulierte Androgen-abhängige TSPY-Transkription widerlegt werden. Zusätzlich wurden zwei TSPY-Transkripte unterschiedlicher Grösse und Transkriptionsraten detektiert, wobei das grössere Transkript TSPY-S stärker exprimiert wird als das kleinere Transkript TSPY-L. Ursache hierfür ist alternatives Splicing in Intron 4 des TSPY-Gens, das zur Expression der beiden Protein-Varianten mit unterschiedlichen C-Termini führt. Die durchgeführte Haplotyp-Analyse zur Identifizierung transkribierter TSPY-Gene konnte aufzeigen, dass das einzige funktionelle Gen des sog. TSPY minor Clusters (mit dem Haplotyp G-G-18) als einziges nicht alternativ gespliced wird und andererseits das häufigste TSPY-S Transkript (44 %) darstellt. Hierfür wird die Möglichkeit einer „locus-control-region“ diskutiert. Um Interaktionspartner von TSPY-S zu identifizieren und dadurch möglicherweise Hinweise auf die Funktion von TSPY zu erhalten, wurde das Hefe-Zwei-Hybrid-System eingesetzt. Vorversuche lokalisierten eine mögliche Transkriptions-Aktivierungsdomäne im N-Terminus von TSPY, weshalb eine N-terminale Deletion von TSPY-S, die einen grossen Teil der NAP Domäne und den C-Terminus enthält, als Köder eingesetzt wurde, um eine Testis-cDNABibliothek nach interagierenden Proteinen zu durchsuchen. Die Interaktion von TSPY mit den drei interessantesten Kandidaten hTid-1, dem menschlichen Homolog eines Tumor-Suppressor-Gens aus Drosophila, einem Mitglied der Ubiquitin-like-Proteinfamilie Ubiquilin 3 (UBQLN3), das aufgrund der Protein-Struktur eine Funktion bei der Regulation des Zellzyklus haben könnte und Isopetidase T (USP5), einer Ubiquitin-spezifische Protease, die an der proteasomalen Protein-Degradation beteiligt ist wurde durch Co-Transformation verifiziert und genauer analysiert. Immunhistochemische Experimente bestätigten die ausschliessliche zelluläre Lokalisation von TSPY in den Spermatogonien. Es konnten jedoch leichte entwicklungsspezifische Unterschiede gezeigt werden. In post-pubertärem und adulten Testis-Gewebe wird TSPY im Kern und Cytoplasma der mitotischen Spermatogonien exprimiert, aber in einem sehr grossen Anteil der ruhenden Spermatogonien im früh-kindlichen Testis (6 Monate) fehlt ein Kernsignal. Expression der EGFP (enhanced green fluorescent protein) -markierten Wildtyp cDNAs von TSPY-S und –L in HEK-293 Zellen bestätigte eine Protein-Lokalisation in Cytoplasma und Kern. Gezielte Deletion des C-Terminus der EGFP-TSPY-Fusionsproteine führte zur Degradation der Proteine, was die Bedeutung des variablen C-Terminus hervorhebt. Selektive Mutation einer mit den Computer vorhergesagten und durch einen Phosphorylierungs-Assay experimentell bestätigten CK2-Phosphorylierungs-Stelle im C-Terminus von TSPY-S verhinderte die Kern-Lokalisation, was darauf hindeutete, dass die C-terminale Phosphorylierung für die Lokalisation im Zellkern notwendig ist. Für TSPY-L konnte dieses Muster nicht bestätigt werden, da Mutationen im direkten C-Terminus von TSPY-L zur Protein-Degradation führten. Aufgrund der Datenlage wurde die Arbeitshypothese aufgestellt, dass TSPY im Cytoplasma durch CK2 phosphoryliert und in den Zellkern transportiert wird. Nach Androgen-Stimulus und Signal-Transduktion kommt es zur Kern-Lokalisation von CK2 und dadurch zur verstärkten Phosphorylierung von TSPY im Kern. Dort führt die Interaktion von TSPY mit den einzelnen identifizierten Proteinen zur Regulation des Zellzyklus und der mitotischen Proliferation der Spermatogonien, aber auch zur pathologischen Funktion von TSPY bei der Entstehung von Keimzelltumoren. Diese Arbeitshypothese müsste überprüft und verbessert werden, um die Funktion von TSPY bei der Proliferation der Spermatogonien und der Krebsentstehung aufzuklären.
Bis zur Entfaltung der Wirkung eines Pharmakons laufen zahlreiche komplexe Vorgänge ab, die sich in drei wesentliche Phasen unterteilen lassen. Die pharmazeutische Phase umfasst mit der Applikation und dem Zerfall der Arzneiform sowie dem Auflösen des Wirkstoffes Vorgänge, die im wesentlichen von den galenischen Eigenschaften des Arzneistoffes abhängen. In der pharmakokinetischen Phase erfolgt mit der Resorption die Aufnahme des Wirkstoffes in den Organismus, dem sich die Verteilung in die unterschiedlichen Gewebe über die Blutbahn anschließt. Durch verschiedene Eliminationsprozesse wird der Wirkstoff zuletzt wieder aus dem Körper ausgeschieden. Mit dem Erreichen des Wirkortes beginnt die pharmakodynamische Phase, in der die pharmakologischen Effekte des Arzneistoffes zur erwünschten klinischen Wirkung führen. Der Nachweis des Pharmakons am Wirkort in klinisch-relevanten Konzentrationen ermöglicht somit Rückschlüsse auf die Wirksamkeit des Arzneistoffes, aber unter bestimmten Voraussetzungen auch auf dessen Wirkmechanismus. Während mittlerweile ein Großteil neuer Arzneistoffe mit Hilfe unterschiedlicher Mechanismen durch exaktes Drug Targeting an den Wirkort gesteuert werden, weisen andere Substanzen teilweise ungewollt eine gewebespezifische, dirigierende Komponente auf, die neben der eigentlichen Hauptwirkung weitere unterstützende oder auch unerwünschte Effekte auslösen. Von besonderem Interesse ist diese Gewebespezifität für pflanzliche Arzneistoffe, deren Wirkkomponenten bislang noch nicht eindeutig bestimmt werden konnten. Gemeinsam mit anderen pharmakologischen Befunden kann der analytische Nachweis eines wirksamkeitsmitbestimmenden Inhaltsstoffes am Wirkort in ausreichenden Konzentrationen ein weiterer deutlicher Hinweis auf dessen Wirkbeteiligung sein. Besonders vor dem Hintergrund einer rationalen, evidenz-basierten Pharmakotherapie, deren Anforderungen die pflanzlichen Arzneien mittlerweile ebenso wie die synthetischen Wirkstoffe erfüllen müssen, ist die Erforschung sowohl des Wirkprinzips als auch der Pharmakokinetik des Wirkstoffes von besonderer Bedeutung. Obwohl Johanniskrautextrakte bereits seit dem 17. Jahrhundert gegen die Melancholie und somit als Antidepressivum eingesetzt wurden, sind sowohl der exakte Pathomechanismus der Depression als auch die Wirkkomponente und der Wirkmechanismus der Extrakte aus Hyperici herba noch immer Gegenstand umfassender Forschung. Vor allem wegen der geringen Nebenwirkungsrate sind Johanniskrautpräparate gegenüber synthetischen Antidepressiva eine bevorzugte Alternative für die Therapie leichter bis mittelschwerer Depressionen. Ähnlich den Effekten der synthetischen Antidepressiva sind Johanniskrautextrakte in der Lage, durch eine Wiederaufnahmehemmung der Neurotransmitter Noradrenalin, Serotonin, Dopamin, sowie GABA und L-Glutamat deren Konzentration im synaptischen Spalt zu erhöhen, was zu einer nachfolgenden adaptiven Veränderung der jeweiligen Rezeptoren führt. In mehreren Studien konnten diese Effekte vornehmlich den Phloroglucinolderivaten Hyperforin und Adhyperforin zugeordnet werden. Unterstützt wurden diese in vitro und in vivo Befunde durch die Ergebnisse einer Vielzahl verhaltenspharmakologischer Untersuchungen, die einen deutlichen Zusammenhang zwischen der Wirksamkeit in antidepressiven Modellen und dem Gehalt an Hyperforin in den Extrakten ergeben haben. Zahlreiche klinische Studien belegen darüber hinaus die Wirksamkeit und Verträglichkeit von Johanniskrautextrakten. ...
Die Replikation und Pathogenese von HIV ist in hohem Maße von zellulären Faktoren abhängig. Das Virus muss einerseits die protektiven und antiviralen Abwehrmechanismen der Wirtszelle umgehen können und gleichzeitig ist seine Replikation an die Nutzung zellulärer Faktoren adaptiert. Neben der Interaktion mit konstitutionell exprimierten zellulären Proteinen bewirkt das HI-Virus auch eine transkriptionelle Regulation zellulärer Gene, um sich einen für seine Replikation vorteilhaften Funktionszustand der Wirtszelle zu schaffen. Durch eine HIV-Infektion differentiell exprimierte Gene stellen daher potentielle Kandidatengene zur Identifizierung essentieller Wirtsfaktoren oder zellulärer Restriktionsfaktoren der HIV-Replikation dar. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die durch HIV-Infektion differentiell regulierten Gene LEREPO4, GLiPR, SCC-112 und Moesin auf eine mögliche Funktion bei der HIV-Replikation analysiert. Dabei wurden diese durch RNA Interferenz (RNAi) im Kontext einer HIV-Infektion reprimiert. Als zelluläres Modellsystem wurden P4-CCR5-Zellen verwendet, bei denen eine Infektion mit dem Virusstamm HIV-1Bru eine Induktion der Gene LEREPO4, GLiPR und Moesin sowie eine Repression von SCC-112 bewirkte. Die RNA-Interferenz vermittelte Suppression dieser Gene erfolgte durch Applikation von synthetischen siRNA Oligonukleotiden oder durch intrazelluläre Expression von short hairpin RNAs (shRNA). Durch den Einsatz von shRNAs konnte jedoch unter den vorliegenden Versuchsbedingungen nur eine unzureichende Gensuppression erreicht werden. Aus diesem Grund wurden synthetische siRNA Oligonukleotide verwendet. Es konnte eine deutliche Reduktion der jeweiligen Zielgene bewirkt werden, ohne dass nennenswerte Effekte auf den Phänotyp und die Viabilität der Zellen beobachtet wurden. Der Einfluss der siRNA-vermittelten Gensuppression auf die HIV-Replikation wurde durch Infektion der Zellen ermittelt. Hierbei zeigte sich, dass die Depletion von GLiPR und LEREPO4 eine deutliche Inhibition der HIV-Replikation bewirkte. Das Ausmaß der Inhibition war ähnlich ausgeprägt, wie durch Verwendung einer bereits publizierten, gegen das virale Gen p24 gerichteten siRNA. Die Depletion von SCC-112 hatte im Gegensatz hierzu keine eindeutige Wirkung auf die HIV-Replikation, so dass nicht ausgeschlossen werden kann, dass seine Repression während einer HIV-Infektion ein unspezifischer bzw. sekundärer Effekt ist. Die siRNA-vermittelte Suppression von Moesin führte zu einem unerwarteten Ergebnis, da eine deutliche Steigerung der HIV-Replikation im Vergleich zur Kontrolle festgestellt wurde. Damit konnte erstmals belegt werden, dass Moesin nicht für die HIV-Replikation benötigt wird, wie es durch andere Arbeiten postuliert wurde. Diese Annahme begründete sich auf der Beobachtung, dass Moesin in Viruspartikel inkorporiert wird. Daher wurde eine Beteiligung an der Zusammenlagerung oder Abschnürung viraler Partikel vermutet. Die in dieser Arbeit ermittelten Ergebnisse lassen vermuten, dass LEREPO4 und GLiPR notwendige Faktoren der HIV-Replikation sind, wohingegen Moesin einen negativen Effekt zu vermitteln scheint. Die zugrunde liegenden Mechanismen dieser Wirkung auf die HIVReplikation sind jedoch weitgehend unklar. Da die Proteine LEREPO4, SCC-112 und GLiPR nicht oder nur unzureichend charakterisiert sind, war ein weiteres Ziel dieser Arbeit zelluläre Funktionen dieser Proteine zu ermitteln, um Rückschlüsse auf ihre Funktion bei der HIV-Replikation zu gewinnen. Es konnten polyklonale Antikörper gegen LEREPO4 generiert werden, mit denen eine Bestimmung der zellulären Lokalisation möglich war. Mittels Co-Immunopräzipitation wurde die Interaktion von LEREPO4 und TRAF-2 nachgewiesen. Die Bestimmung des Einflusses von LEREPO4 auf die NF-κB-Aktivierung lässt vermuten, dass LEREPO4 an der TRAF-vermittelten Signaltransduktion beteiligt ist. Untersuchungen zur Funktion von GLiPR zeigten, dass es sich möglicherweise um ein sekretorisches Protein handeln könnte, wie durch den fluoreszenzmikroskopischen Nachweis eines GLiPR-EGFP-Fusionsproteins in HeLa-Zellen ermittelt wurde. Weiterhin konnte mittels Annexin-V-Färbung und TUNEL-Assay belegt werden, dass eine exogene Expression des GLiPRs in HeLa Zellen zu einem deutlichen Anstieg der Apoptoserate führte. Zusätzlich wurden für jedes Protein Genexpressionsprofile nach siRNA vermittelter Repression mittels Microarray-Analyse erstellt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass LEREPO4 und GLiPR mögliche Kofaktoren der HIV-Replikation darstellen. Im Gegensatz hierzu scheint Moesin einen negativen Effekt zu vermitteln. Auf Grundlage der in dieser Arbeit ermittelten Daten können weiterführende Untersuchungen durchgeführt werden, um die genaue Funktion der oben genannten Proteine bei der HIV-Replikation zu klären.
Gephyrin ist ein Protein mit strukturellen und enzymatischen Eigenschaften. Ein Aspekt der strukturellen Funktion ist die synaptische Verankerung inhibitorischer Rezeptoren an das Zytoskelett. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, dass ein Interaktionspartner von Gephyrin, Collybistin, die Organistion des Aktin-Zytoskeletts reguliert. Die enzymatische Funktion von Gephyrin besteht in der Synthese eines Kofaktors, welcher für die Aktivität von Molybdoenzymen notwendig ist. Das gezielte Ausschalten des für Gephyrin kodierenden Gens weist im Mausmodell einen letalen Phänotyp auf. Als Ursache hierfür kommen die fehlende synaptische Aggregation von Glyzin- und GABAA-Rezeptoren in neuronalem Gewebe, sowie die fehlende Aktivität von Molybdoenzymen in peripheren Organen in Frage. Da sowohl Molybdän-Kofaktor-Defizienzen beim Menschen, wie auch bestimmte Mutationen von Glyzin- und GABAA-Rezeptoren bei Mäusen letal sind, kann der beobachtete Phänotyp nicht eindeutig zugeordnet werden. Die vorliegende Arbeit verfolgt zwei Ziele. Das erste ist eine Einengung der Binderegion von Collybistin an Gephyrin. Dabei konnte diese durch immunzytochemische und biochemische Methoden auf wenige Aminosäuren genau beschrieben werden. Verschiedene Strukturvorhersageprogramme weisen auf eine helikale Struktur für diesen Sequenzabschnitt hin. Der Austausch der Aminosäuren R107, D108, R111 und E117 mit Alanin führt über den Verlust ionischer Ladungen zum Verlust der Bindungseigenschaft. Das zweite verfolgte Ziel ist die Einführung eines transgenen Konstrukts, welches nur die Molybdän-Kofaktor-Synthesefunktion wiederherstellen soll, in den genetischen Hintergrund der Gephyrin-„knock-out“ Maus. Ziel dieser Analyse ist die Herstellung eines Phänotyps, bei dem die inhibitorische Transmission in einer Weise gestört ist, welche Symptome der Molybdän-Kofaktor-Insufizienz ausschließt. So sollte die Ursache für die Letalität der Gephyrin-Mutation zugeordnet werden können. Dazu wurde das pflanzliche Gephyrin-Homolog Cnx1 in ein Expressionskonstrukt kloniert, und nach biochemischer, immunzytochemischer und funktioneller Analyse in heterologen Zellen in eine Wildtyp-Mauslinie injiziert. Diese wurde mit Geph-/--Mäusen gekreuzt und die daraus resultierenden homozygoten, transgenen Tiere analysiert. Diese Tiere sterben ebenso wie die Geph-/--Mäuse am Tag der Geburt. mRNA des Transgens konnte in Hirn und Leber nachgewiesen werden, das Protein allerdings nur in Hirnextrakten. Dementsprechend lag die Aktivität des für die Lebensfähigkeit von Säugetieren wichtigsten Molybdoenzyms, der Sulfitoxidase, in Leberextrakten nur bei 30%. Eine morphologische Untersuchung von Gehirnschnitten ergab keine Auffälligkeiten. Eine Immunhistochemische Analyse von Rückenmarkschnitten zeigte in Übereinstimmung mit Beobachtungen an Gephyrin-„knock out“-Mäusen diffus verteilte Glyzin-Rezeptoren. Somit wurde eine Maus mit beeinträchtigter inhibitorischer synaptischer Transmission und partiell wiederhergestellter Molybdän-Kofaktor Biosynthese hergestellt. Aufgrund der großen Schwankungsbreite der Aktivität der Sulfitoxidase in Leberextrakten verschiedener Geph-/- + cnx Tiere wäre ein Unterschied in der Lebenserwartung verschiedener Tiere zu erwarten gewesen, wenn die Defizienz dieses Molybdoenzyms die Ursache für den letalen Phänoyp gewesen wäre. Da die transgenen Tiere aber wie die Geph-/- Mäuse wenige Stunden nach der Geburt sterben, ist davon auszugehen, dass der beschriebene Phänotyp auf das Fehlen der strukturellen Eigenschaften von Gephyrin zurückzuführen ist, und nicht von einer durch Beeinträchtigung des Schwefelstoffwechsels hervorgerufene progressive Schädigung des ZNS.
Das Epsilon-Proteobakterium Wolinella succinogenes wächst unter anaeroben Bedingungen durch Nitrit-Atmung. Als Elektronendonoren werden Formiat oder Wasserstoff verwendet. Die terminale Reduktase der Elektronentransportkette von Formiat zu Nitrit ist der Cytochrom C-Nitrit-Reduktase-Komplex (NrfHA), welcher die Reduktion von Nitrit zu Ammonium katalysiert. Menachinon dient als Redoxmediator. Die katalytische Untereinheit NrfA ist ein Pentahäm Cytochrom c, dessen Struktur bekannt ist. Die Häm c-Gruppe im aktiven Zentrum von NrfA wird über ein ungewöhnliches CXXCK-Motiv kovalent gebunden, während die übrigen vier Häm c-Gruppen über konventionelle CXXCH-Motive gebunden werden. Der Lysin-Rest des CXXCK-Motivs ist der axiale Ligand des Häm-Eisens der Häm-Gruppe im katalytischen Zentrum. Die Untereinheit NrfH ist ein membranständiges Tetcahäm-Cytochrom C, das den Elektronentransport von Menachinol zu NrfA katalysiert. Im Nitrit-Reduktase-Operon nrfHAIJ wird das Nrfl-Protein kodiert, das ähnlich zu verschiedenen Cytochrom c-Biogenese Proteinen (Ccsl und CcsA) anderer Organismen ist. Ziel dieser Arbeit war die Konstruktion und Charakterisierung von Mutanten, in denen der Lysin-Rest des CXXCK-Motivs (K134) von NrfA ausgetauscht wurde oder konservierte Aminosäure-Reste am katalytischen des NrfAProteins ausgetauscht wurden. Weiterhin wurden Mutanten konstruiert und charakterisiert, in denen das nrfl-Gen inaktiviert wurde. Folgende Ergebnisse wurden erhalten: Es wurde eine Mutante konstruiert (W. succinogenes K134H), in der das CXXCK-Motiv im aktiven Zentrum von NrfA in ein konventionelles CXXCH-Motiv gewandelt wurde. Die spezifische Nitrit-Reduktase-Aktivität, gemessen mit reduziertem Benzylviologen als Elektronendonor, betrug maximal 40% der Aktivität des Wildstammes. Die Elektronentransport-Aktivität von Formiat zu Nitrit betrug 6% der Aktivität des Wildstamms. Durch MALDI-Massenspektroskopie wurde gezeigt, dass das NrfA-Protein aus dieser Mutante, ebenso wie das Protein aus dem Wildstamm, fünf Häm-Gruppen enthielt. In W. succinogenes Mutanten, in denen der Lysin-Rest 134 gegen Leucin oder Glutamin ausgetauscht wurde, ließ sich das Nrf-Protein durch Western-Blot-Analysen nicht mehr nachweisen. 2. In W. succinogenes R114L, Y21 8F, H277L wurden konservierte Aminosäure-Reste in NrfA ausgetauscht, die nach dem postulierten Mechanismus der Nitrit-Reduktion an der heterolytischen Spaltung der ersten N-O-Bindung des Nitrits beteiligt sind. Alle diese Mutanten wachsen nicht durch Nitrit-Atmung. W. succinogenes H277L und R114L besitzen keine Nitrit-Reduktase-Aktivität, obwohl das NrfA-Protein in allen Mutanten nachweisbar war. Die Elektronentransport-Akivität von Formiat zu Nitrit in W. succinogenes Y218F betrug 6% im Vergleich zum Wildstamm und die Nitrit-Reduktase-Aktivität betrug 14% gegenüber dem Wildstamm. Aus der Struktur von W. succinogenes NrfA ist ersichtlich, dass der Glutamin-Rest 276 Teil eines Substrat-Kanals ist, der von der Oberfläche des NrfA-Proteins zur Häm-Gruppe im aktiven Zentrum führt (Einsle et al. 2000). in W. succinogenes Q276E wurde der Glutamin-Rest gegen einen negativ geladenen Glutamat-Rest ausgetauscht. W. succinogenes Q276E wächst nicht durch Nitrit-Atmung. Die Elektronentransport-Aktivität von Formiat zu Nitrit betrug in dieser Mutante 6% im Vergleich zum Wildstamm. Die Nitrit-Reduktase-Aktivität war gegenüber dem Wildstamm um 90% erniedrigt. 3. In der Mutante W. succinogenes stopl wurde das nrfl-Gen durch Einführen von zwei Stop-Codons an den Positionen 47 und 48 inaktiviert. Diese Mutante wächst nicht durch Nitrit-Atmung und besitzt keine Nitrit-Reduktase-Aktivität. Im NrfA-Protein aus W.succinogenes stopl fehlte die über das CXXCK-Motiv ligandierte Häm-Gruppe im aktiven Zentrum, während die übrigen über konventionelle CXXCH-Motive ligandierten Häm-Gruppen vorhanden waren. 4. Die Mutante W. succinogenes Kl34H/stopl, in der das stopl-Gen inaktiviert war und das CXXCK-Motiv in ein fünftes CXXCH-Motiv geändert wurde, entsprach in ihren Eigenschaften dem Stamm W. succinogenes K134H. Daraus ist zu folgern, dass das Nrfl-Protein speziell am Einbau der Häm-Gruppe am CXXCK-Motiv in NrfA beteiligt ist, während Nrfl für den Einbau an CXXCH-Motiven entbehrlich ist. Nrfl ist vermutlich eine spezielle Häm-Lyase, die den Lysin-Rest des CXXCK-Motivs erkennt. 5. Campylobacter jejuni kodiert ein NrfA-Protein, das fünf CXXCH-Motive anstelle von einem CXXCK-Motiv und vier CXXCH-Motiven enthält. In C. jejuni wird die vermutliche Häm-Gruppe des aktiven Zentrums von einem CMNCH-Motiv ligandiert, während in W. succinogenes die Bindung an einem CWTCK-Motiv erfolgt. In den Mutanten W. succinogenes CMNCK und W. succinogenes CMNCH wurde das Häm-Bindemotiv im aktiven Zentrum von NrfA dem von C. jejuni angeglichen. Keine der beiden Mutanten wuchs durch Nitrit-Atmung. W. succinogenes CMNCK katalysierte den Elektronentransport von Formiat zu Nitrit mit 6% der Aktivität des Wildstamms. Die Nitrit-Reduktase-Aktivität betrug unter 3% im Vergleich zum Wildstamm. In W. succinogenes CMNCH war das NrfA-Protein durch Western-Blot-Analysen nicht nachzuweisen. 6. Um die Präparation des NrfA-Proteins und des NrfHA-Komplexes zu erleichtern und um die Präparation der Untereinheit NrfH zu ermögiichen, wurden W, succinogenes Mutanten konstruiert, die einen Hexa-Histidin-Tag an NrfA oder einen Strep-Tag II am N- oder C-terminus von NrfH tragen. Es war aber nicht möglich, den Nitrit-Reduktase-Komplex oder einzelne Untereinheiten durch entsprechende Affinitätschromatographien anzureichern.
Das Volumen von tierischen Zellen ist durch äußere und innere Einflüsse Veränderungen unterworfen. Um die zelluläre Homöostase zu gewährleisten und bedrohliche Volumenänderungen zu verhindern, verfügen die meisten Zellen daher über regulatorische Mechanismen zur Verringerung (regulatory volume decrease, RVD) oder Erhöhung (regulatory volume increase, RVI) des Zellvolumens. Darüber hinaus finden diese Mechanismen auch im Rahmen physiologischer Prozesse, wie z. B. der Zellbewegung oder der Proliferation Verwendung. Der RVD erfordert einen Sensor-Mechanismus, der die Veränderung des Zellvolumens registriert. Die nachfolgende Signaltransduktion führt zur Aktivierung von Transportmechanismen, die v. a. dem Export von K+- und Cl--Ionen, aber auch organischen Osmolyten, dienen und zum Ausstrom von Wasser aus der Zelle führen, bis das Sollvolumen erreicht ist. Bisher ist noch nicht sicher, welcher Mechanismus den RVD einleitet; in verschiedenen Geweben wurden Hinweise auf mehrere mögliche Kandidaten gefunden. In dieser Arbeit wurde der RVD von HaCaT-Zellen, einer humanen Keratinozyten-Zelllinie hinsichtlich der Beteiligung des Aktin-Zytoskeletts mit mikroskopischen, pharmakologischen und molekularbiologischen Methoden untersucht. HaCaT-Zellen schwellen in hypotonem Medium schnell an (30 s) und führen einen RVD durch, der nach ca. 5 min das Ausgangsvolumen wieder herstellt. Der RVD von HaCaT-Zellen ist vom Einstrom extrazellulärer Ca2+-Ionen abhängig. Dieser Einstrom erfolgt durch einen Kanal, der durch die Inhibitoren von stretch activated channels (SAC) Gd3+ und GsMTx-4, sowie den spezifischen Inhibitor des transient receptor potential vaniloid 4 (TRPV4), Rutheniumrot, gehemmt werden kann. TRPV4 wird in HaCaT-Zellen exprimiert. Der RVD und der damit verbundene Einstrom von Ca2+-Ionen, nicht aber das Anschwellen der Zellen werden durch den Abbau des Aktin-Zytoskeletts durch 2 μM Cytochalasin D (CD) gehemmt. Die Hemmung durch CD ist reversibel; nach dem Entfernen von CD bildet sich innerhalb von 30 min erneut ein Netzwerk von Aktinfilamenten aus. Ein zwei-stufiges Absenken der Osmolarität (jeweils ca. 20%), zunächst in Anwesenheit von CD führt zu einer Volumenzunahme, löst aber keinen RVD aus. Auch nach dem Entzug von CD bleibt das Volumen konstant erhöht. Erst das zweite Absenken löst eine Volumenregulation aus, allerdings nur bis zu dem Volumen, das nach dem Entfernen von CD etabliert war. Die mikroskopische Struktur des Aktin-Zytoskeletts von HaCaT-Zellen ändert sich während des RVD kaum. Durch die Messung der Fluoreszenz von gebundenem Rhodamin-Phalloidin konnte ein vorübergehender Anstieg der Menge von Aktinfilamenten (F-Aktin) während des RVD gezeigt werden. Ein quantitativer biochemischer Ansatz zeigt, dass die relative Menge des Triton- X-100-löslichen Anteils des Aktin-Zytoskeletts im gleichen Zeitraum zunimmt. Der RVD von HaCaT-Zellen hängt ebenfalls von der Geschwindigkeit der Osmolaritätsänderung ab; die langsame Verringerung der Osmolarität (≤ 5 mosM/min) führte zum Anschwellen, nicht aber zum RVD. Auf Basis der erzielten Ergebnisse wird ein Modell für den RVD von HaCaTZellen vorgeschlagen, bei dem der Anstieg des Zellvolumens zu einer Zunahme der mechanischen Spannung im kortikalen Zytoskelett führt. Dadurch wird – indirekt, etwa durch Phospholipase A2, oder direkt - TRPV4 aktiviert. Dies führt zu einem Einstrom von extrazellulären Ca2+-Ionen und über Ca2+-abhängige Aktin-bindende Proteine (z. B. Gelsolin) zu einer Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts (Gel-Sol-Übergang) und verbunden damit zu einer Abnahme der mechanischen Spannung. Ca2+-Ionen und kurze Aktinfilamente aktivieren Transportmechanismen, die zum Ausstrom von K+- und Cl-- Ionen und einer Abnahme des Zellvolumens führen.
Einige Teilergebnisse dieser Arbeit wurden bereits veröffentlicht: Mahnke K., Schönfeld K., Fondel S. et al (2007), Int. J. Cancer 120; 2723-2733 Depletion of CD4+CD25+ human regulatory T cells in vivo: Kinetics of Treg depletion and alterations in immune functions in vivo and in vitro Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Treg depletierende Wirkung von ONTAK, einem Fusionsprotein aus Interleukin-2 und Diphterietoxin, untersucht. Hierzu wurde ONTAK in Zellkultur auf humanen Lymphozyten getestet und anschließend Melanomapatienten verabreicht. ONTAK konnte sowohl in vitro als auch in vivo eine Depletion von Tregs induzieren, wenngleich der in vivo Effekt nicht vollständig war. Des Weiteren wurde der immunologische Effekt, der auf die Reduktion der Tregs zurückzuführen ist, untersucht. Hierzu wurden die Patienten mit DCP behandelt, welches normalerweise zu einer schwachen Entzündungsreaktion führt. Nach Treg Depletion wurden starke Kontaktekzeme in den Patienten induziert. Aufgrund dieser verstärkten Immunantwort erfolgte eine Applikation der Tumorpeptide MART1 und gp100 in das Kontaktekzem. Anschließend konnten peptidspezifische CD8 T-Zell Populationen detektiert werden, die sowohl INF-γ sekretierten, als auch zytotoxisch aktiv waren. Solche starken Immunantworten wurden bisher nur unter zu Hilfenahme starker Adjuvanzien induziert. ONATK führt bereits nach einmaliger Applikation zu einer Depletion regulatorischer T-Zellen in vivo. Dabei wird der Gehalt von 4 % regulatorischen T-Zellen im Blut auf einen Gehalt von 1 % gesenkt. Diese Depletion der Tregs verstärkt eine Immunisierung mit Peptiden, die eine starke CD8 T-Zell vermittelte Immunantwort induziert. Allerdings kam es zu keiner vollständigen Depletion der Tregs, was durch die geringe in vivo Halbwertszeit von ONTAK, sowie durch unbekannte Mechanismen der Treg Homöostase erklärt werden könnte. Die Wirkweise von ONTAK konnte nur im Blut, aber nicht in anderen Organen wie z.B. Lymphknoten erforscht werden, daher besteht die Möglichkeit, einer unvollständigen Depletion der Zellen in peripheren Organen. In wieweit Tregs im Blut mit anderen Zellen wechselwirken ist weitgehenst unerforscht. Die meisten Untersuchungen zeigen Zell-Zell Interaktionen in den Lymphknoten und im entzündeten Gewebe. Der Ort, an dem die Tregs aber wirklich ihr suppressives Potential auf andere Zellen entfalten, ist noch unbekannt. Hiermit beschäftigt sich der zweite Teil dieser Arbeit. Zur Beantwortung dieser Frage sollten Tregs in vivo in Mäusen in die Haut oder den Lymphknoten geleitet werden. Um das Vorhaben auszuführen, wurden die Zytokinrezeptoren CCR7, CCR9 und CCR10 sowie die Adhäsionsmoleküle PSGL-1, ESL-1 und CD103 kloniert und in zwei Expressionssystemen getestet. Ein lentivirales System zeigte eine schlechte Transduktionseffizienz, so dass ein zweites System mit einer Elektroporationstechnik, der Nucleofection gewählt wurde. Dieses führte zu Expressionseffizienzen von ca. 40 %. Zuerst wurde die Funktionalität der klonierten Moleküle in vitro in der murinen T-Zellline EL-4 in Transwell- und Flowchamberversuchen demonstriert, anschließend wurden murine in vitro expandierte Tregs nucleofiziert. Eine umfassende Analyse der nucleofizierten Zellen zeigte eine Heraufregulation von CD69 und eine Herunteregulation von CD62L, was auf eine Aktivierung der Zellen deutet. Mit einhergehender Aktivierung nahm auch die Apoptoserate der Zellen zu, diese konnte auch durch Modifikationen der Nucleofections- sowie der Kulturbedingungen nicht verringert werden. Nach einer Inkubationszeit von 16 Stunden nach der Nucleofection ließen sich noch adhäsive Eigenschaften der exprimierten Moleküle in der Flowchamber nachweisen. Im Suppressionstest, in dem die Zellen über einen Zeitraum von drei Tagen inkubiert wurden, waren die Zellen jedoch nicht mehr suppressiv. Daher wären die in vivo Versuche, die den suppressiven Einfluß der Tregs auf die Ohrschwellung in Abhängigkeit ihrer Lokalisation untersuchen sollten, erfolglos geblieben. Mit der Induktion der Apoptose stießen die hier verwendeten Methoden an ihre Grenzen. Zur Realisierung des Projekts müssten andere Transduktionssysteme oder Tregs aus knock out Mäusen verwendet werden. Regulatorische T-Zellen nehmen eine Schlüsselrolle bei der Suppression von anti-Tumor Immunantworten aber auch bei dem Schutz vor Autoimmunerkrankungen ein. Eine erfolgreiche Manipulation dieser Zellen in vivo oder in vitro bildet eine solide Basis für neuartige Immuntherapien gegen entsprechende Krankheiten. ONTAK ist ein wirkungsvolles Medikament, um die Anzahl der regulatorischen Zellen in vvo zu reduzieren. Es trägt dadurch zu einer verstärkten Immunantwort bei. Eine einmalige Gabe von ONTAK ist sicherlich nicht ausreichend, um Tumore zu bekämpfen, es kann aber Immuntherapien unterstützen. Eine Manipulation von Tregs, durch die Expression von Transgenen um ihr Migrationsverhalten in vivo zu beeinflussen und damit die Suppression von Autoimmunerkrankungen zu bedingen, ist noch nicht ausgereift und bedarf noch weiterer Forschung.
Untersuchungen zum Target und Wirkmechanismus der eNOS-Transkriptionsverstärker AVE9488 und AVE3085
(2008)
Die Substanzen AVE9488 und AVE3085 der neuen chemischen Klasse der eNOS-Transkriptionsverstärker führen zu einer signifikanten Aktivierung des eNOSPromotors, die in vitro und in vivo in einer Erhöhung der eNOS-Expression auf mRNAund Proteinebene resultiert. Als Folge davon kommt es zu einer signifikant gesteigerten Synthese von bioverfügbarem Stickstoffmonoxid (NO). Dieser Effekt führt in Kombination mit einer ebenfalls beobachteten Normalisierung der eNOS-Entkopplung zu einer deutlichen antiatherosklerotischen Wirkung in ApoE-Knockout-Mäusen. AVE9488 und AVE3085 wurden initial durch eine phänotypische Reihentestung chemischer Bibliotheken in einer stabilen eNOS-Promotor-Reporter-Endothelzelllinie identifiziert. Daher waren bis zum heutigen Zeitpunkt molekulare Targets und ihre Wirkweise unbekannt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand daher darin, Targetproteine der eNOS-Transkriptionsverstärker zu identifizieren, zu validieren und Hinweise auf den zugehörigen Wirkmechanismus zu sammeln. Zur Identifizierung potenzieller Zielproteine wurden zwei unterschiedliche Strategien verfolgt. In einem genomischen Ansatz sollten einzelne, für die Aktivierung des eNOSPromotors durch AVE9488 und AVE3085 essentielle Transkriptionsfaktoren identifiziert werden. Eine in silico-Analyse des für die Substanzwirkung notwendigen 300bp-Promotorbereichs vor Transkriptionsstart auf konservierte Transkriptionsfaktor-Bindemotive ergab potenzielle Bindungsstellen für insgesamt 105 Transkriptionsfaktoren. In Gel-Retardierungsexperimenten mit Oligonukleotiden, die aufbauend auf der bioinformatischen Analyse die konservierten cis-Elemente in diesem Sequenzbereich abdeckten, und Kernextrakten aus Endothelzellen, die mit AVE9488 behandelt worden waren, konnte eine Abschwächung der DNA-Protein-Komplexbildung beobachtet werden. Diese Effekte konnten jedoch mit dieser Technologie aufgrund der hohen Anzahl möglicher bindender Transkriptionsfaktoren nicht auf einzelne eingeengt werden. Im Folgenden wurden daher einzelne Transkriptionsfaktoren ausgewählt, die eine nachgewiesene Rolle bei der Regulation der eNOS-Transkription besitzen, und auf ihre Bedeutung bei der Substanz- ermittelten eNOS-Promotoraktivierung untersucht. Nach Ausschaltung durch siRNA von Sp1, GATA-2, Ets-1, MAZ und PATZ1 im eNOS-Transkriptionstest konnten bei Sp1, GATA-2 und MAZ lediglich eine Erniedrigung der basalen eNOS-Promotoraktivitätfestgestellt werden. Da die Substanz-induzierte eNOS-Transkriptionserhöhung bei keinem der untersuchten Transkriptionsfaktoren beeinflusst wurde, scheinen diese Proteine bei diesem Prozess keine Rolle zu spielen. Als zweite Strategie kamen Proteomik-Techniken zur Identifizierung möglicher Targetprot eine durch ihre direkte biochemische Affinität zum Pharmakophor der eNOS-Transkriptionsverstärker zum Einsatz. Durch die chromatographische Anreicherung bindender Proteine aus Endothelzelllysaten an spezifischen Affinitätsmaterialien und der Markierung rekombinanter, humaner Proteine auf Protein-Mikroarrays mit Biotinmarkierten eNOS-Transkriptionsverstärkern konnte eine Gesamtliste mit insgesamt 18 potenziellen Targetkandidaten ermittelt werden. Die weitere zelluläre Validierung dieser Kandidaten erfolgte durch ihre siRNA-vermittelte Ausschaltung im eNOS-Transkriptionstest. Innerhalb aller potenziellen Targets konnte nur nach Ausschalten von Häm-bindenden Protein 1 (HEBP1) der eNOS-Promotor durch AVE3085 nur noch signifikant abgeschwächt gegenüber der Kontrolle aktiviert werden. Dieses Protein stellte somit den einzigen Targetkandidaten dar, der bei der Aktivierung des eNOS-Promotors eine Rolle zu spielen scheint. Nach rekombinanter Expression des humanen HEBP1 konnte die Bindung der eNOS-Transkriptionsverstärker an dieses Protein durch zwei unabhängige biochemische Methoden konfirmiert werden. Bei Messungen der Tryptophanfluoreszenz des HEBP1 konnte der eNOS-Transkriptionsverstärker 9257 den Liganden Hämin, der eine Quenchung der Fluoreszenz bewirkt, aus der Bindung verdrängen. Weiterhin konnte mit Hilfe einer Fluoreszenz-markierten eNOS-Substanz ihre direkte Bindung an das HEBP1 durch Messung der Fluoreszenzpolarisation nachgewiesen und ein KD-Wert von 11,7μM ermittelt werden. Abschließend konnte in ersten Untersuchungen der Hebp1-Expression in einem Herz-Kreislauf-relevanten Tiermodell für chronische Herzinsuffizienz nach Myokardinfarkt die differentielle Hochregulation des Hebp1-Gens um den Faktor 2,5 unter pathologischen Bedingungen nachgewiesen werden, die jedoch nicht durch die Behandlung mit AVE3085 beeinflusst wurde.
Ein früherer Vorschlag zum Reaktionsmechanismus der DFPase, der eine Wasseraktivierung durch den Rest H287 postulierte, mußte nach neuen experimentellen Daten verworfen werden. Daher lag zu Beginn der hier vorliegenden Arbeit kein Vorschlag für den Mechanismus der DFPase vor, der die experimentellen Daten erklären konnte. Für das längerfristige Ziel, die katalytischen Eigenschaften der DFPase gezielt verändern zu können, war es daher notwendig, zunächst den Mechanismus der Hydrolyse von Verbindungen wie DFP durch die DFPase näher zu untersuchen. Durch computergestützte Modellierung im aktiven Zentrum der DFPase (Docking) wurde die Bindung von DFP und anderen Substraten der DFPase genauer untersucht und mit vorhandenen experimentellen Daten verglichen. Diese Arbeiten führten auch zur theoretischen Untersuchung des Bindungsverhaltens von O,O-Dialkylphosphoroamidaten als potentiellen Inhibitoren der DFPase. Diese den Dialkylfluorophosphaten strukturell sehr ähnlichen Substanzen werden durch die DFPase nicht umgesetzt. Die Ergebnisse der Dockinguntersuchung führten schließlich zu der Synthese von drei Phosphoroamidaten unter der Untersuchung ihres Verhaltens als Inhibitoren der DFPase. DIe Charakterisierung erfolgte dabei über enzymkinetische Methoden sowie NMR-Experimente. Mit dem stärksten Inhibitor O,O-Dicyclopentylphosphoroamidat gelang die Kristallisation eines Komlexes mit der DFPase, der mit der Methode der Röntgenbeugung strukturell bestimmt werden konnte. Dieser Komplex belegt die Bindung der Phosphorylgruppe von Substraten an das katalytisch wirksame Calciumion im aktiven Zentrum der DFPase und zeigt die vorherrschenden Bindungskräfte zwischen Ligand und Protein auf. Eine Reihe von Mutanten der DFPase, bei denen gezielt die koordinierenden Aminosäuren des katalytischen Calciumions verändert wurden, ergänzte die bereits in früheren Arbeiten erzeugten Mutanten. Die katalyischen Eigenschaften dieser Mutanten und ihre Fähigkeit zur Metallbindung gestatten es, diese Metallbindungsstelle genauer zu beschreiben und lassen zusammen mit den Dockingexperimenten und der Struktur des Inhibitor-Enzymkomplexes vermuten, dass der calciumkoordinierende Aminosäurerest D229 als aktives Nukleophil im Reaktionsmechanismus der DFPase fungiert. Diese Vermutung ließ sich mit experimentellen Daten untermauern. Durch 18O-Isotopenmarkierung konnte gezeigt werden, dass ein Sauerstoffatom von D229 auf das entstehende Produkt übertragen wird. Hierdurch konnte die Existenz eines Phosphoenzymintermediats nachgewiesen werden. Des weiteren gelang es, Kristalle der DFPase zu züchten, die für Neutronenbeugungsexperimente geeignet waren. Im Rahmen dieser Experimente gelang die Aufnahme eines vollständigen Datensatzes und die Lösung der Neutronenbeugungsstruktur der DFPase in einer Auflösung von 2,2 Å. Diese Neutronenstruktur, in der Wasserstoffatome im Unterschied zu Röntgenstrukturen gut sichtbar sind, zeigt eindeutig, dass der Rest D229 wie erforderlich deprotoniert und dass das in der Bindungstasche an das Calciumion koordinierende Wassermolekül nicht als Hydroxid vorliegt. Damit ließ sich die direkte Aktivierung von Wasser durch das Metallion ausschließen. Neben wichtigen Informationen über die Bindungstasche der DFPase lieferte die Neutronenstruktur auch detaillierte Einblicke in das Wasserstoffbrückennetzwerk im zentralen, wassergefüllten Tunnel des Proteins. Über die Bestimmung des Wasserstoff/Deuteriumaustausches von Proteinrückgradamiden konnten weitere Aussagen über die Solvenszugänglichkeit von verschiedenen Proteinbereichen gemacht werden. Für die DFPase konnten strukturell und funktionell ähnliche Proteine identifiziert werden. Neben der Paraoxonase 1 waren dies das Calciumbindeprotein Regucalcin aus Agrobacterium thumefaciens sowie das Drug Resistance Protein 35 aus Staphylococcus aureus. Es konnte gezeigt werden, dass diese Proteine eine der katalytischen Calciumbindestelle der DFPase vergleichbare Metallbindestelle aufweisen und verschiedene Enzymaktivitäten dieser Proteine durch einen Mechanismus mit einem zu D229 analogen Nukleophil erklärt werden können. Ein direkter Vergleich zwischen der DFPase und der humanen Paraoxonase gelang durch Untersuchungen mit fluorogenen Organophosphaten als Substrate. Hierbei konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass die DFPase in der Lage ist, Substrate mit einer P-O Bindung hydrolytisch zu spalten. Die unterschiedlich gute Umsetzung der verschiedenen Substrate durch die beiden Enzyme konnte auf der Grundlage der Proteinstrukturen erklärt werden, wobei für die Paraoxonase postuliert wurde, dass der calciumbindende Aminosäurerest D269 als zu D229 analoges Nukleophil wirkt. Abschließend gelang es, zusätzlich eine Zusammensetzung für eine Enzympräparation zu finden, die eine Gefriertrocknung der DFPase mit nur geringem Verlust an enzymatischer Aktivität erlaubt. Ein solches lagerstabiles Enzympulver ist ein notwendiger Schritt hin zu einer praktischen Anwendung der DFPase für die technische Dekontamination von hochtoxischen Nervenkampfstoffen.
Helicobacter pylori (H. pylori) ist ein weit verbreitetes Humanpathogen, welches den menschlichen Magen besiedelt und zu schwerwiegenden entzündlichen Erkrankungen des gastralen Traktes führen kann. Bereits 1994 wurde das Bakterium als ein Klasse 1 Karzinogen deklariert, da H. pylori im erwiesenen Maße mit der Entstehung von hochinvasivem Magenkrebs in Verbindung gebracht wird. In vitro induziert H. pylori eine starke Migration der infizierten Epithelzellen, die unter anderem mit der Auflösung der Zellkontakte einhergeht. Die zugrunde liegenden molekularen Zusammenhänge konnten bisher noch nicht vollständig aufgeklärt werden. Die Mechanismen der Auflösung der Zelladhäsion wurden in der vorliegenden Arbeit untersucht, um einen tieferen Einblick in die H. pylori vermittelten Virulenz zu erhalten. So konnte eine H. pylori-induzierte Dissoziation des E-Cadherin Komplexes, bestehend aus p120, 􀄮- und 􀈕-Catenin beobachtet werden, der in einem Verlust der Zelladhäsion resultierte. Es konnte darüber hinaus eine Spaltung der extrazellulären Domäne von ECadherin detektiert werden, die wahrscheinlich zu einer Destabilisierung und somit zur Auflösung des gesamten E-Cadherin Komplexes führte. Durch den Zerfall der Adhärenzverbindungen wurden Catenine in den zytoplasmatischen Pool freigegeben, von denen p120 in den Zellkern translozierte und die Transaktivierung von Zielgenen auslöste, die in diesem Zusammenhang mit Hilfe von Reportergenanalysen quantifiziert wurden. Diese Prozesse zeigten sich von dem Pathogenitätsfaktor CagA (cytotoxin associated gene A) unabhängig, der über das bakterielle Typ IV Sekretionssystem in die Wirtszellen transloziert wird und krebsassoziierte Signaltransduktionswege aktivieren kann. In weiteren Untersuchungen wurden deshalb die Auswirkungen löslicher H. pylori Faktoren auf die Spaltung von E-Cadherin und folglich auf die Zellmotilität und Morphologie epithelialer Zellen analysiert. Aufgrund dieser Beobachtungen wurden in weiteren Experimenten proteolytische Aktivitäten von H. pylori untersucht. Dabei konnte erstmalig die hypothetische Protease HtrA (high temperature requirement protein A) von H. pylori durch massenspektrometrischen Analysen als eine caseinolytisch aktive Protease gefunden werden. Nach der Klonierung und Aufreinigung von HtrA konnte darüber hinaus auch E-Cadherin als spezifisches biologisches Substrat der Wirtszellen für HtrA identifiziert werden. Diese selektive Fragmentierung von E-Cadherin durch HtrA fügt sich als ein neues Element in das Modell der H. pylori Pathogenese, die einen initialen Schritt in der frühen Phase der Infektion darstellen könnte.
Ziel der vorliegenden Arbeit sind Strukturuntersuchungen an geplant gezüchteten Einkristallen elektronenreicher Iod- und Schwefel-Verbindungen, ergänzt durch zugehörige Dichtefunktionaltheorie-Berechnungen. Besonderes Augenmerk gilt insbesondere Molekülen mit Thiophenyl-Substituenten R-S-(C6H5) und ihren isovalenzelektronischen Derivaten vom Typ R-NH-(C6H5) sowie den bisher unbekannten Donator/Akzeptor-Komplexen des Iodanils. Durch optimierte Auswahl jeweils geeigneter Lösungsmittel und Kristallisationsbedingungen gelingt es, zahlreiche unterschiedliche Typen kristalliner Nichtmetall-Verbindungen zu züchten. Die Strukturen der isolierten Einkristalle werden durch Vergleich mit bereits literaturbekannten sowie anhand quantenchemischer Berechnungen diskutiert und vertiefen das Verständnis der experimentellen Befunde wesentlich. ... Insgesamt belegen die in der Dissertation detalliert beschriebenen Ergebnisse, daß Kombinationen von gezielter Kristallzüchtung, anschließender Strukturbestimmung und quantenchemische Berechnungen zahlreiche Informationen über Wechselwirkungen in Kristallen liefern. So verdeutlicht die anschauliche Betrachtung der I2-Komplexe durch zugehörige Einkristallstrukturen sowie quantenchemische Modellrechnungen, daß auch geringe Wechselwirkungen teils beträchtliche Einflüsse auf Stöchiometrien und Strukturparameter in Kristallen ausüben. Das Schlußbeispiel Tris(thiophenyl)methan-Dimer belegt durch alle notwendigen Messungen wie Kristallstrukturanalyse, quantenchemische hochkorrelierte Berechnungen und massenspektrokopische Messungen, wie sich durch das Zusammenwirken moderner Methoden unerwartete Ergebnisse für einen neuartigen Verbindungstyp festigen lassen. Die lohnenden Ergebnisse der Untersuchungen erweitern die Kenntnisse statischer Aspekte bei Selbstorganisations-Phänomenen.
Organismen besitzen die Fähigkeit sich Temperaturerniedrigungen anzupassen, wobei über die molekularen Mechanismen der Kälteadaptation wenig bekannt ist. Für die Untersuchung dieser Mechanismen stellt die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae ein ausgezeichnetes Modellsystem aufgrund der einfachen Struktur und der Möglichkeit zur genetischen Manipulation dar. In dieser Arbeit wurde die transkriptionelle Antwort von S. cerevisiae auf Kälte mit Hilfe von DNA Chips (6330 ORFs) charakterisiert, wobei Proben von Hefekulturen mit einer Inkubationsdauer von 10 und 30 min, 2, 12 und 60 h bei 10°C verwendet wurden. 634 Gene reagierten mit einer signifikanten Expressionsänderungen auf den Kälteeinfluss, wobei zwei distinkte Phasen, definiert als frühe und späte Kälteantwort, identifiziert wurden. Vergleiche der Kälteantwort mit Expressionsdaten verschiedener Umweltstressbedingungen ergaben differentielle Expressionsmuster. Im Vergleich zu anderen Stressreaktionen zeigten Gene der frühen Kälteantwort entweder ein entgegengesetztes Expressionsmuster (“inverser Hitzeschockeffekt”) oder keine transkriptionelle Reaktion. Dieser Effekt kehrte sich während der späten Kälteantwort in eine allgemeine Stressantwort um. Messungen des Trehalose- und Glykogengehalts sowie Studien mit einer in der Stressinduktion beeinträchtigten Doppelmutante Δmsn2/Δmsn4 bei 10°C zeigten, dass die allgemeine Stressantwort ein Teil der späten Kälteantwort ist. Dagegen deuten die Daten der frühen Kälteantwort auf eine Kälte-spezifische Reaktion hin, wobei Anpassung der Membranfluidität sowie RNA-Modifikation eine essentielle Rolle spielen. Im Zusammenhang mit der Untersuchung der Kälteanpassung in S. cerevisiae wurde der ORF YBR255W mit unbekannter Funktion, dessen Deletion einen Kälte-sensitiven Wachstumsdefekt besitzt, auf molekular-biologischer und biochemischer Ebene charakterisiert. Die transkriptionelle Reaktion einer Δybr255w-Mutante bei Kälte (10ºC) wurde mit den Expressionsdaten des Wildtyps verglichen und zeigte starke Veränderungen während der frühen Kälteantwort, wobei nach 2 Stunden der größte Expressionsunterschied zum Wildtyp beobachtet wurde. 65% der Gene der frühen Kälteantwort zeigten YBR255Wabhängige Veränderungen, darunter Gene des Zellzyklus, des Zellwachstums und der Zelldifferenzierung. Interaktionsstudien auf genetischer und Proteinebene ergaben, dass Ybr255p mit einer Komponente des „Mitotic Exit Network“ und Komponenten des PKC1-Wegs interagiert. Die Überexpression von Ybr225p zeigte drastische Veränderungen der Zellmorphologie, wie sie ebenfalls für Mutanten des „Mitotic Exit Network“ beschrieben sind. Zusammengenommen mit der transkriptionellen Reaktion der Δybr255w-Mutante auf Kälte deuten diese Ergebnisse auf eine essentielle Rolle von Ybr255p im Zellzyklus bei Kälte hin.
Ubiquitylation is a three-step process, which results in the attachment of the small protein ubiquitin (Ub) to lysine residues on a substrate protein. SUMO proteins are ubiquitin (Ub)-related modifiers implicated in the regulation of gene transcription, cell cycle, DNA repair and protein localization. The molecular mechanisms by which the sumoylation of target proteins regulates diverse cellular functions remain poorly understood. During my PhD I isolated and characterized SUMO1 and SUMO2 binding motifs. Using Yeast Two Hybrid system, bioinformatics and NMR spectroscopy we defined a common SUMO-interacting motif (SIM) and map its binding surfaces on SUMO1 and SUMO2. This motif forms a β-strand that could bind in parallel or anti-parallel orientation to the β2-strand of SUMO due to the environment of the hydrophobic core. A negative charge imposed by a stretch of neighboring acidic amino acids and/or phosphorylated serine residues determines its specificity in binding to distinct SUMO paralogues and can modulate the spatial orientation of SUMO-SIM interactions. Mutation of the SUMO interacting motif of TTRAP (TRAFS and TNF receptor associated protein) influences both its localization and dynamic behaviour in living cells. Ubiquitin (Ub)-binding domains (UBDs) are key elements in conveying Ub-based cellular signals. UBD-containing proteins interact with ubiquitylated targets and control numerous biological processes including receptor trafficking, DNA repair, virus budding and gene transcription. They themselves undergo UBD-dependent monoubiquitylation, which promotes intramolecular binding of the UBD to the attached Ub and consequently leads to their functional inhibition. During the second part of my PhD I could show that, in contrast to the established ubiquitylation pathway, the presence of UBDs allows the monoubiquitylation of host protein independently of classical E3 ligases. UBDs of different types including UBA, UIM, UBM, NFZ and UBZ, can directly cooperate with E2 Ub-conjugating enzymes to promote monoubiquitylation of their host proteins. Using FRET technology I verified that the E2 enzyme and the substrate directly interact in cells. Moreover, UBD-containing proteins Stam2 and Sts2 promote self-ubiquitylation and not ubiquitylation of other targets or form polyUb chains from free Ub. Our study revealed a yet unappreciated role of E2 enzymes in ubiquitylation reactions of UBD containing proteins.
Gehirne von an Scrapie erkrankten Tieren sind histopathologisch durch Vakuolisierung, Astrogliose, Neurodegeneration und charakteristische PrPSc-Ablagerungen gekennzeichnet. Die pathologischen Mechanismen, die zu diesen Veränderungen führen, sind noch weitgehend unverstanden. Die Untersuchung der differentiellen Genexpression in Scrapie-infizierten Mausgeweben kann zu einem besseren Verständnis der pathogenen Mechanismen dieser Erkrankung auf molekularer Ebene beitragen. Auch könnten einige der differentiell exprimierten Gene zur Entwicklung eines auf Surrogatmarkern basierenden Testsystems beitragen oder für die Entwicklung von Strategien zur therapeutischen Intervention nützlich sein. Um im Verlauf der Scrapieerkrankung in Mäusen hoch- oder herunterregulierte Gene zu identifizieren, wurden RNA arbitrarily primed PCR (RAP-PCR) und suppression subtractive hybridisation (SSH) an Hirn- und Milzproben Scrapie-infizierter Mäuse und gesunder Kontrolltiere durchgeführt. Die Ergebnisse wurden anhand eines differentiellen Screening-Schrittes, Sequenzanalysen und Northernblots bestätigt. Durch einen Datenbankabgleich der erhaltenen Sequenzen wurden mehrere Kandidaten identifiziert. Einige davon, wie GFAP, Apolipoprotein D, Vimentin, Mx-Protein, MHC I und II wurden bereits als in Scrapie-infizierten Gehirnen hochreguliert von anderen Arbeitsgruppen publiziert. Eine differentielle Regulation weniger weiterer Kandidaten, wie Cytochromoxidase, Ubiqitinierungsfaktor E4a und das herunterregulierte Stathmin wurden bisher noch nicht beschrieben. Auch eine bisher unbekannte differentiell exprimierte Sequenz wurde gefunden. Ergänzend zu den Untersuchungen auf Nukleinsäureebene wurde die 2DElektrophorese für Gehirngewebe zur Untersuchung der differentiellen Expresssion auf Proteinebene unter Berücksichtigung posttranslationaler Modifikationen etabliert. Protokolle für die Vorbereitung von Mäusegehirnproben, die Durchführung der isoelektrischen Fokussierung und der 2. Dimension, sowie Färbeprotokolle für qualitative und quantitative Analysen der Gele unter Berücksichtigung der Erfordernisse nachfolgender MALDI-Analysen wurden erarbeitet.
In der Vergangenheit wurden verschiedene Fusionstranskripte, welche normalerweise bei Leukämie-assoziierten chromosomalen Translokationen auftreten, in hämatopoetischen Zellen gesunder Personen gefunden. Da diese Personen keine entsprechenden chromosomalen Abberationen aufwiesen, ist es sehr wahrscheinlich, dass diese Fusionstranskripte durch trans-Spleißen entstehen. Während dieser Arbeit konnten durch inverse PCR, welche an unbehandelter cDNA gesunder Probanden durchgeführt wurde, intragenische trans-Spleiß-Produkte nachgewiesen werden. Interessanterweise weisen das MLL-Gen und seine fünf häufigsten Translokationspartner AF4, AF9, AF10, ELL und ENL ein großes Spektrum an trans-gespleißten RNAs auf. Nur in einem weiteren Mitglied der MLL-Familie (MLL3) konnte intragenisches trans-Spleißen nachgewiesen werden. Für verschiedene als Kontrolle verwendete Haushaltsgene konnte kein intragenisches trans-Spleißen nachgewiesen werden. Intergenische trans-Spleiß-Ereignisse konnten durch direkte PCR und RACEExperimente für die Gene MLL, ELL und ENL nachgewiesen werden. Bemerkenswerterweise entsprechen ein intragenisches trans-Spleiß-Produkt des MLL-Gens dem Transkript der chromosomalen Abberationen MLL-PTD und ein intergenisches trans-Spleiß-Produkt des MLL-Gens dem Transkript der chromosomalen Abberationen MLL•AF4. In Hefe konnte gezeigt werden, dass RNA als Vorlage für DNA-Reparaturen dienen kann. Somit lag der Schluß nahe, dass die oben genannten trans-gespleißten RNAs möglicherweise einen Einfluss auf die DNA-Reparatur haben. Dass RNA nicht nur in Hefen sondern auch in Menschen als Vorlage für DNA-Reparaturen dienen kann, konnte im Zuge dieser Arbeit durch mehrere in vitro Experimente mit Kernextrakten aus humanen Zelllinien bestätigt werden. Allerdings konnte keinerlei Einfluss von (trans-)gespleißter RNA auf die DNA-Reparatur in zahlreichen in vitro Experimenten nachgewiesen werden. Mit einem daraufhin etablierten in vivo System konnte ebenfalls ein Einfluss von (trans-) gespleißter RNA auf die DNA-Reparatur ausgeschlossen werden. Weiterhin konnten mit Hilfe der durchgeführten RACE-Experimente vorzeitige Polyadenylierungen von Transkripten in den Bruchpunktsregionen von MLL, AF4, AF9 und ENL identifiziert werden. Durch diese ungewöhnliche Termination der Transkription werden stark verkürzte Transkripte erzeugt, welche in kurze Proteinisoformen translatiert werden können. Ein Vergleich von 274 unterschiedlichen Bruchpunktsequenzen mit größeren direkten und indirekten Sequenzwiederholungen zwischen der Bruchpunktsregion von MLL und den Bruchpunktsregionen seiner häufigsten Translokationspartner wurde ebenfalls durchgeführt. Eine signifikante Korrelation zwischen den Sequenzwiederholungen und der Lokalisation der Bruchpunkte war jedoch nicht erkennbar. Bei diesem Vergleich fielen allerdings Häufungen von Bruchpunkten im MLL-Gen mit AF4, AF9 und ENL als Translokationspartner auf, wobei sich die Ursache für diese Häufungen auf Topoisomerase II Spaltstellen zurückführen ließ.
The heat stress (hs) response is universal to all organisms. As the cell senses increase in temperature, heat stress transcription factors (Hsfs) are activated to upregulate the expression of a number of genes encoding heat stress proteins (Hsp) which act as molecular chaperones to protect cells against heat damages. In higher plants, the phenomenon seems to be unusually complex both at the level of Hsfs and Hsps (e.g., 21 Hsf encoding genes in Arabidopsis and at least 17 in tomato). Upon prolonged hs, another characteristic property of plant cells is the assembly of large cytosolic aggregates called heat stress granules (HSG), which are composed of Hsps, HsfA2, RNA and RNA-binding proteins. The present work was aimed to understand plant hs response using tomato as a model system. To study the function of tomato Hsfs in their native system, we generated transgenic tomato lines altered in expression of HsfA1, HsfA2, and HsfB1. Tomato plants with 10-fold overexpression of HsfA1 (OE plants) were characterised by integration of a single HsfA1 expression cassette, whereas the plants harbouring a tandem inverted repeat (IR) of the cassette showed cosuppression of HsfA1 (CS plants). The lack of HsfA1 expression in CS plants results from posttranscriptional gene silencing connected with the formation of small interfering RNA (siRNA). Under normal growth conditions, major developmental features were similar for wild-type (WT), OE and CS plants. However, in contrast to the former two, CS plants and fruits were extremely sensitive to elevated temperature because hs-induced synthesis of major chaperones and Hsfs was strongly reduced or lacking. Despite the complexity of the plant Hsf family, the function of tomato HsfA1 is unique as master regulator of induced thermotolerance. On the other hand, maintenance of essential chaperones in CS plants during seed development suggests involvement of other Hsfs and/or transcription factor(s). HsfB1 and HsfA2 transgenic tomato plants, unaffected in thermotolerance, further supported the function of HsfA1 as the major factor regulating hs-inducible genes. Hs87 independent phenotypes of plants with altered expression of HsfB1 indicates developmental role of this Hsf. Using transient reporter assays with mesophyll protoplasts from WT tomato, we demonstrated that plasmids encoding Hsfs A1, A2 and A3 were well expressed which could function as activators for reporter gene expression. However, in protoplasts derived from CS plants, plasmids encoding HsfA2 and HsfA3 were normally expressed but even higher amounts of HsfA1 expression plasmids were completely silenced. Therefore, silencing of HsfA1 in CS plants was also reproduced in its mesophyll protoplasts. Lacking thermotolerance in CS protoplasts could be restored after transformation with expression plasmids encoding functionally equivalent HsfA2 or HsfA3 resulting in (i) expression of chaperones, (ii) survival of the cells at otherwise lethal temperature, (iii) thermoprotection of firefly luciferase, and (iv) assembly of heat stress granules (HSGs). The strong silencing caused by an IR in CS plants opened the possibility of a broad use of RNAi for gene knock-down also in the transient system of mesophyll protoplasts. Using this technology, we attempted to dissect essential components of thermotolerance and HSG assembly. We demonstrated the previously reported function of chaperones such as Hsp70 and Hsp101, and could discriminate the in vivo chaperone functions of different isoforms of Hsp20 and Hsp70 proteins. Hsp17-CI, Hsp70 (hs-inducible isoforms), and Hsp101 are absolutely essential chaperones for thermotolerance in plants. Furthermore, the results also show that despite Hsp17-CI and -CII being major components of HSG complexes, they are dispensable for assembly of these complexes. Based on these results, it is proposed that in the transient protoplast system an approach with gene-specific IRs can be used to discriminate functions of closely related isoforms among protein-families and to dissect complex protein networks.
Plastids are complex plant organelles fulfilling essential physiological functions, such as photosynthesis and amino acid metabolism. The majority of proteins required for these functions are encoded in the nuclear genome and synthesized on cytosolic ribosomes as precursors, which are subsequently translocated across the outer and inner membrane of the organelle. Their targeting to the organelle is ensured by a so called transit peptide, which is specifically recognized by GTP-dependent receptors Toc159 and Toc34 at the cytosolic side of outer envelope. They cooperatively regulate the insertion of the precursor protein into the channel protein Toc75, thereby initiating the translocation process. Toc34 is regarded as the primary receptor, while Toc159 probably provides the driving force for the insertion. Precursor transfer is achieved by the physical interaction between both receptors in the GTP loaded state. One translocon unit, also called the Toc core complex, is formed by four molecules Toc34, four molecules Toc75 and one molecule Toc159. In the GDP-loaded state, Toc34 preferably forms homodimers, whose physiological function was investigated in the presented study. It could be shown that the dissociation of GDP and therefore the nucleotide exchange are inhibited by the homodimeric state of Toc34. Dissociation of the homodimer is induced by the recognition of a precursor protein, which renders the binding of GTP and subsequent interaction with Toc159 possible. Thus, the homodimeric conformation could reflect an inactive state of the translocon, preventing GTP consumption in the absence of a precursor protein. Both homodimerization as well as heterodimerization of the receptor are regulated by phosphorylation, which could be demonstrated by in vitro and in vivo approaches using atToc33 from Arabidopsis thaliana as a model system. Since the phosphorylated form of Toc34 cannot be assembled with the Toc core complex, it can be concluded that the interactions between GTPase domains not only regulate the transfer of precursor proteins, but also warrant the integrity of the translocon.
The chemiosmotic theory suggested by Peter Mitchell (Mitchell, 1961, Nature 191:144-148; see Mitchell, 1979, Science 206:1148-1159 for review) postulated that the energy released upon the oxidation of electron donor substrates is transiently stored as electrochemical proton potential, delta-p across energy-transducing membranes, which acts then as the driving force for the ATP synthesis. Membrane protein complexes can both generate and utilise a transmembrane electrochemical proton potential, either by transmembrane proton transfer or by transmembrane electron transfer coupled to protolytic reactions on opposite sides of the membrane. The dihaem-containing membrane protein complex quinol:fumarate reductase (QFR) from the anaerobic epsilon-proteobacterium Wolinella succinogenes apparently combines both of these mechanisms (Haas et al, 2005, Biochemistry 44:13949-13961; Lancaster et al, 2005, PNAS 102:18860–18865; Mileni et al, 2005, Biochemistry 44:16718-16728; Madej et al, 2006, EMBO J 25:4963-4970). QFR is the terminal enzyme of anaerobic fumarate respiration that allows bacteria to use fumarate as the terminal electron acceptor (Kröger, 1978, Biochim Biophys Acta 505:129-45; Lancaster, 2004, In: Respiration in Archaea and Bacteria Volume 1:57-85). QFR couples the two-electron reduction of fumarate to succinate to the two-electron oxidation of quinol to quinone. QFR contains two haem b groups bound by the transmembrane subunit C, which are termed the ‘proximal haem’, bP, and the ‘distal haem’, bD, according to the relative proximity to the hydrophilic subunits A and B (Lancaster et al, 1999, Nature 402:377-85). The two-electron transfer via the two haem groups has been proposed (Lancaster, 2002, Biochimica et Biophysica Acta 1565:215-231) and demonstrated (Madej et al, 2006, EMBO J 25:4963-4970) to be coupled to a compensatory, parallel transfer of two protons via a transmembrane proton transfer pathway. The two most prominent constituents of the proposed pathway were suggested to be the haem bD ring C propionate and the side chain of amino-acid residue Glu C180, after which the proton transfer pathway was named the ‘E-pathway’ (Lancaster, 2002, Biochimica et Biophysica Acta 565:215-231). The essential role of Glu C180 was supported by site-directed mutagenesis and structural and functional characterization of the enzyme E180Q, where the Glu C180 was replaced with a Gln residue (Lancaster et al, 2005, PNAS 102:18860–18865). Moreover, multiconformer continuum electrostatics (MCCE) calculations (Haas and Lancaster 2004, Biophys J 87:4298-4315) and Fouriertransformed infrared (FTIR) spectroscopy experiments (Haas et al, 2005, Biochemistry 44:13949-13961) indicated the Glu C180 side chain to undergo a combination of a conformational change and protonation upon haem reduction. The contribution of haem bD propionate is less clear, however, a combination of 13C labelling of the haem propionates with redox-induced FTIR experiments (Mileni et al, 2005, Biochemistry 44:16718-16728) and MCCE calculations (Haas and Lancaster, 2004, Biophys J 87:4298-4315) support a change in protonation, possibly accompanied by a change in environment upon haem reduction. These experiments and their results strongly support the existence of the ‘E-pathway’ which is transiently open during the reduction of the haem groups and blocked in the oxidized state of the enzyme (Lancaster, 2002b, Biochim Biophys Acta 1565:215-231). All available crystal structures of the QFR, however, are those of the oxidized enzyme. Therefore, it is advantageous to perform simulations of various redox states of the enzyme to determine for instance, how the side-chain of Glu C180 and haem bD ring C propionate behave upon changes of the redox states of the haem groups and why is the ‘E-pathway’ blocked in the oxidized state of the enzyme. Although the distal haem ring C propionate and Glu C180 were identified as the most prominent components of the proton transfer pathway, it was not clear, on the basis of the structure, how proton transfer could occur between them. In addition, two constituents are not enough to span the membrane region and the additional participants in the proton transfer pathway must be identified. Since an atomistic investigation of proton transfer in this system is not yet possible experimentally, I used available theoretical methods such as classical molecular dynamics (MD) simulation (Alder and Wainwright, 1959, J Phys Chem 31:459-466; McCammon et al, 1977, Nature 267:585-590) and Q-HOP molecular dynamics (Q-HOP MD) simulation (Lill and Helms, 2001, J Chem Phys 115:7993-8005) to investigate the postulated mechanism of electron coupled proton transfer in QFR. MD simulations allowed us to move away from static difference pictures obtained from FTIR experiments and MCCE calculations. The advantage of the MD simulations over the experiments and the simulations performed so far is that the time-dependent properties could now be analyzed. The behaviour of various residues and their side-chains and any environmental changes may be directly observed during MD simulations. Although classical MD simulations cannot be used to study proton transfer reactions, they can provide information on formation of configurations that would allow either direct proton transfer between donor and acceptor residues or indirect proton transfer mediated by water molecules. To avoid the static protonation of residues which is inherent in classical MD simulations, Q-HOP MD simulations were performed which explicitly describe proton transfer reactions by allowing the change of the protonation state of residues ‘on the fly’. The structures obtained after classical molecular dynamics simulations ....
Shaped by some of the most dramatic tectonic events of the Cenozoic, the parts of southern and eastern Asia that have become known as the Oriental faunal region comprise vast areas of great geological complexity and ecological diversity. One of the four major groups of terrestrial elapid snakes in this region is the genus Bungarus. These nocturnal and predominantly ophiophagous snakes are widely known as kraits and are an important cause of snakebite mortality throughout their wide range that extends from Afghanistan to Vietnam and eastern China, and south to the Indonesian islands of Java and Bali. Although present on Borneo, kraits have not been found on any island of the Philippines, nor on Lesser Sunda Islands east of Bali. Despite their medical significance and the great importance of Bungarus toxins as tools in neuropharmacology, krait systematics and taxonomy have remained largely unstudied. Twelve species of Bungarus were recognized at the beginning of the present study. Many of these are rare in collections, and most aspects of their biology are unknown. While some species are highly distinct, most kraits are conservative morphologically, rendering molecular methods invaluable for the study of their diversity and biogeography. This study is the first to address the relationships within Bungarus and the historical biogeography of kraits based on molecular evidence. I inferred phylogeographic relationships based on analyses of new nucleotide sequences of the entire mitochondrial cytochrome b gene of 51 kraits and partial NADH dehydrogenase subunit 4 sequences of 40 kraits which I analyzed together with a representative sample of 32 published elapid and non-elapid outgroup taxa using Bayesian, maximum-likelihood, maximum-parsimony and neighbor-joining methods. I then used the recovered phylogeny to investigate the evolution of selected morphological characters and, together with collections-based geographical distribution information, in dispersal-vicariance analyses with models of variable taxonomic and biogeographic complexity. The phylogenetic analyses demonstrate that the current taxonomy of kraits does not adequately represent either the relationships or the genetic diversity in this genus. In contrast, I identified monophyletic groups that are congruent with recognized biogeographic units as well as extensive ecomorph evolution and morphologically cryptic speciation. The following additional conclusions are collectively supported by the mitochondrial phylogeny and morphological as well as biochemical synapomorphies: (1) Kraits are monophyletic with respect to the remaining taxa of the Elapidae; (2) Bungarus flaviceps and Bungarus bungaroides form the monophyletic sister clade of a clade formed by B. fasciatus, black-and-white-banded, and uniformly black taxa; (3) the remaining taxa are divisible into two sister clades, the South Asian species (Bungarus sindanus (Bungarus caeruleus, Bungarus ceylonicus)) vs. Himalayan, Burmese, Southeast and East Asian taxa; (4) within the latter, Burmese taxa form the sister clade to Southeast and East Asian taxa; (5) the widespread and medically significant species Bungarus candidus and Bungarus multicinctus are paraphyletic. The results of this study highlight the importance of vicariant geological events and sea level fluctuations for the cladogenesis of kraits. Events of particular importance in the evolution of kraits include the uplift of the Indo-Burman ranges (Arakan-Naga Hills) which separated black-and-white banded kraits in India and Southeast Asia, and the uplift of mountain ranges in Yunnan, China (e.g., the Gaoligong Shan), which coincided with lineage separation in two distantly related clades of kraits. Alternating dispersal and vicariance events due to Pleistocene climatic and sea level changes have caused complex phylogeographic patterns in kraits in Southeast Asia. Zones of contact between closely related evolutionary lineages of the B. candidus complex are identified in Thailand, Vietnam, and southern China (Hainan). Within this complex, two main clades are revealed. One includes populations from the Southeast Asian mainland and is in contact with B. multicinctus in southern China. The other consists of populations from Thailand, southern Vietnam, Java, and Bali. The phylogeny as well as genetic distances suggest a scenario in which a Pleistocene southward dispersal of B. candidus to Sumatra, Java, and Bali during times of low sea levels was temporarily interrupted by vicariant events (rising sea levels, especially flooding of the Malacca Strait between Sumatra and the Malay Peninsula, and of the Bali Strait between Java and Bali). In this context, the close phylogenetic relationship between haplotypes from southern Vietnam and those from Java and Bali suggests that "southern" B. candidus dispersed directly via colonization of the widely receded South Chinese Sea, and not by taking a detour via the Malay Peninsula and Thailand, which were already inhabited by other populations of B. candidus. Using these phylogenetic estimates as the framework for a study on the diversity and evolution of krait venom components, I applied biochemical and molecular genetic approaches to identify and quantify polypeptide and protein toxins in krait venom, focusing on the distribution and molecular evolution of alpha-bungarotoxin, an irreversible competitive antagonist of nicotinic acetylcholine receptors with an exceptionally high applied significance as a receptor probe. I was specifically interested in the medically relevant question of intraspecific and interspecific variability in toxin diversity, and whether receptor-binding postsynaptic toxins evolve at rates different from those of presynaptic neurotoxins like beta-bungarotoxin, which act by destroying the nerve terminal and are believed to exhibit hypervariable functional diversification due to an accelerated mode of molecular evolution. In the context of this question, I isolated and purified the major lethal neurotoxins from B. candidus venoms by sequential steps of liquid chromatography for structural and functional characterization studies. Cloning and sequence analysis of toxin-coding genomic DNAs showed that the gene encoding the alpha-bungarotoxin alanine-31 variant, originally isolated from B. multicinctus venom, is widely present and highly conserved in multiple populations of B. candidus and is expressed as the principal postsynaptic neurotoxin at least in Javan B. candidus. In addition to the widespread presence of genomic DNAs encoding the alpha-bungarotoxin alanine-31 variant, the present study also revealed the partial genes of three novel alpha-bungarotoxin isoforms in addition to the previously known alanine-31 and valine-31 variants, all of which share an invariant exon 3 coding region. While alpha-bungarotoxin is the principal postsynaptic neurotoxin of Taiwanese B. multicinctus and Javan B. candidus, the main postsynaptic neurotoxin of Thai B. candidus both by quantity and lethality was a novel polypeptide of similar toxicity with a mass of 8030 Da and 73 amino acid residues, whose characterization at the genetic and protein levels revealed a novel subgroup of krait neurotoxins, here named alpha-delta-bungarotoxins and represented by four sequences from Bungarus caeruleus and B. candidus. alpha-delta-Bungarotoxins share high sequence homology with alpha-bungarotoxins but the purified, 8030 Da alpha-delta-bungarotoxin-1 exhibits only reversible, low affinity binding to nicotinic receptors and high site-selectivity for the acetylcholine binding site at the alpha-delta-subunit interface of the receptor. These properties render alpha-delta-bungarotoxin not only the first snake long-chain neurotoxin with reversible binding and binding-site selectivity, but also an exciting natural tool with which to address structure-function relationships at the subunit interfaces of the human receptor. The results of comparisons of the number of non-synonymous nucleotide substitutions per nonsynonymous site (dN) to the number of synonymous nucleotide substitutions per synonymous site (dS) strongly suggest that positive selection is acting on exon 2 of the alpha-bungarotoxin and probably also of the alpha-delta-bungarotoxin genes. In addition, the numbers of nucleotide substitutions per site of intron (dI) compared to the dS value of the toxin-coding exon regions provide strong evidence for accelerated molecular evolution in exon 2 of alpha-delta-bungarotoxins —whose value of dI is only one-eighth of the value of dS—whereas the hypothesis of accelerated evolution is rejected for 13 unique genomic DNAs encoding five alpha-bungarotoxin isoforms from B. candidus and B. multicinctus....
The aim of the study was to investigate the role of the CX3C chemokine FKN in the role of platelet adhesion. The presence of the FKN receptor CX3CR1 in platelets is demonstrated and G-protein dependent activation of platelets with soluble FKN results in the increased adhesion of platelets to collagen and fibrinogen under flow 228 and adhesion of leucocytes to firmly attached platelets 231. Whether membrane-bound FKN is capable to promote the direct adhesion of platelets in flowing blood analogue to leucocytes was completely unknown. The adhesion mechanisms of FKN in mediating the adhesion of leucocytes under flow are well characterised and represent a novel unique mechanism of leucocyte capture and firm adhesion: FKN is responsible for immediate arrest of flowing CX3CR1 expressing leucocytes without the participation of additional adhesion receptors and ligands. This is in contrast to the classical leucocyte adhesion pathways, which are multistep processes involving leucocyte arrest, rolling and subsequent cell activation prior to firm arrest. In leucocytes, the FKN – CX3CR1 axis is sufficient to allow rapid arrest of leucocytes at low shear flow conditions 67, 101, 115, 122, 261. The set of data from this study demonstrates that immobilised FKN was capable to mediate the adhesion of platelets under low shear conditions, whereas there was no interaction in the absence of shear flow. In the presence of vWf in the adhesion matrix, FKN mediated the potent increased adhesion of platelets. This was in parts due to the activation of flowing platelets via CX3CR1 and the augmented translocation of platelets on FKN via the vWf receptor GPIbα. With respect to platelet activation, the function of endothelial FKN was comparable to leucocytes: in both cell types, the FKN dependent activation is mediated by its cognate receptor CX3CR1. This is in contrast to the adhesive capacity: in leucocytes, FKN dependent adhesion is mediated by CX3CR1, whereas in platelets, the adhesive capacity was mostly mediated by the vWf receptor GPIbα with only minor contribution from CX3CR1. In platelets, activation and adhesion by FKN were mediated by two distinct receptors, whereas in leucocytes, CX3CR1 is solely responsible for FKN dependent activation and adhesion. The presented results point out to a role of platelets in early stage of atherosclerosis. The in vivo expression of both, FKN and vWf is regulated by TNF-α, which is released in early stages of inflammation. The presence of vWf and FKN in the endothelial lining of blood vessels during these conditions is sufficient to initiate the capturing and translocation of platelets on the tunica interna. The rolling of platelets on the endothelium can induce endothelial damage and inflammation of the vessel, which might advance to the generation of clinically significant atherosclerotic plaques and fibrous atheroma.
11 mit Salix spp. assoziierte Gallmücken-Arten (Diptera: Cecidomyiidae: Oligotrophini) wurden einer morphometrischen Analyse unterzogen. Dabei fanden 18 allgemeine und 10 geschlechtsspezifische Merkmale Berücksichtigung. Von sechs Arten wurden darüber hinaus 10 larvale Merkmale morphometrisch erfasst. Insgesamt wurden 325 Imagines und 45 Larven vermessen. Die Ergebnisse lassen eine neue systematische Einteilung auf Gattungs- und Artebene zu. Neben der morphologisch und biologisch bereits vorher eindeutig zu differenzierenden Gattung Iteomyia ist eine Aufteilung des verbleibenden Artenschwarms in drei Gruppen erkennen. Als wesentliche trennende Merkmale zeigen sich Antennen und geschlechtspezifische Charakteristika wie die Länge des Ovipositors bei den Imagines und die Ausbildung der für die Larven charakteristischen Spatula. Die morphologische Differenzierung findet ihre Entsprechung in qualitativen, biologischen Merkmalen der Tiere. Aus diesem Grund wird die Aufteilung der auf Salix spp. gallenbildenden Cecidomyiidae in mindestens vier Gattungen vorgeschlagen. Die Gattung Iteomyia behält ihren aktuellen Status und wird von der einzigen Art repräsentiert, die auf der Blattflächen von Weiden Gallen erzeugt (I. capreae). Die Dasineura-Gruppe enthält die sich in Blattrandgallen entwickelnden Gallmücken (D. auritae, D. marginemtorquens und D. roskami) sowie die inquilinen Arten, die zur Verpuppung einen Kokon anlegen und mindestens zwei Generationen im Jahr realisieren (in der vorliegenden Arbeit untersucht: D. schreiteri). In Rabdophaga werden jene Taxa integriert, die sich im Sproßbereich ihrer Wirtspflanzen unmittelbar unter der Rindeentwickeln, ohne ausgeprägte Gallenbildungen auszulösen (in der vorliegenden Arbeit untersucht: R. saliciperda und R. repentiperda) Ihre Entwicklung ist univoltin, die Verpuppung erfolgt ohne Anfertigung eines Kokons. In einer noch genauer zu definierenden vierten Gruppierung (hier provisorisch mit dem Gattungsnamen „Salicicola“ bezeichnet) fasst die Arten zusammen, die an den Sprossen ihrer Wirtspflanzen deutliche Gallenbildungen hervorrufen. Auch sie sind univoltin und verpuppen sich im Sproßbereich ohne Anfertigung eines Kokons. Die Zuordnung des in der vorliegenden Studie nicht untersuchten Artenkomplexes, den Knospengallenerzeugern, ist noch nicht geklärt. Eine endgültige Klärung der hier vorgeschlagenen systematischen Einteilung kann nur das Ergebnis einer umfassenden Revision sämtlicher mit Salix spp. assoziierten Gallmücken sein. Die polyphage Weidenrosenmücke Rabdophaga rosaria lässt sich mit Hilfe einer Hauptkomponenten-Analyse morphometrisch in vier Cluster gruppieren, die in der systematischen Aufteilung der von ihnen genutzten Salix spp. (alba, aurita/caprea/cinerea, purpurea und repens) ihre Entsprechung finden. Die festgestellte Auftrennung der Weidenrosenmücke illustriert anschaulich die Idee der sequentiellen Evolution, nach der aufgrund der engen phänologischen, biochemischen und physiologischen Interaktionen zwischen spezialisierten Phytophagen und ihren Wirtspflanzen eine schrittweise hochgradige Anpassung der beteiligten Organismengruppen zu erwarten ist. Wie im vorliegenden Fall steht am Ende solch einer Entwicklung die Herausbildung sogenannter Biotypen, deren Eigenständigkeit durch morphologische Unterschiede untermauert wird. Die Cecidomyiidae Iteomyia capreae ruft je nach genutzter Wirtspflanzenart verschiedene Gallenformen mit unterschiedlichem Verteilungsmuster auf den Blattflächen hervor. Die sich in den beiden Gallentypen entwickelnden Tiere unterscheiden sich morphologisch und lassen sich in Abhängigkeit der von ihnen genutzten Wirtspflanze ähnlich wie Rabdophaga rosaria in zwei Biotypen einteilen. Die auf Salix caprea lebenden Tiere weisen eine geringere Gallenzahl pro Blatt auf als die auf S. cinerea lebenden Tiere. Die beiden Biotypen zeigen signifikante Unterschiede hinsichtlich ihrer Fertilität. Der S. caprea-Typus, der seine einkammrigen Gallen über die gesamte Blattfläche verteilt, zeigt eine höhere Fruchtbarkeit als der S. cinerea-Typus, der ein- bis mehrkammrige Gallen entlang des Blattmittelnervs anlegt. Gleichzeitig zeigen sich signifikante Unterschiede in der durch Parasitoiden hervorgerufenen Mortalität. Die kleinen, über die gesamte Blattfläche verstreuten Gallen des S. caprea-Typs weisen eine geringere Parasitierungsrate auf als die großen, am Mittelnerv konzentrierten Gallen des S. cinerea-Typs. Von acht der elf untersuchten Gallmückenspezies wurde der Feindartenkomplex analysiert. Zu diesem Zweck wurden an 30 Standorten in Deutschland und Dänemark über 7500 Gallen gesammelt und in Zucht genommen. Aufgrund der vielkammrigen Gallen einzelner Arten konnten insgesamt mehr als 12500 Gallenkammern auf ihre Artenzusammensetzung hin analysiert werden. Insgesamt konnten 57 Parasitoiden-Arten nachgewiesen werden, die sich auf sieben Familien parasitischer Hymenopteren verteilen. Am artenreichsten vertreten sind die Pteromalidae und Platygasteridae mit einem Anteil von jeweils 24,56 % (14 spp). Der Artenreichtum ist mit fast zehn Spezies pro Gegenspielerkomplex ungewöhnlich hoch und liegt deutlich über den Werten anderer Gallenerzeuger-Gruppen. 27 Spezies (47,37 %) konnten keiner bekannten Art zugeordnet werden. Es wird vermutet, dass sich darunter zahlreiche, für die Wissenschaft neue Arten befinden. Insgesamt 42 spp. (73,7 %) der nachgewiesenen Parasitoidenarten wurden nur aus einer der untersuchten Wirtsarten gezüchtet, lediglich fünf Arten attackierten mehr als zwei der untersuchten Wirtsarten. Das Verhältnis von Idiobionten (töten den Wirt zum Zeitpunkt der Parasitierung ab) zu Koinobionten (erlauben dem Wirt zunächst ein weiteres Wachstum) ist mit 53,3 % zu 46,7 % annähernd gleich. Für 37 Taxa (64,91 %) konnten Angaben über ihre Wirtsbindung gemacht werden. Es zeigte sich, daß der Feindkomplex der untersuchten Gallmücken von stark spezialisierten Arten dominiert wird. Alle Arten sind bisher nur an gallenerzeugenden oder zumindest endophytisch lebenden Wirten nachgewiesen worden, 28 spp. sind darüber hinaus auf gallenbildende Cecidomyiidae spezialisiert, 10 spp. parasitieren nur cecidogene Gallmücken auf Weiden. Am artenreichsten war mit 24 spp. der Gegenspielerkomplex des Blattgallenerzeugers Iteomyia capreae, gefolgt von den Blattrandgallenerzeugern Dasineura auritae (12 spp.) und D. marginemtorquens (11 spp.), dem Sproßgallenerzeugern Rabdophaga salicis (10 spp.) und der Inquilinen-Art Dasineura schreiteri (10 spp.) sowie der unmittelbar unter der Rinde ihrer Wirtspflanzen lebenden sogenannten Schrotschuß-Gallmücke R. saliciperda (6 spp.). Mit nur drei bzw. vier Arten erwiesen sich die Gegenspielerkomplexe der Weidenrosen-Gallmücke Rabdophaga rosaria und der Sproßgallen erzeugenden R. degeeri am artenärmsten. Die Ähnlichkeits-Analyse der jeweiligen Gegenspielerspektren ließ eine große Eigenständigkeit erkennen, die geringen Ähnlichkeiten sprechen für einen hohen Anteil von Spezialisten in den Parasitoidenkomplexen. In den Gegenspielerspektren dominierten nur jeweils zwei bis fünf Arten. 19 der 57 Arten wiesen eudominante oder dominate Abundanz-Werte auf. Dabei waren vor allem die Arten der Gattungen Synopeas, Torymus, Platygaster und Aprostocetus von größerer Bedeutung für die Mortalitätsraten ihrer Wirte. Die Erreger der verschiedenen Gallentypen waren unterschiedlichen Mortalitätsraten durch Parasitoide unterworfen. Dasineura auritae und D. marginemtorquens, die Erzeuger von Blattrandgallen, wiesen die höchsten durchschnittlichen Parasitierungsraten auf (43,04 %), die Inquiline D. schreiteri die geringste (20,25 %). Die Sproßgallenerzeuger Rabdophaga salicis und R. degeerii wiesen nur eine geringfügig höhere Mortalität durch Parasitierung (24,31 %) auf, gefolgt von der Weidenrosen-Gallmücke Rabdophaga rosaria (25,47 %) und den Blattgallen von Iteomyia capreae (31,26 %). Der Feindkomplex der untersuchten Cecidomyiidae wurde mit dem der an Salix spp. gallenbildenden Tenthredinidae verglichen. Bislang sind für die mit Salix spp. assoziierten cecidogenen Gallmücken und Blattwespen in Nord- und Mitteleuropa über Gegenspielerarten nachgewiesen worden, von denen lediglich sieben in beiden Wirtsfamilien auftreten. Brutparasiten, die vor allem bei den Blattgallenerzeugern (Pontania spp.) vorhanden sind, fehlen bei den Gallmücken völlig. Sowohl Cecidomyiidae als auch Tenthredinidae werden vor allem von spezialisierten Parasitoiden attackiert, deren Wirtskreis sich auf diese gallenbildenden Herbivoren-Gruppen beschränkt. Innerhalb der Gegenspielerspektren sind jeweils über 80 % der Parasitoidenarten bislang nur in einem Gallentyp nachgewiesen worden. Der Artenpool der Blattwespen-Parasitoiden wird mit fast 60 % von den Ichneumonoidea dominiert. Bei den Gallmücken fehlt diese ParasitoidenÜberfamilie völlig, hier sind die Chalcidoidea mit über 70 % der Arten das bestimmende Element. Dagegen stellen die in den Tenthrediniden-Gallen lediglich mit zwei Arten vertretenen Platygasteroidea im Gegenspielerspektrum der Cecidomyiidae mehr als 25 % aller Spezies. Bei den Blattwespen tritt nur ein knappes Drittel der Parasitoidenarten, deren Biologie näher bekannt ist, als Koinobionten auf. Bei den Gallmücken erhöht sich der Anteil dieser Feindarten-Gilde auf über 50 %. Vergleicht man die einzelnen Gallentypen, so sind auch in der Parasitierungs-Strategie der beteiligten Arten große Unterschiede zu verzeichnen. Die meisten Parasitoide der Tenthredinidae befallen junge Wirtslarven, bei den Gallmücken ist dagegen der Typ des Junglarven-Parasitoiden nur selten anzutreffen: Wird ein frühes Wirtsstadium angegriffen (in der Regel durch Koinobionten), so erfolgt bereits die Belegung des Wirtseies. Blattwespen weisen höhere Mortalitätsraten als Gallmücken auf. Darüber hinaus zeigt sowohl bei den Blattwespen als auch bei den Gallmücken die durch Parasitierung hervorgerufene Mortalität prägnante Unterschiede zwischen den einzelnen Wirtsarten und Gallentypen, aber auch innerhalb einer Art gibt es je nach Lokalität und Untersuchungsjahr deutliche Schwankungen. Bei den Tenthredinidae liegt die durchschnittliche Parasitierungsrate der Blattgallenerzeuger (53,3 %) deutlich über den Werten der Sproßgallenerzeuger (41,7 %) Entsprechende große Unterschiede lassen sich für die Blattrandgallenerzeuger (43,04 %) und Sproßgallenerzeuger (24,31 %) der Cecidomyiidae feststellen.
Das große therapeutische Potential der RNA Interferenz wird dadurch deutlich, dass sich wenige Jahre nach der Entdeckung die ersten potentiellen RNAi Medikamente in den klinischen Teststudien befinden. Jedoch müssen bis zur therapeutischen Anwendung im großen Maße noch einige Hindernisse überwunden werden. Um eine optimale Wirkung der siRNAs gewährleisten zu können müssen folgende Punkte beachtet werden: - Erhöhte Nuclease-Resistenz - Effiziente zelluläre Aufnahme - Keine Off-Target Effekte - in vivo geringe Toxizität Das richtige Design der siRNAs ist somit von enormer Bedeutung. Hierfür bedient man sich verschiedener Modifikationsmöglichkeiten wie z.B. Basenmodifikationen, Modifikationen an der 2´-O-Position sowie am Phosphatrückrat. Im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit ist es gelungen verschiedene Syntheserouten zur Darstellung von Nucleosiden mit kationischen sowie neutralen 2´-O-Modifikationsmotiven zu erarbeiten und zu optimieren. ...
Strukturelle Analyse des CusCBA-Systems von Escherichia coli Kupfer ist als Kofaktor in vielen Enzymen ein essentielles Spurenelement. Die Aufrechterhaltung der Kupferhomöostase ist für die Zelle enorm wichtig, da es sich um ein redox-aktives Übergangsmetall handelt, das selbst in geringsten Konzentrationen toxisch wirkt. Gewöhnlich ist in der Zelle kein einziges freies Kupferion nachweisbar, da die Zelle redundante Mechanismen für die Detoxifikation von Kupfer besitzt. Ein Mechanismus zur Detoxifikation von Kupfer und Silber in E. coli ist das Cus-System. Es handelt sich um einen vierteiligen Effluxkomplex, der sich aus dem inneren Membranprotein CusA, dem periplasmatischen Membranfusionsprotein CusB und dem TolC ähnlichen äußeren Membranprotein CusC zusammensetzt. Das vierte Protein dieses Systems, CusF, dient im Periplasma als Kupferchaperon. Dieser Komplex ermöglicht das Ausschleusen von Cu(I)- und Ag(I)-Ionen aus dem Cytoplasma über das Periplasma und die äußere Membran in einem einzigen Schritt. In dieser Arbeit sollte die Röntgenstruktur des periplasmatischen Proteins CusB geklärt werden, um anhand struktureller Daten analysieren zu können wie CusA und CusC über CusB miteinander verbunden sind und welche Konformationsänderungen dabei vonstatten gehen. CusB wurde dafür über Ni2+-Chelat-Affinitätschromatographie und Größenausschluss-Chromatographie bis zur Homogenität gereinigt. Das Protein lag in Lösung als Monomer vor. Kristalle von CusB wurden nach der Dampfdiffusionsmethode des hängenden Tropfens hergestellt, wobei Kristalle in nur einem von 500 verschiedenen Ansätzen entstanden sind. Röntgenstreuung wurde bis zu einer Auflösung von 8 Å am ESRF (European Synchrotron Radiation Facility) in Grenoble gemessen. Die Streuung der Kristalle ließ starke Anisotropie und hohe Mosaizität erkennen. Um die Qualität der Kristalle von CusB zu verbessern, wurden Kristalle des Proteins ohne Hexahistidinanhängsel hergestellt. Diese Kristalle zeigten in Röntgenstreuungsexperimenten keine Verbesserung der Auflösung und Qualität. Die Röntgenstrukturen und Analysen durch Protease-Verdau von den zu CusB verwandten Proteinen AcrA und MexA zeigten, dass in diesen die N-Termini und C-Termini unstrukturiert sind. Deswegen wurden zunächst Konstrukte von CusB hergestellt in denen verschieden lange Bereiche des N-Terminus deletiert wurden. Ein Konstrukt von CusB, in dem die ersten 20 Aminosäuren deletiert waren, konnte in 10 von 500 Ansätzen kristallisiert werden. Nach Feinabstimmung der initialen Ansätze wurde für Kristalle dieses Konstrukts eine Auflösung von 5,3 Å am ESRF in Grenoble gemessen. Allerdings wies die Röntgenstreuung ebenfalls ein starke Anisotropie und Mosaizität auf, so dass die Struktur dieses Proteins nicht gelöst werden konnte. Strukturelle Analyse des RNAi-Suppressors B2 des Nodamura Virus: RNAi (RNA-Interferenz) bezeichnet einen sequenzspezifischen RNA-Degradationsprozess, um die Synthese eines Proteins zu verhindern. Zwei RNA-Typen wirken als Auslöser der RNAi: Doppelsträngige RNA dient als Vorläufer von siRNAs (small interfering RNAs), während einzelsträngige RNA mit Stamm-Schleifen-Strukturen als Vorläufer der miRNA (microRNA) dient. SiRNA und miRNA werden durch die Typ III Endonuklease Dicer im Cytoplasma produziert, sind 21-30 Nukleotide lang mit charakteristischen 2-NukleotidÜberhängen am 3’-Ende. Über den Komplex aus Dicer und dem doppelsträngige RNA-bindenden Protein R2D2 werden diese kleinen RNAs an das Protein Argonaute (AGO) abgeben. Dieses baut einen Strang der doppelsträngigen, kleinen RNAs über seine RNAse-Aktivität ab und hält den anderen (Führungs-) Strang gebunden. Daraufhin wird entweder komplementäre mRNA abgebaut oder die Translation komplementärer mRNA verhindert. RNAi dient im Organismus unter anderem der Verteidigung gegen Viren, wobei die Expression viraler Proteine durch RNAi verhindert wird. Durch Koevolution haben Viren allerdings Mechanismen zur Unterdrückung der RNAi in den Wirtszellen entwickelt. Ein RNAi Suppressor ist das Protein B2 des Nodamura Virus (NMV B2). Um Mechanismen und Gemeinsamkeiten der RNAi Suppression durch Viren analysieren zu können, wurde in dieser Arbeit die Röntgenstruktur der RNA bindenden Domäne von NMV B2 gelöst. Hierfür wurde ein Konstrukt (Aminosäuren 1-79) bis zur Homogenität aufgereinigt. Kristalle wurden mit einer Proteinkonzentration von 15 mg/ml mittels der Dampfdiffusions-Methode des hängenden Tropfens hergestellt. Diese wuchsen innerhalb von zwei Tagen als lange Nadeln mit Ausmaßen von 200 x 10 x 10 μm. Bei Messungen am ESRF in Grenoble wurde eine Auflösung bis 2,5 Å erreicht. Das Protein kristallisierte mit einem Dimer pro asymmetrischer Einheit. Die Kristalle wuchsen in der Raumgruppe P212121 mit den Einheitszelldimensionen a = 32.2, b = 56.6, c = 98.6. Die Phase wurde über molekularen Ersatz mit der Struktur des homologen Proteins B2 des Flock House Virus (FHV B2) bestimmt. Die Struktur stellte sich als ein gestrecktes Dimer mit einer Größe von ca. 55 x 10 x 15 Å, bestehend aus drei Alpha-Helices pro Monomer dar. Trotz geringer Sequenzidentität von NMV B2 und FHV B2 zeigten beide Strukturen ein Vier-Helix-Bündel, das von einer sehr kurzen Helix am C-Terminus bedeckt ist. Bei einem Vergleich der RNA-bindenden Aminosäurereste der beiden Strukturen fällt ein hoher Grad an Konservierung auf. Von zehn RNA-interagierenden Resten sind fünf identisch. Die RNA bindenden Reste werden von beiden Monomeren des Dimers beigetragen. So ist wohl mindestens ein Dimer für die RNA-Bindung durch B2 Proteine notwendig.
In dieser Arbeit wurde die Verteilung von Glykolyseenzymen in Kulturzellen unter normalen und die Glykolyse stimulierenden und hemmenden Bedingungen untersucht. Die Hauptfunktion, die der Strukturbindung und -Bildung von Glykolyseenzymen zugeschrieben wird, ist das so genannte metabolite-channelling bzw. substratechannelling, also die effiziente, lokale Bereitstellung von ATP. Im Mittelpunkt dieser Untersuchungen stand Aldolase (EC 4.1.2.13). Unter allen Bedingungen liegt Aldolase, wie die meisten anderen Glykolyseenzyme gleichzeitig sowohl in strukturgebundener, als auch in gelöster Form im Cytoplasma vor. Unter normalen Kulturbedingungen wurde die strukturgebunde Aldolase an Stressfasern sowie dem fibrillären Aktin-Netzwerk des Zellkortex vorgefunden. Diese Beobachtungen wurden an fixierten Zellen gemacht; an lebenden Zellen konnte die Bindung an Stressfasern durch Mikroinjektion fluorochromierter Aldolase direkt nachgewiesen werden. Ferner wurde beobachtet, dass Aldolase selbst, unabhängig vom Vorhandensein von Aktin in der Zelle netzwerkartige Strukturen bilden kann. Das Hinzufügen von Aldolase zu in vitro polymerisierten Aktinfilamenten führte zu einer Bündelung der Aktinfilamente, die wahrscheinlich auf eine quervernetzende Wirkung dieses Enzyms zurückzuführen ist. Durch Injektionen mit Gemischen unterschiedlich markierter Glykolyseenzyme konnte gezeigt werden, dass diese Enzyme auch in gelöster Form nicht völlig homogen in den Zellen verteilt sind. In Gegenwart hoher Substratkonzentrationen wurde entdeckt, dass Aldolase in großem Ausmaß an Intermediärfilamente gebunden wird. Da dieses Verhalten zwar unabhängig von der Präparationsmethode auftrat, in vitro durch Kosedimentation aber nicht bestätigt werden konnte, ist anzunehmen, dass neben dem Substrat weitere Faktoren bei diesem Phänomen eine Rolle spielen. Die Applikation von Insulin führte zu keinerlei mikroskopisch beobachtbaren Änderungen im Bindungsverhalten der Aldolase. Dennoch konnte eine geringe Steigerung der Aktivität in der unlöslichen Fraktion des Zellproteins nachgewiesen werden. Die Mikroinjektion unphysiologisch hoher Mengen von Aldolase führte zu einem drastischen Abbau von Aktinfilamenten und Stressfasern in den injizierten Zellen. Andere Glykolyseenzyme (GAPDH, PGM, LDH und TIM) zeigten dagegen keinerlei Wirkung. Der selbe Effekt ist bereits für PFK beschrieben worden, wo er durch eine starke Assoziation der PFK mit Gelsolin hervorgerufen wird. Der Wirkungsmechanismus bei der Aldolase ist dagegen bislang nicht bekannt. Durch die Inkubation fixierter Zellen mit fluorochromierter Aldolase wurden eine große Zahl freier Bindungsstellen an Mikrotubuli entdeckt. Allerdings konnten keine Bedingungen ermittelt werden, unter denen die intrazelluläre Aldolase an Mikrotubuli bindet. Weiterhin wurde ein Experiment entworfen, um die lokale Bereitstellung von Energie in Form von ATP und metabolite-channelling nachzuweisen. Dazu wurden Monolayerkulturen durch Hemmung von Atmung und Glykolyse ATP-entleert und durch Permeabilisierung alle löslichen Bestandteile freigesetzt. Die Gabe verschiedener ATP-Konzentrationen führte in diesem Fall zu einer Kontraktion der verbleibenden Zellbestandteile, wobei die Kontraktionsgeschwindigkeit abhängig von der gegebenen ATPKonzentration war. Durch die Gabe von FBP und ADP konnte diese Kontraktion ebenfalls ausgelöst werden, was für die Konversion von ADP zu ATP wodurch ein von FBP und den strukturgebundenen Enzymen unterhaltener glykolytischen FluSS und somit metabolite-channelling nachgewiesen wurde.
Sodium proton antiporters are ubiquitous membrane proteins found in the cytoplasmic and organelle membranes of cells of many different origins, including plants, animals and microorganisms. They are involved in cell energetics, and play primary roles in the homeostasis of intracellular pH, cellular Na+ content and cell volume. Adaptation to high salinity and/or extreme pH in plants and bacteria or in human heart muscles requires the action of such Na+/H+ antiporters. NhaA is the essential Na+/H+ antiporter for pH and Na+ homeostasis (at alkaline pH) in Escherichia coli and many other enterobacteria. NhaA is an electrogenic Na+/H+ antiporter that exchanges 2H+ for 1Na+ (or Li+). NhaA shares with many other prokaryotic and eukaryotic antiporters a very strong dependence on pH. In order to achieve three-dimensional structure of NhaA, the previously described NhaA protein preparation was modified: (i) the wild type bacterial strain (TA16) used for homologous over-expression of NhaA was replaced with a delta nhaA strain (RK20). As a result, the purity and homogeneity of the sample was significantly improved; (ii) the previously two-step purification procedure was shortened to a single step affinity chromatography purification; (iii) a wide-range screening of crystallisation conditions, more than 20,000, was performed; (iv) a Seleno-L-methionine (SeMet) NhaA derivative was produced in order to solve the phases during structure determination. In parallel, attempts of production and crystallisation of co-complexes composed of NhaA and antibody fragments have been made. Four different monoclonal antibodies were available against NhaA. Selected antibody fragments were produced and the stability of the complex analysed. Here, the crystal structure of the pH down-regulated secondary transporter NhaA of Escherichia coli is presented at 3.45 Å resolution. A negatively charged ion funnel opens to the cytoplasm and ends in the middle of the membrane at the putative ion-binding site. There, a unique assembly of two pairs of short helices connected by crossed, extended chains creates a balanced electrostatic environment. A possible mechanism is proposed: the binding of charged substrates causes electric imbalance inducing movements, which allow for a rapid alternating access mechanism. This ion exchange machinery is regulated by a conformational change elicited by a pH signal perceived at the cytoplasmic funnel entry. The structure represents a novel fold that provides two major insights: it reveals the structural basis for the mechanism of Na+/H+ exchange and its unique regulation by pH in NhaA and in many other similar antiporters. Furthermore, it is also important for the understanding of the architecture of membrane proteins in general. However, although many aspects of the ion-translocation mechanism and pH regulation are clarified by the NhaA structure, higher resolution structures with Li+ or Na+ bound are required for understanding the ligand binding and the translocation mechanism at the atomic level. The alkaline pH-induced conformation is essential to further understand the pH-control and proton access to the binding site.
TeaABC from the halophilic bacterium Halomonas elongata belongs to the family of tripartite ATP-independent periplasmic (TRAP) transporters. It facilitates the uptake of the compatible solutes ectoine and hydroxyectoine which protect the cell from dehydration by accumulating in the cytoplasm during hyperosmotic stress. It is the only known TRAP transporter activated by osmotic stress. Ectoine and hydroxyectoine accumulation in H. elongata is regulated by the cytoplasmic universal stress protein TeaD. The gene encoding TeaD is located in the same operon as the TeaABC gene. TeaD regulates the cellular homeostasis of ectoine possibly by interacting directly or indirectly with TeaABC. All subunits of TeaABC and TeaD were expressed in E. coli and purified. With TeaD and the solute binding protein (SBP) TeaA high levels of expression suitable for crystallization could be obtained and their 3D structures solved. The small transmembrane protein TeaB and the transporter TeaC showed only moderate and low levels of expression respectively. Functional analysis on TeaA was performed using Isothermal Titration Calorimetry. The measurements demonstrate that TeaA is a high affinity ectoine-binding protein (Kd = 0.19 _M) that also has a significant affinity for hydroxyectoine (Kd = 3.8 _M). The structure of TeaA was solved using ab initio phase determination by MAD (multiple anomalous dispersion). TeaA structures were determined in three conformations: TeaA alone, TeaA in complex with ectoine and TeaA in complex with hydroxyectoine. The resolutions of the structures were 2.2, 1.55 and 1.80 Å, respectively. These represent the first structures of an osmolyte SBP associated to a TRAP transporter. The structures reveal similar ligand binding compared to osmolyte SBPs of ABC transporter pointing to coevolution of the ligand binding modes. Moreover, unique features such as the solvent-mediated specific binding of the ligands ectoine and hydroxyectoine could be observed for TeaA. The structure of TeaD in complex with its cofactor ATP was solved by molecular replacement at a resolution of 1.9 Å. Comparison with other structures of universal stress proteins shows striking oligomerization and ATP binding in TeaD. In conclusion, this work presents the first detailed analysis of the molecular mechanisms underlying ligand recognition of an osmoregulated transporter from the TRAP-transporter family.
Membranes are essential for life, because a cell must separate itself from the environment to keep its molecules from dissipating away and also must keep out foreign molecules that disturb them or their cell components. However, the cell must communicate with the environment and adapt to the external conditions, needs to pump in nutrients and release toxic products of its metabolism. Membrane proteins present in the membranes of the cell and cell organelles, help the cell to gather information about the environment and perform various biological processes. Membrane proteins perform a wide range of biological functions including respiration, signal transduction and transport. Despite their high importance in biological function, only few structures have been determined because of the difficulties in producing high amounts of membrane proteins and obtaining good quality crystals. This Ph. D. thesis involves the study of different kinds of cytochrome oxidases and a membrane anchored cytochrome oxidase electron donor. Though structures of many cytochrome oxidases are known to date, there exist many different types of oxidases in different organisms, which help the organism to survive under unfavorable environmental conditions. The structural differences between these terminal oxidases which make the organism to survive in extreme environments are unclear. To investigate these, structures of different types of oxidases are necessary. Therefore, we are interested in revealing the structural details of different types of oxidases. The different types of oxidase I worked with were the caa3 HiPIP:oxygen oxidoreductase from Rhodothermus marinus, the aa3-type quinol oxidase from Acidianus ambivalens and bd-type quinol oxidase from three different organisms (Escherichia coli, Bacillus thermodenitrificans and Aquifex aeolicus). Besides the protein from E. coli all other proteins are from thermophilic organisms from which the proteins obtained are generally believed to be highly stable. The presence of a high content of charged amino acids that enhances the occurrence of salt bridges contributes to the stability of thermophilic proteins. ....
RNA interference (RNAi) is triggered by recognition of double-stranded RNA (dsRNA), and elicits the silencing of gene(s) complementary to the dsRNA sequence. RNAi is thought to have emerged as a way of safeguarding the genome against mobile genetic elements and viral infection, thus maintaining genomic integrity. dsRNA is first processed into small interfering RNAs (siRNA) by the enzyme Dicer. siRNAs are ~21 to 25 -nt long, and contain a signature 5’ phosphate group and a two nucleotide long 3’ overhang (Bernstein et al., 2001). The siRNA is then loaded into the RNA-induced si-lencing complex (RISC), of which Argonaute is the primary catalytic component (Liu et al., 2004). Energetic asymmetry of the siRNA ends allows for its directional loading into RISC (Khvorova et al., 2003; Schwarz et al., 2003). Argonaute cleaves the passen-ger strand of the siRNA, leaving the guide strand of the siRNA bound to RISC (Gregory et al., 2005; Matranga et al., 2005; Rand et al., 2005). This single-stranded guide strand siRNA bound to Argonaute is able to recognize target mRNA in a sequence-specific manner, and cleaves the mRNA. Argonaute 2 in complex with single-stranded siRNA is sufficient for mRNA recognition and cleavage, thus forming a minimal RISC (Rivas et al., 2005). miRNAs, endogenously expressed small RNA genes which typically contain mismatches and non-Watson-Crick base pairing, are processed by this general pathway, although typically modulate gene expression by translational repression as opposed to cleavage of their target mRNA. The number of Argonaute genes is highly variable between species, ranging from one in S. pombe to twenty-seven in C. elegans. Earlier crystal structures of Argonaute apoen-zymes show the architecture of Argonaute to be a multidomain protein composed of N terminal, PAZ, MID, and PIWI domains (Song et al., 2004; Yuan et al., 2005). These multi-domain proteins are present in both prokaryotic and eukaryotic organisms. The role of Argonaute proteins in prokaryotes is still unknown, but based similarity to eu-karyotic Argonautes, they may also be involved in nucleic acid-directed regulatory pathways. These proteins have served as excellent models for learning about the struc-ture and function of this family of proteins. RNAi has found a widespread application for the simple yet effective knockdown of genes of interest. The catalytic cycle of RISC requires the binding of a number of different nucleotide structures to Argonaute, and we expect Argonaute to undergo a number of conforma-tional changes during the cycle of mRNA recognition by RISC (Filipowicz, 2005; Tom-ari and Zamore, 2005). Nevertheless, it remains unclear how the multi-domain ar-rangement of Argonaute recognizes and distinguishes between single-stranded and dou-ble-stranded oligonucleotides, which correspond to the Dicer-processed siRNA product, guide strand siRNA, and the guide strand / mRNA duplex. The Argonaute protein from Aquifex aeolicus was cloned, expressed, crystallized and solved by molecular replacement. Relative to earlier Argonaute structures, a 24° reorientation of the PAZ domain in this structure opens a basic cleft between the N-terminal and PAZ domains, exposing the guide strand binding pocket of PAZ. A 5.5-ns molecular dynamics simulation of Argonaute showed a strong tendency of the PAZ and N-terminal domains to be mobile. Binding of single-stranded DNA to Argonaute was monitored by total internal reflection fluorescence spectroscopy (TIRFS). The experi-ments showed biphasic kinetics indicative of large conformational changes, and re-vealed a hotspot of binding energy corresponding to the first 9 nucleotides, the so-called “seed region” most crucial for sequence-specific target recognition. As RNAi may have evolved as a way of safeguarding the genome viral infection, it is not surprising that viruses have evolved different strategies to suppress the host RNAi response in the form of viral suppressor protein. (Hock and Meister, 2008; Lecellier and Voinnet, 2004; Rashid et al., 2007; Song et al., 2004; Vastenhouw and Plasterk, 2004). These viral suppressors are widespread, having been identified in a number of different viral families. Not surprisingly, they generally share little sequence homology with one another, although they appear to exist as oligomers built upon a ~ 100-200 amino acid protomer. Tomato aspermy virus, a member of the Cucumoviruses, encodes for protein 2B (TAV 2B, 95 a.a., ~11.3 kDa) that acts as an RNAi suppressor. Intriguingly, a similar genomic arrangement is seen in RNAi suppressors in the Nodaviruses, a family of viruses that can infect both plants and animals, such as Flock house virus b2 (FHV b2). The 2B and b2 proteins are both derived from a frameshifted ORF within the RNA polymerase gene (Chao et al., 2005). In spite of this genomic similarity, the 2B and b2 proteins share little sequence identity, and it is not well understood how the Cucumovirus 2B proteins suppress RNAi. To address how TAV 2B suppresses RNAi, the oligonucleotide-binding properties of TAV 2B were studied. TAV 2B shows a preference for double-stranded RNA oligonucleotides corresponding to siRNAs and miRNAs, and also binds to single-stranded RNA oligonucleotides. A stretch of positively charged residues between amino acids 20-30 are critical for RNA binding. Binding to RNA oligomerizes and induces a conformational change in TAV 2B into a primarily helical structure. These studies sug-gest that suppression of RNAi by TAV 2B may occur by targeting different stages of the RNAi pathway. TAV 2B falls under the category of more general RNAi suppres-sors, with potentially multiple targets for suppression.
Im Jahr 1991 trat das Abkommen zur Erhaltung der in Europa und den außereuropäischen Arealstaaten vorkommenden Populationen der Arten der Säugerordnung Chiroptera in Kraft (EUROBATS: The Agreement on the Conservation of Populations of European Bats). Zuvor waren die Säuger allgemein schon in dem „Übereinkommen zur Erhaltung der wandernden wildlebenden Tierarten“ in Anhang II (Oktober 1985) aufgelistet. Auch in der Liste der in Deutschland vorkommenden Arten der Anhänge II, IV und V der FFH-Richtlinie (92/43/EWG) sind alle einheimischen Fledermausarten (Anhang II und IV) erwähnt. Für die Erhaltung der Fledermäuse ist der Schutz wichtiger „Stätten“ (z. B. Zwischenquartiere, Winterschlafquartiere, Wochenstubenquartiere) unumgänglich. Die Erhaltung und der Schutz, sowohl der Quartiere als auch der Futterplätze, vor Beschädigung oder Beunruhigung sind nach diesem Abkommen sicherzustellen. Diese Arbeit über die Stoffwechseldaten soll klarstellen, wie wichtig der Schutz der Fledermausquartiere - vor allem im Winter – ist. Der Energieverbrauch und die Anpassung der einheimischen Arten an Umgebungstemperaturen (Ta) soll mit Messwerten untermauert und mit der tropischen Art Carollia perspicillata verglichen werden. Weiterhin ist es Ziel dieser Arbeit, einen alternativen Versuchsaufbau zu entwickeln, der die Berechnung der Stoffwechselrate (SWR) ohne das Fangen der Tiere ermöglichen soll. Mit Hilfe einer IR-Kamera sollen Bilder von der Körperoberflächentemperaturverteilung und gleichzeitig Stoffwechselmessungen gemacht werden. Da die Körpertemperatur (Tb) und die SWR bei den einheimischen Fledermausarten direkt voneinander abhängig sind (HANUS 1959), könnte diese Methode hier angewandt werden. Nach der Erstellung einer Datenbank (SWR/IR-Bild) kann dann nur durch die IR-Bilder Rückschlüsse auf die SWR gezogen werden. Bei nordamerikanischen Arten konnte bestimmt werden, dass mindestens 75 % der Energiereserven, die eine Fledermaus für den Winterschlaf zur Verfügung hat, während der Aufwachphasen verbraucht werden (THOMAS et al. 1990). Eine Störung im Winterquartier führt zum Erwachen der Tiere. Nach einem Aufwachvorgang sind die Abstände des Wiedererwachens zunächst kürzer. Je kürzer die Fledermäuse im Torpor sind, desto schneller wachen sie auf. Dies verstärkt die Aufwachwahrscheinlichkeit und die damit verbundene Kettenreaktion, je öfter die Störungen auftreten (THOMAS et al. l.c.). Dies führt zu einem zusätzlichen Energieverbrauch. Der Einfluss einer Störung ist noch bis zu 8 h später in einem Winterquartier durch erhöhte Flugaktivität zu bemerken (THOMAS 1995). Dies lässt sich daraus erklären, dass die Tiere, die aufgewacht sind und aktiv sind, andere Fledermäuse durch ihre Aktivität aufwecken (Berührung, Wärme, Reproduktionsverhalten etc.). Dies soll nun auch für einheimische Arten überprüft werden. Aus den vorliegenden Erkenntnissen und den eigenen Messergebnissen sollen dann folgende weitere Fragen beantwortet werden: - Warum besteht die Notwendigkeit die Winterquartiere vor Störungen zu schützen? Welche tatsächliche Bedeutung haben Störungen im Winterquartier auf die Energetik der Fledermäuse? - Wie viel Energie verbrauchen die Fledermäuse im Sommer in Abhängigkeit von der Ta? - Gibt es Unterschiede zwischen der SWR der tropischen Art Carollia perspicillata und den einheimischen Arten? Die Vergleichbarkeit der Ergebnisse ist durch identische Messbedingungen gewährleistet. - Lassen sich aus den SWR unterschiedliche Abhängigkeiten (Körpermasse (bm), Ta etc.) ableiten? - Hat die Nahrung den erwarteten Einfluss auf den RQ-Wert? Die Stoffwechseldaten sind deshalb so wichtig, da man damit zeigen könnte, welch extremer Ressourcenverlust für die Fledermaus mit einer Störung verbunden ist. Die Notwendigkeit des Schutzes der Fledermäuse vor Störungen im Quartier, sowohl der Sommer-, als auch die Winterquartiere, wäre dann mit Messdaten belegt. Die Unterschiede in der Abhängigkeit der SWR von der Ta, der bm, der Ernährungsform und der Tb sowohl im Wachzustand als auch im Torpor, soll für verschiedene Arten geklärt werden.
Durch Beobachtungen individuell farbmarkierter Meisen und Kleiber an einer Futterstelle zwischen Sommer und Frühjahr konnte erstmals die Struktur gemischter Meisenschwärme und ihre Veränderung im Jahresverlauf systematisch analysiert werden. Nur im Winter bilden sich sehr kompakte Schwärme von durchschnittlich 27 Individuen, die sich schnell fortbewegen und nur zehn bis fünfzehn Minuten an der Futterstelle verweilen. Ihr Auftreten ist sowohl mit der Tageslänge als auch direkt mit der Temperatur korreliert. Eine Erniedrigung der Temperatur führt zu einem engeren Zusammenschluß der Individuen, vor allem auch verschiedener Arten. Dieses Verhalten ermöglicht eine effizientere Nahrungssuche, weil die Individuen von den Kenntnissen der übrigen Schwarmmitglieder über Nahrungsquellen profitieren und weil sie weniger Zeit zum Sichern aufwenden müssen. Die Schwarmgröße ist jedoch nicht temperaturabhängig. Sie wächst mit der Anzahl der Individuen, die an einem Tag die Futterstelle nutzen. Demnach erweitern die Individuen im Winter ihre Aktionsräume, vermutlich aufgrund des erhöhten Nahrungsbedarfs. Dadurch begegnen sich mehr Individuen bei der Nahrungssuche und bilden größere Schwärme. Die individuelle Zusammensetzung der Schwärme verändert sich dabei ständig. Es gibt keine Gruppen fester Zusammensetzung, die auch nur tage- oder stundenweise zusammen blieben. Während die Neigung der Individuen, sich anderen Meisen anzuschließen, im Winter sehr stark ist, spielen individuelle Bindungen für die Schwarmbildung offensichtlich keine Rolle. Dieser offenen Struktur der Schwärme entsprechend, wurde bei der Kohlmeise, die den größten Anteil an den gemischten Schwärmen hatte, nur eine schwach entwickelte, nicht strikt lineare Rangordnung gefunden. Lediglich das Männchen, in dessen Brutrevier die Futterstelle lag, war allen anderen Individuen eindeutig überlegen. Territorialität beeinflußte bei Männchen und Weibchen die Aggressivität. Männchen sind aggressiver als Weibchen, jedoch nicht immer dominanter, das Alter spielt für die Dominanz keine Rolle. Männchen sind um so dominanter, je schwerer sie sind. Männchen, die bis Ende Juli im Gebiet eintreffen oder im Vorjahr schon ansässig waren, sind dominanter als Männchen, die erst ab Oktober eintreffen. Bei jungen Männchen wird die Dominanz hauptsächlich von der Aggressivität bestimmt. Die einzige nachweisbare individuelle Bindung bei Kohlmeisen in Winterschwärmen ist die Paarbindung, die im Gegensatz zu bisherigen Vermutungen bereits ab Oktober besteht. Die Wahl von Freßkumpanen ist dennoch nicht völlig beliebig. Männchen meiden einander, und Weibchen ziehen andere Weibchen als Freßkumpaninnen vor, weil sie von Männchen vom Futter verdrängt werden könnten. Bei einander bereits bekannten Brutvögeln ist dies jedoch nicht festzustellen. Männchen, die sich gegenseitig einschätzen können, meiden einander nicht grundsätzlich. Auch verpaarte Weibchen meiden bekannte Männchen nicht. Sie profitieren vielleicht auch vom Status ihres Männchens. Sowohl die schwach ausgeprägte Rangordnung als auch das Fehlen individuell aneinander gebundener Gruppen bei Kohlmeisen widerspricht der einzigen systematischen Freilanduntersuchung zur Sozialstruktur der Kohlmeise, die in einer Population der japanischen Unterart P. m. minor feste Gruppen konstanter Zusammensetzung fand. Ein selektiver Vorteil von Gruppen konstanter Zusammensetzung ist nicht zu erkennen, da keine gemeinsamen Territorien verteidigt werden und sich Individuen verschiedener Gruppen frei mischen. Die zwischenartliche Dominanzstruktur in den gemischten Schwärmen war eindeutig. Kleiber, die sich einzeln oder paarweise Meisenschwärmen anschließen, dominieren alle Meisenarten, Kohlmeisen dominieren Blau- und Sumpfmeisen. Letztere sind allen anderen Arten unterlegen. Dementsprechend bevorzugen Sumpf- und Blaumeisen Artgenossen als Freßkumpane. Kohlmeisen ziehen jedoch die schwächeren Blaumeisen ihren eigenen Artgenossen vor. Dominante Arten profitieren von der gemeinsamen Nahrungssuche mit untergeordneten Arten, weil sich die Nahrungskonkurrenz, die mit der Schwarmbildung immer verbunden ist, auf sie weniger negativ auswirkt. Als schwächste Art bleiben die Sumpfmeisen innerhalb gemischter Schwärmen meist deutlich unter sich und mischen sich nur im Winter stärker mit anderen Arten. Durch den erhöhten Nahrungsbedarf und die stark herabgesetzte Aggressivität der Individuen in dieser Zeit übersteigt dann der Vorteil großer Schwärme für die Nahrungssuche den Nachteil der Konkurrenz auch für unterlegene Individuen.
Höhere Eukaryoten stellen ein Ensemble von Zellen dar, die in Kompartimente unterteilt sind. Somit sind intra- und interzelluläre Transportprozesse entscheidend für das Überleben dieser Zellverbände. In meiner Arbeit habe ich Evolution und Struktur von Translokationskomplexen untersucht, um einige Aspekte dieser komplexen Systeme zu untersuchen. Eingangs befassten wir uns mit Rezeptorsystemen am Beispiel des Proteintransports. Mittels phylogenetischer Analysen fanden wir heraus, dass Pex5 nicht der Urahn der anderen untersuchten 3-TPR-Domänen ist, obwohl Pex5 in allen eukaryotischen Organismen vorkommt. Ein Vergleich der 3-TPR-Domänen mit der restlichen Sequenz des Rezeptorproteins ergab, dass die 3-TPR-Domänen eine langsamere Evolutionsgeschwindigkeit aufweisen, was für eine Evolutionseinschränkung durch Interaktionspartner spricht. Sec72 ist möglicherweise aus einer TPR1 (Hop) Domäne entstanden und eine Funktion als Hsp70-erkennende Komponente des Sec-Komplexes für den post-translationalen Import kann daraus abgeleitet werden. „Recycling“ von 3-TPR-Domänen anderer Proteine konnten wir durch unsere phylogenetische Analyse auch für die zweite 3-TPR-Domäne von Tom34 nachweisen, die mit CYP40/FKBP51/52 clustert. Darüber hinaus war es uns möglich, die plastidär bzw. mitochondriell lokalisierten Formen von Toc64 phylogenetisch zu unterscheiden. Durch Erzeugung von Homologiemodellen konnten organellspezifische Aminosäuren strukturell eingeordnet werden. Dabei stellten wir fest, dass sich fast alle Positionen, die sich in der Aminosäurekomposition unterscheiden, auf der konvexen Seite der 3-TPR-Domäne befinden. Molekulardynamische Simulationen zeigten zudem deutliche Veränderung der Hauptbewegungen der 3-TPR-Domänen nach Komplexierung mit dem Hsp90-C-Terminus. Bei Bindung des Liganden werden intramolekulare Wasserstoffbrücken sowohl auf der konvexen als auch konkaven Seite der 3-TPR-Domäne „umgeschaltet“. Diese Erkenntnisse führen zu zwei Hypothesen: 1.) die Organellspezifität der Rezeptoren wird durch die Interaktion mit anderen Komplexpartnern garantiert und 2.) die Änderungen des Wasserstoffbrückennetzwerkes auf der konvexen Seite nach Hsp90-Bindung führen zur Ausbildung der Bindungsstelle für die andere Komplexkomponente. Beide Hypothesen erklären die experimentellen Beobachtungen bezüglich der Rezeptoren und warum keine phylogenetischen Hinweise für die Existenz von Vorstufenprotein-spezifischen Hsp70/90-Proteinen gefunden werden konnten. Nach dem Rezeptor haben wir uns mit dem Translokationsprozess befasst. Wir konnten phylogenetisch zeigen, dass sich Omp85 aus Proteobakterien im Vergleich zu Cyanobakterien und Eukaryoten insbesondere durch andersartige POTRA Domänen auszeichnet und fanden zwei konservierte Motive in der Porenregion. Zudem konnten wir im Heterokontophyten P. tricornutum ein vollständiges Omp85 identifizieren (bipartite Signalsequenz, 2 POTRAs, Pore mit langen Schleifen). Die Aminosäuresequenz weicht teils deutlich von den bekannten Omp85-Proteinen ab, was die Entdeckung erschwerte. Wir haben damit geklärt, dass auch im Translokationsapparat von komplexen Plastiden ein b-Fassprotein der Omp85 Familie die Kerneinheit bildet. Ebenfalls zu den Protein-transportierenden b-Fassproteinen gehört TolC, das aber im Gegensatz zu Omp85 auch andere Substanzen, wie zum Beispiel Siderophore transportiert. Alr2887 ist das einzige TolC-ähnliche Protein aus Anabaena sp. PCC7120. Vergleichende Phänotypuntersuchungen weisen auf eine Interaktion eines ABC-Transporters (DevBCA Operon) mit Alr2887 hin. Die Distanz zwischen äußerer Membran und Plasmamembran ist in Anabaena doppelt so groß wie in E. coli. Entsprechend fanden wir im Adapterprotein DevB eine stark verlängerte dimere Doppelwendel, die das von TolC gebildete a-Fass im Periplasma bis hin zum ABC-Transporter in der Plasmamembran theoretisch fortsetzen kann. Da verschiedenste in Anabaena existierende ABC-Transporter TolC als Abflusskanal benötigen, nehmen wir an, dass Alr2887 ein Rundumtalent in Bezug auf die zu transportierenden Substrate darstellt. Dieses ist auch aufgrund der basalen Einordnung im phylogenetischen Baum zu vermuten; es könnte somit auch in den „Multi-Drug-Efflux“ involviert sein. Nicht nur ABC-Transporter, auch TonB-abhängige Transporter stehen in funktionellem Zusammenhang mit TolC. Wir haben Aminosäuresequenzen von ~4600 TBDTs aus Gram-negativen Bakterien und Cyanobakterien zusammengetragen und nach ihrer paarweisen Ähnlichkeit geclustert. Anhand experimentell charakterisierter TBDTs mit bekannten Substraten und TBDTs mit vorhergesagten Substraten konnten wir sehr vielen Clustern ein Substrat zuordnen, das die in ihnen zusammengefassten TBDTs aller Wahrscheinlichkeit nach importieren. Wir konnten ferner feststellen, dass es noch eine Menge weiterer Cluster mit unbekannten Substratspezifitäten gibt und unsere Analysen stimulieren somit die Arbeiten an diesem System im Allgemeinen und in Cyanobakterien im Besonderen.
Channelrhodopsin-2, or ChR2, is a light-gated inward rectifying cation channel. Ever since its first characterisation (Nagel et al., 2003), it has been used extensively in the light-activated control of neural cells in culture as well as in living animals like mice, Caenorhabditis elegans and Drosophila melanagaster. Despite its broad application in the field of neuroscience, little is known about the properties of this ion channel. The aim of this thesis is to elucidate the single channel conductance under different conditions using stationary noise analysis on whole cell recordings of a HEK293 cell line that stably expresses the truncated ChR2 (amino acids 1-315), which behaves identically to the full length protein (Nagel et al., 2003). Stationary noise analysis is based on the fact that the ion channel noise due their opening and closing has a characteristic form of a plateau at low frequency points and a following decrease of power with 1/f² in difference power spectra, which are composed of the difference of fast Fourier transformed (FFT) stationary whole-cell recordings with and without illumination. From the parameters yielded by an approximation of the power spectra with a Lorentzian function the single channel conductance can be estimated. The single channel conductance of ChR2 was determined at -60 mV applied for different cations, yielding values of 91 ± 25 fS (Guanidine+), 42 ± 7 fS (Na+), 61 ± 18 fS (Li+) and 37 ± 14 fS (Methylammonium+). With 200 mM Guanidine+ outside of the cells and measurements between 0 mV and -60 mV applied, it could be shown that the inward rectification is still present on the scale of the single channel. Noise Analysis with concentrations between 40 and 200 mM Guanidine+ showed a saturation of the single channel conductance with high Guanidine+ concentrations with a maximal conduction of 129 ± 9 fS (Michaelis Menten approximation: Km = 82 ± 14 mM). Activation Energies of the rate constants k (2πfc, with fc = corner frequency of the Lorentzian function) and koff (1/τoff, with τoff = closing time of the channel at -60 mV) were determined to be 75 ± 23 kJ/mol and 64 ± 11 kJ/mol, respectively, which are similar to the value determined for the Channelrhodopsin-1 closing times (~60 kJ/mol; Nagel et al., 2002). The activation energy of the ChR2 single channel conductance was determined to be 21.2 ± 20.8 kJ/mol, which also is similar to the activation energy of the ChR1 current amplitude (20 kJ/mol; Nagel et al., 2002). The amount of active ChR2 channels in the membrane (160,000 or 226 ChR2/μm²) as well as the single channel current (-7.5 ± 0.6 fA) could be determined by variation of the light intensity (0.05 mW mm-2 to 5.3 mW mm-2). In the course of this thesis, the single channel parameters of the ChR2 mutant H134R were also determined. H134R had been previously published as a “gainof- function” mutant (Nagel et al., 2005a). The increased macroscopic current amplitude of H134R could be explained by an increased lifetime of the channel in comparison to the wildtype ChR2. Within the margin of error both single channel conductances in the presence of 200 mM Guanidine+ of the wildtype (91.1 ± 24.9 fS) and the H134R (89.4 ± 30.7 fS) are the same. In the presence of 200 mM Lithium+ values of 60.6 ± 17.8 fS for the wildtype ChR2 and 50.8 ± 9.6 fS for the H134R mutant were determined. This thesis marks the first in depth analysis of the single channel conductance of ChR2. Using stationary noise analysis the single channel conductance of Channelrhodopsin-1 as well as interesting Channelrhodopsin-2 mutants can also be analysed in the future.
An den Folgen von AIDS sind bisher fast 20 Millionen Menschen gestorben. Mit der Einführung der hochaktiven antiretroviralen Therapie (HAART) konnte erstmals die Viruslast bei gleichzeitiger Erhöhung der CD4-Lymphozytenzahl effizient erniedrigt werden. Dadurch konnte zwar eine Kontrolle der Virusreplikation und damit verbunden eine längere Überlebenszeit erreicht werden, jedoch ist eine vollständige Eradikation des Virus bisher nicht möglich. Hohe Behandlungskosten, Nebenwirkungen der antiviralen Substanzen, ihre unzureichende Wirkung in manchen Körperkompartimenten und die rasche Verbreitung resistenter Viren schränken die Effektivität von HAART ein. Alternative Therapieformen zielen in den letzten Jahren verstärkt auf die HIV-Eintrittshemmung durch Inhibition der Membranfusion von Virus und Wirtszelle („Fusionsinhibitoren“). Peptide, die sich aus der „heptad repeat“ Region 2, HR2, des gp41 ableiten (C-Peptide), sind äußerst wirksame antivirale Substanzen. 2003 wurde T-20, ein 36 Aminosäure langes C-Peptid, als erster Fusionsinhibitor zugelassen. Sein breiter Einsatz ist jedoch aufgrund rascher Resistenzbildung, mangelnder oraler Verfügbarkeit, einer äußerst kurzen Serumhalbwertszeit sowie daraus resultierender hoher Therapiekosten limitiert. Aufgrund dessen sollte in der vorliegenden Arbeit mit der Entwicklung von RNA-Aptameren als HIV-Fusionsinhibitoren ein neuer therapeutischer Ansatz etabliert werden. Zur Isolierung dieser RNA-Aptamere wurden zwei hoch komplexe RNA-Bibliotheken in manuellen sowie automatisierten Selektionen gegen verschiedene Zielstrukturen auf dem HIV-1 gp41 mit Hilfe der SELEX-Technologie selektiert. Der Wirkmechanismus der isolierten RNA-Aptamere sollte analog zu den gp41 HR-abgeleiteten Peptiden auf der Hemmung der Ausbildung des Sechs-Helix-Bündels als fusionaktive Struktur beruhen. So sollten die RNA-Aptamere die Ausbildung der zentralen N coiled-coil Struktur verhindern (Selektion gegen HR1-Peptide) oder die Anlagerung der HR-2 Domänen an die konservierten hydrophoben Furchen des zentralen N coiled-coils inhibieren (Selektion gegen HR2-Peptide). Die gewählten Zielstrukturen wurden entweder als freie synthetische Peptide oder membrangebunden auf der Oberfläche von humanen T-Zellen präsentiert. Um die Selektion von serumstabilen Aptameren zu gewährleisten, wurden die RNA-Aptamere unter Einsatz von 2’-F- oder 2’-NH2-modifizierten Pyrimidinen transkribiert. Nach initialen Selektionsrunden wurden die isolierten Aptamerfraktionen in einer „single-round infection“ unter Einsatz von HIV-Pseudotypvektoren auf spezifische Inhibition des Eintritts von HIV in die Zielzellen analysiert. Die isolierten RNA-Aptamere waren in der Lage, den HIV-Eintritt zu inhibieren, ihre Wirksamkeit war allerdings im Vergelich zu der naiven Bibliothek gering. Nach Durchführung von verschiedenen Reifungsstrategien, um die Affinität der vorselektieren RNA-Fraktionen zum jeweiligen Zielepitop zu erhöhen, konnte die inhibitorische Wirkung der gereiften RNA-Fraktionen auf das 10Fache im Vergleich zu der Urspungsbibliothek verbessert werden. Die wirksamste RNA-Fraktion, 435UU, wurde aus einer Selektion einer aminomodifizierten N30 RNA-Bibliothek gegen das membranverankerte Fusionsprotein M435, bestehend aus gp41 C46 und dem membranproximalen HIV-Linker, und anschließender Kompetiton mit dem 2F5 Antikörper gewonnen. Die 435UU RNA-Fraktion konnte den Eintritt von HIV mit einer IC50 ≈ 200 nM spezifisch hemmen. Weiterhin konnte die spezifische Fusionsinhibition der 435UU Aptamerfraktion in einem Zell-Zellfusionsassay unter Einsatz von HIV env exprimierenden Zellen und einer humanen T-Zelllinie demonstriert werden. Die Affinität der 435UU-Fraktion wurde in einem Gelmobilitätsversuch bestimmt. Die moderate HIV-Eintrittshemmung beruhte auf einer schwachen Bindung (Kd ≈ 750 nM) an das Zielepitop auf dem gp41. Die Analyse von Einzelaptameren aus der 435UU RNA-Population ergab keine signifikanten Unterschiede in ihrem HIV-Neutralisationspotential. Des Weiteren konnten nur wenig gemeinsame Primärstrukturmotive bestimmt werden. Der Gehalt an inkorporierten Pyrimidinen in den 435UU-Einzelaptameren war allerdings mit ca. 70% vergleichsweise hoch. Unter Einsatz von randomisierten RNA-Transkripte mit definiertem Pyrimidingehalt konnte festgestellt werden, dass tendenziell ein höherer Gehalt an NH2-Pyrimidinen die HIV-Neutralisation fördert. Allerdings konnte keine eindeutige Korrelation zwischen der Bindung an das C46-HIVLinker Fusionskonstrukt und dem Pyrimidingehalt der Transkripte ermittelt werden. Die Sekundärstukturvorhersage ergab keine strukturelle Verwandtschaft unter den 435UU-Einzelaptameren noch konnten klar definierte Sekundärstrukturmotive gefunden werden. Die Selektion der 435UU-Aptamerfraktion erfolgte deshalb nich allein aufgrund ihres hohen Pyrimidingehaltes. Ein direkter Vergleich der 435UU Aptamerfraktion mit dem bisher einzigen RNA-Eintrittsinhibitor, einem anti-gp120 RNA-Aptamer, ergab zwar eine geringfügig schwächere HIV-Inhibition, jedoch ein wesentlich breiteres Wirkspektrum der isolierten anti-gp41 RNA-Aptamere wahrscheinlich durch ihren hoch konservierten Wirkmechanismus. Schlussendlich könnte die Wahl der Präsentation der Zielstrukturen sowie der Selektionsdurchführung die Gewinnung von RNA-Aptameren mit moderater Affinität fördern und gleichzeitig zum Verlust von hoch affinen RNA-Strukturen führen. In nachfolgenden Selektionen sollte deshalb die Selektionsstringenz erhöht sowie gegen membrangebundene Zielstrukturen selektiert werden, die die tatsächliche native gp41 Konformation darstellen.
Zusammenfassung (in German) Rostpilze sind obligate Parasiten auf vielen holzigen und krautigen Pflanzen und führen weltweit zu ernsten ökonomischen Schäden in der Landwirtschaft. Weltweit sind zurzeit sind ca. 100 Gattungen und 9000 Arten von Rostpilzen (Pucciniales, Basidiomycota) bekannt. Es gibt fünf verschiedene Entwicklungsstadien mit je eigener Morphologie: Spermogonium, Aecidium, Uredosporenlager, Teleutosporenlager und Basidium. Bei vielen Rostpilzen kommt es im Entwicklungsgang zu einem Wechsel zwischen zwei verschiedenen Wirtsarten. Die Spermogonien werden auf einem haploiden Myzel erzeugt, das sich nach der Infektion des Pflanzengewebes durch Basidiosporen entwickelt. In den Spermogonien entwickeln sich einzellige, monokaryotische, hyaline Spermatien, die in einem süßlichen Exudat ausgeschieden werden. Das Aecidium bildet einzellige, dikaryotische Aecidiosporen in Ketten. Bei der Keimung entwickeln sie dikaryotische Hyphen, welche entweder Uredosporen- oder Teleutosporenlager, aber nicht wieder Aecidien erzeugen. Die Uredosporen der Uredosporenlager dienen der Massenausbreitung, Infektion derselben Wirtsart und wiederholten Bildung neuer Uredosporenlager. Das Ornament der Uredosporen ist variabel: echinulat, verrucos, gestreift verrucos, zerfurcht, runzelig, labyrinthisch, pseudoreticulat oder reticulat. Teleutosporenlager und Teleutosporen sind das wichtigste Stadium für allgemeine Unterscheidungen und die Nomenklatur von Rostpilzen, da sie das sexuelle Stadium repräsentieren. Teleutosporen erzeugen Basidien und Basidiosporen. Teleutosporen sind morphologisch sehr variabel und präsentieren deshalb die nützlichsten zuverlässigen Eigenschaften zur Unterscheidung der Arten. Die Basidien entstehen größtenteils am distalen Ende der Teleutosporenzelle und sind transversal septiert. Die Basidiosporen sitzen auf Sterigmen auf den Basidienzellen und sind globos oder subglobos. Durch die hoch spezifische Abhängigkeit der Rostpilz-Arten von ihren Wirtspflanzen ist die Verbreitung der Rostpilze an die Verbreitung ihrer Wirte gebunden. Jedoch sind vollständige Lebens-Zyklen der Rostarten, mikromorphologische Details der oben genannten Stadien, Spektren der Wirtspflanzen und geographische Verbreitung unvollständig bekannt. Einige dieser offenen Fragen am Beispiel der Rostpilze Panamas zu beantworten ist das Ziel dieser Arbeit. Da für das relativ kleine Land Panama 9.500 Pflanzenarten bekannt sind, wird eine hohe Zahl an Rostpilzarten vermutet. Die Rostpilze Panamas wurden sporadisch von verschiedenen Mykologen studiert. Bis 2007 waren in Panama jedoch lediglich 25 Gattungen und 101 Arten von Rostpilzen bekannt. Für die vorliegende Arbeit wurden in den Jahren 2004 bis 2007 Rostpilze in Panama gesammelt, hauptsächlich in der Provinz Chiriquí im Westen Panamas. Insgesamt wurden 468 Belege geprüft, die 150 verschiedenen Arten von Rostpilzen entsprechen. 233 Belege wurden zwischen 2005 und 2007 im ppMP-Projekt (pflanzenparasitische Mikropilze Panamas) von M. Piepenbring, O. Perdomo, R. Mangelsdorff, T. Trampe und T. Hofmann gesammelt. 76 Belege wurden von M. Piepenbring zwischen 1998 und 2007 gesammelt. 1 Beleg wurde von R. Kirschner (2003) gesammelt. Zusätzlich wurden Belege aus Herbarien konsultiert, 30 Belege aus dem New York Botanical Garden (NYBG), 93 Belege aus den U.S. National Fungus Collections (BPI) und 35 Belege aus der Purdue University (PUR). In dieser Arbeit werden 30 Arten von Rostpilzen aus dem Westen Panamas detailliert beschrieben und durch rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen und Zeichnungen illustriert. Zwei davon sind neue Arten: Puccinia urochloae auf Urochloa decumbes (Poaceae) und Uromyces melampodii auf Melampodium costaricense (Asteraceae). Puccinia urochloae unterscheidet sich von den bekannten Puccinia-Arten durch diorchidioide Teleutosporen, Teleutosporenmaße sowie Paraphysen und Uromyces melampodii von anderen Uromyces-Arten durch die Teleutosporenmaße und Wirtsgattung. 28 Arten werden erstmalig für Panama dokumentiert: für Aecidium psychotriae auf Psychotria cf. carthagenensis (Rubiaceae), für Coleosporium verbesinae auf Verbesina gigantea (Asteraceae), für Crossopsora byrsonimatis auf Byrsonima crassifolia (Malphigiaceae), für Crossopsora uleana auf Solanum trizygum (Solanaceae), für Puccinia cordiae auf Cordia alliodora (Boraginaceae), für Puccinia cyperi-tagetiformis auf Cyperus odoratus (Cyperaceae), für Puccinia enixa auf Baccharis cf. pedunculata, für Puccinia inaudita auf Wedelia inconstans (Asteraceae), für Puccinia psidii auf Syzygium jambos (Myrtaceae), für Puccinia sp. 1 auf Aulonemia patriae (Poaceae), für Puccinia sp. 2 auf Carex longii (Cyperaceae), für Pucciniosira dorata auf Triumfetta bogotensis (Malvaceae), für Uredo ficina auf Ficus sp. (Moraceae), für Uredo hydrocotyles auf Hydrocotyle mexicana (Apiaceae), für Uredo incomposita auf Eleocharis sp. (Cyperaceae), für Uredo jatrophicola auf Jatropha curcas (Euphorbiaceae), für Uredo kyllingiae auf Kyllinga cf. odorata (Cyperaceae), für Uredo melinidis auf Melinis minutiflora (Poaceae), für Uredo notata auf Byrsonima crassifolia (Malpighiaceae), für Uredo peperomiae auf Peperomia glabella (Piperaceae), für Uredo proeminens auf Euphorbia heterophylla and E. hyssopifolia (Euphorbiaceae), für Uredo rubescens auf Dorstenia contrajerva (Moraceae), für Uredo yucatanensis auf Mimosa albida (Fabaceae), für Uromyces bidenticola auf Bidens pilosa (Asteraceae), für Uromyces ictericus auf Iresine celosiae (Amaranthaceae), für Uromyces sp. 1 auf Struthanthus sp. (Loranthaceae) und für Uromyces trifolii-repentis auf Trifolium repens (Fabaceae). Die Zahl der für Panama bekannten Rostpilze erhöht sich mit dieser Arbeit von 101 auf 131 Arten. Für fünf andere Rostpilze werden weltweit neue Wirtsarten genannt: Cordia spinescens als Wirt von Alveolaria cordiae, Eupatorium odoratum als Wirt von Cionothrix praelonga, Xylopia grandiflora als Wirt von Dasyspora gregaria, Cyperus diffusus als Wirt von Puccinia subcoronata, und Calathea indecora als Wirt von Puccinia thaliae. Die Artenvielfalt von Pflanzen in den Tropen ist noch nicht vollständig bekannt, und man kann keine Voraussagen machen oder feststellen, ob ein Gebiet artenreicher ist als andere. Die bescheidene Dokumentation von Rost-Pilzen in Panama beruht auf einem Mangel an Inventuren im Gebiet. Die in Panama am häufigsten vertretenen Wirts-Familien sind die Asteraceae, Cyperaceae, Fabaceae und Poaceae. Die Asteraceae, mit 303 Arten die sechstgrößte Pflanzenfamilie in Panama, haben die größte Zahl der Wirtsarten von Rost-Pilzen in Panama mit 24 Rostarten, nämlich in den Gattungen Cionothrix, Coleosporium, Dietelia, Endophyllum, Puccinia und Uromyces. Die Fabaceae jedoch präsentieren die höchste Zahl der Rost-Gattungen in Panama (Ateloucada, Dicheirinia, Phakopsora, Puccinia, Uraecium, Uredo, Uromyces und Uropyxis) mit 23 Rostarten. Die Fabaceae sind mit einer Gesamtzahl von 487 Arten in Panama die zweitgrößte Pflanzenfamilie. In dieser Studie wurden rasterelektronenmikroskopische Beobachtungen der Morphologie und Ornamentierung von Sporen durchgeführt. Echinulate und verrucose Ornamentierung sind mit dem Lichtmikroskop bei gewissen Arten von Pilzen schwierig zu unterscheiden. Das beobachtete Ornament ist jeweils spezifisch für die Art. Die asexuell gebildeten Uredosporenlager und Uredosporen sind in der Regel das zahlenmäßig am häufigsten anzutreffende Entwicklungsstadium und seine Merkmale sind genügend unveränderlich und unterschieden, um sie taxonomisch zu verwenden. Die taxonomisch nützlichsten Eigenschaften von Uredosporen sind: die Form und Größe der Spore, die Farbe und Stärke der Sporen-Wand, ihre Oberflächenornamentierung, die Zahl und Verteilung der Keimporen. Die Anwesenheit von Paraphysen ist bei Rost-Pilzen taxonomisch nicht wichtig. In den beobachteten Belegen sind Paraphysen sowohl in Uredo- als auch in Teleutosporenlagern vorhanden, allerdings am häufigsten in Uredosporenlagern. Bestimmte Merkmale der Paraphysen können jedoch taxonomisch wichtig sein. In unserer Analyse fanden wir Arten mit pigmentierten Paraphysen bei Crossopsora uleana, Puccinia sp. 1, Uredo jatrophicola, Uredo yucatanensis und Uromyces melampodii. Crossopsora uleana hat verzweigte Paraphysen. Für die Identifikation der Rostpilze ist es notwendig und wesentlich, die Wirtspflanzen zu identifizieren. Dennoch können viele Pflanzenproben nicht leicht identifiziert werden, da viele steril sind, und in den meisten Fällen sind blühende oder fruchtenden Teile für die Pflanzenbestimmung wesentlich. Viele Rostpilzarten wurden in der Vergangenheit sehr knapp und unvollständig, mit irreführenden Angaben und ungenauen Wirtsdaten beschrieben. Rostpilze können im Feld leicht erkannt werden. Es gibt wenige Ausnahmen, die mit anderen pathogenen Pilzen verwechselt werden können. Solch ein Beispiel ist Stigmina anacardii, ein imperfekter Pilz mit oberflächlich ähnlicher Morphologie wie Rostpilze, aber mit Beziehung zu den Ascomycota. Basidien und Basidiosporen von Alveolaria cordiae werden erstmals illustriert und dokumentiert. Am Beispiel von Dasyspora gregaria konnte erstmals eine fein warzige Ornamentierung der Basidiosporen bei Rostpilzen aufgezeigt werden. Resumen (in Spanish) Especies de Pucciniales son hongos parásitos de plantas del grupo Basidiomycota. En esta tesis 30 especies de Pucciniales recientemente colectadas en el Oeste de Panama se presentan con descripciones detalladas, microscopia electrónica de barrido y dibujos. De estas, 2 son nuevas especies: Puccinia urochloae y Uromyces melampodii. Además, 28 especies se citan por primera vez para Panama: Aecidium psychotriae, Coleosporium verbesinae, Crossopsora byrsonimatis, Crossopsora uleana, Puccinia cordiae, Puccinia cyperi-tagetiformis, Puccinia enixa, Puccinia inaudita, Puccinia paupercula, Puccinia psidii, Puccinia sp. 1, Puccinia sp. 2, Pucciniosira dorata, Uredo ficina, Uredo hydrocotyles, Uredo incomposita, Uredo jatrophicola, Uredo kyllingiae, Uredo melinidis, Uredo notata, Uredo peperomiae, Uredo proeminens, Uredo rubescens, Uredo yucatanensis, Uromyces bidenticola, Uromyces ictericus, Uromyces sp. 1 y Uromyces trifolii-repentis. Asi el numero de especies de Pucciniales conocidas para Panama aumenta de 101 a 131. En 5 especies diferentes de hongos se descubrieron nuevas especies en plantas hospederas: Cordia spinescens para Alveolaria cordiae, Eupatorium odoratum para Cionothrix praelonga, Xylopia gradiflora para Dasyspora gregaria, Cyperus diffusus para Puccinia subcoronata, y Calathea indecora para Puccinia thaliae. La especie Dasyspora gregaria es reportada con basidiosporas finamente verrucosas por primera vez en royas y la especie Alveolaria cordiae, una especie pobremente conocida es reportada, descrita e ilustrada con detalles por primera vez sobre Cordia spinescens en Panama.
Die anaerobe Atmung mit Nitrat und Nitrit als terminalen Elektronenakzeptoren bildet einen wichtigen Teil des biologischen Stickstoff-Zyklus. Beispiele sind Denitrifikation und respiratorische Nitrat-Ammonifikation, wobei in beiden Fällen in einem ersten Schritt Nitrat zu Nitrit reduziert wird. In der Denitrifikation entstehen dann verschiedene gasförmige Produkte (NO, N2O, N2), wogegen Nitrit in der Ammonifikation ohne die Freisetzung weiterer Zwischenprodukte direkt zu Ammonium reduziert wird. Während die terminalen Reduktasen dieser Atmungsketten gut untersucht sind, ist das Wissen über die Zusammensetzung kompletter Elektronentransportketten sowie die Interaktion einzelner Proteine als auch zwischen den Proteinen und Chinonen in der Membran begrenzt. Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung der membranständigen Chinol-Dehydrogenasen NapGH und NrfH in der respiratorischen Nitrat-Ammonifikation von Wolinella succinogenes. Dieses Epsilonproteobakterium ist ein etablierter Modellorganismus der anaeroben Atmung und wächst durch respiratorische Nitrat-Ammonifikation mit Formiat oder H2 als Elektronendonoren. Als terminale Reduktasen werden dabei die periplasmatische Nitratreduktase NapA und die Cytochom c-Nitritreduktase NrfA benötigt. Die Genomsequenz weist keine weiteren typischen Nitrat- und Nitritreduktasen auf, und napA- und nrfA-defiziente Mutanten sind nicht in der Lage durch Nitrat- bzw. Nitritatmung wachsen. Das Operon des Nap-Systems (napAGHBFLD) von W. succinogenes kodiert Proteine, die an der Nitrat-Reduktion durch Menachinol beteiligt sind (NapA, -B, -G und -H) und Proteine, die für die Reifung und Prozessierung von NapA benötigt werden (NapF, -L und –D). Im Gegensatz zu vielen anderen Bakterien läuft die Nitrat-Atmung unabhängig von einem NapC-ähnlichen Protein ab, das als membrangebundenes Tetrahäm-Cytochrom c für die Chinol-Oxidation zuständig ist und Elektronen über den Elektronenüberträger NapB an die terminale Reduktase NapA liefert. Zwar sind im Genom zwei NapC-Homologe kodiert (FccC und NrfH), doch die Deletion beider Gene hatte keinen Einfluss auf die Nitrat-Atmung. Es wurde vermutet, dass die Funktion von NapC in W. succinogenes stattdessen durch die beiden Fe/S-Cluster Proteine NapG und NapH übernommen wird. Die Reduktion von Nitrit zu Ammonium wird durch den NrfHA-Komplex katalysiert. Das Pentahäm-Cytochrom c NrfA bildet dabei die katalytische Untereinheit, die über das membranständige Tetrahäm-Cytochrom c auf der periplasmatischen Seite der Membran gebunden ist. NrfH gehört zur NapC/NirT-Familie und überträgt Elektronen von Menachinol auf NrfA. Mittels gerichteter Mutagenese von nrfH wurden in früheren Arbeiten bereits Aminosäure-Reste identifiziert, die essentiell für die Elektronentransportaktivität von Formiat zu Nitrit sind.
The growth of blood vessels is crucial for organ growth in the embryo and repair of wounded tissues in the adult. An imbalance in this process contributes to numerous malignant, inflammatory, ischemic, infectious and immune disorders (Ferrara et al., 2003). Postnatal neovascularization occurs through the recruitment of progenitor cells and angiogenesis. Integrins are heterodimeric cell surface molecules and are the main receptors for extracellular matrix proteins. Regulation of integrin activation is crucial during embryonic development and during adult life. Dysregulation of integrin activity leads to severe diseases. In this study, we have demonstrated that Rap1, a small GTPase regulating integrin activity, and its GEF Epac1 are expressed in both EPC and endothelial cells. Moreover, the pharmacological activator of Epac activates the small GTPase Rap1 in progenitor cells. In parallel the angiogenic growth factors VEGF and bFGF activate Rap1 in endothelial cells. In addition, the regulation of Rap1 activity in EPC and in endothelial cells plays an important role in the regulation of migration and adhesion to matrix proteins, by regulating the activity of different integrins, a mechanism known as integrin inside‐out signaling. Furthermore, regulation of Rap1 activity affects probably indirectly through outside‐in signaling of integrins the activity of several and crucial proteins such PKB/Akt and focal adhesion kinase in endothelial cells. In line with these results, we have demonstrated that Rap1 activity affect angiogenesis, homing of EPC to ischemic tissues and thereby postnatal neovascularization. The understanding how Rap1 regulates integrin activity in endothelial cells is still not completely clear, for example we have demonstrated that the known effectors of Rap1 mediating the increase of integrin activity in T and B cells, such as RAPL and RIAM are, respectively, either not increasing integrin activity or not expressed in endothelial cells. We aim to find the effector of Rap1 promoting integrin activity in endothelial cells and how RAPL regulates integrin functions and angiogenesis. Moreover data from us and others using genetic models and generation of Rap1a or Rap1b deficient mice or deficient for Rap1a and Rap1b led to embryonic lethality suggesting that Rap1 is a key node protein during embryonic development. The development of conditionnal Rap1a/b endothelial/pericytes restricted deficient mice will help us to decipher more precisely the role of Rap1 during vascular development and angiogenesis.
Ataxin-2 is a novel protein, within which the unstable expansion of a polyglutamine domain can cause Spinocerebellar Ataxia type 2 (SCA2), a neurodegenerative disease which belongs to the group of polyglutamine disorders. SCA2 is characterised by a progressive loss of neurons that first affects the cerebellum and brain stem and then may extend to other areas of the brain, like substantia nigra, motoneurons and thalamus. Several lines of research have attempted to determine therole of ataxin-2 in its normal and mutant version. Different animal models and cell culture approaches to study ataxin-2 function implicated ataxin-2 in RNA processing, embryonic development, apoptosis and cytoskeleton. However, the function of ataxin-2 still remains unclear. In this thesis, a protein interaction approach was chosen as an alternative to gain insights into the cellular function of ataxin-2. Full-length ataxin-2 was used as bait in a yeast two-hybrid screen of human adult brain cDNA. Among five candidate interactor proteins identified, two were the endophilins A1 and A3, proteins involved in vesicle endocytosis. Co-immunoprecipitation studies confirmed the association of these proteins in an endogenous complex of mouse brain. In vitro binding experiments narrowed the binding interfaces down to two proline-rich domains on ataxin-2, which interacted with the SH3 domain of endophilins A1/A3. Ataxin-2 and endophilins A1/A3 colocalised at the endoplasmic reticulum as determined by immunofluorescence microscopy of transfected cell lines, and by centrifugation fractionation studies of mouse brain. Importantly, the pattern observed in transfected cells was conserved in untransfected rat hippocampal neurons. In mouse brain, associations of ataxin-2 with endocytic proteins such as the adaptor CIN85, the ubiquitin ligase c-Cbl and also GRB2, in the last case by means of a SH3 domain array chip, were also demonstrated. GST pull-down assays showed ataxin-2 to interact directly with the SH3 domains A and C of CIN85, the C-terminal SH3 domain of GRB2, and the SH3 domain of Src, a kinase activated after receptor stimulation. Functional studies demonstrated that ataxin-2 affects endocytic trafficking of the epidermal growth factor receptor (EGFR) by reducing the EGFR internalisation after EGF stimulation. Taken together, these data implicate ataxin-2 to play a role in endocytic receptor cycling.
Nahrungsmittelallergikern steht aufgrund inakzeptabler Nebenwirkungen bei der spezifischen Immuntherapie zurzeit noch keine kausale Therapie dieser Erkrankung zur Verfügung. Demzufolge bleibt die Vermeidung der entsprechenden Lebensmittel für Nahrungsmittelallergiker der einzige Weg möglicherweise lebensbedrohlichen allergischen Reaktionen zu entgehen. Ziel dieser Arbeit war es, das Potential eines viralen Vektors für die Verwendung bei der spezifischen Immuntherapie der Lebensmittelallergie zu untersuchen. Die Überlegung dahinter war, das Risiko eines anaphylaktischen Schocks, der bei Injektion eines Allergens immer gegeben ist, durch intrazelluläre Expression des Proteins über das rekombinante Virus zu verringern. Zusätzlich dazu bringt das modifizierte Vacciniavirus Ankara (MVA) ideale Voraussetzungen für eine Allergievakzine mit: Die Infektion mit MVA führt zu einer stark Th1-gerichteten Immunantwort gegen die viral exprimierte Proteine, die möglicherweise die allergische Th2-gerichtete Immunantwort modulieren kann. Die prophylaktische Immunisierung mit MVA-OVA im Mausmodell der systemischen Sensibilisierung gegen Ovalbumin (OVA) führte dosisabhängig zur Suppression der spezifischen IgE-Antwort und somit zum Schutz vor allergischer Sensibilisierung. Zusätzlich konnte nachgewiesen werden, dass die Vakzinierung mit MVA-OVA eine dauerhafte spezifische IgG-Antwort induziert. Diese Daten unterstützen das Konzept einer Modulation der Sensibilisierung durch MVA-Vakzine. Weiterhin wurden zwei rekombinante Vakzinen generiert, mittels derer entweder das Tropomyosin aus Garnelen (Pen a 1) oder das Lipid-Transfer-Protein aus Haselnuss (Cor a 8) intrazellulär exprimiert werden konnte. Dass die Sensibilisierung gegen diese Allergene häufig mit schweren allergischen Reaktionen korreliert, unterstreicht die Notwendigkeit einer verbesserten Immuntherapie in diesem Bereich. Während MVA-Pen a 1 in ausreichender Menge und Qualität für die Verwendung im Mausmodell hergestellt werden konnte, gelang es nicht, eine homogene Population von MVA-Cor a 8 zu gewinnen, in der das Selektionsgen K1L nicht mehr vorhanden war. Parallel zur Virusherstellung wurden Mausmodelle der Sensibilisierung gegen Cor a 8 und Pen a 1 entwickelt. Vergleiche unterschiedlicher Mausstämme ergaben, dass sich Mäuse des Stammes CBA/J am empfänglichsten für eine systemische Sensibilisierung mit Cor a 8 sind. Aufgrund von Erfahrungen zur Sensibilisierung gegen Pen a 1 wurden Mäuse des Stammes C3H/HeJ bei der Etablierung eines Garnelenallergiemodells verwendet. Es zeigte sich, dass durch die intragastrale Applikation von 0,1 mg Pen a 1 sowie Choleratoxin als Adjuvanz (drei Gaben in dreiwöchigem Abstand), gefolgt von einer systemischen Gabe des Allergens mit Aluminiumhydroxid eine spezifische Sensibilisierung hervorgerufen werden konnte, die nach Exposition mit Pen a 1 zu allergischen Symptomen führte. Auch in diesem Modell bot die prophylaktische Immunisierung mit MVA-Pen a 1 Schutz vor Pen a 1spezifischer Sensibilisierung. Um die therapeutische Effektivität der Vakzine ermitteln zu können, muss die begonnene Etablierung eines Allergiemodells mit symptomauslösenden Provokationen und immunologischen Analysen weitergeführt werden. Der in dieser Studie beobachtete starke schützende Effekt einer Vakzinierung mit MVA vor allergischer Sensibilisierung und das sehr gute Sicherheitsprofil dieses Vektors in klinischen Studien zu anderen Erkrankungen belegt die Möglichkeit einer Verwendung von MVA zur erfolgreichen spezifischen Immuntherapie der Lebensmittelallergie.
In this thesis I have investigated the regulation of eicosanoid synthesizing-enzymes by cannabinoid receptor agonists. Rat renal mesangial cells were used as a model system. I could show that all three (CB1, CB2, and GPR55) cannabinoid receptors are expressed on the mRNA level in rat renal mesangial cells – but with differing expression profiles. The CB1 and GPR55 receptors are expressed in comparable amounts, whereas the CB2 receptor is considerably less expressed than the CB1 and the GPR55 receptors. Furthermore I could show that stimulation of renal mesangial cells with CB1 receptor agonists, such as R(+)MA or ACEA, increased IL-1β-induced cPLA2, sPLA2-IIa, and COX2 protein and mRNA expression which subsequently led to an enhanced IL-1β-induced PGE2 formation. Additionally, the IL-1β- induced sPLA2-IIa promoter activity was also increased by CB1 receptor stimulation. Besides the modulated expression of the eicosanoid synthesizing enzymes, I could show that CB1 agonists also led to an increase of IL-1β-induced iNOS expression and subsequent NO formation. In contrast, stimulation with CB2 selective agonists led to a decrease in IL-1β- induced sPLA2-IIa protein expression and PGE2 formation. Accordingly, the IL-1β-induced sPLA2-IIa promoter activity was also reduced by CB2 receptor agonists. IL-1β-induced iNOS expression and subsequent NO formation were not influenced by CB2 recptor activation. Matching the results I obtained with CB1 receptor agonists on IL-1β-induced PGE2 formation, I could observe an increased cPLA2 protein and mRNA expression with a subsequent increase in IL-1β-induced PGE2 formation by GPR55 stimulation. Stimulation with THC, an unselective CB agonist, increased the IL-1β-induced sPLA2-IIa protein expression and subsequently led to an enhanced IL-1β-induced PGE2 formation. Subjecting the cells to higher THC concentrations surprisingly led to a reduction of the IL-1b-induced sPLA2-IIa protein expression and PGE2 formation. A possible explanation may be the differential expression of the three CB receptors. At low concentrations THC may predominantly activate CB1 and GPR55 and with increasing concentration CB2 receptors may also be activated, slightly reversing the enhancing effect. Moreover, I could show that the CB1 receptor stimulation mediated phosphorylation and hence the activation of ERK1/2 MAPK. Additionally to ERK1/2, there was also a phosphorylation and activation of NFkB observed by CB1 receptor stimulation. In my thesis I could show for the first time that PPARα was activated by IL-1β in rMC. The IL-1β-induced PPARα promoter activity was completely inhibited by addition of the CB2 receptor agonist, JWH015. These findings were confirmed by inhibition of the IL-1β-induced PGE2 formation by a PPARα antagonist (MK-886). In summary, I could show that activation of CB1 receptors in our system led to a worsening of an inflammatory condition, whereas activation of the CB2 receptors led to the complete opposite; namely a reduction of the inflammatory response by reducing the sPLA2-IIa expression and PGE2 formation. GPR55 activation did not display any alteration of inflammatory conditions, since the classical inflammatory pathway was not influenced.
Regulation des matrizellulären Proteins SMOC-1 durch Zytokine und Stickoxid in Rattenmesangiumzellen
(2009)
Zytokine stimulieren in Mesangiumzellen die Produktion und die Freisetzung großer Mengen entzündlicher Mediatoren. In dieser Arbeit wurden mit Hilfe der RAP-PCR („RNA arbitrarily primed polymerase chain reaction“), einer auf mRNA basierenden „Differential display“-Methode, die Effekte von Interleukin-1β (IL-1β) auf das Genexpressionsmuster in glomerulären Rattenmesangiumzellen untersucht. Dabei wurde das matrizelluläre Glykoprotein „Secreted modular calcium-binding protein-1“ (SMOC-1) identifiziert, welches in Mesangiumzellen durch IL-1β herunterreguliert wird. SMOC-1 wird von verschiedenen Zelltypen exprimiert und sezerniert, doch seine biologische Funktion konnte bisher nicht aufgedeckt werden. Weitere Experimente bestätigten, dass die mRNA- und Proteinexpression von SMOC-1 durch proinflammatorische Zytokine, wie IL-1β und Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) herunterreguliert wird. Dieser Effekt wird zu einem großen Teil durch die endogene Freisetzung von Stickoxid (NO) aufgrund der Aktivität der induzierbaren NO-Synthase (iNOS) und der nachfolgenden Aktivierung der löslichen Guanylatzyklase (sGC) vermittelt. Außerdem tragen auch reaktive Sauerstoffver-bindungen (ROS), deren Bildung durch die Zytokine verstärkt wird, zur Herunter-regulierung der SMOC-1-Expression bei. Durch In-situ-Hybridisierungsexperimente konnte ferner gezeigt werden, dass die Hemmung der NO-Synthese durch den spezifischen iNOS-Inhibitor L-NIL in einem Rattenmodell der anti-Thy1.1-Glomerulonephritis die SMOC-1-Expression deutlich erhöhte. Dies belegt somit auch in vivo die biologische Relevanz von NO in der Modulierung der SMOC-1-Expression. Die funktionelle Rolle von SMOC-1 in Mesangiumzellen wurde durch die Hemmung der SMOC-1-Expression mit Hilfe einer spezifischen siRNA untersucht. Dabei zeigte sich, dass die Hemmung von SMOC-1 eine deutliche Inhibierung der mRNA-Expression von „Transforming growth factor β1“ (TGF-β1) sowie dessen Gesamtproteinspiegel zur Folge hat. Auch die Aktivität von TGF-β1 wurde reduziert, wie anhand der verringerten Spiegel an aktivem TGF-β1-Protein und der verringerten mRNA-Expression bekannter TGF-β-regulierter Gene, wie „Connective tissue growth factor“ (CTGF), „Plasminogen activator inhibitor-1“ (PAI-1) und Biglykan gezeigt wurde. Diese Ergebnisse deuten auf eine Rolle von SMOC-1 bei der Modulierung des TGF-β1-Signalwegs hin. Zusammenfassend betrachtet scheint NO die SMOC-1-Expression in der akuten glomerulären Entzündung zu vermindern und dadurch die TGF-β-getriebenen profibrotischen Signalprozesse zu limitieren. Der zweite Aspekt dieser Arbeit befasst sich mit der Rolle von Peroxisomen-Proliferator-aktivierten Rezeptoren (PPAR) in der IL-1β-vermittelten Expression der induzierbaren NO-Synthase. PPARα-Aktivatoren steigern in Mesangiumzellen die IL-1β-induzierte Aktivität der iNOS, während die Hemmung von PPARα durch spezifische Inhibitoren oder siRNA die iNOS-Expression/-Aktivität deutlich reduziert. Die Ergebnisse von Promotor-studien zeigten die essentielle Rolle einer möglichen PPAR-Bindestelle im iNOS-Promotor. IL-1β scheint die Bildung eines endogenen PPAR-Liganden zu induzieren, wodurch die Bindung von PPAR-Proteinkomplexen an das regulatorische DNA-Element im iNOS-Promotor verstärkt und dessen Aktivität gesteigert wird. Daneben scheinen jedoch auch Nebeneffekte der PPAR-Aktivatoren, wie die Freisetzung von ROS, zur synergistischen Wirkung auf die IL-1β-induzierte iNOS-Expression beizutragen. Die Wirkung von dualen PPARα/γ-Aktivatoren auf entzündliche Prozesse wird seit längerem diskutiert, daher wurden die biologischen Effekte von neu synthetisierten möglichen dualen PPARα/γ-Aktivatoren auf Entzündungsparameter, wie z. B. die iNOS-Expression, in Mesangiumzellen untersucht. Alle untersuchten Aktivatoren steigerten in der Form von Esterverbindungen die IL-1β-induzierte Expression der iNOS sowie der sekretorischen Phospholipase A2 (sPLA2), während die entsprechenden freien Säuren wenig Effekte zeigten. Diese proinflammatorische Wirkung scheint jedoch weniger auf einer Aktivierung des PPAR-Rezeptors zu beruhen als auf der Freisetzung von ROS, die durch die Aktivatoren teilweise deutlich erhöht wurde. Weitere Experimente zur Charakterisierung der PPAR-spezifischen Wirkung der Aktivatoren sowie zur optimalen Wirkkonzentration sind nötig, bevor der Effekt dieser Aktivatoren auf die inflammatorische Genexpression genau bewertet werden kann.
The reggie protein family consists of two homologous members, reggie-1 and reggie-2, also termed flotillin-2 and flotillin-1, respectively, that are ubiquitously expressed and evolutionarily well conserved, suggesting an important but so far ill-defined function. In various cell types, both reggies have been found to be constitutively associated with lipid rafts by means of acylation modifications and oligomerization. Lipid rafts are glycosphingolipid- and cholesterol-rich membrane microdomains which have been implicated in several cellular processes including membrane transport and signal transduction through growth factor receptors. However, the molecular details of these processes are still poorly understood. With the observation that reggies colocalize with activated glycosylphosphatidylinositolanchored proteins (GPI-APs) and Fyn kinase in rafts, a role for these proteins in signaling events has been suggested. In agreement with that, we have previously shown that reggie-1 becomes multiply tyrosine phosphorylated by Src kinases in response to epidermal growth factor (EGF) stimulation, pointing to a function for reggie-1 in growth factor signaling. Furthermore, overexpression of reggie-1 enhances spreading on fibronectin substrate in a tyrosine-dependent manner, thus revealing a role for reggie-1 in regulation of actin cytoskeleton through growth factor receptors. Due to the similarity shared by reggie proteins at amino acid level and to their ability to form hetero-oligomeric complexes, the first aim of this study was to analyze the putative tyrosine phosphorylation of reggie-2 in growth factor stimulated cells. Similarly to reggie-1, reggie-2 was found to be multiply tyrosine phosphorylated by Src kinase and to exist in a molecular complex with Src, with the degree of co-immunoprecipitation dependent on the activity of Src. Recent studies from us have also shown that administration of EGF results in the endocytosis of reggie-1 from the plasma membrane into endosomes, which is in line with a proposed role for reggies in membrane trafficking processes. In order to characterize in detail the endocytic mechanism that mediates the uptake of reggie-1, the dependency of reggie-1 endocytosis on clathrin and dynamin was investigated by means of overexpressing a variant form of Eps15 or a dominant negative form of dynamin-2. In either case the translocation of reggie-1 into endosomes in response to EGF was not affected, and this, together with the results that reggie-1 colocalized with cholera toxin (CTX) but not with transferrin receptor (TfnR) during EGF signaling, indicates that reggie-1 is taken up by means of a dynaminindependent, raft-mediated pathway. These findings are very well in line with recent data showing the pathway of entry into cells of reggie-2 as a raft-mediated endocytic pathway. The endocytosis of reggie-2 in response to EGF was also analyzed in this study. Similarly to reggie-1, in growth factor stimulated cells reggie-2 underwent a translocation from the plasma membrane to endosomes where the two reggies were found to colocalize with each other, suggesting that epidermal growth factor signaling might trigger the endocytosis of reggie oligomers. In addition, colocalization with both the late endosomal marker LAMP3/CD63 and epidermal growth factor receptor (EGFR) was detected, again indicating a function for reggies in signal transduction through growth factor receptors. EGFR has been reported to localize in rafts but, although this association is thought to be functional during EGF stimulation, how segregation of EGFR into rafts modulates its endocytosis and signaling is still under debate. Since reggie oligomers have recently been suggested to define a raft subtype, a further aim of this study was to investigate whether the depletion of reggies by means of small interfering RNA could interfere with the signaling and the trafficking through EGFR. Knockdown of reggie-2 resulted in an altered tyrosine phosphorylation of EGFR in response to EGF, while the degree of ubiquitination was not affected. Less efficient phosphorylation of tyrosine residues, especially of those which are docking sites for Grb2 and Shc, led in turn to an impaired activation of p38 and ERK1/2 MAPKs. Depletion of reggie-2 did not affect the early trafficking of activated EGFRs, with receptors being endocytosed and delivered to late endosomes as efficiently as in control cells. This would be in line with the normal degree of ubiquitination observed for EGFR, as ubiquitin moieties have been proposed to represent sorting tags that ensure receptor endocytosis into early endosomes and its proper intracellular trafficking. On the contrary, after prolonged EGF stimulation, depletion of reggie-2 resulted in a decreased downregulation of both receptor-bound ligand and EGFR, and in their accumulation in intracellular vesicles, thus pointing to a role for reggie-2 in the degradative pathway. Taken all together, these data ndicate that the association of EGFR with reggie-microdomains is likely to be important for proper receptor trafficking and signaling.
Reggie-1 (flotillin-2) and reggie-2 (flotillin-1) are membrane microdomain proteins which are associated with the membrane by means of acylation. They influence different cellular signaling processes, such as neuronal, T-cell and insulin signaling. Upon stimulation of the EGF receptor, reggie-1 becomes phosphorylated and undergoes tyrosine 163 dependent translocation from the plasma membrane to endosomal compartments. In addition, reggie-1 was shown to influence actindependent processes. Reggie-2 has been demonstrated to affect caveolin- and clathrin-independent endocytosis. Both proteins form homo- and hetero-oligomers, but the function of these oligomers has remained elusive. Moreover, it has not been clarified if functions of reggie-1 are also influenced by reggie-2 and vice versa. The first aim of the study was to further investigate the interplay and the heterooligomerization of reggie proteins and their functional effects. Both reggie proteins were individually depleted by means of siRNA. In different siRNA systems and various cell lines, reggie-1 depleted cells showed reduced protein amounts of reggie-1 and reggie-2, but reggie-2 knock down cells still expressed reggie-1 protein. The decrease of reggie-2 in reggie-1 depleted cells was only detected at protein but not at mRNA level. Furthermore, reggie-2 expression could be rescued by expression of siRNA resistant wild type reggie-1-EGFP constructs, but not by the soluble myristoylation mutant G2A. This mutant was also not able to associate with endogenous reggie-1 or reggie-2, which demonstrates that membrane association of reggie-1 is necessary for hetero-oligomerization. In addition, fluorescence microscopy studies and membrane fractionations showed that correct localization of overexpressed reggie-2 was dependent on co-overexpressed reggie-1. Thus, hetero-oligomerization is crucial for membrane association of reggie-2 and for its protein stability or protein expression. Moreover, the binding of reggie-2 to reggie-1 required tyrosine 163 of reggie-1 which was previously shown to be important for endosomal translocation of reggie-1. Since reggie-2 was implicated to function in clathrin- and caveolin-independent endocytosis pathways, the effect of reggie-2 depletion on reggie-1 endocytosis was investigated. Indeed, reggie-1 was dependent on reggie-2 for endosomal localization and EGF-induced endocytosis. By FRET-FLIM analysis it could be shown that reggie heterooligomers are dynamic in size or conformation upon EGF stimulation. Thus, it can be concluded that reggie proteins are interdependent in different aspects, such as protein stability or expression, membrane association and subcellular localization. In addition, these results demonstrate that the hetero-oligomers are dynamic and reggie proteins influence each other in terms of function. A further aim was the characterization of reggie-1 and reggie-2 function in actindependent processes, where so far only reggie-1 was known to play a role. Depletion of either of the proteins reduced cell migration, cell spreading and the number of focal adhesions in steady state cells. Thus, also reggie-2 affects actin-dependent processes. Further investigation of the focal adhesions during cell spreading revealed that depletion of reggie-1 displayed different effects as compared to reggie-2 knock down. Reggie-1 depleted cells had elongated cell-matrix-adhesions and showed reduced activation of FAK and ERK2. On the other hand, depletion of reggie-2 resulted in a restricted localization of focal adhesion at the periphery of the cell and decreased ERK2 phosphorylation, but it did not affect FAK autophosphorylation. Hence, reggie proteins influence the regulation of cell-matrix-adhesions differently. A link between reggie proteins and focal adhesions is the actin cross-linking protein -actinin. The interaction of -actinin with reggie-1 could be verified by means of co-immunoprecipitations and FRET-FLIM analysis. Reggie-1 binds -actinin especially in membrane ruffles and in other locations where actin remodeling takes place. Moreover, -actinin showed a different localization pattern during cell spreading in reggie-1 depleted cells, as compared to the control cells. These results provide further insights into the function of both reggie proteins. Their interplay and hetero-oligomerization was shown to be crucial for their role in endocytosis. In addition, both reggie proteins influence actin-dependent processes and differentially affect focal adhesion regulation.
Safety concerns associated with the use of viral vectors in gene therapy applications have attracted considerable attention towards the development of nonviral vectors as alternatives for DNA delivery. While nonviral vectors are commonly not associated with safety problems, they are still very inefficient compared to viral vectors, and require significant improvements to approach the efficiency of their viral counterparts. Meanwhile ligands or single-chain antibody fragments that bind to cell surface receptors for increased and/or specific cellular uptake, endosome escape activities, and nuclear localization sequences (NLSs) to enhance transport of plasmid DNA into the nucleus, have become available that can be incorporated into nonviral vectors to improve their efficacy. However, as gene delivery is a multistep process, the challenge is to incorporate multiple of these functional elements into a single nonviral vector system, while retaining their specific activities. A promising method to attach such entities to plasmid DNA is the use of multifunctional fusion proteins that bind to DNA through a DNA-binding domain. In principle, two types of DNA-binding domains/proteins can be used to anchor additional functional domains or peptides to a plasmid, namely sequence-specific DNA-binding domains, described in the first part of this thesis, or those that bind DNA independent of its sequence, exemplified in the second part of this work by a derivative of the human HMGB2 protein. The first fusion protein constructed and analyzed contained the E. coli LexA repressor as a sequence-specific DNA-binding domain. In addition, this DNA-carrier protein, termed TEL, included a bacterial translocation domain as an integrated endosome escape activity, and human TGF-a for specific targeting to the EGF-receptor (EGFR). TEL was expressed in E. coli and purified under both native and denaturing conditions. Purified, denatured TEL was refolded and subsequently shown to bind specifically to EGFR-expressing cells. However, inclusion of TEL in complexes of plasmid DNA and poly-L-lysine (pL) did not lead to increased gene delivery into EGFR-expressing COS-1 cells. Most likely this was due to the absence of DNA-binding activity of the LexA moiety in TEL. In contrast, native TEL was able to interact specifically with DNA. Nevertheless, since this interaction was rather weak, and refolding of denatured TEL had not resulted in functional activity of all of its protein domains, it seemed unlikely that fusion proteins containing LexA would exhibit gene transfer capabilities superior to those of similar DNA-carrier proteins previously constructed in our group. Further work therefore focused on the use of the E2C-Sp1C protein as an alternative sequencespecific DNA-binding domain. This artificial zinc-finger protein was fused to the single-chain antibody fragment scFv(FRP5), directed against the human ErbB2 growth factor receptor. The resulting 5-E2C fusion protein was expressed in E. coli and purified under native and denaturing conditions. Refolded and native 5-E2C were found to bind specifically to ErbB2-expressing cells, indicating that scFv(FRP5) in 5-E2C was functional in both preparations. In contrast, whereas refolded 5-E2C bound DNA only weakly, significant DNA binding was observed for native 5-E2C. In addition, it could not only be shown that the interaction of native 5-E2C with DNA containing its recognition sequence was specific, but also that this protein was able to bind DNA and recombinant ErbB2 simultaneously, demonstrating the functionality of both domains in native 5-E2C. Despite these encouraging results, the inclusion of native 5-E2C in pL- or polyethyleneimine (PEI)-DNA complexes did not lead to an (5-E2C-specific) enhancement of gene transfer efficiency, irrespective of the presence of the endosome-disruptive reagent chloroquine during transfection. In the second part of this thesis an alternative approach for the development of DNA-carrier proteins for nonviral gene delivery is described, based on human HMGB2, a DNA-binding protein without sequence specificity. HMGB2 contains an acidic C-terminus that has been found to decrease the affinity of the protein for DNA. Therefore, this C-terminal tail was deleted, resulting in an HMGB2-variant consisting of amino acids 1-186. HMGB2186, purified under native conditions from E. coli lysates, was able to interact with DNA and bound to the surface of different cell lines. Importantly, after binding to plasmid DNA HMGB2186 mediated gene delivery into COS-7 cells with higher efficiency than pL. In addition, HMGB2186-mediated gene transfer was strongly enhanced in the presence of chloroquine, indicating that the endocytic pathway was involved in cellular uptake. To improve internalization and intracellular routing of HMGB2186 as a DNA-carrier, a derivative containing the TAT47-57 cell-penetrating peptide (CPP), reported to facilitate cell entry independent of endocytosis, was constructed. Since this peptide also contains an NLS, in addition an HGMB2186-variant containing the SV40-NLS was constructed to investigate the effect of a peptide that has only nuclear localizing properties. Interestingly, the resulting TAT-HMGB2186 and SV40-HMGB2186 fusion proteins displayed DNA-binding activities similar to HMGB2186, but mediated gene delivery into different cell lines clearly more efficiently than the parental molecule. Furthermore, the efficacy of both fusion proteins was enhanced markedly in the presence of chloroquine, an indication that endocytosis was involved in the transfection process mediated by these proteins. This suggests that the increased transfection efficiency observed for TAT-HMGB2186 was more likely due to the NLS function present in the TAT47-57 peptide, rather than to its ‘cell penetrating properties’. Finally, the incorporation of functional peptides derived from human proteins into HMGB2186 was investigated. An uncharged CPP originating from Kaposi-FGF, reported to facilitate efficient cellular uptake of fused protein domains in an endocytosis-independent manner, was fused to HMGB2186 together with the SV40-NLS. Interestingly, the resulting KSV40-HMGB2186 fusion protein bound DNA similarly as previously tested DNA-carrier proteins, but did not mediate enhanced transfection compared to HMGB2186. In addition, the importin-b-binding (IBB) domain derived from human importin-a2 was investigated as a component of a DNA-carrier protein. Since the IBB domain can function as an NLS, it was fused to HMGB2186 resulting in the DNA-carrier protein IBBHMGB2186. Although IBB-HMGB2186 bound DNA in a similar manner as the other HMGB2186-derivatives, gene delivery mediated by IBB-HMGB2186 was only as effective as HMGB2186 mediated transfection, suggesting no significant role of the IBB domain. However, addition of chloroquine resulted in a remarkable enhancement of IBB-HMGB2186-mediated gene transfer, which was now more efficient than with any other HMGB2186-variant tested, and not much lower than gene transfer mediated by PEI, one of the most efficient transfection reagents available to date. To enhance nonviral gene delivery even further, the HMGB2186-based DNA-carrier proteins described in this thesis might now serve as building blocks for novel fusion proteins that include additional complementing activities. In this respect it seems particularly promising that, under conditions of effective end some escape, IBB-HMGB2186, which consists entirely of protein domains of human origin, was the most efficient of all proteins tested in this work.
Die ribosomal synthetisierten und posttranslational modifizierten antimikrobiellen Peptide Subtilin aus B. subtilis und Nisin A aus L. lactis gehören zur Klasse der lanthioninhaltigen Bakteriocine, die als Lantibiotika bezeichnet werden. Die Regulation der Biosynthese beider Lantibiotika unterliegt der dichteabhängigen Genregulation, die auch als Quorum Sensing bezeichnet wird. Dabei wirken die Peptide als Pheromon autoinduzierend auf die eigene Biosynthese durch Signaltransduktion über die Zwei-Komponenten-Regulationssysteme SpaRK bzw. NisRK. Durch die Konstruktion und Anwendung zweier spezifischer Reportersysteme, die auf der transkriptionellen Induktion einer chromosomal integrierten PspaS-lacZ bzw. PnisA-gusA-Fusion beruhen, wurde die autoinduzierende Fähigkeit der Peptide sowohl qualitativ durch chromogene Analysen auf Agarplatten als auch quantitativ in Mikrotiterplatten spezifisch nachgewiesen. Beide Reportersysteme wurden zur Analyse von Struktur-Funktionsbeziehungen in Bezug zur autoinduzierenden Wirkung der Peptide verwendet. Dabei wurden neben dem Subtilinproduzenten B. subtilis ATCC 6633 acht weitere Subtilin-produzierende Bacillus-Stämme identifiziert. Durch die Konstruktion eines Expressionssystems zur Produktion von durch ortsgerichteter in vitro Mutagenese erstellten Subtilinvarianten bzw. Subtilin/Nisin AHybriden wurden mehr als 80 verschiedene Peptide durch rationales Design generiert. Deren Biosynthese wurde durch MALDI-TOF MS spezifisch nachgewiesen und hinsichtlich ihrer Wirkung als induzierende Peptide über beide Reportersysteme untersucht. Durch Überexpression des Responsregulators SpaR wurde eine Induktion der Promotorfusion unabhängig von der Autoinduktion durch die jeweiligen Peptide gezeigt. Dies ermöglicht die Produktion und Charakterisierung von induktionsdefizienten Varianten. Durch die Analysen der generierten Peptide wurde eine Beteiligung des N-terminalen Bereichs von Subtilin an der Sensierung durch die Histidinkinase SpaK identifiziert. Die in vivo Produktion von verkürzten Subtilinvarianten und proteolytische Analysen von Subtilin und Nisin A zur Generierung von N-terminalen Fragmenten der Peptide bestätigte die essentielle Rolle des Nterminalen Bereichs der Lantibiotika in Bezug zur Autoinduktion. Für beide Peptide und deren jeweilige N-terminalen Fragmente, bestehend aus den ersten zwanzig Aminosäuren, wurde keine Kreuzinduktion in den Reportersystemen zur Bestimmung der Autoinduktion festgestellt. Bei simultaner Applikation des nativen Induktors mit dem korrespondierenden Peptid bzw. den jeweiligen N-terminalen Fragmenten wurde eine signifikante Reduktion der vermittelten Enzymaktivität detektiert. Dieser Effekt wurde aufgrund der Inhibition der Signaltransduktion als Quorum Quenching bezeichnet und erstmalig für lantibiotische Peptide beschrieben. Da diese Reduktion durch die gleichzeitige Zugabe von Lipid II-bindenden Substanzen, wie Vancomycin und Bacitracin, nachgewiesen wurde, konnte erstmals eine Beteiligung von Lipid II an der Signalkaskade verdeutlicht werden. Lantibiotika wirken aufgrund hochaffiner Bindung an Lipid II und anschließender Porenbildung in der cytoplasmatischen Membran überwiegend antimikrobiell gegen Gram-positive Organismen. Da die Bindung an Lipid II über ein konserviertes Bindemotiv im Nterminalen Bereich der Peptide erfolgt, wird die Beteiligung von Lipid II an der Sensierung des externen Stimulus durch die Histidinkinase LanK unterstützt.
The respiratory chain is composed of protein complexes residing in the inner mitochondrial membrane of eukaryotes or in the cytoplasmic membrane of prokaryotes. This cellular energy converter transforms a redox potential stored in low potential substrates into an electrochemical potential across the respective membrane. Typical respiratory chains contain the complexes I, II, III and IV named according to their sequence in the respiratory chain reaction. Electrons of low potential substrates enter at complex I or II and are passed via complex III to complex IV where they are transferred to oxygen. The transport of electrons between the complexes is mediated by small electron shuttles like quinol or cytochrome c. Two different models describe their exchange either by (1) random collision of freely diffusible electron shuttles and membrane protein complexes or (2) arrangement of the complexes in supercomplexes enabling direct channeling of electron shuttles. In the Gram positive bacterium Corynebacterium glutamicum, the complex III to complex IV electron shuttle cytochrome c is not diffusible but a covalently bound part of the diheme cytochrome subunit QcrC of complex III. Therefore, the complexes III and IV have to form a supercomplex for electron transduction. The aim of this thesis was to purify and characterise this obligatory supercomplex III/IV of C. glutamicum. To gain sufficient biomass of C. glutamicum as starting material for purification, a phosphate buffered minimal medium was developed that enabled yield of total 120 g wet cell mass (38 g dry mass) in 12 L (6×2 L) shaking cultures. The determined conversion factor of glucose into biomass was 0.46 g/g indicating an intact respiratory chain. The yield was increased by bioreactor cultivation to ~690 g wet cell mass (~220 g dry mass) in ~10 L culture volume. A previously described homologous expression system was applied that produces the complex IV subunit CtaD with a fused Strep-tag II to facilitate purification. Affinity purifications using the Strep-tag II affinity to Strep-Tactin resin yielded a mixture of complexes and supercomplexes. Two supercomplex III/IV versions named supercomplex A and B and free complex IV were identified in this mixture by size exclusion chromatography, redox difference spectroscopy and two dimensional polyacrylamide gel electrophoresis including blue native polyacrylamide electrophoresis. The here presented downscaled blue native polyacrylamide electrophoresis method with analysis times of ~1 h enabled efficient screening of factors influencing the stability of supercomplex III/IV. The screening resulted that the integrity of supercomplex III/IV is preserved by using neutral detergents at minimal detergent to protein ratios for solubilisation and low detergent concentrations for purification and storage slightly above the required critical micellar concentration. Furthermore, pH <=7.5 is required for stability of supercomplex III/IV. Large biomass yields enabled upscaling of supercomplex III/IV affinity purification. Application of the identified stability conditions resulted in affinity purified samples free of supercomplex B. The major component supercomplex A was efficiently separated from residual free complex IV by preparative size exclusion chromatography. Concentration of purified supercomplex A by ultracentrifugation resulted in integrity of the supercomplex for several days at 4 °C. Purified supercomplex A contains ten different previously described subunits. The heme content of supercomplex A relative to the protein mass is heme A: 6.0 μmol/g, heme B: 6.5 μmol/g, and heme C: 5.8 μmol/g determined by redox difference spectroscopy and biochemical protein quantification. This indicates an equimolar ratio of complex III and complex IV in supercomplex A. Supercomplex A has quinol oxidase activity that is inhibited by stigmatellin or sodium azide. The turnover number of transferred electrons per complex III monomer is 148 s−1 at 25° C. The homogeneity and stability of the prepared supercomplex A enabled the growth of threedimensional crystals of up to 0.1 mm in length. Their composition of supercomplex A was verified by redox difference spectroscopy of intact crystals and blue native polyacrylamide electrophoresis of dissolved crystals. The crystals diffracted X-rays corresponding to a resolution of ~10 Å. Electron microscopy of negative stained samples revealed the uniform shape of purified supercomplex A particles with dimensions of 22 × 9 nm in the view plane. Combined heme quantification, size determination, determined activity, symmetry considerations, and particle shape indicate that supercomplex A has a central dimer of complex III and two monomers of complex IV on opposite sides. This conformation is functionally reasonable because it provides each complex III monomer with one complex IV monomer as electron acceptor. Therefore, the stoichiometry of supercomplex A is most likely III2IV2. The sensitivity of supercomplex A to detergents indicated a role of phospholipids in its stability. Therefore, a method for phospholipid identification and quantification was developed that is suitable for detergent solubilised crude and purified membrane protein samples. The analysis combines separation of phospholipid classes according to their head group by normal phase high performance liquid chromatography with evaporative light scattering detection. Calibration with external standard allows quantification of phospholipid amount in the range of 0.25-12 μg. The method is verified by analysing the phospholipid content of the well characterised complex III of Saccharomyces cerevisiae. The reduction of its phospholipid content during its purification steps is monitored. The complex III sample purified to crystallisation quality contains the phospholipid content that was also observed in previously reported structures determined by X-ray crystallography. Purified stable supercomplex A from C. glutamicum revealed a large content of bound phospholipids. The main differences between intact supercomplex A and a mixture of potentially disintegrated smaller complexes is that intact supercomplex A has a doubled phosphatidic acid content and an increased phosphatidyl glycerol content. The importance of the small anionic phosphatidic acid for mediation of contacts between complexes in a supercomplex is discussed. The total phospholipid content of stable supercomplex A is sufficient for a complete belt surrounding the supercomplex in the membrane plane. This indicates that also all essential internal phospholipid binding positions are occupied and potentially stabilise supercomplex A.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene proteomanalytische Methoden untersucht und evaluiert, die, basierend auf der Verwendung 2D-gelelektrophoretischer, 2D-chromatographischer und massenspektrometrischer Techniken, die differentielle, quantitative Proteinanalyse zweier unterschiedlicher muriner Fibroblasten-Zelllinien ermöglichen. Hierfür wurden zunächst unterschiedliche Methoden für die 2D-elektrophoretische Proteinauftrennung analysiert. Im Hinblick auf eine größtmögliche Auflösung und Gel-zu- Gel-Reproduzierbarkeit wurden innerhalb der ersten Dimension (IEF) die Lademethode, die Fokussierungszeiten und der Reduktionsschritt (DTT oder HED) optimiert. Desweiteren wurde eine auf isoelektrischer Fokussierung basierende Vorfraktionierungsmethode auf ihre Anwendbarkeit bei einer quantitativen Proteomanalyse getestet. Für die Proteingelfärbung wurde unter anderem ein selbst synthetisierter Fluoreszenzfarbstoff eingesetzt, der hinsichtlich Färbesensitivität und MS-Kompatibilität mit etablierten Protokollen verglichen wurde. Eine Doppelfärbungs-Methode von Proteingelen (Silberfärbung nach Fluoreszenzfärbung) wurde auf ihre MS-Kompatibilität nach tryptischen Verdau untersucht. Desweiteren wurden manuelle und automatisierte Verdauprotokolle für eine möglichst hohe Peptide Recovery optimiert. Die zunächst durch die Anwendung von klassischen Färbe- und Quantifizierungsmethoden nach 2DE gewonnenen Ergebnisse wurden mit neueren Labelling-Methoden zur relativen Proteinquantifizierung verglichen. Dabei kamen zwei unterschiedliche Multiplexing-Verfahren zum Einsatz, die sich in der Proteinquantifizierung grundlegend unterscheiden (DIGE: gelbasierte Proteinquantifizierung; iTRAQ: LC-MS/MS basierte Peptidquantifizierung). Die für diese beiden Methoden bestehenden Protokolle wurden für die Anwendbarkeit auf die Fibroblasten-Proteinextrakte angepasst. Es konnte gezeigt werden, daß diese beiden Labelling-Methoden in Bezug auf Reproduzierbarkeit und quantitativer Aussagekraft dem klassischen 2DE-Experiment (Proteinfärbung nach der Auftrennung auf einzelnen Gelen) überlegen sind. Die statistische Absicherung der analysierten relativen Quantitätsunterschiede verbesserte sich durch die zusätzliche Anwendung der beiden neuen Labelling-Methoden erheblich. Dabei stützt sich die Signifikanz der quantitativen Bestimmung sowohl auf die große statistische Sicherheit, die innerhalb dieser beiden Multiplexing-Methoden erreicht wird, als auch auf die Wiederholbarkeit in unterschiedlichen Experimenten (21 Proteine wurden in unterschiedlichen Ansätzen bestätigt). Die beiden Labelling-Methoden DIGE und iTRAQ unterscheiden sich außer in der Quantifizierungsstrategie auch grundsätzlich in dem Ansatz der Auftrennung (DIGE: Proteine, 2DElektrophorese; iTRAQ: Peptide, 2D-Flüssigchromatographie). Damit besitzen sie unterschiedliche Limitierungen in Bezug auf die physiko-chemischen Eigenschaften der Peptide/Proteine, die mit der jeweiligen Methode aufgetrennt werden können. Der daraus resultierende komplementäre Charakter beider Methoden konnte anhand mehrerer Proteine verdeutlicht werden. Durch die relative Quantifizierung konnten insgesamt 30 Proteine identifiziert werden, die aufgrund der An- oder Abwesenheit des MLL-Proteins in den beiden murinen Zelllinien differentiell reguliert sind. Die alleine schon durch die unterschiedliche Morphologie der untersuchten murinen Fibroblasten vermutete Deregulation von Struktur- und Stressproteinen (Actin, HSP27, HSP70) konnte bestätigt werden. Weitere Expressionsunterschiede zwischen Mll-/-- und Mll+/+-Fibroblasten zeigten sich vor allem bei Proteinen, die funktionell der Gruppe RNA-prozessierender Proteine (Polyadenylate Binding Protein, PTB-associated Splicing Factor, hnRNPs) zugeordnet werden können. Ein Vergleich der quantitativen Proteomdaten dieser Arbeit mit den mRNA-Expressionsprofilen der gleichen Zellen zeigt nur eine sehr geringe Korrelation bezüglich der Regulationen einzelner Gene/Proteine. Die meisten der bisherigen Studien, die eine Untersuchung des mRNA/Protein-Verhältnisses zum Gegenstand haben, bestätigen das Fehlen einer Korrelation. Diese Tatsache unterstreicht die Wichtigkeit der Kombination genomischer und proteinanalytischer Daten zur Aufklärung zellulärer molekularer Prozesse.
The heat stress response is characterized by the presence of heat stress transcription factors (Hsfs) which mediate transcription of heat stress genes. In tomato (Lycopersicon peruvianum) cell cultures the simultaneous expression of four Hsfs, which are either constitutively (HsfA1 and HsfA3) or heat-stress inducible (HsfA2 and HsfB1) expressed, results in a complex network with dynamically changing cellular levels, intracellular localization and functional interactions. In order to examine the relevance of their multiplicity as well as to get more insights into the complexity of the plant heat stress response, the individual tomato Hsfs were investigated with respect to their protein interactions in vitro and in vivo. To this aim, I used pull-down assays as well as yeast assays to study the following aspects: 1. Oligomeric state of Hsfs: the results show that all class A Hsfs (HsfA1, HsfA2 and HsfA3) are trimeric proteins and interact with each other via the oligomerization (HR-A/B) domain. The similarity of their HRA/B regions allows formation of homo- and heterooligomeric complexes between all class A Hsfs. This special property was investigated by mutational studies with HsfA2 indicating that the linker and the HR-B regions are the minimal part required for Hsf/Hsf interactions. The conserved hydrophobic amino acid residues of the HR-B region are most important whereas the amino acid residues of the linker may provide higher flexibility to the HR-B region. Another investigated factor was HsfB1. HsfB1 is a member of class B Hsfs, which are characterized by an oligomerization domain without the 21 amino acid residues linker inserted between the HR-A and HR-B regions. It has a low activator potential and exists exclusively as dimer. HsfB1 can not physically interact with class A Hsfs. However, HsfB1 and HsfA1, binding to adjacent HSE sites, are assumed to cause strong synergistic effects in gene activation. 2. Potential HsfB1 interacting proteins: we searched for HsfB1 interacting proteins by using recombinant His-tagged proteins with HsfB1 as baits in pull-down assays. Histones H2A, H2B and H4 were identified by means of Peptide Mass Finger Printing and N-terminal sequencing analyses. The three histones represent the major proteins in tomato whole cell extracts retrieved by HsfB1. 3. HsfA2/small heat stress proteins (sHsps) interaction: pull-down and yeast two-hybrid assays were used to study the specific interaction of HsfA2 with tomato class II sHsp. This interaction occurs via the oligomerization domain of HsfA2. Other members of the plant Hsp20 family, including class I sHsp, do not interact with HsfA2. Heterooligomers of HsfA2 with class II sHsp may represent precursor forms of the plant higher molecular weight cytoplasmic complexes of heat stress granules, which form during heat stress. The findings presented in this thesis are a contribution to support the concept of a Hsfs network via protein-protein interactions. These data, together with information obtained from other studies, are used to propose a tentative model of the complex Hsfs network controlling the plant heat stress response.
G protein-coupled receptors (GPCRs) comprise the largest membrane protein family and play an essential role in signal transduction through the cell membrane. They are currently the targets of approximately 50 % of the pharmaceuticals on the market (Klabunde and Hessler, 2002). However, only one high-resolution GPCR structure has been determined up to now, that of bovine rhodopsin (Palczewski et al., 2000). The GPCR activation and regulation mechanisms are still unknown and other GPCR structures are thus required. MePNet (Membrane Protein Network) was a European consortium dedicated to structural studies of GPCRs. The approach was to produce 100 GPCRs in three expression systems (Escherichia coli, Pichia pastoris and Semliki Forest Virus infected mammalian cells) in order to select at each step of the process (production, solubilization, purification) the constructs that fulfilled quantity and quality (functionality) requirements for crystallization trials. In our team, we screened 38 of the 100 targets in P. pastoris. For each receptor, the clone with the highest production level was identified by dot-blot. The size and homogeneity of each receptor were then analyzed by Western-blot. The human adenosine A2A receptor showed a well-defined and pronounced single band and was thus selected for further characterization. The adenosine A2A receptor is a GPCR mainly localized in the central nervous system and, as it antagonizes dopaminergic activity, it has great potential as a drug target for the treatment of Parkinson’s disease. Functional characterization by binding assays with the specific antagonist [3H]-ZM241385 demonstrated a Bmax of 56 +/- 3 pmol/mg i.e. pmol of binder per milligram of total membrane protein, and a KD of 0.40 +/- 0.02 nM. Receptor production was then improved by lowering the induction temperature, decreasing the induction time and adding DMSO to the medium. For large-scale production, fermention reached around 300 g cells (wet weight)/L culture, which provided 43 mg of functional receptor in membranes per liter of culture. Functional solubilization was achieved with dodecyl-β-D-maltoside and the soluble yield was increased to 70-80 % of the membrane content by addition of cholesteryl hemisuccinate and increasing the ionic strength. The receptor was successfully purified via Ni-NTA and monomeric avidin chromatography in the presence of the antagonist ZM241385. This strategy produced a pure, homogeneous and stable receptor preparation with functionality demonstrated by radioligand binding assays. The total receptor yield after purification was routinely around 20 % of the membrane functional receptor content and 2 g of membranes provided 4 mg of pure receptor for crystallization trials. GPCRs are very difficult targets for crystallization, and co-crystallization with antibody fragments has been shown to be a successful method for crystallization of membrane proteins. In order to develop such a tool for the adenosine A2A receptor, a single-chain Fv (scFv) fragment specific to the purified receptor was selected by phage display. The receptor was functionally immobilized on the surface of streptavidin beads and after two rounds of selection, 6 different phages were identified several times. After production in E. coli and purification via Ni-NTA affinity chromatography, 4 out of the 6 scFv fragments were sufficiently enriched to be tested by ELISA. For the ELISA, the receptor was functionally immobilized via the biotinylation domain of the construct in a 96-well streptavidin-coated plate. The antibody fragments binding to the receptor were identified based on interaction with HRP-conjugated protein L. One scFv fragment gave a positive ELISA signal 10 fold above background and titration of the scFv fragment binding to the receptor was specific and saturable. However no complex of scFv fragment and receptor was observed on gel filtration. In order to have a more sensitive detection method, the scFv fragment was labeled with fluorescein: a complex was then observed up on gel filtration but the binding appeared to be non-specific. A pull-down assay with immobilized non-labeled scFv fragment finally confirmed the specificity of the binding, but also the low affinity of the interaction. Affinity maturation of this specific scFv fragment by a random mutagenesis and selection process should improve this parameter in order to obtain an adapted tool for co-crystallization.
A generic drug product (World Health Organization (WHO) terminology: multisource product) is usually marketed and manufactured after the expiry date of the innovator’s patent. Generic drugs are less expensive than the innovator products because generic manufacturers do not have to amortize the investment costs of research, development, marketing, and promotion. Multisource products must contain the same active pharmaceutical ingredients (APIs) as the original formulation and have to be shown to be interchangeable with the original formulation. Multisource products have to be shown bioequivalent to the innovator counterpart with respect to pharmacokinetic and pharmacodynamic properties. Multisource products are therefore identical in dose, strength, route of administration, safety, efficacy, and intended use. Bioequivalence can be demonstrated by in vitro dissolution, pharmacokinetic, pharmacodynamic or clinical studies. Since 2000, the U.S. Food and Drug Administration (FDA) allows the approval of certain multisource products solely on the basis of in vitro studies, i.e. by waiving in vivo studies in humans (“Biowaiver”), based on the Biopharmaceutics Classification Scheme (BCS). The BCS characterizes APIs by their solubility and permeability in the gastrointestinal tract (GIT). The different BCS Classes I-IV (Class I: high solubility, high permeability; Class II: low solubility, high permeability; Class III: high solubility, low permeability and Class IV: low solubility, low permeability) result from all possible combinations of high and low solubility with high and low permeability. Since the adoption of the BCS by the FDA in 1995, the BCS criteria have been under continuous development. In 2006, the WHO has released the most recent bioequivalence guidance including relaxed criteria for bioequivalence studies based on modified BCS criteria. According to this guidance, APIs belonging to the BCS classes I – and under defined conditions - II and III – are eligible for a biowaiver-based approval. The principal objective of this work was to characterize the first-line anti tuberculosis APIs, isoniazid, pyrazinamide, ethambutol dihydrochloride and rifampicin, according to their physicochemical, biopharmaceutical, pharmacokinetic and pharmacological properties and to classify them according to the BCS. Ethambutol dihydrochloride and isoniazid were classified as borderline BCS class I/III APIs. Pyrazinamide was classified as a BCS class III and rifampicin as a BCS class II API. Based on the BCS classification and the additional criteria defined in the WHO bioequivalence guidance, the possibility of biowaiver-based approval for immediate release (immediate release) solid oral dosage forms containing the first-line antituberculosis drugs was evaluated. A biowaiver-based approval with defined constraints was recommended for immediate release solid oral dosage forms containing isoniazid (interaction with reducing sugars), pyrazinamide and ethambutol dihydrochloride (relative narrow therapeutic index). Rifampicin was classified as a BCS class II API, and it was concluded that rifampicin containing solid oral immediate release drug products as well as Scale-Up and Post-Approval Changes (SUPAC) changes should not be approved by a biowaiver on the following basis: (i) its solubility and dissolution are highly variable due to polymorphism and instability, (ii) concomitant intake of food and antacids reduces its absorption and bioavailability, (iii) no in vitro predictive dissolution test has been found which correlates to in vivo absorption and (iv) several publications reporting cases of non-bioequivalent and bioinequivalent rifampicin products have been located in the literature. Thus, it is recommended that bioequivalence of rifampicin containing solid oral immediate release drug products should be established by in vivo pharmacokinetic studies in humans. This risk-benefit benefit assessment of a biowaiver-based approval was presented as a poster at the American Association of Pharmaceutical Scientists (AAPS) 2005 and subsequently published as “Biowaiver Monographs” in the Journal of Pharmaceutical Sciences. Based on the assessment of the dissolution properties of the antituberculosis drugs for a biowaiver approval, quality control dissolution methodologies for the International Pharmacopoeia (Pharm. Int.) were developed, presented at the WHO expert meeting and adopted in the Pharm. Int. (http://www.who.int/medicines/publications/pharmprep/OMS_TRS_948.pdf). Additionally, preliminary biowaiver recommendations were also developed for four firstline antimalarial drugs listed on the WHO Essential Medicines List (EML): Quinine, as both the hydrochloride and sulphate, and proguanil hydrochloride were classified as borderline BCS class I/III APIs. Since quinine is a narrow therapeutic index drug and many cases of non-bioequivalence have been reported in the literature, a biowaiverbased approval was not recommended. For solid oral immediate release dosage forms containing proguanil a biowaiver-based approval was recommended under the condition that they dissolve very rapidly. Primaquine phosphate was classified as a BCS class I API. Therefore, a biowaiver-based approval was recommended for immediate release solid oral dosage forms containing primaquine phosphate. Mefloquine hydrochloride was classified as a basic, BCS class IV/II API, making it ineligible for the biowaiver. Additionally, reports of non-bioequivalence and a narrow therapeutic index were found in the scientific literature. Consequently, bioequivalence of solid oral immediate release dosage forms containing mefloquine hydrochloride should be established by in vivo pharmacokinetic studies. The results for quinine hydrochloride and sulphate, proguanil hydrochloride, primaquine diphosphate and mefloquine hydrochloride were presented as a poster at the Pharmaceutical Sciences World Congress (PSWC) 2007 and published as a WHO Collaborating Center Report in June 2006. The aim of this project was to collect, evaluate, generate and publish relevant information for a biowaiver-based approval of essential medicines in order to provide a summary to local regulatory authorities. This information complements the selected list of essential medicines by providing information about the biopharmaceutical properties and pharmaceutical quality of solid oral immediate release dosage forms containing these APIs. The aim of the biowaiver project, inspired by the WHO and brought in life by the International Pharmaceutical Federation (FIP), is to enable access to essential medicines in standardized quality at an affordable price. In this work, a significant contribution to this aim in the form of four biowaiver monographs for the antituberculosis drugs and several reports on the antimalarials has been achieved.
Delthyridoid spiriferids are characterized by a global abundance and fast evolution during Silurian and Devonian, and, therefore, are used as important biostratigraphical and palaeobiogeographical tools. In this work, delthyridoid brachiopod faunas from different regions of today’s world, resp., of different palaeobiogeographical units, are compared side-by-side to investigate their phylogenetic relationships and to improve, in a second step, the palaeobiogeography from Late Silurian to Early Eifelian time. A new systematics of Delthyridoidae is established which is more complicated than hitherto assumed. The results of this study are mainly based on direct comparison of articulated and isolated brachiopod shells, external and internal moulds, as well as latex casts and serial sections. The computer supported cladistic analyses have turned out not to be useful due to different kinds of preservation resulting in an incomplete matrix which is insufficient for reliable cladograms. A further problem in terms of cladistical analyses are various convergences during the evolution of spiriferids. Many characters evolved independently from each other at different times in each lineage so that autapomorphies are hardly or not at all recognizable. As a result, families and genera are only definable by a combination of characters rather than by a single or a few autapomorphies. As a new method, 3D reconstruction from serial sections is introduced which made it possible for the first time to compare directly mouldic and shelly material. Preliminary results are presented herein. Statistical analyses of measurements taken from new taxa are made but regarded as a descriptive argument rather than a deciding factor for taxonmy due to incomplete preservation and/or tectonic deformation. Brachiopods, especially type material, from collections of different institutions and museums are studied as well as personal material, whenever possible collected from topotype outcrops. Emended diagnoses, if necessary, from family to species level are given. During this work several new taxa have been erected: 7 new families: Australospiriferidae, Murchisonispiriferidae, Orientospiriferidae, Otospiriferidae, Patriaspiriferidae, Rostrospiriferidae, and Trigonospiriferidae; 6 new genera, 1 of these in open nomenclature: Cyclopterospirifer, Hallispirifer, Parlinispirifer, Murchisonispirifer, Shujiapingensispirifer, and gen. nov. B; and 3 new species: Patriaspirifer merriami, Patriaspirifer johnsoni, and Murchisonispirifer feldmani; 1 taxon is defined as nomen novum: Orientospirifer nakaolingensis wani. In the framework of this project, 2 families: Filispiriferidae and Multispiriferidae; 1 subfamily: Multiplicatispiriferinae, 6 genera, 1 of them in open nomenclature: Frequentispirifer, Leonispirifer, Multiplicatispirifer, Ovetensispirifer, Turcispirifer, and Gen. A; and 9 new species, 3 of them in open nomenclature: Filispirifer hamadae, Leonispirifer leonensis, Multiplicatispirifer foumzguidensis, Oventensispirifer novascotianus, Quiringites arensentiae, Turcispirifer turciae, Multiplicatispirifer cf. foumzguidensis, Quiringites cf. arensentiae, and ?Turcispirifer sp. A which have already been established are also described in this work. The brachiopod faunas studied consist of externally very similar spiriferids which have been identified as same genera, species, or even subspecies in earlier times. These forms are considered as 6 distinct morphotypes Howellella-, Arduspirifer-, Acrospirifer-, Euryspirifer-, Paraspirifer-, and Multiplicatispirifer-like morphotypes, which are briefly introduced. The new systematics is characterized by different clades, the European/North African delthyridoid spiriferid clade, the North American delthyridoid spiriferid clade, the Asian delthyridoid spiriferid clade, the Malvinokaffric delthyridoid spiriferid clade, and the delthyridoid multiplicated spiriferid clade. Each of them is described in a cladistic and in a phylogenetic way. Their phylogenetic relationship sheds new light on palaeobiogeographical interpretations for the different stages from Late Silurian to early Middle Devonian time. A tendency for increasing endemicity is seen until the end of the Early Emsian, which is interrupted by short term regional faunal exchange within a province or within a realm, followed by a loss of endemicity resulting in global distribution of brachiopod genera until the end of Givetian time. The Old World Realm is re-defined due to the lack of phylogenetic relationship between its faunas and subdivided into the European Realm, consisting of the Gondwanan and Avalonian provinces, and the Asian Realm, consisting of the Siberian, Sino, and Mongolian provinces. A reconstruction of Lower Devonian palaeobiographical map is introduced.
(1) Die genomweite Expressionsanalyse von salzadaptierten Zellen von M. mazei Gö1 identifizierte eine Reihe von salzregulierten Genen. Neben den beiden Operone ota und abl, die für die Akkumulierung von Glycin-Betain und Ne-Azetyl-b-Lysin verantwortlich sind, konnte ein ABC-Transporter (MM0953), der in seiner Genumgebung weitere Transporter sowie Proteine mit konservierten S-Layer-Domänen aufweist, als salzreguliert erkannt werden. Dies deutet auf ein S-Layer-Exportsystem hin, das eine Rolle in salzadaptierten Zellen spielen könnte. (2) Eine genomweite Expressionsanalyse von Zellen von M. mazei Gö1 zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach einem hyperosmotischen Schock auf 400 mM NaCl ermöglichte Einblicke in den Verlauf der Genexpression. Die Erhöhung der externen Osmolarität resultierte in der erhöhten Expression von Genen, die für die Aufnahme und Biosynthese von kompatiblen Soluten verantwortlich sind sowie von Genen deren Produkte regulatorische Funktion haben könnten. (3) Genomweite Expressionsanalysen von Zellen von M. mazei Gö1 nach einem hypoosmotischen Schock zeigten erhöhte Expression von Genen, die an der Regulation und an der generellen Stressantwort beteiligt sind. Gene, deren Produkte im Stoffwechsel wichtig sind – besonders Gene, die für Methylamin-Corrinoid-Methyltransferasen kodieren – erscheinen stark reprimiert. (4) Die Bestimmung der intrazellulären Ionenkonzentrationen zeigte ein unspezifisches Einströmen von den Ionen, die den osmotischen Schock auslösen sofort nach dem Schock, sowie den Ausstrom derselben Ionen im Verlauf von 5 Minuten. Die Ionenkonzentrationen der Ionen, die den Schock auslösten, blieben intrazellulär erhöht. Das Ein- und Ausströmen der Ionen nach einem hyperosmotischen Stress ist nicht energieabhängig. (5) M. mazei akkumulierte nach einem hyperosmotischen Schock kein K+, zeigte aber eine erhöhte intrazelluläre Konzentration dieses Ions, wenn die Zellen in Medium mit erhöhter Osmolarität angezogen wurden. (6) Durch hyperosmotische Schocks mit verschiedenen Salzen und Zuckern konnte gezeigt werden, dass die kurzzeitige Akkumulation von Ionen keine gerichtete Antwort auf den osmotischen Stress ist. (7) Es konnte weiters gezeigt werden, dass Zellen von M. mazei Gö1, die mit dem kompatiblen Solut Betain inkubiert wurden, nach einem hyperosmotischen Schock K+ akkumulieren. Dies bedeutet möglicherweise eine K+-abhängige Regulation des Glycin-Betain-Transporters. (8) Die Funktion der drei im Genom kodierten Na+/H+-Antiporter konnte auf transkriptioneller Ebene nicht geklärt werden. Trotzdem zeigt ein Hydrophobizitätsplot des Proteins eine mögliche Beteiligung von Nha1 (MM0294) an der Osmoregulation durch eine hydrophile C-terminale Domäne. (9) Nach einem hyperosmotischen Schock von 38,5 auf 400 mM NaCl erhöhte sich die intrazelluläre Konzentration an Glutamat, das in M. mazei als kompatibles Solut fungiert, bereits nach drei Stunden. Zellen, die bereits an die erhöhte Salzkonzentration adaptiert waren, enthielten 1,4 μmol Glutamat/mg Protein. (10) Die Glutamin-Synthetase zeigte eine erhöhte Transkription nach einem hyperosmotischen Schock. Das Protein wird aber nicht salzabhängig produziert und zeigt keine Enzymaktivität. Die Biosynthese des Solutes über eine Glutamat-Dehydrogenase ist die wahrscheinliche Alternative. (11) Aufgrund der generierten Expressionsprofile und der physiologischen Daten konnte ein Modell der Osmoadaptation in Methanosarcina mazei Gö1 erstellt werden.
Pflanzliche Biomasse bietet sich hervorragend als billiges und in großen Mengen verfügbares Ausgangssubstrat für biotechnologische Fermentationsprozesse an. Für die Herstellung von Bioethanol ist die Hefe Saccharomyces cerevisiae der wichtigste Produktionsorganismus. Allerdings kann S. cerevisiae die in Biomasse in großer Menge enthaltenen Pentosen Xylose und Arabinose nicht verwerten. Für einen ökonomisch effizienten Fermentationsprozess ist es daher essentiell, das Substratspektrum der Hefe entsprechend zu erweitern. Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, den bereits in Hefe etablierten bakteriellen Arabinose-Stoffwechselweg signifikant zu verbessern. Genetische und physiologische Analysen ergaben, dass eines der heterolog produzierten Enzyme, die L-Arabinose-Isomerase aus Bacillus subtilis, einen limitierenden Schritt innerhalb des Stoffwechselweges darstellte. In einem genetischen Screening konnte ein aktiveres Isoenzym aus Bacillus licheniformis gefunden werden. Zusätzlich wurde der Codon-Gebrauch aller heterologen bakteriellen Gene dem Codon-Gebrauch der hoch-exprimierten glykolytischen Gene von S. cerevisiae angepasst. Mit diesem rationalen Ansatz konnte die Ethanolproduktivität aus Arabinose um mehr als 250% erhöht werden, der Ethanolertrag wurde um über 60% gesteigert. Dies stellte die erste erfolgreiche Verbesserung eines heterologen Stoffwechselwegs in S. cerevisiae über Codon-optimierte Gene dar. In einem breit angelegten Screening wurde zum ersten Mal eine prokaryontische Xylose-Isomerase gefunden, die in S. cerevisiae eine hohe Aktivität aufweist. Durch das Einbringen des xylA-Gens aus Clostridium phytofermentans in verschiedene Hefe-Stämme wurden diese in die Lage versetzt, Xylose als alleinige Kohlenstoffquelle zu nutzen. Zusätzlich konnte damit die Vergärung von Arabinose und Xylose in einem einzigen S. cerevisiae-Stamm kombiniert werden. Vorherige Versuche, einen Pentose-vergärenden Stamm zu konstruieren, der einen bakteriellen Arabinose-Stoffwechselweg mit dem eukaryontischen Xylose-Reduktase/Xylitol-Dehydrogenase-Weg kombinierte, scheiterten an der unspezifischen Umsetzung der Arabinose durch die Xylose-Reduktase zu dem nicht weiter verstoffwechselbaren Arabitol. Für einen industriellen Einsatz der rekombinanten Hefen war es unerlässlich, die Eigenschaften für die Pentose-Umsetzung in Industrie-relevante Hefe-Stämme zu übertragen. Durch die Etablierung von genetischen Methoden und Werkzeugen ist es in dieser Arbeit gelungen, Industrie-Stämme zu konstruieren, die in der Lage sind, Arabinose oder Xylose zu metabolisieren. Dabei wurden die heterologen Gene stabil in die Chromosomen der Stämme integriert. Diese wurden mit Hilfe von „Evolutionary Engineering“ so optimiert, dass sie die Pentose-Zucker als alleinige Kohlenstoffquellen zum Wachstum nutzen konnten. Fermentationsanalysen zeigten eine effiziente Umsetzung der Pentosen zu Ethanol in diesen Stämmen. Damit ist ein neuer Startpunkt für die Konstruktion von industriellen Pentose-fermentierenden Hefe-Stämmen markiert, der zukünftig effizientere Bioethanol-Produktion ermöglichen wird.
The research presented in this thesis characterizes U2AF homology motifs (UHM) and their interactions with UHM ligand motifs (ULM) in the context of splicing regulation. UHM domains are a subgroup of RNA recognition motifs (RRM) originally discovered in the proteins U2AF65 and U2AF35. Whereas canonical RRMs are usually involved in binding of RNA, UHM domains bind tryptophan containing linear protein motifs (ULM) instead. In the first article, we analyze the complex network of interactions between splicing factors and RNA that initiate the assembly of the spliceosome at the 3´ splice site of an intron. The protein U2AF65 binds a pyrimidine-rich element in introns and recruits U2snRNP by binding its protein component SF3b155. My contribution was to define the binding site of the protein U2AF65 to the intrinsically unstructured N-terminus of the scaffolding protein SF3b155. I could show that the UHM domain of U2AF65 recognizes a ULM in SF3b155, and that this binding site is not overlapping with the binding sites of other splicing factors, like p14, to SF3b155. As the U2AF65-UHM:SF3b155-ULM interaction is mutually exclusive with an interaction between U2AF65-UHM and a ULM in the splicing factor SF1, which was reported to initially recognize the branch point sequence, my results provide the molecular details on how SF3b155 replaces SF1 during spliceosomal reorganizations. In the second article, we show that overexpression of the UHM domain of the splicing factor SPF45 induces exon 6 skipping in the pre-mRNA of Fas (CD95/APO-1). I provide evidence for in vitro binding of SPF45-UHM to ULM sequences in the splicing factors U2AF65, SF1, and SF3b155. I crystallized free and SF3b155-bound SPF45 UHM and solved both structures by X-ray crystallography. The analysis of the complex interface and sequence differences in the ULMs allowed me to design mutations of SPF45-UHM, which selectively inhibit binding to distinct ULMs. After assessing the ULM binding properties in vitro, we could show that the activity of SPF45-UHM in influencing the splicing pattern of Fas relies on interactions with SF3b155 and/or SF1, but that an interaction with U2AF65 is dispensable. A mechanism for the activity of SPF45-UHM could thus be engaging in ULM interactions and thus interfering with the network of interactions that initiate the assembly of the spliceosome at the 3´splice site, as described above. In the third article, we describe an unusual flexible homodimerization mode of the UHM in the splicing factor Puf60, which enables simultaneous interactions with ULM sequences on other splicing factors. I could show that the NMR relaxation properties of Puf60-UHM are inconsistent with a model of a rigid dimer, but rather indicate a dimerization via a flexible linker. I identified a flexible loop in the peptide backbone of Puf60-UHM, and showed that mutiation of acidic residues in this loop impairs the dimerization. To analyze the dimerization interface in further detail, I solved the structure of Puf60-UHM by X-ray crystallography. The acidic residues in the flexible loop of one UHM dimer subunit mediate the dimerization by contacting basic residues on the β-sheet surface of the other dimer subunit. Differences in the four dimer interfaces observed for the eight molecules in the asymmetric unit of the crystal support the model of an undescribed, flexible mode of dimerization, and thus complement the NMR relaxation data. Furthermore, I could show that the Puf60-UHM dimer and U2AF65-UHM contact different ULM sequences on the SF3b155 N-terminus in vitro, thus providing a possible explanation for the mutual cooperative activation of Puf60 and U2AF65 in splicing assays described in the literature. The fourth article is a review about recent research on the recognition of DNA double strand breaks (DSB) by covalent histone modifications. The p53 binding protein 1 (53BP1) is a DSB sensor and a checkpoint protein for mitosis. Recent crystallographic evidence indicates that 53BP1 recognizes DSB sites by binding histone H4 dimetylated at lysine 20 (H4-K20). We provide a comprehensive overview of the atomic resolution structures that revealed how proteins can specifically recognize histone tail modifications, especially methylated lysines, to read the information stored in what is called the histone code.
On the molecular basis of novel anti-inflammatory compounds and functional leukocyte responses
(2006)
Inflammation is a complex pathophysiological event that can be triggered by activation of a number of distinct activation pathways eventually leading to the release of pro-inflammatory molecules and enzymes. Among all cells involved in inflammatory processes, neutrophils, monocytes and platelets are of major relevance. Activation of leukocytes occurs via binding of agonists to distinct GPCRs leading to activation of G proteins and proximate signaling cascades. In short, GPCR activation by pro-inflammatory agonists such as fMLP, PAF or LTB4 leads to activation of G proteins that are associated with the receptor at the cytosolic side of the plasma membrane. G proteins consist of a Gα- and a Gβγ-subunit which are associated in the inactive state. In this state, G proteins bind GDP. Upon activation, GDP is replaced by GTP that results in the dissociation of the Gα- from the Gβγ-subunit. Both subunits are capable of activating distinct PLC-β isoenzymes that catalyze the turnover of PtdIns(4,5)P2 into the second messengers Ins(1,4,5)P3 and DAG. Every GPCR holds a distinct pattern of associated G proteins which preferentially activate distinct PLC-β isoenzymes. Ca2+ channels within the SR/ER-membrane function as specific receptors for Ins(1,4,5)P3. Ligation of Ins(1,4,5)P3 to this receptor causes a release of Ca2+ from intracellular stores into the cytosol that is subsequently followed by the influx of Ca2+ e through channels in the plasma membrane. Ca2+ represents an important signaling molecule, involved in the regulation of cellular processes and enzymes that mediate inflammatory events such as ROS formation and the release of degradative enzymes. 5-LO and COXs are involved in the biosynthesis of pro-inflammatory eicosanoids and catalyze the turnover of AA into LTs and PGs, respectively. Both enzymes play pivotal roles in the initiation and maintenance of allergic diseases and inflammatory processes. LTB4 is regarded as a potent chemotactic and chemokinetic substance, whereas the cysteinyl-LTs cause smooth muscle contraction and increased vascular permeability. Therefore, 5-LO inhibitors are assumed to possess therapeutic potential for the treatment of diseases related to inflammation. Besides the intervention with 5-LO activity, inhibition of COX-activity is an effective way to suppress inflammatory reactions. The two COX isoenzymes, namely COX-1 and COX-2 show different patterns in terms of tissue expression and sensitivity towards inhibitors. COX-1 is supposed to be constantly expressed whereas COX-2 expression is upregulated at sites of inflammation. The extract of H. perforatum is commonly used for the treatment of mild to moderate depressive disorders, accompanied by a moderate profile of side effects. The extract´s efficacy as an antidepressant can be traced back to the content of the phloroglucinol hyperforin which represents the most abundant lipophilic constituent. However, in folk medicine hypericum extracts are additionally used for the treatment of inflammatory disorders such as rheumatoid arthritis or inflammatory skin diseases. In fact, it was shown that hypericum extracts and hyperforin possess anti-inflammatory potential. Hyperforin was described as a dual inhibitor of 5-LO and COX-1. The phloroglucinols MC and S-MC from M. communis significantly differ from the molecular structure of hyperforin. Hyperforin represents a monomeric prenylated derivative whereas MS and S-MC are non-prenylated oligomeric compounds. To date, the anti-inflammatory potential of SM and S-MC has not been investigated in detail. So far, solely antioxidant activity was attributed to MC and S-MC that indeed might qualify them as anti-inflammatory drugs. The phloroglucinols MC, S-MC and hyperforin are potent inhibitors of ROS formation and HLE release. However, any inhibitory potential of these compounds was only observed when cells were activated by GPCR agonists such as fMLP or PAF. In contrast, when cells were stimulated under circumvention of G protein-associated signaling cascades, the abovementioned inhibitors were not effective at all. In leukocytes, [Ca2+]i plays a pivotal role in signal transduction and regulation of the indicated pro-inflammatory cellular functions. We were able to show that MC, S-MC and hyperforin inhibited GPCR-mediated Ca2+ mobilization with approximately the same potency as the above-mentioned leukocyte responses. However, all of the indicated phloroglucinols were ineffective when cells were stimulated with ionomycin. Since ionomycin as well as GPCR agonists exert their effects by mobilizing Ca2+ i, it seems conceivable that MC, S-MC and hyperforin somehow interfere with G protein-associated signaling pathways. In order to investigate PLC as a potential target of hyperforin, the effects of hyperforin were compared to those of the broad spectrum PLC inhibitor U-73122. We found that both inhibitors acted in a comparable manner in terms of agonist-induced Ca2+ mobilization and in regard of the manipulation of basal Ca2+ levels in unstimulated cells. In this respect, significant differences between hyperforin and U-73122 were obvious for inhibition of total PLC activity in vitro. Thus, U-73122 blocked PLC activity whereas hyperforin was ineffective in this respect. This might indicate that only certain PLC isoenzymes are affected by hyperforin. Alternatively, other components within G protein-associated signaling pathways such as G proteins itself or the Ins(1,4,5)P3 receptor must be taken into account as putative targets of hyperforin. We were able to introduce MC and S-MC as novel dual inhibitors of 5-LO and COX-1. Interestingly, such a pattern was also described for hyperforin. MC and S-MC turned out to be direct inhibitors of 5-LO, based on the fact that they inhibit 5-LO not only in intact cells but also as purified enzyme in vitro. For MC and S-MC, great discrepancies were observed between the IC50 values concerning 5-LO inhibition and the concentrations that exert the antioxidative effects. It seems probable that 5-LO inhibition is not related to reduction of the active site iron as a result of the antioxidant activity of MC and S-MC but rather to direct interference with the 5-LO enzyme. The capability of MC and S-MC to suppress COX-1 activity seems not to be a unique effect of these phloroglucinols because for COX-1, the IBPC, present in both MC and S-MC, turned out to be the most active compound. ....
Active neurogenesis continuously takes place in the dentate gyrus of the adult mammalian brain. The dentate gyrus of the adult rodent hippocampus contains an astrocytelike cell population that is regarded as residual radial glia. These cells reside with their cell bodies in the subgranular layer (SGL). Radial processes traverse the granule cell layer (GCL) and form bushy ramifications in the inner molecular layer (IML). The residual radial glial cells apparently represent neuronal progenitor cells that can give rise to functionally integrated granule cells. To date the cellular and molecular events driving a subpopulation of these cells into neurogenesis as well as the cellular transition states are poorly understood. The present study shows, that in the mouse dentate gyrus, this cell type selectively expresses surfacelocated ATPhydrolyzing activity and is immunopositive for nucleoside triphosphate diphosphohydrolase 2 (NTPDase2). NTPDase2 is an ectoenzyme and hydrolyzes extracellular nucleoside triphosphates such as ATP or UTP to their respective nucleoside diphosphates. The enzyme becomes expressed in the hippocampus during late embryogenesis from E17 onwards, and is thus not involved in early brain development. Its embryonicpattern of expression mirrors dentate migration of neuroblasts and the formation of the primary and finally the tertiary dentate matrix. NTPDase2 is also expressed by a transient population of cortical radial glia from late embryonic development until postnatal day 5. NTPDase2 can be employed as a novel markerfor defining cellular transition states along the neurogenic pathway. It is associated with subpopulations of GFAP and nestinpositive cells. These intermediate filaments are typically expressed by the progenitor cells of the dentate gyrus. In addition there is a considerable overlap with doublecortinand PSANCAM positive cells. The expression of the microtubuleassociated protein doublecortin and of PSANCAM which are expressed by migrating neuroblasts is indicative of a transition of progenitors to a neural phenotype or an immature form of granule cell. NTPDase2 is no longer associated with young neurons and with maturegranule cells, as indicated by the lack of doubleimmunostaining for III tubulin and NeuN, respectively. Furthermore, β S100positive astrocytes do not express NTPDase2 validating that NTPDase2 is also not associated with later stages of gliogenesis. Experiments with the Sphase marker bromodeoxyuridine (BrdU) demonstrate that NTPDase2positive cell proliferate. Postmitotic BrdU-labeled cells preferentially acquire an NTPDase2positive phenotype. Many of these cells were also positive for GFAP. The contribution of BrdUlabeled cells positive for NTPDase2 increased with time from 2 h to 72 h, validating a strong association of NTPDase2 with proliferating cells of the dentate gyrus. The colocalization studies with various markers and the results of the experiments suggestthat NTPDase2 is associated with cell types of varying maturation states but not with mature neurons or astrocytes. Studies on the formation of neurospheres from the dentate gyrus validate previous data suggesting that the hippocampal progenitors have little capacity for self renewal in vitro. In situ hybridization results indicate the presence of one of the metabotropic purinergic receptor subtypes (the P2Y1 receptor) within the adult neurogenic regions, the dentate gyrus and the lateral walls of the lateral ventricles. A patchclamp analysis demonstrates the presence of functional ionotropic nucleotide receptor (P2X receptors) in progenitor cells expressing nestin promotordriven GFP. They suggest that the signaling pathway via extracellular nucleotides and nucleotide receptors may play a role in the control of adult hippocampal neurogenesis.
Studies in particular of the last decade showed that active neurogenesis continuously takes place in the subventricular zone (SVZ) of the lateral ventricles of the adult rodent brain. Neurogenesis in the SVZ leads to migration of neuroblasts within the rostral migratory stream (RMS) and mature neuron formation mainly in the olfactory bulb (OB). According to present understanding, glial cells with astrocytic properties represent the actual adult neural stem cells. The cell types representing the various cellular transition states leading to the formation of mature neurons as well as the mechanisms controlling adult neurogenesis and neuroblast migration are poorly understood. A previous study from this laboratory demonstrated that the ATP-hydrolyzing enzyme nucleoside triphosphate diphosphohydrolase 2 (NTPDase2) is associated with type B cells, the presumptive neural stem cells. NTPDase2 is a protein of the plasma membrane with its catalytic site facing the extracellular space. It hydrolyzes extracellular nucleoside triphosphates to their respective nucleoside diphosphates. This raises the possibility that the signaling pathway via extracellular nucleotides is involved in the control of adult neurogenesis. Neurons as well as glial cells express several subtypes of receptors (P2 receptors) that are responsive to the nucleotides ATP, ADP, UTP, or UDP. P2X receptors are ATP-gated Na+, K+ and Ca2+ permeable ion channels, P2Y receptors are coupled to trimeric G-proteins. In order to probe for a functional role of nucleotides in adult neurogenesis, the present study referred to an in vitro system (neurospheres). Neurospheres produced from isolates of the mouse SVZ and cultured in the presence of EGF and bFGF expressed the neural stem cell marker nestin and also GFAP, S100β, NTPDase2 and tissue non-specific alkaline phosphatase. Neurospheres generated from the cells of the subventricular zone were multipotenital. This was revealed by immunostaining of differentiated cells with markers for astrocytes, neurons and oligodendrocytes. The presence of ecto-nucleotidase was verified by analyzing the free phosphate released from nucleotides. The tissue non-specific form of alkaline phosphatase was the predominant enzyme. Both NTPDase2 and TNAP could be identified by immunocytochemistry and Western blotting. Hydrolysis was not observed for p-nitrophenyl thymidine monophosphate, a substrate of members of the ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase family (NPP1 to NPP3). Since ecto-nucleotidases control the availability of extracellular nucleotide agonists, neurospheres were studied for the potential expression and functional role of nucleotide receptors. Neurospheres responded to extracellular nucleotides with a transient rise in Ca2+ (ATP = ADP > UTP). The rise in Ca2+ was due to P2Y receptors. The Ca2+ response was unaltered in the absence of extracellular Ca2+ and strongly reduced by thapsigargin, a blocker of internal Ca2+ stores. The P2Y1 antagonist MRS2179 strongly reduced the ATP- or ADP-induced increase in Ca2+, suggesting the involvement of a P2Y1 receptor. In addition, suramin and PPADS, non-selective antagonists for P2 receptors, inhibited most of the Ca2+ response. The agonistic activity of UTP and the lack of response to UDP implied the additional presence of a P2Y2 and/or a P2Y4 receptors and the absence of a functional P2Y6 receptor. RT-PCR experiments demonstrated that neurospheres expressed P2Y1 and P2Y2 receptors but not P2Y4 receptor. That the majority of the Ca2+ response to ATP was mediated via P2Y1 receptors was also confirmed by analysis of P2Y1 knockout mice and by application of the P2Y1 receptor-specific antagonist MRS2179. In addition, agonists of P2Y1 and P2Y2 receptors and low concentrations of adenosine augmented cell proliferation inspite of the presence of mitogenic growth factors. Neurosphere cell proliferation was attenuated after application of MRS2179 and in neurospheres from P2Y1 receptor knockout mice. These results infer a nucleotide receptor-mediated synergism that augments growth factor-mediated cell proliferation. Taken together these results suggest that P2Y-mediated nucleotidergic signalling is involved in neurosphere function and possibly also in adult neurogenesis in situ.
In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass bei verschiedenen Hämostasedefekten eine unterschiedliche Aktivierung des Gerinnungssystems besteht. So wiesen Personen mit heterozygoter Prothrombin-Mutation (G20210A) eine massiv erhöhte Thrombinbildung auf, während sie in den üblichen Globaltests (Prothrombinzeit (PT) und aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aPTT)) und der Thrombinzeit (TZ) nicht pathologisch waren. Bei Personen mit reaktiv aktiviertem Gerinnungssystem war ebenfalls eine erhöhte Thrombinbildung nachweisbar, zudem war die aPTT verkürzt. Dagegen zeigten Personen mit Antiphospholipidsyndrom und Personen mit heterozygoter/homozygoter FV-Leiden-Mutation eine leicht gesteigerte Thrombinbildung, ferner waren die anderen plasmatischen Tests (PT, aPTT, TZ), außer der Lupus-Antikoagulans-sensitiven aPTT, unauffällig. In dieser Arbeit wurde mit dem Thrombingenerierungstest (TGT) eine Methode etabliert und evaluiert, um die in-vitro Wirksamkeit neuer Antithrombotika auf die Blutgerinnung zu untersuchen. Die verwendeten Antithrombotika repräsentieren 3 Klassen oral applizierbarer, niedermolekularer Substanzen: 1. Thrombininhibitoren (Dabigatran und Melagatran) 2. FXa-Inhibitoren (Rivaroxaban und Apixaban) 3. Duale Thrombin/FXa-Inhibitoren (BR4965 und BR4966) Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass Antithrombotika je nach Wirkmechanismus (FXa-Hemmung, Thrombinhemmung oder duale Thrombin/FXa-Hemmung) unterschiedliche Effekte auf die TGT-Parameter ETP (endogenes Thrombinpotential) und PEAK (größte Thrombinbildungsgeschwindigkeit) haben. Während der PEAK gut geeignet war, die antihämostatische Wirkung von selektiven FXa-Inhibitoren abzubilden, wurde das ETP durch die FXa-Inhibitoren nicht so stark beeinflusst, insbesondere in plättchenarmen Plasma (PPP). Im Gegensatz dazu hatten die selektiven Thrombininhibitoren eine gute dosisabhängige Wirkung auf das ETP, jedoch keine auf den PEAK. Mehr noch wurde für Inhibitoren mit thrombinhemmender Komponente beobachtet, dass sie den PEAK der Thrombinbildung erhöhen statt reduzieren, wenn sie in niedrigen Konzentrationen zugegeben wurden. Dieses Phänomen war umso stärker ausgeprägt, je höher die Thrombinselektivität der Substanz war. Erwartungsgemäß zeigten die beiden dualen Thrombin/FXa-Inhibitoren sowohl Eigenschaften von FXa-Inhibitoren, als auch von selektiven Thrombininhibitoren, wobei die Substanz BR4965 in ihrer Wirkung eher den FXa-Inhibitoren ähnelte und BR4966 eher den selektiven Thrombininhibitoren. In PPP und PRP (plättchenreichem Plasma) von Personen mit aktiviertem Gerinnungssystem (heterozygote/homozygote FV-Leiden Mutation, heterozygote Prothrombin-Mutation oder reaktiv aktiviertes Gerinnungssystem) zeigten die Antithrombotika ähnliche Effekte auf die Thrombinbildung wie bei gesunden Probanden. Lediglich in PRP von Patienten mit Antiphospholipidsyndrom verursachten die Inhibitoren eine stärkere Hemmung der Thrombinbildung, insbesondere die FXa-Hemmer. Der Einfluss des FXa-Inhibitors Rivaroxaban auf die PT erwies sich als dosisabhängig und korreliert eng mit dem Plasmaspiegel, so dass mit diesem Globaltest ein einfacher Monitoring-Test zur Verfügung steht. Es ist aber zu beachten, dass die PT in Sekunden abgelesen werden muss, denn nur für eine Ablesung in Sekunden, aber nicht in % (= Quick-Wert) ergab sich eine enge Korrelation mit den Plasmaspiegeln. Für das Monitoring von selektiven Thrombininhibitoren wie Dabigatran war die aPTT besser geeignet. Die Heparin-induzierte Thrombozytopenie Typ II (HIT Typ II) ist eine schwerwiegende Komplikation der Heparin-Therapie. Daher wurde untersucht, ob die neu entwickelten Antithrombotika auch das Risiko für die Enstehung einer HIT Typ II bergen. Hierzu wurde auf Basis der Thrombinbildung ein Testsystem entwickelt, in dem gezeigt wurde, dass Plättchenfaktor 4 (PF4) die gerinnungshemmende Aktivität von Heparinen, aber nicht die der neuen Antithrombotika neutralisiert. Hieraus ist zu schließen, dass PF4 an Heparine binden kann, aber nicht an die neuen Antithrombotika. Folglich sollte das Risiko einer HIT Typ II unter den neuen Antithrombotika gering sein, da hierfür zunächst Antikörper an den Komplex aus PF4 und Heparin (bzw. PF4/Antithrombotikum) binden müssen. Abschließend wurde der Einfluss der neuen Inhibitoren auf die Ausbildung der Thrombozyten- Leukozyten-Aggregate untersucht, da bei akuten thromboembolischen Ereignissen (z.B. Herzinfarkt) erhöhte Werte von Thrombozyten-Leukozyten-Aggregaten nachgewiesen wurden. Alle untersuchten Substanzen hatten eine inihibitorische Wirkung auf die Ausbildung der Thrombozyten-Leukozyten-Aggregate, wobei der hemmende Effekt umso stärker ausgeprägt war, je höher die Thrombinselektivität des Inhibitors war. In dieser Arbeit wurde mit dem Thrombingenerierungstest (TGT) eine Methode etabliert und evaluiert, um die in-vitro Wirksamkeit neuer Antithrombotika auf die Blutgerinnung zu untersuchen. Die verwendeten Antithrombotika repräsentieren 3 Klassen oral applizierbarer, niedermolekularer Substanzen: 1. Thrombininhibitoren (Dabigatran und Melagatran) 2. FXa-Inhibitoren (Rivaroxaban und Apixaban) 3. Duale Thrombin/FXa-Inhibitoren (BR4965 und BR4966) Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass Antithrombotika je nach Wirkmechanismus (FXa-Hemmung, Thrombinhemmung oder duale Thrombin/FXa-Hemmung) unterschiedliche Effekte auf die TGT-Parameter ETP (endogenes Thrombinpotential) und PEAK (größte Thrombinbildungsgeschwindigkeit) haben. Während der PEAK gut geeignet war, die antihämostatische Wirkung von selektiven FXa-Inhibitoren abzubilden, wurde das ETP durch die FXa-Inhibitoren nicht so stark beeinflusst, insbesondere in plättchenarmen Plasma (PPP). Im Gegensatz dazu hatten die selektiven Thrombininhibitoren eine gute dosisabhängige Wirkung auf das ETP, jedoch keine auf den PEAK. Mehr noch wurde für Inhibitoren mit thrombinhemmender Komponente beobachtet, dass sie den PEAK der Thrombinbildung erhöhen statt reduzieren, wenn sie in niedrigen Konzentrationen zugegeben wurden. Dieses Phänomen war umso stärker ausgeprägt, je höher die Thrombinselektivität der Substanz war. Erwartungsgemäß zeigten die beiden dualen Thrombin/FXa-Inhibitoren sowohl Eigenschaften von FXa-Inhibitoren, als auch von selektiven Thrombininhibitoren, wobei die Substanz BR4965 in ihrer Wirkung eher den FXa-Inhibitoren ähnelte und BR4966 eher den selektiven Thrombininhibitoren. In PPP und PRP (plättchenreichem Plasma) von Personen mit aktiviertem Gerinnungssystem (heterozygote/homozygote FV-Leiden Mutation, heterozygote Prothrombin-Mutation oder reaktiv aktiviertes Gerinnungssystem) zeigten die Antithrombotika ähnliche Effekte auf die Thrombinbildung wie bei gesunden Probanden. Lediglich in PRP von Patienten mit Antiphospholipidsyndrom verursachten die Inhibitoren eine stärkere Hemmung der Thrombinbildung, insbesondere die FXa-Hemmer. Der Einfluss des FXa-Inhibitors Rivaroxaban auf die PT erwies sich als dosisabhängig und korreliert eng mit dem Plasmaspiegel, so dass mit diesem Globaltest ein einfacher Monitoring-Test zur Verfügung steht. Es ist aber zu beachten, dass die PT in Sekunden abgelesen werden muss, denn nur für eine Ablesung in Sekunden, aber nicht in % (= Quick-Wert) ergab sich eine enge Korrelation mit den Plasmaspiegeln. Für das Monitoring von selektiven Thrombininhibitoren wie Dabigatran war die aPTT besser geeignet. Die Heparin-induzierte Thrombozytopenie Typ II (HIT Typ II) ist eine schwerwiegende Komplikation der Heparin-Therapie. Daher wurde untersucht, ob die neu entwickelten Antithrombotika auch das Risiko für die Enstehung einer HIT Typ II bergen. Hierzu wurde auf Basis der Thrombinbildung ein Testsystem entwickelt, in dem gezeigt wurde, dass Plättchenfaktor 4 (PF4) die gerinnungshemmende Aktivität von Heparinen, aber nicht die der neuen Antithrombotika neutralisiert. Hieraus ist zu schließen, dass PF4 an Heparine binden kann, aber nicht an die neuen Antithrombotika. Folglich sollte das Risiko einer HIT Typ II unter den neuen Antithrombotika gering sein, da hierfür zunächst Antikörper an den Komplex aus PF4 und Heparin (bzw. PF4/Antithrombotikum) binden müssen. Abschließend wurde der Einfluss der neuen Inhibitoren auf die Ausbildung der Thrombozyten- Leukozyten-Aggregate untersucht, da bei akuten thromboembolischen Ereignissen (z.B. Herzinfarkt) erhöhte Werte von Thrombozyten-Leukozyten-Aggregaten nachgewiesen wurden. Alle untersuchten Substanzen hatten eine inihibitorische Wirkung auf die Ausbildung der Thrombozyten-Leukozyten-Aggregate, wobei der hemmende Effekt umso stärker ausgeprägt war, je höher die Thrombinselektivität des Inhibitors war.
I. Untersuchung der Transformationsmaschinerie in Acinetobacter baylyi ADP1 durch Analyse der subzellulären Lokalisation von Kompetenzproteinen, Mutantenstudien und In-vivo-Detektion des DNA-Translokators in der lebenden Zelle. 1. Durch Komplementationsstudien konnte gezeigt werden, dass die Markerinsertionen in den Mutanten T843 (comM::nptII) und T840 (comL::nptII) keine polaren Effekte auf stromabwärts gelegene Gene des comM-Q Clusters haben. Hieraus kann geschlossen werden, dass ComM und ComL essentiell sind für die natürliche Transformation. 2. Mit Hilfe der sacB-nptII Selektionskassette wurde eine markerlose und somit nichtpolare Mutation in comN erzeugt. Diese Mutante war nicht mehr transformierbar, woraus eindeutig geschlossen werden kann, dass ComN ebenfalls essentiell ist für die natürliche Transformation. 3. Western-Blot-Analysen subzellulärer Fraktionen von A. baylyi ergaben, dass die Kompetenzproteine ComL und ComN in der inneren Membran lokalisiert sind. 4. Mutantenstudien führten zu dem Schluss, dass ComL in der comM-, der comN- und der comO-Mutante weder im Rohextrakt, noch in subzellulären Membranfraktionen nachzuweisen ist. Auch ComN ist in der comM- und der comO-Mutante weder im Rohextrakt, noch in subzellulären Membranfraktionen nachzuweisen. Daraus lässt sich folgern, dass die Proteine entweder die Expression der entsprechende Gene beeinflussen oder dass durch Interaktionen von ComM, ComN, ComL und ComO die Stabilität der Proteine erhöht wird. 5. Die Kompetenzproteine ComEA und ComP wurden translational mit GFPuv fusioniert (C-terminale Fusion). Die Expression der Gene comEA-gfp und comP-gfp, die auf dem Plasmid pRK415 unter der Kontrolle eines lac-Promotors vorlagen, führte nach Induktion mit IPTG zur Detektion der Fusionsproteine in A. baylyi. Über Komplementationsstudien konnte nachgewiesen werden, dass die ComEA-GFP- und ComP-GFP-Fusionsproteine funktionsfähig sind. 6. Fluoreszenzmikroskopische Analysen zeigten, dass die Verteilung von ComEA und ComP in der Zellmembran von A. baylyi abhängig ist von der Wachstumsphase und der Kompetenz: Während die Kompetenzproteine in der lag-Phase (zum Zeitpunkt maximaler Kompetenzinduktion) gleichmäßig über die gesamte Membran verteilt sind, finden sie sich im Laufe der exponentiellen Phase (mit abnehmender Kompetenz) in einer abnehmenden Zahl von separaten Foci, bis sie schließlich in der späten stationären Phase (zum Zeitpunkt minimaler Kompetenz) nur noch in 1 - 2 distinkten Foci lokalisiert sind. II. DNA-Transfer in marinen Bakterien 1. Vor der Auswahl geeigneter Selektionsmarker für DNA-Transferstudien in marinen Bakterien wurde eine Analyse der spontanen Resistenzen mariner Bakterien durchgeführt. Diese Analysen ergaben, dass 72 % von 116 marinen Isolaten sensitiv gegenüber einer Kombination von je 100 μg Kanamycin und 100 μg Streptomycin pro ml Medium sind. 2. Es wurde ein Transformationsprotokoll für das Screening mariner Bakterien auf die Fähigkeit zur DNA-Aufnahme durch natürliche Transformation etabliert. Es wurden drei Vektoren pM1, pM2 und pM3 konstruiert, die eine Übertragung und stabile Insertion von Antibiotikaresistenz-Markergenen und dem zur Detektion eingesetzten gfp-Gen durch homologe Rekombination flankierender rDNA-Bereiche mit dem rDNA-Operon des Rezipienten ermöglichten. 3. Unter Einsatz dieser Vektoren wurde die Transformierbarkeit von 83 marinen Isolaten überprüft. Diese Analysen führten zur Identifizierung von vier transformierbaren Isolaten. Bei diesen Isolaten handelt es sich um Marinobacter sp., K. rosea, P. phosphoreum und P. marincola Stämme.
In der vorgelegten Arbeit wurden 50 Mutationen von Aminosäuren im Bereich der Chinoloxidationsbindungsstelle (Qo-Site) des bc1-Komplexes aus Paracoccus denitrificans untersucht. Hierzu wurden die Mutanten erstellt, Kinetiken der Substratbindung bestimmt und EPR Spektren aufgenommen. Mit den gleichen Methoden wurden auch verschiedene Klasse I und Klasse II Inhibitoren der Qo-Site untersucht. Wenngleich der Reaktionsmechanismus auch mit Hilfe dieser Mutationen nicht vollständig aufgeklärt werden konnte, so konnten doch neue Einsichten in die Funktionsweise des bc1-Komplexes gewonnen werden. Verschiedene Modelle wurden vorgeschlagen, um die energetisch günstige aber thermodynamisch unwahrscheinliche Verzweigung der beiden Elektronen des Ubichinols auf die beiden Redoxketten des bc1-Komplexes der Atmungskette zu beschreiben. Da die Redoxpotentiale der beiden primären Elektronenakzeptoren extrem unterschiedlich sind, scheint es zwingend zu sein, dass beide Elektronen den Hochpotentialzweig (Rieske, Cytochrom c1, Cytochrom c) durchlaufen. Energetisch bietet jedoch die Wiederverwendung eines der beiden Elektronen den immensen Vorteil der realen Verdopplung der Protonenpumpleistung. Die wichtigsten Mutationen der vorliegenden Arbeit betreffen die vermuteten direkten Bindungspartner des Ubichinols, bE295 und fH155. Das Histidin ist Teil der beweglichen Rieske Untereinheit des bc1-Komplexes, das Glutamat ist Teil eines hoch konservierten Abschnitts des Cytochrom b. Aufgrund der gemessenen Wirkungen der untersuchten Mutationen auf die kinetischen Kennzahlen und EPR Parameter der eingesetzten Substrate und Inhibitoren lassen sich folgende Schlüsse ziehen. Die Bindung des Chinol-Substrats in der Qo-Site benötigt die korrekte Ausrichtung und den unveränderten Bindungspartner fH155 der Rieske [2Fe-2S]-Gruppe. Das Fehlen des zweiten vermuteten Bindungspartners bE295, der ein Teil des hochkonservierten PEWY-Loops ist, wird hingegen toleriert. Die Aktivitäten bei Mutationen dieser Aminosäure liegen mit bis zu 56% im Vergleich zum Wildtyp (bE295A) relativ hoch. Auch unter Berücksichtigung von möglichen bypass Reaktionen ist es fraglich, ob das Glutamat des PEWY-Loops ein direkter Bindungspartner des Substrats ist. Der Inhibitor Stigmatellin bindet im bc1-Komplex von Paracoccus denitrificans irreversibel in der Qo-Site, auch wenn einer der beiden vermuteten Bindungspartner (bE295 bzw. fH155) nicht verfügbar oder verändert ist. Daraus kann man schließen, dass die Bindung des Stigmatellins im Wesentlichen von seiner Seitenkette im Bereich des Chinol-Eintrittskanals des bc1-Komplexes stabilisiert wird. Wechselwirkungen der bizyklischen Kopfgruppe mit Aminosäuren der Chinoloxidationsbindungstasche sind hierfür nicht zwingend notwendig. Weitere durchgeführte Mutationen lassen folgende weitere Rückschlüsse zu: Der korrekte Bindungsraum der Qo-Site ist für eine maximale Umsatzgeschwindigkeit des bc1-Komplexes erforderlich. Dies zeigen Mutationen von bG158 und bV161. Die Struktur des hochkonservierten PEWY-Loops ist mitentscheidend für die Aktivität des bc1-Komplexes. Störungen der Konfiguration in diesem Bereich führen zu einer deutlichen Abnahme der Aktivität. Dies lassen Mutationen von bY297, bP294 und bW296 erkennen. Der ef-Loop hat einen Einfluss auf die Bewegungsvorgänge der Rieske-Kopfgruppe. Er ist jedoch nicht sehr flexibel (bL286H). Veränderungen im Wasserstoffbrückennetzwerk der Rieske-Kopfgruppe führen zu einer deutlichen Verminderung der Elektronentransferraten (bY159F, bS157A und bF151H). Die Bindungsregionen von Klasse I Inhibitoren in der Qo-Site überlappen mit denen des natürlichen Substrats. Sie sind jedoch nicht identisch, was sich im unterschiedlichen Verhalten einiger Mutationen auf die Aktivität von Substrat und die Inhibitionswirkung von Klasse I Hemmstoffen ausdrückt. Die Untersuchungen der Auswirkungen von Mutationen auf einen vermuteten Wasserkanal im Bereich des Häm bL und auf eine angenommene Zinkbindungsstelle im gleichen Bereich zeigen keine eindeutig interpretierbaren Ergebnisse. Die Mutationsstudien im Bereich des Cytochrom c1 wurden begonnen. Zusätzliche Mutanten in diesem Bereich könnten weiterführende Aufschlüsse über die Wechselwirkung der Rieske-Kopfgruppe mit Cytochrom c1 bringen. Die vorgelegte Studie lässt erkennen, dass die Vorgänge in der Qo-Site des bc1-Komplexes aus Paracoccus denitrificans höchst komplex sind. Zusätzliche Untersuchungen der erzeugten Mutanten mit Hilfe weiterer Detektionsmethoden, insbesondere CD- und FTIR-Messungen, könnten in Zukunft eine noch bessere Einsicht in die Vorgänge dieses wichtigen Komplexes der Atmungskette geben.
Molekulare Regulation der UDP-Zucker-Biosynthese Untersuchungen anhand der myo-Inositoxygenase
(2006)
Der Nukleotidzucker UDP-Glucuronsäure ist die prinzipielle Zuckervorstufe für UDP-Galacturonsäure, -Xylose, -Arabinose und –Apiose, welche alle in die Zellwandpolymere der pflanzlichen Zellwand einfließen. UDP-Glucuronsäure kann in Arabidopsis über zwei alternative, funktionelle Synthesewege gebildet werden, wobei entweder die UDP-Glucose-Dehydrogenase oder die myo-Inositoxygenase als Schlüsselenzym, welche den Kohlehydratfluss in Richtung Zellwandbiosynthese katalysiert, involviert ist. In dieser Arbeit wurden die Gene für die Enzymisoformen der Inositoxygenase (MIOX) aus Arabidopsis thaliana analysiert. Sie repräsentieren eine kleine Genfamilie bestehend aus vier Isoformen. Studien mittels Promotor::GUS-Konstrukten und RT-PCR zeigten, dass die Transkription der MIOX-Gene eine sehr transiente und organspezifische Genexpression ist. Die Isoformen MIOX1 und MIOX2 ließen sich in nahezu allen Geweben nachweisen wogegen die Isoformen MIOX4/5 nur in den generativen Geweben aufzufinden waren. Es konnte eine deutliche Präsenz aller vier MIOX-Isoformen in den generativen Geweben nachgewiesen werden und die Nukleotidzucker, die während der Samenentwicklung benötigt werden, scheinen überwiegend über die MIOX zur Verfügung gestellt zu werden. So zeigen T-DNA-Insertionslinien von ΔMIOX1 & 2 eine reduzierte Schleimhülle um die Samen und eine erhöhte Ausfallrate bei der Samenentwicklung auf. Ansonsten zeigen die untersuchten T-DNA-Insertionslinien einen ähnlichen Wuchs wie der Wildtyp auf. Auch konnten keine Unterschiede über die durchgeführten Zellwandanalysen, mittels GC-MS, MALDI und Dionex-HPLC verifiziert werden, was durch die Redundanz der MIOX- und UGD-Isoformen erklärt werden könnte. Nichtsdestotrotz konnte bei den Isoformen ΔMIOX1 & 2 eine dramatische Reduktion beim Einbau von 3H-Inosit in Zellwandpolymere von Keimlingen verzeichnet werden, was einen klaren Beweis für eine funktionelle MIOX liefert, da in diesem Gewebe diese beiden Isoformen die einzig aktiven sind. Außerdem konnten über Promotor-Deletions-Analysen potentielle cis-Elemente für die Promotoren von MIOX2 und MIOX4 aufgedeckt werden.
NADPH-Oxidasen der Nox-Familie sind eine wichtige Quelle für reaktive Sauerstoffspezies (ROS, reactive oxygen species) in verschiedenen Geweben und Zellen. Die Isoformen der NADPH-Oxidase unterscheiden sich dabei in ihrer physiologischen Funktion: Während Nox1 und Nox2 eher akute, Agonisten-induzierte ROS-Signaltransduktion vermitteln, sind Nox4-abhängig produzierte ROS an chronischen Prozessen wie Differenzierung beteiligt. Die Isoformen der NADPH-Oxidase unterscheiden sich darüber hinaus in ihrer intrazellulären Lokalisation, der Art der Aktivierung und der Spezies der abgegebenen ROS. Nox1 muss durch die Interaktion mit zytosolischen Untereinheiten (NoxA1 und NoxO1) aktiviert werden und produziert dann hauptsächlich Superoxidanionradikale (O2-). Nox4 dagegen ist unabhängig von zytosolischen Untereinheiten und somit konstitutiv aktiv und setzt eher Wasserstoffperoxid (H2O2) in den Extrazellulärraum frei. Zwischen diesen Unterschieden, deren strukturelle Ursachen weitgehend unbekannt sind, und den unterschiedlichen Funktionen von Nox1 und Nox4 besteht wahrscheinlich ein Zusammenhang. In transfizierten HEK293-Zellen konnte zunächst durch Immunofluoreszenz-Mikroskopie und subzelluläre Fraktionierung gezeigt werden, dass Nox1 in der Plasmamembran lokalisiert ist und Nox4 in der Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER) verbleibt. Um die strukturellen Unterschiede zwischen Nox1 und Nox4, die eine Rolle bei der intrazellulären Lokalisation, den Aktivierungsmechanismen und der Art der abgegebenen ROS spielen könnten, zu identifizieren, wurden chimäre Proteine aus Nox1 und Nox4 konstruiert und analysiert. Zunächst konnte gezeigt werden, dass die konstitutive Aktivität von Nox4 durch den zytosolischen Bereich vermittelt wird. Dafür ist allerdings der komplette zytosolische Bereich ab der 6. Transmembrandomäne nötig, chimäre Konstrukte mit einem kürzeren Anteil des zytosolischen Bereichs von Nox4 waren nicht aktiv. Für die Aktivierung von Nox1 dagegen ist der zytosolische Bereich nicht ausreichend, vermutlich spielen weitere Interaktionen mit Bereichen im transmembranen Teil des Proteins ebenfalls eine Rolle. Für die korrekte intrazelluläre Lokalisation benötigen Membranproteine ein N-terminales Signalpeptid. Wenn das vorhergesagte Signalpeptid von Nox1 durch das von Nox4 ausgetauscht wurde, zeigte dieses chimäre Protein keine Plasmamembran-Lokalisation mehr, es war stattdessen in vesikelähnlichen Strukturen unterhalb der Plasmamembran lokalisiert. Das Signalpeptid von Nox1 war nicht dazu in der Lage, Nox4 zur Plasmamembran zu transportieren, das Protein war weiterhin im ER lokalisiert, was darauf hindeutet, dass Nox4 noch weitere Mechanismen besitzt, die seine ER-Lokalisation bedingen. Der Austausch des Signalpeptids von Nox4 gegen das von Nox1 führte dazu, dass das chimäre Protein statt H2O2 O2- produzierte. Dieses Ergebnis spricht dafür, dass der N-Terminus von Nox4 bei der H2O2-Produktion eine Rolle spielt. Experimente mit Nox1 und Nox4 mit N-terminalem Myc-Tag deuteten darauf hin, dass nur der N-Terminus von Nox1 prozessiert wird, also dass das Signalpeptid während der co-translationalen Translokation abgespalten wird. Ohne Signalpeptid waren sowohl Nox1 als auch Nox4 inaktiv. Die dritte extrazytoplasmatische Schleife von Nox4 enthält 28 zusätzliche Aminosäuren verglichen mit Nox1, die sich auf zwei Bereiche aufteilen. Eine Deletion der Aminosäuren, die nur in Nox4 vorhanden sind, führte dazu, dass das Protein O2- anstelle von H2O2 produzierte, ohne dass die intrazelluläre Lokalisation verändert wurde. Zwei konservierte Cysteine innerhalb der deletierten Bereiche scheinen bei diesem Prozess eine Rolle zu spielen, vermitteln den Effekt aber nicht alleine, da nach Mutation dieser Cysteine die Umkehr der ROS-Produktion nicht ganz so stark war wie bei der Deletion der kompletten Bereiche. In Nox1 sind die Cysteine wahrscheinlich in die Aktivierung des Proteins involviert, da deren Mutation die Aktivität von Nox1 reduzierte. Der N-Terminus und die dritte extrazytoplasmatische Schleife von Nox4 sind somit an einem Prozess beteiligt, der die H2O2-Produktion von Nox4 vermittelt. Die entsprechenden Abschnitte in Nox1 scheinen andere Funktionen zu erfüllen. Das Signalpeptid von Nox1 ist für die korrekte intrazelluläre Lokalisation in der Plasmamembran verantwortlich; die dritte extrazytoplasmatische Schleife ist wahrscheinlich an der Aktivierung des Proteins beteiligt. In dieser Arbeit konnten also strukturelle Unterschiede zwischen Nox1 und Nox4 in verschiedenen Bereichen der Proteine identifiziert werden, die für die unterschiedliche intrazelluläre Lokalisation und die Art der produzierten ROS verantwortlich sind.
Das Genom des anaeroben ε-Proteobakteriums Wolinella succinogenes codiert überraschenderweise für Enzymkomplexe, die typisch für die aerobe Atmung sind. Die entsprechenden Gene werd en unter bekannten Wachstumsbedingungen nicht
exprimiert. Darunter findet sich ein Operon ( sdhABE) für eine putative „Succinat-Dehydrogenase“, die hohe Sequenzhomol ogien zu sog. „nicht-klassischen“ archaealen Succinat-Dehydrogenasen zeigt. In der vorliegenden Arbeit sollte die „Succinat-Dehydro genase“ mit Hilfe des etablierten genetischen Systems zur Modifikation und Produktion der Chinol:Fumarat-Reduktase(QFR) homolog in W. succinogenes produziert und charakterisiert werden. Das genetische System besteht aus der QFR- Deletions-mutante ΔfrdCAB und dem Vektor pFrdcat2, der aufgrund seiner zentralen Bedeutung im Rahmen dieser Arbeit sequenziert wurde.
Die akute lymphatische Leukämie (ALL) ist eine aggressive Krankheit des hämatopoetischen Systems. Die Gegenwart des Philadelphia - Chromosoms (Ph), das die Translokation t(9;22) kodiert, oder die t(4,11) definieren Hochrisiko - ALL - Patienten mit einer besonders schlechten Prognose (Hoelzer and Gokbuget 2000; Hoelzer et al. 2002; Hoelzer et al. 2002)]. Das Ph Chromosom führt je nach Bruchpunkt der Translokation zur Expression von p185(BCR-ABL) oder p210(BCR-ABL). Die Fusion der Abl-Tyrosin Kinase an Bcr führt zur konstitutiven Aktivierung der Abl-Kinase, die hauptsächlich für die Transformation der Zellen verantwortlich ist. Die Überlebensrate durch aktuelle zytostatische Therapien der Ph+ ALL liegt bei 0-10%, trotz initialer Komplettremission (CR) von 80%, die ähnlich hoch wie die von Ph– Patienten ist. Imatinib (GleevecTM, GlivecTM, früher STI571) ist ein spezifischer Inhibitor der Abl – Kinase mit hoher Effizienz für die Behandlung der Ph+ ALL. Trotz der effektiven Hemmung von BCR-ABL durch Imatinib kommt es beinahe immer zum Rezidiv. Dies verschlechtert weiter die Prognose (Donato et al. 2004). Die Entstehung von Mutationen ist die häufigste Ursache für Resistenz gegen Imatinib, Nilotinib und/oder Dasatinib - Therapie. In dieser Arbeit wurden alternative Therapiestrategien für die Behandlung der ALL untersucht. Dazu wurden zwei Ansätze gewählt, wobei 1.) Gene identifiziert wurden, die zur Imatinib – Resistenz führen, um der Resistenzentwicklung vorzubeugen oder die Resistenz zu überwinden. Weiterhin wurde 2.) versucht die aberrante Transkription leukämischer Zellen zu verhindern. Dazu wurde die Inhibition der Histon – Deazetylierung, die für die aberrante Remodellierung des Chromatins verantwortlich ist, untersucht. ...
Mitochondria are dynamic organelles indispensible for viability of eukaryotic cells. Diffusion of proteins in mitochondrial membranes is a prerequisite for the correct functionality of the organelles. However, its study is made complicated due to the nontrivial geometry, small size and positional instability of the organelle, restricting the usability of regular experimental methods and theoretical understanding of acquired data. Therefore, here the molecular transport along the main mitochondrial axis was investigated using highly accurate computational methods combining them with traditional experimental approaches. Using recently reported electron microscopic tomography data concerning the constitution of mitochondria [Fre02], a lattice model of the inner mitochondrial membrane (IM) reproducing its structure in great details was built up. With Monte Carlo (MC) simulations of particle dynamics on this model, it was found that the membrane geometry induces nonlinear effects in the motion of molecules along the mitochondrial axis, which in turn lead to a transient violation of the 2nd Fick?s equation. We show that mere curvature of the IM resulting from the presence of cristae is sufficient for the emergence of transient anomalous diffusion (TAD) in the membrane. The MC calculations have enabled an accurate estimation of regularities in the extent of deviations from the normal regime, therefore allowing us to propose non-homogenous power law as a suitable generalization of the current approach to the analysis of experimental data for the transient dynamics. The general cause of TAD resulting from the membrane curvature alone, without any involvement of specific inter-particle interactions prompted us to predict the similar dynamical effect also for other curved cellular membranes, be it diffusion in endoplasmic reticulum or in plasma membrane of cells possessing dense microvilli. The data indicate that the geometry-induced anomalous diffusion should be easily detectable with current experimental methods, but only in the restricted range of time scales corresponding to high temporal resolution. Until now, experimental measurements of molecular diffusion in biological membranes indiscriminately assumed either pure normal or pure anomalous diffusion schemes for the analysis of data acquired in very wide range of temporal resolutions, which often lead to ambiguities in the interpretation of diffusion parameters. The MC calculations have clearly illustrated the necessity for a more subtle treatment of experimental conditions: the assumption of pure Gaussian diffusion model is justified only if the applied temporal resolution is sufficiently low (as is often the case when using scanning techniques exemplified further); otherwise, the transient regime should be tested for by means of the non-homogenous power function. In the second part of the study the Fluorescence Recovery after Photobleaching (FRAP) with the laser scanning microscope is introduced as a method of choice for studying protein mobility within mitochondrial membranes. The conventional FRAP methodology [Axe76] was extended to enable its application for the determination of confined diffusion with conventional laser scanning microscopes which allowed us to communicate for the first time the direct measurement of protein diffusion in mitochondrial membranes of living cells. This is achieved through adaptation of FRAP data analysis to account for the spatial dimensions of the organelle and the spatiotemporal pattern of light pulses induced by the microscope. The experimental circumstances existing during the particular measurement session are computationally recreated and this way the best suited values of diffusion parameters are found. The method is validated experimentally for four FP-tagged mitochondrial membrane proteins: the IM OxPhos complexes F1F0 ATPase and cytochrome c oxidase and for Tom7 and hFis1 - components of the mitochondrial protein import and fission machineries respectively localized in the outer membrane. We find that for all proteins simple normal diffusion is not a sufficient description. In the inner membrane, diffusion coefficient of F1F0 ATPase expressed in HeLa cell line is found to be 0.2 ?m2/s, with more than 1/3 of the protein molecules being immobilized, while cytochrome c oxidase (in CEF primary cells) demonstrated a similar diffusivity pattern (0.4 ?m2/s, 30% immobile). In the outer membrane, the D (0.7 ?m2/s) and immobile fraction (7-8%) of GFP-Tom7 and GFP-hFis1 (both in HeLa cells) are identical, which designates a substantial difference in comparison to the IM protein mobility. Diffusion coefficients of mitochondrial membrane proteins studied here lay in the intermediate region between those measured in artificial bilayers and in plasma membranes. Protein crowding and intermolecular interactions will be among the major causes responsible for the detected slowdown of diffusion.
Die Verarbeitung von Informationen im zentralen Nervensystem beruht auf dem Zusammenspiel von erregender und hemmender Neurotransmission. Die Übertragung von Signalen zwischen Neuronen erfolgt chemisch über die Ausschüttung von Neurotransmittern an spezialisierten Kontaktstellen, den Synapsen. Glyzin und gamma-Aminobuttersäure (GABA) sind die bedeutendsten inhibitorischen Neurotransmitter im zentralen Nervensystem von Säugern, welche Rezeptoren vom Glyzin- (GlyR) und GABAA-Typ (GABAAR) aktivieren. Diese ligandengesteuerten Ionenkanäle sind in postsynaptischen Membranen angereichert und mit intrazellulären Proteinen assoziiert. Die Rekrutierung der Rezeptoren in postsynaptischen Domänen ist ein an das zytoplasmatisch lokalisierte Protein Gephyrin gekoppelter Prozess. So bindet Gephyrin spezifisch an die intrazelluläre Domäne der beta-Untereinheit des GlyR (GlyR beta) und bildet für die Verankerung des Rezeptors ein gerüstartiges Netzwerk unterhalb der synaptischen Membran. Die gezielte Inaktivierung des Gephyrin-Gens führt in Mäusen zu einem postnatal letalen Phänotyp und zu dem Verlust der synaptischen Anreicherung des GlyR und bestimmter GABAA-Rezeptoren auf zellulärer Ebene. Gephyrin ist ein 93 kDa großes Protein, das nicht nur im zentralen Nervensystem (ZNS), sondern auch in anderen Organen wie Leber und Niere exprimiert wird, in denen es an der Synthese des Molybdän-Kofaktors von Oxido-Reduktasen beteiligt ist. Das Gephyrin-Protein wird durch 30 Exons codiert, von denen zehn als sogenannte Kassetten alternativ gespleißt werden können. Die bestuntersuchte Spleißvariante besitzt 736 Aminosäuren und ist in eine N- und eine C-terminale Domäne (Aminosäuren 1-181 bzw. 318-736) sowie eine zentrale Linker-Domäne unterteilt. Die N- und die C-terminalen Bereiche von Gephyrin sind den Proteinen MogA und MoeA aus E. coli homolog und werden daher auch als G-Domäne (N-terminal) bzw. E-Domäne (C-terminal) bezeichnet. In kristallographischen Untersuchungen wurde gezeigt, dass die G- und E-Domänen zur Tri- bzw. Dimerisierung befähigt sind. Diese speziellen Oligomerisierungseigenschaften der beiden Gephyrindomänen bilden wahrscheinlich die Grundlage für die Entstehung von Gephyrin-Clustern sowie eines hexagonalen Gephyrin-Gerüstes. Dieses Gerüst stellt den Verknüpfungspunkt zwischen Rezeptoren und dem Zytoskelett dar und ermöglicht somit die effiziente Clusterbildung und die zielgerichtete Anordnung einer großen Anzahl inhibitorischer Rezeptoren. In der vorliegenden Arbeit sollten die Rolle dieser beiden Domänen bei der Bildung membranassoziierter Gephyrinaggregate und die molekularen Mechanismen der Clusterbildung des Gephyrinmoleküls untersucht werden. Zu diesem Zweck wurden durch zielgerichtete Mutagenese unterschiedliche Gephyrin-Mutanten hergestellt, um die Fähigkeit der Oligomerisierung der G- und E-Domäne gezielt zu modifizieren. Dadurch sollte die Bedeutung der Oligomerisierung hinsichtlich der Aggregat- bzw. Clusterbildung untersucht werden. Außerdem sollten die Wechselwirkungen zwischen Gephyrin und anderen Proteinen und deren Einfluss auf die synaptische Lokalisation analysiert werden. Für diese Untersuchungen wurden auf der Basis von Röntgenstruktur-Daten spezifische Aminosäurereste an den bei der Oligomerisierung beteiligten Kontaktstellen ausgetauscht. In der G-Domäne wurden zu diesem Zweck vier separate Aminosäuren des Trimer-Interface durch Arginin ersetzt (GephRRRR). Analog hierzu wurden in der EDomäne einzelne Aminosäuren durch Arginin bzw. Glutamat substituiert (GephRER), um dadurch eine Dimersierung zu verhindern. Für die Kassette C5’ wird angenommen, dass deren Vorhandensein die Interaktion zwischen Gephyrin und GlyR beeinträchtigt, wodurch GlyR aus GABAergenen Synapsen ausgeschlossen wird. Daher wurde der Einfluss dieser Gephyrin-Spleißvariante (GephC5’), die zu einer Peptidinsertion innerhalb der G-Domäne führt, und einer Gephyrin-Mutante (Gephmut), die den Verlust der Wechselwirkung mit dem GlyR bedingt, auf die Aggregatbildung von Gephyrinoligomeren untersucht. Bei dem Konstrukt Gephmut wurden, basierend auf Daten von Röntgenstrukturuntersuchungen, neun Aminosäuren (713-721) am Cterminalen Ende der E-Domäne durch den homologen Bereich des bakteriellen MoeA Proteins aus E. coli ersetzt. Zunächst wurden die einzelnen isolierten Domänen mittels Gelfiltration hinsichtlich ihres Oligomerisierungsverhaltens untersucht. Die Mutationen wurden hierzu in verkürzte Proteine eingeführt, bei denen nur die G- bzw. die E-Domäne exprimiert wurden. Diese Konstrukte wurden daher als GRRRR, GC5’ bzw. ERER und Emut bezeichnet. Bei diesen zeigte sich, dass die G-Domäne des Gephyrin-Wildtyps zu trimeren Proteinkomplexen oligomerisiert. Im Gegensatz hierzu war die Mutante GRRRR nicht in der Lage, Trimere zu bilden. Das Einfügen der C5’-Kassette führte ebenfalls zu einer Störung der Trimerisierung. Gelfiltrationsexperimente mit der E-Domäne ergaben, dass die mutierte Domäne ERER, im Gegensatz zum Wildtyp-Konstrukt, keine Dimere ausbildet. Bisherige Studien haben jedoch gezeigt, dass das Emut Polypeptid zur Dimerisierung befähigt ist. Das Oligomerisierungsverhalten des kompletten Gephyrin-Proteins wurde mittels blauer nativer Gelelektrophorese (BN-PAGE) analysiert. Für die hier beschriebenen Untersuchungen mit BN-PAGE wurde rekombinantes Gephyrin in Xenopus laevis Oozyten heterolog exprimiert. Die Analyse ergab, dass Wildtyp Gephyrin nativ als Hexamer vorliegt, welches durch ansteigende Konzentrationen des Detergenzes Natriumdodecylsulfat (SDS) in Trimere, Dimere und Monomere zerfällt. Sowohl GephRRRR und GephC5’ liegen nativ fast ausschließlich als Dimere vor, während GephRER nur trimere Aggregate formt. Die entsprechende Doppelmutante mit Mutationen in Gund E-Domäne war wie erwartet nur noch als Monomer existent. Die als Kontrolle eingesetzte Glyzinrezeptor-Bindungsmutante Gephmut bildete, ebenso wie der Wildtyp, Hexamere aus. Daraus folgt, dass die Oligomere der G- bzw E-Domäne Zwischenprodukte der Hexamerbildung darstellen. Die Analyse der Oligomerisierungseigenschaften der Mutanten wurde nachfolgend in humanen embryonalen Nierenzellen (HEK 293T) untersucht. Nach heterologer Expression von Wildtyp Gephyrin in HEK 293T-Zellen formen sich große, charakteristische Gephyrinaggregate. Die Oligomerisierungs-Mutanten GephRRRR, GephRER und GephC5’ aggregierten jedoch nicht, sondern waren diffus im Zytoplasma verteilt. Die wiederum als Kontrolle eingesetzte Bindungsmutante Gephmut hingegen wies eine normale Aggregation auf. Diese Ergebnisse bestätigen die grundlegende Rolle der Oligomerisierung von G- und E- Domänen für die Aggregatbildung von Gephyrin. Mittels GST-Pulldown und Kolokalisationsanalysen in HEK Zellen wurde die Wechselwirkung der Gephyrinmutanten mit der GlyR beta, dem Motorkomplexprotein Dynein light chain-1 (Dlc-1) und dem Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor Collybistin (Cb) untersucht. Beide Ansätze weisen darauf hin, dass die Trimerisierung der G-Domäne an der Interaktion von Gephyrin mit Dlc-1 und die Dimerisierung der E-Domäne bei der Bindung an GlyR beta und Cb beteiligt ist. Die Mutante Gephmut zeigte in beiden Fällen einen totalen Verlust der Bindungsfähigkeit sowohl an das GlyR beta Bindungsmotiv als auch an Cb. Der Einbau der C5’ Kassette in Gephyrin scheint jedoch nicht dessen Bindung an den GlyR zu beeinflussen. Für die Analyse der Clusterbildung und des zielgerichteten Transports in Neuronen wurden Wildtyp und mutiertes Gephyrin in hippocampalen und spinalen Primärkulturen der Ratte exprimiert. Zur Überprüfung einer synaptischen Lokalisation wurde Gephyrin gemeinsam mit dem vesikulären inhibitorischen Aminosäure-Transporter (VIAAT), einem präsynaptischen Marker-Protein, detektiert. In beiden Kulturen wies Gephyrin eine punktartige Verteilung in den Neuriten auf und wurde gezielt an Synapsen angereichert. Im Kontrast dazu zeigten alle Oligomerisierungsmutanten, GephRRRR, GephC5’ und GephRER keine Ausbildung von Clustern sondern eine diffuse Verteilung im Zellkörper und in Dendriten. Das Konstrukt Gephmut wies jedoch Clusterbildung und eine punktförmige Verteilung auf. Diese Daten belegen, dass die Oligomerisierung der G- wie auch der E-Domänen für die Clusterbildung und synaptische Lokalisation von Gephyrin unerlässlich ist. Die Wechselwirkung mit dem GlyR und/oder Collybistin ist ebenfalls für die Anreicherung in der Synapse erforderlich, nicht jedoch für die Bildung der Gephyrin-Cluster. Die dargestellten Ergebnisse belegen die Rolle der spezifischen Oligomerisierungseigenschaften der G- und E-Domäne für die Ausbildung des hexagonalen Gephyringerüstes und dessen grundlegende Bedeutung für die spezifische Anreicherung von Gephyrin an inhibitorischen Synapsen in Neuronen.
Die Alzheimer-Demenz (AD) ist gekennzeichnet durch extrazelluläre Ablagerungen bestehend aus dem Amyloidbeta-Peptid (Aß), durch neurofibrilläre Bündel bestehend aus dem Tau-Protein, massiven Neuronenverlust und synaptische Dysfunktion. Weiterhin ist bekannt, dass mitochondriale Dysfunktion eine entscheidende Rolle bei der AD spielt. Mit Hilfe von dissoziierten Hirnzellen von NMRI, Thy1-APP-, P301L Tau- und JNK-Knockout-Mäusen wurden Veränderungen, verursacht durch genetisch, alters- und geschlechtsbedingten Risikofaktoren, auf die mitochondriale Funktion untersucht. Die Abeta-Belastung der untersuchten Thy1-APP Mäuse führte zu einer mitochondrialen Fehlfunktion durch intrazelluläres Abeta und damit zu einem Energiedefizit. Aß hemmte die Atmungskette, vor allem die COX-Aktivität, indem es an die COX-Untereinheit bindet und damit die Anlagerung von Cytochrom C verhindert. Eine zusätzliche Mutation wie PS1M146L verursacht eine größere und früher einsetzende Abeta-Akkumulation im Gehirn der Mäuse und führte zu größerer mitochondrialer Schädigung im Vergleich zu den APP transgenen Mäusen. Der Grad der Abeta-Schädigung ist auch von dem Aggregationszustand von Abeta abhängig. Eine Akkumulation von intra- und extrazellulären Oligomeren reicht aus, um das mitochondriale Membranpotential zu erniedrigen. Die Aß-Belastung nimmt im Alter zu und es bilden sich ab dem 6. Monat Amyloid-Plaques im Gehirn der Thy1-APP Mäuse aus, die zu einem veränderten Verhältnis von Bcl-xL und Bax in Richtung Bax führten. Bax und Bcl-2 sind an der Bildung der mitochondrialen Pore beteiligt. Durch die Öffnung der mitochondrialen Pore sinkt das mitochondriale Membranpotential und die ATP-Spiegel. Bax begünstigt zusätzlich die Freisetzung von Cytochrom C und Smac. Der Abfall des mitochondrialen Membranpotentials, die geringen ATP-Spiegel und die Cytochrom C Freisetzung werden mit der Apoptose in Verbindung gebracht und erklären die erhöhte Empfindlichkeit der Mäuse gegenüber oxidativem Stress. Desweiteren muss die JNK3 berücksichtigt werden. Sie ist der mitochondrialen Fehlfunktion vorgeschaltet und löst eine degenerative Apoptose aus. Abeta und Tau werden bei der Entstehung von AD miteinander in Verbindung gebracht. Dieser Synergismus führt zu einer mitochondrialen Fehlfunktion im Kortex der Mäuse. Aufgrund des unveränderten Transmembranpotentials der dissoziierten Hirnzellen im Gehirn der Thy1APP Mäuse ab dem 6. Monat scheinen nur die aggregierten Polypeptide für die Neurotoxizität bei der AD eine Rolle zu spielen. Die COX-Aktivität wurde im Alter ebenfalls wieder verbessert und stabilisierte dadurch die ATPSpiegel. Die P301L-Taumäuse entwickeln ebenfalls erst im Alter neurofibrilläre Bündel (NFT) durch die Akkumulation von hyperphosphorylierten Tau. Ab dem 2. Lebensjahr der Mäuse wurde ein starker signifikanter Abfall des mitochondrialen Membranpotentials und der ATPSpiegel beobachtet. Der Anstieg der ROS-Spiegel der zwei Jahre alten Mäuse führte direkt zu einer Reduzierung der Komplex-I-Aktivität. Für diese Neurotoxizität scheint die Bildung der NFT verantwortlich zu sein. Die Wirkung von Ginkgo-biloba-Extrakt (EGb 761) und Piracetam auf die mitochondriale Fehlfunktion in jungen und alten NMRI-Mäusen untersucht. Eine Stabilisierung des mitochondrialen Membranpotentials und die Normalisierung der ATP-Spiegel konnte mit Hilfe von EGb 761 und Piracetam festgestellt werden. Besonders bei alten Mäusen konnte die schon angefangene mitochondriale Fehlfunktion fast komplett kompensiert werden. EGb 761 und Piracetam waren in der Lage nach zweiwöchiger Behandlung der APP transgenen Mäusen die löslichen Abeta-Spiegel im Gehirn signifikant zu senken. Durch diese Entlastung wurde die durch Abeta-verursachte Destabilisierung der mitochondrialen Membranen aufgehoben und die Mitochondrien vor oxidativen Schädigungen geschützt. Drei wichtige Angriffspunkte werden aufgrund der Daten für Piracetam vorgeschlagen: 1. die Senkung der Abeta-Spiegel im Gehirn, 2. die Stabilisierung der mitochondrialen Membranen und eine dadurch verbesserte Membranfluidität und 3. die Verbesserung der mitochondrialen Funktion vor altersbedingten Schädigungen. Die drei Punkte sind miteinander verknüpft, aufgrunddessen, dass Abeta die mitochondriale Membranen destabilisiert und dies zu einer mitochondrialen Fehlfunktion führen kann. Die neuroprotektiven Effekte von EGb 761 wurden durch 1. Senkung der Aß-Spiegel, 2. Mitochondrienmembranstabilisierende Wirkungen, 3. antioxidative Effekte, und 4. durch Modulation von Chloridkanälen hervorgerufen. In APP transgenen Mäusen wird trotz gleicher APP Expression in weiblichen Mäuse eine erhöhte Beta-Sekretasespaltung von APP mit verstärkter Bildung von C99 und Abeta (unlösliches und lösliches) im Vergleich zu den männlichen Tieren gebildet. Die in dieser Arbeit vorgestellten Daten zeigen, dass die erhöhten Abeta-Spiegel und der damit verbundene oxidative Stress in transgenen Mäusen zusätzlich die Mitochondrien der weiblichen Tiere besonders schädigen und die Atmungskette beeinträchtigen. Damit bestätigt sich, dass das Geschlecht ein weiterer Risikofaktor der AD ist. Daher unterstützen die im Rahmen dieser Doktorarbeit erhobenen Befunde grundsätzlich die weitere Erforschung pharmakologischer Ansätze besonders von Ginkgo-biloba-Extrakt und Piracetam zur Verbesserung kognitiver Störungen als Therapie oder auch zur Prophylaxe der Alzheimer Krankheit. Der Schutz von EGb 761 und Piracetam auf die Mitochondrien vor oxidativem Stress kann daher zur Vorbeugung vor allgemeinen Alterungsprozessen dienen. Abeta und Tau spielen zusammen beim Untergang der Neurone eine große Rolle. Therapien, welche die Ablagerungen von Abeta im Gehirn verringern, sollten in einem frühen Stadium der Krankheit besonders wirksam sein. In einem späteren Stadium wären hingegen zusätzlich Medikamente nötig, die gegen die neurofibrilläre Bündel gerichtet sind. Damit ließe sich theoretisch der fortschreitende Zelluntergang bei Alzheimerpatienten zu mindestens verlangsamen.
Meliolaceae aus Panama
(2006)
Die Meliolaceae (Meliolales, Ascomycota), die auch „Schwarze Mehltaupilze“ (dark oder black mildews) genannt werden, umfassen weltweit ca. 1583 bekannte Arten in 20 Gattungen. Meliolaceae-Arten kommen hauptsächlich in den Tropen vor. Es handelt sich um obligate Parasiten auf Pflanzen, die über 330 verschiedenen Pflanzenfamilien angehören. Von August 2002 bis September 2005 wurden Meliolaceae-Arten mit ihren Wirtspflanzen in Panama hauptsächlich im Westen des Landes gesammelt. Die Wirtspflanzen wurden bestimmt. In Rahmen dieser Arbeit wurden 90 Belege von schwarzen Pilzen auf Blättern lichtmikroskopisch untersucht. Von diesen stellten sich 69 Belege als mit Meliolaceae-Arten parasitierte Blätter heraus. 55 der Belege mit Meliolaceae-Arten wurden bis zur Art bestimmt. Die restlichen 14 Belege waren problematisch zu bestimmen, weil die Meliolaceae von Hyperparasiten befallen waren. Die 55 Belege repräsentieren 42 verschiedene Meliolaceae-Arten, nämlich vier Appendiculella-Arten, sechs Asteridiella-Arten, fünf Irenopsis-Arten und 27 Meliola-Arten. Fünf neue Meliolaceae-Arten wurden im Rahmen dieser Arbeit entdeckt, drei Appendiculella-Arten, eine auf Lozanella enantiophylla (Ulmaceae/Cannabaceae), eine auf Cupania guatemalensis (Sapindaceae) bzw. eine auf Monstera deliciosa (Araceae), eine Asteridiella Art auf Buddleja nitida (Buddlejaceae), eine Irenopsis-Art auf Chrysophyllum sp. (Sapotaceae). Außerdem werden 21 Meliolaceae-Arten zum ersten Mal für Panama nachgewiesen: Appendiculella calostroma, Asteridiella formosensis, A. hymenaeicola, A. solanacearum, A. vegabajensis, Irenopsis miconiicola, Meliola anacardii, M. byrsonimicola, M. cf. cucurbitacearum, M. crescentiae, M. dissotidis, M. gesneriae, M. indica, M. lanosa, M. lundiae, M. mammeae, M. nigra, M. ocoteicola, M. cf. orchidacearum, M. pisoniae und M. ripogoni. Nur 16 der 42 gesammelten Meliolaceae-Arten sind schon für Panama bekannt. Die vorherige Anzahl der bekannten Meliolaceae-Arten für Panama lag bei 105 Arten. Nach dieser Untersuchung liegt diese Anzahl bei 131 Arten. Für das Nachbarland Costa Rica liegt diese Anzahl bei 84 Arten, und beide Ländern teilen nur 25 bekannte Meliolaceae-Arten. Die untersuchten Meliolaceae-Arten parasitieren Arten aus 36 verschiedenen Gattungen der Pflanzen, die zu 30 verschiedenen Pflanzenfamilien gehören. Für bekannte Meliolaceae-Arten werden 31 Wirtspflanzen-Arten zum ersten Mal für Panama nachgewiesen. Von diesen gehören vier zu Gattungen, von denen bisher keine Wirtsarten für Meliolaceae bekannt waren, nämlich Attalea (Arecaceae) für Meliola melanococcae, Crucea (Rubiaceae) für Asteridiella vegabajensis, Phinaea (Gesneriaceae) für M. gesneriae und Rytidostylis (Cucurbitaceae) für M. cf. cucurbitacearum. Im Vergleich zu Indien mit der größten Anzahl bekannter Meliolaceae-Arten (461) gibt es andere tropische Länder, in denen die Anzahl der bekannten Meliolaceae bisher null ist, weil diese Gruppe dort noch nicht erforscht worden ist. Durch die vorliegende Arbeit wird deutlich, dass die Meliolaceae in den Tropen höchst divers und bisher nur ansatzweise erforscht worden sind.
Ziel dieser Arbeit war es, zentrale Wirkungen von Statinen näher zu untersuchen. Hierbei sollten zum einen die Statin-Effekte auf die zerebrale und membranäre Cholesterinhomöostase näher untersucht werden, zum anderen sollten Effekte von Statinen auf die APP-Prozessierung sowie auf apoptotische Regulatoren im Gehirn in vivo analysiert werden. Einfluss unterschiedlicher Applikationsformen auf zentrale Statin-Effekte Bislang ist noch nicht vollständig aufgeklärt, ob und inwieweit Statine die zerebrale Cholesterin- oder Isoprenoidsynthese beeinflussen. Statine werden in tierexperimentellen in vivo-Studien bei oraler Wirkstoffapplikation über unterschiedliche Applikationsformen verabreicht wie Schlundsondierung, über das Trinkwasser oder das Futter – der Einfluss der unterschiedlichen Applikationsformen auf die zentralen Statineffekte ist allerdings nicht bekannt. Die zerebralen Statinkonzentrationen wurden bislang nur nach Applikation per Schlundsonde im Tiermodell bestimmt. Für alle anderen oralen Applikationsformen liegen keine Konzentrations-Zeit-Profile der zerebralen Statinspiegel vor. Die in dieser Arbeit vorgestellten Daten über einen direkten Vergleich der Applikation von Lovastatin und Pravastatin über das Futter und per Schlundsonde zeigen, dass zentrale Statin-Effekte insbesondere auf membranärer Ebene entscheidend durch die Wahl der Applikationsform beeinflusst werden. Effekte von Simvastatin auf die zerebrale Cholesterinhomöostase – Vergleich Maus – Meerschweinchen In der vorliegenden Arbeit wurden die Effekte von Simvastatin auf die zentrale und periphere Cholesterinhomöostase in zwei verschiedenen in vivo-Modellen, Mäusen und Meerschweinchen, untersucht. Sowohl Mäuse wie auch Meerschweinchen stellen etablierte Tiermodelle für Untersuchungen des Cholesterin- und Lipoprotein-Metabolismus dar. Allerdings weisen Meerschweinchen eine grössere Ähnlichkeit zum Menschen im Bezug auf den Lipidstoffwechsel auf als die Maus. Die auffälligste Übereinstimmung zwischen Mensch und Meerschweinchen ist, dass auch bei Meerschweinchen die Mehrheit des Cholesterins in LDL transportiert wird. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass insgesamt eine subchronische Simvastatin-Behandlung in Mäusen und Meerschweinchen nicht die gleichen Effekte auf die periphere und zentrale Cholesterinhomöostase hat. Allerdings belegen die Ergebnisse an beiden Tiermodellen, dass generell eine subchronische Simvastatin-Gabe die zerebrale Cholesterinhomöostase nicht negativ beeinflusst. Allerdings werden insbesondere die Serumcholesterinspiegel, die Cholesterinkonzentration in synaptosomalen Plasmamembranen und die DPH-Anisotropie in den beiden Tiermodellen vermutlich aufgrund von Speziesunterschieden im Lipidstoffwechsel in unterschiedlichem Ausmaß beeinflusst, so dass Speziesunterschiede bei der Interpretation tierexperimentellen Statin-Studien immer beachtet werden sollten. Effekte von Simvastatin auf die APP-Prozessierung in vivo Es ist bekannt, dass Statine einen unmittelbaren Einfluss auf die membranäre Cholesterinhomöostase ausüben und dabei vermutlich über eine Veränderung von Raft-Strukturen die APP-Prozessierung modulieren. In der vorliegenden Arbeit wurde der Effekt einer subchronischen Simvastatin-Gabe auf die APP-Prozessierung in einem transgenen AD-Mausmodell (APP751SL-Mäuse) untersucht. Durch die Simvastatin-Behandlung wird eine Umverteilung des Cholesterins aus dem cytofacialen Membranblatt ins exofaciale Membranblatt in synaptosomalen Plasmamembranen induziert und die Proteinexpression des Raft-Markers Flotillin wird signifikant reduziert. Diese Veränderungen innerhalb der synaptosomalen Plasmamembranen sind mit einer Zunahme der Spiegel von unlöslichem Abeta im Gehirn der APP751SL-Mäuse assoziiert. Vermutlich war die Cholesterinsenkung in der Membran nicht stark genug, um die an der APP-Prozessierung beteiligten Sekretasen per se zu inaktivieren. Es scheint vielmehr zu einer Dislokalisation der Rafts zu kommen, die über eine räumliche Annäherung von APP und β-Sekretase/γ-Sekretase letztendlich zu einer erhöhten APP-Prozessierung führt. Darüberhinaus ist in unserer Studie eine Abnahme der Konzentration an löslichem Abeta1-40 im Gehirn der Simvastatin behandelten APP751SL-Mäuse nachweisbar sowie eine gleichzeitige Erhöhung der Konzentration an löslichem Abeta1-40 im Plasma. Dieser Befund deutet darauf hin, dass die Clearance von zerebralem löslichem Abeta1-40 ins Blut durch Simvastatin erhöht wurde. Neuroprotektive Effekte von Simvastatin Es gibt vermehrt Hinweise darauf, dass Statine neben ihrer cholesterinsenkenden Wirkung zentrale protektive Effekte im Rahmen neurologischer Erkrankungen wie Alzheimer Demenz (AD) oder ischämischem Schlaganfall vermitteln. In einer vorangehenden Studie an Mäusen konnten wir zeigen, dass eine subchronische Simvastatin-Gabe eine erhöhte Genexpression des antiapoptotischen Proteins Bcl-2 induziert. In der vorliegenden Arbeit kann dieser Befund im Gehirn von Meerschweinchen bestätigt werden und darüberhinaus kann nachgewiesen werden, dass Simvastatin eine Reduktion der Proteinexpression des proapoptotischen Proteins Bax im Gehirn der behandelten Meerschweinchen induziert. An dissoziierten Hirnzellen wurde anschließend untersucht, ob die signifikante Reduktion der Ratio Bax/Bcl-2 durch Simvastatin-Gabe im Gehirn von Meerschweinchen auf mitochondrialer Ebene protektiv wirkt gegen oxidativen und nitrosativen Stress sowie gegen den Bcl-2 Antagonisten HA 14-1. An dissoziierten Hirnzellen der behandelten Meerschweinchen wirkt Simvastatin über eine Senkung der Ratio Bax/Bcl-2, nachfolgende Hemmung der Caspase-Aktivierung und eine Stabilisierung des mitochondrialen Membranpotentials protektiv. Diese protektiven Wirkungen von Simvastatin sind im Rahmen neurologischer Erkrankungen wie der AD und dem ischämischem Schlaganfall von großer Bedeutung, da bei diesen Erkrankungen Apoptose und mitochondriale Dysfunktion eine Schlüsselrolle in neurodegenerativen Prozessen spielt.
Massenspektrometrische Untersuchungen von DNA, RNA und nichtkovalenten Oligonukleotid-Komplexen
(2005)
Ziel dieser Dissertation war es, grundlegende Untersuchungen zum massenspektrometrischen Nachweis von DNA und RNA durchzuführen, sowie der spezifische Nachweis von nichtkovalenten Oligonukleotid-Komplexen. Dabei lag der Schwerpunkt auf den folgenden drei Bereichen: - Allgemeiner Vergleich zwischen DNA und RNA sowie den Ionisierungsmethoden nano-ESI und MALDI - Quantitative Untersuchung des Einflusses des Salzgehaltes und der Aufreinigung der Probe auf das Spektrum - Grundlegende Vorraussetzungen zum spezifischen Nachweis nichtkovalenter Komplexe mittels Massenspektrometrie (MS) Dabei zeigte sich beim massenspektrometrischen Vergleich von DNA mit RNA, dass die RNA stets eine höhere Stabilität aufweist, wobei diese bei beiden Oligonukleotiden mit steigender Kettenlänge abnimmt. Gleichzeitig erhöht sich mit steigender Kettenlänge die Tendenz zur Kationenanlagerung im Spektrum. Um diese Anlagerungen zu unterdrücken, ist die Verwendung von ammoniumhaltigen Zusätzen ist bei der MS stets erforderlich. Bei MALDI haben die Matrices einen großen Einfluss auf das Fragmentierungsverhalten der Proben. Für die Oligonukleotide konnte daher folgende Einteilung der Matrices von „hart“ nach „weich“ getroffen werden: HCCA > DHB > THAP ungefähr gleich ATT > HPA. Bei der Untersuchung von Oligonukleotiden mittels nano-ESI konnte gezeigt werden, dass die Verwendung von Quarzkapillaren der Verwendung von Glaskapillaren vorzuziehen ist, da mit Quarz die Anlagerungen der Kationen im Spektrum deutlich unterdrückt werden. Weiterhin wurde festgestellt, dass die Erhöhung des Drucks in der ersten Druckstufe zu einer schonenderen Desolvatisierung und damit zu einer deutlich verbesserten Nachweisgrenze führt. Bei der quantitativen Untersuchung des Salzeinflusses konnte eine maximale Salzkonzentration ermittelt werden, bei der eine massenspektrometrische Untersuchung von DNA und RNA noch möglich ist. Dabei hat sich gezeigt, dass bei direktem Vergleich nano-ESI 1000fach empfindlicher auf Salzverunreinigungen reagiert als MALDI. Generell lässt sich sagen, dass RNA eine höhere Tendenz zur Kationenanlagerung besitzt als DNA, wobei sich dieser Effekt mit steigender Kettenlänge verstärkt und bei nano-ESI deutlicher auftritt als bei MALDI. Das hat zur Folge, dass bei RNA ein höherer Aufreinigungsgrad notwendig ist, um im Vergleich zu DNA vergleichbare Ergebnisse zu erhalten. Dem entsprechend wurden neben der Aufreinigungsmethode mittels Ionenpaar-HPLC auch verschiedene Pipettenspitzen, die mit Chromatographiematerial gefüllt sind, zur Aufreinigung verwendet. Mit beiden Methoden konnte eine vergleichbare Reduktion der Kationenanlagerungen im Spektrum erreicht werden, wobei klar ist das die Verwendung von Pipettenspitzen die zeit- und kosteneffizientere Lösung darstellt. Durch ein neuartiges Aufreinigungsprotokoll für Pipettenspitzen konnte der Zeitaufwand noch einmal deutlich reduziert werden. Für die Untersuchung nichtkovalenter Oligonukleotid-Komplexe wurden „native“ Bedingungen gefunden, bei der die native Struktur des Komplexes soweit erhalten bleibt, dass ein spezifischer Nachweis mittels nano-ESI möglich ist. Diese Bedingungen stellen einen Kompromiss zwischen einerseits der Stabilität des Komplexes in Lösung und andererseits den optimalen Bedingungen für die Elektrospray-Ionisierung dar. Die erste untersuchte Komplexklasse waren Oligonukleotid-Dimere. Es wurden verschiedenste DNA-, RNA- sowie DNA-RNA-Hetero-Dimere mit Bindungsenergien zwischen 0 und -22,1 kcal/mol mittels nano-ESI vermessen. Es wurde eine klare Grenze ermittelt, bei der die Detektion nichtkovalenter Komplexe möglich ist. Spezifischen Dimere können im Spektrum nur dann detektiert werden, wenn deren Bindungsenergie mindestens -11,5 kcal/mol oder mehr beträgt. Als zweite Gruppe wurden Oligonukleotid-Dimere mit „Minor Groove Binding Ligands“ (MGBLs) mittels nano-ESI untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die MGBLs spezifisch und in der entsprechenden Bindungsstöchiometrie an DNA-Dimere binden. Für einen neusynthetisierten Ligand konnte erstmals die Bindungspräferenz an DNA-Dimere mit der Massenspektrometrie bestätigt werden. In allen Fällen wurde keine unspezifische Bindung an RNA-Dimere oder DNA-RNA-Hetero-Dimere beobachtet. Als letztes wurden RNA-Aminoglykosid-Komplexe mit nano-ESI untersucht. Hierbei konnten nur teilweise spezifischen Komplexe im Spektren nachgewiesen werden, da die Bindungsenergie einiger Komplexe deutlich unterhalb der Nachweisgrenze von -11,5 kcal/mol lag. Alle genannten nichtkovalenten Komplexe wurden auch mittels MALDI vermessen, allerdings konnten keine spezifischen Komplexe nachgewiesen werden. Durch direkten Vergleich von MALDI mit nano-ESI und entsprechende Kontrollexperimente konnte erstmals gezeigt werden, dass die nichtkovalenten Komplexe nicht wie vermutet während der MALDIKristallisation zerstört werden. Viel mehr werden die Komplexe im MALDI-Kristall unzerstört eingebaut und eine Zerstörung erfolgt erst während des Desorptions-/Ionisationsprozesses. Es besteht die berechtigte Vermutung, dass bei stärker bindenden Komplexen eine unzersetzte Ionisation mittels MALDI erfolgen kann. Daher sind weitere Untersuchungen in diese Richtung sinnvoll und es werden zur Zeit Komplexe, deren Bindungsenergie weit über -22,1 kcal/mol liegt, in der Arbeitsgruppe untersucht. Abschließend ist festzustellen, dass die Massenspektrometrie eine schnelle und effiziente Möglichkeit zur Analyse von DNA und RNA ist, die allerdings einen hohen Anspruch an die Sauberkeit und damit an die Aufreinigung der Probe stellt. Darüber hinaus ist die MS auch in der Lage nichtkovalente Oligonukleotid-Ligand-Komplexe zu untersuchen. Da in den letzten Jahren DNA und RNA als mögliches Zielmolekül für neue Therapieansätze mehr und mehr an Bedeutung gewonnen haben, bietet sich die Massenspektrometrie als eine Möglichkeit zur Analyse von Oligonukleotid-Wirkstoff- Komplexe an.
Das humane MLL-Gen (Mixed Lineage Leukemia) ist in chromosomale Translokationen mit mehr als 50 verschiedenen Partnergenen involviert. Alle diese Rearrangements sind mit akuter lymphatischer oder akuter myeloischer Leukämie assoziiert. Die reziproke Translokation t(4;11) ist ursächlich für die Entstehung einer akuten lymphatischen Leukämie, die gehäuft bei Kleinkindern auftritt. Die Prognose dieser aggressiven Leukämie ist sehr schlecht, da die leukämischen Blasten nahezu Therapie-resistent sind. Für einige MLL-Rearrangements konnte in Transduktions/Transplantations-Experimenten gezeigt werden, dass das MLL-Fusionsgen akute myeloische Leukämien in Mäusen induzieren kann. Aus diesem Grund steht immer noch das jeweilige MLL-Fusionsprotein im Mittelpunkt der Suche nach einem zugrunde liegenden Pathomechanismus. Die Versuche, ein Tiermodell mit dem MLL/AF4- Fusionsprodukt zu etablieren, blieben lange Zeit erfolglos. Erst Anfang dieses Jahres gelang es, durch eine knock-in Strategie, transgene Mäuse zu generieren, die das MLL/AF4 Translokationsprodukt tragen. Diese Mäuse entwickeln nach einer sehr langen Latenzzeit von bis zu 540 Tagen diffuse B-Zell-Lymphome. An der t(4;11) sind die Gene MLL auf Chromosom 11q23 und AF4 auf Chromosom 4q21 beteiligt. Die reziproke Translokation führt zur Entstehung von zwei Fusionsgenen (MLL/AF4 und AF4/MLL) mit intaktem Leserahmen. Wir nehmen an, dass beide Fusionsgene notwendig sind, um die Entartung der Zellen zu bewirken. Zum Einen ist der beschriebene Phänotyp der transgenen MLL/AF4 positiven Mäuse mit dem aggressiven Verlauf der t(4;11) Leukämie nicht vergleichbar, und zum Anderen findet man bei der Mehrzahl der Patienten mit einer t(4;11) beide Fusionstranskripte in den leukämischen Blasten. Um die Eigenschaften der Fusionsproteine AF4/MLL und MLL/AF4 zu untersuchen, wurden stabil transfizierte murine embryonale Fibroblasten-Linien etabliert, die entweder eines oder beide Fusionsgene regulierbar exprimierten. Mit Hilfe dieses in vitro Modells konnte man erstmals die Auswirkungen der gleichzeitigen Expression beider Fusionsgene auf das Verhalten der Zellen analysieren. Die Untersuchungen der Proliferation und der Apoptoseraten der verschiedenen transfizierten Zelllinien ergab, dass das AF4/MLL Fusionsprotein in den Zellen zu Wachstumstransformation führt, aber gleichzeitig die Zellen für den Zelltod durch bislang unbekannte Apoptosemechanismen sensitiviert. Das MLL/AF4 Translokationsprodukt war nicht in der Lage, eine Wachstumstransformation auszulösen. Vielmehr wurde deutlich, dass die Expression von MLL/AF4 die Proliferation der Zellen hemmt. Die Untersuchung der spezifischen Apoptoserate in den MLL/AF4 positiven Zellen ergab, dass die Zellen sowohl unter normalen Bedingungen als auch unter Stress-Konditionen Apoptose-resistent waren. Damit besitzen beide Fusionsproteine onkogene Eigenschaften. Da nur die mit AF4/MLL und MLL/AF4 transfizierten Zellen eine stark erhöhte Proliferation aufwiesen, im Wachstum transformiert waren und eine erhöhte Apoptoseresistenz zeigten, wurde deutlich, dass die Eigenschaften beider Fusionsproteine notwendig sind, um den vollständig transformierten Phänotyp auszulösen. Um die Veränderungen in den Zellen auf molekularer Ebene zu untersuchen, wurde mittels quantitativer PCR die Expression verschiedener Zellzyklus- und Apoptose-regulierender Gene untersucht. Dabei wurde deutlich, dass die Expression Zellzyklus- und Apoptose-regulierender Gene in allen drei Zellen verändert war. Genexpressionsprofil-Studien der Zellen ergaben schließlich, dass der Transkriptionsfaktor Nanog in den doppelt-transfizierten Zellen verstärkt exprimiert wurde. Nanog ist in die Aufrechterhaltung der Pluripotenz und des Selbsterneuerungspotenzials von embryonalen Stammzellen involviert. In dieser Arbeit konnte erstmals der Phänotyp einer Zelllinie beschrieben werden, die beide Fusionskonstrukte, AF4/MLL und MLL/AF4, stabil exprimierte. Dabei wurde deutlich, dass nur durch die Expression beider Fusionsgene ein Phänotyp erzeugt wird, der den Leukämoblasten sehr ähnlich ist. Die Expression von Nanog in diesen Zellen erklärt den Stammzell-Charakter der leukämischen Zellen.
Tiere und Menschen sind für das tägliche Überleben auf eine schnelle Bewertung und flexible Nutzung verschiedenster Umweltreize angewiesen. So nutzen Vögel, wie viele andere Tiere, sowohl den Magnetsinn als auch die Geometrie der Umgebung und Landmarken, um sich im Raum zu orientieren. Auch erfolgt eine schnelle und komplexe Auswertung des visuellen Inputs, beispielsweise, um bei der Futtersuche selektiv Futterkörner finden zu können. Unklar ist bislang, wie Raum- und Objektinformation in den beiden Hirnhälften verarbeitet werden und wie die Aufgabenteilung zwischen den Hemisphären aussieht. Zur Klärung dieser Thematik soll die vorliegende Arbeit beitragen, wobei die Versuche so angelegt wurden, dass mögliche, grundlegende Verarbeitungsstrategien unter zwei Gesichtspunkten betrachtet werden konnten: Zum einen wurden den Tieren prinzipiell unterschiedliche Aufgaben präsentiert, um über verschiedene Bereiche auf dem Gebiet der Raum- und Objektverarbeitung hinweg vergleichen zu können. Zum anderen wurde mit den beiden zurzeit wichtigsten Vogelmodellen gearbeitet, der Brieftaube (Columba livia) und dem Haushuhnküken (Gallus gallus). Dies erlaubt einerseits den Vergleich eigener Ergebnisse mit anderen Befunden innerhalb derselben Art, während andererseits auch Parallelen und Unterschiede zwischen verschiedenen Arten betrachtet werden können. Vögel eignen sich hierbei aufgrund ihrer Anatomie besonders gut für die Erforschung von Hemisphärenunterschieden. Durch ein nahezu vollständiges Überkreuzen der Sehnerven und das Fehlen eines Corpus callosum oder anderer funktionell entsprechender Strukturen zum Informationsaustausch zwischen den Hirnhälften wird der visuelle Input eines Auges überwiegend in der gegenüberliegenden Hirnhälfte verarbeitet. Lateralisation kann daher sehr leicht durch Abdecken eines Auges untersucht werden. Bei Brieftauben wurde die Repräsentation von Geometrie und Landmarken untersucht (Kapitel 2). Die Tiere lernten hierbei, das Zentrum einer quadratischen Arena mithilfe rein geometrischer Hinweise oder mittels einer Kombination von Geometrie und Landmarken zu finden. Durch Verändern der verfügbaren Informationsart wurde untersucht, welche Informationen die Tauben zum Lokalisieren des Zentrums nutzten. Die Ergebnisse zeigen mit einer beidseitigen Verarbeitung ein qualitativ anderes Muster der Repräsentation von Rauminformationen als bislang bei anderen Arten, wie z.B. dem Haushuhnküken, beschrieben. Ferner hing der relative Gebrauch von Geometrie und Landmarken in starkem Maße von der vorherigen Erfahrung der Tauben ab. In einer weiteren Studie wurde die Verarbeitung von Magnetkompassinformation bei Brieftauben untersucht (Kapitel 3). Hierbei wurde erstmals erfolgreich ein Versuchsdesign zur Laboruntersuchung entwickelt. Auch bei dieser Raumkognitionsaufgabe wurde ein Unterschied zu der bei anderen Arten gefundenen linkshemisphärischen Spezialisierung zugunsten einer Verarbeitung sowohl in der linken als auch in der rechten Hirnhälfte gefunden. Während die Tauben hierbei mit der rechten Hirnhälfte lediglich die richtige Achse wahrnahmen, erfassten sie mit der linken Hemisphäre die spezifische Richtung. Dies könnte die gefundene linkshemisphärische Überlegenheit im Freiland erklären. Erstmals bei Vögeln wurde beim Haushuhnküken in einem weiteren Versuch die hemisphärische Verarbeitung von Raumfrequenzinformation untersucht, die sowohl für die visuelle Raumorientierung als auch für das Objekterkennen von großer Bedeutung ist (Kapitel 4). Die Raumfrequenz ist hierbei allgemein als ein Maß für die Wiederholungen einer Struktur über eine bestimmte Strecke definiert und kann zur Charakterisierung beliebig komplexer Objekte verwendet werden. Die Küken wählten zwischen simultan dargebotenen Objekten, deren Oberflächen sich hinsichtlich ihrer Raumfrequenzen unterschieden. Die Ergebnisse weisen auf eine Spezialisierung der linken Hirnhälfte für hohe und der rechten Hirnhälfte für niedrige Raumfrequenzen hin. Aufgrund der Parallelen zu Befunden beim Menschen könnte dies auf eine gemeinsame Grundlage der Lateralisationsentwicklung bei Wirbeltieren hindeuten. Während sich die vorangehenden Studien der vorliegenden Arbeit mit Spezialisierungen der linken und rechten Hirnhälfte bei der Verarbeitung von Raum- und Objektinformation befassten, wurde in Kapitel 5 das Zusammenwirken von linker und rechter Hirnhälfte bei der selektiven Nahrungssuche untersucht. Hierbei konnte am Beispiel des Haushuhnkükens erstmals bei Vögeln Hemisphärenkooperation gezeigt werden, was als Hinweis darauf zu werten ist, dass eine bilaterale Repräsentation im Vogelhirn in komplexen Situationen, die eine rasche und effiziente Beurteilung des gesamten überschaubaren Bereichs erfordern, möglich ist. Insgesamt zeigen die Ergebnisse für mehrere wichtige Fragen der Lateralisationsforschung wie die Erfahrungsabhängigkeit, den Nachweis unterschiedlicher Lateralisationsmuster bei Brieftauben und Haushuhnküken in der geometrischen Orientierung oder die Kooperation der Hirnhemisphären, dass bisherige Ansichten über die Verarbeitung von Raum- und Objektinformation bei Vögeln einer kritischen Überarbeitung bedürfen.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte ein Anti-PGE2-Antikörperfragment exprimiert werden, mit dem über NMR-Spektroskopie genauere Strukturdaten der Antikörperbindungsdomäne zu erhalten wären. Da Fab-, Fv- und scFv-Fragmente die Antigenbindungsstelle besitzen und sich gegenüber einem vollständigem IgG zusätzlich durch ihre geringere Größe auszeichnen, wurden die korrespondierenden Antikörperfragmente für diese Arbeiten gewählt. Ausgehend von einer etablierten Hybridom-Zelllinie konnten über cDNA-Synthese und Assembly-PCR die Gene für die Antikörperfragmente bereitgestellt werden. Zum Verifizieren von DNA-Sequenz und Bindungseigenschaften stand ein Anti-PGE2-Fab-Fragment früherer Arbeiten von Frau Dr. Ilse Zündorf zur Verfügung. Für Strukturuntersuchungen müssen relativ große Proteinmengen bereit gestellt werden, daher ist es notwendig, hohe Ausbeuteverluste durch Präzipitation, Degradierung, Aufreinigungsverluste u.a. zu vermeiden. Um zunächst eine möglichst gute Proteinexpression zu erhalten, wurde der Bakterienstamm Escherichia coli BL21DE3 und das pET-Expressionssystem gewählt. In diesem System war zu erwarten, dass die überexprimierten Antikörperfragmente unter den gewählten Bedingungen in Form unlöslicher Aggregate, sogenannter inclusion bodies, in den Zellen vorliegen werden. Die der Klonierung der VH-, Vk- und scFv-Gene folgende Expression der Proteine zeigte, dass es tatsächlich zur Bildung von inclusion bodies kommt. Die Vorteile dieser Aggregatbildung, wie hohe Proteinmenge, Proteaseunempfindlichkeit aufgrund der hohen Dichte sowie die hohe Homogenität, sollten für die Gewinnung nativer Antikörperfragmente genutzt werden. Hierfür konnte ein System etabliert werden, das im wesentlichen auf der Solubilisierung der Aggregate und der Reduktion falscher Disulfidbrücken mit anschließender Rückfaltung und Rekonstituierung der Disulfidbrücken beruht. Kritische Parameter, die den Rückfaltungsprozess beeinflussen, wurden untersucht. Hierunter fallen insbesondere die Zusammensetzung des Renaturierungssystems wie Pufferbedingungen, das Verhältnis von oxidierten zu reduzierten Glutathion und der Zusatz von sogenannten Faltungsenhancern, die Additiva. Für fast alle wesentlichen Punkte konnten Systemkomponenten etabliert werden, die für das scFv-Fragment eine nahezu vollständige Überführung der inclusion bodies in die lösliche Form erlauben. Auch eine Bindung an das Antigen Prostaglandin E2 konnte unter Anwendung von Radioimmunoassays gezeigt werden. Problematisch ist die Aufkonzentrierung der in niedriger Konzentration vorliegenden renaturierten scFv-Fragmente. Je stärker aufkonzentriert wird, desto stärker präzipitieren die scFv-Moleküle in der Ultrafiltrations- bzw. Zentrifugationsfiltereinheit. Antikörper und Antikörperframente sind ohne Frage eine sehr wichtige Molekülgruppe von molekularbiologischen und biochemischen Interesse, nicht nur in dieser Arbeitsgruppe. Im Rahmen einer möglichen Weiterführung dieser Arbeit müsste geklärt werden, ob das Präzipitationsverhalten der scFv-Fragmente eine inhärente Eigenschaft des Anti-PGE2 scFv ist, oder ob hier doch eine zumindest teilweise inkorrekte Faltung der Proteinkette vorliegt. Mögliche weitere Experimente könnten in der Variation des Linkers liegen oder das etablierte Verfahren an einem weiteren scFv-Fragment zu testen. Da die genannten Probleme bei der Aufkonzentrierung der Proteinlösung auftreten, sollten statt der angewandten Techniken alternative Methoden geprüft werden. Auch wäre es interessant zu sehen, ob sich ein z.B. kommerziell verfügbares scFv-Fragment, dessen Bindungseigenschaften bekannt sind, nach Denaturierung wieder in die native Form überführen lässt. Abschließend lässt sich sagen, dass die Herstellung von nativen Protein aus inclusion bodies viele Vorteile bietet, die für die Präparation größerer Proteinmengen nicht ungenutzt bleiben sollten.
5-LO is the key enzyme in the biosynthesis of proinflammatory leukotrienes. It catalyses the conversion of arachidonic acid to the hydroperoxy intermediate 5(S)-hydroperoxy-6- trans-8,11,14-cis-eicosatetraenoic acid (5-HpETE). In a second step 5-LO catalyses a dehydration reaction forming the unstable epoxide intermediate 5(S)-trans-5,6-oxido-7,9- trans-11,14-cis-eicosatetraenoic acid (leukotriene A4 , LTA4). The 5-LO gene is subjected to versatile regulation mechanisms. Apart from regulation by DNA-methylation and histone acetylation / deacetylation 5-LO gene expression can be regulated by the differentiation inducers calcitriol (1,25-dihydroxyvitamin D3) and transforming growth factor beta (TGFβ) 5-LO gene expression. In the myeloid cell lines Mono Mac 6 (MM6) and HL-60, differentiation with both agents caused a prominent upregulation of 5-LO mRNA level, of 5-LO protein expression and of 5-LO activity. Treatment with calcitriol alone already has an impact on 5-LO gene expression which is additionally potentiated by TGFβ treatment. Previous nuclear run-off analysis and reporter gene analysis could not associate the 5-LO promoter with the induction of 5-LO mRNA expression mediated by calcitriol and TGFβ. Inclusion of the 5-LO coding sequence (cds) and inclusion of the 5-LO cds plus the last four introns of the gene (J to M) in the 5-LO promoter construct pN10 led to an enhanced reporter gene activity. The inductions were dependent on vitamin D receptor (VDR) and retinoid x receptor (RXR) cotransfection. Therefore the work was concentrated on identifying elements outside the 5-LO promoter region which contribute to the calcitriol / TGFβ effect on 5-LO mRNA expression. Insertion of the LTA4 hydrolase coding sequence – a coding sequence of similar size - instead of the 5-LO cds led to a loss of the calcitriol / TGFβ effect (pN10LTA4Hcds 1-fold induction). Therewith, it was proven that the presence of the 5-LO cds is crucial for the upregulating effect of calcitriol / TGFβ on 5-LO mRNA level. Cloning of the SV40 promoter instead of pN10 upstream of the 5-LO cds still showed inducibility by treatment with the inducers which argues for a promoter unspecific effect. Insertion of the 5-LO cds in a promoterless basic vector (pGL3cds) displayed same inductions by calcitriol / TGFβ treatment as the 5-LO promoter 5-LO cds construct (pN10cds). Thus, the effect of the inducers is not dependent on the 5-LO promoter under the in vitro conditions of the reporter gene assay. Hence, further cloning was done with promoterless constructs. Through 5-LO cds deletion constructs a positive regulating region in exon 10 to 14 was discovered. To adapt the natural gene context the last four introns (J-M) of the 5-LO gene were inserted in a promoterless construct containing exon 10 to 14 (pGL3cdsΔABInJM). 5end deletion constructs of it revealed putative vitamin D responsive elements (VDREs) in exon 12 and intron M. Mutation of the putative VDREs led to a reduced calcitriol effect –more prominent when the putative VDRE in intron M was mutated (reduction of 40%). Moreover another putative VDRE in exon 10 with an adjacent SMAD binding element (SBE) was detected. SMAD proteins are effector proteins of TGFβ signalling. Gelshift experiments demonstrated in vitro binding of the VDR-RXR heterodimer to those three putative VDREs. By chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay in vivo binding of VDR and RXR was shown to the VDRE in the region of exon 10, exon 12 and intron M. 8h and 24h incubation with calcitriol / TGFβ resulted in enhanced expression of VDR in each of the examined regions. The VDR is able to bind to the VDRE without its ligand, whereas this goes along with corepressor recruitment and thus the VDR has a repressive effect on transcription. Histone H4 acetylation was increased when MM6 cells were treated for 8h or 24h with calcitriol or the combination of calcitriol / TGFβ. This finding implies that at that point of time corepressors associated with the VDR are replaced by coactivators. It seems convincing that 5-LO transcription is mainly promoted by calcitriol alone which leads to a more accessible chromatin structure. Previous data indicated that calcitriol and TGFβ upregulate 5-LO RNA maturation and 5- LO transcript elongation. Thus several elongation markers were investigated by ChIP analysis: Histone H3 lysine 36 (H3K36) trimethylation and H4K20 monomethylation were detected in the analysed regions in exon 10, exon 12 and intron M. In region exon 10 the H3K36 trimethylation status was enhanced after 24h calcitriol or calcitriol / TGFβ treatment. An increased H4K20 monomethylation status in all regions was observed when MM6 cells were treated for 24h with calcitriol / TGFβ. 24h treatment with both agents also enhanced the recruitment of the elongation form of RNA polymerase II, which is phosphorylated at serine 2 of the carboxyterminal domain, to the investigated regions. These findings prove the positive regulating role for calcitriol and TGFβ on 5-LO transcript elongation. A putative mechanism of the effect of calcitriol and TGFβ on 5-LO RNA maturation might be the elevated phosphorylation of serine 2 of the RNA Polymerase II which is known to be followed by recruiting polyadenylating factors.
Lichtsensitive Proteine bzw. Photorezeptoren eignen sich hervorragend für das Studium des Zusammenhangs von Proteinstruktur und –funktion. Lichtrezeptorproteine werden leicht durch Licht angeregt, wodurch eine gute Zeitauflösung für deren Untersuchung erreicht werden kann. Weiterhin sind sie als Signalproteine während der Etablierung des aktiven Zustandes und dessen Zerfalls großen konformationellen und strukturellen Änderungen unterworfen. Ausgehend von diesen Eigenschaften wurde bereits eine große Zahl von Lichtrezeptorproteinen genauer untersucht. Diese vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit lichtinduzierten konformationellen Änderungen in Membranproteinen. Dafür wurden drei verschiedene Systeme herangezogen: das kleine α-helikale Peptid Gramicidin A, der G-Protein gekoppelte Rezeptor Rhodopsin and die BLUF (blue light using FAD) Domäne des hypthetischen Membranproteins Blrp (blue-light regulated phosphodiesterase) aus E. coli. Gramicidin A (gA) ist ein aus dem Bodenbakterium B. brevis isoliertes Antibiotikum, das Transportkanäle für einwertige Kationen wie Lithium, Natrium und Kalium ausbildet. Gelöst in Detergenzmizellen, wurde für gA unerwartet eine Wechselwirkung mit Blaulicht fest gestellt (Abbildung 1). Diese Beobachtung wurde mit statischen und zeitaufgelösten NMRspektroskopischen Methoden genauer untersucht und ist in Kapitel 2 näher beschrieben. Basierend auf den gewonnenen Erkenntnissen wird postuliert, dass einer der Tryptophanreste (Trp9) eine lichtinduzierte konformationelle Änderung erfährt. Ausgehend von der Konformation in Lösung befindet sich die Seitenkette von Trp9 in einem Gleichgewicht (70:30) mit einer zweiten Konformation. Bei der zweiten Konformation handelt es sich möglicherweise um die Orientierung, die der Tryptophanrest unter Festkörper-NMR Bedingungen einnimmt. Die Lebensdauer der neuen Konformation beträgt in etwa eine Sekunde. Der G-Protein gekoppelte Rezeptor Rhodopsin ist verantwortlich für die Verarbeitung von Lichtsignalen in den Stäbchenzellen der Retina. Die Absorption eines einzelnen Photons führt zur Isomerisierung des kovalent gebundenen Chromophors 11-cis-Retinal, wodurch konformationelle Änderungen im Protein veranlasst werden. Der aktivierte Metarhodopsin II (MetaII) Zustand induziert eine Enzymkaskade und schließlich einen Nervenimpuls, das Säugern das Kontrastsehen ermöglicht. Eine große Bandbreite an hochauflösenden NMRspektroskopischen Methoden, (einschließlich zeitaufgelöster und Festkörper-NMR Methoden) wurde im Laufe dieser Arbeit angewandt, um Konformation und Dynamik von bovinem Rhodopsin näher zu untersuchen. In Kapitel 3.1 sind zu Beginn mehrere Optimierungsschritte im Hinblick auf ein kostengünstiges, isotopenmarkiertes Säugerzellenmedium beschrieben. In diesem Zusammenhang wurden mehrere Rhodopsin NMR-Proben hergestellt, wobei der Gehalt an isotopenmarkierten Aminosäuren ca. 50% betrug. Anhand dieser Proben konnte bewiesen werden dass sich mit Lösungs-NMR-Spektroskopie auch sehr große, in Detergenzmizellen stabilisierte Membranproteine (~150 kD Gesamtmasse) detailliert studieren lassen. Die Untersuchungen konzentrierten sich auf den C-Terminus, für den nach sequentieller Zuordnung (Abbildung 2a) und heteronuklearern Relaxationsmessungen ein Mobilitätsverhalten bestimmt wurde, das dem mittelgroßer Proteine ähnelt. Des Weiteren konnten keinerlei definierte Strukturelemente innerhalb des C-Terminus identifiziert werden, u.a. durch einen Vergleich mit eines 19mer Peptids, dessen Primärsequenz des Rhodopsin C-Terminus entspricht (Abbildung 2a und 2b). In Kapitel 3.2 wird die nichtinvasive Zuordnung der Rückgratresonanzen aller fünf Trytophane mit Hilfe einer Kombination aus Lösungs- und Festkörper-NMR beschrieben. Dazu wurden verschiedene Rhodopsinproben hergestellt, die alle möglichen 13C’i-1-Carbonyl/15Ni-Tryptophan isotopenmarkierten Amidpaare enthielten. Eine Teilzuordnung der Tryptophanindolsignale konnte in Lösung durch Protonen-/Deuteriumaustausch und heteronukleare Relaxationsmessungen erreicht werden. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Kombination aus Lösungs- und Festkörper-NMR-Spektroskopie sehr gut geeignet ist um komplementäre Informationen zu strukturellen und dynamischen Eigenschaften von Rhodopsin zu liefern. Fehlende Zuordnungen in den Lösungspektren konnten durch den Verglich mit Festkörperspektren ergänzt werden und umgekehrt (Abbildung 3). In Kapitel 3.3 ist die erfolgreiche Adaption der zeitaufgelösten NMR-Spektroskopie für die Untersuchung des Rhodopsin MetaII Zerfalls in vitro beschrieben. Die zeitaufgelösten protonendetektieren NMR-Experimente wurden mit unmarkiertem, in Detergenzmizellen stabilisiertem Protein bei verschiedenen Temperaturen aufgenommen, wobei sich die anschließende Auswertung auf die stark tieffeldverschobene Indolregion konzentrierte (Abbildung 4). Für die berücksichtigten Signale traten nach Induktion des aktivierten Zustandes deutliche chemische Verschiebungsänderungen auf, außerdem zeigten sie unterschiedlich schnellen MetaII Zerfall. Zusätzlich zu der erwarteten Zeitkonstante des MetaII Zerfalls (~6 min bei 298 K) konnte erstmalig eine zweite, ca. zehnmal langsamere Zeitkonstante bestimmt werden. Diese zweite Zeitkonstante ist möglicherweise ein Ausdruck für die langsame Entfaltung von Sekundärstrukturelementen nach dem Zerfall des Proteins in Opsin und Retinal. Die BLUF-Domänen verwenden Flavinadeninnukleotid (FAD) als Chromophor und gehören zu der Familie der Blaulichtrezeptoren. In Kapitel 4 wird die Untersuchung des lichtadaptierten Zustandes der E. coli BLUF Domäne auf Protein- und Ligandenebene mit zeitaufgelösten proton- und phosphordetektierten NMR-Experimenten beschrieben. In Abbildung 5 sind die statischen Licht- und Dunkelspektren (jeweils licht- und dunkeladaptiert) dargestellt. Im Folgenden konnte durch Beobachtung der Dunkeladaption bei verschiedenen Temperaturen die Aktivierungsenergie des Lichtzustandes bestimmt werden. Des Weiteren wurden zum ersten Mal phosphordetektierte NMR-Experimente erfolgreich angewandt, um einen biologisch relevanten Vorgang zeitabhängig näher zu bestimmen.
Shrew-1 wurde bei der Suche invasivitätsassoziierter Gene mittels eines DDRT-PCR-Ansatzes aus invasiven Zellen isoliert. Wie computergestützte Analysen der Sequenz ergaben, wies das bis dahin unbekannte Protein keinerlei Ähnlichkeiten mit bereits bekannten Proteinen auf und homologe Proteine wurden bisher nur in Vertebraten gefunden. Expressionsanalysen mit einem GFP-markierten shrew-1 zeigten, dass es an der basolateralen Plasmamembran lokalisiert, wo es mit dem E-Cadherin vermittelten Adhäsions-Komplex kolokalisiert. Eine Integration in diesen Komplex geschieht höchstwahrscheinlich durch direkte Interaktion mit β-Catenin. Ein weiteres Molekül das als potenzieller Interaktionspartner von shrew-1 identifiziert wurde und das in der Literatur oft als Tumorsuppressor diskutiert wird, ist Caveolin-1. Ferner konnten Überexpressionexperimente bereits zeigen, dass shrew-1 die Invasivität von HT1080-Zellen erhöhen kann. Das Ziel dieser Arbeit war es, zum einen mit Hilfe des Hefe-Split-Ubiquitin-Systems eine Interaktion von shrew-1 und Caveolin-1 zu bestätigen und zum anderen neue Interaktionspartner zu identifizieren, die helfen könnten, die Rolle von shrew-1 in invasiven Vorgängen zu erklären. Um eine mögliche Verbindung von shrew-1 und einem neuen Interaktionspartner in Bezug auf die Zellinvasivität zu untersuchen, sollten sowohl shrew-1 als auch der potenzielle Interaktionspartner mittels RNAi ausgeschaltet werden. Mit Hilfe des Split-Ubiquitin-Systems war es möglich, die Interaktion zwischen shrew-1 und caveolin-1 zu bestätigen und zu zeigen, dass diese durch die zytoplasmatische Domäne von shrew-1 vermittelt wird. Weiterhin konnte CD147 als neuer Interaktionpartner identifiziert werden. Eine Interaktion beider Proteine konnte ferner mit Hilfe des Bimolekularen-Fluoreszens-Komplementations-Systems (BIFC), des Fluoreszens-Resonanz-Energie-Transfers (FRET) und Coimmunoprezipitationen bestätigt werden. Die Interaktion von shrew-1 und CD147 scheint allerdings abhängig vom zellulären Kontext zu sein, wie die FRET-Analysen vermuten lassen. So konnte nämlich mit diesen Analysen eine starke Interaktion in MCF7-Zellen gezeigt werden, wohingegen die Interaktion in MDCK-Zellen schwächer war. Einer der auffälligsten Unterschiede dieser beiden Zelllinien im Bezug auf diese Interaktion könnte sein, dass MCF7-Zellen im Gegensatz zu MDCK-Zellen kein Caveolin-1 exprimieren. Caveolin-1 konnte seinerseits als Interaktionspartner von shrew-1 mit Hilfe des Hefe-Split-Ubiquitin-Systems bestätigt werden und andererseits wurde von einer anderen Arbeitsgruppe eine Interaktion von CD147 mit Caveolin-1 publiziert. Um dies näher zu untersuchen, wurde Caveolin-1 in MCF7-Zellen exprimiert und die FRET-Analysen in diesen wiederholt. Wie vermutet kam es zu einer Reduktion der Interaktion in Caveolin-1 exprimierenden MCF7-Zellen. CD147 ist neben vielen anderen Funktionen auch maßgeblich an der Regulation von Matrix-Metalloproteinasen beteiligt und kann somit die Invasivität von Zellen beeinflussen. Um einen Einfluß von shrew-1 und CD147 auf die Invasivität zu untersuchen, wurden beide Proteine mittels RNAi in HeLa-Zellen ausgeschaltet. Nachdem ein negativer Einfluss dieses Ansatzes auf das Proliferationsverhalten der Zellen ausgeschlossen werden konnte, wurde ein möglicher Effekt auf die Invasivität der Zellen untersucht. Durch die Analyse in Matrigel-Invasionsassays konnte gezeigt werden, dass das unabhängige Ausschalten beider Proteine die Invasivität der Zellen auf 35-55% im Vergleich zu Kontrollzellen reduziert. Die Ergebnisse dieser Arbeit untermauern die Annahme, dass shrew-1 eine Rolle bei invasiven Vorgängen spielt und weisen darauf hin, dass dies möglicherweise durch eine Interaktion mit CD147 geschieht. Die Interaktion mit CD147 und damit eine mögliche Funktion von shrew-1 bei invasiven Vorgängen scheinen dabei abhängig vom zellulären Kontext zu sein.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden die 5´- und 3´-Enden 23 ausgewählter Transkripte des halophilen Archaeons Halobacterium salinarum bestimmt. Die Daten wurden dazu verwendet, die Längen der untranslatierten Bereiche zu ermitteln, Konsensussequenzen für die Transkriptionsinitiation und -termination abzuleiten und die Rolle haloarchaealer UTRs bei der Translationsinitiation und -regulation zu untersuchen. Der experimentelle Ansatz wurde mit einer bioinformatischen Analyse des Genoms von H. salinarum vervollständigt. Dabei konnten die Konsensussequenzen der basalen Promotorelemente genauer definiert werden und ein neues Promotorelement konnte entdeckt werden. Weiterhin wurde ein Konsensusmotiv gefunden, welches wahrscheinlich für die Termination der Transkription wichtig ist. Alle 23 analysierten Transkripte hatten eine 3´-UTR mit einer durchschnittlichen Länge von 48 Nukleotiden und ihre 3´-Enden waren nicht posttranskriptionell modifiziert. Die experimentellen Ergebnisse und bioinformatischen Daten ergaben, dass die Mehrheit der haloarchaealen Transkripte keine 5´-UTR besitzt. Die meisten Transkripte mit 5´-UTRs enthielten unerwarteterweise keine Shine-Dalgarno (SD)-Sequenz. Die Analyse des H. salinarum Genoms machte deutlich, dass weniger als 10% aller Gene eine SD Sequenz vorrausgeht und dass sogar bei Genen, die distal im Operon liegen, meistens keine SD-Sequenz zu finden ist. Weiterhin wurde der Einfluss einer ausgewählten 5´-UTR ohne SD-Sequenz und einer 3´-UTR auf die Transkriptstabilität und die Translationseffizienz untersucht. Das Transkript mit 5´ UTR ohne SD-Sequenz wurde in H. salinarum effizient translatiert. In einer Studie an H. volcanii konnte das Gleiche für verschiedene 5´ UTRs ohne SD-Sequenz in Verbindung mit einem Reportergen gezeigt werden (Brenneis et al., 2007). An diesen Transkripten kann die Translation also nicht über den „bakteriellen“ Mechansimus durch Basenpaarung mit dem 3´-Ende der 16S rRNA initiiert werden. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurde untersucht, ob es sich bei dem Mechanismus der Translationsinitiation an Transkripten mit 5´-UTR ohne SD-Sequenz um einen Scanning-Mechanismus wie bei Eukaryonten oder um einen neuen Mechanismus handelt. Für die Experimente wurde das zuvor erwähnte Reportergensystem aus H. volcanii verwendet. Neben AUG wurden GUG und UUG effizient als Startkodons an einem Transkript mit 5´-UTR genutzt, wohingegen AUG das einzige funktionierende Startkodon bei einem Transkript ohne 5´-UTR war. Verschiedene Deletionsversionen der 20 Nukleotide langen 5´-UTR wurden im Gegensatz zur kompletten 5´-UTR nur sehr ineffizient translatiert. Das Einfügen zusätzlicher AUGs stromaufwärts des natürlichen Startkodons hatte keinen Einfluss auf die Translationseffizienz am internen AUG. Ein zusätzliches AUG am 5´-Ende im gleichen Leseraster des natürlichen AUGs führte zur gleichzeitigen Nutzung beider Startkodons auf derselben mRNA. Eine stabile Haarnadelstruktur am 5´-Ende inhibierte die Translation nur am ersten AUG und hatte keinen Einfluss auf die Translationseffizienz am internen AUG. Zusammenfassend konnte durch die erhaltenen Ergebnisse ausgeschlossen werden, dass der Mechanismus der Translationsinitiation an Transkripten mit 5´-UTR ohne SD-Sequenz ein Scanning-Mechansimus wie bei Eukaryonten ist. Neben der Translationsinitiation an Transkripten ohne 5´-UTR und an Transkripten mit SD-Sequenz existiert also noch ein dritter, bis jetzt unbekannter Mechansimus zur Translationsinitiation in Haloarchaea. In initialen Versuchen zur genaueren Charakterisierung der drei verschiedenen Translationsinitiationsmechanismen, wurden Konstrukte hergestellt, bei denen alle drei verschiedenen Startkodons auf einer mRNA vorhanden sind. Es wurden erste Hinweise darauf gefunden, dass Stressbedingungen einen Einfluss auf die unterschiedlichen Initiationsmechansimen haben. Anders als erwartet führte die Mutation einer natürlichen SD-Sequenz nicht zu einer verminderten Translationseffizienz am entsprechenden Startkodon. Die Bestimmung des 5´-Endes eines Transkripts mit in silico vorhergesagter SD-Sequenz offenbarte, dass das Transkript keine 5´-UTR und somit auch keine SD-Sequenz besaß. Beide Ergebnisse machen deutlich, dass SD-Sequenzen eine noch viel geringere Rolle bei der haloarchaealen Translationsinitiation spielen, als anhand der Sequenz und UTR Analysen angenommen werden konnte.
5-lipoxygenase (5-LO) is the key enzyme in the formation of inflammatory leukotrienes, which are mediators of inflammation and allergy. The 5-LO catalyses the oxidation of arachidonic acid to 5-HPETE and subsequently to LTA4. The leukotrienes are involved in the development and maintenance of inflammatory diseases, like asthma and allergic rhinitis. Additionally, 5-LO is overexpressed in some cancer types, although its relevance is still not fully understood. 5-LO expressing cells are B- lymphocytes and cells of myeloid origin like monocytes, macrophages and granulocytes. The 5-LO promoter lacks a TATA or CCAT box and covers two CpG islands. These are characteristics of a housekeeping gene, but as the 5-LO is not expressed ubiquitiously, the expression of the 5-LO is tightly regulated. Epigenetic mechanisms were known to be involved in the control of the 5-LO expression. The HDAC inhibitor TsA significantly induced the transcriptional activity of the 5-LO promoter in reporter gene assays as well as on 5-LO mRNA transcript level in MM6 cells. The GC-boxes GC4 and GC5 in the proximal 5-LO promoter were identified to be essential for the TsA effect, as deletion of these element led to an attenuated TsA effect in reporter gene assay. Recruitment of the transcription factors Sp1 and Sp3 and the RNA polymerase II to the 5-LO promoter was detectable after TsA treatment in MM6 cells by chromatin immunoprecipitation assays (ChIP), while the acetylation status of histone H4 remained unchanged. Likewise it is known that DNA methylation leads to silencing of 5-LO expression in-vitro and in-vivo. The 5-LO promoter is densely methylated in the cell line U937, but unmethylated in HL-60 cells and - elucidated in this study - also in MM6 cells. Reporter gene assays with in-vitro methylated 5-LO promoter containing plasmids revealed that the frequency of methylated CpGs is directly proportional to reduction of 5-LO promoter activity. Incubation of U937 cells with 5-AdC, an inhibitor of DNA methyltransferases, was able to reactivate 5-LO transcription and to demethylate CpG dinucleotides. In the first part of this study the mechanism of TsA induced promoter activation was further investigated. I elucidated the mechanism of Sp1 and Sp3 recruitment to the 5-LO promoter after TsA treatment. Immnoprecipitation assay was used to detect a transcription factor complex containing Sp1 or Sp3 interacting with HDAC proteins, which might change its composition after TsA treatment. Besides the posttranslational modifications of the transcription factors Sp1 and Sp3 after TsA treatment were investigated, potentially causing an increased interaction of the proteins with the 5-LO promoter. Both aspects and their response in HDAC inhibition have been described. TsA did not affect the composition of the Sp1/HDAC1/HDAC2 complex. Sp3 was not located in a complex with the HDAC enzymes. Acetylation of Sp1 and Sp3 was detectable, but no change occurred after TsA treatment. Since neither release of the transcription factors off a complex, nor alterations in posttranslational modifications of Sp1 and Sp3 are the reason for the increased Sp1 and Sp3 binding to the 5-LO promoter, I elucidated alterations in the chromatin structure. The acetylation status of the histone proteins H3 and H4, as well as the chromatin marks H3K4me3, representing active chromatin, and H3K9me, representative for repressive state, were investigated. Additionally, the time course of the TsA effect was determined on 5-LO mRNA level using real-time PCR. The acetylation status of the histone proteins on the 5-LO core promoter correlated with the basal 5-LO mRNA transcript expression in MM6, HL-60 and U937 cells. The highest 5-LO mRNA level was detectable in MM6 cells, followed by HL-60 cells. The lowest 5-LO mRNA level was detected in 5-LO promoter methylated U937 cells. The order of the basal 5-LO mRNA expression of the three cell lines correlates with the basal acetylation status of histone proteins H3 and H4. In MM6 cells the highest basal levels in acH3 and acH4 were detected, followed by HL-60 and U937 cells. Moreover, the data obtained in U937 cells revealed that the correlation between DNA methylation and histone hypoacetylation is alike on the 5-LO promoter. TsA treatment induced the 5-LO mRNA level in the three cell lines with different intensity: 5-LO mRNA level in MM6 cells was induced 11-fold, in HL-60 cells 6- fold and in U937 cells 4- fold. The histone acetylation and methylation levels on the 5-LO promoter after TsA incubation were investigated. No increase in acH3 and acH4, but in H3K4me3 was detectable in MM6 cells by ChIP assay. HL-60 cells showed an increase in acH3 and acH4 as well as in H3K4me3. H3K9me was only detectable in untreated U937 cells, but disappeared after TsA treatment, while acH3, acH4 and H3K4me3 increased constantly after TsA treatme nt. A strong correlation between the histone modifications and the time course of the mRNA expression was detectable in all three cell lines. The combination of the posttranslational modifications acH3, acH4 and H3K4me3 led to a fast effect in transcriptional activation and the maxima of acH3 and acH4 were usually associated with the maximum in 5-LO mRNA transcript level. An increase in H3K4me3 alone, as detected in MM6 cells, led to continuous increase in the 5-LO mRNA expression with a late maximum. Additionally, we detected a slight overall decrease in 5-LO promoter methylation in U937 cells after TsA treatment. This fact taken together with the observed histone modifications could explain the 4- fold response in 5-LO mRNA level to TsA treatment of the methylated cell line U937. Another aim of the present study was to identify the specific HDAC enzymes involved in the 5-LO promoter regulation. Reporter gene assays and real-time PCR with selective HDAC inhibitors revealed that HDACs of class I are involved in 5-LO promoter regulation, namely HDAC 1, 2 and 3. The influence of each of the enzymes seemed to depend on the cell type, as inhibition of HDACs 2, 3 strongly induced 5-LO promoter activity in reporter gene assay in HeLa cells, whereas in MM6 cells HDACs 1 and 2, 3 seemed to be responsible for the 5-LO promoter regulation, measured as 5-LO mRNA level. The HDACs of class IIa and class III are not involved in the regulation of 5-LO mRNA expression. The second part of this study investigated the influence of MBD proteins on the methylated 5-LO promoter and the 5-LO mRNA expression. ChIP assays revealed MBD1, 2 and MeCP2 protein binding to the proximal 5-LO promoter in U937 cells. MBD1 was detectable on the 5-LO promoter in unmethylated HL-60 cells, while no MBD protein was located on the 5-LO promoter in MM6 cells. To elucidate the functional role of the MBD proteins, stable knocked down of MBD proteins was established in U937 cells. 5-LO mRNA transcript level was determined in the knock down clones by real-time PCR. The 5-LO transcript level was increased in all knock down samples. MBD2 knock down clones showed the highest effect in activating 5-LO with a 3- and 4.4-fold increase in the 5-LO mRNA level, followed by MBD1 (3.5- fold) and MeCP2 (2.5-fold) knock down clones. A combined participation of these three enzymes in the corepression of the methylated 5-LO promoter is indicated. Taken together, the data reveal that epigenetic mechanisms are strongly involved in the regulation of 5-LO transcription and might function as a crucial control mechanism of 5-LO expression.
Die Aufrechterhaltung des physiologischen Gleichgewichtes in einem mehrzelligen Organismus erfordert Mechanismen, welche die Balance zwischen der Toleranz gegenüber Selbst-Antigenen und der Auslösung einer Immunantwort ermöglichen. Diese Mechanismen werden unter dem Begriff periphere Toleranz zusammengefasst. Regulatorische T-Zellen (Treg) sind eine T-Zell-Subpopulation, die für periphere Toleranz und Homöostase des Immunsystems von großer Bedeutung sind (Powrie et al., 2003). Durch ihre suppressiven Eigenschaften sind Treg in der Lage, die Proliferation von konventionellen T-Zellen (Tcon) sowohl in vivo als auch in vitro zu hemmen und so eine Immunantwort von autoreaktiven TZellen einzudämmen. Für die Hemmung von Tcon in vitro wird der direkte Zellkontakt zwischen Treg und Tcon benötigt (Thornton und Shevach, 1998). Der molekulare Mechanismus humaner Treg ist bislang jedoch nur unzureichend geklärt. In der hier vorgestellten Forschungsarbeit wurden TZR-abhängige Signaltransduktionskaskaden analysiert, um den molekularen Mechanismus humaner Treg sowohl auf Ebene der Treg als auch auf Ebene der gehemmten Tcon zu entschlüsseln. Hierzu wurden im Rahmen der hier beschriebenen Experimente in unserer Abteilung die ex vivo Isolation und die in vitro Expansion humaner Treg etabliert. Mit Hilfe sensitiver Analysemethoden der TZR-abhängigen Signaltransduktionskaskaden konnte für humane Treg gezeigt werden, dass sie nach Stimulation über ihren TZR einen geringeren Ca2+-Einstrom im Vergleich zu dem in Tcon aufweisen. Ein weiteres Ergebnis der hier vorliegenden Arbeit ist, dass Treg im Zuge ihrer Aktivierung eine geringere Phosphorylierung einiger, für die TZR-induzierte-Signalkaskade relevante Signalmoleküle wie ERK1/2 und p38MAPK aufweisen. Für gehemmte Tcon aus der Kokultur mit humanen Treg wurde in dieser Forschungsarbeit ein zu Kontroll-Tcon vergleichbarer Ca2+-Einstrom detektiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen außerdem, dass Tcon aus der Kokultur mit Treg eine verringerte Phosphorylierung der Signalmoleküle ERK1/2 und p38MAPK aufweisen. Die hier veröffentlichten Ergebnisse ermöglichen einen ersten Einblick in die molekulare Signaltransduktion von humanen Treg und zum ersten Mal auch in die von gehemmten Tcon. Dieses Verständnis stellt eine Grundlage für weitere Experimente dar und ermöglicht einen Schritt in Richtung der vollständigen Entschlüsselung des molekularen Mechanismus humaner Treg, die eine Voraussetzung für den therapeutischen Einsatz dieser Zellen ist. Eine weitere Zielsetzung dieser Arbeit war es, den Einfluss apoptotischer Zellen auf die Immunantwort zu untersuchen. Für die Gewebehomöostase mehrzelliger Organismen ist die effiziente und immunologisch unauffällige Eliminierung apoptotischer Zellen unabdingbar (Fadok et al., 1998; Lauber et al., 2004; Skoberne et al., 2005; Steinman und Nussenzweig, 2002). Im Rahmen der hier erläuterten Experimente wurden in vitro Studien durchgeführt, die einen inhibierenden Effekt apoptotischer Zellen auf die Reifung humaner dendritischer Zellen zeigen. Es konnte bestätigt werden, dass dendritische Zellen nach Phagozytose apoptotischer Zellen weniger proinflammatorische Moleküle sekretieren und eine geringere Oberflächenexpression kostimulatorischer Moleküle aufweisen. Nach Etablierung zweier in vitro Modellsysteme wurde in weiteren Experimenten gezeigt, dass T-Zellen durch dendritische Zellen, die zuvor apoptotische Zellen aufgenommen haben, eine geringere Stimulation erfahren. Diese Ergebnisse deuten auf einen anti-stimulatorischen Effekt dendritischer Zellen, die zuvor apoptotische Zellen aufgenommen haben hin, und sie bilden die Basis für eine anschließende in vitro Analyse der molekularen Auswirkungen auf dendritische Zellen und T-Zellen.
Die Chemoresistenz von Tumoren ist ein schwerwiegendes Problem in der Krebstherapie. Insbesondere das maligne Melanom gilt aufgrund seiner ausgeprägten Therapieresistenz als nahezu unheilbar. Ein erster Schritt zur Verbesserung der Chemotherapie von Tumoren ist das Verständnis von Mechanismen, die der Resistenz zugrunde liegen. Für die Aufklärung der Mechanismen ist die Molekularbiologie des chemoresistenten Phänotyps von großem Interesse. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Veränderungen im Transkriptionsmuster analysiert, die mit dem Erwerb von Chemoresistenz in Melanomzellinien einhergehen. Die Melanomzellinie MeWo wurde mit Abkömmlingen, die erworbene Resistenz gegen die DNA-schädigenden Agenzien Etoposid (MeWoEto1), Cisplatin (MeWoCis1) und Fotemustin (MeWoFote40) aufweisen, bezüglich ihres Transkriptionsmusters verglichen. Um zunächst eine möglichst große Anzahl von Genen in die Analyse einzubeziehen, wurden initiale Genexpressionsanalysen unter Verwendung des RZPD UniGene 1 Arrays durchgeführt. Dieses Array repräsentiert ca. 31.500 cDNA Sequenzen, die bei einer geschätzten Redundanz von 1,44 einer Anzahl von 21.875 verschiedenen Transkripten entsprechen. Geht man davon aus, dass der Mensch insgesamt über ca. 30.000 Gene verfügt, wurde durch die Verwendung dieses Arrays ein großer Teil aller humanen Gene untersucht. Unter definierten Selektionskriterien wurden 126 Gene ausgewählt, die als im chemoresistenten Phänotyp differentiell exprimiert angesehen wurden. Diese 126 Gene wurden mit 1.143 weiteren tumorassoziierten Genen für die Zusammenstellung und Produktion eines chemoresistenzspezifischen Kandidatengen-Arrays ausgewählt. In verifizierenden Analysen unter Verwendung des Kandidatengen-Arrays wurde eine differentielle Expression für 57 der initial selektierten Gene sowie für weitere 209 tumorassoziierte Gene festgestellt. Die in diesen Analysen angewandten Kriterien für die Definition differentieller Genexpression wurden in exemplarischen Northernblot-Analysen geprüft. Hier zeigte sich eine qualitative Übereinstimmung der Ergebnisse beider Methoden von 81,4%. Da zur Zeit noch keine Hochdurchsatz-Methoden für funktionelle Analysen zur Verfügung stehen, wurde versucht, den Kreis vielversprechender Kandidaten durch eine Integration von Ergebnissen anderer Experimente einzuengen. In Clusteranalysen zur Untersuchung von Verwandtschaftsgraden zwischen den resistenten Zellpopulationen zeigte die MeWoEto1-Zellinie eine vergleichsweise hohe Stabilität in ihrem Genexpressionsmuster über einen Zeitraum von ca. 2,5 Jahren, während MeWoCis1 und MeWoFote40 hier beträchtliche Schwankungen aufwiesen. Die Expressionsmuster der letzteren resistenten Linien zeigten zum spätesten analysierten Zeitpunkt Konvergenz, nachdem sie zunächst deutlich voneinander abwichen. Da die Wirkung sowohl von Cisplatin als auch von Fotemustin zur Bildung von DNA-Addukten führt, kann die Konvergenz als Ergebnis einer fortschreitenden Optimierung der Resistenz in beiden Linien gedeutet werden. Einzelne Gene wie z.B. PEPP2 und CRYAB, die konvergierend differentielle Expression zeigten, können demnach als vielversprechende Kandidaten für eine funktionelle Relevanz in der Resistenz gegen Cisplatin und Fotemustin betrachtet werden. Neben der Clusteranalyse wurden Ergebnisse von vergleichenden genomischen Hybridisierungen (CGH), der Untersuchung einer Deregulation von Kandidatengenen in mehreren der resistenten Linien oder nach Kurzzeitbehandlung von MeWo-Zellen mit den Zytostatika sowie Literaturdaten verwendet, um die Relevanz der differentiellen Expression für einzelne Gene zu validieren. Danach wurden unter anderen die apoptoserelevanten Gene CRYAB und STK17A sowie MPP1, AHCYL1, CYR61 und STMN3 als vielversprechende Kandidaten eingestuft. Ein weiteres bis dahin unbekanntes Gen aus der C2H2-Zinkfinger-Genfamilie, für das in initialen Analysen sowie in Northernblot und RT-PCR-Experimenten eine Überexpression in MeWoCis1 und MeWoEto1 nachgewiesen werden konnte, wurde bezüglich seiner mRNA-Sequenz vervollständigt und im Detail analysiert. Für dieses Gen konnte phänotyp- bzw. gewebespezifisches differentielles Spleissen sowie differentielle Polyadenylierung nachgewiesen werden. Das alternative Spleissen von Exon 3, dem aufgrund seiner ausgeprägten Homologie zu bereits charakterisierten KRAB A Domänen die Funktion der transkriptionalen Repression zugewiesen werden kann, könnte für ein phänotypspezifisches Transkriptionsprogramm verantwortlich sein. Ausgehend von insgesamt 267 differentiell exprimierten Genen konnte der Kreis vielversprechender Kandidaten durch die Integration von Daten aus anderen Experimenten auf ca. 20 Gene eingeengt werden. Unmittelbar im Anschluss and die Dissertation werden diese Gene in funktionellen Analysen bezüglich ihrer Relevanz für den chemoresistenten Phänotyp analysiert.
Die Ergebnisse der vorliegenden Dissertation beleuchten neue Aspekte der pflanzlichen Hitzestressantwort. Die Ergebnisse der experimentellen Arbeiten können erheblich die Planung und Durchführung zukünftiger Untersuchungen erleichtern, sowie das Verständnis der Regulation von Hitzestresstranskriptionsfaktoren als terminale Komponenten der zellulären Stressantwort verbessern. Zum ersten Mal wurde die Interaktion zwischen einem Hitzestresstranskriptionsfaktor und einem cytoplasmatischen Hitzestressprotein der Hsp20 Familie nachgewiesen. Die Aktivität des LpHsfA2 hängt von zahlreichen Faktoren ab, die den zellulären Zustand während und nach der Stressperiode widerspiegeln. Der bisher am besten verstandene Regulationsmechanismus, das Verhältnis des Kernimports im Vergleich zum Kernexport, welches stark durch die Heteroligomerisierung mit HsfA1 beeinflusst wird, wird durch den Einfluss von Hsp17.4-CII auf den Aggregationszustand und die Aktivität von HsfA2 erweitert. Nach massiver Akkumulierung von HsfA2 unter Hitzestressbedingungen führt die spezifische Interaktion mit Hsp17.4-CII zu einer reversiblen Inaktivierung des Transkriptionsfaktors und zu einer Bindung in hochmolekularen Komplexen. Die Interaktion ist hochspezifisch. Die nur durch wenige AS-Austausche charakterisierte Isoform Hsp17.3-CII bindet LpHsfA2 nicht. Im Gegensatz dazu ist der solubilisierende Einfluss der Hitzestressproteine der Klasse CI klassen-, nicht aber speziesspezifisch. Das Wechselspiel aus Inaktivierung durch Bindung an Hsp17.4-CII und anschliessende Resolubilisierung durch Hsp17-CI, sowie Kernimport nach erfolger Heterooligomerisierung mit HsfA1, führt zu einer fein abgestimmten Regulation der zellulären Lokalisation von HsfA2 und somit auch zur Modulation seiner Funktion als Transkriptionsaktivator. Die in der Arbeit gewählten experimentellen Bedingungen bewirken eine Aggregation von HsfA2 auch unter Kontrollbedingungen und ähneln der Situation in einer Pflanzenzelle während der Erholungsphase nur teilweise. In vivo wird der massiven Aggregation von HsfA2 und Hsp17.4-CII durch den Einfluss von HsfA1 und Hsp17-CI entgegengewirkt. Die gefundene in vitro Situation bietet somit ein wertvolles experimentelles Artefakt, um die Wechselwirkungen der Proteine während der Erholungsphase der Pflanze zu untersuchen und verstehen zu lernen. Aufgrund verschiedener experimenteller Hinweise kann davon ausgegangen werden, dass es sich bei der gezeigten spezifischen Interaktion nicht um ein auf die Gattung Lycopersicon beschränktes Phänomen handelt. In ersten Experimenten konnten Hinweise auf einen ähnlichen Regulationsmechanismus in A. thaliana gefunden werden (spezifische Interaktion zwischen AtHsfA2 und AtHsp17.7-CII). Allerdings zeigen die Ergebnisse der Experimente, in denen Proteine aus A. thaliana untersucht wurden, Abweichungen zu dem für die Tomatenproteine erarbeiteten Bild. Weitere Untersuchungen an Arabidopsis müssen hierzu durchgeführt werden, um Klarheit über den grundlegenden Regulationsmechanismus sowie speziesspezifische Besonderheiten zu bringen. Das aus den experimentellen Befunden resultierende Bild zeigt thermotolerante Tomatenzellen, in denen LpHsfA2 in einer transkriptionel inaktiven Form durch Bindung mit löslichem Hsp17.4- CII in Gegenwart von Hsp17-CI stabilisiert wird. Der Transkriptionsfaktor ist in diesem Zustand bereit für eine rasche Reaktivierung bei einem wiederkehrenden Hitzestress. Auch wenn mittlerweile die vier wichtigsten Regulatoren dieses Netzwerkes identifiziert werden konnten (LpHsfA1, LpHsfA2, LpHsp17.4-CII und LpHsp17-CI), kann nicht ausgeschlossen werden, dass weitere Faktoren beteiligt sind. Die Identifizierung solcher Faktoren, sowie weiterführende Arbeiten an Tomatenzellen, zum Beispiel durch Ausschalten einzelner Faktoren mit Hilfe von RNAi Konstrukten, wird in Zukunft helfen, noch mehr Details dieses interessanten Phänomens zu klären. Trotz der sehr guten Kenntnis der molekularen Eigenschaften der 21 AtHsf in Bezug auf ihre funktionellen Domänen wird erst das Verständnis der Art und Weise, wie diese Moleküle miteinander oder mit Co-Regulatoren interagieren und wie sie in die zellulären Regulationsnetzwerke eingebunden sind, zu einem Gesamtbild der Funktion der Hitzestresstranskriptionsfaktoren führen. Insbesondere gilt dies, seit die Analyse der Transkritionsprofile der AtHsf mit Hilfe von Micro-Array Analysen gezeigt haben, dass die Aufgaben der Hsf weit über die Regulation der Hitzestressantwort hinausgehen könnten. So könnten einige Vertreter der Hsf eine Rolle in der Pathogenabwehr spielen, bzw. im Laufe der Evolution ausschließlich entwicklungsspezifische Funktionen übernommen haben. Um die geschilderte Fragestellung effektiv zu bearbeiten, wurde in dieser Arbeit das Hefe-Zwei-Hybridsystem zur Charakterisierung der Interaktionseigenschaften der 21 AtHsf eingesetzt. Die zeitsparende Bearbeitung vieler Proben war hierbei ein Kernziel, das erfolgreich bearbeitet werden konnte: Die etablierte Hochdurchsatzmethode kann zukünftige Untersuchungen von Protein-Protein-Interaktionen stark beschleunigen. Die standardisierte Verwendung von Mikrotiterplatten und Mehrkanalpipetten in Kombination mit den etablierten Tranformations-, Analyse und PCR-Verfahren macht eine Bearbeitung großer Probenmengen möglich. Die Synthese dieser Technik mit der Kenntniss des gesamten Genoms von A. thaliana sowie der Fülle an Transkriptionsdaten einzelner Gene unter verschiedenen Umgebungsbedingungen stellt zukünftigen Untersuchungen ein potentes Instrumentarium ganz allgemeiner Art zur Verfügung. Im vorliegenden Fall wurde die etablierte YTH Methode dazu verwendet, Erkenntnisse über das Interaktionsverhalten der AtHsf untereinander zu gewinnen. Die Zusammenfassung aller auftretenden Interaktionen liefert für einige Gruppen von Hsf interessante Einsichten. In vielen Fällen (z.B. AtHsfA4/A5; AtHsfA1/A9) konnte für Vertreter eine Interaktion gezeigt werden, für die bereits physiologische Zusammenhänge bekannt sind. Das erstellte Interaktom kann dazu dienen, bereits bekannte Hsf-Hsf Interaktionen durch einen weiteren experimentellen Befund zu belegen, sowie bisher unbekannte Verbindungen aufzudecken. Zur Identifizierung unbekannter Interaktionspartner mussten zunächst geeignete Bibliotheken hergestellt werden. Mit Hilfe dieser Bibliotheken konnten zahlreiche putative Interaktionspartner identifiziert und durch das Interaktom bereits bekannte Interaktionspartner für fast alle Köder in den Bibliotheken gefunden werden. Dies bestätigt sowohl die gute Abdeckung der mRNA Population der Zellen, aus denen die Bibliotheken gewonnen wurden, als auch die Reproduzierbarkeit und Funktionalität des YTH Screenings. Die Tatsache, dass in der Population der putativen Interaktionspartner für AtHsf gehäuft Transkriptionsfaktoren auftreten, lässt auf die Art der Vernetzung der AtHsf in den Proteinnetzwerken schließen: Die Regulation der Zielgene erfolgt möglicherweise bevorzugt durch eine direkte Wechselwirkung von Transkriptionsfaktoren verschiedener Familien. Neben der Etablierung der Methoden zur beschleunigten Untersuchung zahlreicher Proben stellte auch die Standardisierung der experimentellen Folgeschritte einen wichtigen Aspekt dar, um eine reproduzierbare Aussage über die Relevanz einer Interaktion treffen zu können. Interessante Ansatzpunkte, sowie Vorschläge für weiterführende experimentelle Arbeiten sollen im Folgenden für die wichtigsten Klone thesenartig dargestellt werden: Ein möglicher Co-Regulator für AtHsfA5 Das mit Hilfe der AtHsfA5-CTD identifizierte unbekannte Protein, codiert durch den Lokus At5g01370, bietet einen Ansatzpunkt für eine gezielte Untersuchung der Rolle und Regulation des AtHsfA5. Die spezifische Interaktion zwischen HsfA5 und HsfA4, die sowohl in A. thaliana als auch in Tomate existiert, sowie das auffällige Fehlen einer hemmenden Aktivität von AtHsfA5 auf HsfA4 an den bisher untersuchten Reporterkonstrukten in Pflanzenzellen, zeichnen diesen TF als einen besonders interessanten Vertreter der AtHsf aus. Es muss wegen der Pflanzenspezifität des Hemmeffektes über die Existenz eines HsfA5 spezifischen Co-Repressors nachgedacht werden. In diesem Zusammenhang kann die Analyse des identifizierten Proteins helfen, einen solchen Regulator zu charakterisieren. Die im Rahmen dieser Arbeit dokumentierten Ergebnisse legen nahe, dass das von At5g01370 codierte Protein mit der NLS-Region von AtHsfA5 interagiert. Da die entscheidenden Experimente bisher nur in Hefe durchgeführt wurden, steht eine Reproduktion in einem pflanzlichen Expressionssystem für weiterführende Arbeiten im Vordergrund. Die Versuche, die Transkriptionseigenschaften von AtHsfA5 durch Co-Expression des unbekannten Proteins oder Co-Transformation eines RNAi induzierenden Plasmides zu beeinflussen, sind bisher mangels Kenntnis der Zielgene von AtHsfA5 fehlgeschlagen. Weitere Schritte bei der Bearbeitung dieser Fragestellung müssen demnach die Suche nach einem geeigneten Testsystem, sowie die experimentelle Bestätigung einer Interaktion beider Proteine in planta sein. Im Rahmen der Promotion wurde der Lokus des identifizierten Gens auf das Vorhandensein einer T-DNA Insertion hin überprüft. Eine entsprechende Linie existiert nicht, so dass transgene Pflanzen durch Transformation von Überexpressions- oder RNAi-Kassetten hergestellt werden müssten. Es ist nicht auszuschließen, dass schon die Deletion einer der beiden chromosomalen Kopien des Gens zu einem lethalen Phänotyp führt und daher keine T-DNA Insertionslinien existieren. In diesem Fall kann möglicherweise der Phänotyp einer Überexpressionspflanze Aufschlüsse über einen Zusammenhang der Funktion des unbekannten Proteins und der Rolle des AtHsfA5 liefern. AtHsfB2a interagiert mit AtDLC8 (At3g15930) Die Interaktion des Dynein Leichte Kette 8 Proteins (DLC8) mit AtHsfB2a bietet ebenfalls Ansätze für weitere Untersuchungen. Durch die mit Hilfe des Interaktoms identifizierte spezifische Interaktion zwischen AtHsfB2a und HsfB2b hebt sich diese Subgruppe der Klasse B der AtHsf von den übrigen Vertretern ab. Die im Ergebnisteil beschriebenen Befunde, vornehmlich aus Experimenten mit Säugersystemen, deuten eine regulatorische Rolle für DLC Proteine allgemein an (zum Beispiel beschrieben für die Interaktion zwischen dem TF Bim aus der Bcl2 Familie und DLC8 (Day et al., 2004)). Eine detaillierte Charakterisierung der im YTH gefundenen Interaktion zwischen DLC8 und AtHsfB2a könnte eine pflanzenspezifische, regulatorische Funktion der DLC Proteine zeigen, die losgelöst von den Transportfunktionen des Dynein Komplexes existiert. Das Fehlen geeigneter Reportersysteme für AHsfB2a stellt in diesem Zusammenhang ein großes Problem dar. Auch für den Lokus At3g15930 existieren keine TDNA Linien, obwohl der gesamte umgebende chromosomale Kontext zahlreiche Insertionen aufweist. Die Herstellung und Kultivierung von Überexpressions- oder „knock down“ Pflanzen für das DLC8 Protein muss zeigen, ob dieses in Verbindung mit HsfB2a essentielle Aufgaben während der Entwicklung bzw. bei der Stressabwehr von A. thaliana übernimmt. Interaktion von AtHsfA9 mit AtDr1 (At5g23090) Der mit Hilfe von AtHsfA9 identifizierte Klon AtDr1 stellt möglicherweise eine Verbindung zwischen den AtHsf und einem sehr allgemeinen Regulationsmechanismus in Pflanzen dar, über den bisher nur sehr wenig bekannt ist. Die meisten Repressoren, die aus nicht-pflanzlichen Systemen beschrieben wurden, üben ihre Funktion genspezifisch aus, d.h. sie binden entweder Promoter-spezifisch an die entsprechenden Zielgene oder an spezifische Bindungspartner. Einer der wenigen Repressoren, die eine generelle Funktion ausüben, ist Dr1. In Säugerzellen zum Beispiel verringert Dr1 die generelle Effektivität der RNA-Polymerase II. Da kürzlich die Existenz und Funktionalität der pflanzlichen Homologe von Dr1 in Reis bewiesen wurde, bietet die nun gefundene Verbindung mit der Gruppe der AtHsf einen viel versprechenden Ansatzpunkt. Allerdings war es im Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht möglich, mit Hilfe geeigneter Reportersysteme eine Repression von Promotoren durch Dr1 zu zeigen. Die Etablierung eines solchen Systems (auch endogener chromosomaler Reportersysteme) steht daher im Vordergrund weiterer Untersuchungen. Im Rahmen der Arbeit konnten transgene T-DNA Insertionslinien des Lokus At5g23090 charakterisiert werden, sie liegen für weitere Untersuchungen bereit. Allen voran steht die Analyse des Transkriptionsniveaus verschiedener Zielgene in Wildtyppflanzen sowie in den beschriebenen Mutanten. Weitere Schritte sind die Herstellung und Analyse transgener Pflanzen, die veränderte Mengen an Dr1 und AtHsfA9 aufweisen. Neben der Identifizierung der Vernetzungen der AtHsf mit Dr1 als einem generellen Regulator der Genexpression kann eventuell auch die molekulare Wirkungsweise des Dr1 Repressors in Pflanzen mit Hilfe solcher Experimente entschlüsselt werden. AtHsfB1 interagiert mit AtbZip44 (At1g75390) Die aus den durchgeführten YTH Screenings resultierende wahrscheinlich wichtigste Vernetzung der AtHsf mit bisher unbekannten Co-Regulatoren stellt das Zusammenspiel der Hsf mit den bZip Transkriptionsfaktoren da. Die Kombination des inaktiven HsfB1 mit AtbZip44 führt zu einer verstärkten Aktivierung von Zielgenen, zu denen auch die Gene von HsfA3 und HsfC1 gehören. Obwohl eine direkte Interaktion beider Transkriptionsfaktoren für die synergistische Aktivierung nicht stattfindet, deutet die am Promoter von AtHsfC1 und AtHsfA3 gefundene Konstellation eine bisher unbekannte Rolle für AtHsfB1 an, die von der kürzlich beschriebenen Rolle von LpHsfB1 in Tomatenzellen abweicht. Die gefundenen experimentellen Ergebnisse lassen folgende Hypothese zu: AtHsfB1, der sowohl in Wurzel- als auch in Sprossgewebe unter zahlreichen Stressbedingungen induziert wird, bindet an Promotoren und besetzt dort spezifische Bindestellen, die klassischen HSE. Aufgrund fehlender Aktivatormotive führt diese Bindung zu keiner Aktivierung der Zielgene. Die Promotoren befinden sich jedoch nun in einem Zustand, in dem die Bindung weiterer Aktivatoren, im beschriebenen Fall AtbZip44, zu einer raschen und starken Aktivierung des Gens führt. Durch das Zusammenwirken von zwei unabhängig voneinander bindenden Transkriptionsfaktoren könnte ein erhöhtes Maß an Flexibilität und Sensitivität der Genregulation erreicht werden. Auch eine generelle induzierte Toleranz gegenüber Stress könnte durch die differentielle Expression von AtHsfB1 und weiteren Faktoren erklärt werden. In diesem Fall würde HsfB1 auch nach Beendigung eines Stresszustandes noch an den Promotoren wichtiger Zielgene gebunden bleiben, ohne diese unnötig zu aktivieren. Bei Wiederkehren der Stresssituation wäre eine rasche Reaktivierung durch Synergismen mit kurzlebigen, potenten Aktivatoren, wie zum Beispiel AtbZip44, möglich. Durch die Wechselwirkung von AtHsfB1 mit Vertretern verschiedener Familien von Transkriptionsfaktoren, möglicherweise auch Repressoren, kann so eine Vielzahl von Zielgenen reguliert werden. Die weitere Untersuchung des AtbZip44 erscheint aus zwei Gründen besonders lohnend: (1) AtbZip44 beeinflusst die Synthese der AS Prolin. Prolin stellt ein weit verbreitetes Osmolyt dar, welches als Hydroxyl-Radikal-Fänger fungiert, Plasmamembranen unter Stressbedingungen schützt sowie die Toleranz von Pflanzen gegenüber Frost und Hochsalzbedingungen erhöht. (2) Für AtHsfA5 wurde eine direkte Interaktion mit AtbZip44 in vitro gezeigt. Ob ein Komplex zwischen AtHsfA5 und AtbZip44 eine Transkription an geeigneten Reportern bewirkt, ist allerdings noch offen, und muss durch geeignete Experimente gezeigt werden. Neben umfangreichen Screeningarbeiten, der basalen Charakterisierung aller interessanten Klone und der Detailcharakterisierung der Interaktion zwischen AtHsfB1 und AtbZip44 konnten zusätzlich erste Vorarbeiten mit transgenen Pflanzen für die interessantesten Kandidaten durchgeführt werden. Als Ergebnis der Arbeit stehen somit einige vielversprechende Ansatzpunkte für weitere Studien zur Verfügung, ebenso die standardisierte Technik und die notwendigen konservierten Bibliotheken, um in kurzer Zeit Screenings mit weiteren Köderproteinen durchzuführen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit tragen dazu bei, zukünftige Experimente besser zu planen, sowie die Rolle der Hsf als terminale Komponenten der pflanzlichen Stressantwort weiter zu entschlüsseln und zu verstehen. Die Entschlüsselung der Funktion aller Proteine eines Gesamtorganismus, deren posttranslationale Modifizierungen, die Möglichkeit stabiler sowie transienter Interaktionen mit anderen Proteinen und somit die Vernetzung aller Proteine zu einem Gesamtnetzwerk stellt die große Herausforderung des Zeitalters der „proteomics“ dar. Verliefen während der Entschlüsselung der Genome von Organismen die Informationen auf Nukleinsäureebene noch linear, so dass mit Hilfe eines hohen Automatisierungsgrades ein rascher Fortschritt erzielt werden konnte, so erfordert die so genannte „post-genomics“ Ära hohe finanzielle und personelle Investitionen. Die Nicht-Linearität der Proteinfunktionen, die durch Modifikationen und Wechslwirkungen beeinflusst werden, hat rasch gezeigt, dass ein komplexer Organismus nicht lediglich durch die Kenntnis der Summe seiner Gene verstanden werden kann. Das Zeitalter der „proteomics“ erfordert trotz potenter Hochdurchsatzmethoden und weit fortgeschrittener Computeranalysen mehr denn je ausgefeilte Testmethoden und eine individuelle Untersuchung einzelner Proteine und deren Wechselwirkungen, um schließlich die Kernfrage der Biologie, wie Leben funktioniert, beantworten zu können.
Der metabotrope Glutamatrezeptor Untertyp 4 gehört zusammen mit den Untertypen 6, 7 und 8 zur Gruppe III der metabotropen Glutamatrezeptoren (mGluRs). Diese präsynaptisch lokalisierten Rezeptoren sind an der Regulation der Neurotransmission an glutamatergen und nicht-glutamatergen Synapsen beteiligt. In der vorliegenden Arbeit sollten bisher unbekannte intrazelluläre Interaktionspartner für den metabotropen Glutamatrezeptor Untertyp 4 (mGluR4) identifiziert werden, um neue Erkenntnisse zur Regulation und Funktion dieses Rezeptors zu gewinnen. Dazu wurden Bindungsstudien mit Fusionsprotein aus Glutathion-S-Transferase (GST) und der kompletten C-terminalen Domäne des mGluR4 (mGluR4-C) durchgeführt. Die gebundenen Proteine wurden auf silbergefärbten SDS-Polyacrylamidgelen analysiert und anschließend über MALDI-TOF-Massenspektrometrie und Datenbank-gestützte Computerprogramme identifiziert. Außerdem wurden in Zusammenarbeit mit Dr. John Caldwell Proteine über Tandemmassenspektrometrie identifiziert. Mit diesem Ansatz konnten zwölf potentielle mGluR4-Interaktionspartner identifiziert werden. Die Bindung an mGluR4 konnte für drei dieser Proteine durch Immunoblotanalyse mit spezifischen Antikörpern bestätigt werden: für das Mikrotubuli-assoziierte Protein 1B (MAP1B), das stable tubule-only polypeptide protein (STOP-Protein) und, in geringerem Ausmaß, für die schwere Kette des nicht-muskulären Myosin II-B (MHCIIB). Die Interaktion zwischen mGluR4 und MAP1B wurde im folgenden näher charakterisiert. Bindungsstudien mit GST-Fusionsproteinen zeigten, daß MAP1B auch an die C-terminalen Domänen von mGluR6, mGluR7 und mGluR8 und damit an alle mGluRs der Gruppe III bindet. Für die mGluRs der Gruppe II konnte keine Interaktion mit MAP1B belegt werden. Weitere Bindungsstudien mit Deletionsmutanten konnten die für die MAP1B-Bindung verantwortliche Binderegion auf die 24 bzw. 38 N-terminalen Aminosäuren der C-terminalen Domänen von mGluR7 bzw. mGluR8 eingrenzen. Es wurde gezeigt, daß das Ca2+-abhängig an dieselbe Rezeptorregion bindende Calmodulin mit MAP1B um die Bindung an mGluR4 konkurriert. Immuncytochemische Experimente konnten eine partielle Kolokalisation von MAP1B und mGluR4 in transfizierten Säugetierzellen nachweisen. In kultivierten Primärneuronen konnte eine partielle Kolokalisation von endogenem mGluR4 mit endogenem MAP1B gezeigt werden. Die teilweise Überlappung der Immunreaktivitäten von mGluR4 und MAP1B läßt darauf schließen, daß eine Interaktion der beiden Proteine auch unter physiologischen Bedingungen möglich ist.
Identifizierung und Charakterisierung neuartiger 5-Lipoxygenase-Inhibitoren – in silico und in vitro
(2009)
Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung und Charakterisierung neuer potenter 5-LO-Inhibitoren unter Verwendung sowohl computergestützter als auch experimenteller Methoden. Ausgangspunkt war ein ligandenbasiertes virtuelles Screening unter Verwendung der ladungsbasierten Deskriptoren Charge 3D und TripleCharge3D. Hierbei konnten zwei neue direkte 5-LO-Inhibitoren identifiziert werden. Jede dieser beiden Substanzen diente als Startpunkt weiterer virtueller Screenings mit dem Ziel, die Potenz der Substanzen zu verbessern bzw. eine SAR der Substanzklasse zu erhalten. Dabei zeigte sich für die Klasse der Thiazolinone, dass eine hohe Toleranz gegenüber unterschiedlichen Substituenten am Grundgerüst bezüglich der Auswirkung auf die Aktivität vorliegt: insbesondere werden relativ große Substituenten toleriert. Des Weiteren scheint der 2-Phenylsubstituent für die 5-LO-inhibitorische Aktivität essentiell zu sein, da Derivate, die einen Heterozyklus an dieser Position aufweisen, inaktiv sind. Eines der aktivsten Derivate dieser Klasse, C06 (Substanz 12), konnte weiter molekular-pharmakologisch charakterisiert werden. Die Substanz zeigt keine offensichtlichen zytotoxischen Effekte, ist unabhängig vom Stimulus der 5-LO-Aktivierung und zeigt nanomolare inhibitorische Aktivität sowohl in intakten PMNL (IC50-Wert 0,65 =M) als auch in PMNL-Homogenaten (IC50-Wert 0,66 =M) sowie in zellfreiem PMNL-S100 (IC50-Wert 0,26 =M) und am gereinigten Enzym (IC50-Wert 0,3 =M). C06 ist selektiv für die 5-LO, da andere arachidonsäurebindende Proteine (PPARs, cPLA2 und 12- und 15-LO) nicht beeinflusst werden. Auch Nager-5-LO (aus der Ratte und der Maus) wird inhibiert mit IC50-Werten im nanomolaren Bereich. Allerdings zeigte sich die Substanz inaktiv in einem menschlichen Vollblutassay in Gegenwart von Serum. C06 scheint nicht an die für die Interaktion der 5-LO mit der Membran verantwortliche C2-ähnliche Domäne der 5-LO zu binden. Ebenso hat der Membranbestandteil Phosphatidylcholin keinen bzw. nur geringen Einfluss auf das inhibitorische Potential von C06. Aktivitätstests mit steigender Substratkonzentration deuten auf einen allosterischen Bindemodus von C06 hin. Diese experimentellen Daten flossen in die Identifizierung des putativen putativen Bindemodus an der 5-LO ein. Hierzu wurde zunächst ein Homologie- Modell der 5-LO unter Verwendung der kürzlich neu veröffentlichten Daten der Röntgenkristallstruktur der Kaninchen-15-LO (PDB-Code: 2p0m [Choi et al., 2008]) erstellt. Durch eine Bindetaschenvorhersage mit dem Programm PocketPicker und einer pseudorezptorbasierten Auswahl der potentiellen Bindetasche mit anschliessendem Liganden-Docking konnten zwei Bindebereiche postuliert werden, beide an einer Oberflächenbindetasche der 5-LO ausserhalb des aktiven Zentrums. .....
Der Einfluss von Stress auf einen Organismus führt zur Expression molekularer Chaperone unterschiedlichster Hitzestressprotein-(Hsp)-Familien, die die Zellen vor stressbedingten Schäden schützen. Mitglieder der Hsp2O-Familie (kurz small Hsps, sHsps) besitzen ein Molekulargewicht von 12-43 kDa und sind durch einen zentralen, evolutiv konservierten Bereich, der als alpha-Crystallin-Domäne (ACD) bezeichnet wird, gekennzeichnet. Diese besteht größtenteils aus beta-Strängen, während die flankierenden Bereiche hingegen variabel in Länge, Sequenz sowie Sekundärstrukturen sind. sHsps bilden mit Hilfe der Sekundärstrukturen oligomere Komplexe aus. Darüber hinaus besitzen sie eine ATP-unabhängige Chaperonaktivität und spielen beim Schutz thermosensitiver Proteine eine wichtige Rolle. In Pflanzenzellen führt ein anhaltender Hitzestress zur Ansammlung von sHsps zu so genannten Hitzestressgranula (HSGs), die sich wiederum zu größeren HSG-Komplexen (HSCs) organisieren. Eine mögliche Funktion von HSCs ist der Schutz zellulärer denaturierter Proteine vor einer irreversiblen Aggregation. Durch deren Bindung mittels sHsps und Eingliederung in den HSC-Verband werden die denaturierten Proteine in einem faltungskompetenten Zustand gehalten. Schließlich können die mit den HSCs assoziierten ATP-abhängigen Hsp-Maschinen (z.B. Hsp70/40, Hsp100) die sHsp-gebundenen Substrate renaturieren. Wie in der vorliegenden Arbeit dargestellt, weisen Pflanzen die höchste soweit bekannte Anzahl von sHsp-Genen auf. Die korrespondierenden Proteine werden anhand ihrer Primärsequenz und subzellulären Lokalisation in verschiedene Klassen eingeteilt: sHsps der Klassen CI und CI1 befinden sich im nucleo-cytoplasmatische Raum, sHsps der Klasse M in Mitochondrien, der Klasse P in den Plastiden und der Klasse ER im endoplasmatischen Reticulum sowie im Golgi-Apparat. Da das Genom von Arabidopsis thaliana das erste komplett sequenzierte pflanzliche Genom ist, eignete sich dieser Modelorganismus zur Identifikation aller sHsp kodierenden Gene. Der Einsatz von Protein- und Nukleotidsequenzen bereits bekannter pflanzlicher sHsps als Suchkriterium in der NCBI-Datenbank (BLASTP und BLASTN), ergab die ldentifikation 19 putativer sHsp kodierender Gene, von denen erstaunlicheweise 13 bislang noch nicht bekannt waren. Proteinsequenzvergleiche ergaben, dass 7 der neu entdeckten sHsps nicht den typischen Klassen zugehörig sind. Dies bildete den Ausgangspunkt für deren nähere Analyse und Charakterisierung im Rahmen des ,,Functional Genomics": (1) Lokalisationsstudien I: Myc-Epitop markierte sHsp-Konstrukte wurden transient in Tabak-Mesophyllprotoplasten transformiert. Über Lokalisationsstudien per lmmunfluoreszenz konnten diese Proteine in tatsächlich 7 neu definierte sHsp Klassen eingeteilt werden. Interessanteweise werden die Vertreter dieser neuen Klassen von jeweils nur einem Gen kodiert. Die Vertreter der Klassen CI11 bis CVII lokalisieren im nucleo-cytoplasmatischen Kompartiment. Ferner bewiesen die Kodetektionen von organellären Markerproteinen, dass Klasse MII sHsps in die Mitochondrien und Mitglieder der Klasse Po in die Peroxisomen transportiert werden. Dies stimmte überein mit der Vorhersage von organellären Signalsequenzen. (2) Lokalisationsstudien II: Frühere Studien zeigten, dass sHsps der Klassen CI und CII unter Hitzestressbedingungen HSCs ausbilden. Wahrscheinlich fungieren Klasse CII sHsps als Grundgerüst für die HSC-Bildung und rekrutieren sHsps der Klasse CI in diese Multichaperonkomplexe. Die Proteine (Myc-markiert) Hsp17.4-CIII, Hsp15.4-CIV, Hsp18.5-CVI und Hsp14.7-CVII wurden unter Hitzestressbedingungen in endogene HSCs von Tabak-Mesophyllprotoplasten eingegliedert. Dieses Phänomen bleibt auf die genannten sHsp Klassen beschränkt, da weder Hsp21.7-CV, noch die organellären Proteine Hsp26.5-MI1 sowie Hsp15.7-Po in HSCs detektiert wurden. (3) Das sHsp-lnteraktom: Im Gegensatz zu früheren Studien, konnte in der vorliegenden Arbeit eine lnteraktion zwischen sHsps verschiedener Klassen zum ersten Mal im Hefe-Zwei-Hybrid-System sowie über Pull-down und nativer SDS-Gelelektrophorese detektiert werden. Am Beispiel eines Klasse CIII sHsps wurde gezeigt, dass die lnteraktion mit sHsps anderer Klassen zu einer Heterooligomerisierung führt. Dies wiederum hat eine nachhaltige Beeinflussung der intrazellulären Lokalisation der sHsps zur Folge. (4) Darüber hinaus ist für sHsps der Klasse CIII typisch, dass sie aufgrund einer Kernlokalisationssequenz innerhalb der ACD in den Nukleus transportiert werden. Im Vergleich zu sHsps der Klassen CI und CII, die Oligomere Strukturen von 220-230 kDa ausbilden, assemblieren sHsp-Monomere der Klasse CIII zu hochmolekularen Komplexen im Bereich von 1 MDa. (5) Das sHsp-Transkriptom: Durch RT-PCR-Analysen und Auswertung der öffentlich zugänglichen Microarray-Daten des AtGenExpress Konsortiums, konnte die Expression aller sHsps kodierenden Gene im Arabidopsis Genom auf transkriptioneller Ebene analysiert werden. Es zeigte sich, dass neben Hitzestress auch der Einfluss anderer abiotischer Stressoren, wie U. a. oxidativer stress und UV-B Bestrahlung, zu einer Akkumulation von sHsp-Transkripten führt. Ferner werden einige sHsps in bestimmten Entwicklungsstufen bzw. Organen, wie z.B. Blüten, Blättern und Samen, unabhängig von Stresseinflüssen exprimiert. (6) Funktionelle Analysen: Ein seminatives in vitro Chaperontestsystem, in dem Luciferase als thermosensitives Modelsubstrat eingesetzt wird, wurde herangezogen, um ausgesuchte sHsps bezüglich ihrer möglichen Chaperonfunktion zu testen. In Abhängigkeit der rekombinant hergestellten Proteine Hsp18.5-CVI, Hsp26.5-MII und Hsp15.7-Po konnte eine verminderte Aggregation der Luciferase unter Hitzestresseinwirkung und eine darauf folgende erhöhte Renaturierung durch ATP-abhängige Chaperonmaschinen während einer Erholungsphase beobachtet werden. (7) Peroxisomale sHsps: Da nie zuvor über peroxisomale sHsps berichtet wurde, nahm Hsp15.7-Po eine besondere Rolle bei den Untersuchungen ein. Dieses Protein besitzt eine putative peroxisomale Lokalisationssequenz (PTS) am C-Terminus, bestehend aus der Abfolge der Aminosäurereste SKL (PTS1). Durch Hefe-Zwei-Hybrid-Studien und lmmunfluoreszenzanalysen (in Tabak-Mesophyllprotoplasten und Säugerzellen) sowie den Einsatz von Mutanten wurde demonstriert, dass die PTS1 tatsächlich für die lnteraktion von Hsp15.7-Po mit den TPR-Domänen des peroxisomalen Importrezeptors Pex5 und für die peroxisomale Lokalisation des sHsps verantwortlich ist. Ein Hefe-Zwei-Hybrid-Screening nach möglichen lnteraktionspartnern von Hsp15.7-Po lieferte den ersten Anhaltspunkt für die lnteraktion mit cytoplasmatischen sHsps (Hspl7.7-CII). Dies ließ sich durch Pull-down-Analysen bestätigten und auf Hsp17.6-CII erweitern. Diese Interaktionen beeinflussten jedoch nicht die subzelluläre Lokalisation der jeweiligen Proteine bei Koexpression in Tabak-Mesophyllprotoplasten. All die hier dargestellten Ergebnisse weisen auf diverse Funktionen der einzelnen neu identifizierten sHsps der unterschiedlichen Klassen hin und bilden die Grundlage für zukünftige, detaillierte in planta Untersuchungen, die hierdurch erleichtert werden können.