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Die vorliegende Arbeit hat die Charakterisierung und Untersuchung des Stabilitätsverhaltens von
Parvulustat (PL), einem Homologen des α-Amylase-Inhibitors Tendamistat, zum Inhalt. Zur
weitreichenden Charakterisierung wurden verschiedene Proteinregionen des Parvulustats der CTerminus,
das hydrophobe Cluster, die Disulfidbrücken sowie die Proline auf ihren jeweiligen
Einfluss auf die Struktur und die thermodynamische Stabilität untersucht. In der vorliegenden
Zusammenfassung werden die Ergebnisse dieser Studien komprimiert präsentiert:
· Charakterisierung des Parvulustat-Wildtyps
Es galt vorweg herauszufinden, wie sich der Inhibitor unter nativen und denaturierten
Bedingungen verhält, um Rückschlüsse auf seine Merkmale und Strukturen zu ziehen. Die
erzielten Ausbeuten und die hohe Reinheit des isolierten Parvulustats erlaubten eine umfassende
Charakterisierung, einschließlich zahlreicher Kristallisationsexperimente, die vermuten lassen,
dass eine Kristallisation möglich sein sollte. Aufgrund der Tatsache, dass die Struktur des
Parvulustats bis 2009 unbekannt war, wurde die sekundäre Struktur mittels Circulardichroismus
und Fluoreszenzspektroskopie untersucht. Die Analyse des fernen UV-CD-Spektrums bei pH 7,0
und 25°C offenbarte eine „all-b-sheet“ Protein-Struktur. Mittels Fluoreszenzspektroskopie wurde
deutlich, dass die aromatischen Aminosäuren exponiert vorliegen. Um zunächst einen Einblick in
die Strukturveränderungen und die thermodynamische Stabilität zu erhalten, wurde der
temperaturinduzierte Entfaltungsübergang mittels CD-Spektroskopie verfolgt. Das Angleichen der
bei 230 nm gemessenen CD-Daten nach der linearen Extrapolations-Methode für eine
Zweizustands-Faltung ergab einen Tm-Wert von 82°C und D H(Tm) von 201,6 kJ/mol. Die
beträchtlichen Werte veranschaulichen die hohe Stabilität des Parvulustats. Eine aus den CDMessungen
bei 50° ergebende Übergangskurve zeigte, dass sich die Sekundärstruktur mit einem
Übergangsmittelpunkt bei 5,62 M GdnHCl kooperativ und reversibel entfaltet. Das Protein
entfaltet sogar infolge einer pH-Wert-Senkung bis auf pH 1 nicht vollständig, sondern es wechselt
direkt in einen Säure-Zustand („acid-state“). Dieser Zustand zeigt spektroskopisch die gleichen
Eigenschaften wie das native Protein, wobei die volle Inhibierungs-Aktivität nicht erhalten bleibt.
In sehr basischem Milieu bei pH 14 nimmt Parvulustat einen alkalisch denaturierten
Zwischenzustand IB an, der sich erheblich von dem GdnHCl-denaturierten, dem säurebehandelten
oder vom „molten globule“ Zustand unterscheidet. Allgemein behielt Parvulustat
über ein breites pH-Wert Spektrum (1,0-10,0) die native Struktur, bzw. eine „native like“ Struktur,
was erneut auf die enorme Stabilität des Proteins hindeutet. Die von Rehm et al. (Rehm et al.,
Theoretischer Teil
-4-
2009) aufgeworfene Hypothese des „induced fit“ Inhibierungsmechanismus des Parvulustats
konnte durch die in dieser Arbeit durchgeführten Experimenten bekräftigt werden. Mittels
Sekundärstrukturbestimmungen des Parvulustats unter Komplexbildung mit der a-Amylase
konnte eindeutig gezeigt werden, dass strukturelle Veränderungen am Inhibitor im Komplex
vorliegen. Durch zahlreiche Tests konnte festgestellt werden, dass die WRY-Region des
Parvulustats sich der Struktur der a-Amylase anpasst. Die Komplexierung des Parvulustats
bewirkte aber eine thermodynamische Destabilisierung der Inhibitor-Struktur.
· Einfluss des C-Terminus auf die Stabilität des Parvulustats
Um die Ursachen für die hohe Stabilität des Parvulustats auch im Vergleich zu Tendamistat (Tm:
79°C) zu finden, wurde der Einfluss des hoch flexiblen C-Terminus untersucht. Die Derivate mit
um zwei (PL-2AA), vier (PL-4AA) und sieben (PL-7AA) Aminosäuren verkürztem C-Terminus
wurden isoliert und analysiert. Die Entfaltungstemperaturen der verkürzten Derivate des
Parvulustats sinken mit abnehmender Zahl der Aminosäuren. Die Ergebnisse suggerieren, dass
der C-Terminus des Parvulustats eine entscheidende Rolle in der strukturellen Vollständigkeit des
Proteins während der thermischen Entfaltung spielt und damit auch in der Faltung (Tab.: 2.1). Der
Vergleich der Inhibitoraktivitäten der verkürzten Proteine mit dem nativen Parvulustat ergibt für
die Varianten PL-2AA und PL-4AA eine dem Wildtyp ähnliche Aktivität. Die Variante PL-7AA
weist eine leicht verringerte Aktivität auf.
Tabelle 2.1: ...
Einfluss hydrophober Oberflächenclustern auf Stabilität und Faltung
des Parvulustats
Parvulustat besitzt in der Mitte des ersten b-Faltblatts, um die Position 22 liegend, einen
hydrophoben Oberflächencluster. Wie mit Hilfe von Substitutionsexperimenten in dieser Region
gezeigt werden konnte, ist die thermodynamische Stabilität des Parvulustats in hohem Maße von
der Bildung dieses kleinen aber wichtigen hydrophoben Kerns bestimmt. Demnach muss das b-
Faltblatt I und das b-Hairpin I eine entscheidende Rolle in der Faltung von Parvulustat spielen.
Position 22 ist in zweierlei Hinsicht für die Stabilität des Parvulustats wichtig: einerseits durch die
energetisch wichtigen Wasserstoffbrückenbindungen und zum zweiten steuert die Stelle zur
Formation des hydrophoben Kerns bei. Die Daten suggerieren, dass es auch eine
thermodynamische Kopplung zwischen dem hydrophoben Effekt und der Präsenz von
Wasserstoffbrückenbindungen geben könnte. Zumindest aus der Sicht der Stabilität ist es
eindeutig, dass interatomare Interaktionen wie Wasserstoffbrückenbindungen, van-der-Waalsund
Dipol-Dipol-Wechselwirkungen notwendig sind, um eine stabile Bildung von b-Faltblättern
in Parvulustat und seinen Derivaten zu verwirklichen.
· Der Effekt der Proline auf die Stabilität des Parvulustats
Der Effekt der Substitution des Prolins durch Alanin an verschiedenen Positionen des Parvulustats
wurde ebenfalls untersucht. Im Ganzen betrachtet führt auch die Mehrfachsubstitution von Prolin
zu keiner nennenswerten strukturellen Veränderung im Parvulustat. Die durchgeführten
thermischen Entfaltungsexperimente bestätigen diese Beobachtungen. Alle Einzelmutanten (P5A,
P42A, P48A, P72A) zeigten eine höhere thermische Stabilität als der Wildtyp (Abb. 2.1).
Abbildung 2.1: Tm-Werte des Parvulustat-Wildtyps und seinen Prolin Mutanten.
Theoretischer Teil
-6-
Die fast gleich bleibenden Tm-Werte bzw. die Erhöhung der Stabilität des Parvulustats sind durch
die strukturelle Fluktuationen zu erklären, denn die rigide XAS-Pro-Bindung wurde durch die
flexible XAS-Ala-Bindung ersetzt.
· Der Einfluss der Disulfidbindung auf die Stabilität des Parvulustats
Der Einfluss der zwei Disulfidbrücken des Parvulustats wurde bezüglich Aktivität, spektraler
Eigenschaften sowie Stabilität untersucht. Hierfür wurden 25 Inhibitorvarianten mittels gezielter
Mutagenese gewonnen, in denen jeweils zwei Cysteinreste, die im natürlich vorkommenden
Parvulustat Disulfidbrücken bilden, durch andere Aminosäuren ersetzt wurden. Die Ergebnisse
zeigten, dass die Faltung Parvulustats ein zwei Zustand Verhalten besitzt, das außer in
Tendamistat in keinem anderen disulfid-verknüpftem Protein gefunden wurde. Dieses Verhalten
wurde durch die Entfernung von Disulfidbrücken nicht beeinflusst. Wie durch die CD- und
fluoreszenzspektroskopischen Experimente belegt werden konnte, ist die native Struktur des
Parvulustats durch die Entfernung der C43-C70-Disulfidbindung tiefgreifend verändert worden.
Passend zu den Veränderungen der Struktur haben die Mutationen schwerwiegende
Destabilisierungseffekte auf das Protein verursacht, was auch an der Erniedrigung der Freien
Gibbs Energie der Denaturierung und der Tm-Werte zu erkennen ist. Die Untersuchung des
Einflusses der Aminosäure-Substitution in den Positionen 43 und 70 auf die thermodynamische
Stabilität des Parvulustats führt zum Ergebnis, dass die Hydrophobizität und Polarität des Restes
70 einen bedeutenden Effekt auf die Stabilität des Proteins besitzt. Die Betrachtung der
thermodynamischen Daten macht deutlich, dass der Beitrag der freien Energie zur Stabilisierung
nicht nur abhängig von der eingeführten Aminosäure ist, sondern zum Teil auch von dem
strukturellen Kontext abhängt. Die Daten zeigen, dass die Substitution des Alanins an der Stelle
70 durch Leucin oder Threonin die Struktur um 0,3 bzw. 1,7 kJ/mol stabilisieren. Zusätzliche
Beiträge zum Unterschied bezüglich des ΔG°-Werts zwischen den Varianten C43AC70L/T und
C43L/TC70A können sich auch durch die unterschiedliche lokale Umgebung, wie z.B. die
Seitenketten von benachbarten Aminosäuren um die zwei Mutationsstellen ergeben. Der Tm-Wert
des Wildtyp-Proteins beträgt 82°C. Die Vergleiche dieser Größe mit der von der stabilsten
Cystein-defizitären Doppelmutante C43AC70T (47,3°C) ergibt eine Differenz von 34,7°C. Dieses
Ergebnis untermauert, dass die Disulfidbindung 2 eine extrem wichtige strukturelle Komponente
in der ungewöhnlich hohen Stabilität des Parvulustats darstellt.
Das Ziel der Arbeit war es dennoch die Daten der Stabilitäten einzelner Disulfidmutanten zu
sammeln und zu erfassen, um dadurch allgemeine Grundregeln für eine rationale Gestaltung der
Elimination beider Disulfidbrücken im Sinne einer vorhersagbaren Auswirkung auf die
Proteinstabilität zu bekommen.
Theoretischer Teil
-7-
Der Versuch ein disulfidfreies Protein in großen Mengen aus S. lividans zu isolieren, stellte sich
aber als extrem schwierig dar. Nach der Änderung des Stamms des Wirtsorganismus
(Streptomyces lividans TK23), Erhöhung der Qualität der Protoplasten und der Expressions-
Bedingungen (19°C, 150 rpm) konnten auf dem SDS-Gel stärkere Banden des Derivats
C9AC25TC43AC70T-4AA beobachtet werden. Die Expression der Mutante
C9AC25TC43AC70L-4AA konnte hingegen nicht nachgewiesen werden. Die anschließende
Reinigung des Derivats C9AC25TC43AC70T-4AA des Parvulustats mittels Gelfiltration und RPHPLC
bzw. Isolierung des Proteins aus dem SDS-Gel brachte das erwünschte Produkt. Dieses
konnte mit der MALDI-Massenspektroskopie eindeutig nachgewiesen werden. Das aktive
Cystein-freie Derivat C9AC25TC43AC70T-4AA konnte auch auf dem a-Amylase Plattentest
nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine Expression und der Nachweis einer
cystein-freien Variante möglich sind, dennoch haben die Ausbeuten dieses Proteins für
weiterreichende Analytik nicht ausgereicht. Demnach sind die Disulfidbrücken für die Stabilität
und Struktur des Parvulustats von enormer Bedeutung dennoch sind sie nicht zwingend
erforderlich für die Aktivität und die Expression in S. lividans.
Die Hitzestresstranskriptionsfaktoren HsfA1 und HsfA2 repräsentieren wichtige transkriptionelle Regulatoren in der Regulation der Hitzestressantwort von Lycopersicon esculentum (Tomate). Unter Stressbedingungen induziert HsfA1 die Expression von HsfA2 und bildet heterooligomere HsfA1/HsfA2 Komplexe, die im Zusammenhang mit der erhöhten Expression von Hitzestressgenen stehen (Scharf et al., 1998b, Mishra et al., 2002, Port et al., 2004). Durch funktionelle Charakterisierungen der Wechselwirkung zwischen HsfA1 und HsfA2 werden neue Aspekte der spezifischen und synergistischen Aktivierung durch HsfA1 und HsfA2 erläutert. - Die Spezifität der funktionellen Interaktion zwischen HsfA1 und HsfA2 wird in Vergleich mit weiteren Klasse A Hsfs, HsfA3, HsfA4b und HsfA5 anhand von GUS Reporter Assays, Coimmunpräzipitationsanalysen und der interaktionsvermittelten Kernretention von GFP-HsfA2 verdeutlicht. Trotz des Potenzials von HsfA2, multiple Wechselwirkungen einzugehen, ist die Spezifität zwischen HsfA1 und HsfA2 am höchsten. Für die Analyse der synergistische Aktivierung durch HsfA1 und HsfA2 werden 3HA-HsfA1 und 3HA-HsfA2 in unterschiedlichen Mengenverhältnissen coexprimiert. Sowohl am Hsp17.3B-CI::GUS Reporter als auch an der induzierte, endogene Tabak Hsp17-CI Expression kann der spezifische Effekt der synergistischen Aktivierung durch HsfA1 und HsfA2 demonstriert werden. - Um die strukturellen Voraussetzungen der synergistischen Aktvierung zu definieren, werden Mutanten mit Defekten in der DNA Bindung, Oligomerisierung und Aktivierung in funktionellen Analysen der transkriptionellen Aktivität (GUS Reporter Assays, Induktion endogener Hsp17-CI Expression), Komplexbildung (Co-Immunpräzipitation) und der HsfA1 vermittelte Kernretention von HsfA2 (Immunfluoreszenz) untersucht. Die synergistische Aktivierung erfordert die Bildung heterooligomerer HsfA1/HsfA2 Komplexe, die über eine Kombination ihrer C-terminalen Aktivierungsdomänen kooperativ aktivieren. Dagegen hat die DNA Bindung durch die DBDs beider Hsfs einen geringen Anteil an der synergistischen Aktivierung. Zur Verifizierung der funktionellen Unterschiede zwischen HsfA1 und HsfA2 werden HsfA1-HsfA2 Hybride durch Coexpression mit HsfA1 und HsfA2 Wildtypformen analysiert. Heterooligomere Komplexe aus Wildtyp und Hybrid-Hsfs zeigen ausschließlich eine synergistische Aktivierung, wenn die C-terminalen Aktivierungsdomänen von beiden Hsf Typen stammen, während heterooligomere HsfA1/HsfA2 Komplexe mit typgleichen C-Termini nicht synergistisch aktivieren. Weiterhin wird gezeigt, dass Wildtyp- Hybridkomplexe mit identischen HR-A/B Regionen in der synergistischen Aktivierung abgeschwächt sind. - Die Bildungseigenschaften der DNA-Hsf Komplexe (DNP) von HsfA1 und HsfA2 werden in Hinblick auf qualitative Veränderungen unter Coexpressionsbedingungen betrachtet. Interessanterweise konnte die Bildung intermediärer DNPs sowie von Hsf-Komplexen mit intermediärer Größe in Gelfiltrationsanalysen als Indizien für qualitativ veränderte HsfA1/HsfA2 Komplexen nachgewiesen werden. Die funktionelle Analyse von HsfA1 C-terminalen Deletionsmutanten führt zur Identifizierung einer de-regulierten HsfA1 Mutante, die trotz de-regulierter Aktivität mit HsfA2 zur synergistische Aktivierung fähig ist. - Zur Verifizierung der interaktionsvermittelten synergistischen Aktivierung wird die Oligomerisierung partiell deletierter HsfA2 HR-A/B Mutanten ermittelt. Da diese Mutanten intermediäre Oligomerisierungszustände zeigen, werden durch die systematische Deletionsmutation der HR-A/B Region von HsfA2 strukturellen Voraussetzungen für die synergistische Aktivierung durch HsfA1 und HsfA2 charakterisiert. Co-Immunpräzipitationsversuche belegen, dass die Integrität der HR-A/B Region für die Bildung stabiler HsfA1/HsfA2 Komplexe benötigt wird, jedoch eine transiente und spezifische Interaktion über die C-terminalen L2 und HR-B Regionen für die synergistische Aktivierung ausreicht. - In der Charakterisierung der kooperativen, synergistischen Aktivierung durch beide CTADs werden Mutanten der vier vorhandenen AHA Motive von HsfA1 und HsfA2 durch Coexpression mit dem Wildtyp Hsf Partner getestet. Die Ergebnisse verdeutlichen, dass jedes der AHA Motive unterschiedlich zur synergistischen Aktivierung beitragen.
1. A preliminary revision of the genus Muntiacus in the Indo-Australian Archipelago Introduction Sexual differences Sexual cycle Characters of age in the dentitions Age differences in skull measurements Age differences of antlers Age differences in coat Systematic part 2. Revision of the genus Arctogalidia in the Indo-Australian Archipelago. Introduction Key to the greges in the genus Arctogalidia Key to the subspecies of the grex A. t. trivirgata Gregal form A. t. trilineata
Nahrungsmittelallergikern steht aufgrund inakzeptabler Nebenwirkungen bei der spezifischen Immuntherapie zurzeit noch keine kausale Therapie dieser Erkrankung zur Verfügung. Demzufolge bleibt die Vermeidung der entsprechenden Lebensmittel für Nahrungsmittelallergiker der einzige Weg möglicherweise lebensbedrohlichen allergischen Reaktionen zu entgehen. Ziel dieser Arbeit war es, das Potential eines viralen Vektors für die Verwendung bei der spezifischen Immuntherapie der Lebensmittelallergie zu untersuchen. Die Überlegung dahinter war, das Risiko eines anaphylaktischen Schocks, der bei Injektion eines Allergens immer gegeben ist, durch intrazelluläre Expression des Proteins über das rekombinante Virus zu verringern. Zusätzlich dazu bringt das modifizierte Vacciniavirus Ankara (MVA) ideale Voraussetzungen für eine Allergievakzine mit: Die Infektion mit MVA führt zu einer stark Th1-gerichteten Immunantwort gegen die viral exprimierte Proteine, die möglicherweise die allergische Th2-gerichtete Immunantwort modulieren kann. Die prophylaktische Immunisierung mit MVA-OVA im Mausmodell der systemischen Sensibilisierung gegen Ovalbumin (OVA) führte dosisabhängig zur Suppression der spezifischen IgE-Antwort und somit zum Schutz vor allergischer Sensibilisierung. Zusätzlich konnte nachgewiesen werden, dass die Vakzinierung mit MVA-OVA eine dauerhafte spezifische IgG-Antwort induziert. Diese Daten unterstützen das Konzept einer Modulation der Sensibilisierung durch MVA-Vakzine. Weiterhin wurden zwei rekombinante Vakzinen generiert, mittels derer entweder das Tropomyosin aus Garnelen (Pen a 1) oder das Lipid-Transfer-Protein aus Haselnuss (Cor a 8) intrazellulär exprimiert werden konnte. Dass die Sensibilisierung gegen diese Allergene häufig mit schweren allergischen Reaktionen korreliert, unterstreicht die Notwendigkeit einer verbesserten Immuntherapie in diesem Bereich. Während MVA-Pen a 1 in ausreichender Menge und Qualität für die Verwendung im Mausmodell hergestellt werden konnte, gelang es nicht, eine homogene Population von MVA-Cor a 8 zu gewinnen, in der das Selektionsgen K1L nicht mehr vorhanden war. Parallel zur Virusherstellung wurden Mausmodelle der Sensibilisierung gegen Cor a 8 und Pen a 1 entwickelt. Vergleiche unterschiedlicher Mausstämme ergaben, dass sich Mäuse des Stammes CBA/J am empfänglichsten für eine systemische Sensibilisierung mit Cor a 8 sind. Aufgrund von Erfahrungen zur Sensibilisierung gegen Pen a 1 wurden Mäuse des Stammes C3H/HeJ bei der Etablierung eines Garnelenallergiemodells verwendet. Es zeigte sich, dass durch die intragastrale Applikation von 0,1 mg Pen a 1 sowie Choleratoxin als Adjuvanz (drei Gaben in dreiwöchigem Abstand), gefolgt von einer systemischen Gabe des Allergens mit Aluminiumhydroxid eine spezifische Sensibilisierung hervorgerufen werden konnte, die nach Exposition mit Pen a 1 zu allergischen Symptomen führte. Auch in diesem Modell bot die prophylaktische Immunisierung mit MVA-Pen a 1 Schutz vor Pen a 1spezifischer Sensibilisierung. Um die therapeutische Effektivität der Vakzine ermitteln zu können, muss die begonnene Etablierung eines Allergiemodells mit symptomauslösenden Provokationen und immunologischen Analysen weitergeführt werden. Der in dieser Studie beobachtete starke schützende Effekt einer Vakzinierung mit MVA vor allergischer Sensibilisierung und das sehr gute Sicherheitsprofil dieses Vektors in klinischen Studien zu anderen Erkrankungen belegt die Möglichkeit einer Verwendung von MVA zur erfolgreichen spezifischen Immuntherapie der Lebensmittelallergie.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Charakterisierung des Proteoglykans Biglycan und seiner Funktion als Signalmolekül in inflammatorischen und autoimmunen Prozessen. Die biologische Bedeutung der in vitro gewonnenen Ergebnisse in primären Makrophagen und dendritischen Zellen wurde durch in vivo Modelle der Pathogenvermittelten-und nicht-Pathogen-vermittelten Inflammation und der Autoimmun-Erkrankung Lupus Nephritis bestätigt. In primären Makrophagen und dendritischen Zellen induziert Biglycan die Produktion proinflammatorischer Zytokine und Chemokine durch Interaktion mit Toll-like Rezeptor (TLR) 2 und 4. Mit nucleotide-binding oligomerization like Rezeptorprotein3 (NLRP3)-,apoptosisassociated speck-like protein containing a CARD (ASC)- , Caspase-1- und TLR2/4- defizienten Mäusen und verschiedenen pharmakologischen Inhibitoren war es möglich in primären murinen peritonealen und Knochenmark-Makrophagen nachzuweisen, dass Biglycan die Caspase-1 NLRP3/ASC-abhängig aktivierte und damit die Prozessierung der Proform und Sekretion von reifem IL-1β induzierte. Durch Bindung an TLR2/TLR4 aktivierte Biglycan die NFκB, Erk und p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) Signalwege und stimulierte die Expression von Interleukin-1 beta (IL-1β). Biglycan aktivierte zudem den P2X7 Rezeptor (P2X7R) in Makrophagen und ist somit in der Lage auch ohne zusätzliche Ko-Stimulation, beispielsweise durch ATP, das NLRP3 Inflammasom zu stimulieren und die Prozessierung von aktivem IL-1β anzuregen. In einem Pathogenvermittelten (Lipopolysaccharid (LPS)-induzierte Sepsis) wie auch –nicht-athogenvermittelten (unilaterale Uretherobstruktion, UUO) Mausmodell der Inflammation wurde die biologische Relevanz dieser Prozesses gezeigt. Die Defizienz von Biglycan ging in diesen Modellen mit verminderter Aktivierung des NLRP3/Caspase-1 Inflammasomes, geringeren Spiegeln von reifem IL-1β und geringerer Organschädigung einher. Nachdem aufgezeigt werden konnte, dass die Biglycan-Konzentrationen in Nierenbiopsien und im Plasma von Patienten mit Lupus Nephritis stark erhöht waren, wurde seine Relevanz in Immunitätsreaktionen einschließlich autoinflammatorischen Prozessen genauer untersucht. Die Effekte von Biglycan in verschiedenen Stadien der Erkrankung wurden mit der MRL-Faslpr (kurz MRL/lpr) Maus, einem etablierten Modell der Lupus Nephritis (LN) und einem dafür generierten Modell der Defizienz (Bgn-/- MRL/lpr) und Überexpression von Biglycan (hBGN MRL/lpr) analysiert. In den verschiedenen Stadien der LN nahm die Konzentration von zirkulierendem und renalem Biglycan in MRL/lpr Mäusen zu und korrelierte gleichermaßen mit dem Fortschreiten der Erkrankung. Die Defizienz von Biglycan verminderte hingegen stark die renale Infiltration von Entzündungszellen, insbesondere B1-Zellen, außerdem die Zytokin-, Chemokin- und Immunglobulin-Konzentrationen und minderte die Progredienz der Niereninsuffizienz verglichen mit Lupus Mäusen gleichen Alters. In der Initialphase der Lupus Nephritis induzierte Biglycan in Mäusen, transient transgen für humanes Biglycan (hBGN MRL/lpr), vermehrte renale Zellinfiltration und Albuminurie als Zeichen nephrotischer Dysfunktion. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Produktion des stark proinflammatorischen Zytokines IL-1β in jungen Lupus Nephritis Mäusen NLRP3/Caspase-1-abhängig ist und durch Biglycan verstärkt wurde. Die Mechanismen, durch die endogenes Biglycan die Leukozyteninfiltration in Lupus Mäusen induzierte und somit inflammatorische und autoimmune Vorgänge potenzierte, wurden insbesondere an B-Zellen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass Biglycan die renale Migration von einem besonderen B-Zell Subtyp, B1-Zellen, verantwortlich für die T-Zellenunabhängige Autoimmunglobulinproduktion beim LN, unterhielt. Dabei vermittelte Biglycan die Rekrutierung von B1-Zellen in die Niere durch Regulation der Expression und Synthese der B-Zell C-X-C Chemokin Ligand 13 (CXCL13) in der Niere und in residenten peritonealen Makrophagen. In vitro konnte zudem der Mechanismus aufgeklärt werden, über den Biglycan CXCL13 reguliert. In primären Makrophagen und dendritischen Zellen induziert Biglycan die Expression und Sekretion von CXCL13 über TLR2 und TLR4. Die Daten zeigen auf, dass Biglycan als endogenes Gefahrensignal starke proinflammatorische Reaktionen hervorruft. Über Rezeptoren des angeborenen Immunsystems, TLR2 und TLR4, aktiviert Biglycan des weiteren Zellen des adaptiven Immunsystems und inuziert die Rekrutierung weiterer Lymphozyten. Demnach kann postuliert werden, dass Biglycan als Brückenmolekül das anegborene und adaptive Immunsystem verbindet, und somit ein potenzielles neues „drug target“ in autoinflammatorischen, wie auch autoimmunen Vorgängen darstellt.
The Opisthobranchia comprise highly specialized marine gastropods and have therefore been subject to diverse investigations covering various biological disciplines. However, a robust phylogeny of these gastropods is still lacking and several subclades have only been rarely studied. Furthermore, crucial aspects for the evolution of Opisthobranchia have not been comparatively analysed. Therefore, the aim of the present thesis is to gain new insights into the phylogeny of the Opisthobranchia with special focus on certain critical groups (Pleurobranchomorpha, Acteonoidea) and to assess several crucial features of the evolution of the investigated clades. The combination of four different gene markers (18S rDNA, 28S rDNA, 16S rDNA and CO1) and modern molecular systematic analysis tools were used to construct phylogenetic hypotheses focussing on Opisthobranchia as a whole as well as Pleurobranchomorpha and Acteonoidea in more detail. Intriguing new aspects of phylogeny and evolution of Opisthobranchia were revealed. First of all, monophyly of Opisthobranchia is definitely rejected based on the present data, while monophyly of Euthyneura (comprising Opisthobranchia and Pulmonata) is supported. Monophyly of opisthobranch subclades is confirmed for Nudipleura (as well as its constituting groups Nudibranchia and Pleurobranchomorpha), Umbraculida, Pteropoda (as well as subclades Thecosomata and Gymnosomata) and Acochlidiacea, for Cephalaspidea (if Runcinacea is regarded as a separate clade) and for Sacoglossa (if Cylindrobulla is accepted as an Oxynoacea). Aplysiomorpha are rendered paraphyletic due to the position of Akera bullata, but this result needs further investigation and should be considered with caution. The Nudipleura are found as the first single offshoot of the Euthyneura implying an early evolutionary separation of the last common ancestor of this clade. The remaining taxa form two main clades, one comprising the opisthobranch subgroups Umbraculida, Cephalaspidea, Aplysiomorpha and Pteropoda, while the other contains the pulmonate taxa and the opisthobranch Sacoglossa and Acochlidiacea. The interrelationships within these clades remain largely unresolved due to low statistical support values. However, a possible sister group relationship of Acochlidiacea and Eupulmonata receives statistical support. Opisthobranchia display various highly specific adaptations to diverse food sources. However, evolution of these specialized traits has never been assessed at an analytical level. The current thesis reconstructs the evolution of dietary preferences with novel methodologies based on the newly proposed phylogenetic hypothesis. Reconstruction of dietary evolution revealed herbivory as the ancestral condition in Euthyneura implying that carnivory evolved at least five times independently in the diverse lineages. The first comprehensive molecular phylogenetic hypothesis of the Pleurobranchomorpha could not reveal monophyly of the two main subclades Pleurobranchaeidae and Pleurobranchidae. This is due to the position of a single taxon (Euselenops luniceps) which is assigned to the Pleurobranchaeidae based on morphology but clusters within Pleurobranchidae in the current hypothesis. Furthermore, the tribe Berthellini and the genus Berthella are rendered paraphyletic by the current analyses. The results of molecular systematic analyses were used to reconstruct historical biogeography of Pleurobranchomorpha. Four different methodological approaches were applied yielding ambiguous results for Pleurobranchomorpha. However, the Pleurobranchidae comprising about 80% of the extant Pleurobranchomorpha most probably derived from an Antarctic origin. Dating of the phylogenetic tree via molecular clock methods yielded divergence of Pleurobranchidae into the Antarctic Tomthompsonia antarctica and the remaining species in Early Oligocene. Afterwards the latter underwent rapid radiation during Oligocene and Early Miocene. This divergence event coincides with two major geological events in the Antarctic region. On the one hand, the onset of glaciation and on the other hand the opening of the Drake Passage with concurrent formation of an Antarctic circumpolar current (ACC). I suppose that these sudden and dramatic changes in climate and palaeogeography probably accounted for migration of the last common ancestor of Pleurobranchidae (besides Tomthompsonia) into warmer regions via the Drake Passage to the Western Atlantic and Eastern Pacific and via the South Tasman Rise to the Indo-West Pacific. Furthermore, the ACC may have triggered larval dispersal to the Eastern Atlantic. The phylogenetic position of Acteonoidea has been a matter of debate for decades and they have long been considered as basal opisthobranchs. Results of the present thesis rather support placement in “Lower Heterobranchia” as sister group of Rissoelloidea. The current division of Acteonoidea into three families has never been investigated by means of phylogenetic methods. Thus, this thesis provides the first comprehensive investigation of this clade challenging present division into three families. The results rather support division into two main clades with the monogeneric Bullinidae clustering within Aplustridae doubting its separate status. Additionally, Rictaxis punctocaelatus which has been assigned to Acteonidae clusters basal to Aplustridae rendering Acteonidae paraphyletic. Since information on morphology of R. punctocaelatus was lacking until now, I conducted the first detailed investigation on morphology and histology of this species in order to reassess the unexpected molecular systematic placement. Character tracing analyses revealed similarities with both acteonoidean families implying an intermediate position of this species which might be assigned to a separate family in the future. Furthermore, the common features of Acteonidae and Rictaxis (massive shell, small foot, anterior mantle cavity opening, and absence of oral gland) are possibly plesiomorphic for the whole Acteonoidea. In summary, the results of the present thesis provide valuable novel insights into the phylogeny and evolution of the Opisthobranchia by employing state-of-the-art approaches of molecular systematics and evolutionary reconstruction. Thus, diverse hypotheses on opisthobranch phylogeny and evolution were either supported or rejected as well as novel hypotheses proposed which offer the basis for further research on these extraordinary gastropods.
Untersuchungen zum Target und Wirkmechanismus der eNOS-Transkriptionsverstärker AVE9488 und AVE3085
(2008)
Die Substanzen AVE9488 und AVE3085 der neuen chemischen Klasse der eNOS-Transkriptionsverstärker führen zu einer signifikanten Aktivierung des eNOSPromotors, die in vitro und in vivo in einer Erhöhung der eNOS-Expression auf mRNAund Proteinebene resultiert. Als Folge davon kommt es zu einer signifikant gesteigerten Synthese von bioverfügbarem Stickstoffmonoxid (NO). Dieser Effekt führt in Kombination mit einer ebenfalls beobachteten Normalisierung der eNOS-Entkopplung zu einer deutlichen antiatherosklerotischen Wirkung in ApoE-Knockout-Mäusen. AVE9488 und AVE3085 wurden initial durch eine phänotypische Reihentestung chemischer Bibliotheken in einer stabilen eNOS-Promotor-Reporter-Endothelzelllinie identifiziert. Daher waren bis zum heutigen Zeitpunkt molekulare Targets und ihre Wirkweise unbekannt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand daher darin, Targetproteine der eNOS-Transkriptionsverstärker zu identifizieren, zu validieren und Hinweise auf den zugehörigen Wirkmechanismus zu sammeln. Zur Identifizierung potenzieller Zielproteine wurden zwei unterschiedliche Strategien verfolgt. In einem genomischen Ansatz sollten einzelne, für die Aktivierung des eNOSPromotors durch AVE9488 und AVE3085 essentielle Transkriptionsfaktoren identifiziert werden. Eine in silico-Analyse des für die Substanzwirkung notwendigen 300bp-Promotorbereichs vor Transkriptionsstart auf konservierte Transkriptionsfaktor-Bindemotive ergab potenzielle Bindungsstellen für insgesamt 105 Transkriptionsfaktoren. In Gel-Retardierungsexperimenten mit Oligonukleotiden, die aufbauend auf der bioinformatischen Analyse die konservierten cis-Elemente in diesem Sequenzbereich abdeckten, und Kernextrakten aus Endothelzellen, die mit AVE9488 behandelt worden waren, konnte eine Abschwächung der DNA-Protein-Komplexbildung beobachtet werden. Diese Effekte konnten jedoch mit dieser Technologie aufgrund der hohen Anzahl möglicher bindender Transkriptionsfaktoren nicht auf einzelne eingeengt werden. Im Folgenden wurden daher einzelne Transkriptionsfaktoren ausgewählt, die eine nachgewiesene Rolle bei der Regulation der eNOS-Transkription besitzen, und auf ihre Bedeutung bei der Substanz- ermittelten eNOS-Promotoraktivierung untersucht. Nach Ausschaltung durch siRNA von Sp1, GATA-2, Ets-1, MAZ und PATZ1 im eNOS-Transkriptionstest konnten bei Sp1, GATA-2 und MAZ lediglich eine Erniedrigung der basalen eNOS-Promotoraktivitätfestgestellt werden. Da die Substanz-induzierte eNOS-Transkriptionserhöhung bei keinem der untersuchten Transkriptionsfaktoren beeinflusst wurde, scheinen diese Proteine bei diesem Prozess keine Rolle zu spielen. Als zweite Strategie kamen Proteomik-Techniken zur Identifizierung möglicher Targetprot eine durch ihre direkte biochemische Affinität zum Pharmakophor der eNOS-Transkriptionsverstärker zum Einsatz. Durch die chromatographische Anreicherung bindender Proteine aus Endothelzelllysaten an spezifischen Affinitätsmaterialien und der Markierung rekombinanter, humaner Proteine auf Protein-Mikroarrays mit Biotinmarkierten eNOS-Transkriptionsverstärkern konnte eine Gesamtliste mit insgesamt 18 potenziellen Targetkandidaten ermittelt werden. Die weitere zelluläre Validierung dieser Kandidaten erfolgte durch ihre siRNA-vermittelte Ausschaltung im eNOS-Transkriptionstest. Innerhalb aller potenziellen Targets konnte nur nach Ausschalten von Häm-bindenden Protein 1 (HEBP1) der eNOS-Promotor durch AVE3085 nur noch signifikant abgeschwächt gegenüber der Kontrolle aktiviert werden. Dieses Protein stellte somit den einzigen Targetkandidaten dar, der bei der Aktivierung des eNOS-Promotors eine Rolle zu spielen scheint. Nach rekombinanter Expression des humanen HEBP1 konnte die Bindung der eNOS-Transkriptionsverstärker an dieses Protein durch zwei unabhängige biochemische Methoden konfirmiert werden. Bei Messungen der Tryptophanfluoreszenz des HEBP1 konnte der eNOS-Transkriptionsverstärker 9257 den Liganden Hämin, der eine Quenchung der Fluoreszenz bewirkt, aus der Bindung verdrängen. Weiterhin konnte mit Hilfe einer Fluoreszenz-markierten eNOS-Substanz ihre direkte Bindung an das HEBP1 durch Messung der Fluoreszenzpolarisation nachgewiesen und ein KD-Wert von 11,7μM ermittelt werden. Abschließend konnte in ersten Untersuchungen der Hebp1-Expression in einem Herz-Kreislauf-relevanten Tiermodell für chronische Herzinsuffizienz nach Myokardinfarkt die differentielle Hochregulation des Hebp1-Gens um den Faktor 2,5 unter pathologischen Bedingungen nachgewiesen werden, die jedoch nicht durch die Behandlung mit AVE3085 beeinflusst wurde.
Helicobacter pylori (H. pylori) ist ein weit verbreitetes Humanpathogen, welches den menschlichen Magen besiedelt und zu schwerwiegenden entzündlichen Erkrankungen des gastralen Traktes führen kann. Bereits 1994 wurde das Bakterium als ein Klasse 1 Karzinogen deklariert, da H. pylori im erwiesenen Maße mit der Entstehung von hochinvasivem Magenkrebs in Verbindung gebracht wird. In vitro induziert H. pylori eine starke Migration der infizierten Epithelzellen, die unter anderem mit der Auflösung der Zellkontakte einhergeht. Die zugrunde liegenden molekularen Zusammenhänge konnten bisher noch nicht vollständig aufgeklärt werden. Die Mechanismen der Auflösung der Zelladhäsion wurden in der vorliegenden Arbeit untersucht, um einen tieferen Einblick in die H. pylori vermittelten Virulenz zu erhalten. So konnte eine H. pylori-induzierte Dissoziation des E-Cadherin Komplexes, bestehend aus p120, 􀄮- und 􀈕-Catenin beobachtet werden, der in einem Verlust der Zelladhäsion resultierte. Es konnte darüber hinaus eine Spaltung der extrazellulären Domäne von ECadherin detektiert werden, die wahrscheinlich zu einer Destabilisierung und somit zur Auflösung des gesamten E-Cadherin Komplexes führte. Durch den Zerfall der Adhärenzverbindungen wurden Catenine in den zytoplasmatischen Pool freigegeben, von denen p120 in den Zellkern translozierte und die Transaktivierung von Zielgenen auslöste, die in diesem Zusammenhang mit Hilfe von Reportergenanalysen quantifiziert wurden. Diese Prozesse zeigten sich von dem Pathogenitätsfaktor CagA (cytotoxin associated gene A) unabhängig, der über das bakterielle Typ IV Sekretionssystem in die Wirtszellen transloziert wird und krebsassoziierte Signaltransduktionswege aktivieren kann. In weiteren Untersuchungen wurden deshalb die Auswirkungen löslicher H. pylori Faktoren auf die Spaltung von E-Cadherin und folglich auf die Zellmotilität und Morphologie epithelialer Zellen analysiert. Aufgrund dieser Beobachtungen wurden in weiteren Experimenten proteolytische Aktivitäten von H. pylori untersucht. Dabei konnte erstmalig die hypothetische Protease HtrA (high temperature requirement protein A) von H. pylori durch massenspektrometrischen Analysen als eine caseinolytisch aktive Protease gefunden werden. Nach der Klonierung und Aufreinigung von HtrA konnte darüber hinaus auch E-Cadherin als spezifisches biologisches Substrat der Wirtszellen für HtrA identifiziert werden. Diese selektive Fragmentierung von E-Cadherin durch HtrA fügt sich als ein neues Element in das Modell der H. pylori Pathogenese, die einen initialen Schritt in der frühen Phase der Infektion darstellen könnte.
Identifizierung und Charakterisierung neuartiger 5-Lipoxygenase-Inhibitoren – in silico und in vitro
(2009)
Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung und Charakterisierung neuer potenter 5-LO-Inhibitoren unter Verwendung sowohl computergestützter als auch experimenteller Methoden. Ausgangspunkt war ein ligandenbasiertes virtuelles Screening unter Verwendung der ladungsbasierten Deskriptoren Charge 3D und TripleCharge3D. Hierbei konnten zwei neue direkte 5-LO-Inhibitoren identifiziert werden. Jede dieser beiden Substanzen diente als Startpunkt weiterer virtueller Screenings mit dem Ziel, die Potenz der Substanzen zu verbessern bzw. eine SAR der Substanzklasse zu erhalten. Dabei zeigte sich für die Klasse der Thiazolinone, dass eine hohe Toleranz gegenüber unterschiedlichen Substituenten am Grundgerüst bezüglich der Auswirkung auf die Aktivität vorliegt: insbesondere werden relativ große Substituenten toleriert. Des Weiteren scheint der 2-Phenylsubstituent für die 5-LO-inhibitorische Aktivität essentiell zu sein, da Derivate, die einen Heterozyklus an dieser Position aufweisen, inaktiv sind. Eines der aktivsten Derivate dieser Klasse, C06 (Substanz 12), konnte weiter molekular-pharmakologisch charakterisiert werden. Die Substanz zeigt keine offensichtlichen zytotoxischen Effekte, ist unabhängig vom Stimulus der 5-LO-Aktivierung und zeigt nanomolare inhibitorische Aktivität sowohl in intakten PMNL (IC50-Wert 0,65 =M) als auch in PMNL-Homogenaten (IC50-Wert 0,66 =M) sowie in zellfreiem PMNL-S100 (IC50-Wert 0,26 =M) und am gereinigten Enzym (IC50-Wert 0,3 =M). C06 ist selektiv für die 5-LO, da andere arachidonsäurebindende Proteine (PPARs, cPLA2 und 12- und 15-LO) nicht beeinflusst werden. Auch Nager-5-LO (aus der Ratte und der Maus) wird inhibiert mit IC50-Werten im nanomolaren Bereich. Allerdings zeigte sich die Substanz inaktiv in einem menschlichen Vollblutassay in Gegenwart von Serum. C06 scheint nicht an die für die Interaktion der 5-LO mit der Membran verantwortliche C2-ähnliche Domäne der 5-LO zu binden. Ebenso hat der Membranbestandteil Phosphatidylcholin keinen bzw. nur geringen Einfluss auf das inhibitorische Potential von C06. Aktivitätstests mit steigender Substratkonzentration deuten auf einen allosterischen Bindemodus von C06 hin. Diese experimentellen Daten flossen in die Identifizierung des putativen putativen Bindemodus an der 5-LO ein. Hierzu wurde zunächst ein Homologie- Modell der 5-LO unter Verwendung der kürzlich neu veröffentlichten Daten der Röntgenkristallstruktur der Kaninchen-15-LO (PDB-Code: 2p0m [Choi et al., 2008]) erstellt. Durch eine Bindetaschenvorhersage mit dem Programm PocketPicker und einer pseudorezptorbasierten Auswahl der potentiellen Bindetasche mit anschliessendem Liganden-Docking konnten zwei Bindebereiche postuliert werden, beide an einer Oberflächenbindetasche der 5-LO ausserhalb des aktiven Zentrums. .....
In der vorliegenden Dissertation konnte gezeigt werden, dass Hyperforin wichtige Funktionnen von Keratinozyten beeinflusst. Hyperforin triggert die Ausdifferenzierung der epidermalen Zellen und inhibiert gleichzeitig ihre Proliferation. Diese Ergebnisse zeigen die physiologische Relevanz der Hyperforin-vermittelten Effekte, da diese beiden Prozesse in der Haut normalerweise gegenläufig ablaufen. Weiterhin war die von Hyperforin ausgeübte Ausdifferenzierungs-Zunahme und Proliferationshemmung vergleichbar mit den Effekten einer hohen [Ca2+]ex, die in vivo die Funktionen von Keratinozyten steuert. Die Frage, die aus diesen Ergebnissen resultierte, war, über welchen Mechanismus Hyperforin die Effekte in Keratinozyten beeinflusst. Die Untersuchung des Mechanismus der Hyperforin-induzierten Effekte zeigte, dass Hyperforin über die Aktivierung des TRPC6-Kanals einen Calcium-Influx in Keratinozyten bewirkt und resultierend daraus die Ausdifferenzierung von Keratinozyten anregt. Auch hier ergeben sich Parallelen zu der durch hohes [Ca2+]ex -induzierten Ausdifferenzierung, die ebenfalls einen Calcium-Einstrom in Keratinozyten auslöst. Eine Microarray-Analyse von Hyperforin-inkubierten Keratinozyten und anschließende Experimente mit selektiven Inhibitoren zeigte die Beteiligung der PKC/Ras/MEK/ERK-Signalkaskade. Interessanterweise gibt es hier ebenfalls Ähnlichkeiten zwischen Hyperforin und einer hohen [Ca2+]ex, da bekannt ist, dass eine hohe [Ca2+]ex die Ausdifferenzierung zumindest teilweise über diesen Signatransduktions-Weg steuert. Aufgrund der Parallelen zwischen der Hyperforin- und Ca2+-induzierten Ausdifferenzierung und den vermehrten Hinweisen auf die wichtige Rolle von TRPC-Kanälen in Keratinozyten, stellte sich die Frage, ob eine hohe [Ca2+]ex ebenfalls zur Aktivierung von TRPC-Kanälen führt. Tatsächlich konnten wir in dieser Arbeit zeigen, dass Calcium in Keratinozyten mehrere TRPC-Kanäle aktiviert und so einer Erhöhung der [Ca2+]i führt. Hierdurch konnte zum ersten Mal auch die Beteiligung von DAG-aktivierten TRPC-Kanälen an der Ca2+-induzierten Ausdifferenzierung gezeigt werden. Bei der Untersuchung von Psoriasis-Keratinozyten, die eine Hyperproliferation und erniedrigte Ausdifferenzierung in vivo aufweisen, konnte in der vorliegenden Dissertation eine grundlegende Störung des Calcium-Haushaltes festgestellt werden. Dabei zeigten die Psoriasis-Keratinozyten im Vergleich zu gesunden hPKs eine abnorme Antwort auf unterschiedliche Stimuli, die zu einer Erhöhung der [Ca2+]i führen. Sowohl eine hohe [Ca2+]ex, als auch Hyperforin führte zu einem deutlich erniedrigten Calcium-Einstrom in den Keratinozyten der Psoriasis-Patienten. Aus diesen Ergebnissen resultiert die Frage nach den Ursachen dieser Störungen. Da in dieser Arbeit bereits gezeigt werden konnte, dass Hyperforin und eine hohe [Ca2+]ex über TRPC-Kanäle die Ausdifferenzierung in Ketatinozyten beeinflussen, untersuchten wir die Expression von TRPC-Kanälen in Psoriasis-Keratinozyten. Es konnte gezeigt werden, dass die Expression aller TRPC-Kanäle signifikant erniedrigt war. Vor dem Hintergrund der wichtigen Rolle der TRPC-Kanäle für die Calcium-Homöostase und Ausdifferenzierung von epidermalen Zellen, ist dies durchaus eine denkbare und plausible Erklärung für die Defekte der Psoriasis-Keratinozyten. Weiterhin zeigten unsere Ergebnisse, dass der CaR in Psoriasis-Keratinozyten vermindert exprimiert wird. Da dem CaR eine wichtige Rolle in der Regulation der [Ca2+]i als Antwort auf eine Änderung der [Ca2+]ex zugeschrieben wird, könnte dies eine weitere mögliche Erklärung für die gefundenen Störungen der Psoriasis-Keratinozyten sein.
Delthyridoid spiriferids are characterized by a global abundance and fast evolution during Silurian and Devonian, and, therefore, are used as important biostratigraphical and palaeobiogeographical tools. In this work, delthyridoid brachiopod faunas from different regions of today’s world, resp., of different palaeobiogeographical units, are compared side-by-side to investigate their phylogenetic relationships and to improve, in a second step, the palaeobiogeography from Late Silurian to Early Eifelian time. A new systematics of Delthyridoidae is established which is more complicated than hitherto assumed. The results of this study are mainly based on direct comparison of articulated and isolated brachiopod shells, external and internal moulds, as well as latex casts and serial sections. The computer supported cladistic analyses have turned out not to be useful due to different kinds of preservation resulting in an incomplete matrix which is insufficient for reliable cladograms. A further problem in terms of cladistical analyses are various convergences during the evolution of spiriferids. Many characters evolved independently from each other at different times in each lineage so that autapomorphies are hardly or not at all recognizable. As a result, families and genera are only definable by a combination of characters rather than by a single or a few autapomorphies. As a new method, 3D reconstruction from serial sections is introduced which made it possible for the first time to compare directly mouldic and shelly material. Preliminary results are presented herein. Statistical analyses of measurements taken from new taxa are made but regarded as a descriptive argument rather than a deciding factor for taxonmy due to incomplete preservation and/or tectonic deformation. Brachiopods, especially type material, from collections of different institutions and museums are studied as well as personal material, whenever possible collected from topotype outcrops. Emended diagnoses, if necessary, from family to species level are given. During this work several new taxa have been erected: 7 new families: Australospiriferidae, Murchisonispiriferidae, Orientospiriferidae, Otospiriferidae, Patriaspiriferidae, Rostrospiriferidae, and Trigonospiriferidae; 6 new genera, 1 of these in open nomenclature: Cyclopterospirifer, Hallispirifer, Parlinispirifer, Murchisonispirifer, Shujiapingensispirifer, and gen. nov. B; and 3 new species: Patriaspirifer merriami, Patriaspirifer johnsoni, and Murchisonispirifer feldmani; 1 taxon is defined as nomen novum: Orientospirifer nakaolingensis wani. In the framework of this project, 2 families: Filispiriferidae and Multispiriferidae; 1 subfamily: Multiplicatispiriferinae, 6 genera, 1 of them in open nomenclature: Frequentispirifer, Leonispirifer, Multiplicatispirifer, Ovetensispirifer, Turcispirifer, and Gen. A; and 9 new species, 3 of them in open nomenclature: Filispirifer hamadae, Leonispirifer leonensis, Multiplicatispirifer foumzguidensis, Oventensispirifer novascotianus, Quiringites arensentiae, Turcispirifer turciae, Multiplicatispirifer cf. foumzguidensis, Quiringites cf. arensentiae, and ?Turcispirifer sp. A which have already been established are also described in this work. The brachiopod faunas studied consist of externally very similar spiriferids which have been identified as same genera, species, or even subspecies in earlier times. These forms are considered as 6 distinct morphotypes Howellella-, Arduspirifer-, Acrospirifer-, Euryspirifer-, Paraspirifer-, and Multiplicatispirifer-like morphotypes, which are briefly introduced. The new systematics is characterized by different clades, the European/North African delthyridoid spiriferid clade, the North American delthyridoid spiriferid clade, the Asian delthyridoid spiriferid clade, the Malvinokaffric delthyridoid spiriferid clade, and the delthyridoid multiplicated spiriferid clade. Each of them is described in a cladistic and in a phylogenetic way. Their phylogenetic relationship sheds new light on palaeobiogeographical interpretations for the different stages from Late Silurian to early Middle Devonian time. A tendency for increasing endemicity is seen until the end of the Early Emsian, which is interrupted by short term regional faunal exchange within a province or within a realm, followed by a loss of endemicity resulting in global distribution of brachiopod genera until the end of Givetian time. The Old World Realm is re-defined due to the lack of phylogenetic relationship between its faunas and subdivided into the European Realm, consisting of the Gondwanan and Avalonian provinces, and the Asian Realm, consisting of the Siberian, Sino, and Mongolian provinces. A reconstruction of Lower Devonian palaeobiographical map is introduced.
TeaABC from the halophilic bacterium Halomonas elongata belongs to the family of tripartite ATP-independent periplasmic (TRAP) transporters. It facilitates the uptake of the compatible solutes ectoine and hydroxyectoine which protect the cell from dehydration by accumulating in the cytoplasm during hyperosmotic stress. It is the only known TRAP transporter activated by osmotic stress. Ectoine and hydroxyectoine accumulation in H. elongata is regulated by the cytoplasmic universal stress protein TeaD. The gene encoding TeaD is located in the same operon as the TeaABC gene. TeaD regulates the cellular homeostasis of ectoine possibly by interacting directly or indirectly with TeaABC. All subunits of TeaABC and TeaD were expressed in E. coli and purified. With TeaD and the solute binding protein (SBP) TeaA high levels of expression suitable for crystallization could be obtained and their 3D structures solved. The small transmembrane protein TeaB and the transporter TeaC showed only moderate and low levels of expression respectively. Functional analysis on TeaA was performed using Isothermal Titration Calorimetry. The measurements demonstrate that TeaA is a high affinity ectoine-binding protein (Kd = 0.19 _M) that also has a significant affinity for hydroxyectoine (Kd = 3.8 _M). The structure of TeaA was solved using ab initio phase determination by MAD (multiple anomalous dispersion). TeaA structures were determined in three conformations: TeaA alone, TeaA in complex with ectoine and TeaA in complex with hydroxyectoine. The resolutions of the structures were 2.2, 1.55 and 1.80 Å, respectively. These represent the first structures of an osmolyte SBP associated to a TRAP transporter. The structures reveal similar ligand binding compared to osmolyte SBPs of ABC transporter pointing to coevolution of the ligand binding modes. Moreover, unique features such as the solvent-mediated specific binding of the ligands ectoine and hydroxyectoine could be observed for TeaA. The structure of TeaD in complex with its cofactor ATP was solved by molecular replacement at a resolution of 1.9 Å. Comparison with other structures of universal stress proteins shows striking oligomerization and ATP binding in TeaD. In conclusion, this work presents the first detailed analysis of the molecular mechanisms underlying ligand recognition of an osmoregulated transporter from the TRAP-transporter family.
Strukturelle Analyse des CusCBA-Systems von Escherichia coli Kupfer ist als Kofaktor in vielen Enzymen ein essentielles Spurenelement. Die Aufrechterhaltung der Kupferhomöostase ist für die Zelle enorm wichtig, da es sich um ein redox-aktives Übergangsmetall handelt, das selbst in geringsten Konzentrationen toxisch wirkt. Gewöhnlich ist in der Zelle kein einziges freies Kupferion nachweisbar, da die Zelle redundante Mechanismen für die Detoxifikation von Kupfer besitzt. Ein Mechanismus zur Detoxifikation von Kupfer und Silber in E. coli ist das Cus-System. Es handelt sich um einen vierteiligen Effluxkomplex, der sich aus dem inneren Membranprotein CusA, dem periplasmatischen Membranfusionsprotein CusB und dem TolC ähnlichen äußeren Membranprotein CusC zusammensetzt. Das vierte Protein dieses Systems, CusF, dient im Periplasma als Kupferchaperon. Dieser Komplex ermöglicht das Ausschleusen von Cu(I)- und Ag(I)-Ionen aus dem Cytoplasma über das Periplasma und die äußere Membran in einem einzigen Schritt. In dieser Arbeit sollte die Röntgenstruktur des periplasmatischen Proteins CusB geklärt werden, um anhand struktureller Daten analysieren zu können wie CusA und CusC über CusB miteinander verbunden sind und welche Konformationsänderungen dabei vonstatten gehen. CusB wurde dafür über Ni2+-Chelat-Affinitätschromatographie und Größenausschluss-Chromatographie bis zur Homogenität gereinigt. Das Protein lag in Lösung als Monomer vor. Kristalle von CusB wurden nach der Dampfdiffusionsmethode des hängenden Tropfens hergestellt, wobei Kristalle in nur einem von 500 verschiedenen Ansätzen entstanden sind. Röntgenstreuung wurde bis zu einer Auflösung von 8 Å am ESRF (European Synchrotron Radiation Facility) in Grenoble gemessen. Die Streuung der Kristalle ließ starke Anisotropie und hohe Mosaizität erkennen. Um die Qualität der Kristalle von CusB zu verbessern, wurden Kristalle des Proteins ohne Hexahistidinanhängsel hergestellt. Diese Kristalle zeigten in Röntgenstreuungsexperimenten keine Verbesserung der Auflösung und Qualität. Die Röntgenstrukturen und Analysen durch Protease-Verdau von den zu CusB verwandten Proteinen AcrA und MexA zeigten, dass in diesen die N-Termini und C-Termini unstrukturiert sind. Deswegen wurden zunächst Konstrukte von CusB hergestellt in denen verschieden lange Bereiche des N-Terminus deletiert wurden. Ein Konstrukt von CusB, in dem die ersten 20 Aminosäuren deletiert waren, konnte in 10 von 500 Ansätzen kristallisiert werden. Nach Feinabstimmung der initialen Ansätze wurde für Kristalle dieses Konstrukts eine Auflösung von 5,3 Å am ESRF in Grenoble gemessen. Allerdings wies die Röntgenstreuung ebenfalls ein starke Anisotropie und Mosaizität auf, so dass die Struktur dieses Proteins nicht gelöst werden konnte. Strukturelle Analyse des RNAi-Suppressors B2 des Nodamura Virus: RNAi (RNA-Interferenz) bezeichnet einen sequenzspezifischen RNA-Degradationsprozess, um die Synthese eines Proteins zu verhindern. Zwei RNA-Typen wirken als Auslöser der RNAi: Doppelsträngige RNA dient als Vorläufer von siRNAs (small interfering RNAs), während einzelsträngige RNA mit Stamm-Schleifen-Strukturen als Vorläufer der miRNA (microRNA) dient. SiRNA und miRNA werden durch die Typ III Endonuklease Dicer im Cytoplasma produziert, sind 21-30 Nukleotide lang mit charakteristischen 2-NukleotidÜberhängen am 3’-Ende. Über den Komplex aus Dicer und dem doppelsträngige RNA-bindenden Protein R2D2 werden diese kleinen RNAs an das Protein Argonaute (AGO) abgeben. Dieses baut einen Strang der doppelsträngigen, kleinen RNAs über seine RNAse-Aktivität ab und hält den anderen (Führungs-) Strang gebunden. Daraufhin wird entweder komplementäre mRNA abgebaut oder die Translation komplementärer mRNA verhindert. RNAi dient im Organismus unter anderem der Verteidigung gegen Viren, wobei die Expression viraler Proteine durch RNAi verhindert wird. Durch Koevolution haben Viren allerdings Mechanismen zur Unterdrückung der RNAi in den Wirtszellen entwickelt. Ein RNAi Suppressor ist das Protein B2 des Nodamura Virus (NMV B2). Um Mechanismen und Gemeinsamkeiten der RNAi Suppression durch Viren analysieren zu können, wurde in dieser Arbeit die Röntgenstruktur der RNA bindenden Domäne von NMV B2 gelöst. Hierfür wurde ein Konstrukt (Aminosäuren 1-79) bis zur Homogenität aufgereinigt. Kristalle wurden mit einer Proteinkonzentration von 15 mg/ml mittels der Dampfdiffusions-Methode des hängenden Tropfens hergestellt. Diese wuchsen innerhalb von zwei Tagen als lange Nadeln mit Ausmaßen von 200 x 10 x 10 μm. Bei Messungen am ESRF in Grenoble wurde eine Auflösung bis 2,5 Å erreicht. Das Protein kristallisierte mit einem Dimer pro asymmetrischer Einheit. Die Kristalle wuchsen in der Raumgruppe P212121 mit den Einheitszelldimensionen a = 32.2, b = 56.6, c = 98.6. Die Phase wurde über molekularen Ersatz mit der Struktur des homologen Proteins B2 des Flock House Virus (FHV B2) bestimmt. Die Struktur stellte sich als ein gestrecktes Dimer mit einer Größe von ca. 55 x 10 x 15 Å, bestehend aus drei Alpha-Helices pro Monomer dar. Trotz geringer Sequenzidentität von NMV B2 und FHV B2 zeigten beide Strukturen ein Vier-Helix-Bündel, das von einer sehr kurzen Helix am C-Terminus bedeckt ist. Bei einem Vergleich der RNA-bindenden Aminosäurereste der beiden Strukturen fällt ein hoher Grad an Konservierung auf. Von zehn RNA-interagierenden Resten sind fünf identisch. Die RNA bindenden Reste werden von beiden Monomeren des Dimers beigetragen. So ist wohl mindestens ein Dimer für die RNA-Bindung durch B2 Proteine notwendig.
Die zellfreie Proteinsynthese hat sich in den letzten Jahren zu einem potenten Werkzeug – auch in der Produktion von Membranproteinen – entwickelt. Da keine lebenden Zellen genutzt werden, kann der Prozess der präparativen Membranproteinproduktion vereinfacht und individuell optimiert werden. Im Gegensatz zu konventionellen zellbasierten Expressionssystemen gewährleistet die zellfreie Proteinsynthese die direkte Zugänglichkeit zum Reaktionsort und damit die Möglichkeit der unmittelbaren Kontrolle. Dies ermöglicht eine genaue Anpassung der Reaktionsbedingungen auf das Zielprotein. Die Verbesserung und Entwicklung neuer Modi der zellfreien Membranproteinsynthese war ein Teil der vorliegenden Arbeit. Setzt man dem Zellfrei-System von Außen keine hydrophobe Umgebung zu, so präzipitiert das neu-synthetisierte Membranprotein im Reaktionsmix (P-CF). Interessanter Weise unterscheiden sich diese Präzipitate von den aus der E.coli zellbasierten Proteinproduktion bekannten Einschlußkörperchen, da sie sich teilweise leicht in mildem Detergenz resolubilisieren lassen. Zudem konnte für verschiedene Transportproteine, die aus Präzpitat resolubilisiert und danach in Liposomen rekonstituiert wurden, spezifische Transportaktivität gezeigt werden (z.B. eukaryotische Ionentransporter, Multi-Drug Resistenzproteine von E.coli). Alternativ können die Membranproteine direkt, durch die Zugabe von Detergenzien in den Reaktionsmix, solubilisiert werden (D-CF). Um die einzelnen Expressionsmodi zu optimieren wurden 24 gebräuchliche Detergenzien auf ihre Eigenschaft hin gestestet, strukturell sehr unterschiedliche Membranproteine zu solubilisieren. Die Familie der langkettigen Polyoxyethylen-alkyl Ether hat sich dabei als sehr geeignet erwiesen um das prokaryotische α-helikale Multi-Drug Resistenzprotein EmrE, den bakteriellen vornehmlich aus ß-sheets bestehenden Transporter Tsx und den eukaryotischen G-Protein gekoppelten Vasopressin Rezeptor V2R direkt im D-CF Modus zu solubilisieren. Zudem konnte eine Abhängigkeit der spezifischen Aktivität von Tsx vom verwendeten Expressionsmodus bzw. des verwendeten Detergenz mit Hilfe der Black Lipid Membrane´ Methode gezeigt werden. Die Expression eines repäsentativen Teils von 134 Zielproteinen des inneren Membranproteoms von E.coli wurde in drei verschiedenen Zellfrei-Expressionsmodi getestet. Ein an jedes Zielprotein des Membranroteoms C-terminal fusioniertes GFP diente der Konzentrationsbestimmung im D-CF Expressionsmodus. Die Faltung von GFP ist in Anwesenheit von Detergenz signifikant reduziert. Zunächst wurden alle Zielproteine in einem batch´ System im D-CF Modus im Mikrotiterplatten Maßstab mit Hilfe eines Roboters hergestellt. Die Etablierung einer robotergestützten Plattform, welche das Pipettieren, Inkubieren und Detektieren kombiniert, diente als Grundlage für den Herstellungsprozess des Membranroteoms von E.coli in einem Medium-Durchsatz Verfahren in batch´ Konfiguration. In dieser ersten Stufe des Screens im D-CF Modus konnten 84 Zielproteine (63%) aufgrund der detektierten GFP-Fluoreszens in Mengen von 1 bis 60μg pro mL Reaktion als erfolgreich produziert identifiziert werden. Zudem wurde das Membranproteom in dem effektiveren continous exchange (CE) Verfahren im P-CF, wie auch im D-CF Modus wiederholt exprimiert. Im Vergleich zur batch´ Konfiguration konnten im CE D-CF Modus deutlich mehr Zielproteine (75%) als positiv identifiziert werden. 16 Zielproteine wurden dabei bereits in Expressionsmengen von mehr als 100μg solubilisierte Membranproteinfusion pro mL Reaktionsmix gewonnen. 99 Zielproteine (74%) konnten als positiv identifiziert werden, nachdem die unlösliche Fraktion der CE P-CF Reaktion elektrophoretisch getrennt und angefärbt wurde. Für 66 Kandidaten (49%) stellt das produzierte Protein nach Coomassie-Färbung eine dominante Bande, und damit (semi-)präparative Proteinmengen, dar. Der Erhalt von Detergenz-solubilisierten Membranproteinproben von hoher Qualität ist ein wichtiger Schritt zur Gewinnung struktureller sowie biochemischer Daten. Das E.coli α-helikale Multi- Drug Resistenz Protein SugE konnte im CE P-CF Verfahren in präparativen Mengen von mehr als 2mg Protein pro mL des Reaktionsansatzes gewonnen werden. Durchgeführte analytische Größenausschlusschromatographie zeigte, dass der Transporter unter optimierten Reaktionsbedingungen in einem homogenen, schlanken Peak eluiert. Mittels elektronenmikroskopischer Gefrierbruchanalysen konnte eine effiziente und homogene Rekonstitution von SugE in E.coli Liposomen gezeigt werden. Bindungsstudien unter der Verwendung fluoreszensbasierter Anisotropie-Messungen haben gezeigt dass Proflavin – im Gegenteil zu Ethidium – ein Substrat von SugE ist. YedZ ist ein 24kDa leucinreiches Membranprotein mit sechs putativen Transmembransegmenten und enthält zwei Kofaktoren, ein Häm b und ein Flavin-mononukleotid (FMN). Im P-CF Modus exprimiertes YedZ kann effizient in den Detergenzien LMPG, LPPG, SDS und DPC resolubilisiert werden. Analytische Größenausschlusschromatographie zeigte einen symmetrischen Elutionspeak der apo-Form. Mittels CD-Spektroskopie des gereinigten apo-YedZ in 0.02% DDM wurde ein α-helikaler Sekundärstrukturanteil von 55% ermittelt. Zur Gewinnung von holo-YedZ wurde anstatt Hämb das chemisch verwandte Hemin eingesetzt. Die aufgenommenen UV/Vis Spektren der zellfrei produzierten holo-YedZ Proteinprobe in ihrer oxydierten und reduzierten Form, zeigen zu einer in vivo exprimierten Vergleichsprobe identische Absorptionsmaxima. Für sechs G-Protein gekoppelten Rezeptoren konnte die zellfreie Expression in präparativen Mengen gezeigt werden. Das Steroid-Derivat Digitonin, sowie einzelne Mitglieder der Detergenzfamilie der langkettigen Polyoxyethylen-alkyl Ether, wurden als am geeignetsten für die lösliche Expression der GPCRs im CE D-CF Verfahren ermittelt. Löslich in Anwesenheit von Brij78 produzierter GPCR Proben, zeigten nach Negativfärbung in elektronenmikroskopischen Einzelpartikelanalysen eine homogene Probenpräparation und geben Hinweis auf eine strukturelle Dimerisierug der Rezeptoren. Detergenzsolubilisierte Rezeptoren konnten in Liposomen, basierend auf E.coli Lipid-Mischungen, rekonstituiert werden. Elektronen-mikroskopische Gefrierbruchanalysen zeigten eine homogene Rekonstitution, welche auf eine funktionelle Faltung der Rezeptoren schließen lässt.
NADPH-Oxidasen der Nox-Familie sind eine wichtige Quelle für reaktive Sauerstoffspezies (ROS, reactive oxygen species) in verschiedenen Geweben und Zellen. Die Isoformen der NADPH-Oxidase unterscheiden sich dabei in ihrer physiologischen Funktion: Während Nox1 und Nox2 eher akute, Agonisten-induzierte ROS-Signaltransduktion vermitteln, sind Nox4-abhängig produzierte ROS an chronischen Prozessen wie Differenzierung beteiligt. Die Isoformen der NADPH-Oxidase unterscheiden sich darüber hinaus in ihrer intrazellulären Lokalisation, der Art der Aktivierung und der Spezies der abgegebenen ROS. Nox1 muss durch die Interaktion mit zytosolischen Untereinheiten (NoxA1 und NoxO1) aktiviert werden und produziert dann hauptsächlich Superoxidanionradikale (O2-). Nox4 dagegen ist unabhängig von zytosolischen Untereinheiten und somit konstitutiv aktiv und setzt eher Wasserstoffperoxid (H2O2) in den Extrazellulärraum frei. Zwischen diesen Unterschieden, deren strukturelle Ursachen weitgehend unbekannt sind, und den unterschiedlichen Funktionen von Nox1 und Nox4 besteht wahrscheinlich ein Zusammenhang. In transfizierten HEK293-Zellen konnte zunächst durch Immunofluoreszenz-Mikroskopie und subzelluläre Fraktionierung gezeigt werden, dass Nox1 in der Plasmamembran lokalisiert ist und Nox4 in der Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER) verbleibt. Um die strukturellen Unterschiede zwischen Nox1 und Nox4, die eine Rolle bei der intrazellulären Lokalisation, den Aktivierungsmechanismen und der Art der abgegebenen ROS spielen könnten, zu identifizieren, wurden chimäre Proteine aus Nox1 und Nox4 konstruiert und analysiert. Zunächst konnte gezeigt werden, dass die konstitutive Aktivität von Nox4 durch den zytosolischen Bereich vermittelt wird. Dafür ist allerdings der komplette zytosolische Bereich ab der 6. Transmembrandomäne nötig, chimäre Konstrukte mit einem kürzeren Anteil des zytosolischen Bereichs von Nox4 waren nicht aktiv. Für die Aktivierung von Nox1 dagegen ist der zytosolische Bereich nicht ausreichend, vermutlich spielen weitere Interaktionen mit Bereichen im transmembranen Teil des Proteins ebenfalls eine Rolle. Für die korrekte intrazelluläre Lokalisation benötigen Membranproteine ein N-terminales Signalpeptid. Wenn das vorhergesagte Signalpeptid von Nox1 durch das von Nox4 ausgetauscht wurde, zeigte dieses chimäre Protein keine Plasmamembran-Lokalisation mehr, es war stattdessen in vesikelähnlichen Strukturen unterhalb der Plasmamembran lokalisiert. Das Signalpeptid von Nox1 war nicht dazu in der Lage, Nox4 zur Plasmamembran zu transportieren, das Protein war weiterhin im ER lokalisiert, was darauf hindeutet, dass Nox4 noch weitere Mechanismen besitzt, die seine ER-Lokalisation bedingen. Der Austausch des Signalpeptids von Nox4 gegen das von Nox1 führte dazu, dass das chimäre Protein statt H2O2 O2- produzierte. Dieses Ergebnis spricht dafür, dass der N-Terminus von Nox4 bei der H2O2-Produktion eine Rolle spielt. Experimente mit Nox1 und Nox4 mit N-terminalem Myc-Tag deuteten darauf hin, dass nur der N-Terminus von Nox1 prozessiert wird, also dass das Signalpeptid während der co-translationalen Translokation abgespalten wird. Ohne Signalpeptid waren sowohl Nox1 als auch Nox4 inaktiv. Die dritte extrazytoplasmatische Schleife von Nox4 enthält 28 zusätzliche Aminosäuren verglichen mit Nox1, die sich auf zwei Bereiche aufteilen. Eine Deletion der Aminosäuren, die nur in Nox4 vorhanden sind, führte dazu, dass das Protein O2- anstelle von H2O2 produzierte, ohne dass die intrazelluläre Lokalisation verändert wurde. Zwei konservierte Cysteine innerhalb der deletierten Bereiche scheinen bei diesem Prozess eine Rolle zu spielen, vermitteln den Effekt aber nicht alleine, da nach Mutation dieser Cysteine die Umkehr der ROS-Produktion nicht ganz so stark war wie bei der Deletion der kompletten Bereiche. In Nox1 sind die Cysteine wahrscheinlich in die Aktivierung des Proteins involviert, da deren Mutation die Aktivität von Nox1 reduzierte. Der N-Terminus und die dritte extrazytoplasmatische Schleife von Nox4 sind somit an einem Prozess beteiligt, der die H2O2-Produktion von Nox4 vermittelt. Die entsprechenden Abschnitte in Nox1 scheinen andere Funktionen zu erfüllen. Das Signalpeptid von Nox1 ist für die korrekte intrazelluläre Lokalisation in der Plasmamembran verantwortlich; die dritte extrazytoplasmatische Schleife ist wahrscheinlich an der Aktivierung des Proteins beteiligt. In dieser Arbeit konnten also strukturelle Unterschiede zwischen Nox1 und Nox4 in verschiedenen Bereichen der Proteine identifiziert werden, die für die unterschiedliche intrazelluläre Lokalisation und die Art der produzierten ROS verantwortlich sind.
Neuropathische Schmerzen werden durch Läsionen im zentralen oder peripheren Nervensystem ausgelöst. Sie treten z.B. bei der diabetischen Polyneuropathie oder nach einem Bandscheibenvorfall auf und sind durch die Symptome Allodynie und Hyperalgesie gekennzeichnet. Bislang lassen sich neuropathische Schmerzen nur unzureichend behandeln, weshalb ein großer Bedarf an neuen, besser wirksamen und verträglicheren Arzneimitteln besteht. Die Voraussetzung für die Entwicklung neuer Arzneimittel ist die Erforschung der molekularen Mechanismen von Neuropathien. Im ersten Projekt dieser Dissertation sollten deshalb mit Hilfe der differenziellen Gelelektrophorese Proteine identifiziert werden, die nach Induktion neuropathischer Schmerzen im Lumbalmark von Ratten reguliert sind. Durch vergleichende Proteomanalyse konnte gezeigt werden, dass 55 Proteine 7 Tage nach Induktion neuropathischer Schmerzen im Lumbalmark der Ratte differenziell exprimiert werden. 54 Proteine zeigten ein verminderte, und ein Protein eine gesteigerte Expression im Modell der „spared nerve injury“ (SNI). Durch massenspektrometrische Analyse der Proteinspots konnten 38 Proteine eindeutig identifiziert werden. Einige dieser Proteine sind möglicherweise an zentralen Sensibilisierungsvorgängen beteiligt und könnten somit als neue Zielmoleküle für die Schmerztherapie fungieren. Die meisten der deregulierten Proteine stehen im Zusammenhang mit dem Energiestoffwechsel und dem zellulären Metabolismus. Aufgrund der verminderten Expression dieser Proteine deutet vieles darauf hin, dass es 7 Tage nach SNI auf spinaler Ebene zu degenerativen Prozessen wie z.B. dem Abbau der Myelinscheide kommt. Mit einer Reihe ausgewählter Proteine wurden zusätzlich Genexpressionsanalysen mittels RT-PCR durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass zahlreiche Proteine, die im DIGE Experiment auf Proteinebene eine reduzierte Expression aufwiesen, schon auf Transkriptionsebene reguliert sind. Einige Gene waren in ihrer mRNA-Expression jedoch nicht verändert, was ein Hinweis darauf ist, dass die beobachteten Regulationen auf translationale bzw. posttranslationale Modifikationen zurückzuführen sind. Eines der Proteine, welches aufgrund der peripheren Nervenläsion eine deutlich geringere spinale Expression zeigte, wurde anhand des Massenspektrums als Latexin identifiziert. Latexin ist ein Inhibitor der Carboxypeptidase A Aktivität und spielt bei der Schmerzweiterleitung und Schmerzverarbeitung eine Rolle. Darüber hinaus wurde der Abbau von Latexin in der Literatur mit der neurodegenerativen Erkrankung Morbus Alzheimer in Verbindung gebracht. In der vorliegenden Arbeit wurde die periphere und zentrale Expression von Latexin mit Hilfe verschiedener molekularbiologischer Methoden untersucht. Dabei zeigte sich, dass Latexin unter neuropathischen Bedingungen im Lumbalmark sowohl auf Transkriptionsebene, als auch auf Translationsebene signifikant reduziert vorliegt. Zusätzlich wurde mit Hilfe eines Aktivitätsassays nachgewiesen, dass eine verminderte Latexinexpression zu einer signifikanten Erhöhung der Carboxypeptidase-Aktivität führt. Im peripheren Nervensystem konnte im Gegensatz zum zentralen Nervensystem keine Modulation von Latexin beobachtet werden. Um die funktionelle Relevanz von Latexin bei neuropathischen Schmerzen zu charakterisieren, wurden am Ende der Dissertation rekombinante Adenoviren hergestellt, mit deren Hilfe eine spinale Latexinüberexpression erreicht werden sollte. Die dazugehörigen Tierversuche wurden erst nach Abschluss dieser Arbeit durchgeführt. Im Vorfeld dieser Arbeit wurden mit NF-kappaB p50 Knockout-Mäusen mehrere Schmerztests durchgeführt, die gezeigt haben, dass p50 Knockout-Mäuse im Vergleich zu Wildtyp-Tieren signifikant weniger akute und chronische Entzündungsschmerzen hatten. In einem zweiten Projekt sollte deshalb untersucht werden, welche molekularen Mechanismen dem verminderten Schmerzverhalten der Knockout Tiere zugrunde liegen. Anhand von RT-PCR Experimenten konnte gezeigt werden, dass das NF-kappaB abhängige, proinflammatorische Gen COX-2 8 Stunden nach Zymosaninjektion in eine Hinterpfote bei den Wildtyp-Tieren im Lumbalmark signifikant erhöht war, während bei den Knockout-Mäusen keine signifikante Veränderung zu beobachten war. Weiterhin wurden Änderungen der Proteinexpression und der Genexpression im Lumbalmark von NF-kappaB Knockout- und Wildtyp-Tieren mittels 2D-Gelelektrophorese bzw. RNA-Microarray untersucht. Beim Vergleich der Proteinexpressionsmuster zeigten sich bei 5 Proteinen Regulationen infolge der p50 Deletion, während mit Hilfe des RNA-Microarrays 7 differenziell exprimierte Gene identifiziert werden konnten, die auf das Fehlen der p50 Untereinheit zurückzuführen sind. Zusammenfassend lässt sich aus diesen Befunden schlussfolgern, dass die p50 Untereinheit des Transkriptionsfaktors NF-kappaB als Zielmolekül für die Therapie akuter und chronischer Entzündungsschmerzen geeignet sein könnte. Es wird vermutet, dass die p50 Untereinheit von NF-kappaB bei chronischen Entzündungsschmerzen auf zentraler Ebene an einer Aktivierung proinflammatorischer Stimuli beteiligt ist, während p50 bei akuten Schmerzen wahrscheinlich eine konstitutive Rolle spielt.
Mitochondria are dynamic organelles indispensible for viability of eukaryotic cells. Diffusion of proteins in mitochondrial membranes is a prerequisite for the correct functionality of the organelles. However, its study is made complicated due to the nontrivial geometry, small size and positional instability of the organelle, restricting the usability of regular experimental methods and theoretical understanding of acquired data. Therefore, here the molecular transport along the main mitochondrial axis was investigated using highly accurate computational methods combining them with traditional experimental approaches. Using recently reported electron microscopic tomography data concerning the constitution of mitochondria [Fre02], a lattice model of the inner mitochondrial membrane (IM) reproducing its structure in great details was built up. With Monte Carlo (MC) simulations of particle dynamics on this model, it was found that the membrane geometry induces nonlinear effects in the motion of molecules along the mitochondrial axis, which in turn lead to a transient violation of the 2nd Fick?s equation. We show that mere curvature of the IM resulting from the presence of cristae is sufficient for the emergence of transient anomalous diffusion (TAD) in the membrane. The MC calculations have enabled an accurate estimation of regularities in the extent of deviations from the normal regime, therefore allowing us to propose non-homogenous power law as a suitable generalization of the current approach to the analysis of experimental data for the transient dynamics. The general cause of TAD resulting from the membrane curvature alone, without any involvement of specific inter-particle interactions prompted us to predict the similar dynamical effect also for other curved cellular membranes, be it diffusion in endoplasmic reticulum or in plasma membrane of cells possessing dense microvilli. The data indicate that the geometry-induced anomalous diffusion should be easily detectable with current experimental methods, but only in the restricted range of time scales corresponding to high temporal resolution. Until now, experimental measurements of molecular diffusion in biological membranes indiscriminately assumed either pure normal or pure anomalous diffusion schemes for the analysis of data acquired in very wide range of temporal resolutions, which often lead to ambiguities in the interpretation of diffusion parameters. The MC calculations have clearly illustrated the necessity for a more subtle treatment of experimental conditions: the assumption of pure Gaussian diffusion model is justified only if the applied temporal resolution is sufficiently low (as is often the case when using scanning techniques exemplified further); otherwise, the transient regime should be tested for by means of the non-homogenous power function. In the second part of the study the Fluorescence Recovery after Photobleaching (FRAP) with the laser scanning microscope is introduced as a method of choice for studying protein mobility within mitochondrial membranes. The conventional FRAP methodology [Axe76] was extended to enable its application for the determination of confined diffusion with conventional laser scanning microscopes which allowed us to communicate for the first time the direct measurement of protein diffusion in mitochondrial membranes of living cells. This is achieved through adaptation of FRAP data analysis to account for the spatial dimensions of the organelle and the spatiotemporal pattern of light pulses induced by the microscope. The experimental circumstances existing during the particular measurement session are computationally recreated and this way the best suited values of diffusion parameters are found. The method is validated experimentally for four FP-tagged mitochondrial membrane proteins: the IM OxPhos complexes F1F0 ATPase and cytochrome c oxidase and for Tom7 and hFis1 - components of the mitochondrial protein import and fission machineries respectively localized in the outer membrane. We find that for all proteins simple normal diffusion is not a sufficient description. In the inner membrane, diffusion coefficient of F1F0 ATPase expressed in HeLa cell line is found to be 0.2 ?m2/s, with more than 1/3 of the protein molecules being immobilized, while cytochrome c oxidase (in CEF primary cells) demonstrated a similar diffusivity pattern (0.4 ?m2/s, 30% immobile). In the outer membrane, the D (0.7 ?m2/s) and immobile fraction (7-8%) of GFP-Tom7 and GFP-hFis1 (both in HeLa cells) are identical, which designates a substantial difference in comparison to the IM protein mobility. Diffusion coefficients of mitochondrial membrane proteins studied here lay in the intermediate region between those measured in artificial bilayers and in plasma membranes. Protein crowding and intermolecular interactions will be among the major causes responsible for the detected slowdown of diffusion.
Channelrhodopsin-2, or ChR2, is a light-gated inward rectifying cation channel. Ever since its first characterisation (Nagel et al., 2003), it has been used extensively in the light-activated control of neural cells in culture as well as in living animals like mice, Caenorhabditis elegans and Drosophila melanagaster. Despite its broad application in the field of neuroscience, little is known about the properties of this ion channel. The aim of this thesis is to elucidate the single channel conductance under different conditions using stationary noise analysis on whole cell recordings of a HEK293 cell line that stably expresses the truncated ChR2 (amino acids 1-315), which behaves identically to the full length protein (Nagel et al., 2003). Stationary noise analysis is based on the fact that the ion channel noise due their opening and closing has a characteristic form of a plateau at low frequency points and a following decrease of power with 1/f² in difference power spectra, which are composed of the difference of fast Fourier transformed (FFT) stationary whole-cell recordings with and without illumination. From the parameters yielded by an approximation of the power spectra with a Lorentzian function the single channel conductance can be estimated. The single channel conductance of ChR2 was determined at -60 mV applied for different cations, yielding values of 91 ± 25 fS (Guanidine+), 42 ± 7 fS (Na+), 61 ± 18 fS (Li+) and 37 ± 14 fS (Methylammonium+). With 200 mM Guanidine+ outside of the cells and measurements between 0 mV and -60 mV applied, it could be shown that the inward rectification is still present on the scale of the single channel. Noise Analysis with concentrations between 40 and 200 mM Guanidine+ showed a saturation of the single channel conductance with high Guanidine+ concentrations with a maximal conduction of 129 ± 9 fS (Michaelis Menten approximation: Km = 82 ± 14 mM). Activation Energies of the rate constants k (2πfc, with fc = corner frequency of the Lorentzian function) and koff (1/τoff, with τoff = closing time of the channel at -60 mV) were determined to be 75 ± 23 kJ/mol and 64 ± 11 kJ/mol, respectively, which are similar to the value determined for the Channelrhodopsin-1 closing times (~60 kJ/mol; Nagel et al., 2002). The activation energy of the ChR2 single channel conductance was determined to be 21.2 ± 20.8 kJ/mol, which also is similar to the activation energy of the ChR1 current amplitude (20 kJ/mol; Nagel et al., 2002). The amount of active ChR2 channels in the membrane (160,000 or 226 ChR2/μm²) as well as the single channel current (-7.5 ± 0.6 fA) could be determined by variation of the light intensity (0.05 mW mm-2 to 5.3 mW mm-2). In the course of this thesis, the single channel parameters of the ChR2 mutant H134R were also determined. H134R had been previously published as a “gainof- function” mutant (Nagel et al., 2005a). The increased macroscopic current amplitude of H134R could be explained by an increased lifetime of the channel in comparison to the wildtype ChR2. Within the margin of error both single channel conductances in the presence of 200 mM Guanidine+ of the wildtype (91.1 ± 24.9 fS) and the H134R (89.4 ± 30.7 fS) are the same. In the presence of 200 mM Lithium+ values of 60.6 ± 17.8 fS for the wildtype ChR2 and 50.8 ± 9.6 fS for the H134R mutant were determined. This thesis marks the first in depth analysis of the single channel conductance of ChR2. Using stationary noise analysis the single channel conductance of Channelrhodopsin-1 as well as interesting Channelrhodopsin-2 mutants can also be analysed in the future.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion des in der Membran des Endoplasmatischen Retikulum lokalisierten Proteins Gsf2 der Hefe Saccharomyces cerevisiae näher charakterisiert. Gsf2 ist ein 46 kDa großes ER-Transmembran-Protein mit zwei membrandurchspannenden Domänen, wobei C- und N-Terminus cytosolisch orientiert sind. Zudem besitzt Gsf2 C-terminal ein klassisches Dilysin-Motiv. Dies deutet daraufhin, dass Gsf2 über den retrograden Transportweg mittels COPI-Vesikel recycelt wird. Dies impliziert auch einen Transport von Gsf2 über den anterograden Transportweg [COPII]. Bisherige Befunde deuteten darauf hin, dass Gsf2 in das sekretorische System involviert ist. Eine Deletion des GSF2-Gens resultiert in einer Retention der Hexosetransporter Hxt1, Hxt3 und Gal2 im ER. Für die Identifikation von potentiellen Interaktionspartnern von Gsf2 im sekretorischen System wurden Protein-Protein-Interaktionsstudien mit Hilfe des Split-Ubiquitin-Systems [SUS] durchgeführt. Dabei konnten Interaktionen zwischen den Proteinen Sar1, Sec12, Hxt1 und dem Sec61-Translokations-Komplex mit dem vermeintlichen Verpackungschaperon Gsf2 identifiziert werden. Zusätzlich konnte unter Anwendung einer Pull-Down-Analyse die Interaktion zwischen Gsf2 und Hxt1 biochemisch bestätigt werden. Zur Aufklärung von funktionellen Domänen, wurde ein in Gsf2 identifiziertes potentielles ER-Export-Motiv [RR](F)[RR] durch den Austausch durch fünf Alanine modifiziert. Die Veränderung der Aminosäuresequenz [RR](F)[RR] (354-358 AS) in Gsf2 bewirkte einen partiellen Funktionsverlust bei einer restriktiver Temperatur von 37°C. Des Weiteren deuteten mehrere Anhaltspunkte darauf hin, dass Gsf2 mit Hxt1 in COPII Vesikel verpackt wird. Eine Aufreinigung von konstitutiven COPII-Vesikel aus in vivo erwies sich experimentell als nicht durchführbar. Deshalb wurde ein in vitro Ansatz [COPII vesicle budding assay] ausgewählt. Dafür wurden die für die Vesikelbildung benötigten Komponenten aufgereinigt und mit ER-Donormembranen inkubiert. Mittels Western-Blot-Analyse konnte Gsf2 in COPII Vesikeln nachgewiesen werden. Das Vorhandensein eines klassischen Rücktransport-Motivs (KKSN) am C-Terminus von Gsf2 weist zudem daraufhin, dass das Protein über den retrograden Transportweg [COPI] zurück zum ER transportiert wird. Durch die Blockade des retrograden Transportweges mit anschließender Lokalisationsuntersuchungen mittels Saccharosedichtegradienten-Zentrifugation und Fluoreszenzmikroskopie konnte eine Fehlverteilung von Gsf2 an der Plasmamembran festgestellt werden. Somit wird Gsf2 möglicherweise über den retrograden Transportweg recycelt. Postuliert wird ein Modell bei dem Gsf2 für die Aufkonzentration spezifischer Cargomoleküle [Hxt1] an ER-Exit-Sites zuständig ist und deren Verpackung in COPII Vesikel gewährleistet. Anschließend wird es über den retrograden Transportweg zurück zu ER transportiert.
Das große therapeutische Potential der RNA Interferenz wird dadurch deutlich, dass sich wenige Jahre nach der Entdeckung die ersten potentiellen RNAi Medikamente in den klinischen Teststudien befinden. Jedoch müssen bis zur therapeutischen Anwendung im großen Maße noch einige Hindernisse überwunden werden. Um eine optimale Wirkung der siRNAs gewährleisten zu können müssen folgende Punkte beachtet werden: - Erhöhte Nuclease-Resistenz - Effiziente zelluläre Aufnahme - Keine Off-Target Effekte - in vivo geringe Toxizität Das richtige Design der siRNAs ist somit von enormer Bedeutung. Hierfür bedient man sich verschiedener Modifikationsmöglichkeiten wie z.B. Basenmodifikationen, Modifikationen an der 2´-O-Position sowie am Phosphatrückrat. Im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit ist es gelungen verschiedene Syntheserouten zur Darstellung von Nucleosiden mit kationischen sowie neutralen 2´-O-Modifikationsmotiven zu erarbeiten und zu optimieren. ...
1. Der Abgleich der Genprodukte von PA0119, PA0120 und PA0121 ergab, dass PA0119 68%ige Ähnlichkeit mit dem DctA-Transporter von S. meliloti besitzt. Das Genprodukt PA0120 zeigt eine 46%ige Ähnlichkeit mit dem Transkriptionsregulator LctR von E. coli und trägt konservierte Domänen der GntR- sowie der FCDSuperfamilie. Das Genprodukt PA0121 weist eine 44%ige Ähnlichkeit mit einem hypothetischen Transkriptionsregulator von Streptomyces ambofaciens auf. 2. Es konnte gezeigt werden, dass die drei offenen Leserahmen (ORFs) PA0119, PA0120 und PA0121 von P. aeruginosa in mRNA transkribiert werden und somit Gene sind. In den späten CF-Isolaten M25 und M26 ist deren Transkriptmenge im Vergleich zum frühen CF-Isolat M1 sowie zum Referenzstamm P. aeruginosa PAO1 um das 14fache erhöht. 3. Mit Hilfe von RT-PCR Analysen konnte gezeigt werden, dass die drei Gene PA0119, PA0120 und PA0121 eine Transkriptionseinheit bilden und somit in einem Operon P0119-PA0121 organisiert sind. Die angrenzenden ORFs PA0118 und PA0122 konnten dieser Transkriptionseinheit nicht zugeordnet werden. 4. Analysen der Promotor-Reportergenfusion führten zu dem Schluss, dass die Strukturgene PA0119, PA0120 und PA0121 des Operons von einer stromaufwärts von PA0119 lokalisierten Promotorsequenz transkribiert werden. Der Promotor liegt ca. 237 bp vor dem Start von PA0119. Darüber hinaus konnte eine FadR-ähnliche Bindestelle in der Promotorregion P119-121 abgeleitet werden. 5. Der Promotor P119-121 zeigt in mit Dicarboxylaten supplementiertem Minimalmedium M9 eine 2-3fach erhöhte Promotoraktivität gegenüber dem mit Glukose supplementierten Minimalmedium M9. In Gegenwart von Dicarboxylaten erfährt der Promotor P119-121 somit eine Induktion bzw. durch Glukose eine Repression. 6. Der Promotor P119-121 wird wachstumsphasenabhängig reguliert. Die Abhängigkeit der Promotoraktivität von RhlI, RhlR und RpoS indiziert eine Quorum Sensingsowie RpoS-abhängige Regulation des Promotors P119-121. 7. Eine mit PA0119 durchgeführte heterologe Komplementation einer DctA-Mutante von S. meliloti führte zu einer partiellen Wiederherstellung der Fähigkeit der DctAMutante, auf den Dicarboxylaten Succinat und Fumarat wachsen zu können. Dieser Befund indiziert zusammen mit den vier konservierten Motiven, die bisher in charakterisierten Dicarboxylat-Transportern gefunden wurden, dass PA0119 potentiell einen Dicarbonsäure-Transporter in P. aeruginosa darstellt. 8. Mutantenstudien mit den generierten Mutanten ΔPA0119Ω, PA0120Ω und ΔPA0121Ω zeigten im Vergleich zum Wildtyp allerdings kein abweichendes Kulturwachstum; weder in den nährstoffreichen Medien ASM und LB noch im Minimalmedium M9, das jeweils mit 40 mM Succinat bzw. Glutamat supplemiert wurde. Dies wurde durch MicroArrayTM-Analysen mit den Biolog-Platten PM1 und PM2 bestätigt. Daraus wird deutlich, dass keine der hier angebotenen C-Quellen (siehe Anhang) ausschließlich von PA0119 transportiert wird. Auch die Verwertung dieser C-Quellen wird nicht durch die in den Mutanten PA0120::Ω und ΔPA0121::Ω ausgeschalteten Genprodukte beeinflusst. 9. In der Biolog-Platte PM10a schien ΔPA0119::Ω gegenüber PAO1 in den Kavitäten C1 (pH5.5, Methionin) und C10 (pH 5.5, Ornithin) eine leicht abweichende Stoffwechselaktivität zu besitzen. Dies indiziert eine mögliche pH-Abhängigkeit des potentiellen PA0119-Transporters. 10. Im Minimalmedium M9, supplemiert mit Glutamat, zeigt die Mutante ΔPA0119::Ω unter unter erhöhten osmotischen Bedingungen gegenüber dem Wildtyp PAO1 eine reduzierte Wachstumsrate. Dies indiziert, dass PA0119 unter erhöhten osmotischen Bedingungen am Transport von Dicarboxylaten, wie Glutamat, in die Zelle beteiligt sein könnte. 11. Biofilmbildung stellt die bevorzugte Wachstumsform von P. aeruginosa in der CF-Lunge dar. Das Genprodukt PA0120 zeigt zudem eine Ähnlichkeit mit dem Regulator LctR, und es wurde gezeigt, dass eine LctR-Mutante von E. coli in ihrer Fähigkeit zur Biofilmbildung beeinträchtigt ist. Die Untersuchung der ΔPA0119::Ω- und der PA0120::Ω-Mutanten zeigt im Vergleich zum Wildtyp im LB-Medium eine Beeinträchtigung in der Anheftung an Mikrotiterplatten. Dies indiziert, dass sowohl der potentielle Transporter PA0119 als auch der potentielle Transkriptionsregulator PA0120 an der Biofilmbildung von P. aeruginosa beteiligt sind. 12. Die Messung der Promotoraktivität in der ΔPA0119::Ω-Mutante zeigt eine Repression des Promotors an. In der PA0120::Ω-Mutante dagegen findet sich eine zweifache Induktion des Promotors vor PA0119-PA0121. Dies Ergebnis wird durch die Ergebnisse der Real-Time-PCR-Analysen untermauert, da in der PA0120::Ω-Mutante signifikant erhöhte Transkriptmengen des PA0119-Gens detektiert wurden. Bei der ΔPA0121::Ω-Mutante liegt die Promotor-Aktivität im Bereich von PAO1. Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass das Genprodukt von PA0119 auf den Promotor P119-121 aktivierend wirkt, während das PA0120-Genprodukt die P119-121- Promotoraktivität negativ reguliert. 13. Zur Identifizierung weiterer PA0120-regulierter Gene wurde eine Transkriptomanalyse der PA0120::Ω-Mutante durchgeführt. Diese ergab, dass neben PA0119 vier weitere Gene, und zwar PA0656, PA0810, PA1852 und PA5261, signifikant hoch reguliert wurden. Vermutlich sind diese Genprodukte zusammen mit dem Regulator PA0120 Teile eines regulatorischen Netzwerks zur Anpassung von P. aeruginosa an die CF-Lunge.
5-lipoxygenase (5-LO) is the key enzyme in the formation of inflammatory leukotrienes, which are mediators of inflammation and allergy. The 5-LO catalyses the oxidation of arachidonic acid to 5-HPETE and subsequently to LTA4. The leukotrienes are involved in the development and maintenance of inflammatory diseases, like asthma and allergic rhinitis. Additionally, 5-LO is overexpressed in some cancer types, although its relevance is still not fully understood. 5-LO expressing cells are B- lymphocytes and cells of myeloid origin like monocytes, macrophages and granulocytes. The 5-LO promoter lacks a TATA or CCAT box and covers two CpG islands. These are characteristics of a housekeeping gene, but as the 5-LO is not expressed ubiquitiously, the expression of the 5-LO is tightly regulated. Epigenetic mechanisms were known to be involved in the control of the 5-LO expression. The HDAC inhibitor TsA significantly induced the transcriptional activity of the 5-LO promoter in reporter gene assays as well as on 5-LO mRNA transcript level in MM6 cells. The GC-boxes GC4 and GC5 in the proximal 5-LO promoter were identified to be essential for the TsA effect, as deletion of these element led to an attenuated TsA effect in reporter gene assay. Recruitment of the transcription factors Sp1 and Sp3 and the RNA polymerase II to the 5-LO promoter was detectable after TsA treatment in MM6 cells by chromatin immunoprecipitation assays (ChIP), while the acetylation status of histone H4 remained unchanged. Likewise it is known that DNA methylation leads to silencing of 5-LO expression in-vitro and in-vivo. The 5-LO promoter is densely methylated in the cell line U937, but unmethylated in HL-60 cells and - elucidated in this study - also in MM6 cells. Reporter gene assays with in-vitro methylated 5-LO promoter containing plasmids revealed that the frequency of methylated CpGs is directly proportional to reduction of 5-LO promoter activity. Incubation of U937 cells with 5-AdC, an inhibitor of DNA methyltransferases, was able to reactivate 5-LO transcription and to demethylate CpG dinucleotides. In the first part of this study the mechanism of TsA induced promoter activation was further investigated. I elucidated the mechanism of Sp1 and Sp3 recruitment to the 5-LO promoter after TsA treatment. Immnoprecipitation assay was used to detect a transcription factor complex containing Sp1 or Sp3 interacting with HDAC proteins, which might change its composition after TsA treatment. Besides the posttranslational modifications of the transcription factors Sp1 and Sp3 after TsA treatment were investigated, potentially causing an increased interaction of the proteins with the 5-LO promoter. Both aspects and their response in HDAC inhibition have been described. TsA did not affect the composition of the Sp1/HDAC1/HDAC2 complex. Sp3 was not located in a complex with the HDAC enzymes. Acetylation of Sp1 and Sp3 was detectable, but no change occurred after TsA treatment. Since neither release of the transcription factors off a complex, nor alterations in posttranslational modifications of Sp1 and Sp3 are the reason for the increased Sp1 and Sp3 binding to the 5-LO promoter, I elucidated alterations in the chromatin structure. The acetylation status of the histone proteins H3 and H4, as well as the chromatin marks H3K4me3, representing active chromatin, and H3K9me, representative for repressive state, were investigated. Additionally, the time course of the TsA effect was determined on 5-LO mRNA level using real-time PCR. The acetylation status of the histone proteins on the 5-LO core promoter correlated with the basal 5-LO mRNA transcript expression in MM6, HL-60 and U937 cells. The highest 5-LO mRNA level was detectable in MM6 cells, followed by HL-60 cells. The lowest 5-LO mRNA level was detected in 5-LO promoter methylated U937 cells. The order of the basal 5-LO mRNA expression of the three cell lines correlates with the basal acetylation status of histone proteins H3 and H4. In MM6 cells the highest basal levels in acH3 and acH4 were detected, followed by HL-60 and U937 cells. Moreover, the data obtained in U937 cells revealed that the correlation between DNA methylation and histone hypoacetylation is alike on the 5-LO promoter. TsA treatment induced the 5-LO mRNA level in the three cell lines with different intensity: 5-LO mRNA level in MM6 cells was induced 11-fold, in HL-60 cells 6- fold and in U937 cells 4- fold. The histone acetylation and methylation levels on the 5-LO promoter after TsA incubation were investigated. No increase in acH3 and acH4, but in H3K4me3 was detectable in MM6 cells by ChIP assay. HL-60 cells showed an increase in acH3 and acH4 as well as in H3K4me3. H3K9me was only detectable in untreated U937 cells, but disappeared after TsA treatment, while acH3, acH4 and H3K4me3 increased constantly after TsA treatme nt. A strong correlation between the histone modifications and the time course of the mRNA expression was detectable in all three cell lines. The combination of the posttranslational modifications acH3, acH4 and H3K4me3 led to a fast effect in transcriptional activation and the maxima of acH3 and acH4 were usually associated with the maximum in 5-LO mRNA transcript level. An increase in H3K4me3 alone, as detected in MM6 cells, led to continuous increase in the 5-LO mRNA expression with a late maximum. Additionally, we detected a slight overall decrease in 5-LO promoter methylation in U937 cells after TsA treatment. This fact taken together with the observed histone modifications could explain the 4- fold response in 5-LO mRNA level to TsA treatment of the methylated cell line U937. Another aim of the present study was to identify the specific HDAC enzymes involved in the 5-LO promoter regulation. Reporter gene assays and real-time PCR with selective HDAC inhibitors revealed that HDACs of class I are involved in 5-LO promoter regulation, namely HDAC 1, 2 and 3. The influence of each of the enzymes seemed to depend on the cell type, as inhibition of HDACs 2, 3 strongly induced 5-LO promoter activity in reporter gene assay in HeLa cells, whereas in MM6 cells HDACs 1 and 2, 3 seemed to be responsible for the 5-LO promoter regulation, measured as 5-LO mRNA level. The HDACs of class IIa and class III are not involved in the regulation of 5-LO mRNA expression. The second part of this study investigated the influence of MBD proteins on the methylated 5-LO promoter and the 5-LO mRNA expression. ChIP assays revealed MBD1, 2 and MeCP2 protein binding to the proximal 5-LO promoter in U937 cells. MBD1 was detectable on the 5-LO promoter in unmethylated HL-60 cells, while no MBD protein was located on the 5-LO promoter in MM6 cells. To elucidate the functional role of the MBD proteins, stable knocked down of MBD proteins was established in U937 cells. 5-LO mRNA transcript level was determined in the knock down clones by real-time PCR. The 5-LO transcript level was increased in all knock down samples. MBD2 knock down clones showed the highest effect in activating 5-LO with a 3- and 4.4-fold increase in the 5-LO mRNA level, followed by MBD1 (3.5- fold) and MeCP2 (2.5-fold) knock down clones. A combined participation of these three enzymes in the corepression of the methylated 5-LO promoter is indicated. Taken together, the data reveal that epigenetic mechanisms are strongly involved in the regulation of 5-LO transcription and might function as a crucial control mechanism of 5-LO expression.
Amphibians of Malawi : an analysis of their richness and community diversity in a changing landscape
(2009)
This study summarizes the state of the knowledge of the amphibian diversity in Malawi highlighting the possible threats impending on this fauna correlated with human encroachment and land use change. New data about diversity, distribution and ecology have been gathered, whereas the old ones have been summarised, reviewed and commented. In order to put in context the responses of the amphibian communities to land use change, the main environmental characteristics of the country at a broad space and time scale have been explored. Furthermore, the original habitats and vegetation have been described, and their status in the present day Malawi discussed. In the same way, an overview of the actual state of the knowledge about the Malawian amphibians has been provided, and their ability to act as surrogate of environmental integrity in Sub-Saharan Africa commented on the basis of the available studies. Afterwards, the results of the study of the selected areas and samples have been analysed within this newly generated context. Different field and laboratory methods were applied for the quantitative analysis of the richness and diversity of the communities. Opportunistic search was used to detect species richness, whereas the visual encounter survey was applied to detect the relative abundance of species. Several indices of diversity and similarity, and extrapolations by means of true richness estimators were used for the analysis of the alpha and beta diversities. Additional information were gathered by means of pitfall traps with drift fence, and by the recording of the advertisement calls. Supplementary methods were applied for the analysis of the taxonomic composition of the collected material. In Malawi 84 amphibian species are recorded, two of which still undescribed (Leptopelis sp. and Phrynobatrachus sp.). Three further species need to be confirmed and might be possibly present too: Amietia viridireticulata, Hemisus guineensis, and Hyperolius minutissimus. Additionally, other unrecognised cryptic species — at least one — are present within the Hyperolius nasutus complex. Most of the species belong to the order Anura (82 species; 97.6%), whereas only two species belong to the Gymnophiona (2.4%). Anurans are divided into 12 families and 23 genera, whereas the two caecilians species into one family (Caecilidae) and two genera. The more diverse family is the Hyperoliidae (21 species, 25%) followed by the families Ptychadenidae (13 species, 15%), Arthroleptidae (11 species, 13%), Phrynobatrachidae (10 species, 12%), and Bufonidae and Pyxicephalidae (9 species, 11% respectively). The remaining high family diversity (seven families, Caecilidae included) is contrasted by a low number of species (11 species in total, 14%). Based on the available distribution data, the value of species richness of the anuran communities in Malawi is comprised between 5‒45 species. In average 16.8 ± 9.0 species (N=80) are to be found, 75% of the sites have less than 21 species, and only two sites have more than 25 species. Four hot spots of amphibian diversity were identified: the Nyika Plateau (24 species), Mangochi-Malombe (25 species), Zomba Plateau (32 species) and the Mulanje Massif (45 species). In the studied areas a mean of 14.7 ± 1.6 species was observed and extrapolations by means of the true richness estimators were in good agreement with this result. Among the studied areas the richest was Palm Forest Reserve (17 species), followed by Kaningina Forest Reserve (16 species) and Vinthukutu F. R., and Vwaza W. R (15 species). The poorest area was the Misuku Mountains with 12 species only and a slightly different ranking was generated by the true richness estimators. The mean of the species present in the samples was 4.8 ± 2.1 species, considerably less than the true species richness detected in the respective areas. Basing on the ranking generated by the K-dominance plot the most diverse samples were Palm F. R. and Misuku, whereas the less diverse were Kaningina F. R. and Fort Lister, confirmed by the values of the diversity indices. The main finding of this study was the observation of the lack of a clear match between environmental degradation and amphibian diversity, and the crucial importance of temporary water bodies for the preservation of the amphibian diversity. In fact, despite most of the original habitat formerly present in Malawi have been destroyed and replaced by cultivations, the amphibian communities of different areas showed a comparable diversity at both family and species richness level, and no evident match between environmental degradation and amphibian diversity was recognisable. Differences in species richness could mostly be explained by natural factors such the elevation gradient and the presence of temporary water bodies. However, it was not possible to exclude that the communities have changed during historical time and the shift in species composition already occurred together with the modification of their relative frequencies. Most of the species showed a remarkable ecological plasticity and several species were found in a variety of both natural and altered habitats. The classification of the Malawian amphibians on the basis of ecological guilds based on the available natural history data showed the preponderance (76%) of generalist pond breeders. As a consequence, most of these amphibians possessed a scarce capacity to act as surrogates of habitat integrity. Based on the result of this study the farm bush landscape with traditional agriculture practices bears a great potential to support amphibian diversity in terms of species richness, representing a compromise between local economic development and conservation. Furthermore, the results of this study indicate the outstanding importance of the southern-east region of Malawi for the conservation of the country’s amphibians.
Regulation des matrizellulären Proteins SMOC-1 durch Zytokine und Stickoxid in Rattenmesangiumzellen
(2009)
Zytokine stimulieren in Mesangiumzellen die Produktion und die Freisetzung großer Mengen entzündlicher Mediatoren. In dieser Arbeit wurden mit Hilfe der RAP-PCR („RNA arbitrarily primed polymerase chain reaction“), einer auf mRNA basierenden „Differential display“-Methode, die Effekte von Interleukin-1β (IL-1β) auf das Genexpressionsmuster in glomerulären Rattenmesangiumzellen untersucht. Dabei wurde das matrizelluläre Glykoprotein „Secreted modular calcium-binding protein-1“ (SMOC-1) identifiziert, welches in Mesangiumzellen durch IL-1β herunterreguliert wird. SMOC-1 wird von verschiedenen Zelltypen exprimiert und sezerniert, doch seine biologische Funktion konnte bisher nicht aufgedeckt werden. Weitere Experimente bestätigten, dass die mRNA- und Proteinexpression von SMOC-1 durch proinflammatorische Zytokine, wie IL-1β und Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) herunterreguliert wird. Dieser Effekt wird zu einem großen Teil durch die endogene Freisetzung von Stickoxid (NO) aufgrund der Aktivität der induzierbaren NO-Synthase (iNOS) und der nachfolgenden Aktivierung der löslichen Guanylatzyklase (sGC) vermittelt. Außerdem tragen auch reaktive Sauerstoffver-bindungen (ROS), deren Bildung durch die Zytokine verstärkt wird, zur Herunter-regulierung der SMOC-1-Expression bei. Durch In-situ-Hybridisierungsexperimente konnte ferner gezeigt werden, dass die Hemmung der NO-Synthese durch den spezifischen iNOS-Inhibitor L-NIL in einem Rattenmodell der anti-Thy1.1-Glomerulonephritis die SMOC-1-Expression deutlich erhöhte. Dies belegt somit auch in vivo die biologische Relevanz von NO in der Modulierung der SMOC-1-Expression. Die funktionelle Rolle von SMOC-1 in Mesangiumzellen wurde durch die Hemmung der SMOC-1-Expression mit Hilfe einer spezifischen siRNA untersucht. Dabei zeigte sich, dass die Hemmung von SMOC-1 eine deutliche Inhibierung der mRNA-Expression von „Transforming growth factor β1“ (TGF-β1) sowie dessen Gesamtproteinspiegel zur Folge hat. Auch die Aktivität von TGF-β1 wurde reduziert, wie anhand der verringerten Spiegel an aktivem TGF-β1-Protein und der verringerten mRNA-Expression bekannter TGF-β-regulierter Gene, wie „Connective tissue growth factor“ (CTGF), „Plasminogen activator inhibitor-1“ (PAI-1) und Biglykan gezeigt wurde. Diese Ergebnisse deuten auf eine Rolle von SMOC-1 bei der Modulierung des TGF-β1-Signalwegs hin. Zusammenfassend betrachtet scheint NO die SMOC-1-Expression in der akuten glomerulären Entzündung zu vermindern und dadurch die TGF-β-getriebenen profibrotischen Signalprozesse zu limitieren. Der zweite Aspekt dieser Arbeit befasst sich mit der Rolle von Peroxisomen-Proliferator-aktivierten Rezeptoren (PPAR) in der IL-1β-vermittelten Expression der induzierbaren NO-Synthase. PPARα-Aktivatoren steigern in Mesangiumzellen die IL-1β-induzierte Aktivität der iNOS, während die Hemmung von PPARα durch spezifische Inhibitoren oder siRNA die iNOS-Expression/-Aktivität deutlich reduziert. Die Ergebnisse von Promotor-studien zeigten die essentielle Rolle einer möglichen PPAR-Bindestelle im iNOS-Promotor. IL-1β scheint die Bildung eines endogenen PPAR-Liganden zu induzieren, wodurch die Bindung von PPAR-Proteinkomplexen an das regulatorische DNA-Element im iNOS-Promotor verstärkt und dessen Aktivität gesteigert wird. Daneben scheinen jedoch auch Nebeneffekte der PPAR-Aktivatoren, wie die Freisetzung von ROS, zur synergistischen Wirkung auf die IL-1β-induzierte iNOS-Expression beizutragen. Die Wirkung von dualen PPARα/γ-Aktivatoren auf entzündliche Prozesse wird seit längerem diskutiert, daher wurden die biologischen Effekte von neu synthetisierten möglichen dualen PPARα/γ-Aktivatoren auf Entzündungsparameter, wie z. B. die iNOS-Expression, in Mesangiumzellen untersucht. Alle untersuchten Aktivatoren steigerten in der Form von Esterverbindungen die IL-1β-induzierte Expression der iNOS sowie der sekretorischen Phospholipase A2 (sPLA2), während die entsprechenden freien Säuren wenig Effekte zeigten. Diese proinflammatorische Wirkung scheint jedoch weniger auf einer Aktivierung des PPAR-Rezeptors zu beruhen als auf der Freisetzung von ROS, die durch die Aktivatoren teilweise deutlich erhöht wurde. Weitere Experimente zur Charakterisierung der PPAR-spezifischen Wirkung der Aktivatoren sowie zur optimalen Wirkkonzentration sind nötig, bevor der Effekt dieser Aktivatoren auf die inflammatorische Genexpression genau bewertet werden kann.
In der vorliegenden Arbeit wurden zehn Substanzen, die im Rahmen des Projekts INTAFERE analytisch in verschiedenen Gewässersystemen des Hessischen Rieds nachgewiesen werden konnten, ökotoxikologisch charakterisiert. Neben der Bestimmung der Akut- und der chronischen Toxizität wurde auch das endokrine Potential mit Hilfe eines rekombinanten Hefe-Assays ermittelt.Die akute Toxizität zeigt zwischen den verschiedenen Substanzen große Differenzen. Die drei Organophosphate TCPP, TBEP und TCEP zeigen selbst bei hohen Konzentrationen keine oder nur sehr geringe Effekte, während 4-NP, 4-t-OP, BPA, TDCPP, AHTN und Terbutryn mit LC50-Werten bis zu 5 mg/l eine höhere Toxizität besitzen.Im Hefe-Assay kann in mehreren Versuchswiederholungen das östrogene Potential von 4-NP (MW: 6,71x10-6 M), 4-t-OP (MW: 7,16x10-6 M) und BPA (MW: 4,88x10-6 M), sowie die antiandrogene Wirkung des Bisphenols (5,29x10-5 M) bestätigt werden. Im Gegensatz dazu können im Yeast Antiestrogen Screen zum ersten Mal Hinweise auf die antiöstrogene Wirkung von TCPP (MW: 6,86x10-5 M), Terbutryn (MW: 3,99x10-5 M), TDCPP (MW: 2,65x10-6 M) und TBP (MW: 2,28x10-5 M) aufgezeigt werden.TBP und TDCPP führen auch in der chronischen Exposition bei Potamopyrgus antipodarum zu einer Reduktion in der Embryonenzahl (mehrfach beobachtete NOEC beider Substanzen: 6,25 mg/kg), ein Effekt, der zunächst nicht von einer toxischen Wirkung unterschieden werden kann. Allerdings scheint sich ein antiöstrogener Wirkmechanismus auf die Schnecken bei den Versuchen zur Mischtoxizität zu bestätigen, da die gleichzeitige Exposition gegenüber BPA und 4-tOP zu einer geringfügigen Aufhebung des Effekts führt. Potamopyrgus reagiert ebenfalls mit einer Reduktion der Embryonenzahl bei der Exposition gegenüber AHTN (mehrfach beobachtete NOEC: 2 mg/kg), zeigt sich aber insensitiv gegenüber der Belastung mit Terbutryn.Die Exposition von Chironomus riparius gegenüber den verschiedenen Substanzen führt bis auf eine Ausnahme zu keinen signifikanten substanzbedingten Beeinträchtigungen. Einzig das s-Triazin Terbutryn verursacht eine hohe Mortalität mit einer NOEC (28 d) von 250 μg/kg. Eine Toxizität auf den Anneliden Lumbriculus variegatus zeigt sich lediglich bei derExposition gegenüber BPA (NOEC: 10 mg/kg; Biomasse, 28 d) und 4-NP (EC10: 6,88 mg/kg; 95% KI: 3,97-11,9; Reproduktion, 28 d). Die durchgeführten Versuche zur Toxizität von Mischungen zeigen eine größere Gefährdung auf als bei Vorliegen der Einzelsubstanzen in Konzentrationen unterhalb ihres Schwellenwertes zu vermuten wäre. Allerdings lassen sich die mit dem Hefe-Assay erzielten Ergebnisse aufgrund großer Variabilitäten zwischen den einzelnen Versuchswiederholungen nicht immer eindeutig mit Hilfe des additiven oder des unabhängigen Modells beschreiben, zeigen dabei jedoch trotzdem ein gegenüber den Einzelsubstanzergebnissen verändertes Risiko auf. Um diesem in der Risikobewertung Rechnung zu tragen, wird ein Verfahrensvorschlag entwickelt, in dem durch zusätzliche Sicherheitsfaktoren für PNECs ein Überschreiten des risikoanzeigenden Werts von 1 des PEC/PNEC-Quotienten einer Mischung verhindert werden kann.
Plastids are complex plant organelles fulfilling essential physiological functions, such as photosynthesis and amino acid metabolism. The majority of proteins required for these functions are encoded in the nuclear genome and synthesized on cytosolic ribosomes as precursors, which are subsequently translocated across the outer and inner membrane of the organelle. Their targeting to the organelle is ensured by a so called transit peptide, which is specifically recognized by GTP-dependent receptors Toc159 and Toc34 at the cytosolic side of outer envelope. They cooperatively regulate the insertion of the precursor protein into the channel protein Toc75, thereby initiating the translocation process. Toc34 is regarded as the primary receptor, while Toc159 probably provides the driving force for the insertion. Precursor transfer is achieved by the physical interaction between both receptors in the GTP loaded state. One translocon unit, also called the Toc core complex, is formed by four molecules Toc34, four molecules Toc75 and one molecule Toc159. In the GDP-loaded state, Toc34 preferably forms homodimers, whose physiological function was investigated in the presented study. It could be shown that the dissociation of GDP and therefore the nucleotide exchange are inhibited by the homodimeric state of Toc34. Dissociation of the homodimer is induced by the recognition of a precursor protein, which renders the binding of GTP and subsequent interaction with Toc159 possible. Thus, the homodimeric conformation could reflect an inactive state of the translocon, preventing GTP consumption in the absence of a precursor protein. Both homodimerization as well as heterodimerization of the receptor are regulated by phosphorylation, which could be demonstrated by in vitro and in vivo approaches using atToc33 from Arabidopsis thaliana as a model system. Since the phosphorylated form of Toc34 cannot be assembled with the Toc core complex, it can be concluded that the interactions between GTPase domains not only regulate the transfer of precursor proteins, but also warrant the integrity of the translocon.
The aim of the study was to investigate the role of the CX3C chemokine FKN in the role of platelet adhesion. The presence of the FKN receptor CX3CR1 in platelets is demonstrated and G-protein dependent activation of platelets with soluble FKN results in the increased adhesion of platelets to collagen and fibrinogen under flow 228 and adhesion of leucocytes to firmly attached platelets 231. Whether membrane-bound FKN is capable to promote the direct adhesion of platelets in flowing blood analogue to leucocytes was completely unknown. The adhesion mechanisms of FKN in mediating the adhesion of leucocytes under flow are well characterised and represent a novel unique mechanism of leucocyte capture and firm adhesion: FKN is responsible for immediate arrest of flowing CX3CR1 expressing leucocytes without the participation of additional adhesion receptors and ligands. This is in contrast to the classical leucocyte adhesion pathways, which are multistep processes involving leucocyte arrest, rolling and subsequent cell activation prior to firm arrest. In leucocytes, the FKN – CX3CR1 axis is sufficient to allow rapid arrest of leucocytes at low shear flow conditions 67, 101, 115, 122, 261. The set of data from this study demonstrates that immobilised FKN was capable to mediate the adhesion of platelets under low shear conditions, whereas there was no interaction in the absence of shear flow. In the presence of vWf in the adhesion matrix, FKN mediated the potent increased adhesion of platelets. This was in parts due to the activation of flowing platelets via CX3CR1 and the augmented translocation of platelets on FKN via the vWf receptor GPIbα. With respect to platelet activation, the function of endothelial FKN was comparable to leucocytes: in both cell types, the FKN dependent activation is mediated by its cognate receptor CX3CR1. This is in contrast to the adhesive capacity: in leucocytes, FKN dependent adhesion is mediated by CX3CR1, whereas in platelets, the adhesive capacity was mostly mediated by the vWf receptor GPIbα with only minor contribution from CX3CR1. In platelets, activation and adhesion by FKN were mediated by two distinct receptors, whereas in leucocytes, CX3CR1 is solely responsible for FKN dependent activation and adhesion. The presented results point out to a role of platelets in early stage of atherosclerosis. The in vivo expression of both, FKN and vWf is regulated by TNF-α, which is released in early stages of inflammation. The presence of vWf and FKN in the endothelial lining of blood vessels during these conditions is sufficient to initiate the capturing and translocation of platelets on the tunica interna. The rolling of platelets on the endothelium can induce endothelial damage and inflammation of the vessel, which might advance to the generation of clinically significant atherosclerotic plaques and fibrous atheroma.
Methanosarcina acetivorans kann Kohlenmonoxid (CO) als Kohlenstoff- und Energiequelle nutzen. Als Endprodukte entstehen bei der Verwertung von CO neben Methan signifikante Mengen an Azetat und Formiat sowie Dimethylsulfid (DMS). In dieser Arbeit sollten verschiedene Aspekte dieses außergewöhnlichen CO-Stoffwechsels analysiert werden. Folgende Ergebnisse wurden erzielt: 1) Weder die Methanogenese, noch die Bildung eines der anderen Metaboliten wird durch hohe CO-Partialdrücke gehemmt. Inhibitorstudien mit BES belegen, dass die CO-Oxidation und die Bildung von Azetat, Formiat und DMS nicht an die Methanogenese gekoppelt sind. Inhibitorstudien legen nahe, dass die Methanogenese aus CO am Aufbau eines Na+-Gradienten beteiligt ist und das Vorhandensein eines vom Protonenpotential-abhängigen Schrittes. 2) Eine neue, kostengünstige Transformationsmethode mittels Polyethylenglykol (PEG) konnte für M. acetivorans etabliert werden. Die Transformationshäufigkeit betrug ca. 1,1 x 107 Transformanden/μg DNA und liegt damit im Bereich von der der bisher etablierten Liposomen-vermittelten Transformationsmethode. 3) Mutantenanalysen und physiologische Studien belegen eine Beteiligung der Mts-Proteine in der DMS-Bildung und DMS-Verwertung, da in ihrer Abwesenheit kein DMS aus CO gebildet, kein Methan aus DMS produziert wird, und M. acetivorans nicht mehr auf DMS als Energiequelle wachsen kann. Die Mts-Proteine sind für das carboxidotrophe Wachstum jedoch nicht essentiell. Immunologische Analysen belegen eine substratabhängige Regulation von MtsF und weisen auf genetische Interaktionen der einzelnen Loci oder der Isoformen selbst hin. 4) Die monofunktionellen CODH-Isoformen von M. acetivorans sind am carboxidotrophen Wachstum beteiligt, jedoch nicht essentiell. Die beiden Isoformen der bifunktionellen CODH/ACS sind funktionell, und wenigstens eine von ihnen ist für autotrophes als auch carboxidotrophes Wachstum notwendig. Eine mögliche posttranslationale Modifikation von Cdh1 weist auf unterschiedliche physiologische Funktion und/oder Lokalisation hin. 5) Die F420H2-Dehydrogenase ist essentiell für methylotrophes, nicht jedoch für carboxidotrophes Wachstum.
Pflanzliche Biomasse bietet sich hervorragend als billiges und in großen Mengen verfügbares Ausgangssubstrat für biotechnologische Fermentationsprozesse an. Für die Herstellung von Bioethanol ist die Hefe Saccharomyces cerevisiae der wichtigste Produktionsorganismus. Allerdings kann S. cerevisiae die in Biomasse in großer Menge enthaltenen Pentosen Xylose und Arabinose nicht verwerten. Für einen ökonomisch effizienten Fermentationsprozess ist es daher essentiell, das Substratspektrum der Hefe entsprechend zu erweitern. Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, den bereits in Hefe etablierten bakteriellen Arabinose-Stoffwechselweg signifikant zu verbessern. Genetische und physiologische Analysen ergaben, dass eines der heterolog produzierten Enzyme, die L-Arabinose-Isomerase aus Bacillus subtilis, einen limitierenden Schritt innerhalb des Stoffwechselweges darstellte. In einem genetischen Screening konnte ein aktiveres Isoenzym aus Bacillus licheniformis gefunden werden. Zusätzlich wurde der Codon-Gebrauch aller heterologen bakteriellen Gene dem Codon-Gebrauch der hoch-exprimierten glykolytischen Gene von S. cerevisiae angepasst. Mit diesem rationalen Ansatz konnte die Ethanolproduktivität aus Arabinose um mehr als 250% erhöht werden, der Ethanolertrag wurde um über 60% gesteigert. Dies stellte die erste erfolgreiche Verbesserung eines heterologen Stoffwechselwegs in S. cerevisiae über Codon-optimierte Gene dar. In einem breit angelegten Screening wurde zum ersten Mal eine prokaryontische Xylose-Isomerase gefunden, die in S. cerevisiae eine hohe Aktivität aufweist. Durch das Einbringen des xylA-Gens aus Clostridium phytofermentans in verschiedene Hefe-Stämme wurden diese in die Lage versetzt, Xylose als alleinige Kohlenstoffquelle zu nutzen. Zusätzlich konnte damit die Vergärung von Arabinose und Xylose in einem einzigen S. cerevisiae-Stamm kombiniert werden. Vorherige Versuche, einen Pentose-vergärenden Stamm zu konstruieren, der einen bakteriellen Arabinose-Stoffwechselweg mit dem eukaryontischen Xylose-Reduktase/Xylitol-Dehydrogenase-Weg kombinierte, scheiterten an der unspezifischen Umsetzung der Arabinose durch die Xylose-Reduktase zu dem nicht weiter verstoffwechselbaren Arabitol. Für einen industriellen Einsatz der rekombinanten Hefen war es unerlässlich, die Eigenschaften für die Pentose-Umsetzung in Industrie-relevante Hefe-Stämme zu übertragen. Durch die Etablierung von genetischen Methoden und Werkzeugen ist es in dieser Arbeit gelungen, Industrie-Stämme zu konstruieren, die in der Lage sind, Arabinose oder Xylose zu metabolisieren. Dabei wurden die heterologen Gene stabil in die Chromosomen der Stämme integriert. Diese wurden mit Hilfe von „Evolutionary Engineering“ so optimiert, dass sie die Pentose-Zucker als alleinige Kohlenstoffquellen zum Wachstum nutzen konnten. Fermentationsanalysen zeigten eine effiziente Umsetzung der Pentosen zu Ethanol in diesen Stämmen. Damit ist ein neuer Startpunkt für die Konstruktion von industriellen Pentose-fermentierenden Hefe-Stämmen markiert, der zukünftig effizientere Bioethanol-Produktion ermöglichen wird.
Höhere Eukaryoten stellen ein Ensemble von Zellen dar, die in Kompartimente unterteilt sind. Somit sind intra- und interzelluläre Transportprozesse entscheidend für das Überleben dieser Zellverbände. In meiner Arbeit habe ich Evolution und Struktur von Translokationskomplexen untersucht, um einige Aspekte dieser komplexen Systeme zu untersuchen. Eingangs befassten wir uns mit Rezeptorsystemen am Beispiel des Proteintransports. Mittels phylogenetischer Analysen fanden wir heraus, dass Pex5 nicht der Urahn der anderen untersuchten 3-TPR-Domänen ist, obwohl Pex5 in allen eukaryotischen Organismen vorkommt. Ein Vergleich der 3-TPR-Domänen mit der restlichen Sequenz des Rezeptorproteins ergab, dass die 3-TPR-Domänen eine langsamere Evolutionsgeschwindigkeit aufweisen, was für eine Evolutionseinschränkung durch Interaktionspartner spricht. Sec72 ist möglicherweise aus einer TPR1 (Hop) Domäne entstanden und eine Funktion als Hsp70-erkennende Komponente des Sec-Komplexes für den post-translationalen Import kann daraus abgeleitet werden. „Recycling“ von 3-TPR-Domänen anderer Proteine konnten wir durch unsere phylogenetische Analyse auch für die zweite 3-TPR-Domäne von Tom34 nachweisen, die mit CYP40/FKBP51/52 clustert. Darüber hinaus war es uns möglich, die plastidär bzw. mitochondriell lokalisierten Formen von Toc64 phylogenetisch zu unterscheiden. Durch Erzeugung von Homologiemodellen konnten organellspezifische Aminosäuren strukturell eingeordnet werden. Dabei stellten wir fest, dass sich fast alle Positionen, die sich in der Aminosäurekomposition unterscheiden, auf der konvexen Seite der 3-TPR-Domäne befinden. Molekulardynamische Simulationen zeigten zudem deutliche Veränderung der Hauptbewegungen der 3-TPR-Domänen nach Komplexierung mit dem Hsp90-C-Terminus. Bei Bindung des Liganden werden intramolekulare Wasserstoffbrücken sowohl auf der konvexen als auch konkaven Seite der 3-TPR-Domäne „umgeschaltet“. Diese Erkenntnisse führen zu zwei Hypothesen: 1.) die Organellspezifität der Rezeptoren wird durch die Interaktion mit anderen Komplexpartnern garantiert und 2.) die Änderungen des Wasserstoffbrückennetzwerkes auf der konvexen Seite nach Hsp90-Bindung führen zur Ausbildung der Bindungsstelle für die andere Komplexkomponente. Beide Hypothesen erklären die experimentellen Beobachtungen bezüglich der Rezeptoren und warum keine phylogenetischen Hinweise für die Existenz von Vorstufenprotein-spezifischen Hsp70/90-Proteinen gefunden werden konnten. Nach dem Rezeptor haben wir uns mit dem Translokationsprozess befasst. Wir konnten phylogenetisch zeigen, dass sich Omp85 aus Proteobakterien im Vergleich zu Cyanobakterien und Eukaryoten insbesondere durch andersartige POTRA Domänen auszeichnet und fanden zwei konservierte Motive in der Porenregion. Zudem konnten wir im Heterokontophyten P. tricornutum ein vollständiges Omp85 identifizieren (bipartite Signalsequenz, 2 POTRAs, Pore mit langen Schleifen). Die Aminosäuresequenz weicht teils deutlich von den bekannten Omp85-Proteinen ab, was die Entdeckung erschwerte. Wir haben damit geklärt, dass auch im Translokationsapparat von komplexen Plastiden ein b-Fassprotein der Omp85 Familie die Kerneinheit bildet. Ebenfalls zu den Protein-transportierenden b-Fassproteinen gehört TolC, das aber im Gegensatz zu Omp85 auch andere Substanzen, wie zum Beispiel Siderophore transportiert. Alr2887 ist das einzige TolC-ähnliche Protein aus Anabaena sp. PCC7120. Vergleichende Phänotypuntersuchungen weisen auf eine Interaktion eines ABC-Transporters (DevBCA Operon) mit Alr2887 hin. Die Distanz zwischen äußerer Membran und Plasmamembran ist in Anabaena doppelt so groß wie in E. coli. Entsprechend fanden wir im Adapterprotein DevB eine stark verlängerte dimere Doppelwendel, die das von TolC gebildete a-Fass im Periplasma bis hin zum ABC-Transporter in der Plasmamembran theoretisch fortsetzen kann. Da verschiedenste in Anabaena existierende ABC-Transporter TolC als Abflusskanal benötigen, nehmen wir an, dass Alr2887 ein Rundumtalent in Bezug auf die zu transportierenden Substrate darstellt. Dieses ist auch aufgrund der basalen Einordnung im phylogenetischen Baum zu vermuten; es könnte somit auch in den „Multi-Drug-Efflux“ involviert sein. Nicht nur ABC-Transporter, auch TonB-abhängige Transporter stehen in funktionellem Zusammenhang mit TolC. Wir haben Aminosäuresequenzen von ~4600 TBDTs aus Gram-negativen Bakterien und Cyanobakterien zusammengetragen und nach ihrer paarweisen Ähnlichkeit geclustert. Anhand experimentell charakterisierter TBDTs mit bekannten Substraten und TBDTs mit vorhergesagten Substraten konnten wir sehr vielen Clustern ein Substrat zuordnen, das die in ihnen zusammengefassten TBDTs aller Wahrscheinlichkeit nach importieren. Wir konnten ferner feststellen, dass es noch eine Menge weiterer Cluster mit unbekannten Substratspezifitäten gibt und unsere Analysen stimulieren somit die Arbeiten an diesem System im Allgemeinen und in Cyanobakterien im Besonderen.
Die anaerobe Atmung mit Nitrat und Nitrit als terminalen Elektronenakzeptoren bildet einen wichtigen Teil des biologischen Stickstoff-Zyklus. Beispiele sind Denitrifikation und respiratorische Nitrat-Ammonifikation, wobei in beiden Fällen in einem ersten Schritt Nitrat zu Nitrit reduziert wird. In der Denitrifikation entstehen dann verschiedene gasförmige Produkte (NO, N2O, N2), wogegen Nitrit in der Ammonifikation ohne die Freisetzung weiterer Zwischenprodukte direkt zu Ammonium reduziert wird. Während die terminalen Reduktasen dieser Atmungsketten gut untersucht sind, ist das Wissen über die Zusammensetzung kompletter Elektronentransportketten sowie die Interaktion einzelner Proteine als auch zwischen den Proteinen und Chinonen in der Membran begrenzt. Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung der membranständigen Chinol-Dehydrogenasen NapGH und NrfH in der respiratorischen Nitrat-Ammonifikation von Wolinella succinogenes. Dieses Epsilonproteobakterium ist ein etablierter Modellorganismus der anaeroben Atmung und wächst durch respiratorische Nitrat-Ammonifikation mit Formiat oder H2 als Elektronendonoren. Als terminale Reduktasen werden dabei die periplasmatische Nitratreduktase NapA und die Cytochom c-Nitritreduktase NrfA benötigt. Die Genomsequenz weist keine weiteren typischen Nitrat- und Nitritreduktasen auf, und napA- und nrfA-defiziente Mutanten sind nicht in der Lage durch Nitrat- bzw. Nitritatmung wachsen. Das Operon des Nap-Systems (napAGHBFLD) von W. succinogenes kodiert Proteine, die an der Nitrat-Reduktion durch Menachinol beteiligt sind (NapA, -B, -G und -H) und Proteine, die für die Reifung und Prozessierung von NapA benötigt werden (NapF, -L und –D). Im Gegensatz zu vielen anderen Bakterien läuft die Nitrat-Atmung unabhängig von einem NapC-ähnlichen Protein ab, das als membrangebundenes Tetrahäm-Cytochrom c für die Chinol-Oxidation zuständig ist und Elektronen über den Elektronenüberträger NapB an die terminale Reduktase NapA liefert. Zwar sind im Genom zwei NapC-Homologe kodiert (FccC und NrfH), doch die Deletion beider Gene hatte keinen Einfluss auf die Nitrat-Atmung. Es wurde vermutet, dass die Funktion von NapC in W. succinogenes stattdessen durch die beiden Fe/S-Cluster Proteine NapG und NapH übernommen wird. Die Reduktion von Nitrit zu Ammonium wird durch den NrfHA-Komplex katalysiert. Das Pentahäm-Cytochrom c NrfA bildet dabei die katalytische Untereinheit, die über das membranständige Tetrahäm-Cytochrom c auf der periplasmatischen Seite der Membran gebunden ist. NrfH gehört zur NapC/NirT-Familie und überträgt Elektronen von Menachinol auf NrfA. Mittels gerichteter Mutagenese von nrfH wurden in früheren Arbeiten bereits Aminosäure-Reste identifiziert, die essentiell für die Elektronentransportaktivität von Formiat zu Nitrit sind.
Beteiligung der Sphingosinkinasen 1 und 2 bei Zellwachstum und Apoptose in Nierenmesangiumzellen
(2009)
Seit einigen Jahren ist bekannt, dass Sphingolipide neben ihrer Funktion als Plasmamembranbestandteile auch als intra- und extrazelluläre Botenstoffe in zelluläre Signalwege eingreifen können. So haben das Lysosphingolipid S1P und sein Vorläufermolekül Ceramid wichtige regulatorische Funktionen in der Regulation von Zelltod- und wachstum. Dabei agiert Ceramid als proapoptotisches und wachstumshemmendes Lipid, während S1P zellprotektive und wachstumfördernde Funktionen in der Zelle hat und dadurch als „Gegenspieler“ von Ceramid wirkt. Durch die zwei Enzymklassen der Ceramidasen und Sphingosinkinasen wird in der Zelle ein sogenanntes „Sphingolipid-Gleichgewicht“ durch die stete Interkonvertierbarkeit der Lipide aufrechterhalten. Das zu einem bestimmten Zeitpunkt in seiner Konzentration dominierende Sphingolipid entscheidet so über das Schicksal der Zelle, ob es zum Zelltod oder zum Wachstum kommt. In dieser Arbeit wurde die Beteiligung der beiden Sphingosinkinasen 1 und 2 bei Zellwachstum und Apoptose in Nierenmesangiumzellen untersucht. Dafür wurden aus SK1(-/-)- und SK2(-/-)-Mäusen Mesangiumzellen isoliert. Obwohl beide Sphingosinkinasen dasselbe Produkt S1P generieren, zeigen die beiden „knock-out“-Zelllinien unterschiedliches Apoptose- und Wachstumsverhalten. In einem ersten Kapitel wurde gezeigt, dass eine Depletion der SK1 in einer Desensitivierung der Mesangiumzellen gegenüber dem apoptotischen Stimulus Staurosporin und in einer drastischen Wachstumsverlangsamung im Vergleich zu den Wt-Zellen resultierte. Im Gegensatz dazu führte eine Depletion der SK2 zu einem Schutz vor Apoptose und zu einer erhöhten Wachstumsrate. In einem zweiten Kapitel wurden mögliche molekulare Mechanismen untersucht, die für diese gegensätzlichen Zellantworten verantwortlich sind. Nachdem eine vermehrte Prozessierung der Caspase 3 in SK1(-/-)-Zellen und eine verminderte Prozessierung in SK2(-/-)- Zellen festgestellt wurde, ergaben weitere Westernblot-Analysen eine Beteiligung der beiden Signalkaskaden PKB/Bad sowie MEK/ERK1/2 im Apoptosemechanismus der Mausmesangiumzellen. SK1(-/-)-Zellen zeigen eine verminderte Phosphorylierungsrate der involvierten Enzyme PKB, MEK1/2 und ERK1/2, wohingegen die Signalkaskaden von SK2(-/-) durch vermehrte Phosphorylierung dieser Kinasen konstitutiv aktiviert sind. Daneben scheint auch der antiapoptotische Faktor Bcl-xL am Vorgang der mesangialen Apoptose beteiligt. Eine Depletion der SK1 führt zu einer reduzierten Bcl-xL-Proteinexpression, wohingegen SK2(-/-)- Zellen eine drastisch erhöhte Expressionsrate dieses antiapoptotischen Faktors aufweisen. Als zentraler Regulator des Zellwachstums zeigt sich das Retinoblastoma-Protein (Rb) in den SK1(-/-)- und SK2(-/-)-Zellen antagonistisch reguliert. Während keine basale Phosphorylierung des Proteins in SK1(-/-)-Zellen gefunden werden konnte, ist Rb in SK2(-/-)-Zellen hyperphosphoryliert. Anschliessend konnte in SK1(-/-)- und SK2(-/-)-Zelle eine Beteiligung von weiteren zellzyklus-regulierenden Enzymen, die Rb-Protein vorgeschaltet sind, gefunden werden. So ist die cyklinabhängige Kinase CDK6 in hyperproliferierenden SK2(-/-)-Zellen auf Proteinebene vermehrt exprimiert. SK1(-/-)-Zellen zeigen eine erhöhte Proteinexpression des Zellzyklushemmers p27. In einem dritten Kapitel konnte gezeigt werden, dass eine Depletion der SK2 auch in Mausfibroblasten, die aus der Lunge von SK2(-/-)-Mäusen isoliert worden waren, zu einer vermehrten DNA-Synthese führt; die Funktion des Enzyms scheint also nicht zellspezifisch zu sein. Ein viertes Kapitel machte deutlich, dass Mausmesangiumzellen, die eine humane Variante der SK1 überexprimieren, vor stimulusinduzierter Apoptose geschützt sind. Darüberhinaus ist die DNA-Synthese der hSK1-transgenen Mausmesangiumzellen im Vergleich zu Wt- Zellen erhöht. Zusammenfassend kann man sagen, dass die Sphingosinkinasen 1 und 2 in den primären Mausmesangiumzellen zelluläres Wachstum und Apoptose in entgegengesetzterweise regulieren: die SK1 wirkt mitogen und zellprotektiv, die SK2 hingegen wachstumshemmend und proapoptotisch
Im Rahmen dieser Arbeit wurden die 5´- und 3´-Enden 23 ausgewählter Transkripte des halophilen Archaeons Halobacterium salinarum bestimmt. Die Daten wurden dazu verwendet, die Längen der untranslatierten Bereiche zu ermitteln, Konsensussequenzen für die Transkriptionsinitiation und -termination abzuleiten und die Rolle haloarchaealer UTRs bei der Translationsinitiation und -regulation zu untersuchen. Der experimentelle Ansatz wurde mit einer bioinformatischen Analyse des Genoms von H. salinarum vervollständigt. Dabei konnten die Konsensussequenzen der basalen Promotorelemente genauer definiert werden und ein neues Promotorelement konnte entdeckt werden. Weiterhin wurde ein Konsensusmotiv gefunden, welches wahrscheinlich für die Termination der Transkription wichtig ist. Alle 23 analysierten Transkripte hatten eine 3´-UTR mit einer durchschnittlichen Länge von 48 Nukleotiden und ihre 3´-Enden waren nicht posttranskriptionell modifiziert. Die experimentellen Ergebnisse und bioinformatischen Daten ergaben, dass die Mehrheit der haloarchaealen Transkripte keine 5´-UTR besitzt. Die meisten Transkripte mit 5´-UTRs enthielten unerwarteterweise keine Shine-Dalgarno (SD)-Sequenz. Die Analyse des H. salinarum Genoms machte deutlich, dass weniger als 10% aller Gene eine SD Sequenz vorrausgeht und dass sogar bei Genen, die distal im Operon liegen, meistens keine SD-Sequenz zu finden ist. Weiterhin wurde der Einfluss einer ausgewählten 5´-UTR ohne SD-Sequenz und einer 3´-UTR auf die Transkriptstabilität und die Translationseffizienz untersucht. Das Transkript mit 5´ UTR ohne SD-Sequenz wurde in H. salinarum effizient translatiert. In einer Studie an H. volcanii konnte das Gleiche für verschiedene 5´ UTRs ohne SD-Sequenz in Verbindung mit einem Reportergen gezeigt werden (Brenneis et al., 2007). An diesen Transkripten kann die Translation also nicht über den „bakteriellen“ Mechansimus durch Basenpaarung mit dem 3´-Ende der 16S rRNA initiiert werden. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurde untersucht, ob es sich bei dem Mechanismus der Translationsinitiation an Transkripten mit 5´-UTR ohne SD-Sequenz um einen Scanning-Mechanismus wie bei Eukaryonten oder um einen neuen Mechanismus handelt. Für die Experimente wurde das zuvor erwähnte Reportergensystem aus H. volcanii verwendet. Neben AUG wurden GUG und UUG effizient als Startkodons an einem Transkript mit 5´-UTR genutzt, wohingegen AUG das einzige funktionierende Startkodon bei einem Transkript ohne 5´-UTR war. Verschiedene Deletionsversionen der 20 Nukleotide langen 5´-UTR wurden im Gegensatz zur kompletten 5´-UTR nur sehr ineffizient translatiert. Das Einfügen zusätzlicher AUGs stromaufwärts des natürlichen Startkodons hatte keinen Einfluss auf die Translationseffizienz am internen AUG. Ein zusätzliches AUG am 5´-Ende im gleichen Leseraster des natürlichen AUGs führte zur gleichzeitigen Nutzung beider Startkodons auf derselben mRNA. Eine stabile Haarnadelstruktur am 5´-Ende inhibierte die Translation nur am ersten AUG und hatte keinen Einfluss auf die Translationseffizienz am internen AUG. Zusammenfassend konnte durch die erhaltenen Ergebnisse ausgeschlossen werden, dass der Mechanismus der Translationsinitiation an Transkripten mit 5´-UTR ohne SD-Sequenz ein Scanning-Mechansimus wie bei Eukaryonten ist. Neben der Translationsinitiation an Transkripten ohne 5´-UTR und an Transkripten mit SD-Sequenz existiert also noch ein dritter, bis jetzt unbekannter Mechansimus zur Translationsinitiation in Haloarchaea. In initialen Versuchen zur genaueren Charakterisierung der drei verschiedenen Translationsinitiationsmechanismen, wurden Konstrukte hergestellt, bei denen alle drei verschiedenen Startkodons auf einer mRNA vorhanden sind. Es wurden erste Hinweise darauf gefunden, dass Stressbedingungen einen Einfluss auf die unterschiedlichen Initiationsmechansimen haben. Anders als erwartet führte die Mutation einer natürlichen SD-Sequenz nicht zu einer verminderten Translationseffizienz am entsprechenden Startkodon. Die Bestimmung des 5´-Endes eines Transkripts mit in silico vorhergesagter SD-Sequenz offenbarte, dass das Transkript keine 5´-UTR und somit auch keine SD-Sequenz besaß. Beide Ergebnisse machen deutlich, dass SD-Sequenzen eine noch viel geringere Rolle bei der haloarchaealen Translationsinitiation spielen, als anhand der Sequenz und UTR Analysen angenommen werden konnte.
Tiere und Menschen sind für das tägliche Überleben auf eine schnelle Bewertung und flexible Nutzung verschiedenster Umweltreize angewiesen. So nutzen Vögel, wie viele andere Tiere, sowohl den Magnetsinn als auch die Geometrie der Umgebung und Landmarken, um sich im Raum zu orientieren. Auch erfolgt eine schnelle und komplexe Auswertung des visuellen Inputs, beispielsweise, um bei der Futtersuche selektiv Futterkörner finden zu können. Unklar ist bislang, wie Raum- und Objektinformation in den beiden Hirnhälften verarbeitet werden und wie die Aufgabenteilung zwischen den Hemisphären aussieht. Zur Klärung dieser Thematik soll die vorliegende Arbeit beitragen, wobei die Versuche so angelegt wurden, dass mögliche, grundlegende Verarbeitungsstrategien unter zwei Gesichtspunkten betrachtet werden konnten: Zum einen wurden den Tieren prinzipiell unterschiedliche Aufgaben präsentiert, um über verschiedene Bereiche auf dem Gebiet der Raum- und Objektverarbeitung hinweg vergleichen zu können. Zum anderen wurde mit den beiden zurzeit wichtigsten Vogelmodellen gearbeitet, der Brieftaube (Columba livia) und dem Haushuhnküken (Gallus gallus). Dies erlaubt einerseits den Vergleich eigener Ergebnisse mit anderen Befunden innerhalb derselben Art, während andererseits auch Parallelen und Unterschiede zwischen verschiedenen Arten betrachtet werden können. Vögel eignen sich hierbei aufgrund ihrer Anatomie besonders gut für die Erforschung von Hemisphärenunterschieden. Durch ein nahezu vollständiges Überkreuzen der Sehnerven und das Fehlen eines Corpus callosum oder anderer funktionell entsprechender Strukturen zum Informationsaustausch zwischen den Hirnhälften wird der visuelle Input eines Auges überwiegend in der gegenüberliegenden Hirnhälfte verarbeitet. Lateralisation kann daher sehr leicht durch Abdecken eines Auges untersucht werden. Bei Brieftauben wurde die Repräsentation von Geometrie und Landmarken untersucht (Kapitel 2). Die Tiere lernten hierbei, das Zentrum einer quadratischen Arena mithilfe rein geometrischer Hinweise oder mittels einer Kombination von Geometrie und Landmarken zu finden. Durch Verändern der verfügbaren Informationsart wurde untersucht, welche Informationen die Tauben zum Lokalisieren des Zentrums nutzten. Die Ergebnisse zeigen mit einer beidseitigen Verarbeitung ein qualitativ anderes Muster der Repräsentation von Rauminformationen als bislang bei anderen Arten, wie z.B. dem Haushuhnküken, beschrieben. Ferner hing der relative Gebrauch von Geometrie und Landmarken in starkem Maße von der vorherigen Erfahrung der Tauben ab. In einer weiteren Studie wurde die Verarbeitung von Magnetkompassinformation bei Brieftauben untersucht (Kapitel 3). Hierbei wurde erstmals erfolgreich ein Versuchsdesign zur Laboruntersuchung entwickelt. Auch bei dieser Raumkognitionsaufgabe wurde ein Unterschied zu der bei anderen Arten gefundenen linkshemisphärischen Spezialisierung zugunsten einer Verarbeitung sowohl in der linken als auch in der rechten Hirnhälfte gefunden. Während die Tauben hierbei mit der rechten Hirnhälfte lediglich die richtige Achse wahrnahmen, erfassten sie mit der linken Hemisphäre die spezifische Richtung. Dies könnte die gefundene linkshemisphärische Überlegenheit im Freiland erklären. Erstmals bei Vögeln wurde beim Haushuhnküken in einem weiteren Versuch die hemisphärische Verarbeitung von Raumfrequenzinformation untersucht, die sowohl für die visuelle Raumorientierung als auch für das Objekterkennen von großer Bedeutung ist (Kapitel 4). Die Raumfrequenz ist hierbei allgemein als ein Maß für die Wiederholungen einer Struktur über eine bestimmte Strecke definiert und kann zur Charakterisierung beliebig komplexer Objekte verwendet werden. Die Küken wählten zwischen simultan dargebotenen Objekten, deren Oberflächen sich hinsichtlich ihrer Raumfrequenzen unterschieden. Die Ergebnisse weisen auf eine Spezialisierung der linken Hirnhälfte für hohe und der rechten Hirnhälfte für niedrige Raumfrequenzen hin. Aufgrund der Parallelen zu Befunden beim Menschen könnte dies auf eine gemeinsame Grundlage der Lateralisationsentwicklung bei Wirbeltieren hindeuten. Während sich die vorangehenden Studien der vorliegenden Arbeit mit Spezialisierungen der linken und rechten Hirnhälfte bei der Verarbeitung von Raum- und Objektinformation befassten, wurde in Kapitel 5 das Zusammenwirken von linker und rechter Hirnhälfte bei der selektiven Nahrungssuche untersucht. Hierbei konnte am Beispiel des Haushuhnkükens erstmals bei Vögeln Hemisphärenkooperation gezeigt werden, was als Hinweis darauf zu werten ist, dass eine bilaterale Repräsentation im Vogelhirn in komplexen Situationen, die eine rasche und effiziente Beurteilung des gesamten überschaubaren Bereichs erfordern, möglich ist. Insgesamt zeigen die Ergebnisse für mehrere wichtige Fragen der Lateralisationsforschung wie die Erfahrungsabhängigkeit, den Nachweis unterschiedlicher Lateralisationsmuster bei Brieftauben und Haushuhnküken in der geometrischen Orientierung oder die Kooperation der Hirnhemisphären, dass bisherige Ansichten über die Verarbeitung von Raum- und Objektinformation bei Vögeln einer kritischen Überarbeitung bedürfen.
Zusammenfassung (in German) Rostpilze sind obligate Parasiten auf vielen holzigen und krautigen Pflanzen und führen weltweit zu ernsten ökonomischen Schäden in der Landwirtschaft. Weltweit sind zurzeit sind ca. 100 Gattungen und 9000 Arten von Rostpilzen (Pucciniales, Basidiomycota) bekannt. Es gibt fünf verschiedene Entwicklungsstadien mit je eigener Morphologie: Spermogonium, Aecidium, Uredosporenlager, Teleutosporenlager und Basidium. Bei vielen Rostpilzen kommt es im Entwicklungsgang zu einem Wechsel zwischen zwei verschiedenen Wirtsarten. Die Spermogonien werden auf einem haploiden Myzel erzeugt, das sich nach der Infektion des Pflanzengewebes durch Basidiosporen entwickelt. In den Spermogonien entwickeln sich einzellige, monokaryotische, hyaline Spermatien, die in einem süßlichen Exudat ausgeschieden werden. Das Aecidium bildet einzellige, dikaryotische Aecidiosporen in Ketten. Bei der Keimung entwickeln sie dikaryotische Hyphen, welche entweder Uredosporen- oder Teleutosporenlager, aber nicht wieder Aecidien erzeugen. Die Uredosporen der Uredosporenlager dienen der Massenausbreitung, Infektion derselben Wirtsart und wiederholten Bildung neuer Uredosporenlager. Das Ornament der Uredosporen ist variabel: echinulat, verrucos, gestreift verrucos, zerfurcht, runzelig, labyrinthisch, pseudoreticulat oder reticulat. Teleutosporenlager und Teleutosporen sind das wichtigste Stadium für allgemeine Unterscheidungen und die Nomenklatur von Rostpilzen, da sie das sexuelle Stadium repräsentieren. Teleutosporen erzeugen Basidien und Basidiosporen. Teleutosporen sind morphologisch sehr variabel und präsentieren deshalb die nützlichsten zuverlässigen Eigenschaften zur Unterscheidung der Arten. Die Basidien entstehen größtenteils am distalen Ende der Teleutosporenzelle und sind transversal septiert. Die Basidiosporen sitzen auf Sterigmen auf den Basidienzellen und sind globos oder subglobos. Durch die hoch spezifische Abhängigkeit der Rostpilz-Arten von ihren Wirtspflanzen ist die Verbreitung der Rostpilze an die Verbreitung ihrer Wirte gebunden. Jedoch sind vollständige Lebens-Zyklen der Rostarten, mikromorphologische Details der oben genannten Stadien, Spektren der Wirtspflanzen und geographische Verbreitung unvollständig bekannt. Einige dieser offenen Fragen am Beispiel der Rostpilze Panamas zu beantworten ist das Ziel dieser Arbeit. Da für das relativ kleine Land Panama 9.500 Pflanzenarten bekannt sind, wird eine hohe Zahl an Rostpilzarten vermutet. Die Rostpilze Panamas wurden sporadisch von verschiedenen Mykologen studiert. Bis 2007 waren in Panama jedoch lediglich 25 Gattungen und 101 Arten von Rostpilzen bekannt. Für die vorliegende Arbeit wurden in den Jahren 2004 bis 2007 Rostpilze in Panama gesammelt, hauptsächlich in der Provinz Chiriquí im Westen Panamas. Insgesamt wurden 468 Belege geprüft, die 150 verschiedenen Arten von Rostpilzen entsprechen. 233 Belege wurden zwischen 2005 und 2007 im ppMP-Projekt (pflanzenparasitische Mikropilze Panamas) von M. Piepenbring, O. Perdomo, R. Mangelsdorff, T. Trampe und T. Hofmann gesammelt. 76 Belege wurden von M. Piepenbring zwischen 1998 und 2007 gesammelt. 1 Beleg wurde von R. Kirschner (2003) gesammelt. Zusätzlich wurden Belege aus Herbarien konsultiert, 30 Belege aus dem New York Botanical Garden (NYBG), 93 Belege aus den U.S. National Fungus Collections (BPI) und 35 Belege aus der Purdue University (PUR). In dieser Arbeit werden 30 Arten von Rostpilzen aus dem Westen Panamas detailliert beschrieben und durch rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen und Zeichnungen illustriert. Zwei davon sind neue Arten: Puccinia urochloae auf Urochloa decumbes (Poaceae) und Uromyces melampodii auf Melampodium costaricense (Asteraceae). Puccinia urochloae unterscheidet sich von den bekannten Puccinia-Arten durch diorchidioide Teleutosporen, Teleutosporenmaße sowie Paraphysen und Uromyces melampodii von anderen Uromyces-Arten durch die Teleutosporenmaße und Wirtsgattung. 28 Arten werden erstmalig für Panama dokumentiert: für Aecidium psychotriae auf Psychotria cf. carthagenensis (Rubiaceae), für Coleosporium verbesinae auf Verbesina gigantea (Asteraceae), für Crossopsora byrsonimatis auf Byrsonima crassifolia (Malphigiaceae), für Crossopsora uleana auf Solanum trizygum (Solanaceae), für Puccinia cordiae auf Cordia alliodora (Boraginaceae), für Puccinia cyperi-tagetiformis auf Cyperus odoratus (Cyperaceae), für Puccinia enixa auf Baccharis cf. pedunculata, für Puccinia inaudita auf Wedelia inconstans (Asteraceae), für Puccinia psidii auf Syzygium jambos (Myrtaceae), für Puccinia sp. 1 auf Aulonemia patriae (Poaceae), für Puccinia sp. 2 auf Carex longii (Cyperaceae), für Pucciniosira dorata auf Triumfetta bogotensis (Malvaceae), für Uredo ficina auf Ficus sp. (Moraceae), für Uredo hydrocotyles auf Hydrocotyle mexicana (Apiaceae), für Uredo incomposita auf Eleocharis sp. (Cyperaceae), für Uredo jatrophicola auf Jatropha curcas (Euphorbiaceae), für Uredo kyllingiae auf Kyllinga cf. odorata (Cyperaceae), für Uredo melinidis auf Melinis minutiflora (Poaceae), für Uredo notata auf Byrsonima crassifolia (Malpighiaceae), für Uredo peperomiae auf Peperomia glabella (Piperaceae), für Uredo proeminens auf Euphorbia heterophylla and E. hyssopifolia (Euphorbiaceae), für Uredo rubescens auf Dorstenia contrajerva (Moraceae), für Uredo yucatanensis auf Mimosa albida (Fabaceae), für Uromyces bidenticola auf Bidens pilosa (Asteraceae), für Uromyces ictericus auf Iresine celosiae (Amaranthaceae), für Uromyces sp. 1 auf Struthanthus sp. (Loranthaceae) und für Uromyces trifolii-repentis auf Trifolium repens (Fabaceae). Die Zahl der für Panama bekannten Rostpilze erhöht sich mit dieser Arbeit von 101 auf 131 Arten. Für fünf andere Rostpilze werden weltweit neue Wirtsarten genannt: Cordia spinescens als Wirt von Alveolaria cordiae, Eupatorium odoratum als Wirt von Cionothrix praelonga, Xylopia grandiflora als Wirt von Dasyspora gregaria, Cyperus diffusus als Wirt von Puccinia subcoronata, und Calathea indecora als Wirt von Puccinia thaliae. Die Artenvielfalt von Pflanzen in den Tropen ist noch nicht vollständig bekannt, und man kann keine Voraussagen machen oder feststellen, ob ein Gebiet artenreicher ist als andere. Die bescheidene Dokumentation von Rost-Pilzen in Panama beruht auf einem Mangel an Inventuren im Gebiet. Die in Panama am häufigsten vertretenen Wirts-Familien sind die Asteraceae, Cyperaceae, Fabaceae und Poaceae. Die Asteraceae, mit 303 Arten die sechstgrößte Pflanzenfamilie in Panama, haben die größte Zahl der Wirtsarten von Rost-Pilzen in Panama mit 24 Rostarten, nämlich in den Gattungen Cionothrix, Coleosporium, Dietelia, Endophyllum, Puccinia und Uromyces. Die Fabaceae jedoch präsentieren die höchste Zahl der Rost-Gattungen in Panama (Ateloucada, Dicheirinia, Phakopsora, Puccinia, Uraecium, Uredo, Uromyces und Uropyxis) mit 23 Rostarten. Die Fabaceae sind mit einer Gesamtzahl von 487 Arten in Panama die zweitgrößte Pflanzenfamilie. In dieser Studie wurden rasterelektronenmikroskopische Beobachtungen der Morphologie und Ornamentierung von Sporen durchgeführt. Echinulate und verrucose Ornamentierung sind mit dem Lichtmikroskop bei gewissen Arten von Pilzen schwierig zu unterscheiden. Das beobachtete Ornament ist jeweils spezifisch für die Art. Die asexuell gebildeten Uredosporenlager und Uredosporen sind in der Regel das zahlenmäßig am häufigsten anzutreffende Entwicklungsstadium und seine Merkmale sind genügend unveränderlich und unterschieden, um sie taxonomisch zu verwenden. Die taxonomisch nützlichsten Eigenschaften von Uredosporen sind: die Form und Größe der Spore, die Farbe und Stärke der Sporen-Wand, ihre Oberflächenornamentierung, die Zahl und Verteilung der Keimporen. Die Anwesenheit von Paraphysen ist bei Rost-Pilzen taxonomisch nicht wichtig. In den beobachteten Belegen sind Paraphysen sowohl in Uredo- als auch in Teleutosporenlagern vorhanden, allerdings am häufigsten in Uredosporenlagern. Bestimmte Merkmale der Paraphysen können jedoch taxonomisch wichtig sein. In unserer Analyse fanden wir Arten mit pigmentierten Paraphysen bei Crossopsora uleana, Puccinia sp. 1, Uredo jatrophicola, Uredo yucatanensis und Uromyces melampodii. Crossopsora uleana hat verzweigte Paraphysen. Für die Identifikation der Rostpilze ist es notwendig und wesentlich, die Wirtspflanzen zu identifizieren. Dennoch können viele Pflanzenproben nicht leicht identifiziert werden, da viele steril sind, und in den meisten Fällen sind blühende oder fruchtenden Teile für die Pflanzenbestimmung wesentlich. Viele Rostpilzarten wurden in der Vergangenheit sehr knapp und unvollständig, mit irreführenden Angaben und ungenauen Wirtsdaten beschrieben. Rostpilze können im Feld leicht erkannt werden. Es gibt wenige Ausnahmen, die mit anderen pathogenen Pilzen verwechselt werden können. Solch ein Beispiel ist Stigmina anacardii, ein imperfekter Pilz mit oberflächlich ähnlicher Morphologie wie Rostpilze, aber mit Beziehung zu den Ascomycota. Basidien und Basidiosporen von Alveolaria cordiae werden erstmals illustriert und dokumentiert. Am Beispiel von Dasyspora gregaria konnte erstmals eine fein warzige Ornamentierung der Basidiosporen bei Rostpilzen aufgezeigt werden. Resumen (in Spanish) Especies de Pucciniales son hongos parásitos de plantas del grupo Basidiomycota. En esta tesis 30 especies de Pucciniales recientemente colectadas en el Oeste de Panama se presentan con descripciones detalladas, microscopia electrónica de barrido y dibujos. De estas, 2 son nuevas especies: Puccinia urochloae y Uromyces melampodii. Además, 28 especies se citan por primera vez para Panama: Aecidium psychotriae, Coleosporium verbesinae, Crossopsora byrsonimatis, Crossopsora uleana, Puccinia cordiae, Puccinia cyperi-tagetiformis, Puccinia enixa, Puccinia inaudita, Puccinia paupercula, Puccinia psidii, Puccinia sp. 1, Puccinia sp. 2, Pucciniosira dorata, Uredo ficina, Uredo hydrocotyles, Uredo incomposita, Uredo jatrophicola, Uredo kyllingiae, Uredo melinidis, Uredo notata, Uredo peperomiae, Uredo proeminens, Uredo rubescens, Uredo yucatanensis, Uromyces bidenticola, Uromyces ictericus, Uromyces sp. 1 y Uromyces trifolii-repentis. Asi el numero de especies de Pucciniales conocidas para Panama aumenta de 101 a 131. En 5 especies diferentes de hongos se descubrieron nuevas especies en plantas hospederas: Cordia spinescens para Alveolaria cordiae, Eupatorium odoratum para Cionothrix praelonga, Xylopia gradiflora para Dasyspora gregaria, Cyperus diffusus para Puccinia subcoronata, y Calathea indecora para Puccinia thaliae. La especie Dasyspora gregaria es reportada con basidiosporas finamente verrucosas por primera vez en royas y la especie Alveolaria cordiae, una especie pobremente conocida es reportada, descrita e ilustrada con detalles por primera vez sobre Cordia spinescens en Panama.
Das Leben aller Organismen wird grundlegend durch den tages- und jahreszeitlich bedingten Wechsel der Beleuchtungsverhältnisse geprägt. Die Anpassung der Stoffwechselprozesse und Verhaltensweisen an diese Oszillationen erfolgt nicht passiv, sondern wird durch eine innere Uhr gesteuert. Tageszeitliche Rhythmen, die auch ohne den Einfluss äußerer, periodisch verlaufender Umgebungsreize (Zeitgeber) ablaufen, werden als zirkadiane Rhythmen bezeichnet. Im Säugetier steuert ein endogener Rhythmusgenerator im Nucleus suprachiasmaticus (SCN) zirkadiane Rhythmen, indem er periphere Oszillatoren miteinander synchronisiert. Auf molekularer Ebene besteht dieser endogener Rhythmusgenerator aus Aktivatoren (BMAL1 und CLOCK/NPAS2) und Inhibitoren (PER1/2 und Cry1/2), die in Rückkopplungsschleifen die Grundlage für die Rhythmogenese steuern. Die Synchronisation dieses molekularen Uhrwerkes an die Umgebungszeit erfolgt durch Licht, das in der Retina wahrgenommen und an das SCN weitergeleitet wird. Die Signaltransduktionskaskaden nach einem Lichtpuls in der frühen und der späten Nacht unterscheiden sich dabei wesentlich: Ein Lichtpuls während der frühen Nacht führt zu einer erhöhten Freisetzung von Ca2+-Ionen über Ryanodin Rezeptoren (RYR), während ein Lichtpuls während der späten Nacht zu einer erhöhten Guanylylcyclase Aktivität führt. Um zu untersuchen, wie der endogene Rhythmusgenerator seinen Lichteingang reguliert, wurde die Licht-vermittelte Phasenverzögerung in BMAL1+/+- (profizienten) und BMAL1-/-- (defizienten) Mäusen untersucht. Die Befunde aus den in-situ Hybridisierungsstudien, RTQ-PCR und immunhistochemischen Untersuchungen dieser Arbeit zeigten, dass in BMAL1-/--Mäusen die Licht-induzierte mPer-Expression während der frühen Nacht selektiv beeinträchtigt ist. Zudem konnte gezeigt werden, dass die mRNA- und Proteinmengen von RYRs in BMAL1-/--Mäusen dramatisch reduziert waren. Ryr1:: und Ryr2::Luciferase-Reportersstudien zeigten darüber hinaus, dass die Ryr-Expression durch CLOCK/BMAL1 aktiviert und durch CRY1inhibiert werden kann. Diese Ergebnisse liefern den ersten Beweis dafür, dass der endogene Rhythmusgenerator des Säugers die Signalübertragung seines eigenen Lichteingangs regulieren kann. Weiterhin wurde in dieser Arbeit die ontogenetische Entwicklung des endogenen Rhythmusgenerators im SCN und in einem Melatonin-abhängigen peripheren Oszillator, der PT, untersucht und miteinander verglichen. Dazu wurden die Uhrengenproteine im fetalen (E18), postnatalen (P2 & P10) und adulten SCN und in der PT von C3H-Mäusen zu vier verschiedenen zirkadianen Zeitpunkten mittels Immunhistochemie untersucht. Die Anzahl immunreaktiver SCN-Zellen gegen alle untersuchten Uhrengenproteine (außer BMAL1) war im Fetus signifikant niedriger, als in der adulten Maus. Auch im SCN neonataler (P2) Mäuse erreichte die Anzahl immunreaktiver Zellen noch nicht das Niveau der adulten Maus. Erst 10 Tage nach der Geburt (P10) zeigen alle Uhrengenproteine im SCN ein adultes Verteilungsmuster. Offenbar reift das Uhrwerk im SCN von Mäusen graduell während der postnatalen Entwicklungsphase. Dabei besteht eine zeitliche Korrelation zwischen der Reifung des endogenen Rhythmusgenerators im SCN und der Ausbildung von inter-suprachiasmatischen und retino-suprachiaamatischen neuronalen Kontakten. Im Gegensatz zum SCN zeigte der Melatonin-abhängigen Oszilllator in der PT bereits im Fetus einen nahezu vollständig ausgeprägten Rhythmus der Uhrengenproteine. Da das fetale Pinealorgan noch nicht zur rhythmischen Melatonin-Synthese fähig ist, liegt es nahe, dass das mütterliche Melatonin die rhythmische Expression der Uhrengene in der fetalen PT reguliert. Wie in vitro Untersuchungen an PER2::LUCIFERASE-Mäusen zeigten, hat das mütterliche Melatonin offenbar auch einen modulierenden Einfluss auf den fetalen SCN. Bei diesen Mäusen konnte im fetalen und postnatalen SCN ein zirkadianer Rhythmus in der PER2-Synthese nachgewiesen werden, der eine relativ lange Periodenlänge aufwies und nach 3 Tagen zum Erliegen kam. Eine Stimulation mit Melatonin führte zu einer deutlichen Verkürzung der Periodenlänge im PER2-Rhythmus. Folglich scheint das mütterliche Melatonin eine wichtige Quelle für Informationen der Umgebungszeit im Fetus zu sein. Um die Uhrengenexpression während der Maus-Ontogenese in vitro auf zellulärer Ebene darzustellen, wurde in dieser Arbeit zudem ein vom murinen Per2-Promoter angetriebenes DsRed- Reportersystem etabliert und der Versuch begonnen, eine darauf basierende transgene Maus zu generieren.
RNA interference (RNAi) is triggered by recognition of double-stranded RNA (dsRNA), and elicits the silencing of gene(s) complementary to the dsRNA sequence. RNAi is thought to have emerged as a way of safeguarding the genome against mobile genetic elements and viral infection, thus maintaining genomic integrity. dsRNA is first processed into small interfering RNAs (siRNA) by the enzyme Dicer. siRNAs are ~21 to 25 -nt long, and contain a signature 5’ phosphate group and a two nucleotide long 3’ overhang (Bernstein et al., 2001). The siRNA is then loaded into the RNA-induced si-lencing complex (RISC), of which Argonaute is the primary catalytic component (Liu et al., 2004). Energetic asymmetry of the siRNA ends allows for its directional loading into RISC (Khvorova et al., 2003; Schwarz et al., 2003). Argonaute cleaves the passen-ger strand of the siRNA, leaving the guide strand of the siRNA bound to RISC (Gregory et al., 2005; Matranga et al., 2005; Rand et al., 2005). This single-stranded guide strand siRNA bound to Argonaute is able to recognize target mRNA in a sequence-specific manner, and cleaves the mRNA. Argonaute 2 in complex with single-stranded siRNA is sufficient for mRNA recognition and cleavage, thus forming a minimal RISC (Rivas et al., 2005). miRNAs, endogenously expressed small RNA genes which typically contain mismatches and non-Watson-Crick base pairing, are processed by this general pathway, although typically modulate gene expression by translational repression as opposed to cleavage of their target mRNA. The number of Argonaute genes is highly variable between species, ranging from one in S. pombe to twenty-seven in C. elegans. Earlier crystal structures of Argonaute apoen-zymes show the architecture of Argonaute to be a multidomain protein composed of N terminal, PAZ, MID, and PIWI domains (Song et al., 2004; Yuan et al., 2005). These multi-domain proteins are present in both prokaryotic and eukaryotic organisms. The role of Argonaute proteins in prokaryotes is still unknown, but based similarity to eu-karyotic Argonautes, they may also be involved in nucleic acid-directed regulatory pathways. These proteins have served as excellent models for learning about the struc-ture and function of this family of proteins. RNAi has found a widespread application for the simple yet effective knockdown of genes of interest. The catalytic cycle of RISC requires the binding of a number of different nucleotide structures to Argonaute, and we expect Argonaute to undergo a number of conforma-tional changes during the cycle of mRNA recognition by RISC (Filipowicz, 2005; Tom-ari and Zamore, 2005). Nevertheless, it remains unclear how the multi-domain ar-rangement of Argonaute recognizes and distinguishes between single-stranded and dou-ble-stranded oligonucleotides, which correspond to the Dicer-processed siRNA product, guide strand siRNA, and the guide strand / mRNA duplex. The Argonaute protein from Aquifex aeolicus was cloned, expressed, crystallized and solved by molecular replacement. Relative to earlier Argonaute structures, a 24° reorientation of the PAZ domain in this structure opens a basic cleft between the N-terminal and PAZ domains, exposing the guide strand binding pocket of PAZ. A 5.5-ns molecular dynamics simulation of Argonaute showed a strong tendency of the PAZ and N-terminal domains to be mobile. Binding of single-stranded DNA to Argonaute was monitored by total internal reflection fluorescence spectroscopy (TIRFS). The experi-ments showed biphasic kinetics indicative of large conformational changes, and re-vealed a hotspot of binding energy corresponding to the first 9 nucleotides, the so-called “seed region” most crucial for sequence-specific target recognition. As RNAi may have evolved as a way of safeguarding the genome viral infection, it is not surprising that viruses have evolved different strategies to suppress the host RNAi response in the form of viral suppressor protein. (Hock and Meister, 2008; Lecellier and Voinnet, 2004; Rashid et al., 2007; Song et al., 2004; Vastenhouw and Plasterk, 2004). These viral suppressors are widespread, having been identified in a number of different viral families. Not surprisingly, they generally share little sequence homology with one another, although they appear to exist as oligomers built upon a ~ 100-200 amino acid protomer. Tomato aspermy virus, a member of the Cucumoviruses, encodes for protein 2B (TAV 2B, 95 a.a., ~11.3 kDa) that acts as an RNAi suppressor. Intriguingly, a similar genomic arrangement is seen in RNAi suppressors in the Nodaviruses, a family of viruses that can infect both plants and animals, such as Flock house virus b2 (FHV b2). The 2B and b2 proteins are both derived from a frameshifted ORF within the RNA polymerase gene (Chao et al., 2005). In spite of this genomic similarity, the 2B and b2 proteins share little sequence identity, and it is not well understood how the Cucumovirus 2B proteins suppress RNAi. To address how TAV 2B suppresses RNAi, the oligonucleotide-binding properties of TAV 2B were studied. TAV 2B shows a preference for double-stranded RNA oligonucleotides corresponding to siRNAs and miRNAs, and also binds to single-stranded RNA oligonucleotides. A stretch of positively charged residues between amino acids 20-30 are critical for RNA binding. Binding to RNA oligomerizes and induces a conformational change in TAV 2B into a primarily helical structure. These studies sug-gest that suppression of RNAi by TAV 2B may occur by targeting different stages of the RNAi pathway. TAV 2B falls under the category of more general RNAi suppres-sors, with potentially multiple targets for suppression.
Die vaskuläre NADPH-Oxidase ist eine wichtige Quelle für reaktive Sauerstoff-Spezies (ROS). Viele dieser Daten wurden unter Verwendung des Inhibitors Apocynin (4'-Hydroxy-3' methoxyacetophenon) erhoben, dessen Wirkungsweise jedoch nicht bekannt war. In dieser Arbeit wurde der Mechanismus der Hemmung der vaskulären NADPH-Oxidase näher untersucht, sowie nach weiteren Inhibitoren gesucht. In HEK293-Zellen wurden die NADPH-Oxidase-Isoformen Nox1, Nox2, Nox4, Duox1 oder Duox2 überexprimiert und die von den Zellen produzierten Radikale durch verstärkte Chemilumineszenz gemessen. Hierbei wurde festgestellt, dass Apocynin die Produktion von Superoxidanionen nicht hemmt, aber die Detektion von Wasserstoffperoxid- oder Hydroxylradikalen beeinflusst. Wenn die Radikale durch Xanthin/Xanthin-Oxidase oder nicht-enzymatische Systeme generiert wurden, beeinflusste Apocynin direkt die Peroxid-, aber nicht die Superoxid-Detektion. In Leukozyten ist Apocynin ein Pro-Pharmakon, das durch Myeloperoxidase (MPO) aktiviert werden kann. Dieser Prozess führt zur Bildung eines Apocyninradikals, das zu einem Dimer umgewandelt wird. Allerdings kann man aufgrund der hohen Reaktivität des Radikals nur das Dimer nachweisen. Endothelzellen und glatte Muskelzellen sind nicht in der Lage dieses Dimer zu bilden und können daher Apocynin nicht aktivieren. In Nox-überexprimierenden HEK293-Zellen konnte die Dimer-Bildung gezeigt werden, wenn MPO zugegeben wurde. Apocynin kann ohne MPO-Zugabe nur die NADPH-Oxidase in Leukozyten hemmen und wirkt in vaskulären Zellen als Antioxidans. Tatsächlich wurde in vaskulären glatten Muskelzellen die Aktivierung der redoxsensitiven Kinasen p38-MAP-Kinase, Akt und Erk1/2 durch Wasserstoffperoxid und durch den intrazellulären Radikal-Generator Menadion in Anwesenheit von Apocynin verhindert. Des Weiteren wurde untersucht, ob Cyclooxygenase 2 (COX-2), die eine ähnliche Peroxidase-Domäne wie MPO besitzt, mit Apocynin interagiert. Die COX-2-Aktivität wurde durch Apocynin gehemmt. In COX-2 überexprimierenden HEK293- Zellen wurden die Superoxidanion- sowie die Wasserstoffperoxid-Bildung durch Apocynin völlig gehemmt. Allerdings konnte durch die Peroxidaseaktivität von COX-2 Apocynin nicht aktiviert und somit kein Dimer nachgewiesen werden. Diese Beobachtung unterstützt ferner die unspezifische Natur der Nox-Hemmung durch Apocynin.Intravenös appliziertes Apocynin in Mäusen und Schweinen führte zu einer Aktivierung von Apocynin. In vivo wirkt Apocynin somit als möglicher Nox2-Inhibitor und als Antioxidans. Flavonoide, insbesondere die des Katechol-Typs, in dem der B-Ring monomethyliert ist, haben eine ähnliche Struktur wie Apocynin. Daher wurde in dieser Arbeit auch das Potenzial der Flavonoide Epicatechin, 3'-O-Methyl-Epicatechin, Procyanidin B2 und Isorhamnetin als Inhibitoren der NADPH-Oxidase analysiert. Nox-überexprimierende HEK293-Zellen (Nox1, Nox2 sowie Nox4) wurden mit verschiedenen Flavonoiden inkubiert und die ROS-Bildung mittels verstärkter Chemilumineszenz gemessen. Epicatechin und Procyanidin B2 hemmten die Radikal-Detektion der verschiedenen Nox-Isoformen in allen Detektionssystemen. Isorhamnetin hemmte die Radikal-Detektion durch Nox1 nur leicht, allerdings wurde die Bildung der Radikale durch Nox4 und Nox2 fast komplett blockiert. 3'-O-Methyl-Epicatechin wies die schwächste antioxidative Wirkung auf. Es hemmte zwar die Wasserstoffperoxidbildung, jedoch kaum die Nox1- und Nox2-abhängige Superoxidanion-Bildung. Keine der getesteten Substanzen konnte den „respiratorischen Burst“ in mit Phorbolmyristatacetat stimulierten Leukozyten blockieren. Diese Daten deuten darauf hin, dass Apocynin und Katechine potente Antioxidantien für Wasserstoffperoxid, aber keine spezifischen NADPH-Oxidase- Hemmer in vaskulären Systemen sind.
The reggie protein family consists of two homologous members, reggie-1 and reggie-2, also termed flotillin-2 and flotillin-1, respectively, that are ubiquitously expressed and evolutionarily well conserved, suggesting an important but so far ill-defined function. In various cell types, both reggies have been found to be constitutively associated with lipid rafts by means of acylation modifications and oligomerization. Lipid rafts are glycosphingolipid- and cholesterol-rich membrane microdomains which have been implicated in several cellular processes including membrane transport and signal transduction through growth factor receptors. However, the molecular details of these processes are still poorly understood. With the observation that reggies colocalize with activated glycosylphosphatidylinositolanchored proteins (GPI-APs) and Fyn kinase in rafts, a role for these proteins in signaling events has been suggested. In agreement with that, we have previously shown that reggie-1 becomes multiply tyrosine phosphorylated by Src kinases in response to epidermal growth factor (EGF) stimulation, pointing to a function for reggie-1 in growth factor signaling. Furthermore, overexpression of reggie-1 enhances spreading on fibronectin substrate in a tyrosine-dependent manner, thus revealing a role for reggie-1 in regulation of actin cytoskeleton through growth factor receptors. Due to the similarity shared by reggie proteins at amino acid level and to their ability to form hetero-oligomeric complexes, the first aim of this study was to analyze the putative tyrosine phosphorylation of reggie-2 in growth factor stimulated cells. Similarly to reggie-1, reggie-2 was found to be multiply tyrosine phosphorylated by Src kinase and to exist in a molecular complex with Src, with the degree of co-immunoprecipitation dependent on the activity of Src. Recent studies from us have also shown that administration of EGF results in the endocytosis of reggie-1 from the plasma membrane into endosomes, which is in line with a proposed role for reggies in membrane trafficking processes. In order to characterize in detail the endocytic mechanism that mediates the uptake of reggie-1, the dependency of reggie-1 endocytosis on clathrin and dynamin was investigated by means of overexpressing a variant form of Eps15 or a dominant negative form of dynamin-2. In either case the translocation of reggie-1 into endosomes in response to EGF was not affected, and this, together with the results that reggie-1 colocalized with cholera toxin (CTX) but not with transferrin receptor (TfnR) during EGF signaling, indicates that reggie-1 is taken up by means of a dynaminindependent, raft-mediated pathway. These findings are very well in line with recent data showing the pathway of entry into cells of reggie-2 as a raft-mediated endocytic pathway. The endocytosis of reggie-2 in response to EGF was also analyzed in this study. Similarly to reggie-1, in growth factor stimulated cells reggie-2 underwent a translocation from the plasma membrane to endosomes where the two reggies were found to colocalize with each other, suggesting that epidermal growth factor signaling might trigger the endocytosis of reggie oligomers. In addition, colocalization with both the late endosomal marker LAMP3/CD63 and epidermal growth factor receptor (EGFR) was detected, again indicating a function for reggies in signal transduction through growth factor receptors. EGFR has been reported to localize in rafts but, although this association is thought to be functional during EGF stimulation, how segregation of EGFR into rafts modulates its endocytosis and signaling is still under debate. Since reggie oligomers have recently been suggested to define a raft subtype, a further aim of this study was to investigate whether the depletion of reggies by means of small interfering RNA could interfere with the signaling and the trafficking through EGFR. Knockdown of reggie-2 resulted in an altered tyrosine phosphorylation of EGFR in response to EGF, while the degree of ubiquitination was not affected. Less efficient phosphorylation of tyrosine residues, especially of those which are docking sites for Grb2 and Shc, led in turn to an impaired activation of p38 and ERK1/2 MAPKs. Depletion of reggie-2 did not affect the early trafficking of activated EGFRs, with receptors being endocytosed and delivered to late endosomes as efficiently as in control cells. This would be in line with the normal degree of ubiquitination observed for EGFR, as ubiquitin moieties have been proposed to represent sorting tags that ensure receptor endocytosis into early endosomes and its proper intracellular trafficking. On the contrary, after prolonged EGF stimulation, depletion of reggie-2 resulted in a decreased downregulation of both receptor-bound ligand and EGFR, and in their accumulation in intracellular vesicles, thus pointing to a role for reggie-2 in the degradative pathway. Taken all together, these data ndicate that the association of EGFR with reggie-microdomains is likely to be important for proper receptor trafficking and signaling.
A generic drug product (World Health Organization (WHO) terminology: multisource product) is usually marketed and manufactured after the expiry date of the innovator’s patent. Generic drugs are less expensive than the innovator products because generic manufacturers do not have to amortize the investment costs of research, development, marketing, and promotion. Multisource products must contain the same active pharmaceutical ingredients (APIs) as the original formulation and have to be shown to be interchangeable with the original formulation. Multisource products have to be shown bioequivalent to the innovator counterpart with respect to pharmacokinetic and pharmacodynamic properties. Multisource products are therefore identical in dose, strength, route of administration, safety, efficacy, and intended use. Bioequivalence can be demonstrated by in vitro dissolution, pharmacokinetic, pharmacodynamic or clinical studies. Since 2000, the U.S. Food and Drug Administration (FDA) allows the approval of certain multisource products solely on the basis of in vitro studies, i.e. by waiving in vivo studies in humans (“Biowaiver”), based on the Biopharmaceutics Classification Scheme (BCS). The BCS characterizes APIs by their solubility and permeability in the gastrointestinal tract (GIT). The different BCS Classes I-IV (Class I: high solubility, high permeability; Class II: low solubility, high permeability; Class III: high solubility, low permeability and Class IV: low solubility, low permeability) result from all possible combinations of high and low solubility with high and low permeability. Since the adoption of the BCS by the FDA in 1995, the BCS criteria have been under continuous development. In 2006, the WHO has released the most recent bioequivalence guidance including relaxed criteria for bioequivalence studies based on modified BCS criteria. According to this guidance, APIs belonging to the BCS classes I – and under defined conditions - II and III – are eligible for a biowaiver-based approval. The principal objective of this work was to characterize the first-line anti tuberculosis APIs, isoniazid, pyrazinamide, ethambutol dihydrochloride and rifampicin, according to their physicochemical, biopharmaceutical, pharmacokinetic and pharmacological properties and to classify them according to the BCS. Ethambutol dihydrochloride and isoniazid were classified as borderline BCS class I/III APIs. Pyrazinamide was classified as a BCS class III and rifampicin as a BCS class II API. Based on the BCS classification and the additional criteria defined in the WHO bioequivalence guidance, the possibility of biowaiver-based approval for immediate release (immediate release) solid oral dosage forms containing the first-line antituberculosis drugs was evaluated. A biowaiver-based approval with defined constraints was recommended for immediate release solid oral dosage forms containing isoniazid (interaction with reducing sugars), pyrazinamide and ethambutol dihydrochloride (relative narrow therapeutic index). Rifampicin was classified as a BCS class II API, and it was concluded that rifampicin containing solid oral immediate release drug products as well as Scale-Up and Post-Approval Changes (SUPAC) changes should not be approved by a biowaiver on the following basis: (i) its solubility and dissolution are highly variable due to polymorphism and instability, (ii) concomitant intake of food and antacids reduces its absorption and bioavailability, (iii) no in vitro predictive dissolution test has been found which correlates to in vivo absorption and (iv) several publications reporting cases of non-bioequivalent and bioinequivalent rifampicin products have been located in the literature. Thus, it is recommended that bioequivalence of rifampicin containing solid oral immediate release drug products should be established by in vivo pharmacokinetic studies in humans. This risk-benefit benefit assessment of a biowaiver-based approval was presented as a poster at the American Association of Pharmaceutical Scientists (AAPS) 2005 and subsequently published as “Biowaiver Monographs” in the Journal of Pharmaceutical Sciences. Based on the assessment of the dissolution properties of the antituberculosis drugs for a biowaiver approval, quality control dissolution methodologies for the International Pharmacopoeia (Pharm. Int.) were developed, presented at the WHO expert meeting and adopted in the Pharm. Int. (http://www.who.int/medicines/publications/pharmprep/OMS_TRS_948.pdf). Additionally, preliminary biowaiver recommendations were also developed for four firstline antimalarial drugs listed on the WHO Essential Medicines List (EML): Quinine, as both the hydrochloride and sulphate, and proguanil hydrochloride were classified as borderline BCS class I/III APIs. Since quinine is a narrow therapeutic index drug and many cases of non-bioequivalence have been reported in the literature, a biowaiverbased approval was not recommended. For solid oral immediate release dosage forms containing proguanil a biowaiver-based approval was recommended under the condition that they dissolve very rapidly. Primaquine phosphate was classified as a BCS class I API. Therefore, a biowaiver-based approval was recommended for immediate release solid oral dosage forms containing primaquine phosphate. Mefloquine hydrochloride was classified as a basic, BCS class IV/II API, making it ineligible for the biowaiver. Additionally, reports of non-bioequivalence and a narrow therapeutic index were found in the scientific literature. Consequently, bioequivalence of solid oral immediate release dosage forms containing mefloquine hydrochloride should be established by in vivo pharmacokinetic studies. The results for quinine hydrochloride and sulphate, proguanil hydrochloride, primaquine diphosphate and mefloquine hydrochloride were presented as a poster at the Pharmaceutical Sciences World Congress (PSWC) 2007 and published as a WHO Collaborating Center Report in June 2006. The aim of this project was to collect, evaluate, generate and publish relevant information for a biowaiver-based approval of essential medicines in order to provide a summary to local regulatory authorities. This information complements the selected list of essential medicines by providing information about the biopharmaceutical properties and pharmaceutical quality of solid oral immediate release dosage forms containing these APIs. The aim of the biowaiver project, inspired by the WHO and brought in life by the International Pharmaceutical Federation (FIP), is to enable access to essential medicines in standardized quality at an affordable price. In this work, a significant contribution to this aim in the form of four biowaiver monographs for the antituberculosis drugs and several reports on the antimalarials has been achieved.
In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass bei verschiedenen Hämostasedefekten eine unterschiedliche Aktivierung des Gerinnungssystems besteht. So wiesen Personen mit heterozygoter Prothrombin-Mutation (G20210A) eine massiv erhöhte Thrombinbildung auf, während sie in den üblichen Globaltests (Prothrombinzeit (PT) und aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aPTT)) und der Thrombinzeit (TZ) nicht pathologisch waren. Bei Personen mit reaktiv aktiviertem Gerinnungssystem war ebenfalls eine erhöhte Thrombinbildung nachweisbar, zudem war die aPTT verkürzt. Dagegen zeigten Personen mit Antiphospholipidsyndrom und Personen mit heterozygoter/homozygoter FV-Leiden-Mutation eine leicht gesteigerte Thrombinbildung, ferner waren die anderen plasmatischen Tests (PT, aPTT, TZ), außer der Lupus-Antikoagulans-sensitiven aPTT, unauffällig. In dieser Arbeit wurde mit dem Thrombingenerierungstest (TGT) eine Methode etabliert und evaluiert, um die in-vitro Wirksamkeit neuer Antithrombotika auf die Blutgerinnung zu untersuchen. Die verwendeten Antithrombotika repräsentieren 3 Klassen oral applizierbarer, niedermolekularer Substanzen: 1. Thrombininhibitoren (Dabigatran und Melagatran) 2. FXa-Inhibitoren (Rivaroxaban und Apixaban) 3. Duale Thrombin/FXa-Inhibitoren (BR4965 und BR4966) Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass Antithrombotika je nach Wirkmechanismus (FXa-Hemmung, Thrombinhemmung oder duale Thrombin/FXa-Hemmung) unterschiedliche Effekte auf die TGT-Parameter ETP (endogenes Thrombinpotential) und PEAK (größte Thrombinbildungsgeschwindigkeit) haben. Während der PEAK gut geeignet war, die antihämostatische Wirkung von selektiven FXa-Inhibitoren abzubilden, wurde das ETP durch die FXa-Inhibitoren nicht so stark beeinflusst, insbesondere in plättchenarmen Plasma (PPP). Im Gegensatz dazu hatten die selektiven Thrombininhibitoren eine gute dosisabhängige Wirkung auf das ETP, jedoch keine auf den PEAK. Mehr noch wurde für Inhibitoren mit thrombinhemmender Komponente beobachtet, dass sie den PEAK der Thrombinbildung erhöhen statt reduzieren, wenn sie in niedrigen Konzentrationen zugegeben wurden. Dieses Phänomen war umso stärker ausgeprägt, je höher die Thrombinselektivität der Substanz war. Erwartungsgemäß zeigten die beiden dualen Thrombin/FXa-Inhibitoren sowohl Eigenschaften von FXa-Inhibitoren, als auch von selektiven Thrombininhibitoren, wobei die Substanz BR4965 in ihrer Wirkung eher den FXa-Inhibitoren ähnelte und BR4966 eher den selektiven Thrombininhibitoren. In PPP und PRP (plättchenreichem Plasma) von Personen mit aktiviertem Gerinnungssystem (heterozygote/homozygote FV-Leiden Mutation, heterozygote Prothrombin-Mutation oder reaktiv aktiviertes Gerinnungssystem) zeigten die Antithrombotika ähnliche Effekte auf die Thrombinbildung wie bei gesunden Probanden. Lediglich in PRP von Patienten mit Antiphospholipidsyndrom verursachten die Inhibitoren eine stärkere Hemmung der Thrombinbildung, insbesondere die FXa-Hemmer. Der Einfluss des FXa-Inhibitors Rivaroxaban auf die PT erwies sich als dosisabhängig und korreliert eng mit dem Plasmaspiegel, so dass mit diesem Globaltest ein einfacher Monitoring-Test zur Verfügung steht. Es ist aber zu beachten, dass die PT in Sekunden abgelesen werden muss, denn nur für eine Ablesung in Sekunden, aber nicht in % (= Quick-Wert) ergab sich eine enge Korrelation mit den Plasmaspiegeln. Für das Monitoring von selektiven Thrombininhibitoren wie Dabigatran war die aPTT besser geeignet. Die Heparin-induzierte Thrombozytopenie Typ II (HIT Typ II) ist eine schwerwiegende Komplikation der Heparin-Therapie. Daher wurde untersucht, ob die neu entwickelten Antithrombotika auch das Risiko für die Enstehung einer HIT Typ II bergen. Hierzu wurde auf Basis der Thrombinbildung ein Testsystem entwickelt, in dem gezeigt wurde, dass Plättchenfaktor 4 (PF4) die gerinnungshemmende Aktivität von Heparinen, aber nicht die der neuen Antithrombotika neutralisiert. Hieraus ist zu schließen, dass PF4 an Heparine binden kann, aber nicht an die neuen Antithrombotika. Folglich sollte das Risiko einer HIT Typ II unter den neuen Antithrombotika gering sein, da hierfür zunächst Antikörper an den Komplex aus PF4 und Heparin (bzw. PF4/Antithrombotikum) binden müssen. Abschließend wurde der Einfluss der neuen Inhibitoren auf die Ausbildung der Thrombozyten- Leukozyten-Aggregate untersucht, da bei akuten thromboembolischen Ereignissen (z.B. Herzinfarkt) erhöhte Werte von Thrombozyten-Leukozyten-Aggregaten nachgewiesen wurden. Alle untersuchten Substanzen hatten eine inihibitorische Wirkung auf die Ausbildung der Thrombozyten-Leukozyten-Aggregate, wobei der hemmende Effekt umso stärker ausgeprägt war, je höher die Thrombinselektivität des Inhibitors war. In dieser Arbeit wurde mit dem Thrombingenerierungstest (TGT) eine Methode etabliert und evaluiert, um die in-vitro Wirksamkeit neuer Antithrombotika auf die Blutgerinnung zu untersuchen. Die verwendeten Antithrombotika repräsentieren 3 Klassen oral applizierbarer, niedermolekularer Substanzen: 1. Thrombininhibitoren (Dabigatran und Melagatran) 2. FXa-Inhibitoren (Rivaroxaban und Apixaban) 3. Duale Thrombin/FXa-Inhibitoren (BR4965 und BR4966) Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass Antithrombotika je nach Wirkmechanismus (FXa-Hemmung, Thrombinhemmung oder duale Thrombin/FXa-Hemmung) unterschiedliche Effekte auf die TGT-Parameter ETP (endogenes Thrombinpotential) und PEAK (größte Thrombinbildungsgeschwindigkeit) haben. Während der PEAK gut geeignet war, die antihämostatische Wirkung von selektiven FXa-Inhibitoren abzubilden, wurde das ETP durch die FXa-Inhibitoren nicht so stark beeinflusst, insbesondere in plättchenarmen Plasma (PPP). Im Gegensatz dazu hatten die selektiven Thrombininhibitoren eine gute dosisabhängige Wirkung auf das ETP, jedoch keine auf den PEAK. Mehr noch wurde für Inhibitoren mit thrombinhemmender Komponente beobachtet, dass sie den PEAK der Thrombinbildung erhöhen statt reduzieren, wenn sie in niedrigen Konzentrationen zugegeben wurden. Dieses Phänomen war umso stärker ausgeprägt, je höher die Thrombinselektivität der Substanz war. Erwartungsgemäß zeigten die beiden dualen Thrombin/FXa-Inhibitoren sowohl Eigenschaften von FXa-Inhibitoren, als auch von selektiven Thrombininhibitoren, wobei die Substanz BR4965 in ihrer Wirkung eher den FXa-Inhibitoren ähnelte und BR4966 eher den selektiven Thrombininhibitoren. In PPP und PRP (plättchenreichem Plasma) von Personen mit aktiviertem Gerinnungssystem (heterozygote/homozygote FV-Leiden Mutation, heterozygote Prothrombin-Mutation oder reaktiv aktiviertes Gerinnungssystem) zeigten die Antithrombotika ähnliche Effekte auf die Thrombinbildung wie bei gesunden Probanden. Lediglich in PRP von Patienten mit Antiphospholipidsyndrom verursachten die Inhibitoren eine stärkere Hemmung der Thrombinbildung, insbesondere die FXa-Hemmer. Der Einfluss des FXa-Inhibitors Rivaroxaban auf die PT erwies sich als dosisabhängig und korreliert eng mit dem Plasmaspiegel, so dass mit diesem Globaltest ein einfacher Monitoring-Test zur Verfügung steht. Es ist aber zu beachten, dass die PT in Sekunden abgelesen werden muss, denn nur für eine Ablesung in Sekunden, aber nicht in % (= Quick-Wert) ergab sich eine enge Korrelation mit den Plasmaspiegeln. Für das Monitoring von selektiven Thrombininhibitoren wie Dabigatran war die aPTT besser geeignet. Die Heparin-induzierte Thrombozytopenie Typ II (HIT Typ II) ist eine schwerwiegende Komplikation der Heparin-Therapie. Daher wurde untersucht, ob die neu entwickelten Antithrombotika auch das Risiko für die Enstehung einer HIT Typ II bergen. Hierzu wurde auf Basis der Thrombinbildung ein Testsystem entwickelt, in dem gezeigt wurde, dass Plättchenfaktor 4 (PF4) die gerinnungshemmende Aktivität von Heparinen, aber nicht die der neuen Antithrombotika neutralisiert. Hieraus ist zu schließen, dass PF4 an Heparine binden kann, aber nicht an die neuen Antithrombotika. Folglich sollte das Risiko einer HIT Typ II unter den neuen Antithrombotika gering sein, da hierfür zunächst Antikörper an den Komplex aus PF4 und Heparin (bzw. PF4/Antithrombotikum) binden müssen. Abschließend wurde der Einfluss der neuen Inhibitoren auf die Ausbildung der Thrombozyten- Leukozyten-Aggregate untersucht, da bei akuten thromboembolischen Ereignissen (z.B. Herzinfarkt) erhöhte Werte von Thrombozyten-Leukozyten-Aggregaten nachgewiesen wurden. Alle untersuchten Substanzen hatten eine inihibitorische Wirkung auf die Ausbildung der Thrombozyten-Leukozyten-Aggregate, wobei der hemmende Effekt umso stärker ausgeprägt war, je höher die Thrombinselektivität des Inhibitors war.
Das Volumen von tierischen Zellen ist durch äußere und innere Einflüsse Veränderungen unterworfen. Um die zelluläre Homöostase zu gewährleisten und bedrohliche Volumenänderungen zu verhindern, verfügen die meisten Zellen daher über regulatorische Mechanismen zur Verringerung (regulatory volume decrease, RVD) oder Erhöhung (regulatory volume increase, RVI) des Zellvolumens. Darüber hinaus finden diese Mechanismen auch im Rahmen physiologischer Prozesse, wie z. B. der Zellbewegung oder der Proliferation Verwendung. Der RVD erfordert einen Sensor-Mechanismus, der die Veränderung des Zellvolumens registriert. Die nachfolgende Signaltransduktion führt zur Aktivierung von Transportmechanismen, die v. a. dem Export von K+- und Cl--Ionen, aber auch organischen Osmolyten, dienen und zum Ausstrom von Wasser aus der Zelle führen, bis das Sollvolumen erreicht ist. Bisher ist noch nicht sicher, welcher Mechanismus den RVD einleitet; in verschiedenen Geweben wurden Hinweise auf mehrere mögliche Kandidaten gefunden. In dieser Arbeit wurde der RVD von HaCaT-Zellen, einer humanen Keratinozyten-Zelllinie hinsichtlich der Beteiligung des Aktin-Zytoskeletts mit mikroskopischen, pharmakologischen und molekularbiologischen Methoden untersucht. HaCaT-Zellen schwellen in hypotonem Medium schnell an (30 s) und führen einen RVD durch, der nach ca. 5 min das Ausgangsvolumen wieder herstellt. Der RVD von HaCaT-Zellen ist vom Einstrom extrazellulärer Ca2+-Ionen abhängig. Dieser Einstrom erfolgt durch einen Kanal, der durch die Inhibitoren von stretch activated channels (SAC) Gd3+ und GsMTx-4, sowie den spezifischen Inhibitor des transient receptor potential vaniloid 4 (TRPV4), Rutheniumrot, gehemmt werden kann. TRPV4 wird in HaCaT-Zellen exprimiert. Der RVD und der damit verbundene Einstrom von Ca2+-Ionen, nicht aber das Anschwellen der Zellen werden durch den Abbau des Aktin-Zytoskeletts durch 2 μM Cytochalasin D (CD) gehemmt. Die Hemmung durch CD ist reversibel; nach dem Entfernen von CD bildet sich innerhalb von 30 min erneut ein Netzwerk von Aktinfilamenten aus. Ein zwei-stufiges Absenken der Osmolarität (jeweils ca. 20%), zunächst in Anwesenheit von CD führt zu einer Volumenzunahme, löst aber keinen RVD aus. Auch nach dem Entzug von CD bleibt das Volumen konstant erhöht. Erst das zweite Absenken löst eine Volumenregulation aus, allerdings nur bis zu dem Volumen, das nach dem Entfernen von CD etabliert war. Die mikroskopische Struktur des Aktin-Zytoskeletts von HaCaT-Zellen ändert sich während des RVD kaum. Durch die Messung der Fluoreszenz von gebundenem Rhodamin-Phalloidin konnte ein vorübergehender Anstieg der Menge von Aktinfilamenten (F-Aktin) während des RVD gezeigt werden. Ein quantitativer biochemischer Ansatz zeigt, dass die relative Menge des Triton- X-100-löslichen Anteils des Aktin-Zytoskeletts im gleichen Zeitraum zunimmt. Der RVD von HaCaT-Zellen hängt ebenfalls von der Geschwindigkeit der Osmolaritätsänderung ab; die langsame Verringerung der Osmolarität (≤ 5 mosM/min) führte zum Anschwellen, nicht aber zum RVD. Auf Basis der erzielten Ergebnisse wird ein Modell für den RVD von HaCaTZellen vorgeschlagen, bei dem der Anstieg des Zellvolumens zu einer Zunahme der mechanischen Spannung im kortikalen Zytoskelett führt. Dadurch wird – indirekt, etwa durch Phospholipase A2, oder direkt - TRPV4 aktiviert. Dies führt zu einem Einstrom von extrazellulären Ca2+-Ionen und über Ca2+-abhängige Aktin-bindende Proteine (z. B. Gelsolin) zu einer Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts (Gel-Sol-Übergang) und verbunden damit zu einer Abnahme der mechanischen Spannung. Ca2+-Ionen und kurze Aktinfilamente aktivieren Transportmechanismen, die zum Ausstrom von K+- und Cl-- Ionen und einer Abnahme des Zellvolumens führen.
The growth of blood vessels is crucial for organ growth in the embryo and repair of wounded tissues in the adult. An imbalance in this process contributes to numerous malignant, inflammatory, ischemic, infectious and immune disorders (Ferrara et al., 2003). Postnatal neovascularization occurs through the recruitment of progenitor cells and angiogenesis. Integrins are heterodimeric cell surface molecules and are the main receptors for extracellular matrix proteins. Regulation of integrin activation is crucial during embryonic development and during adult life. Dysregulation of integrin activity leads to severe diseases. In this study, we have demonstrated that Rap1, a small GTPase regulating integrin activity, and its GEF Epac1 are expressed in both EPC and endothelial cells. Moreover, the pharmacological activator of Epac activates the small GTPase Rap1 in progenitor cells. In parallel the angiogenic growth factors VEGF and bFGF activate Rap1 in endothelial cells. In addition, the regulation of Rap1 activity in EPC and in endothelial cells plays an important role in the regulation of migration and adhesion to matrix proteins, by regulating the activity of different integrins, a mechanism known as integrin inside‐out signaling. Furthermore, regulation of Rap1 activity affects probably indirectly through outside‐in signaling of integrins the activity of several and crucial proteins such PKB/Akt and focal adhesion kinase in endothelial cells. In line with these results, we have demonstrated that Rap1 activity affect angiogenesis, homing of EPC to ischemic tissues and thereby postnatal neovascularization. The understanding how Rap1 regulates integrin activity in endothelial cells is still not completely clear, for example we have demonstrated that the known effectors of Rap1 mediating the increase of integrin activity in T and B cells, such as RAPL and RIAM are, respectively, either not increasing integrin activity or not expressed in endothelial cells. We aim to find the effector of Rap1 promoting integrin activity in endothelial cells and how RAPL regulates integrin functions and angiogenesis. Moreover data from us and others using genetic models and generation of Rap1a or Rap1b deficient mice or deficient for Rap1a and Rap1b led to embryonic lethality suggesting that Rap1 is a key node protein during embryonic development. The development of conditionnal Rap1a/b endothelial/pericytes restricted deficient mice will help us to decipher more precisely the role of Rap1 during vascular development and angiogenesis.
Individuell markierte Siebenschläfer einer freilebenden Population wurden fünf Jahre lang während ihrer sommerlichen Aktivitätsphase beobachtet, um Erkenntnisse über die Zeitmuster der täglichen und saisonalen Aktivitäten, des Sozialverhaltens und des Winterschlafs zu erhalten. 1. Auf der Basis einer langjährigen Untersuchung an einer weitestgehend „geschlossenen“ und nahezu komplett erfassten Population und der täglichen Anwesenheitskontrolle von individuell mit Transpondern markierten Tieren können qualifizierte Aussagen über die relative Wirkung von exogenen Faktoren und endogenen Steuermechanismen auf Lebensprozesse des Siebenschläfers getroffen werden. 2. Mathematische Simulationen zeigen, wie unvollständig und damit unzulänglich Datensätze sind, wenn auf einer wöchentlichen oder gar nur monatlichen Erhebung beruhen. Soll die Populationsgröße als Maß für die ökologische Zustandsbewertung einer Population und für Prognosen bezüglich deren Entwicklung in den Folgejahren unter bestimmten Umweltbedingungen herangezogen werden, dann ist eine tägliche Kontrolle zur Fehlerminimierung notwendig. Erstmals wurde insbesondere auch nachgewiesen, dass die Populationsstruktur (Alter und Geschlecht der Tiere) und die Populationsdynamik ohne Berücksichtigung chronoethologischer Aspekte nicht angemessen erfasst werden können. 3. Für das „Modellsystem Siebenschläfer“ werden Kriterien zur Bestimmung der Populations-größe und -Struktur entwickelt und als mögliche Richtlinie für die adäquate Paradigmenwahl bei der Erstellung von mittelfristigen Prognosen formuliert. Die Tages- und Jahresrhythmik der Tiere, sowie deren Alter beeinflussen unter Feldbedingungen die Erfassbarkeit des Tierbestandes. Für die Abschätzung von Bestandsdichten muss deshalb der Zeitpunkt der Datenerhebung berücksichtigt werden. 4. Veränderungen des Nahrungsangebotes steuern bekanntermaßen die Gonadenreifung der Männchen und haben damit einen direkten Einfluss auf die Verpaarung der Siebenschläfer. Im Beobachtungsgebiet erfolgt gemäß dem etwa zweijährigen Fruchtbarkeitshythmus der Vegetation auch die Reproduktion der Siebenschläfer meist nur alle zwei Jahre. 5. Die langjährige Nachweisrate der individuell markierten Tiere zeigt an einer Freilandpopulation, dass die Lebenserwartung und auch das durchschnittlich erreichte Alter von Siebenschläfern höher sind als bisher erwartet. Die ersten beiden Überwinterungen stellen für Siebenschläfer eine deutliche „Überlebens-Hürde“ dar; dabei ist grundsätzlich das Gewicht der Tiere beim Eintritt in den Winterschlaf entscheidend für das Erreichen des nächsten Sommers. 6. Der solitär lebende Siebenschläfer findet sich auch nach dem Ende der Paarungszeit und der Auflösung des Geschwisterverbandes zu zeitlich begrenzten Schlafgemeinschaften zusam-men. Erstmals konnte nachgewiesen werden, dass Schlafgruppen in reproduktionsstarken Jahren nur während des Übergangs zwischen dem Winterschlaf und der Sommeraktivität, sowie in reproduktionsarmen Jahren während der gesamten aktiven Phase zur Thermoregu-lation gebildet werden. Vermutlich begünstigen verwandtschaftliche Beziehungen ebenso wie die Habitateigenschaften (wie z.B. das Höhlenangebot) die Bildung von Schlafgruppen. 7. Erstmals wurden an Siebenschläfern die Tagesrhythmik des Verhaltens unterschiedlich alter Tiere analysiert: Adulte Siebenschläfer sind generell nachtaktiv mit einer monophasischen Aktivitätsphase, die oft durch einen kurzen Schlaf („napping“) unterbrochen wird. Der Be-ginn der nächtlichen Aktivität ist synchron zur bürgerlichen Dämmerung. Unter der Kon trolle von streng endogenen Mechanismen, die offensichtlich einem Reifungsprozess unter-liegen, ändert sich der Zeitverlauf der Nachtaktivität mit dem Lebensalter: von einem zunächst polyphasischen Muster der Jungtiere im Brutkasten zu dem monophasischen Muster der adulten Siebenschläfer, sobald sich die Wurfgemeinschaft aufgelöst hat. 8. Bei ungünstigen Umgebungstemperaturen oder bei akutem Nahrungsmangel können die Siebenschläfer in Tageslethargie verfallen, die durch eine charakteristische Körperhaltung, selbst ohne Messung der Körpertemperatur, erkannt werden kann. Dieser Torpor kann wenige Stunden oder auch mehrere Tage andauern („Sommerschlaf“) und ist vermutlich mit ein Grund für die lückenhafte Anwesenheit der Tiere in den Nisthöhlen in reproduktions-schwachen Jahren, die parallel zu knappen Nahrungsressourcen auftreten. Die Lethargiephasen folgen keinem endogenen Zeitplan sondern opportunistisch den exogenen Bedingungen. 9. Das Zeitmuster des Winterschlafs beim Siebenschläfer wird generell in stärkerem Ausmaß von endogenen Programmen als von exogen einwirkenden Faktoren, wie z.B. klimatischen Parametern, kontrolliert. Der Zeitpunkt des Winterschlaf-Endes und somit der Beginn der frühsommerlichen Aktivitätsphase hängt dabei vom Alter und Geschlecht der Tiere nicht aber von Witterungsfaktoren wie der Umgebungstemperatur ab. 10. Die männlichen und weiblichen Jungtiere gehen mit dem durchschnittlich gleichen Körpergewicht in ihren ersten Winterschlaf. Es wurde zum ersten Mal nachgewiesen, dass die männlichen juvenilen Tiere dennoch den Winterschlaf etwa zwei Wochen früher als die Weibchen beenden. Da dieses Phänomen noch vor der Geschlechtsreife zu beobachten ist, liegt hier vermutlich ein endogenes Zeitprogramm vor. 11. Auch der Beginn des Winterschlafs scheint überwiegend endogenen Steuermechanismen zu unterliegen. Hier erfolgt jedoch, im Vergleich zum Winterschlaf-Ende, eine stärkere, alters- und geschlechtsspezifische Modulation durch exogene Faktoren (z.B. Nahrungsverfügbarkeit) und korreliert mit den vorhergehenden Reproduktionsvorgängen. 12. Es wird diskutiert, dass die komplexen endogenen Zeitprogramme, circadiane (Ta-ges)Uhren und circannuale (Jahres)Uhren, die kurze sommerliche Aktivitätsphase der Sie-benschläfer bestimmen. Sie sichern dadurch wie bei vielen anderen Tierarten, die in Habi-taten mit stark ausgeprägten periodischen saisonalen Änderungen in der Nahrungsverfüg-barkeit leben, die weitgehende Unabhängigkeit von kurzfristigen akuten Schwankungen der Umweltbedingungen. Die genetische Verankerung solcher biologischer Uhren könnte deshalb erst langfristig Auswirkungen des globalen Klimawandels widerspiegeln. Die indi-viduelle Variabilität dieser Zeitprogramme ermöglicht gleichwohl wenigstens Teilen der Population, Vorteile bei entsprechenden Umweltveränderungen wahrzunehmen.
Channelrhodopsine sind blaulichtsensitive, Retinal-bindende Proteine aus der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii. Channelrhodopsin 2 (ChR2) wurde als heptahelikaler, kationenselektiver Ionenkanal charakterisiert (Nagel et al., 2003). Wie die zur selben Proteinfamilie gehörende Protonenpumpe Bakteriorhodopsin (bR) wird ChR2 durch Licht aktiviert; allerdings wird hierbei ein passiver Strom ausgelöst, bei dem Kationen entsprechend ihres elektrochemischen Gradienten fließen. Aufgrund dieser Eigenschaft eignet sich ChR2 zur lichtinduzierten Depolarisation von Zellen und zur Auslösung von Aktionspotentialen in Neuronen, über deren Membran ein Konzentrationsgradient von Kationen anliegt (Boyden et al., 2005). Die Stimulation elektrischer Aktivität von ChR2-exprimierenden Neuronen im Hirngewebe von Mäusen, die ChR2 transgen exprimieren, kann beispielsweise genutzt werden, um die Konnektivität von Neuronen und Hirnbereichen zu untersuchen (z.B. Wang et al., 2007). Für diese und weitere Anwendungen war es interessant, ChR2 zelltyp- oder regionenspezifisch in Mäusen zu exprimieren. Zu diesem Zweck sollte ChR2/eGFP bicistronisch oder ChR2-YFP als Fusionsprotein unter einem ubiquitären Promotor exprimiert werden; die Expression sollte aber durch ein Stop-Element unterbunden werden, das von loxP-sites flankiert ist (unaktiviertes Transgen). Das Enzym Cre- Rekombinase entfernt durch Rekombination das Stop-Element an diesen Erkennungssequenzen, wodurch die ChR2-Expression ermöglicht werden sollte (aktiviertes Transgen). Die Cre-Rekombinase kann dabei sowohl viral als auch transgen unter zelltyp- und regionenspezifischen Promotoren exprimiert werden und damit die regionale Spezifität und den Zeitpunkt der ChR2-Expression bestimmen. Es wurden drei Mauslinien über Pronukleus-Injektionen erhalten, die den Reporter β-Galactosidase des unaktivierten Transgens exprimierten. Die Verpaarung von Mäusen dieser Linien mit Cre-Rekombinase-exprimierenden Mauslinien führte aber nur zu einer ineffizienten Aktivierung des Transgens, so dass ChR2-Expression einzig mittels RT-PCR nachgewiesen werden konnte. Nach viraler Expression der Cre-Rekombinase im Hippokampus konnte eine Aktivierung des ChR2-Transgens auch mittels Immunfluoreszenz gezeigt werden. Mangels GFP-Fluoreszenz waren die transgenen Linien aber nicht für gezielte elektrophysiologische Ableitungen verwendbar. In einem zweiten Ansatz wurden transgene Mäuse über embryonale Stammzellen (ES-Zellen) generiert. Bei diesem Ansatz wird eine geringere Kopienzahl des Transgens ins Genom integriert. In den ES-Zellen konnte durch transiente Cre-Rekombinase-Expression gezeigt werden, dass das Transgen effizient aktiviert werden konnte. Aus mehreren ES-Zell-Klonen wurden chimäre Mäuse erhalten, die zum jetzigen Zeitpunkt auf Keimbahntransmission getestet werden. Wie ChR2 einen Kationenkanal bildet und welche Transmembrandomänen und Aminosäuren daran beteiligt sind, ist unbekannt. Daher wurde im zweiten Teil dieser Arbeit untersucht, ob die Positionen E90, E97 und E101, welche in der zweiten Transmembranhelix untereinander zu liegen scheinen, Teil einer Ionenpore sein könnten. Um den Einfluss dieser Aminosäuren auf die Kationenleitung und/ oder – selektivität zu untersuchen, wurden diese Positionen substituiert und die resultierenden ChR2-Mutantenproteine in Xenopus laevis Oozyten exprimiert und elektrophysiologisch analysiert. Um Na+- bzw. Protonen-mediierte Ströme unterscheiden zu können, wurden Na+-haltige und Na+-freie Puffer verschiedener pH-Werte verwendet. Lichtinduzierte Ströme von ChR2E97A, ChR2E97Q, ChR2E97K und ChR2E101K waren im Vergleich zum Wildtyp stark reduziert, ausschließlich bei pH 4 zu detektieren und wohl hauptsächlich durch Protonen getragen. Die isofunktionale, aber ladungsneutrale Mutation ChR2E90Q zeigte nur geringe Unterschiede zum Wildtyp. Alaninsubstitution (E90A) als auch Ladungsinversion (E90K) führte zu starken Veränderungen des ChR2-Stroms im Vergleich zum Wildtyp. ChR2E90A zeigte im Vergleich zum Wildtyp reduzierte Protonenströme sowie einen erhöhten Natriumstrom, der durch Protonen inhibierbar war. Die Ladungsinversion ChR2E90K führte zu allgemein stark verminderten Leitfähigkeiten, lediglich bei pH 4 konnten noch Ströme gemessen werden. Die Ergebnisse sind der erste Hinweis auf eine Beteiligung von Glutamatresten an der Ionenleitfähigkeit in der Transmembranhelix 2 von ChR2.
5-LO is the key enzyme in the biosynthesis of proinflammatory leukotrienes. It catalyses the conversion of arachidonic acid to the hydroperoxy intermediate 5(S)-hydroperoxy-6- trans-8,11,14-cis-eicosatetraenoic acid (5-HpETE). In a second step 5-LO catalyses a dehydration reaction forming the unstable epoxide intermediate 5(S)-trans-5,6-oxido-7,9- trans-11,14-cis-eicosatetraenoic acid (leukotriene A4 , LTA4). The 5-LO gene is subjected to versatile regulation mechanisms. Apart from regulation by DNA-methylation and histone acetylation / deacetylation 5-LO gene expression can be regulated by the differentiation inducers calcitriol (1,25-dihydroxyvitamin D3) and transforming growth factor beta (TGFβ) 5-LO gene expression. In the myeloid cell lines Mono Mac 6 (MM6) and HL-60, differentiation with both agents caused a prominent upregulation of 5-LO mRNA level, of 5-LO protein expression and of 5-LO activity. Treatment with calcitriol alone already has an impact on 5-LO gene expression which is additionally potentiated by TGFβ treatment. Previous nuclear run-off analysis and reporter gene analysis could not associate the 5-LO promoter with the induction of 5-LO mRNA expression mediated by calcitriol and TGFβ. Inclusion of the 5-LO coding sequence (cds) and inclusion of the 5-LO cds plus the last four introns of the gene (J to M) in the 5-LO promoter construct pN10 led to an enhanced reporter gene activity. The inductions were dependent on vitamin D receptor (VDR) and retinoid x receptor (RXR) cotransfection. Therefore the work was concentrated on identifying elements outside the 5-LO promoter region which contribute to the calcitriol / TGFβ effect on 5-LO mRNA expression. Insertion of the LTA4 hydrolase coding sequence – a coding sequence of similar size - instead of the 5-LO cds led to a loss of the calcitriol / TGFβ effect (pN10LTA4Hcds 1-fold induction). Therewith, it was proven that the presence of the 5-LO cds is crucial for the upregulating effect of calcitriol / TGFβ on 5-LO mRNA level. Cloning of the SV40 promoter instead of pN10 upstream of the 5-LO cds still showed inducibility by treatment with the inducers which argues for a promoter unspecific effect. Insertion of the 5-LO cds in a promoterless basic vector (pGL3cds) displayed same inductions by calcitriol / TGFβ treatment as the 5-LO promoter 5-LO cds construct (pN10cds). Thus, the effect of the inducers is not dependent on the 5-LO promoter under the in vitro conditions of the reporter gene assay. Hence, further cloning was done with promoterless constructs. Through 5-LO cds deletion constructs a positive regulating region in exon 10 to 14 was discovered. To adapt the natural gene context the last four introns (J-M) of the 5-LO gene were inserted in a promoterless construct containing exon 10 to 14 (pGL3cdsΔABInJM). 5end deletion constructs of it revealed putative vitamin D responsive elements (VDREs) in exon 12 and intron M. Mutation of the putative VDREs led to a reduced calcitriol effect –more prominent when the putative VDRE in intron M was mutated (reduction of 40%). Moreover another putative VDRE in exon 10 with an adjacent SMAD binding element (SBE) was detected. SMAD proteins are effector proteins of TGFβ signalling. Gelshift experiments demonstrated in vitro binding of the VDR-RXR heterodimer to those three putative VDREs. By chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay in vivo binding of VDR and RXR was shown to the VDRE in the region of exon 10, exon 12 and intron M. 8h and 24h incubation with calcitriol / TGFβ resulted in enhanced expression of VDR in each of the examined regions. The VDR is able to bind to the VDRE without its ligand, whereas this goes along with corepressor recruitment and thus the VDR has a repressive effect on transcription. Histone H4 acetylation was increased when MM6 cells were treated for 8h or 24h with calcitriol or the combination of calcitriol / TGFβ. This finding implies that at that point of time corepressors associated with the VDR are replaced by coactivators. It seems convincing that 5-LO transcription is mainly promoted by calcitriol alone which leads to a more accessible chromatin structure. Previous data indicated that calcitriol and TGFβ upregulate 5-LO RNA maturation and 5- LO transcript elongation. Thus several elongation markers were investigated by ChIP analysis: Histone H3 lysine 36 (H3K36) trimethylation and H4K20 monomethylation were detected in the analysed regions in exon 10, exon 12 and intron M. In region exon 10 the H3K36 trimethylation status was enhanced after 24h calcitriol or calcitriol / TGFβ treatment. An increased H4K20 monomethylation status in all regions was observed when MM6 cells were treated for 24h with calcitriol / TGFβ. 24h treatment with both agents also enhanced the recruitment of the elongation form of RNA polymerase II, which is phosphorylated at serine 2 of the carboxyterminal domain, to the investigated regions. These findings prove the positive regulating role for calcitriol and TGFβ on 5-LO transcript elongation. A putative mechanism of the effect of calcitriol and TGFβ on 5-LO RNA maturation might be the elevated phosphorylation of serine 2 of the RNA Polymerase II which is known to be followed by recruiting polyadenylating factors.
The respiratory chain is composed of protein complexes residing in the inner mitochondrial membrane of eukaryotes or in the cytoplasmic membrane of prokaryotes. This cellular energy converter transforms a redox potential stored in low potential substrates into an electrochemical potential across the respective membrane. Typical respiratory chains contain the complexes I, II, III and IV named according to their sequence in the respiratory chain reaction. Electrons of low potential substrates enter at complex I or II and are passed via complex III to complex IV where they are transferred to oxygen. The transport of electrons between the complexes is mediated by small electron shuttles like quinol or cytochrome c. Two different models describe their exchange either by (1) random collision of freely diffusible electron shuttles and membrane protein complexes or (2) arrangement of the complexes in supercomplexes enabling direct channeling of electron shuttles. In the Gram positive bacterium Corynebacterium glutamicum, the complex III to complex IV electron shuttle cytochrome c is not diffusible but a covalently bound part of the diheme cytochrome subunit QcrC of complex III. Therefore, the complexes III and IV have to form a supercomplex for electron transduction. The aim of this thesis was to purify and characterise this obligatory supercomplex III/IV of C. glutamicum. To gain sufficient biomass of C. glutamicum as starting material for purification, a phosphate buffered minimal medium was developed that enabled yield of total 120 g wet cell mass (38 g dry mass) in 12 L (6×2 L) shaking cultures. The determined conversion factor of glucose into biomass was 0.46 g/g indicating an intact respiratory chain. The yield was increased by bioreactor cultivation to ~690 g wet cell mass (~220 g dry mass) in ~10 L culture volume. A previously described homologous expression system was applied that produces the complex IV subunit CtaD with a fused Strep-tag II to facilitate purification. Affinity purifications using the Strep-tag II affinity to Strep-Tactin resin yielded a mixture of complexes and supercomplexes. Two supercomplex III/IV versions named supercomplex A and B and free complex IV were identified in this mixture by size exclusion chromatography, redox difference spectroscopy and two dimensional polyacrylamide gel electrophoresis including blue native polyacrylamide electrophoresis. The here presented downscaled blue native polyacrylamide electrophoresis method with analysis times of ~1 h enabled efficient screening of factors influencing the stability of supercomplex III/IV. The screening resulted that the integrity of supercomplex III/IV is preserved by using neutral detergents at minimal detergent to protein ratios for solubilisation and low detergent concentrations for purification and storage slightly above the required critical micellar concentration. Furthermore, pH <=7.5 is required for stability of supercomplex III/IV. Large biomass yields enabled upscaling of supercomplex III/IV affinity purification. Application of the identified stability conditions resulted in affinity purified samples free of supercomplex B. The major component supercomplex A was efficiently separated from residual free complex IV by preparative size exclusion chromatography. Concentration of purified supercomplex A by ultracentrifugation resulted in integrity of the supercomplex for several days at 4 °C. Purified supercomplex A contains ten different previously described subunits. The heme content of supercomplex A relative to the protein mass is heme A: 6.0 μmol/g, heme B: 6.5 μmol/g, and heme C: 5.8 μmol/g determined by redox difference spectroscopy and biochemical protein quantification. This indicates an equimolar ratio of complex III and complex IV in supercomplex A. Supercomplex A has quinol oxidase activity that is inhibited by stigmatellin or sodium azide. The turnover number of transferred electrons per complex III monomer is 148 s−1 at 25° C. The homogeneity and stability of the prepared supercomplex A enabled the growth of threedimensional crystals of up to 0.1 mm in length. Their composition of supercomplex A was verified by redox difference spectroscopy of intact crystals and blue native polyacrylamide electrophoresis of dissolved crystals. The crystals diffracted X-rays corresponding to a resolution of ~10 Å. Electron microscopy of negative stained samples revealed the uniform shape of purified supercomplex A particles with dimensions of 22 × 9 nm in the view plane. Combined heme quantification, size determination, determined activity, symmetry considerations, and particle shape indicate that supercomplex A has a central dimer of complex III and two monomers of complex IV on opposite sides. This conformation is functionally reasonable because it provides each complex III monomer with one complex IV monomer as electron acceptor. Therefore, the stoichiometry of supercomplex A is most likely III2IV2. The sensitivity of supercomplex A to detergents indicated a role of phospholipids in its stability. Therefore, a method for phospholipid identification and quantification was developed that is suitable for detergent solubilised crude and purified membrane protein samples. The analysis combines separation of phospholipid classes according to their head group by normal phase high performance liquid chromatography with evaporative light scattering detection. Calibration with external standard allows quantification of phospholipid amount in the range of 0.25-12 μg. The method is verified by analysing the phospholipid content of the well characterised complex III of Saccharomyces cerevisiae. The reduction of its phospholipid content during its purification steps is monitored. The complex III sample purified to crystallisation quality contains the phospholipid content that was also observed in previously reported structures determined by X-ray crystallography. Purified stable supercomplex A from C. glutamicum revealed a large content of bound phospholipids. The main differences between intact supercomplex A and a mixture of potentially disintegrated smaller complexes is that intact supercomplex A has a doubled phosphatidic acid content and an increased phosphatidyl glycerol content. The importance of the small anionic phosphatidic acid for mediation of contacts between complexes in a supercomplex is discussed. The total phospholipid content of stable supercomplex A is sufficient for a complete belt surrounding the supercomplex in the membrane plane. This indicates that also all essential internal phospholipid binding positions are occupied and potentially stabilise supercomplex A.
Ionenkanäle bilden therapeutische Schlüsselstellen für viele Erkrankungen und sind daher vor allem für die pharmakologische und medizinische Forschung von herausragender Bedeutung. Der Forschungsbedarf ist enorm und dementsprechend groß auch die Nachfrage nach elektrophysiologischen Systemen, die eine Analyse von Ionenkanälen und/oder Wirkstoffen im Hochdurchsatz erlauben. Derzeitige Hochdurchsatzsysteme basieren zumeist auf modifizierten Patch-Clamp-Verfahren, weisen aber im Vergleich zu manuellen Patch-Clamp-Systemen noch einige Nachteile auf. In der vorliegenden Arbeit wurde daher im Rahmen eines vom Bundesministerium für Bildung und Forschung geförderten BioChancePlus-Projektes eine alternative Methode, die Fakir-Methode, entwickelt und ihre Einsatzmöglichkeit in Hochdurchsatzsystemen evaluiert. Bei der Fakir-Methode werden Zellen in einem inhomogenen, elektrischen Wechselfeld mit Hilfe dielektrophoretischer Kräfte zu Metallnanoelektroden hin beschleunigt, aufgrund ihrer Bewegungsenergie von letzteren penetriert und dadurch elektrisch kontaktiert. Dies ermöglicht die anschließende, intrazelluläre Messung in physiologischer Lösung. Im Vergleich zur Patch-Clamp-Methode hat die Fakir-Methode die Vorteile, dass das Zytoplasma der Zelle erhalten bleibt und dass mit einer geringen Zelldichte gearbeitet werden kann. Auf der anderen Seite polarisiert die Elektrode schnell und die genaue, intrazelluläre Zusammensetzung während der Messung ist nicht bekannt. Für die Realisierung der Fakir-Methode im Experiment wurde eine Mikrofluidikkammer mit austauschbaren Metallmikro- und Metallnanoelektroden- Chips entwickelt, die die mikroskopische Beobachtung des Kontaktierungsprozesses ermöglichte. Die Charakterisierung der Elektroden erfolgte sowohl durch Potentialmessungen als auch mit Hilfe von Impedanzspektroskopie. Um die dielektrophoretische Attraktion von Zellen genauer steuern zu können, wurde zudem ein Amplitudenmodulator entwickelt. Zellen konnten sowohl einzeln, als auch in Gruppen kontaktiert werden. Intrazelluläre Potentialmessungen von HEK293-Zellen, die den blaulichtgesteuerten Kationenkanal Channelrhodopsin-2 (ChR2) exprimierten, zeigten, dass mit Hilfe der Fakir-Methode von Membranproteinen verursachte Spannungsänderungen gemessen werden können. Beim Fakir-Modell auftretende Schwierigkeiten wurden analysiert und die Ergebnisse genutzt, um ein Konzept für eine hochreproduzierbare Herstellung von Nanoelektroden-Arrays unter Verwendung der 2-Photonenpolymerisations- Technolgie (2PP) zu entwerfen. Für den Einsatz als Biosensoren sind große Zellen besonders geeignet. Eine effektive Vergrößerung von Zellen kann durch die Multi-cell-Elektrofusion erreicht werden. Diese Art der Herstellung von Riesenzellen ist insbesondere deshalb so interessant, weil die Elektrofusion problemlos in ein automatisiertes Mikrofluidiksystem eingebunden werden kann. Neben HEK293-Zellen konnten nach Entwicklung geeigneter Protokolle für die Herstellung von Protoplasten auch Saccharomyces cerevisiae und Pichia pastoris zu Riesenzellen elektrofusioniert werden. Solche Riesenzellen wurden im Rahmen dieser Arbeit biophysikalisch charakterisiert. Neben Kapazitätsmessungen zeigten sowohl die Expression von YFP in den Membranen als auch die Verwendung von fluoresceinhaltiger Patch-Clamp- Pipettenlösung, dass es sich bei den Riesenzellen um einheitliche Kompartimente handelte und somit die gesamte Membranfläche für elektrophysiologische Experimente zur Verfügung stand. Vergleichende Patch-Clamp-Messungen von ChR2-exprimierenden Ursprungs- und Riesenzellen ergaben nicht nur, dass das überexprimierte Protein auch nach der Elektrofusion noch funktional war, sondern auch, dass die Expressionsdichte unverändert blieb. Damit bilden elektrofusionierte Riesenzellen weit über ihre Einsatzmöglichkeiten in Hochdurchsatzsystemen hinaus ein vielversprechendes Werkzeug, um zum Beispiel elektrogene Membranproteine mit geringer Stromamplitude nachzuweisen oder in der giant-inside-out- Konfiguration elektrophysiologische Messungen durchzuführen. Lipophile Anionen können eingesetzt werden, um die elektrischen Eigenschaften der Membranen zu verändern und die Zellstabiliät während des Elektromanipulationsprozesses zu verbessern. Daher wurde für vier verschiedene lipophile Anionen die Spannungsabhängigkeit der Erhöhung der spezifischen Membrankapazität in Patch- Clamp-Experimenten mit HEK293-Zellen analysiert.
Ein früherer Vorschlag zum Reaktionsmechanismus der DFPase, der eine Wasseraktivierung durch den Rest H287 postulierte, mußte nach neuen experimentellen Daten verworfen werden. Daher lag zu Beginn der hier vorliegenden Arbeit kein Vorschlag für den Mechanismus der DFPase vor, der die experimentellen Daten erklären konnte. Für das längerfristige Ziel, die katalytischen Eigenschaften der DFPase gezielt verändern zu können, war es daher notwendig, zunächst den Mechanismus der Hydrolyse von Verbindungen wie DFP durch die DFPase näher zu untersuchen. Durch computergestützte Modellierung im aktiven Zentrum der DFPase (Docking) wurde die Bindung von DFP und anderen Substraten der DFPase genauer untersucht und mit vorhandenen experimentellen Daten verglichen. Diese Arbeiten führten auch zur theoretischen Untersuchung des Bindungsverhaltens von O,O-Dialkylphosphoroamidaten als potentiellen Inhibitoren der DFPase. Diese den Dialkylfluorophosphaten strukturell sehr ähnlichen Substanzen werden durch die DFPase nicht umgesetzt. Die Ergebnisse der Dockinguntersuchung führten schließlich zu der Synthese von drei Phosphoroamidaten unter der Untersuchung ihres Verhaltens als Inhibitoren der DFPase. DIe Charakterisierung erfolgte dabei über enzymkinetische Methoden sowie NMR-Experimente. Mit dem stärksten Inhibitor O,O-Dicyclopentylphosphoroamidat gelang die Kristallisation eines Komlexes mit der DFPase, der mit der Methode der Röntgenbeugung strukturell bestimmt werden konnte. Dieser Komplex belegt die Bindung der Phosphorylgruppe von Substraten an das katalytisch wirksame Calciumion im aktiven Zentrum der DFPase und zeigt die vorherrschenden Bindungskräfte zwischen Ligand und Protein auf. Eine Reihe von Mutanten der DFPase, bei denen gezielt die koordinierenden Aminosäuren des katalytischen Calciumions verändert wurden, ergänzte die bereits in früheren Arbeiten erzeugten Mutanten. Die katalyischen Eigenschaften dieser Mutanten und ihre Fähigkeit zur Metallbindung gestatten es, diese Metallbindungsstelle genauer zu beschreiben und lassen zusammen mit den Dockingexperimenten und der Struktur des Inhibitor-Enzymkomplexes vermuten, dass der calciumkoordinierende Aminosäurerest D229 als aktives Nukleophil im Reaktionsmechanismus der DFPase fungiert. Diese Vermutung ließ sich mit experimentellen Daten untermauern. Durch 18O-Isotopenmarkierung konnte gezeigt werden, dass ein Sauerstoffatom von D229 auf das entstehende Produkt übertragen wird. Hierdurch konnte die Existenz eines Phosphoenzymintermediats nachgewiesen werden. Des weiteren gelang es, Kristalle der DFPase zu züchten, die für Neutronenbeugungsexperimente geeignet waren. Im Rahmen dieser Experimente gelang die Aufnahme eines vollständigen Datensatzes und die Lösung der Neutronenbeugungsstruktur der DFPase in einer Auflösung von 2,2 Å. Diese Neutronenstruktur, in der Wasserstoffatome im Unterschied zu Röntgenstrukturen gut sichtbar sind, zeigt eindeutig, dass der Rest D229 wie erforderlich deprotoniert und dass das in der Bindungstasche an das Calciumion koordinierende Wassermolekül nicht als Hydroxid vorliegt. Damit ließ sich die direkte Aktivierung von Wasser durch das Metallion ausschließen. Neben wichtigen Informationen über die Bindungstasche der DFPase lieferte die Neutronenstruktur auch detaillierte Einblicke in das Wasserstoffbrückennetzwerk im zentralen, wassergefüllten Tunnel des Proteins. Über die Bestimmung des Wasserstoff/Deuteriumaustausches von Proteinrückgradamiden konnten weitere Aussagen über die Solvenszugänglichkeit von verschiedenen Proteinbereichen gemacht werden. Für die DFPase konnten strukturell und funktionell ähnliche Proteine identifiziert werden. Neben der Paraoxonase 1 waren dies das Calciumbindeprotein Regucalcin aus Agrobacterium thumefaciens sowie das Drug Resistance Protein 35 aus Staphylococcus aureus. Es konnte gezeigt werden, dass diese Proteine eine der katalytischen Calciumbindestelle der DFPase vergleichbare Metallbindestelle aufweisen und verschiedene Enzymaktivitäten dieser Proteine durch einen Mechanismus mit einem zu D229 analogen Nukleophil erklärt werden können. Ein direkter Vergleich zwischen der DFPase und der humanen Paraoxonase gelang durch Untersuchungen mit fluorogenen Organophosphaten als Substrate. Hierbei konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass die DFPase in der Lage ist, Substrate mit einer P-O Bindung hydrolytisch zu spalten. Die unterschiedlich gute Umsetzung der verschiedenen Substrate durch die beiden Enzyme konnte auf der Grundlage der Proteinstrukturen erklärt werden, wobei für die Paraoxonase postuliert wurde, dass der calciumbindende Aminosäurerest D269 als zu D229 analoges Nukleophil wirkt. Abschließend gelang es, zusätzlich eine Zusammensetzung für eine Enzympräparation zu finden, die eine Gefriertrocknung der DFPase mit nur geringem Verlust an enzymatischer Aktivität erlaubt. Ein solches lagerstabiles Enzympulver ist ein notwendiger Schritt hin zu einer praktischen Anwendung der DFPase für die technische Dekontamination von hochtoxischen Nervenkampfstoffen.