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Die Knochenansammlung im grauen vulkanischen Tuff der Südserengeti gibt als ökologisch unmögliches
Gemisch ein gutes Abbild des Gesamtbestandes und des Lebensraumes der altquartärcn ost- und innerafrikanischen Fauna. Diese lebte formenreich in Urwald, Savanne und offener Steppe. Das Fehlen wasserlebender Tiere ist hier auf örtliche Umstände zurückzuführen: die vulkanischen Aschen gingen auf Steppenboden nieder, Die benachbarten, ungefähr gleichalten Knochenlager enthalten solche Tiere. Neu ist an der Serengetifauna der bereits beträchtliche Anteil von Kleinsäugern (Nager; Insektivoren fehlen noch). Diese wird weitere Forschung vermehren. Die klimatische Entsprechung der Fauna wird in tropischen, feuchtwarmen Bedingungen erblickt. Obwohl viele tertiäre Formen enthaltend, wird die Fauna nicht als jungtertiär angesehen, sondern wegen des Auftretens moderner· Formen als eine Tiergesellschaft, welche das Quartär eröffnet. Als Leitfossil für dessen Beginn wird der Gattung Archidiskodon, aus welcher die echten Elefanten, darunter auch der afrikanische (Loxodonta africana ) entstanden sind, vor den Equiden der Vorzug gegeben.
Ostafrika, das ja als Tierparadies schlechthin gilt, lebte bis vor kurzem noch im Quartär. Das Schrifttum über seine Tierwelt scheint zwar fast unermeßlich groß, aufs Ganze gesehen ist das Wissen weder tief noch auch nur oberflächlich vollständig. Die Hauptleistung des "weißen Mannes" bestand in der Störung und Vernichtung der Fauna. Aber die Natur ist groß; sie hält noch einen Schatz im Inneren ihrer Gebirge bereit, damit der Mensch seine Stellung zu ihr und den Sinn seines Lebens ergründe, einen von vielen: dle quartäre Lebewelt selbst. Möge die hohe Aufgabe, ihn zu heben, uns Deutschen vergönnt sein! Eine Probe hat Dr. KOHL-LARSEN gesichert.
Die vorliegende Arbeit hat die Charakterisierung und Untersuchung des Stabilitätsverhaltens von
Parvulustat (PL), einem Homologen des α-Amylase-Inhibitors Tendamistat, zum Inhalt. Zur
weitreichenden Charakterisierung wurden verschiedene Proteinregionen des Parvulustats der CTerminus,
das hydrophobe Cluster, die Disulfidbrücken sowie die Proline auf ihren jeweiligen
Einfluss auf die Struktur und die thermodynamische Stabilität untersucht. In der vorliegenden
Zusammenfassung werden die Ergebnisse dieser Studien komprimiert präsentiert:
· Charakterisierung des Parvulustat-Wildtyps
Es galt vorweg herauszufinden, wie sich der Inhibitor unter nativen und denaturierten
Bedingungen verhält, um Rückschlüsse auf seine Merkmale und Strukturen zu ziehen. Die
erzielten Ausbeuten und die hohe Reinheit des isolierten Parvulustats erlaubten eine umfassende
Charakterisierung, einschließlich zahlreicher Kristallisationsexperimente, die vermuten lassen,
dass eine Kristallisation möglich sein sollte. Aufgrund der Tatsache, dass die Struktur des
Parvulustats bis 2009 unbekannt war, wurde die sekundäre Struktur mittels Circulardichroismus
und Fluoreszenzspektroskopie untersucht. Die Analyse des fernen UV-CD-Spektrums bei pH 7,0
und 25°C offenbarte eine „all-b-sheet“ Protein-Struktur. Mittels Fluoreszenzspektroskopie wurde
deutlich, dass die aromatischen Aminosäuren exponiert vorliegen. Um zunächst einen Einblick in
die Strukturveränderungen und die thermodynamische Stabilität zu erhalten, wurde der
temperaturinduzierte Entfaltungsübergang mittels CD-Spektroskopie verfolgt. Das Angleichen der
bei 230 nm gemessenen CD-Daten nach der linearen Extrapolations-Methode für eine
Zweizustands-Faltung ergab einen Tm-Wert von 82°C und D H(Tm) von 201,6 kJ/mol. Die
beträchtlichen Werte veranschaulichen die hohe Stabilität des Parvulustats. Eine aus den CDMessungen
bei 50° ergebende Übergangskurve zeigte, dass sich die Sekundärstruktur mit einem
Übergangsmittelpunkt bei 5,62 M GdnHCl kooperativ und reversibel entfaltet. Das Protein
entfaltet sogar infolge einer pH-Wert-Senkung bis auf pH 1 nicht vollständig, sondern es wechselt
direkt in einen Säure-Zustand („acid-state“). Dieser Zustand zeigt spektroskopisch die gleichen
Eigenschaften wie das native Protein, wobei die volle Inhibierungs-Aktivität nicht erhalten bleibt.
In sehr basischem Milieu bei pH 14 nimmt Parvulustat einen alkalisch denaturierten
Zwischenzustand IB an, der sich erheblich von dem GdnHCl-denaturierten, dem säurebehandelten
oder vom „molten globule“ Zustand unterscheidet. Allgemein behielt Parvulustat
über ein breites pH-Wert Spektrum (1,0-10,0) die native Struktur, bzw. eine „native like“ Struktur,
was erneut auf die enorme Stabilität des Proteins hindeutet. Die von Rehm et al. (Rehm et al.,
Theoretischer Teil
-4-
2009) aufgeworfene Hypothese des „induced fit“ Inhibierungsmechanismus des Parvulustats
konnte durch die in dieser Arbeit durchgeführten Experimenten bekräftigt werden. Mittels
Sekundärstrukturbestimmungen des Parvulustats unter Komplexbildung mit der a-Amylase
konnte eindeutig gezeigt werden, dass strukturelle Veränderungen am Inhibitor im Komplex
vorliegen. Durch zahlreiche Tests konnte festgestellt werden, dass die WRY-Region des
Parvulustats sich der Struktur der a-Amylase anpasst. Die Komplexierung des Parvulustats
bewirkte aber eine thermodynamische Destabilisierung der Inhibitor-Struktur.
· Einfluss des C-Terminus auf die Stabilität des Parvulustats
Um die Ursachen für die hohe Stabilität des Parvulustats auch im Vergleich zu Tendamistat (Tm:
79°C) zu finden, wurde der Einfluss des hoch flexiblen C-Terminus untersucht. Die Derivate mit
um zwei (PL-2AA), vier (PL-4AA) und sieben (PL-7AA) Aminosäuren verkürztem C-Terminus
wurden isoliert und analysiert. Die Entfaltungstemperaturen der verkürzten Derivate des
Parvulustats sinken mit abnehmender Zahl der Aminosäuren. Die Ergebnisse suggerieren, dass
der C-Terminus des Parvulustats eine entscheidende Rolle in der strukturellen Vollständigkeit des
Proteins während der thermischen Entfaltung spielt und damit auch in der Faltung (Tab.: 2.1). Der
Vergleich der Inhibitoraktivitäten der verkürzten Proteine mit dem nativen Parvulustat ergibt für
die Varianten PL-2AA und PL-4AA eine dem Wildtyp ähnliche Aktivität. Die Variante PL-7AA
weist eine leicht verringerte Aktivität auf.
Tabelle 2.1: ...
Einfluss hydrophober Oberflächenclustern auf Stabilität und Faltung
des Parvulustats
Parvulustat besitzt in der Mitte des ersten b-Faltblatts, um die Position 22 liegend, einen
hydrophoben Oberflächencluster. Wie mit Hilfe von Substitutionsexperimenten in dieser Region
gezeigt werden konnte, ist die thermodynamische Stabilität des Parvulustats in hohem Maße von
der Bildung dieses kleinen aber wichtigen hydrophoben Kerns bestimmt. Demnach muss das b-
Faltblatt I und das b-Hairpin I eine entscheidende Rolle in der Faltung von Parvulustat spielen.
Position 22 ist in zweierlei Hinsicht für die Stabilität des Parvulustats wichtig: einerseits durch die
energetisch wichtigen Wasserstoffbrückenbindungen und zum zweiten steuert die Stelle zur
Formation des hydrophoben Kerns bei. Die Daten suggerieren, dass es auch eine
thermodynamische Kopplung zwischen dem hydrophoben Effekt und der Präsenz von
Wasserstoffbrückenbindungen geben könnte. Zumindest aus der Sicht der Stabilität ist es
eindeutig, dass interatomare Interaktionen wie Wasserstoffbrückenbindungen, van-der-Waalsund
Dipol-Dipol-Wechselwirkungen notwendig sind, um eine stabile Bildung von b-Faltblättern
in Parvulustat und seinen Derivaten zu verwirklichen.
· Der Effekt der Proline auf die Stabilität des Parvulustats
Der Effekt der Substitution des Prolins durch Alanin an verschiedenen Positionen des Parvulustats
wurde ebenfalls untersucht. Im Ganzen betrachtet führt auch die Mehrfachsubstitution von Prolin
zu keiner nennenswerten strukturellen Veränderung im Parvulustat. Die durchgeführten
thermischen Entfaltungsexperimente bestätigen diese Beobachtungen. Alle Einzelmutanten (P5A,
P42A, P48A, P72A) zeigten eine höhere thermische Stabilität als der Wildtyp (Abb. 2.1).
Abbildung 2.1: Tm-Werte des Parvulustat-Wildtyps und seinen Prolin Mutanten.
Theoretischer Teil
-6-
Die fast gleich bleibenden Tm-Werte bzw. die Erhöhung der Stabilität des Parvulustats sind durch
die strukturelle Fluktuationen zu erklären, denn die rigide XAS-Pro-Bindung wurde durch die
flexible XAS-Ala-Bindung ersetzt.
· Der Einfluss der Disulfidbindung auf die Stabilität des Parvulustats
Der Einfluss der zwei Disulfidbrücken des Parvulustats wurde bezüglich Aktivität, spektraler
Eigenschaften sowie Stabilität untersucht. Hierfür wurden 25 Inhibitorvarianten mittels gezielter
Mutagenese gewonnen, in denen jeweils zwei Cysteinreste, die im natürlich vorkommenden
Parvulustat Disulfidbrücken bilden, durch andere Aminosäuren ersetzt wurden. Die Ergebnisse
zeigten, dass die Faltung Parvulustats ein zwei Zustand Verhalten besitzt, das außer in
Tendamistat in keinem anderen disulfid-verknüpftem Protein gefunden wurde. Dieses Verhalten
wurde durch die Entfernung von Disulfidbrücken nicht beeinflusst. Wie durch die CD- und
fluoreszenzspektroskopischen Experimente belegt werden konnte, ist die native Struktur des
Parvulustats durch die Entfernung der C43-C70-Disulfidbindung tiefgreifend verändert worden.
Passend zu den Veränderungen der Struktur haben die Mutationen schwerwiegende
Destabilisierungseffekte auf das Protein verursacht, was auch an der Erniedrigung der Freien
Gibbs Energie der Denaturierung und der Tm-Werte zu erkennen ist. Die Untersuchung des
Einflusses der Aminosäure-Substitution in den Positionen 43 und 70 auf die thermodynamische
Stabilität des Parvulustats führt zum Ergebnis, dass die Hydrophobizität und Polarität des Restes
70 einen bedeutenden Effekt auf die Stabilität des Proteins besitzt. Die Betrachtung der
thermodynamischen Daten macht deutlich, dass der Beitrag der freien Energie zur Stabilisierung
nicht nur abhängig von der eingeführten Aminosäure ist, sondern zum Teil auch von dem
strukturellen Kontext abhängt. Die Daten zeigen, dass die Substitution des Alanins an der Stelle
70 durch Leucin oder Threonin die Struktur um 0,3 bzw. 1,7 kJ/mol stabilisieren. Zusätzliche
Beiträge zum Unterschied bezüglich des ΔG°-Werts zwischen den Varianten C43AC70L/T und
C43L/TC70A können sich auch durch die unterschiedliche lokale Umgebung, wie z.B. die
Seitenketten von benachbarten Aminosäuren um die zwei Mutationsstellen ergeben. Der Tm-Wert
des Wildtyp-Proteins beträgt 82°C. Die Vergleiche dieser Größe mit der von der stabilsten
Cystein-defizitären Doppelmutante C43AC70T (47,3°C) ergibt eine Differenz von 34,7°C. Dieses
Ergebnis untermauert, dass die Disulfidbindung 2 eine extrem wichtige strukturelle Komponente
in der ungewöhnlich hohen Stabilität des Parvulustats darstellt.
Das Ziel der Arbeit war es dennoch die Daten der Stabilitäten einzelner Disulfidmutanten zu
sammeln und zu erfassen, um dadurch allgemeine Grundregeln für eine rationale Gestaltung der
Elimination beider Disulfidbrücken im Sinne einer vorhersagbaren Auswirkung auf die
Proteinstabilität zu bekommen.
Theoretischer Teil
-7-
Der Versuch ein disulfidfreies Protein in großen Mengen aus S. lividans zu isolieren, stellte sich
aber als extrem schwierig dar. Nach der Änderung des Stamms des Wirtsorganismus
(Streptomyces lividans TK23), Erhöhung der Qualität der Protoplasten und der Expressions-
Bedingungen (19°C, 150 rpm) konnten auf dem SDS-Gel stärkere Banden des Derivats
C9AC25TC43AC70T-4AA beobachtet werden. Die Expression der Mutante
C9AC25TC43AC70L-4AA konnte hingegen nicht nachgewiesen werden. Die anschließende
Reinigung des Derivats C9AC25TC43AC70T-4AA des Parvulustats mittels Gelfiltration und RPHPLC
bzw. Isolierung des Proteins aus dem SDS-Gel brachte das erwünschte Produkt. Dieses
konnte mit der MALDI-Massenspektroskopie eindeutig nachgewiesen werden. Das aktive
Cystein-freie Derivat C9AC25TC43AC70T-4AA konnte auch auf dem a-Amylase Plattentest
nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine Expression und der Nachweis einer
cystein-freien Variante möglich sind, dennoch haben die Ausbeuten dieses Proteins für
weiterreichende Analytik nicht ausgereicht. Demnach sind die Disulfidbrücken für die Stabilität
und Struktur des Parvulustats von enormer Bedeutung dennoch sind sie nicht zwingend
erforderlich für die Aktivität und die Expression in S. lividans.
1. Die vorliegenden vergleichend-morphologischen Untersuchungen an den Borstenmustern der Larven der Lepidoptera wurden mit dem Ziel durchgeführt, die Kenntnis des Borstenmusters der Lepidopterenlarven zu vertiefen, die auf die Borstenmuster anwendbare vergleichendmorphologische Methodik zu verfeinern und damit auch clie Grundlagen für eine vergleichende Untersuchung der Borstenmuster auf höherer taxionomischer Ebene (Borstenmuster bei Insekten verschiedener Ordnungen) zu liefern. Dabei wurde angestrebt, das ermittelte Verhalten der Borstenmuster während der Phylogenie einer evolutionstheoretischen Interpretation zuzuführen.
2. Zunächst wurde ein kurzer überblick über die wesentlichsten Charakteristika der Borstenmuster der Lepidopterenlarven gegeben. Sie bestehen aus zweierlei Musterelementen - den Borsten (setae) und den sog. Poren (punctures); der charakteristische Bau dieser Musterelemente, ihre Funktion und ihr Verhalten während der Larvalentwicklung wurden erörtert. Die Borsten bilden ein System taktiler Sinnesorgane, während die Poren sehr wahrscheinlich über die Beanspruchung der Cuticula Auskunft geben.
3. Im Interesse einer rationellen Arbeitsweise wurde eine neue Einteilung der Muster und der Musterelemente in verschiedene Kategorien eingeführt. Die Einteilung geschah nach jeweils nur einem Gesichtspunkt, und zwar werden unterschieden: a) nach der Konstanz der Lage der Musterelemente - zwischen den konstanten regulären und den nicht konstanten irregulären Muster(elemente)n; b) nach dem erstmaligen Auftreten der Musterelemente während der Larvalentwicklung - zwischen primären (treten im 1. Larvalstadium auf), subprimären (im 2. Larvalstadium) und sekundären Musterelementen (treten erstmalig in einem späteren Larvalstadium auf); c) nach dem relativen phylogenetischen Alter der Musterelemente - zwischen archaiischen und neuen Musterelementen (z. B. archiprimären, neoprimären, archisubprimären Borsten usw.); d) nach der Größenordnung der Borsten - zwischen (propriorezeptorischen) Mikro- und (taktilen) Makroborsten.
4. In der vorliegenden Arbeit wurden nur die regulären Borstenmuster der Lepidopterenlarven behandelt und zwar nur die Borstenmuster der Kopfkapsel und des Rumpfes (die Sensillen der Kopfanhänge und die Borstenmuster der Thorakalbeine sind nicht berücksichtigt worden). Reguläre Borstenmuster liegen bei allen Larvalstadien der sog. "nackten" Raupen und auch im 1. Larvalstadium der sog. "behaarten" Raupen vor. Diese weisen in späteren Larvalstadien zahlreiche irreguläre Sekundärborsten auf. Im Gegensatz zu den irregulären Borstenmustern sind die regulären Borstenmuster bei den Lepidopterenlarven in den Grundzügen gleichartig, die einzelnen Musterelemente können daher homologisiert und die Differenzen in den Borstenmustern der rezenten Lepidopterenlarven systematisch ausgewertet werden (Chaetotaxie).
5. Das Problem der Homologie und Homonomie der regulären Musterelemente wurde grundsätzlich erörtert. Die Homologisierung der Musterelemente erfolgt primär durch Ermittlung komplexer übereinstimmungen (Grundmethode) , die auch den Hauptkriterien der Homologie nach REMANE zugrunde liegt. Vielfach ist auch eine indirekte Methode anwendbar, die darauf beruht, daß man von Merkmalen, die sich in der lmtersuchten Organismengruppe bei den nach der Grundmethode sicher homologisierten Musterelementen als unveränderlich erweisen, annehmen kann, daß sie auch bei denj enigen Vertretern der Gruppe nicht verändert worden sind, bei denen die Musterelemente nach Vergleichend . morphologische Analyse der regulären Borstenmuster der Grundmethode nicht mehr homologisiert werden können. Solche Merkmale können dann als mehr oder minder spezifische Kennzeichen homologer Musterelemente gelten. Da nach der Grundmethode sicher homologe Musterelemente in der Evolution auch durch "Parallelentwicklung" entstanden sein können, berechtigt diese Homologie nicht in jedem Einzelfall automatisch zum Schluß, daß die betreffenden Musterelemente direkt von einer gemeinsamen Ahnenform übernommen worden sind. Der Nachweis der direkten Herkunft eines Musterelementes von einer gemeinsamen Ahnenform ist in jedem Einzelfall erst durch die Analyse der Verteilung des Musterelementes bei den Vertretern der jeweils betrachteten Gruppe zu erbringen. Es wird daher zwischen einer Homologie im weiteren Sinne (Homologie s. 1. - infolge nicht zufällig übereinstimmender Merkmalskomplexe) und einer Homologie im engeren Sinne (Homologie s. str. - infolge direkter Übernahme der Struktur von einem gemeinsamen Vorfahren) untersehieden. Soweit bei Einzelmerkmalen von Homologie ge· sprochen wird, kann es sieh hierbei nur um die Homologie s. str. handeln (Hilfskriterien der Homologie nach REMANE).
6. Entspreehend der Unterscheidung der Homologie im engeren und weiteren Sinne wurde hier auch zwischen einer Homonomie s. 1. und einer Homonomie s. str. untersehieden. Homonomie s. str. liegt vor, WOlm die betrachteten meristischen Strukturen in der Evolution wirklieh einmal gleich bzw. gleichartig gewesen sind; für die Homonomie s. 1. wird diese Bedingung nicht gestellt, und es ist nur erforderlich, daß nicht zufällige komplexe Übereinstimmungen bei den meristischen Strukturen nachweisbar sind. Es konnte evident gemacht werden, daß die 4 verschiedenen segmentalen Borstenmustertypen (Prothorax, Meso· und Metathorax, Abdominalsegment 1-9, Analsegment) der Lepidopterenlarven nicht homonom s. str. sein können: die Differenzierung der ehemals gleichartigen (im engeren Sinne homonomen) Segmente in die entsprechenden 4 verschiedenen Segmenttypen ist in der Evolution sicher sehr viel früher erfolgt als die Ausbildung des regulären Borstenmusters der Lepidopterenlarven, so daß diese Borstenmuster auf den bereits differenten Segmenten von vornherein unterschiedlich angelegt worden sind. Homonom s. str. sind bis zu einem gewissen Grade nur die Borsten. muster des gleichen Segmenttypus (also des Meso- und Metathorax einerseits und der Abdominalsegmente 1-9 andererseits, wobei hinsichtlich des 9. Abdominalsegmentes Einsehränkungen zu machen sind). Die speziellen Methoden, die Homonomie s. 1. der regulären Musterelemente verschiedenen Segmenttypus festzustellen, wurden eingehend erörtert (S. 228).
7. Die Grundzüge der bisherigen versehiedenen Benennungssysteme der homologen Musterelemente der regulären Borstenmuster der Lepidopterenlarven wurden zusammenfassend dargestellt.
8. Die weitgehende Gleichartigkeit der regulären Borstenmuster nahezu aller Lepidopterenlarven und die bereits hinreichend gut fundierte Einsicht in die phylogenetische Verwandtschaft der älteren Teilgruppen der Lepidoptera (HENNIG 1953) ermöglichte es, die einzelnen evolutiven Abwandlungen im regulären Borstenmuster durch vergleichend-morphologische Untersuchungen zu erfassen und das ancestrale Borstemuust,er der Lepidopterenlarven bis zu einem gewissen Grade zu rekonstruieren. Dazu wurden außer den eigenen Untersuchungsergebnissen an über 100 Arten aus verschiedenen Lepidopterenfamilien alle die zahlreichen (vor allem in der larvalsystematischen) Literatur niedergelegten erreichbaren Daten über die regulären Borstenmuster der Lepidopterenlarven herangezogen.
9. Die hier angewendete Methode der Rekonstruktion ancestraler Strukturausprägungen an rezentem Material wurde eingehend dargestellt. Sie gründet sich auf den Prinzipien der Phylogenetischen Systematik nach HENNIG und beruht auf der Analyse der Ausprägungsformen von Einzelme1"7cmalen, wobei aus der Verteilung der Ausprägungsformen der Einzelmerkmale bei den Vertretern einer Gruppe auf die ursprüngliche (plesiomorphe) Ausprägungsform geschlossen wird, die auch bei der jüngsten gemeinsamen Ahnen/orm der betrachteten Gruppe vorgelegen haben muß. Die Sicherheit der Schlußfolgerung ist dabei abhängig von der Labilität des Einzelmerkmales (bzw. der Struktur), worunter hier die Häufigkeit verstanden wird, mit der die Ausprägungsform des Merkmals in der Evolution der betrachteten Gruppe in irgendeiner Weise abgewandelt worden ist. (Anhaltspunkte über die Labilität eines Merkmals oder einer Struktur sind in etwa durch die Zahl der monophyletischen Teilgruppen gegebenen, in denen mehr als eine Ausprägungsform des Mcrkmals oder der Struktur vorkommen.) Dem gegenüber wird als Flexibilität das Ausmaß der Mannigfaltigkeit in den Abwandlungsformen des Merkmals oder der Struktur in der Evolution einer Gruppe bezeichnet. Für die einzelnen Merkmale lassen sich Flexibilitätsgrenzen finden, die durch die extremsten Ausprägungsformen der Merkmale innerhalb der betrachteten Gruppe gegeben sind. Die Sicherheit der Aussage über die ancestrale Ausprägungsform eines Merkmals ist bei stabilen (d. h. nicht labilen) Merkmalen maximal und nimmt mit zunehmender Labilität des Merkmals ab (also mit der zunehmenden Häufigkeit von Abänderungen des Merkmals in der Evolution der Grnppe). Bei sehr labilen Merkmalen kann nur angegeben werden, innerhalb welcher Flexibilitätsgrenzen das Merkmal bei der Ahnenform ausgebildet gewesen sein muß. Die im einzehlen als plesioI)1orph (ancestral) ermittelten Merkmalsausprägungen ergeben dann insgesamt ein Bild der ancestralen Strukturen. Die Anwendung dieser Methode setzt eine sichere Kenntnis der phylogenetischen Verwandtschaftsbeziehungen der älteren Teilgruppen der betrachteten Gruppe voraus (was bei den Lepidoptera hinreichend gegeben ist); Vergleichend-morphologische Analyse der regulären Borstenmuster andernfalls sind Aussagen über die ancestrale Ausprägungsform nur hinsichtlich der stabilen Merkmale möglich.
10. Das ancestrale reguläre Borstenmuster der Lepidopterenlarven wurde soweit wie möglich rekonstruiert (Abschnitt 0), wobei im einzelnen die jüngsten gemeinsamen Ahnenformen der Glossata, Neolepidoptera, Eulepidoptera und Ditrysia (mit Af I-IV bezeichnet - s. S. 259) behandelt wurden. Da die plesiomorphen Schwestergruppen der Neolepidoptera, Eulepidoptera und Ditrysia, also die Dacnonypha (Eriocraniidae), Aplostomatoptera (Hepialidae) und Incurvariina (Incurvariidae, Adelidae) artenarm, "relictär" sind und offenbar zahlreiche Autapomorphien aufweisen, konnte über die älteren Ahnenformen weniger ausgesagt werden als über die jüngste gemeinsame Ahnenform der sehr artenreichen Ditrysia (Af IV). Das reguläre Borstenmuster der Rumpfsegmente der Af IV ließ sich so gen au rekonstruieren, daß es schematisch gezeichnet werden konnte (Abb. 19). Es ließ sich zeigen, daß die Larven dieser Ahnenformen der Lepidoptera nur das reguläre Borstenmuster besessen haben können, also vom Typus der "nackten" Raupen gewesen sind - Larven vom "behaarten" Raupentypus sind erst sehr viel später als Apomorphien in einzelnen apomorphen Lepidopterengruppen aufgetreten.
11. Im Laufe dieser Untersuchungen zeigte es sich, daß die Psychidae die älteste Teilgruppe der Ditrysia sein müssen. Sie haben nämlich (im larvalen Borstenmuster) symplesiomorphe Merkmalsausprägungen mit den "monotrysischen" Lepidoptera gemeinsam, während alle übrigen hier erfaßten Ditrysia (einschließlich Tineidae) in den gleichen Merkmalen synapomorph sind (S. 261).
12. Die beobachteten evolutiven Abwandlungen im regulären Borstenmuster der Lepidopterenlarven betreffen in der Regel nur einzelne Musterelemente, wobei die Abwandlung eines Musterteiles oder eines Merkmals eines Musterelementes im allgemeinen nicht zwangsläufig zu einer Abwandlung weiterer Musterteile oder weiterer Merkmale des Musterelementes geführt hat (nicht ausgeprägte bzw. geringe Kopplung bei der evolutiven Abänderung von Musterteilen oder der Merkmale eines Musterelementes). Häufige Abänderungen sind: Verlagerung des Ortes einzelner Musterelemente oder Musterelementgruppen, .Änderungen der Borstenform und der relativen Länge einzelner Borsten. Nicht ganz so häufig ist die Reduktion oder das Neuauftreten einzelner Musterelmente (darunter vor allem der sog. "labilen Borsten") . Außerordentlich selten sind .Änderungen des Zeitpunktes, in dem ein Musterelement während der Larvalentwicklung erstmalig auftritt (Subprimärwerden primärer Borsten) und die Umwandlung einer Pore in eine Borste.
13. Das Phänomen der Labilität wurde am Verhalten der sog. "labilen B01'8ten" in der Evolution eingehender untersucht. Die "labilen Borsten" sind archaische Musterelernente, die nur im Auftreten labil sind, während sie in allen anderen Merkmalen weitgehend stabil sind. Ihre Homologie s.1. ist auf Grund der übereinstimmenden Merkmalskomplexe gesichert. Es ließ sich zeigen, daß die labilen Borsten sowohl jeweils unabhängig reduziert als auch unabhängig voneinander aufgetreten sein können (polytope Entstehung der Borsten - "Parallelentwicklungen"), und es konnte auch wahrscheinlich gemacht werden, daß ein Wiederauftreten einmal reduzierter Musterelemente in der Evolution durchaus möglich ist. Weiterhin konnte demonstriert werden, daß im weiteren Sinne homonome Musterelemente auf verschiedenen Segmenten nicht unbedingt gleichzeitig in der Evolution aufgetreten zu sein brauchen (S. 335).
14. Aus den beobachteten Abwandlungsvorgängen und dem erschlossenen Verhalten der labilen Borsten wurde versucht, Anhaltspunkte über die phänogenetisohen Bedingtheiten bei der Bildung des
regulären Borstenmusters zu gewinnen. Es zeigte sich, daß die Ausprägungsform der Merkmale jedes einzelnen Musterelementes für jedes Musterelement durch einen oharakteristischen Komplex von ontogenetischen Entwicklungsfaktoren bedingt sein muß, und es gibt Momente, die dafür sprechen, daß besonders die zur Homologisierung der Musterelemente herangezogenen Merkmale der einzelnen Musterelemente (Art des Musterelementes - Pore oder Borste, Ort, Größe und der Zeitpunkt des erstmaligen Auftretens während der Larvalentwicklung) entwicklungsphysiologisch enger korreliert sind. Der Komplex der Entwicklungsfaktoren jedes einzelnen Musterelementes wurde hier Musterlocus genannt. Ähnlich wie die regulären Musterelemente selber sind auch deren Loci (wenigstens theoretisch) homologisierbar.
15. Das Phänomen der "labilen Borsten" (polytope Entstehung von im weiteren Sinne homologen Borsten, Wiederauftreten eines Musterelementes nach erfolgter Reduktion) kann mit Hilfe des Begriffes der Musterloci so erklärt werden, daß die Loci nicht in jedem Falle morphologisch in Erscheinung treten müssen, sondern auch latent (virtuell bzw. morphogenetisch inaktiv) bleiben können. Durch direkte Übernahme solcher latenter Loci von einer gemeinsamen Ahnenform und durch die voneinander unabhängige Manifestation der Loci wird die polytope Entstehung von im weiteren Sinne homologen Borsten ohne weiteres verständlich - und damit ist auch ein Modell für die kausale Deutung der Pa1'ipotenz im Sinne von HAEoKER gewonnen. Bei der Reduktion (Wegfallen) eines Musterelementes wird offenbar der zugehörige Locus aus dem aktiven in den latenten Zustand versetzt, ohne daß das Gefüge des Locus zerstört oder wesentlich verändert wird, so eine erneute Manifestation des Musterelementes ermöglichend.
16. Das Inaktivwerden (Wegfallen, Reduktion des Musterelementes) bzw. die Aktivierung (Neuauftreten, Realisation oder Manifestation eines Musterelementes) eines Locus kann als Schwelleneffekt gedeutet werden: Vergleichend-morphologische Analyse der regulären Borstenmuster latente Loci sind unterschwellig, morphogenetisch aktive überschwellig. Reduktion und Manifestation können so als entgegengesetzt gerichtete SchweZlenübergänge eines Locus aufgefaßt werden. Die weiteren schwellentheoretischen Folgerungen über die HäufigkeitsverteiJung der labilen Borsten im regulären Borstenmuster der Lepidopterenlarven stimmen mit der beobachteten I-Iäufigkeitsverteilung gut überein.
17. Die ermittelten evolutiven Abänderungen im regulären Borstenmuster lassen sich - soweit sie qualitative oder quantitative Abänderungen der Ausprägungsform der einzelnen Merkmale betreffen - auf Änderungen des Gefüges der einzelnen Musterloci zurückführen, während Reduktion bzw. Neuauftreten als Unter- bzw. überschwelligwerden der Loci gedeutet werden können, wobei das Gefüge der Loci nicht entscheidend geändert wird.
18. Schließlich wurde der Versuch unternommen, an Hand bekannter entwicklungsphysiologischer und genetischer Tatsachen, eine kausale Interpretation der Schwellenübergänge der Loci zu geben. Die Realisation eines latenten Musterlocus ist dabei ein Beispiel für das Manifestwerden
latenter Entwicklungspotenzen überhaupt. Am Beispiel der bereits lange bekannten Ommochrombildung bei Insekten wird auf die Existenz von "unvollständigen morphogenetischen Komplexen" hingewiesen, das sind morphogenetische Reaktionskomplexe, bei denen irgendein Glied einer für das Zustandekommen der Struktur unbedingt notwendigen entwicklungsphysiologischen Reaktionskette ausgefallen ist (etwa durch einen genetischen Block). Die Ausbildung der Struktur wird durch den Ausfall einer derartigen "sine-qua-non" -Bedingung verhindert, wobei jedoch alle übrigen Reaktionsglieder funktionstüchtig bleiben. Die latenten Loci lassen sich als derartige "unvollständige Morphogenesen" auffassen - durch Schließung der Lücke in der "Reaktionskette" wird die Morphogenese vollständig und der latente Locus morphologisch manifest. Umgekehrt bedeutet die Reduktion eines Musterelementes,daß eine sine-qua-non-Bedingtmg für das Musterelement ausgefallen und der Locus des Musterelementes mithin latent geworden ist. Das Verhalten der labilen Borsten in der Evolution der Lepidoptera läßt sich im Sinne der aufgestellten Schwellentheorie durch in der Evolution erfolgte unregelmäßige quantitative Schwankungen eines für das Zustandekommen der Musterelemente unbedingt notwendigen Entwicklungsfaktors (sine-qua-non-Bedingung) wiedergeben. Diese quantitativen Schwankungen des Entwicklungsfaktors sind ihrerseits auf die Veränderungen der Konstitution des Genoms während der Evolution zurückführbar, wobei die Quantität des Entwicklungsfaktors sicher polyfaktoriell bedingt ist. Die hier vorgelegte Konzeption der Realisierung virtueller Entwicklungspotenzen wurde als "Hypothese der unvollständigen morphogenetischen Komplexe" bezeichnet.
Bei meinen Untersuchungen über die Algenflora Lettlands habe ich bisher einigen Gruppen weniger Aufmerksamkeit widmen können; es sind das besonders die farblosen Monaden und die Chrysophyceen. In den letzten Jahren habe ich von Zeit zu Zeit, unter anderen Arbeihm, nach Möglichkeit auch diese zwei Gruppen beachtet. Selbstverständlich setzt das die Untersuchung von lebendem Materiale voraus und womöglich gleich nach dem Einsammeln, da viele in Frage kommende Formen beim längeren Stehen der Proben sehr bald eingehen und verschwinden; an ihrer Stelle treten danach einige verbreitete Saprophyten und andere ubiquitäre Monaden in Vordergrund: Vielfach erwies es sich auch nötig, um die Entwicklungsgeschichte einzelnen Typen einigermassen lernen zu können, mit isolierten Hängetropfkulturen zu arbeiten,was jedoch meist nur dann möglich war, wenn die Monade für die Isolierung in etwas reichlicherer Menge vorlag. Nun konnten die meisten gefundenen Formen der Rhizomastigaceen, Monadaceen und Bodonaceen, sowie die Mehrzahl der untersuchten Eugleninen nicht mit den schon bekannten Arten identifiziert werden. Von den unten berücksichtigten 12 Cyanophyceen, 125 Flagellaten im engeren Sinne, 1 Kalkflagellate, 8 Peridineen und 14 Volvocineen, insgessamt etwa 160 Arten (incl. einiger Varietäten), erwies sich die reichlich grösste Hälfte als neu.
Aus Bequemlichkeitsgründen habe ich auch in diesem Teil meiner Beiträge vorläufig noch die frühere Gruppeneinteilung beibehalten, obwohl diese unseren gegenwärtigen Kenntnissen über die verwandschaftlichen Beziehungen innerhalb der Protisten nicht völlig entsprechen.
Es werden auch 8 neue Gattungen beschrieben. Davon gehört Parabodo zu den Bodonaceen, Kathablepharis und Spiromonas zu den Cryptomonadalen, Gyropaigne und Protaspis zu den Eugleninen, endlich Aulacomonas, Gyromitus lmd Hemitoma zu den Volvocineen. Drei von diesen repräsentieren
meines Erachtens zwei besondere Familien - die der Kathablepharitdaceen und Protaspidaceen.
Die Hitzestresstranskriptionsfaktoren HsfA1 und HsfA2 repräsentieren wichtige transkriptionelle Regulatoren in der Regulation der Hitzestressantwort von Lycopersicon esculentum (Tomate). Unter Stressbedingungen induziert HsfA1 die Expression von HsfA2 und bildet heterooligomere HsfA1/HsfA2 Komplexe, die im Zusammenhang mit der erhöhten Expression von Hitzestressgenen stehen (Scharf et al., 1998b, Mishra et al., 2002, Port et al., 2004). Durch funktionelle Charakterisierungen der Wechselwirkung zwischen HsfA1 und HsfA2 werden neue Aspekte der spezifischen und synergistischen Aktivierung durch HsfA1 und HsfA2 erläutert. - Die Spezifität der funktionellen Interaktion zwischen HsfA1 und HsfA2 wird in Vergleich mit weiteren Klasse A Hsfs, HsfA3, HsfA4b und HsfA5 anhand von GUS Reporter Assays, Coimmunpräzipitationsanalysen und der interaktionsvermittelten Kernretention von GFP-HsfA2 verdeutlicht. Trotz des Potenzials von HsfA2, multiple Wechselwirkungen einzugehen, ist die Spezifität zwischen HsfA1 und HsfA2 am höchsten. Für die Analyse der synergistische Aktivierung durch HsfA1 und HsfA2 werden 3HA-HsfA1 und 3HA-HsfA2 in unterschiedlichen Mengenverhältnissen coexprimiert. Sowohl am Hsp17.3B-CI::GUS Reporter als auch an der induzierte, endogene Tabak Hsp17-CI Expression kann der spezifische Effekt der synergistischen Aktivierung durch HsfA1 und HsfA2 demonstriert werden. - Um die strukturellen Voraussetzungen der synergistischen Aktvierung zu definieren, werden Mutanten mit Defekten in der DNA Bindung, Oligomerisierung und Aktivierung in funktionellen Analysen der transkriptionellen Aktivität (GUS Reporter Assays, Induktion endogener Hsp17-CI Expression), Komplexbildung (Co-Immunpräzipitation) und der HsfA1 vermittelte Kernretention von HsfA2 (Immunfluoreszenz) untersucht. Die synergistische Aktivierung erfordert die Bildung heterooligomerer HsfA1/HsfA2 Komplexe, die über eine Kombination ihrer C-terminalen Aktivierungsdomänen kooperativ aktivieren. Dagegen hat die DNA Bindung durch die DBDs beider Hsfs einen geringen Anteil an der synergistischen Aktivierung. Zur Verifizierung der funktionellen Unterschiede zwischen HsfA1 und HsfA2 werden HsfA1-HsfA2 Hybride durch Coexpression mit HsfA1 und HsfA2 Wildtypformen analysiert. Heterooligomere Komplexe aus Wildtyp und Hybrid-Hsfs zeigen ausschließlich eine synergistische Aktivierung, wenn die C-terminalen Aktivierungsdomänen von beiden Hsf Typen stammen, während heterooligomere HsfA1/HsfA2 Komplexe mit typgleichen C-Termini nicht synergistisch aktivieren. Weiterhin wird gezeigt, dass Wildtyp- Hybridkomplexe mit identischen HR-A/B Regionen in der synergistischen Aktivierung abgeschwächt sind. - Die Bildungseigenschaften der DNA-Hsf Komplexe (DNP) von HsfA1 und HsfA2 werden in Hinblick auf qualitative Veränderungen unter Coexpressionsbedingungen betrachtet. Interessanterweise konnte die Bildung intermediärer DNPs sowie von Hsf-Komplexen mit intermediärer Größe in Gelfiltrationsanalysen als Indizien für qualitativ veränderte HsfA1/HsfA2 Komplexen nachgewiesen werden. Die funktionelle Analyse von HsfA1 C-terminalen Deletionsmutanten führt zur Identifizierung einer de-regulierten HsfA1 Mutante, die trotz de-regulierter Aktivität mit HsfA2 zur synergistische Aktivierung fähig ist. - Zur Verifizierung der interaktionsvermittelten synergistischen Aktivierung wird die Oligomerisierung partiell deletierter HsfA2 HR-A/B Mutanten ermittelt. Da diese Mutanten intermediäre Oligomerisierungszustände zeigen, werden durch die systematische Deletionsmutation der HR-A/B Region von HsfA2 strukturellen Voraussetzungen für die synergistische Aktivierung durch HsfA1 und HsfA2 charakterisiert. Co-Immunpräzipitationsversuche belegen, dass die Integrität der HR-A/B Region für die Bildung stabiler HsfA1/HsfA2 Komplexe benötigt wird, jedoch eine transiente und spezifische Interaktion über die C-terminalen L2 und HR-B Regionen für die synergistische Aktivierung ausreicht. - In der Charakterisierung der kooperativen, synergistischen Aktivierung durch beide CTADs werden Mutanten der vier vorhandenen AHA Motive von HsfA1 und HsfA2 durch Coexpression mit dem Wildtyp Hsf Partner getestet. Die Ergebnisse verdeutlichen, dass jedes der AHA Motive unterschiedlich zur synergistischen Aktivierung beitragen.
Aus dem Dogger Norddeutschlands und des nordwestlichen Polens sowie aus Dogger-Geschieben werden 1 Art der Neritimorpha und 30 Arten der Caenogastropoda beschrieben. Neu sind 7 Arten. 14 Arten werden bereits beschriebenen Arten zugeordnet und 10 unter offener Nomenklatur beschrieben. Neu sind die Gattung Bicorempterus (Aporrhaidae) und die Familien Naricopsinidae, Tripartellidae und Maturifusidae. Die beschriebenen Caenogastropoden zeigen mehr Gemeinsamkeiten zu bisher aus dem Dogger Mittel- und Westeuropas bekannt gemachten Faunen als es bei den Archaeogastropoda und den Heterostropha der Fall war. Die Gleichsetzung der hier vorgestellten Arten mit aus der Literatur bekannten ist oftmals problematisch. Taxonomisch relevante Details besonders der Frühontogenese wurden bisher kaum beschrieben. Auch Fragen der innerartlichen Variation wurden nur gelegentlich angesprochen. Vatopsis antiquus n. sp. ist der älteste genauer bekannte Vertreter der Cerithiopsoidea. Pictavia und Oonia konnten als Vertreter der Ampullospiridae erkannt werden (Ausbildung des Protoconchs). Naricopsina repräsentiert eine Gruppe, die möglicherweise zu den echten Naticidae führte. Einige Gattungen der Aporrhaidae können genauer gefaßt werden. Maturifusus ist der älteste sichere Vertreter der höheren Caenogastropoda (Neomesogastropoda).