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Gehirne von an Scrapie erkrankten Tieren sind histopathologisch durch Vakuolisierung, Astrogliose, Neurodegeneration und charakteristische PrPSc-Ablagerungen gekennzeichnet. Die pathologischen Mechanismen, die zu diesen Veränderungen führen, sind noch weitgehend unverstanden. Die Untersuchung der differentiellen Genexpression in Scrapie-infizierten Mausgeweben kann zu einem besseren Verständnis der pathogenen Mechanismen dieser Erkrankung auf molekularer Ebene beitragen. Auch könnten einige der differentiell exprimierten Gene zur Entwicklung eines auf Surrogatmarkern basierenden Testsystems beitragen oder für die Entwicklung von Strategien zur therapeutischen Intervention nützlich sein. Um im Verlauf der Scrapieerkrankung in Mäusen hoch- oder herunterregulierte Gene zu identifizieren, wurden RNA arbitrarily primed PCR (RAP-PCR) und suppression subtractive hybridisation (SSH) an Hirn- und Milzproben Scrapie-infizierter Mäuse und gesunder Kontrolltiere durchgeführt. Die Ergebnisse wurden anhand eines differentiellen Screening-Schrittes, Sequenzanalysen und Northernblots bestätigt. Durch einen Datenbankabgleich der erhaltenen Sequenzen wurden mehrere Kandidaten identifiziert. Einige davon, wie GFAP, Apolipoprotein D, Vimentin, Mx-Protein, MHC I und II wurden bereits als in Scrapie-infizierten Gehirnen hochreguliert von anderen Arbeitsgruppen publiziert. Eine differentielle Regulation weniger weiterer Kandidaten, wie Cytochromoxidase, Ubiqitinierungsfaktor E4a und das herunterregulierte Stathmin wurden bisher noch nicht beschrieben. Auch eine bisher unbekannte differentiell exprimierte Sequenz wurde gefunden. Ergänzend zu den Untersuchungen auf Nukleinsäureebene wurde die 2DElektrophorese für Gehirngewebe zur Untersuchung der differentiellen Expresssion auf Proteinebene unter Berücksichtigung posttranslationaler Modifikationen etabliert. Protokolle für die Vorbereitung von Mäusegehirnproben, die Durchführung der isoelektrischen Fokussierung und der 2. Dimension, sowie Färbeprotokolle für qualitative und quantitative Analysen der Gele unter Berücksichtigung der Erfordernisse nachfolgender MALDI-Analysen wurden erarbeitet.
Der Einfluss von Stress auf einen Organismus führt zur Expression molekularer Chaperone unterschiedlichster Hitzestressprotein-(Hsp)-Familien, die die Zellen vor stressbedingten Schäden schützen. Mitglieder der Hsp2O-Familie (kurz small Hsps, sHsps) besitzen ein Molekulargewicht von 12-43 kDa und sind durch einen zentralen, evolutiv konservierten Bereich, der als alpha-Crystallin-Domäne (ACD) bezeichnet wird, gekennzeichnet. Diese besteht größtenteils aus beta-Strängen, während die flankierenden Bereiche hingegen variabel in Länge, Sequenz sowie Sekundärstrukturen sind. sHsps bilden mit Hilfe der Sekundärstrukturen oligomere Komplexe aus. Darüber hinaus besitzen sie eine ATP-unabhängige Chaperonaktivität und spielen beim Schutz thermosensitiver Proteine eine wichtige Rolle. In Pflanzenzellen führt ein anhaltender Hitzestress zur Ansammlung von sHsps zu so genannten Hitzestressgranula (HSGs), die sich wiederum zu größeren HSG-Komplexen (HSCs) organisieren. Eine mögliche Funktion von HSCs ist der Schutz zellulärer denaturierter Proteine vor einer irreversiblen Aggregation. Durch deren Bindung mittels sHsps und Eingliederung in den HSC-Verband werden die denaturierten Proteine in einem faltungskompetenten Zustand gehalten. Schließlich können die mit den HSCs assoziierten ATP-abhängigen Hsp-Maschinen (z.B. Hsp70/40, Hsp100) die sHsp-gebundenen Substrate renaturieren. Wie in der vorliegenden Arbeit dargestellt, weisen Pflanzen die höchste soweit bekannte Anzahl von sHsp-Genen auf. Die korrespondierenden Proteine werden anhand ihrer Primärsequenz und subzellulären Lokalisation in verschiedene Klassen eingeteilt: sHsps der Klassen CI und CI1 befinden sich im nucleo-cytoplasmatische Raum, sHsps der Klasse M in Mitochondrien, der Klasse P in den Plastiden und der Klasse ER im endoplasmatischen Reticulum sowie im Golgi-Apparat. Da das Genom von Arabidopsis thaliana das erste komplett sequenzierte pflanzliche Genom ist, eignete sich dieser Modelorganismus zur Identifikation aller sHsp kodierenden Gene. Der Einsatz von Protein- und Nukleotidsequenzen bereits bekannter pflanzlicher sHsps als Suchkriterium in der NCBI-Datenbank (BLASTP und BLASTN), ergab die ldentifikation 19 putativer sHsp kodierender Gene, von denen erstaunlicheweise 13 bislang noch nicht bekannt waren. Proteinsequenzvergleiche ergaben, dass 7 der neu entdeckten sHsps nicht den typischen Klassen zugehörig sind. Dies bildete den Ausgangspunkt für deren nähere Analyse und Charakterisierung im Rahmen des ,,Functional Genomics": (1) Lokalisationsstudien I: Myc-Epitop markierte sHsp-Konstrukte wurden transient in Tabak-Mesophyllprotoplasten transformiert. Über Lokalisationsstudien per lmmunfluoreszenz konnten diese Proteine in tatsächlich 7 neu definierte sHsp Klassen eingeteilt werden. Interessanteweise werden die Vertreter dieser neuen Klassen von jeweils nur einem Gen kodiert. Die Vertreter der Klassen CI11 bis CVII lokalisieren im nucleo-cytoplasmatischen Kompartiment. Ferner bewiesen die Kodetektionen von organellären Markerproteinen, dass Klasse MII sHsps in die Mitochondrien und Mitglieder der Klasse Po in die Peroxisomen transportiert werden. Dies stimmte überein mit der Vorhersage von organellären Signalsequenzen. (2) Lokalisationsstudien II: Frühere Studien zeigten, dass sHsps der Klassen CI und CII unter Hitzestressbedingungen HSCs ausbilden. Wahrscheinlich fungieren Klasse CII sHsps als Grundgerüst für die HSC-Bildung und rekrutieren sHsps der Klasse CI in diese Multichaperonkomplexe. Die Proteine (Myc-markiert) Hsp17.4-CIII, Hsp15.4-CIV, Hsp18.5-CVI und Hsp14.7-CVII wurden unter Hitzestressbedingungen in endogene HSCs von Tabak-Mesophyllprotoplasten eingegliedert. Dieses Phänomen bleibt auf die genannten sHsp Klassen beschränkt, da weder Hsp21.7-CV, noch die organellären Proteine Hsp26.5-MI1 sowie Hsp15.7-Po in HSCs detektiert wurden. (3) Das sHsp-lnteraktom: Im Gegensatz zu früheren Studien, konnte in der vorliegenden Arbeit eine lnteraktion zwischen sHsps verschiedener Klassen zum ersten Mal im Hefe-Zwei-Hybrid-System sowie über Pull-down und nativer SDS-Gelelektrophorese detektiert werden. Am Beispiel eines Klasse CIII sHsps wurde gezeigt, dass die lnteraktion mit sHsps anderer Klassen zu einer Heterooligomerisierung führt. Dies wiederum hat eine nachhaltige Beeinflussung der intrazellulären Lokalisation der sHsps zur Folge. (4) Darüber hinaus ist für sHsps der Klasse CIII typisch, dass sie aufgrund einer Kernlokalisationssequenz innerhalb der ACD in den Nukleus transportiert werden. Im Vergleich zu sHsps der Klassen CI und CII, die Oligomere Strukturen von 220-230 kDa ausbilden, assemblieren sHsp-Monomere der Klasse CIII zu hochmolekularen Komplexen im Bereich von 1 MDa. (5) Das sHsp-Transkriptom: Durch RT-PCR-Analysen und Auswertung der öffentlich zugänglichen Microarray-Daten des AtGenExpress Konsortiums, konnte die Expression aller sHsps kodierenden Gene im Arabidopsis Genom auf transkriptioneller Ebene analysiert werden. Es zeigte sich, dass neben Hitzestress auch der Einfluss anderer abiotischer Stressoren, wie U. a. oxidativer stress und UV-B Bestrahlung, zu einer Akkumulation von sHsp-Transkripten führt. Ferner werden einige sHsps in bestimmten Entwicklungsstufen bzw. Organen, wie z.B. Blüten, Blättern und Samen, unabhängig von Stresseinflüssen exprimiert. (6) Funktionelle Analysen: Ein seminatives in vitro Chaperontestsystem, in dem Luciferase als thermosensitives Modelsubstrat eingesetzt wird, wurde herangezogen, um ausgesuchte sHsps bezüglich ihrer möglichen Chaperonfunktion zu testen. In Abhängigkeit der rekombinant hergestellten Proteine Hsp18.5-CVI, Hsp26.5-MII und Hsp15.7-Po konnte eine verminderte Aggregation der Luciferase unter Hitzestresseinwirkung und eine darauf folgende erhöhte Renaturierung durch ATP-abhängige Chaperonmaschinen während einer Erholungsphase beobachtet werden. (7) Peroxisomale sHsps: Da nie zuvor über peroxisomale sHsps berichtet wurde, nahm Hsp15.7-Po eine besondere Rolle bei den Untersuchungen ein. Dieses Protein besitzt eine putative peroxisomale Lokalisationssequenz (PTS) am C-Terminus, bestehend aus der Abfolge der Aminosäurereste SKL (PTS1). Durch Hefe-Zwei-Hybrid-Studien und lmmunfluoreszenzanalysen (in Tabak-Mesophyllprotoplasten und Säugerzellen) sowie den Einsatz von Mutanten wurde demonstriert, dass die PTS1 tatsächlich für die lnteraktion von Hsp15.7-Po mit den TPR-Domänen des peroxisomalen Importrezeptors Pex5 und für die peroxisomale Lokalisation des sHsps verantwortlich ist. Ein Hefe-Zwei-Hybrid-Screening nach möglichen lnteraktionspartnern von Hsp15.7-Po lieferte den ersten Anhaltspunkt für die lnteraktion mit cytoplasmatischen sHsps (Hspl7.7-CII). Dies ließ sich durch Pull-down-Analysen bestätigten und auf Hsp17.6-CII erweitern. Diese Interaktionen beeinflussten jedoch nicht die subzelluläre Lokalisation der jeweiligen Proteine bei Koexpression in Tabak-Mesophyllprotoplasten. All die hier dargestellten Ergebnisse weisen auf diverse Funktionen der einzelnen neu identifizierten sHsps der unterschiedlichen Klassen hin und bilden die Grundlage für zukünftige, detaillierte in planta Untersuchungen, die hierdurch erleichtert werden können.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene proteomanalytische Methoden untersucht und evaluiert, die, basierend auf der Verwendung 2D-gelelektrophoretischer, 2D-chromatographischer und massenspektrometrischer Techniken, die differentielle, quantitative Proteinanalyse zweier unterschiedlicher muriner Fibroblasten-Zelllinien ermöglichen. Hierfür wurden zunächst unterschiedliche Methoden für die 2D-elektrophoretische Proteinauftrennung analysiert. Im Hinblick auf eine größtmögliche Auflösung und Gel-zu- Gel-Reproduzierbarkeit wurden innerhalb der ersten Dimension (IEF) die Lademethode, die Fokussierungszeiten und der Reduktionsschritt (DTT oder HED) optimiert. Desweiteren wurde eine auf isoelektrischer Fokussierung basierende Vorfraktionierungsmethode auf ihre Anwendbarkeit bei einer quantitativen Proteomanalyse getestet. Für die Proteingelfärbung wurde unter anderem ein selbst synthetisierter Fluoreszenzfarbstoff eingesetzt, der hinsichtlich Färbesensitivität und MS-Kompatibilität mit etablierten Protokollen verglichen wurde. Eine Doppelfärbungs-Methode von Proteingelen (Silberfärbung nach Fluoreszenzfärbung) wurde auf ihre MS-Kompatibilität nach tryptischen Verdau untersucht. Desweiteren wurden manuelle und automatisierte Verdauprotokolle für eine möglichst hohe Peptide Recovery optimiert. Die zunächst durch die Anwendung von klassischen Färbe- und Quantifizierungsmethoden nach 2DE gewonnenen Ergebnisse wurden mit neueren Labelling-Methoden zur relativen Proteinquantifizierung verglichen. Dabei kamen zwei unterschiedliche Multiplexing-Verfahren zum Einsatz, die sich in der Proteinquantifizierung grundlegend unterscheiden (DIGE: gelbasierte Proteinquantifizierung; iTRAQ: LC-MS/MS basierte Peptidquantifizierung). Die für diese beiden Methoden bestehenden Protokolle wurden für die Anwendbarkeit auf die Fibroblasten-Proteinextrakte angepasst. Es konnte gezeigt werden, daß diese beiden Labelling-Methoden in Bezug auf Reproduzierbarkeit und quantitativer Aussagekraft dem klassischen 2DE-Experiment (Proteinfärbung nach der Auftrennung auf einzelnen Gelen) überlegen sind. Die statistische Absicherung der analysierten relativen Quantitätsunterschiede verbesserte sich durch die zusätzliche Anwendung der beiden neuen Labelling-Methoden erheblich. Dabei stützt sich die Signifikanz der quantitativen Bestimmung sowohl auf die große statistische Sicherheit, die innerhalb dieser beiden Multiplexing-Methoden erreicht wird, als auch auf die Wiederholbarkeit in unterschiedlichen Experimenten (21 Proteine wurden in unterschiedlichen Ansätzen bestätigt). Die beiden Labelling-Methoden DIGE und iTRAQ unterscheiden sich außer in der Quantifizierungsstrategie auch grundsätzlich in dem Ansatz der Auftrennung (DIGE: Proteine, 2DElektrophorese; iTRAQ: Peptide, 2D-Flüssigchromatographie). Damit besitzen sie unterschiedliche Limitierungen in Bezug auf die physiko-chemischen Eigenschaften der Peptide/Proteine, die mit der jeweiligen Methode aufgetrennt werden können. Der daraus resultierende komplementäre Charakter beider Methoden konnte anhand mehrerer Proteine verdeutlicht werden. Durch die relative Quantifizierung konnten insgesamt 30 Proteine identifiziert werden, die aufgrund der An- oder Abwesenheit des MLL-Proteins in den beiden murinen Zelllinien differentiell reguliert sind. Die alleine schon durch die unterschiedliche Morphologie der untersuchten murinen Fibroblasten vermutete Deregulation von Struktur- und Stressproteinen (Actin, HSP27, HSP70) konnte bestätigt werden. Weitere Expressionsunterschiede zwischen Mll-/-- und Mll+/+-Fibroblasten zeigten sich vor allem bei Proteinen, die funktionell der Gruppe RNA-prozessierender Proteine (Polyadenylate Binding Protein, PTB-associated Splicing Factor, hnRNPs) zugeordnet werden können. Ein Vergleich der quantitativen Proteomdaten dieser Arbeit mit den mRNA-Expressionsprofilen der gleichen Zellen zeigt nur eine sehr geringe Korrelation bezüglich der Regulationen einzelner Gene/Proteine. Die meisten der bisherigen Studien, die eine Untersuchung des mRNA/Protein-Verhältnisses zum Gegenstand haben, bestätigen das Fehlen einer Korrelation. Diese Tatsache unterstreicht die Wichtigkeit der Kombination genomischer und proteinanalytischer Daten zur Aufklärung zellulärer molekularer Prozesse.
Hitze-Stress-Transkriptionsfaktoren (Hsfs) stellen die zentralen regulatorischen Komponenten einer Signal-Transduktionskette dar, welche die Aktivierung von Hitze-Stress-induzierbaren Genen bewirken. Die Sequenzierung des Genoms von Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) führte zu der Entdeckung von 21 Genen, die für putative Hsfs codieren. Aufgrund struktureller Charakteristika und phylogenetischer Analysen wurden die 21 Hsfs in die Klassen A, B und C aufgeteilt. Der Hauptteil der vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit der funktionellen Charakterisierung der Hsf Familie aus Arabidopsis. Um generelle Konzepte zur Funktion von pflanzlichen Hsfs als Aktivatoren zu unterstützen, wurden als Ausgangspunkt ausgewählte Hsfs aus Lycopersicon peruvianum (Tomate) zu detaillierten Analysen herangezogen. Hsfs besitzen, ähnlich anderen Transkriptions -aktivierenden Proteinen, eine modulare Struktur. In der vorliegenden Arbeit wurden funktionelle Module der 21 Arabidopsis Hsfs untersucht, die für den Oligomerisierungs-Zustand, die intrazelluläre Lokalisation sowie das Transkriptions-aktivierende Potential von Bedeutung sind. Essentiell für die Funktion von Klasse A Hsfs als Transkriptions-Aktivatoren sind kurze Peptidmotive, die durch aromatische und große hydrophobe Aminosäure-Seitenketten geprägt sind, die in einer sauren Umgebung eingebettet sind (AHA Motive: aromatic, large hydrophobic and acid amino acid residues). Es wurde mit GST pull-down Assays gezeigt, dass AHA Motive mit ausgewählten Transkriptions-Komplexen interagieren. Das generelle Konzept für AHA Motive als kohäsive Elemente zur Interaktion mit der Transkriptions- Maschinerie wurde durch Mutationsanalysen verifiziert, besonders detailliert am Beispiel von LpHsfA2 und LpHsfA1 aus Tomate in Reporter-Assays in Tabak-Protoplasten und Hefe als auch GST pull-down Experimenten gezeigt. Im Kontrast zu den Klasse A Hsfs besitzen Klasse B und C Hsfs keine AHA Motive. Diese zeigten auch keine eigene Aktivator-Funktion aber Experimente deuten darauf hin, daß sie Coregulatoren für Klasse A Hsfs darstellen. Es wurde gezeigt, dass diese pflanzliche Besonderheit bei Tomate als auch Arabidopsis existiert. Alle 21 Arabidopsis Hsfs wurden als Transkripte nachgewiesen, ihre Expression verhält sich sehr dynamisch in bezug auf Hitze-Stress als auch Entwicklungssignale. Die präsentierte funktionelle Charakterisierung der Hsf Familie von Arabidopsis gibt erste Einsichten in das komplexe Netzwerk der Hsfs und demonstriert bereits, dass im Vergleich zu anderen Organismen, wie z.B. Drosophila und Hefe mit einem Hsf und Säugern mit drei Hsfs, das komplexe pflanzliche Hsf System eine fein regulierte und effiziente Voraussetzung für Pflanzen darstellt, um schnell und vor allem erfolgreich auf Umwelteinflüsse zu reagieren, denen sie nicht entfliehen können.
Retrovirale Gen-Therapie-Vektoren haben die ethisch problematische Eigenschaft, ungerichtet in das Genom der therapierten Zellen zu integrieren und somit die Zelle gegebenenfalls durch Insertions-Mutagenese zu schädigen. Diese Problematik könnte gelöst werden, indem das zugrunde liegende Prinzip spezifisch integrierender, mobiler genetischer Elemente (Transposons) aufgeklärt und in die Retrovirus-basierten Gen-Therapie-Vektoren mit einbezogen werden könnte. Das Genom des zellulären Schleimpilzes Dictyostelium discoideum enthält eine Reihe von Non-LTR-Retrotransposons, die ausnahmslos Positions- und Orientierungs-spezifisch in die genetisch unproblematischen Regionen vor oder hinter tRNAGene integrieren (tRNA-Gen-assoziierte Retroelemente oder kurz TRE). Zur Untersuchung des Mechanismusses der Positions- und Orientierungs-spezifischen Integration von TRE-Retrotransposons wurde in D. discoideum ein in vivo Retrotranspositions-Testsystem etabliert, mit welchem de novo auftretende Retrotranspositions-Ereignisse endogener TRE-Retrotransposons auf methodisch einfache Weise festgestellt und analysiert werden konnten. Das in vivo Testsystem beruht auf der positiven Selektion derjenigen Zellen eines D. discoideum-Reporterstammes, in denen eines der selten auftretenden Retrotranspositions-Ereignisse stattgefunden hat. Die Herstellung des D. discoideum- Reporterstammes erfolgte durch die Veränderung des UMP-Synthase-Gens (pyr5-6), in welches artifiziell ein Intron (cbfAint) inklusive eines „Köder“-tRNA-Gens (valUAC) integriert wurde. Aufgrund der Integration eines TRE-Retrotransposons in die Nähe des „Köder“-tRNA-Gens kann das Intron nicht mehr korrekt aus der UMP-Synthase-Vorläufer-mRNA gespleißt werden, die Zellen konvertieren dadurch bedingt vom ura+- zum ura--Phänotyp und können deshalb mit dem für ura+-Zellen toxischen Zytostatikum 5-Fluoro-orotat (5-FO) positiv selektiert werden. Durch die detaillierte Analyse zahlreicher 5-FO-resistenter Klone konnte gezeigt werden, daß in modernen D. discoideum-Stämmen ausschließlich die oberhalb von tRNA-Genen integrierenden TRE5-Retrotransposons vom Subtyp A.1 und A.2 gleichermaßen aktiv sind und daß ein beliebiges „Köder“-tRNA-Gen in einer artifiziellen genomischen Umgebung als Integrations-Ziel für TRE5-A-Retrotransposons dienen kann. Die TRE5-A-Retrotransposons zeigten entsprechend den genomischen Kopien eine Positions-Spezifität von ca. 48 (±3) bp oberhalb des tRNA-Gens und Ziel-Sequenz-Verdopplungen von 12 – 15 bp. Alle de novo integrierten TRE5- A.1-Retrotransposons waren 5’-verkürzt, während 64% der TRE5-A.2-Retrotransposons ein intaktes 5’-Ende aufwiesen. Das nukleäre D. discoideum-Protein CMBF (C-Modul-bindender Faktor) bindet Sequenzspezifisch an das C-Modul von TRE5-A-Retrotransposons und könnte deshalb an der Regulation der Transkription und/oder Mobilisierung der TRE5-A-Retrotransposons beteiligt sein. Zur Untersuchung des Einflusses von CMBF auf die TRE5-A-Retrotranspositions-Frequenz wurde das in vivo Retrotranspositions-Testsystem im D. discoideum-Stamm JH.D2 etabliert, welcher mit ca. 5% des Wildtyp-Niveaus CMBF stark unterexprimiert. Die Herstellung von JH.D2 erfolgte durch Einführung eines amber-Translationsstop-Codons in das cbfA-Gen des Wildtyp-Stamms AX2 sowie Expression einer amber-Suppressor-tRNA. Durch die Herstellung eines murinen monoklonalen Anti-CMBF-Antikörpers konnte bewiesen werden, daß die CMBF-Unterexpression auf eine partielle Suppression des cbfA(amber)-Stop-Codons zurückzuführen ist. Die Unterexpression von CMBF führte zu einer Erniedrigung der zellulären Menge an Sense- und Antisense-Transkripten der TRE5-A-Retrotransposons und im in vivo Testsystem zu einer maßgeblichen Reduktion der Retrotranspositions-Frequenz. Das Protein CMBF zeigt in der JumonjiC-Domäne (JmjC) Homologie zu einer Vielzahl von Proteinen prokaryontischer und eukaryontischer Organismen und könnte daher neben der Regulation der TRE5-A-Retrotransposition noch weitere biologische Funktionen in D. discoideum erfüllen. Die eingehende Untersuchung des Phänotyps der CMBFunterexprimierenden Mutante JH.D2 zeigte ein verlangsamtes Wachstum sowie einen um ca. 24 Stunden verzögerter Beginn der Entwicklung aufgrund der Inhibition des cAMP-Signalsystems. Durch die homologe Expression von CMBF und N-terminal verkürzter CMBF-Derivate konnte der Entwicklungs-Phänotyp von JH.D2 revertiert und somit der zelluläre CMBF-Mangel als alleinige Ursache für die phänotypische Veränderung von JH.D2 verantwortlich gemacht werden. Aufgrund von Zweifeln an der Richtigkeit des bislang angenommenen CMBF-kodierenden Gens (cbfA-Gen) wurde der Transkriptionsstart des cbfA-Locus mittels der 5’-RACE-Methode bestimmt und somit der Beginn des cbfA-Gens korrekt definiert. Das cbfA-Gen umfaßt demnach 3412 bp inklusive eines Introns von 409 bp und kodiert somit für ein 1000 Aminosäuren langes Protein mit einem rechnerischen Molekulargewicht von 114 198 kDa. Durch die Etablierung des in vivo Retrotranspositions-Testsystems in Dictyostelium discoideum sind die Voraussetzung für eine detaillierte Untersuchung der spezifischen Retrotransposition der TRE5-Retrotransposons gegeben. Die Herstellung der CMBF-unterexprimierenden D. discoideum-Mutante JH.D2 bietet die Möglichkeit einer eingehenden Funktions-Analyse der charakteristischen Domänen von CMBF.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Vegetation der Savannenlandschaften der Sahelzone von Burkina Faso analysiert. Diese semiaride bis aride Region, die seit einigen Jahrzehnten von Landdegradation betroffen ist, ist als Untersuchungsgebiet u.a. deshalb besonders interessant, weil sie an einem Nutzungsübergang zwischen sesshafter Landwirtschaft und traditionell nomadischer Viehwirtschaft liegt. Im Vordergrund stand bei der Vegetationsanalyse ihre Klassifikation, die Frage nach der floristischen Struktur sowie dem aktuellen Zustand der Vegetation. Zu Beginn der Feldarbeiten wurde das Untersuchungsgebiet, das einen Niederschlagsgradienten von rund 200 mm umfasst, in geomorphologische Landschaftseinheiten (Inselberge, glacis, Niederungen, mares, Dünenzüge) stratifiziert. Innerhalb dieser Einheiten erfolgte die Vegetationsaufnahme mit Hilfe pflanzensoziologischer Aufnahmen. Die Arten der Gehölz- und Krautschicht wurden getrennt behandelt. Die Vegetationsaufnahmen wurden durch Strukturprofiltransekte in der brousse tigrée und Bodenuntersuchungen ergänzt. Auf verschiedenen Skalenebenen wurden die verschiedenen Vegetationsgesellschaften detailliert beschrieben und zu Standortfaktoren in Beziehung gesetzt. Außerdem wurden Vegetationsprofile zur Veranschaulichung der räumlichen Struktur der Vegetation abgeleitet. Bei der Analyse kamen auch computergestützte Methoden und statistische Verfahren (Tests der absichernden Statistik, Berechnung verschiedener Diversitätsindices, Ordinationsverfahren, numerische Klassifikation) zum Einsatz, um die Interpretation der Vegetationsstruktur zu unterstützen. Rund 320 Gefäßpflanzensippen aus 65 Familien konnten sicher bestimmt werden. Die artenreichste Familie sind die Poaceen. Insgesamt können 20 Gesellschaften der Gehölzschicht sowie 22 Gesellschaften der Krautschicht klassifiziert werden, die zur Mehrzahl weiter in Untereinheiten gegliedert sind. Innerhalb jeder Landschaftseinheit werden die Gesellschaften der Gehölzschicht, anschließend diejenigen der Krautschicht, vorgestellt. In der Regel sind sie in ihrer Verbreitung auf jeweils eine Landschaftseinheit beschränkt. Vor allem die Gesellschaften des glacis und der Niederungen besiedeln auch Habitate in Landschaftseinheiten außerhalb ihres Schwerpunktes. Daraus werden Schlüsse zum Ausbreitungsverhalten gezogen. In keinem Fall sind Einheiten der Krautschicht und der Gehölzschicht ausschließlich miteinander kombiniert; vielmehr sind Einheiten der Krautschicht jeweils mit mehreren Einheiten der Gehölzschicht kombiniert, was ihren selbständigen Charakter betont. Zehn Einheiten der Krautschicht sind überwiegend oder völlig gehölzfrei. Eine floristische Verwandtschaft besteht vor allem zwischen den Landschaftseinheiten glacis und Dünenzügen sowie zwischen mares, Niederungen und Dünenzügen; die Inselberge unterscheiden sich deutlich. Die Gehölzvegetation der Inselberge ist in Abhängigkeit von der menschlichen Nutzung in fünf Gesellschaften gegliedert. Während die Commiphora africana-Gesellschaft für wenig beeinflusste Bereiche typisch ist, hat die Combretum micranthum-Fragmentgesellschaft ihren Verbreitungsschwerpunkt in den intensiv genutzten Bereichen. Die Acacia raddiana-Zentralgesellschaft ist an den Unterhängen vertreten. Die Krautschicht der Inselberge gliedert sich in sechs, relativ artenreiche Gesellschaften mit Untereinheiten. Sie stellen zum Teil lokale Besonderheiten dar. Das räumliche Muster der Einheiten der Brachiaria lata-Gesellschaft lässt eine Abhängigkeit von der Art der Beweidung erkennen. Die Vegetation der Sandrampen wird oftmals von Einheiten gebildet, die ihren Verbreitungsschwerpunkt auf den Dünenzügen haben. Die Gehölzvegetation des glacis ist in drei relativ artenarme Gesellschaften gegliedert, die in Abhängigkeit der Lage zum lokalen Vorfluter zoniert und auch über das Untersuchungsgebiet hinaus weit verbreitet sind. Weite Bereiche des glacis sind völlig gehölzfrei. Die häufigste Gesellschaft ist die Acacia raddiana-Zentralgesellschaft. Die Ordination der Daten unterstützt die Klassifikation und zeigt Übergänge zwischen den Einheiten sowie Beziehungen zu den Standortparametern auf. Die Krautvegetation der glacis-Flächen ist relativ einheitlich; es gibt insgesamt nur zwei Gesellschaften. Der Anteil an Ruderalarten, Arten mit Pioniercharakter und solchen, die ihren Verbreitungsschwerpunkt auf Dünenzügen haben, ist relativ hoch. Bedeutendste Einheit ist die Tribulus terrestris-Untereinheit der Schoenefeldia gracilis-Gesellschaft, die eine weite ökologische Amplitude besitzt. Vor allem zu den Krautgesellschaften der Niederungen bestehen enge floristische und räumliche Beziehungen. Die krautigen Arten des glacis haben eine weite ökologische Amplitude. Es bestehen floristische Beziehungen zu Vegetationseinheiten der Sahara. Die Vegetation der mares und Niederungen hat die höchste β-Diversität. Die Gehölzvegetation der Niederungen ist in Abhängigkeit der Überflutungsdauer und -höhe zoniert und relativ struktur- und artenreich. In Galeriewäldern kommen sudanische Gehölzarten vor. Während von Viehherden stark frequentierte mares niedrige Gehölzdeckungen aufweisen oder komplett gehölzfrei sind, ist die Gehölzdeckung an den Ufern nur schwach besuchter mares geschlossen. Dies gilt auch für die artenreiche Krautvegetation. Insgesamt ist die Gehölzvegetation der Niederungen und mares in acht Gesellschaften gegliedert; die einzelnen Einheiten zeigen Übergänge miteinander. Die Krautvegetation der Niederungen enthält ebenfalls sudanische Arten. Sie lässt sich in drei Gesellschaften gliedern, die z.T. nur ein kleines Verbreitungsgebiet haben. Einige Uferabschnitte sind stark degradiert und vegetationslos. Die oftmals röhrichtartige Krautvegetation der mares ist ebenfalls in Abhängigkeit der Überflutungshöhe gegliedert, allerdings kommen an den einzelnen mares teilweise unterschiedliche Einheiten vor. Die Melochia corchorifolia-Gesellschaft steht im Mittelpunkt der Krautvegetation der mares, während die Brachiaria mutica-Gesellschaft für die nicht oder nur wenig überfluteten Bereiche typisch ist. Die Gehölzvegetation der Dünenzüge lässt sich im Untersuchungsgebiet in neun Gesellschaften gliedern. Diese gruppieren sich in einem artenreichen Block wenig beeinflusster Bereiche und in einem relativ artenarmen Block intensiv genutzter Dünenabschnitte. Bestände, die zur Pterocarpus lucens-Gesellschaft gestellt werden, bilden auf abgelegenen Dünenzügen kleine Wäldchen. In diese Gesellschaft werden auch die Bestände der brousse tigrée eingegliedert. Es sind in der Region nur noch wenige Flächen mit intakter brousse tigrée vorhanden. Anhand von zwei Strukturprofiltransekten wird ihre floristische und räumliche Struktur mit vier Zonen veranschaulicht. Pterocarpus lucens und Combretum micranthum sind die beiden dominanten Gehölzarten. Im Untersuchungsgebiet ist die Combretum glutinosum-Zentralgesellschaft weit verbreitet. Durch zwei Ordinationsdiagramme wird der ökologische Schwerpunkt wichtiger Dünenarten aufgezeigt. Die numerische Klassifikation lässt sich gut mit der manuellen Klassifikation in Übereinstimmung bringen. Die Krautvegetation der Dünen ist in sieben Gesellschaften mit vielen, z.T. relativ artenarmen Untereinheiten gegliedert, deren ökologische Bindung aufgrund eines starken, nivellierenden Beweidungseinflusses nicht immer geklärt werden kann. Es dominieren annuelle Arten; viele der Arten kommen in anderer Artenkombination auch in der Sudanzone vor. Daneben zeigt sich eine floristische Verwandtschaft zur Sahara. Unter Bäumen wächst die Achyranthes aspera-Gesellschaft. Krauteinheiten, die in anderen Landschaftseinheiten ihren Verbreitungsschwerpunkt haben, sind auf den Dünenzügen ebenfalls vorhanden, z.B. die Enteropogon prieurii-Gesellschaft der Inselberge und die Schoenefeldia gracilis-Gesellschaft des glacis. Es ist keine floristische Differenzierung entlang des Niederschlagsgradienten erkennbar. Hirsefelder sind mit Kulturbaumparks bestanden. Die Acacia raddiana-Zentralgesellschaft gewinnt auch auf den Dünenzügen an Bedeutung. Die Ergebnisse werden in Beziehung zu den in der Literatur vorhandenen, oftmals auf formationskundlichen Kriterien beruhenden Klassifikationen in Beziehung gesetzt. Je nach verwendetem Verfahren und Distanzmaß liefert die numerische Klassifikation unterschiedliche Ergebnisse, die sich nur zum Teil mit der Klassifikation in Deckung bringen lassen. Durch die Betrachtung der aktuellen Verjüngung, aus den Ergebnissen und ihrer Diskussion werden Aussagen über die aktuelle Vegetationsdynamik abgeleitet. Aktuelle Strukturveränderungen der Vegetation sind mit einem Landnutzungswandel verbunden. In erster Linie handelt es sich um Degradation, für die Beispiele auch aus der Literatur gegeben werden. Auf den Inselbergen gehen artenreiche Bestände zurück, gleichzeitig wandern Arten von den glacis-Flächen her ein. Auf dem glacis sind einerseits eine Artenverarmung, andererseits eine Verbuschung tiefliegender Bereiche sowie eine floristische Homogenisierung vieler Flächen zu beobachten, letzteres gilt auch für die Dünenzüge. An den mares und Niederungen findet ebenfalls eine floristische Verarmung statt, sudanische Arten sterben wie auch auf den Dünenzügen aus. Klimaungunst und vor allem Überbeweidung als mögliche Ursachen für den Vegetationswandel werden diskutiert.
Die chromosomale Translokation t(4;11) ist mit einer aggressiven pro-B ALL im Kleinkindesalter assoziiert und stellt eine der häufigsten genetischen Veränderungen des MLL Gens dar. Bei bis zu 40 % der untersuchten Translokationen des MLL Gens wurde das AF4 Gen als Translokationspartner identifiziert. Durch Arbeiten in unserer Arbeitsgruppe konnte in Focus Formation Experimenten das wachstumstrans-formierende Potenzial sowohl des Wildtyp AF4 Proteins, als auch des bei der Translokation entstehenden AF4•MLL Fusionsproteins, nachgewiesen werden. Es kann somit als gesichert angesehen werden, daß es sich bei dem Wildtyp-AF4 Protein um ein Proto-Onkoprotein und bei dem AF4•MLL Fusionsprotein um ein Onkoprotein handelt. Der für beide Proteine identische Bereich beschränkt sich auf die ersten 360 Aminosäuren des AF4 Proteins, was der Hypothese führte, daß der N-Terminale Bereich des AF4 Proteins (AF4•N) für das beobachtete onkogene Potential in murinen embryonalen Fibroblasten verantwortlich ist. Ein mit dem AF4•N Protein durchgeführter Hefe-2-Hybrid Screen identifizierte die beiden E3-Ligasen SIAH1 und SIAH2 als Bindungspartner. Hierbei handelt es sich um Tumorsupressor- Proteine, die durch Ubiquitinylierung von Zielproteinen diese dem proteasomalen Abbau zuführen. Unter normalen physiologischen Bedingungen unterliegt das AF4 Protein einem raschen Abbau am Proteasom. Dies ist für das AF4•MLL Fusionsprotein nur noch eingeschränkt möglich, da es wie für das Wildtyp-MLL beobachetet proteolytisch gespalten wird, mit sich selbst dimerisiert und dann nicht mehr über das Proteasom abgebaut werden kann. Eine Bindung der beiden E3-Ligasen SIAH1 und SIAH2 konnte jedoch noch beobachtet werden, deshalb sollte die AF4 und SIAH Protein-Protein-Interaktion genauer untersucht werden. Hierzu wurden Hefe-2-Hybrid Experimente mit Deletionsmutanten durchgeführt, um die minimalen Kontakt-domänen zu identifiziert. Die Stärke der Interaktionen wurde durch ß-Galaktosidasetests ermittelt. Die identifizierte minimale AF4 Proteindomäne enthält das für die Erkennung durch die E3-Ligasen notwendige PxAxVxP Motiv und hat eine Länge von 25 Aminosäuren. Für die E3-Ligasen SIAH1 und SIAH2 konnte der für die Interaktion notwendige Kontaktbereich innerhalb der sogenannten Substrat-Bindungs-Domäne (SBD) lokalisiert werden. Interessanterweise ist nicht die große Furche des Dimerisierungsinterfaces der beiden SIAH Monomere der Kontaktbereich, sondern der proximale Zink-Finger Bereich. Die experimentell ermittelten Proteindomänen wurden in geeignete bakterielle Expressionssysteme kloniert und ihre in vitro Interaktion durch Pulldown-Experimente bestätigt. Die strukturelle Aufklärung der Kontaktdomäne erfolgte dann mit Hilfe der NMR-Fast-Mapping Methode. Mit dieser kombinatorischen Methode wurden die an der AF4 Bindung beteiligten Aminosäuren des SIAH Proteins durch Änderung ihrer chemischen Verschiebung im [15N,1H] HSQC-Spektrum nach Titration mit steigenden AF4 Konzentrationen identifiziert. Aus den erhaltenen Daten und anhand der bekannten SIAH Röntgenstruktur konnte ein Modell für die Bindung des AF4 Proteins an die E3-Ligase SIAH1 erstellt werden. Über die Funktion des Proto-Onkoproteins AF4 ist bis dato wenig bekannt. Es gibt Hinweise, daß alle Vertreter der ALF Proteinfamilie über transkriptionsaktivierende Eigenschaften verfügen. Da posttranslationale Modifikationen von Proteinen, wie z.B. Sumoylierung, häufig zur Regulation von Transkriptionsfaktoren beobachtet werden, wurden Untersuchungen auf posttranslationale Modifikationen des AF4 Proteins durchgeführt. Hierzu wurde durch Mutation der E3-Ligase Erkennungssequenz PxAxVxP eine stabilisierte AF4 Mutante hergestellt. Durch Immunopräzipitations Experimente nach Transfektion in 293T Zellen konnte sowohl die Sumoylierung, als auch Tyrosin Phosphorylierungen des AF4 Proteins nachgewiesen werden.
Massenspektrometrische Untersuchungen von DNA, RNA und nichtkovalenten Oligonukleotid-Komplexen
(2005)
Ziel dieser Dissertation war es, grundlegende Untersuchungen zum massenspektrometrischen Nachweis von DNA und RNA durchzuführen, sowie der spezifische Nachweis von nichtkovalenten Oligonukleotid-Komplexen. Dabei lag der Schwerpunkt auf den folgenden drei Bereichen: - Allgemeiner Vergleich zwischen DNA und RNA sowie den Ionisierungsmethoden nano-ESI und MALDI - Quantitative Untersuchung des Einflusses des Salzgehaltes und der Aufreinigung der Probe auf das Spektrum - Grundlegende Vorraussetzungen zum spezifischen Nachweis nichtkovalenter Komplexe mittels Massenspektrometrie (MS) Dabei zeigte sich beim massenspektrometrischen Vergleich von DNA mit RNA, dass die RNA stets eine höhere Stabilität aufweist, wobei diese bei beiden Oligonukleotiden mit steigender Kettenlänge abnimmt. Gleichzeitig erhöht sich mit steigender Kettenlänge die Tendenz zur Kationenanlagerung im Spektrum. Um diese Anlagerungen zu unterdrücken, ist die Verwendung von ammoniumhaltigen Zusätzen ist bei der MS stets erforderlich. Bei MALDI haben die Matrices einen großen Einfluss auf das Fragmentierungsverhalten der Proben. Für die Oligonukleotide konnte daher folgende Einteilung der Matrices von „hart“ nach „weich“ getroffen werden: HCCA > DHB > THAP ungefähr gleich ATT > HPA. Bei der Untersuchung von Oligonukleotiden mittels nano-ESI konnte gezeigt werden, dass die Verwendung von Quarzkapillaren der Verwendung von Glaskapillaren vorzuziehen ist, da mit Quarz die Anlagerungen der Kationen im Spektrum deutlich unterdrückt werden. Weiterhin wurde festgestellt, dass die Erhöhung des Drucks in der ersten Druckstufe zu einer schonenderen Desolvatisierung und damit zu einer deutlich verbesserten Nachweisgrenze führt. Bei der quantitativen Untersuchung des Salzeinflusses konnte eine maximale Salzkonzentration ermittelt werden, bei der eine massenspektrometrische Untersuchung von DNA und RNA noch möglich ist. Dabei hat sich gezeigt, dass bei direktem Vergleich nano-ESI 1000fach empfindlicher auf Salzverunreinigungen reagiert als MALDI. Generell lässt sich sagen, dass RNA eine höhere Tendenz zur Kationenanlagerung besitzt als DNA, wobei sich dieser Effekt mit steigender Kettenlänge verstärkt und bei nano-ESI deutlicher auftritt als bei MALDI. Das hat zur Folge, dass bei RNA ein höherer Aufreinigungsgrad notwendig ist, um im Vergleich zu DNA vergleichbare Ergebnisse zu erhalten. Dem entsprechend wurden neben der Aufreinigungsmethode mittels Ionenpaar-HPLC auch verschiedene Pipettenspitzen, die mit Chromatographiematerial gefüllt sind, zur Aufreinigung verwendet. Mit beiden Methoden konnte eine vergleichbare Reduktion der Kationenanlagerungen im Spektrum erreicht werden, wobei klar ist das die Verwendung von Pipettenspitzen die zeit- und kosteneffizientere Lösung darstellt. Durch ein neuartiges Aufreinigungsprotokoll für Pipettenspitzen konnte der Zeitaufwand noch einmal deutlich reduziert werden. Für die Untersuchung nichtkovalenter Oligonukleotid-Komplexe wurden „native“ Bedingungen gefunden, bei der die native Struktur des Komplexes soweit erhalten bleibt, dass ein spezifischer Nachweis mittels nano-ESI möglich ist. Diese Bedingungen stellen einen Kompromiss zwischen einerseits der Stabilität des Komplexes in Lösung und andererseits den optimalen Bedingungen für die Elektrospray-Ionisierung dar. Die erste untersuchte Komplexklasse waren Oligonukleotid-Dimere. Es wurden verschiedenste DNA-, RNA- sowie DNA-RNA-Hetero-Dimere mit Bindungsenergien zwischen 0 und -22,1 kcal/mol mittels nano-ESI vermessen. Es wurde eine klare Grenze ermittelt, bei der die Detektion nichtkovalenter Komplexe möglich ist. Spezifischen Dimere können im Spektrum nur dann detektiert werden, wenn deren Bindungsenergie mindestens -11,5 kcal/mol oder mehr beträgt. Als zweite Gruppe wurden Oligonukleotid-Dimere mit „Minor Groove Binding Ligands“ (MGBLs) mittels nano-ESI untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die MGBLs spezifisch und in der entsprechenden Bindungsstöchiometrie an DNA-Dimere binden. Für einen neusynthetisierten Ligand konnte erstmals die Bindungspräferenz an DNA-Dimere mit der Massenspektrometrie bestätigt werden. In allen Fällen wurde keine unspezifische Bindung an RNA-Dimere oder DNA-RNA-Hetero-Dimere beobachtet. Als letztes wurden RNA-Aminoglykosid-Komplexe mit nano-ESI untersucht. Hierbei konnten nur teilweise spezifischen Komplexe im Spektren nachgewiesen werden, da die Bindungsenergie einiger Komplexe deutlich unterhalb der Nachweisgrenze von -11,5 kcal/mol lag. Alle genannten nichtkovalenten Komplexe wurden auch mittels MALDI vermessen, allerdings konnten keine spezifischen Komplexe nachgewiesen werden. Durch direkten Vergleich von MALDI mit nano-ESI und entsprechende Kontrollexperimente konnte erstmals gezeigt werden, dass die nichtkovalenten Komplexe nicht wie vermutet während der MALDIKristallisation zerstört werden. Viel mehr werden die Komplexe im MALDI-Kristall unzerstört eingebaut und eine Zerstörung erfolgt erst während des Desorptions-/Ionisationsprozesses. Es besteht die berechtigte Vermutung, dass bei stärker bindenden Komplexen eine unzersetzte Ionisation mittels MALDI erfolgen kann. Daher sind weitere Untersuchungen in diese Richtung sinnvoll und es werden zur Zeit Komplexe, deren Bindungsenergie weit über -22,1 kcal/mol liegt, in der Arbeitsgruppe untersucht. Abschließend ist festzustellen, dass die Massenspektrometrie eine schnelle und effiziente Möglichkeit zur Analyse von DNA und RNA ist, die allerdings einen hohen Anspruch an die Sauberkeit und damit an die Aufreinigung der Probe stellt. Darüber hinaus ist die MS auch in der Lage nichtkovalente Oligonukleotid-Ligand-Komplexe zu untersuchen. Da in den letzten Jahren DNA und RNA als mögliches Zielmolekül für neue Therapieansätze mehr und mehr an Bedeutung gewonnen haben, bietet sich die Massenspektrometrie als eine Möglichkeit zur Analyse von Oligonukleotid-Wirkstoff- Komplexe an.
Mit der vorliegenden Arbeit wird für den südöstlichen Taunus und sein Vorland erstmals eine umfassende monographische Bearbeitung von Flora und Vegetation des Grünlands auf Basis umfangreicher Geländeerhebungen und Literaturrecherchen vorgelegt. Die wesentlichen Ziele der Untersuchung sind: • Darstellung der aktuellen und historischen Vorkommen und räumlichen Verbreitung von Pflanzenarten, Pflanzengesellschaften und Nutzungsintensitäten des Grünlands. • Darstellung der historischen Entwicklung des Grünlands und der sozioökonomischen Situation der Landwirtschaft. • Gefärdungseinstufung der Pflanzenarten und -gesellschaften (Rote Liste). • Kritische Bewertung des derzeitigen Stands der floristisch-vegetationskundlichen Landesforschung. • Bereitstellung von fachlichen Grundlagen für den praktischen Naturschutz, für Naturschutzbehörden, Planungsbüros, regionale Naturschutzforschung und die interessierte Öffentlichkeit. Das 1105 km2 große Untersuchungsgebiet liegt in nordwestlichen Rhein-Main-Gebiet und erstreckt sich von Wiesbaden im Südwesten und Bad Nauheim im Nordosten bzw. Schmitten im Nordwesten und Frankfurt im Südosten. Es umfasst mit dem Hebungsgebiet des Taunus (größte Höhe 878,5 m ü. NN) und dem Senkungsgebiet des Rhein-Main-Tieflands (tiefster Punkt 84 m ü. NN) zwei sehr unterschiedliche geowissenschaftliche Landschaftstypen, die im einzelnen 33 verschiedene naturräumliche Teileinheiten umfassen...
Der Nucleus suprachiasmaticus (SCN) ist der übergeordnete circadiane Schrittmacher (die “Tageszeitenuhr“) der Säugetiere. Er generiert den circadianen Rhythmus und synchronisiert diesen mit den diurnalen Signalen (Zeitgebern) aus der physikalischen Umwelt. Die Generierung der circadianen Rhythmik findet innerhalb einzelner SCN-Neurone (“clock cells“), die einen Multi-Oszillatoren-Veband bilden, statt. Die asynchronen Individualrhythmen der “clock cells“ werden zu einem gemeinsamen Haupt-Rhythmus, den circadianen Rhythmus, synchronisiert. Die entscheidende Rolle bei der Synchronisation der Individual-Rhythmen wird dem inhibitorischen – in fast allen SCN-Neuronen vorkommenden – Neurotransmitter Gamma- Amino-Buttersäure (GABA) zugeschrieben. Der gemeinsame Haupt-Rhythmus wird weiterhin durch exogene Zeitgeber auf die 24-stündige Periodik der Umweltsignale getriggert. Der dafür wichtigste Zeitgeber ist das Licht. Die Licht-Informationen werden retinal perzipiert und chemisch durch den Neurotransmitter Glutamat an den SCN übermittelt. Der Schlaf – als prominente Komponente circadianer Rhythmen – scheint ebenso vom GABAergen System des SCN gesteuert zu werden. In der vorliegenden Arbeit wurde das GABAerge System von Goldhamstern einschließlich seines glutamatergen Eingangssystems und der GABAergen Efferenzen analysiert. Diurnale Fluktuationen der untersuchten Komponenten des GABAergen Netzwerkes wurden auf ihre Beteiligung an Synchronisationsvorgängen im SCN beleuchtet. Die semiquantitative Analyse mit Hilfe von HPLC, Immuncytochemie und Immunoblot- Verfahren erbrachte eindeutige diurnale Fluktuationen aller untersuchten Komponenten des GABAergen Systems im Goldhamster-SCN. Während der Dunkelphase wurde das GABAerge-System aktiviert: die GABA-Synthese (GAD56/67), der Gesamt-GABA-Gehalt und die GABA-Wiederaufnahme (Entsorgung) aus dem synaptischen Spalt durch GABA-Transporter (GAT-1) zeigten eine nächtliche Reaktivitätssteigerung. Dies wurde durch die Erhöhung der nächtlichen GABA-Freisetzung aus SCN-Gewebekulturen (slice-Kulturen) ergänzt. In einer weiteren Untersuchung wurde die Zusammensetzung des GABAA-Rezeptors, der an den Synchronisationsvorgängen im SCN beteiligt ist, näher charakterisiert. Im SCN von Goldhamstern wurden die GABAA-Rezeptor- Untereinheiten alpha 2, alpha 3, beta 1 und beta 2/3 (schwach vertreten) nachgewiesen. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass das GABAerge System an der Schlafregulation beteiligt ist. Die Komponenten des GABAergen Systems (Gesamt-GABA, GAD56/67, GAT-1) im SCN von Goldhamstern wiesen während des Schlafs im Vergleich zum wachen Tier identischer photoperiodischer Phasenlage erhöhte Reaktivität auf. Die Komponenten des glutamatergen Systems, welchem die Lichtinformationsübermittlung an das GABAerge System im SCN obliegt, zeigten ebenfalls eine diurnale Fluktuation. Die Maxima der Immunreaktivität für die AMPA-Rezeptor-Untereinheiten (GluR1, GluR2/3) am Tage deuten auf eine optimale Beteiligung dieser Komponenten an der Lichtvermittlung und auf einen Triggereffekt von Glutamat hin. Der Gesamt-Glutamat-Gehalt im SCN wies zwar erhöhte Werte während der Nacht auf, jedoch konnte keine Aussage über die Menge des funktionellen Neurotransmitters gemacht werden, da nur ein Bruchteil der Gesamt-Glutamat- Menge als Neurotransmitter wirkt. Die AMPA-Rezeptor-Untereinheiten zeigten eine – im Vergleich zu wachen Tieren derselben photischen Phasenlage – erhöhte Reaktivität bei schlafenden Goldhamstern. Die Hochregulation der GABAergen Systems während der Nacht unterstützt die Hypothese, dass GABA-Pulse – verabreicht zu einem bestimmten Tageszeit – Rhythmen individueller SCN-Neurone (“clock cells“) synchronisieren können. Die Synchronisation der GABAAusschüttung zu bestimmten Tageszeiten aus allen SCN-Neuronen wird durch das glutamaterge System getrieben. Alle untersuchten Komponenten zeigten dabei konsensuelle Reaktivitätsmuster, die als erhebliche Kontrastverstärkung der Hell- und Dunkelphase gewertet werden müssen. Die Unterschiede in der Reaktivität des GABAergen und glutamatergen Systems zwischen schlafenden und phasengleich untersuchten wachen Tieren stellen deren große Bedeutung für die Schlafregulation heraus.
Einfluß von Rho-GTPasen und Aktin auf den cortikalen Membrantransport in Xenopus laevis-Oozyten
(2002)
Rho-Isoform-spezifische Änderungen der Zelloberfläche. Durch Bestimmung der Anzahl plasmamembranständiger Na,K-Pumpen bzw. der elektrischen Membrankapazität als Maße für die Zelloberfläche wurde der Einfluss verschiedener rekombinanter Rho-GTPasen auf den kortikalen Membranfluss an Xenopus-Oozyten untersucht. RhoA, RhoB, RhoC, RhoD und Cdc42 führten zu einer Abnahme der Zelloberfläche, wohingegen RhoE, RhoG und Rac1 eine Vergrößerung hervorriefen. Die Rho-GTPase TC10 hatte keinen Einfluss auf die Zelloberfläche. Die Veränderung der Zelloberfläche wurde durch elektronenmikroskopische und fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen verifiziert: Oozyten zeigten nach Überexprimierung von RhoA eine deutliche Reduktion der Mikrovilli, wohingegen die dominant-aktive Form von RhoG (V12-RhoG) zu einer Verlängerung der Mikrovilli führte. Für die Wirkstärke der Rho-GTPasen, die die Oberfläche in ihrer Wild-Typ Form reduzierten, konnte folgende Rangfolge ermittelt werden: RhoB > RhoA > RhoD > RhoC > Cdc42. In der Gruppe der Rho-Proteine, die eine Vergrößerung der Zelloberfläche bewirken, zeigte RhoE den größten Effekt, gefolgt von Xenopus-RhoG, humanem RhoG und Rac1. Aus den Untersuchungen ging ferner hervor, dass dominantaktive Formen der Rho-GTPasen nicht unbedingt stärker wirken als die Wildtypform. Auch einige dominant-negative Formen führten trotz des inhibierten GDP/GTP-Austausches zu unerwarteten Veränderungen der Zelloberfläche. GTPasen anderer Familien wie Arf1, Arf6 oder Rab5a, für die eine Rolle beim vesikulären Transport gut dokumentiert ist, hatten keinen Einfluss auf die Zelloberfläche. Für die Änderung der Zelloberfläche erwies sich das Vorhandensein eines Cterminalen Lipidankers als essentiell, da Rho-GTPase-Mutanten, die infolge des Fehlens eines kritischen Cysteinrestes nicht mehr isoprenyliert werden können, keine Änderung der Zelloberfläche bewirkten. Die Analyse von RhoB-RhoG-Chimären brachte keine eindeutigen Hinweise auf das Vorhandensein einer für die Zelloberflächenregulation entscheidenden weiterer Region. Sowohl N-terminal- als auch C-terminal-gelegene Sequenzabschnitte waren zur Ausbildung des vollen Effektes notwendig. Identifizierung möglicher RhoA-Effektoren. Die Untersuchung von RhoAEffektormutanten, bei denen die Interaktion mit spezifischen Effektormolekülen durch Mutation in der Effektorregion inhibiert war, ergab, dass die Abnahme der Zelloberfläche weder durch Rhophilin, mDia, Kinectin, Citronkinase oder ROK vermittelt wird. Auch der ROK-Inhibitors Y-27632 konnte den RhoA-Effekt nicht blockieren. Nach diesem Ausschlußverfahren konnte die Proteinkinase N (PKN, PRK) als einziger möglicher Effektor für den durch RhoA ausgelösten Internalisierungsprozeß ermittelt werden. Wechselwirkung zwischen Rho und Aktin. Rho-Proteine gelten als endscheidene Regulatorproteine des Aktinzytoskeletts. Als Reaktion auf bestimmte extrazelluläre Signale kontrollieren diese Proteine Aufbau und Zerfall des Aktins. Untersucht wurde hier der Einfluß der Aktinumstrukturierung auf den Rho-vermittelten Membrantransport. Die das Aktin-Zytoskelett gegensätzlich beeinflussenden Substanzen Cytochalasin B, Cytochalasin D und Phalloidin hatten keinen bzw. nur einen schwachen Effekt auf die Oozyten-Oberfläche. Die Rho-vermittelte Zelloberflächenänderungen wurden von diesen Substanzen nicht blockiert. Dagegen bewirkten die das Aktin-Zytoskelett depolymerisierenden Substanzen Latrunculin A und C2-Toxin eine starke Reduzierung der Zelloberfläche. Die Reduzierung unter Latrunculin A kam auch dann zustande, wenn zuvor RhoE überexprimiert wurde, welches selbst die Zelloberfläche stark vergrößert. Wurde zunächst C2-Toxin in Oozyten injiziert und anschließend RhoE überexprimiert, ergab sich keine Veränderung der Membrankapazität im Vergleich zu einer nicht injizierten Kontrolloozyte. Der Effekt von Latrunculin A wurde blockiert, wenn Rho-GTPasen durch Vorbehandlung der Oozyten mit Rho-spezifischen Toxinen (ToxB und C3- Toxin) inaktiviert wurden. Daraus folgt, dass der Effekt von Latrunculin A und C2-Toxin davon abhängt, dass aktivierbares Rho zur Verfügung steht. Jasplakinolid, eine Aktin stabilisierende Substanz, führt ebenfalls zu einer starken Verringerung der Zelloberfläche, die jedoch durch Toxin-Vorhandlung nicht blockierbar und damit RhoA-unabhängig war. Auswirkung der GAP-Wirkung von ExoS auf die Rho-Aktivität. Die Injektion von ExoS, einem Toxin, das gegenüber Rho GAP-Aktivität aufweist, führt zu einer Vergrößerung der Zelloberfläche. Die GAP-Wirkung von ExoS konnte durch das CNFToxin, daß aufgrund einer Aktivierung von Rho zu einer Verminderung der Zelloberfläche führt, nicht aufgehoben werden. Auch die dominant-aktiven Formen von RhoA (V14-RhoA, Q61-RhoA) konnten die GAP-Wirkung von ExoS nicht blockieren. ExoS kann im Gegensatz zu anderen GTPase-aktivierenden Proteinen eine Interaktion mit der deamidierten Form von Rho eingehen und somit den Aktivitätszustand durch GTPHydrolyse beenden. Wechselwirkung zwischen Bordetella Dermonekrose-Toxin (DNT) und Rho. Die biologische Wirkung von DNT resultiert aus einer Deamidierung und Transglutaminierung von Rho-GDP nach Freisetzung von GDI. Aufgrund dieser Modifikationen kommt es zum Verlust der GTP-Hydrolyse-Aktivität und somit zur Bildung einer konstitutiv-aktiven Form von Rho. In Zusammenarbeit mit Prof. Aktories (Pharmakologisches Institut, Freiburg), gelang es, die Aminosäure Lysin als ein weiteres Substrat neben Spermidin und Putrescin für den Transglutaminierunsprozeß des Toxins DNT zu identifizieren.
Hauptanliegen der vorliegenden Arbeit waren einerseits die Inventarisierung der Waldvegetation des Rothaargebirges sowie andererseits der Vergleich mit historischen Bearbeitungen zur Ermittlung von Vegetationsveränderungen. Die aktuelle Vegetation wurde mit Hilfe pflanzensoziologischer Methoden erfaßt und klassifiziert. Ergänzend erfolgte eine Kartierung vieler Waldvegetationseinheiten, welche in Verbreitungskarten dargestellt ist. Von großer Bedeutung im Bereich der Waldgesellschaften ist das Luzulo-Fagetum, welches in einer Reihe unterschiedlicher Ausbildungen vorkommt und im gesamten Gebiet verbreitet ist. Weitere Buchenwälder sind dem Galio odorati-Fagetum und in geringem Umfang dem Hordelymo-Fagetum zuzuordnen. Als Ersatzgesellschaften der Buchenwälder sind die große Flächen einnehmenden Fichtenforste, die überwiegend aus der Haubergswirtschaft entstandenen Wälder des Betulo-Quercetum und die wenigen dem Carpinion zugehörigen Bestände einzustufen. An feuchtere Standorte gebunden sind die Schluchtwälder des Fraxino-Aceretum pseudoplatani sowie Auenwälder, die durch das Carici remotae-Fraxinetum und das Stellario nemorum-Alnetum repräsentiert sind. Weiterhin kommen Bruchwälder des Betuletum carpaticae und des Sphagno-Alnetum vor, welche auf nassen Standorten siedeln. Ebenfalls pflanzensoziologisch dokumentiert wurden Gesellschaften, die im räumlichen Verbund der Wälder auftreten oder mit diesen in einem syndynamischen Zusammenhang stehen. Hierzu gehören insbesondere krautige Formationen der Schlagfluren sowie deren strauchige Folgegesellschaften. Des weiteren wurden Gesellschaften der Heiden, der Quellfluren, der Bachröhrichte und der Felsen erfaßt. Für eine Gegenüberstellung des Luzulo-Fagetum mit seinen forstlichen Ersatzgesellschaften erfolgte eine Betrachtung struktureller Parameter, floristischer Unterschiede sowie von Zeigerwerten. Sowohl Fichtenforst als auch Betulo-Quercetum weisen im Vergleich zum Luzulo-Fagetum eine geringere Anzahl an Varianten auf und Arten der Ordnung Fagetalia treten zurück. Im Fichtenforst häufiger sind Säurezeiger sowie Arten der Schlag- und Ruderalfluren, im Betulo-Quercetum vor allem Säure- und Magerkeitszeiger. Bezogen auf mittlere Zeigerwerte äußern sich die Unterschiede beider Gesellschaften zum Luzulo-Fagetumin höheren Werten für den Faktor Licht, während in bezug auf die Faktoren Feuchte, Bodenreaktion und Stickstoff lediglich das Betulo-Quercetum deutlich vom Luzulo-Fagetum abweicht, wobei die Werte jeweils deutlich geringer ausfallen. Die Relevanz dieser beobachteten Unterschiede offenbart sich an einer exemplarisch durchgeführten Darstellung des Bestockungswandels der Markenwaldungen Winterberg. Hier wurde für das 20. Jahrhundert ein deutlicher Anstieg der mit Fichten bewachsenen Flächen registriert, der auf Kosten des Buchenanteils geht. Zur ergänzenden Beurteilung der Waldvegetation wurden Analysen geringeren Umfangs angestellt. Hierunter fällt zum einen die Darstellung der Waldgesellschaften in einem Ökogramm anhand der mittleren Zeigerwerte für Feuchte, Bodenreaktion und Stickstoff. Bei der Betrachtung der Naturverjüngung in den einzelnen Waldgesellschaften erwiesen sich insbesondere Fagus sylvatica, Picea abies, Acer pseudoplatanus und Sorbus aucuparia als die sich am häufigsten verjüngenden Baumarten. Zur Beurteilung des Faktors Wild wurde die Verbißhäufigkeit an Waldpflanzen registriert. Danach gehören Athyrium filix-femina, Epilobium angustifolium, Dryopteris dilatata und Polygonatum verticillatum zu den beliebtesten Äsungspflanzen. Weiterhin wurde exemplarisch die Vegetation auf den im Rothaargebirge häufig anzutreffenden Meilerflächen dokumentiert. Im Bereich dieser Plätze werden nicht selten Arten der Ordnung Fagetalia sowie andere nährstoffliebende Taxa gefördert. Eine Gegenüberstellung der Aufnahmen von Fagion-Gesellschaften, Luzulo-Fagetum, Fichtenforst und Betulo-Quercetum mit vergleichbaren Aufnahmen historischer Bearbeitungen ergab eine Reihe von Unterschieden. Deutlich zeichnet sich eine Zunahme an stickstoffliebenden Arten ab, die pflanzensoziologisch überwiegend den Klassen Epilobietea angustifolii und Artemisietea vulgaris zuzuordnen sind. In den Fichtenforsten ist dieser Wandel besonders auffällig und spiegelt sich in erhöhten mittleren Zeigerwerten für Stickstoff und Bodenreaktion wider. Für die Fagion-Gesellschaften wurde zudem eine Abnahme an Arten der Ordnung Fagetalia registriert, so daß die Veränderungen der mittleren Zeigerwerte nur gering ausfallen, da diese Arten ebenfalls als Stickstoffzeiger einzustufen sind. Für das Luzulo-Fagetum fällt der Zuwachs an den betreffenden Arten zwar geringer als im Fichtenforst aus, zeigt sich aber in einzelnen Aufnahmen mit dominantem Auftreten der stickstoffzeigenden Arten. Im Betulo-Quercetum ist die Zunahme an Stickstoffzeigern am geringsten ausgeprägt und der Anstieg des entsprechenden mittleren Zeigerwertes beruht primär auf einem Rückgang an Säure- und Magerkeitszeigern. Letztere verzeichnen auch in den anderen Waldgesellschaften unterschiedlich stark ausgeprägte Verluste. Als Ursache für die Veränderungen werden insbesondere stickstoffreiche Immissionen diskutiert, sowie Kompensationskalkungen und Bestandsauflichtungen. Ergänzend sind Nutzungsänderungen in Erwägung zu ziehen, die sich vor allem bei den ehemals als Hauberg bewirtschafteten Beständen des Betulo-Quercetum auswirken. Die ermittelten Ergebnisse fügen sich in eine Reihe ähnlicher Untersuchungen ein und bestätigen damit auch die angewendete Methode des pflanzensoziologischen Typenvergleichs zum Monitoring von Vegetationsveränderungen. Weiterhin wurde in vorliegender Arbeit ein Blick auf die Situation des Wald-Naturschutzes im Rothaargebirge geworfen und Empfehlungen für eine weitere Entwicklung kurz angerissen. Als Beispiel für das Vorkommen gefährdeter Arten und deren Abhängigkeit von der Waldvegetation wurden Verbreitungskarten von Bärlapp-Arten angeführt.
Im Gegensatz zu den Arbeiterinnen der sozial lebenden Wespen und Bienen sind alle Ameisen flügellos. Die Flügellosigkeit der Ameisenarbeiterinnen bedingt, dass selbst kleinste Räume in der Erde oder in Holz von Kolonien besiedelt werden können. Sie war eine wichtige Voraussetzung für ihre Vorherrschaft auf dem Boden. Die für bodennistende Arten als Baumaterial in Frage kommende Erde hat jedoch die Eigenschaft, dass z. B. starke Regenfälle die Stabilität der Bauwerke negativ beeinflussen können. Deshalb und weil Erde in den höheren Regionen des Laubdaches schwierig zu beschaffen ist, sind Erdnester für den Übergang zum Leben in den Baumkronen wenig geeignet. Höhlungen in verrottendem Holz stehen aufgrund der schnellen Zersetzung in den Tropen nur für einen relativ kurzen Zeitraum und wenig regelhaft zur Verfügung. Der dadurch vorherrschende Mangel an Nistraum im tropischen Regenwald ist möglicherweise der wichtigste Faktor der Koloniegrößeregelung bei Ameisen. Erst mit dem Übergang zu aktivem Freinestbau ist es den Ameisen gelungen, sich (i) unabhängig von natürlichen Höhlen zu machen und dadurch große Kolonien zu etablieren, (ii) den Kronenraum als Habitat dauerhaft zu erschließen, (iii) negativen Witterungseinflüssen entgegenzuwirken und (iv) vorhandene Nahrungsressourcen in diesem Stratum permanent zu nutzen. Die in der vorliegenden Arbeit untersuchten freinestbauenden Ameisen sind selbst in der Lage, additiv Nistraum zu schaffen. Die Vertreter dieser Gilde legen ihre Nester nicht in der Erde oder in natürlichen oder selbst ,ausgeräumten-- Hohlräumen von Bäumen an, sondern konstruieren aktiv frei in der Laubregion der Holzgewächse Nisträume bzw. Unterstände, indem sie Material zusammentragen oder herstellen, mit dem eine Abschottung des Brut- und Nahrungsraumes gegenüber der Umwelt erreicht wird. Die erfolgreiche Besiedlung der Kronenregion war den Ameisen nur durch veränderte Bautechniken und eine verbesserte und angepasste Materialverwendung möglich. Gegenstand der vorliegenden Dissertation war zunächst die Bestandsaufnahme der freinestbauenden Ameisen der Baumkronenregion südostasiatischer Regenwälder. Der erste Schritt einer Analyse der Freinestkonstruktionen von Ameisen bestand darin, die Vielfältigkeit der verwirklichten Nestformen zu erfassen und darzustellen, Gemeinsamkeiten und Unterschiede herauszuarbeiten und die beteiligten Ameisenarten zu identifizieren. Im zweiten Teil der Arbeit wurden intensiv die proximaten Mechanismen des aktiven Nest- und Pavillonbaus untersucht. Dazu wurden die einzelnen Schritte der Nestentwicklung für sieben Ameisenarten aus sechs Gattungen in allen Details dargestellt und zusammenfassend beschrieben. Es wurde ermittelt, welche Baumaterialien die verschiedenen Ameisen nutzen und wie diese Materialien verwendet werden. Zur Bestimmung der verschiedensten Nesttypen wurden neben architektonischen Unterschieden auch Differenzen in der Substratwahl, Materialbeschaffenheit und in der Funktion der Nestkonstruktionen berücksichtigt. Als weiteres Kriterium zur Klassifikation arborealer Nestanlagen diente die Verschiedenartigkeit der Materialbearbeitung und der Substratvorbereitungen durch die Ameisen. Einige dieser Nestcharakteristika sind quantitativer, andere qualitativer Natur. Im Verlauf der Untersuchung wurden 1767 Kolonien bearbeitet und eingeordnet. Davon konnten insgesamt 100 Arten bzw. Morphospezies bestimmt und als echte Freinestbauer im Sinne der vorher formulierten Definition charakterisiert werden. Die ermittelten Arten verteilten sich auf acht Gattungen aus den drei Unterfamilien Formicinae, Dolichoderinae und Myrmicinae. Diese drei Unterfamilien gelten als die am weitesten entwickelten Ameisen und dominieren in der Kroneregion tropischer Regenwälder. Auffallend an dieser höher entwickelten Gruppe von Ameisen ist die Tendenz, pflanzliche Produkte als Hauptnahrungsressource zu nutzen. Die artenreichste Gattung Polyrhachis (39 Arten) gehört der Unterfamilie Formicinae an; zusammen mit den Gattungen Camponotus (10) und Oecophylla (1) wurden allein 50 Arten aus dieser Unterfamilie gefunden. In der Gattung Camponotus konnten zwei Untergattungen (C. Karavaievia, C. Myrmotarsus) mit freinestbauenden Arten ermittelt werden. Mit 29 identifizierten Arten aus drei Gattungen stellten die Myrmicinae die zweitgrößte Unterfamilie, wobei allein 23 Arten auf die Gattung Crematogaster entfielen. In den beiden anderen Myrmicinen-Gattungen Monomorium (5 Arten) und Myrmicaria (1 Art) fanden sich nur vergleichsweise wenige Vertreter mit Freinestbau. Die dritte Unterfamilie, die Dolichoderinae, wird durch die Gattungen Dolichoderus und Technomyrmex mit zusammen 21 Arten repräsentiert. Die als Freinestbauer ermittelten Ameisenarten zeigen hinsichtlich ihrer Koloniestruktur und Nestorganisation einige nennenswerte Parallelen. Die Mehrzahl der Arten lebt in polydomen Kolonieverbänden, die ihre manchmal mehr als 200 Nestanlagen meist nur auf eine einzelne oder wenige Nestpflanzen verteilen. In den Gattungen Camponotus und Monomorium sind alle Arten polydom organisiert, bei Dolichoderus und Technomyrmex sind es 90 % und bei Crematogaster 70 %. Polydomie findet man auch bei Myrmicaria arachnoides und Oecophylla smaragdina. Als weitere Gemeinsamkeit fällt ins Auge, dass mit Ausnahme von Myrmicaria arachnoides und Polyrhachis spp. funktionell als Stallnester zu charakterisierende Nestkonstruktionen überwiegen. Insbesondere bei Technomyrmex (100 %), Dolichoderus (100 %), Camponotus (70 %), Crematogaster (82 %), aber auch bei Monomorium (100 %) und Oecophylla smaragdina besteht eine ausgeprägte Tendenz, die Honigtau liefernden Trophobionten und die Brut in denselben Bauten unterzubringen. Bei den meisten Arten besteht somit ein enger Zusammenhang zwischen Freinestbau und trophobiotischer Ernährungsweise. Diese enge räumliche Vereinigung von Nahrungs- und Nistressourcen bildet die Basis für die Entwicklung individuenreicher, konkurrenzstarker und ökologisch dominanter Ameisenarten in der Kronenregion. Insgesamt wurden 22 unterscheidbare Nesttypen ermittelt und in allen Einzelheiten dargestellt. Auf 47 Bildtafeln wurden dazu fotografisch und zeichnerisch die Charakteristika der verschiedenen Nesttypen hinsichtlich der Nestarchitektur und ethologischer Besonderheiten der beteiligten Ameisenarten abgebildet. Während die Anzahl der freinestbauenden Ameisenarten sicherlich nur annähernd erfasst werden konnte, ist bei der Darstellung der verschiedenen Nesttypen zu erwarten, dass die erfolgreichsten, auf der Basis ethoökologischer sowie material- und substrattechnischer Unterschiede ermittelten Erscheinungsformen aufgeklärt werden konnten. Die vorgenommene Unterteilung der Hauptkategorie ,Nestsubstrat-- in drei blattgebundene und zwei stammgebundene Unterkategorien zeigte, dass die zweifach geschützte und materialsparende Position zwischen Blättern, von zusammen 13 Arten aus den Gattungen Polyrhachis (6), Camponotus (Karavaievia) (2), Oecophylla (1) und Crematogaster (3) präferiert wurde. Nester auf der vergleichsweise ungeschützten Blattoberseite wurden nur von Arten der Gattung Polyrhachis gebaut. Die bevorzugte Position der Polyrhachis-Nester war auf der Blattunterseite, 67 % aller Polyrhachis Nester waren dort lokalisiert. Die Nester der Untergattung Camponotus (Karavaievia) waren zu 75 % und die von Technomyrmex, Monomorium und Myrmicaria gar zu 100 % auf der Blattunterseite angebracht. Zusammen betrachtet waren 64 % aller im Rahmen der vorliegenden Arbeit aufgenommenen Nestbauten auf der Unterseite einzelner Blätter zu finden. Von allen Nestbauten auf Stamm- und Astoberflächen waren 75 % von Crematogaster-Arten besiedelt. Diese Nestposition konnte ansonsten nur noch bei zwei Polyrhachis-Arten und bei der mit Epiphyten assoziierten Camponotus (Myrmotarsus) gefunden werden. Je nach Anteil der hauptsächlich verarbeiteten Baustoffe kann man in vier Nestmaterialtypen unterteilen: (i) Nester aus toten pflanzlichen Materialien, (ii) Pilznester, (iii) Seidennester und (iv) Wurzelnester (Ameisengärten). Am häufigsten vertreten waren die aus Larvalseide gefertigten Webenester der Gattungen Polyrhachis, Camponotus (Karavaievia) und Oecophylla; insgesamt 45 % aller Funde gehörten zu dieser Materialgruppe. Fremde Seide konnten neben drei Polyrhachis-Arten auch drei Arten aus der Gattung Dolichoderus verarbeiten. Bemerkenswert ist der hohe Anteil pilzbewachsener Nestbauten. In allen drei Unterfamilien fanden sich Arten, die zu unterschiedlichen Teilen Pilze in ihren Nestern hielten. In der Gattung Technomyrmex waren 70 % aller älteren Nester vollständig aus Pilzhyphen gebildet. Mehr als die Hälfte des Nestmaterials von Monomorium-Nestern bestand ebenfalls aus einem dichten Pilzmyzel. Pilze bildeten auch in den Nestern von einigen Arten der Gattungen Dolichoderus, Crematogaster und Camponotus (Myrmotarsus) die maßgebliche Materialkomponente. Folgt man der bisher verwendeten Begriffsdefinition, die arboreale Ameisennester in der Regel nach den hauptsächlich verwendeten Baumaterialien einteilt, so muss man zu den bislang bekannten Karton- und Seidennestern die dritte Gruppe der Pilznester hinzufügen. Die Wahl des jeweiligen Baumaterials wirkt sich direkt auf die angewandten Bearbeitungsmechanismen und die Art und Weise der Nestfixierung und Neststabilisierung aus. Die Vertreter der Myrmicinen-Gattungen Myrmicaria und Monomorium zeigten in der Materialnutzung sowie bei der Stabilisierung und Fixierung der Konstruktionen gattungsspezifische Eigenheiten. Die Festigung der Nestbauten werden über H- Brückenstabilisierung (Myrmicaria) und Trichomstabilisierung (Monomorium) erreicht. Pilzhyphenstabilisierte Nester bauen Vertreter der Gattungen Technomyrmex, Dolichoderus und Crematogaster. Wobei innerhalb der beiden letztgenannten Gattungen noch eine Reihe weiterer Fixierungsmechanismen auftreten können. Bei Dolichoderus und Crematogaster sind die Methoden der Materialverfestigung sehr vielfältig und haben jeweils eine große Radiation erfahren (Stabilisierung durch Fremdseide, Pilze, Wurzeln und Klebstoff). Den Camponotus-Arten war die Eroberung der Baumkronenregion mit Hilfe von wurzelstabilisierten Ameisengärten (C. (Myrmotarsus)) und mit der Verwendung klebriger Larvalseide (C. (Karavaievia)) möglich. Beschränkt auf Seide zur Nestfixierung sind die Arten der Gattungen Oecophylla und Polyrhachis. Das bestimmende Element in der Nestarchitektur von fast allen Ameisennestern ist die Bogenkammer oder der Bogengang. Die innere Architektur von Oecophylla-Nestern weicht praktisch als einzige von dieser weit verbreiteten ,Bogenkammer-Struktur-- ab. Bei allen anderen Ameisenarten sind die Nestkammern in der Höhendimension in etwa auf die Größe einer einzelnen Arbeiterin beschränkt. Wegen der kooperativen Zusammenarbeit vieler Arbeiterinnen bei Oecophylla wird die Korrelation von Kammerhöhe und Körpergröße in dieser Gattung aufgehoben. Morphologische Besonderheiten, die als Anpassung an das Leben in Freinestern gedeutet werden könnten, konnten in der vorliegenden Arbeit bei keiner der untersuchten Arten festgestellt werden. Bei Bienen, Wespen und bei den Termiten wird überwiegend eine modellierende Bearbeitungstechnik angewandt. Die körpereigenen, flüssig-adhäsiven Substanzen (Wachs, Sekret und Kot) werden dazu oft noch mit Wasser verdünnt. Auch viele Ameisenarten verarbeiten wassergetränktes Material, nur einige wenige Vertreter der Gattung Crematogaster versetzen es allerdings mit klebenden Sekreten. Die durch das Baumaterial und dessen Fixierung am Substrat vorgegebene Verschiedenartigkeit der Bearbeitungstechniken hat bei den Ameisen zu sehr komplexen Verhaltensweisen geführt. So zum Beispiel das gezielte Verzahnen von Blatthaaren und das Verbinden von Baustoffen ohne die Zugabe von Leim. Weiter bearbeiten Ameisen Materialien, indem sie sie mit Fäkalien und anderen nährstoffreichen Substanzen düngen und so das Wachstum von Pilzhyphen und Wurzelfasern aktiv lenken. Die Seidenweber zeigen mit dem Verspinnen noch eine zusätzliche Möglichkeit der Materialbearbeitung bei Ameisen. Im Vergleich mit anderen sozialen Insekten findet man innerhalb der Ameisen eine mehr generalisierte Bautechnik, die möglicherweise variabler und effizienter ist als die Spezialisierung auf nur eine Materialkomponente. Generell sind die Freinestbauer, anders als die weitgehend deterministisch eingenischten obligaten Pflanzenameisen, bei der Auswahl des Nistplatzes nicht auf vorgegebene Hohlraumstrukturen (Domatien etc.) ganz bestimmter Pflanzen angewiesen, sondern erhöhen ihre Beweglichkeit in der Nistplatzwahl durch die Auswahl vergleichsweise häufig zu findender Substrattypen und Nestmaterialien. Bei allen untersuchten Freinestbauern konnte keine Spezialisierung auf eine bestimmte Pflanzenart festgestellt werden. Stochastische Besiedlungsprozesse gewinnen damit in dieser Ameisengilde, im Vergleich mit den myrmekophytischen Ameisenarten, an Bedeutung. In der vorliegenden Dissertation konnte erstmalig experimentell gezeigt werden, dass die bislang nur aus der Neotropis bekannten Ameisengärten auch im paläotropischen Faunengebiet zu finden sind. Die erstaunlichen Ähnlichkeiten zwischen neotropischen und paläotropischen Ameisengarten-Assoziationen deuten darauf hin, dass es in den unterschiedlichen tropischen Gebieten zu einer konvergenten und parallelen Entwicklung von ähnlich präadaptierten Ameisen und Pflanzen gekommen ist. Freinestbau ist mehrfach unabhängig voneinander entstanden. Sehr wahrscheinlich stand bei vielen Ameisen die Sicherung von Trophobiosestellen am Anfang der Entwicklung. Denkbar ist ebenso, dass die Vergesellschaftung von Epiphyten und Ameisen bei einigen Gruppen die Basis für die Evolution von Freinestbau war. Die Fertigung ausgedehnter Schutzbauten außerhalb der Nester, wie man sie beispielsweise bei der Myrmicinen-Gattung Pheidole findet, könnte ebenfalls die Evolution von frei gestalteten Nestern initiiert haben. Insgesamt wird deutlich, dass Konkurrenzvermeidung und die Erweiterung des Nistraum- und Nahrungsspektrums die drei bestimmenden Faktoren in der Evolution des Nestbauverhaltens von Ameisen waren. Anders als bei Wespen und Termiten fehlt den Ameisen jegliche Prädisposition für die Produktion von liquiden Klebesubstanzen. Sie haben vielfältige Wege gefunden, Wasser zum Nest zu transportieren und damit ihren Möglichkeiten entsprechende Verarbeitungs- mechanismen anzuwenden. Die fehlende gemeinsame Prädisposition der Ameisen für eine dauerhafte Fixierung von Baumaterialien, wie sie für freie Nestkonstruktionen notwendig ist, hat viele verschiedene Lösungen hervorgebracht und ist einer der Gründe für die hohe Variabilität der Freinestbauten bei Ameisen. Die in der vorliegenden Arbeit gezeigte variable Nistbiologie hat einen wichtigen Einfluss auf die Abundanzstrukturen tropischer arborealer Arthropodengemeinschaften und ist in hohem Maße für den großen Erfolg der Ameisen in diesem Habitat verantwortlich.