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I. Untersuchung der Transformationsmaschinerie in Acinetobacter baylyi ADP1 durch Analyse der subzellulären Lokalisation von Kompetenzproteinen, Mutantenstudien und In-vivo-Detektion des DNA-Translokators in der lebenden Zelle. 1. Durch Komplementationsstudien konnte gezeigt werden, dass die Markerinsertionen in den Mutanten T843 (comM::nptII) und T840 (comL::nptII) keine polaren Effekte auf stromabwärts gelegene Gene des comM-Q Clusters haben. Hieraus kann geschlossen werden, dass ComM und ComL essentiell sind für die natürliche Transformation. 2. Mit Hilfe der sacB-nptII Selektionskassette wurde eine markerlose und somit nichtpolare Mutation in comN erzeugt. Diese Mutante war nicht mehr transformierbar, woraus eindeutig geschlossen werden kann, dass ComN ebenfalls essentiell ist für die natürliche Transformation. 3. Western-Blot-Analysen subzellulärer Fraktionen von A. baylyi ergaben, dass die Kompetenzproteine ComL und ComN in der inneren Membran lokalisiert sind. 4. Mutantenstudien führten zu dem Schluss, dass ComL in der comM-, der comN- und der comO-Mutante weder im Rohextrakt, noch in subzellulären Membranfraktionen nachzuweisen ist. Auch ComN ist in der comM- und der comO-Mutante weder im Rohextrakt, noch in subzellulären Membranfraktionen nachzuweisen. Daraus lässt sich folgern, dass die Proteine entweder die Expression der entsprechende Gene beeinflussen oder dass durch Interaktionen von ComM, ComN, ComL und ComO die Stabilität der Proteine erhöht wird. 5. Die Kompetenzproteine ComEA und ComP wurden translational mit GFPuv fusioniert (C-terminale Fusion). Die Expression der Gene comEA-gfp und comP-gfp, die auf dem Plasmid pRK415 unter der Kontrolle eines lac-Promotors vorlagen, führte nach Induktion mit IPTG zur Detektion der Fusionsproteine in A. baylyi. Über Komplementationsstudien konnte nachgewiesen werden, dass die ComEA-GFP- und ComP-GFP-Fusionsproteine funktionsfähig sind. 6. Fluoreszenzmikroskopische Analysen zeigten, dass die Verteilung von ComEA und ComP in der Zellmembran von A. baylyi abhängig ist von der Wachstumsphase und der Kompetenz: Während die Kompetenzproteine in der lag-Phase (zum Zeitpunkt maximaler Kompetenzinduktion) gleichmäßig über die gesamte Membran verteilt sind, finden sie sich im Laufe der exponentiellen Phase (mit abnehmender Kompetenz) in einer abnehmenden Zahl von separaten Foci, bis sie schließlich in der späten stationären Phase (zum Zeitpunkt minimaler Kompetenz) nur noch in 1 - 2 distinkten Foci lokalisiert sind. II. DNA-Transfer in marinen Bakterien 1. Vor der Auswahl geeigneter Selektionsmarker für DNA-Transferstudien in marinen Bakterien wurde eine Analyse der spontanen Resistenzen mariner Bakterien durchgeführt. Diese Analysen ergaben, dass 72 % von 116 marinen Isolaten sensitiv gegenüber einer Kombination von je 100 μg Kanamycin und 100 μg Streptomycin pro ml Medium sind. 2. Es wurde ein Transformationsprotokoll für das Screening mariner Bakterien auf die Fähigkeit zur DNA-Aufnahme durch natürliche Transformation etabliert. Es wurden drei Vektoren pM1, pM2 und pM3 konstruiert, die eine Übertragung und stabile Insertion von Antibiotikaresistenz-Markergenen und dem zur Detektion eingesetzten gfp-Gen durch homologe Rekombination flankierender rDNA-Bereiche mit dem rDNA-Operon des Rezipienten ermöglichten. 3. Unter Einsatz dieser Vektoren wurde die Transformierbarkeit von 83 marinen Isolaten überprüft. Diese Analysen führten zur Identifizierung von vier transformierbaren Isolaten. Bei diesen Isolaten handelt es sich um Marinobacter sp., K. rosea, P. phosphoreum und P. marincola Stämme.
Einleitung Das zentrale Nervensystem ist aufgrund seiner geringen Ischämietoleranz ein besonders gefährdetes Organsystem des Körpers während herzchirurgischer Eingriffe. Die vorliegende Dissertation überprüft anhand eines Schweinemodells, ob ein Zusammenhang zwischen retinaler und zerebaler Blutströmungsgeschwindigkeit, repräsentiert durch die SLDF gemessene Blutströmung in der Retina und durch den transkraniellen Doppler (TCD) gemessenen Fluss über die Arteria cerebri media vor, während und nach extrakorporaler Zirkulation (EKZ) besteht und somit der SLDF als Überwachungsmethode der zerebralen Durchblutung eingesetzt werden kann. Das Ziel dieser Untersuchung ist eine erste Validierung des SLDF als eine Messmethode der zerebralen Blutströmung während herzchirurgischer Eingriffe in einem Tiermodell. Materialien und Methoden Nach der Genehmigung durch die zuständige Tierschutzkommision wurden 6 Hausschweine (Yorkshire Duroc, männlich und weiblich) mit einem mittleren Gewicht von 37,3 ± 9,4 kg in diese Untersuchung aufgenommen. Eine transkranielle Dopplersonde (EME Nicolet Pioneer TC 4040) wurde über der rechten Arteria cerebri media fixiert. Zur Erhebung der retinalen Blutströmungsgeschwindigkeit wurde über dem rechten Auge die Scanning Laser Doppler Flowmetrie (SLDF) platziert. Die Messungen wurden vor (T1=nach 30 minütiger Anästhesie; T2=nach 30 minütiger Anästhesie vor der EKZ unter 100%iger Ligatur der Vena cava inferior), während (T3=10 Minuten nach Beginn der EKZ; T4=Ende der zweistündigen EKZ) und nach (T5=60 Minuten nach Beendigung der EKZ; T6=60 Minuten nach Beendigung der EKZ unter 100%iger Ligatur der Vena cava inferior) einer ACVB-Operation unter extrakorporaler Zirkulation (EKZ) durchgeführt. Ergebnisse Signifikante Korrelationen in der Spearman-Rang Korrelation und in der Regressionsanalyse zwischen der retinalen Blutströmung (detektiert durch den SLDF) und der Blutströmung in der A. cerebri media (detektiert durch den TCD) sind vor (T1, T2), während (T3) und nach der EKZ (T5, T6) vorhanden. Lediglich zum Messzeitpunkt T4 konnte keine Korrelation nachgewiesen werden. Schlussfolgerung Diese Untersuchung zeigt, dass sich vor, während und nach der EKZ die retinale Blutströmung und die Blutströmung in der A. cerebri media gleichwertig verhalten. Die fehlende Korrelation zwischen der Blutströmung in der A. cerebri media detektiert durch den TCD zur retinalen Blutströmung kurz vor Ende der EKZ während des Zeitpunktes T4, ist auf die sich ändernden Durchmessern der Kapillaren in der Retina bei nahezu unveränderter Durchmesser an den großen Gefäßen, wie der A. cerebri media zurückzuführen. Da die Regulation der Durchblutung überwiegend in den Kapillaren stattfindet, stellt sich die Frage, ob die SLDF nicht doch eine exaktere Aussage bezüglich der retinalen und somit der zerebralen Blutströmung zulässt. Die Messung des TCD über die A. cerebri media und deren Aussagekraft über die zerebrale Durchblutung wird seit Jahren von einigen Autoren angezweifelt und in diversen Studien als ungenau bezeichnet. Durch den Einblick in die kapillaren Systeme der Retina ist die Möglichkeit gegeben, in die Regulationsvorgänge der Gefässe einzusehen, um daraus auf die Durchblutung z.B. des Zerebrums Rückschlüsse zu erhalten. Welche dieser Messmethoden, die bisher etablierten Methoden TCD oder doch die neue Messmethode SLDF die Erfassung der zerebralen Durchblutung besser wiedergibt, muss in weiteren Studien evaluiert werden. Auch müssen untere Grenzwerte für die retinalen Blutströmung definiert werden, bevor diese Methode Einzug in den klinischen Alltag finden kann.
Camponotus ist die erfolgreichste Ameisengattung der Welt. Neben Pheidole und Crematogaster weist sie die meisten Arten, die höchste Dispersion und die größte Variabilität in morphologischer, ethologischer und ökologischer Hinsicht auf. Die Ursachen dieses Erfolges zu erkennen, war bisher nicht möglich, da nur fragmentarische Ergebnisse aus Freiland- und Laboruntersuchungen zur Verfügung standen. Die vorliegende Arbeit untersucht die Biologie und Ökologie ausgewählter Arten und gibt einen Einblick in die Komplexität ihrer Lebensstrategien. Um zu klären, welche ethologischen und ökologischen Anpassungen zur Gesamtfitness der Arten beitragen, wurden acht Arten der Gattung Camponotus in vier unterschiedlichen Habitaten ausgewählt. C. vagus und C. ligniperda in Laubmischwäldern Deutschlands, C. cruentatus und C. truncatus im mediterranen Klima der Pyrenäenausläufer Südfrankreichs, C. gombaki und C. gigas in offenen Park- und Uferregionen Malaysias sowie C. texens und C. gombaki im tropischen Sekundärwald der malaiischen Halbinsel. Das Verhalten dieser Arten wurde in den für das Überleben einer Kolonie zentralen Bereichen, nämlich Nisten, Außenaktivität und Nahrungserwerb untersucht. Als soziale Insekten sind Ameisen auf permanente und effektive Kommunikationssysteme angewiesen. Deshalb wurde die Rekrutierung, die mit Nestumzug und Nahrungserwerb im Zusammenhang steht, in das Untersuchungsprogramm aufgenommen. Unter Einbeziehung bereits publizierter Daten wird es möglich, den Erfolg von Camponotus zu verstehen. ...
NP25 wurde im Jahre 1994 als ein in allen Bereichen des zentralen Nervensystems Neuron-spezifisch exprimiertes Gen in der adulten Ratte identifiziert (Ren et al., 1994). Durch eigene Vorarbeiten konnte diese selektive neuronale Expression im Huhnembryo bestätigt werden, wobei die Expression von NP25 im Neuralrohr, den sympathischen paravertebralen Ganglien und sensorischen Hinterwurzelganglien vor der terminalen Differenzierung und Scg10-Expresison beginnt (M.Pape, Diplomarbeit, 2003). In dieser Arbeit konnte nun gezeigt werden, dass NP25 in diesen Geweben nach den proneuralen Faktoren Ascl1 und Ngn2 exprimiert wird, zu einem Zeitpunkt an dem die Vorläuferzellen mit der Differenzierung beginnen. Im Neuralrohr beginnt die Expression von NP25 zeitgleich mit der Expression von NeuroM, einem der frühesten Marker für junge, postmitotische differenzierende Neurone (Roztocil et al., 1997). NP25 stellt somit einen der frühesten panneuronalen Marker für differenzierende Neurone dar. Das NP25-Protein ist in den Zellkörpern und Fortsätzen der Neurone im Neuralrohr und den untersuchten peripheren Ganglien lokalisiert, wobei die Fasern der Motoneurone, im Gegensatz zu deren Zellkörpern, NP25-negativ sind. Mit voranschreitender Differenzierung nimmt die NP25- Proteinkonzentration ähnlich wie die Expression auf mRNA-Ebene ab, wobei in den peripheren Ganglien NP25 über einen längeren Zeitraum hinweg auf hohem Niveau exprimiert wird. Kultivierte Neurone aus sensorischen Hinterwurzelganglien und sympathische Neurone der paravertebralen Ganglien zeigen eine Lokalisation des NP25-Proteins im Zytoplasma der Zellkörper und Fortsätze, wobei NP25 in den sympathischen Neuronen wesentlich stärker exprimiert wird. Dieser Befund konnte durch die Analyse der Proteinkonzentration mit Hilfe der Western Blot Methode bestätigt werden. Die Überexpression von NP25 in verschiedenen Zelltypen führte zu verstärktem oder reduzierten Neuritenauswachsen, wobei die Effekte mit dem NP25-Niveau korrelieren. Zellen mit einem geringen endogenen NP25-Expressionsniveau, wie sensorische Neurone aus fünf Tage alten Huhnembryonen und PC12-Zellen, reagieren auf die Erhöhung des NP25-Gehalts mit verstärktem Längenwachstum der Neuriten, während sympathische Neurone aus sieben Tage alten Huhnembryonen, die ein hohes endogenes Expressionsniveau aufweisen, reduziertes Längenwachstum und reduzierte Verzweigungskapazität zeigen. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass maximales Neuritenwachstum eine optimale NP25-Konzentration erfordert, wobei im Falle der Überexpression von NP25 in den sympathischen Neuronen das Optimum überschritten wird und dadurch Neuritenauswachsen und Verzweigung inhibiert werden. Die Effekte auf das Längenwachstum der Neuriten in den primären Neuronen konnten durch RNAi Experimente bestätigt werden. Neben dem Längenwachstum war auch das initiale Auswachsen von Fortsätzen durch die Veränderung des NP25-Expressionsniveaus betroffen. Im Falle der PC12-Zellen induzierte die NP25-Überexpression nicht nur Längenwachstum der Neuriten, sondern auch die Zahl der Fortsätze pro Zelle wurde erhöht. In den sympathischen Neuronen, in denen durch NP25- Überexpression das Längenwachstum und die Verzweigungskapazität negativ reguliert werden, nimmt die Anzahl der Neuriten pro Zellen nach Erniedrigung des NP25-Expressionsniveaus ebenfalls ab. Dies kann dadurch erklärt werden, dass Längenwachstum und initiales Auswachsen von Neuriten durch unterschiedliche Mechanismen reguliert werden (Glebova and Ginty, 2005; Luo, 2002), was hier möglicherweise dazu führt, dass Längenwachstum negativ und initiales Auswachsen positiv durch NP25 beeinflusst wird. In den sensorischen Neurone führte weder die Erhöhung noch die Erniedrigung des NP25-Expressionsniveaus zu einer Veränderung des initialen Auswachsens, was eine differentielle Regulation der Prozesse bestätigt. Da viele Mitglieder der CaP-Proteinfamilie mit F-Aktin interagieren (Gimona et al., 2002) wurde untersucht, ob NP25 und F-Aktin in kultivierten sympathischen und sensorischen Neuronen und in PC12-Zellen kolokalisieren. In den primären Neuronen wurde im Gegensatz zu der Situation in den PC12-Zellen keine Kolokalisation beobachtet, wobei NP25 und F-Aktin in den PC12-Zellen nur in kleinen Bereichen an den distalen Enden filopodienartiger Fortsätze kolokalisieren. Auch eine Interaktion von NP25 und G-Aktin konnte in den PC-Zellen ausgeschlossen werden. Durch die Identifikation zweier RhoGAP-Proteine (NIRGAP1 und 2) als potentielle Interaktionpartner (M.Geissen, nicht publiziert) könnte NP25 Neuritenauswachsen durch indirekte Beeinflussung des Aktinzytoskeletts über Rho-Signalwege regulieren. Die identifizierten RhoGAPs konnten durch in situ Hybridisierung im Rückenmark, in den Hinterwurzelganglien und den sympathischen paravertebralen Ganglien im Rattenembryo nachgewiesen werden. Sie gehören zu keiner bekannten Familie und unterscheiden sich auch strukturell von den meisten bisher beschriebenen RhoGAPs, da sie mehr als eine (drei) GAP-Domänen enthalten. Durch diesen Befund ergeben sich neue Ansätze für die weiteren Untersuchungen zur Regulation des Neuritenwachstums durch NP25. Da im adulten Nervensystem für NP25 eine Funktion in der Dynamik der Dendriten angenommen wird, sind Untersuchungen der Dendritenausbildung in vitro ebenfalls nahe liegend.
In der vorliegenden Arbeit konnte das Subkompartiment der synaptischen aktiven Zone erstmals in der für Proteomstudien erforderlichen Qualität aufgereinigt werden. Nach Präparation des Gesamthirns der Ratte wurden über verschiedene Homogenisations- und Zentrifugationschritte Synaptosomen gewonnen, die durch einen hypoosmotischen Schock zum Platzen gebracht wurden. Der Inhalt, vornehmlich synaptische Vesikel, wurde in einem Saccharosedichtegradienen aufgetrennt. Die Analyse dieses Gradienten bestätigte, dass sich in den unteren, dichteren Fraktionen (Fraktionen 28-34) Elemente synaptischer Vesikel und auch der Plasmamembran befanden. Damit war eine wichtige Grundvoraussetzung für eine nachfolgende Proteomuntersuchung gedockter synaptischer Vesikel erfüllt. Die Analyse dieser Fraktionen durch Western-Blot und mittels Transmissionselektronenmikroskopie zeigte aber auch, dass sie diverse Organellmarker enthielten und insgesamt eine heterogene Zusammensetzung von membranären Strukturen zeigten. Daher folgte als weiterer Aufreinigungsschritt eine immunmagnetische Trennung mit monoklonalen Antikörpern gegen das ubiquitäre integrale Protein synaptischer Vesikel, SV2. Die hohe Reinheit der resultierenden Fraktion gedockter synaptischer Vesikel konnte durch elektronenmikroskopische Analysen und proteinchemische Methoden (2D BAC-/SDS-PAGE und Western Blot) nachgewiesen werden. Die Optimierung der Integrität der verwendeten Proben erlaubte eine funktionelle Zuordnung der durch die hochsensensitiven massenspektrometrischen Analysen identifizierten Proteine. Zur Proteinidentifikation wurden zwei verschiedene Methoden herangezogen: die zweidimensionale BAC-/SDS-PAGE mit anschliessender MALDI-TOF Analyse und die eindimensionale SDS-PAGE mit nachfolgender nanoLC ESI MS/MS. Beide Methoden ergänzten sich; generell wurde über die zweite Methode eine größere Anzahl von Proteinen identifiziert. Durch die Verwendung und Kombination der verschiedenen massenspektrometrischen Methoden und unterstützt durch eine Western Blot Analyse konnten insgesamt 245 Proteine identifiziert werden. Dabei handelte es sich um (i) integrale synaptische Vesikelproteine, (ii) transient mit synaptischen Vesikeln assoziierte Proteine, (iii) Proteine der Plasmamembran und Zelloberfläche, (iv) Signalkaskadenproteine und kleine GTPasen, (v) Proteine des Zytoskeletts, (vi) glykolytische und andere metabolische Enzyme, sowie (vii) Chaperone und (viii) mitochondriale Proteine. Im zweiten Teil der Arbeit wurden ausgewählte Proteine genauer untersucht. Die Analyse der löslichen Proteine WK1 und WK2 zeigten in Genexpressionsstudien eine ubiquitäre Gewebeverteilung. Rekombinante Proteine wurden in Zelllinien exprimiert, um einen Einblick in deren subzelluläre Lokalisierung zu erhalten. Die Expressionsanalyse der integralen Transmembranproteine zeigte für alle Kandidaten eine neuronale Expression der mRNA. Für jeden der Kandidaten wurden individuelle Genexpressionsmuster im Hirn beobachtet. Gegen zwei der Kandidatenproteine konnten funktionelle Antikörper erzeugt werden. Die Immunomarkierung mit anti-Ttyh1-Antikörpern zeigt eine hochspezifische Färbung der Fasertrakte in verschiedenen Hirnarealen sowie eine neuronale Lokalisation in Primärkulturen des Hippokampus und des Neokortex der Ratte. Lingo1-Immunfärbungen markierten selektiv Nervenzellen des limbischen Systems und Mitralzellen des Bulbus olfactorius. Diese Studie führt konsequent die Idee der spezifischen Aufreinigung von Vesikelkompartimenten der Synapse weiter: Mit der Einführung eines hochaffinen immunchemischen Anreicherungsschrittes in dem Aufreinigungsprozess wird dem bisherigen Methodenarsenal zur Spezifizierung der Probe über physiko-chemische Parameter eine neue Dimension hinzugefügt: Die molekulare Identität.
Die Replikation und Pathogenese von HIV ist in hohem Maße von zellulären Faktoren abhängig. Das Virus muss einerseits die protektiven und antiviralen Abwehrmechanismen der Wirtszelle umgehen können und gleichzeitig ist seine Replikation an die Nutzung zellulärer Faktoren adaptiert. Neben der Interaktion mit konstitutionell exprimierten zellulären Proteinen bewirkt das HI-Virus auch eine transkriptionelle Regulation zellulärer Gene, um sich einen für seine Replikation vorteilhaften Funktionszustand der Wirtszelle zu schaffen. Durch eine HIV-Infektion differentiell exprimierte Gene stellen daher potentielle Kandidatengene zur Identifizierung essentieller Wirtsfaktoren oder zellulärer Restriktionsfaktoren der HIV-Replikation dar. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die durch HIV-Infektion differentiell regulierten Gene LEREPO4, GLiPR, SCC-112 und Moesin auf eine mögliche Funktion bei der HIV-Replikation analysiert. Dabei wurden diese durch RNA Interferenz (RNAi) im Kontext einer HIV-Infektion reprimiert. Als zelluläres Modellsystem wurden P4-CCR5-Zellen verwendet, bei denen eine Infektion mit dem Virusstamm HIV-1Bru eine Induktion der Gene LEREPO4, GLiPR und Moesin sowie eine Repression von SCC-112 bewirkte. Die RNA-Interferenz vermittelte Suppression dieser Gene erfolgte durch Applikation von synthetischen siRNA Oligonukleotiden oder durch intrazelluläre Expression von short hairpin RNAs (shRNA). Durch den Einsatz von shRNAs konnte jedoch unter den vorliegenden Versuchsbedingungen nur eine unzureichende Gensuppression erreicht werden. Aus diesem Grund wurden synthetische siRNA Oligonukleotide verwendet. Es konnte eine deutliche Reduktion der jeweiligen Zielgene bewirkt werden, ohne dass nennenswerte Effekte auf den Phänotyp und die Viabilität der Zellen beobachtet wurden. Der Einfluss der siRNA-vermittelten Gensuppression auf die HIV-Replikation wurde durch Infektion der Zellen ermittelt. Hierbei zeigte sich, dass die Depletion von GLiPR und LEREPO4 eine deutliche Inhibition der HIV-Replikation bewirkte. Das Ausmaß der Inhibition war ähnlich ausgeprägt, wie durch Verwendung einer bereits publizierten, gegen das virale Gen p24 gerichteten siRNA. Die Depletion von SCC-112 hatte im Gegensatz hierzu keine eindeutige Wirkung auf die HIV-Replikation, so dass nicht ausgeschlossen werden kann, dass seine Repression während einer HIV-Infektion ein unspezifischer bzw. sekundärer Effekt ist. Die siRNA-vermittelte Suppression von Moesin führte zu einem unerwarteten Ergebnis, da eine deutliche Steigerung der HIV-Replikation im Vergleich zur Kontrolle festgestellt wurde. Damit konnte erstmals belegt werden, dass Moesin nicht für die HIV-Replikation benötigt wird, wie es durch andere Arbeiten postuliert wurde. Diese Annahme begründete sich auf der Beobachtung, dass Moesin in Viruspartikel inkorporiert wird. Daher wurde eine Beteiligung an der Zusammenlagerung oder Abschnürung viraler Partikel vermutet. Die in dieser Arbeit ermittelten Ergebnisse lassen vermuten, dass LEREPO4 und GLiPR notwendige Faktoren der HIV-Replikation sind, wohingegen Moesin einen negativen Effekt zu vermitteln scheint. Die zugrunde liegenden Mechanismen dieser Wirkung auf die HIVReplikation sind jedoch weitgehend unklar. Da die Proteine LEREPO4, SCC-112 und GLiPR nicht oder nur unzureichend charakterisiert sind, war ein weiteres Ziel dieser Arbeit zelluläre Funktionen dieser Proteine zu ermitteln, um Rückschlüsse auf ihre Funktion bei der HIV-Replikation zu gewinnen. Es konnten polyklonale Antikörper gegen LEREPO4 generiert werden, mit denen eine Bestimmung der zellulären Lokalisation möglich war. Mittels Co-Immunopräzipitation wurde die Interaktion von LEREPO4 und TRAF-2 nachgewiesen. Die Bestimmung des Einflusses von LEREPO4 auf die NF-κB-Aktivierung lässt vermuten, dass LEREPO4 an der TRAF-vermittelten Signaltransduktion beteiligt ist. Untersuchungen zur Funktion von GLiPR zeigten, dass es sich möglicherweise um ein sekretorisches Protein handeln könnte, wie durch den fluoreszenzmikroskopischen Nachweis eines GLiPR-EGFP-Fusionsproteins in HeLa-Zellen ermittelt wurde. Weiterhin konnte mittels Annexin-V-Färbung und TUNEL-Assay belegt werden, dass eine exogene Expression des GLiPRs in HeLa Zellen zu einem deutlichen Anstieg der Apoptoserate führte. Zusätzlich wurden für jedes Protein Genexpressionsprofile nach siRNA vermittelter Repression mittels Microarray-Analyse erstellt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass LEREPO4 und GLiPR mögliche Kofaktoren der HIV-Replikation darstellen. Im Gegensatz hierzu scheint Moesin einen negativen Effekt zu vermitteln. Auf Grundlage der in dieser Arbeit ermittelten Daten können weiterführende Untersuchungen durchgeführt werden, um die genaue Funktion der oben genannten Proteine bei der HIV-Replikation zu klären.
Lichtsensitive Proteine bzw. Photorezeptoren eignen sich hervorragend für das Studium des Zusammenhangs von Proteinstruktur und –funktion. Lichtrezeptorproteine werden leicht durch Licht angeregt, wodurch eine gute Zeitauflösung für deren Untersuchung erreicht werden kann. Weiterhin sind sie als Signalproteine während der Etablierung des aktiven Zustandes und dessen Zerfalls großen konformationellen und strukturellen Änderungen unterworfen. Ausgehend von diesen Eigenschaften wurde bereits eine große Zahl von Lichtrezeptorproteinen genauer untersucht. Diese vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit lichtinduzierten konformationellen Änderungen in Membranproteinen. Dafür wurden drei verschiedene Systeme herangezogen: das kleine α-helikale Peptid Gramicidin A, der G-Protein gekoppelte Rezeptor Rhodopsin and die BLUF (blue light using FAD) Domäne des hypthetischen Membranproteins Blrp (blue-light regulated phosphodiesterase) aus E. coli. Gramicidin A (gA) ist ein aus dem Bodenbakterium B. brevis isoliertes Antibiotikum, das Transportkanäle für einwertige Kationen wie Lithium, Natrium und Kalium ausbildet. Gelöst in Detergenzmizellen, wurde für gA unerwartet eine Wechselwirkung mit Blaulicht fest gestellt (Abbildung 1). Diese Beobachtung wurde mit statischen und zeitaufgelösten NMRspektroskopischen Methoden genauer untersucht und ist in Kapitel 2 näher beschrieben. Basierend auf den gewonnenen Erkenntnissen wird postuliert, dass einer der Tryptophanreste (Trp9) eine lichtinduzierte konformationelle Änderung erfährt. Ausgehend von der Konformation in Lösung befindet sich die Seitenkette von Trp9 in einem Gleichgewicht (70:30) mit einer zweiten Konformation. Bei der zweiten Konformation handelt es sich möglicherweise um die Orientierung, die der Tryptophanrest unter Festkörper-NMR Bedingungen einnimmt. Die Lebensdauer der neuen Konformation beträgt in etwa eine Sekunde. Der G-Protein gekoppelte Rezeptor Rhodopsin ist verantwortlich für die Verarbeitung von Lichtsignalen in den Stäbchenzellen der Retina. Die Absorption eines einzelnen Photons führt zur Isomerisierung des kovalent gebundenen Chromophors 11-cis-Retinal, wodurch konformationelle Änderungen im Protein veranlasst werden. Der aktivierte Metarhodopsin II (MetaII) Zustand induziert eine Enzymkaskade und schließlich einen Nervenimpuls, das Säugern das Kontrastsehen ermöglicht. Eine große Bandbreite an hochauflösenden NMRspektroskopischen Methoden, (einschließlich zeitaufgelöster und Festkörper-NMR Methoden) wurde im Laufe dieser Arbeit angewandt, um Konformation und Dynamik von bovinem Rhodopsin näher zu untersuchen. In Kapitel 3.1 sind zu Beginn mehrere Optimierungsschritte im Hinblick auf ein kostengünstiges, isotopenmarkiertes Säugerzellenmedium beschrieben. In diesem Zusammenhang wurden mehrere Rhodopsin NMR-Proben hergestellt, wobei der Gehalt an isotopenmarkierten Aminosäuren ca. 50% betrug. Anhand dieser Proben konnte bewiesen werden dass sich mit Lösungs-NMR-Spektroskopie auch sehr große, in Detergenzmizellen stabilisierte Membranproteine (~150 kD Gesamtmasse) detailliert studieren lassen. Die Untersuchungen konzentrierten sich auf den C-Terminus, für den nach sequentieller Zuordnung (Abbildung 2a) und heteronuklearern Relaxationsmessungen ein Mobilitätsverhalten bestimmt wurde, das dem mittelgroßer Proteine ähnelt. Des Weiteren konnten keinerlei definierte Strukturelemente innerhalb des C-Terminus identifiziert werden, u.a. durch einen Vergleich mit eines 19mer Peptids, dessen Primärsequenz des Rhodopsin C-Terminus entspricht (Abbildung 2a und 2b). In Kapitel 3.2 wird die nichtinvasive Zuordnung der Rückgratresonanzen aller fünf Trytophane mit Hilfe einer Kombination aus Lösungs- und Festkörper-NMR beschrieben. Dazu wurden verschiedene Rhodopsinproben hergestellt, die alle möglichen 13C’i-1-Carbonyl/15Ni-Tryptophan isotopenmarkierten Amidpaare enthielten. Eine Teilzuordnung der Tryptophanindolsignale konnte in Lösung durch Protonen-/Deuteriumaustausch und heteronukleare Relaxationsmessungen erreicht werden. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Kombination aus Lösungs- und Festkörper-NMR-Spektroskopie sehr gut geeignet ist um komplementäre Informationen zu strukturellen und dynamischen Eigenschaften von Rhodopsin zu liefern. Fehlende Zuordnungen in den Lösungspektren konnten durch den Verglich mit Festkörperspektren ergänzt werden und umgekehrt (Abbildung 3). In Kapitel 3.3 ist die erfolgreiche Adaption der zeitaufgelösten NMR-Spektroskopie für die Untersuchung des Rhodopsin MetaII Zerfalls in vitro beschrieben. Die zeitaufgelösten protonendetektieren NMR-Experimente wurden mit unmarkiertem, in Detergenzmizellen stabilisiertem Protein bei verschiedenen Temperaturen aufgenommen, wobei sich die anschließende Auswertung auf die stark tieffeldverschobene Indolregion konzentrierte (Abbildung 4). Für die berücksichtigten Signale traten nach Induktion des aktivierten Zustandes deutliche chemische Verschiebungsänderungen auf, außerdem zeigten sie unterschiedlich schnellen MetaII Zerfall. Zusätzlich zu der erwarteten Zeitkonstante des MetaII Zerfalls (~6 min bei 298 K) konnte erstmalig eine zweite, ca. zehnmal langsamere Zeitkonstante bestimmt werden. Diese zweite Zeitkonstante ist möglicherweise ein Ausdruck für die langsame Entfaltung von Sekundärstrukturelementen nach dem Zerfall des Proteins in Opsin und Retinal. Die BLUF-Domänen verwenden Flavinadeninnukleotid (FAD) als Chromophor und gehören zu der Familie der Blaulichtrezeptoren. In Kapitel 4 wird die Untersuchung des lichtadaptierten Zustandes der E. coli BLUF Domäne auf Protein- und Ligandenebene mit zeitaufgelösten proton- und phosphordetektierten NMR-Experimenten beschrieben. In Abbildung 5 sind die statischen Licht- und Dunkelspektren (jeweils licht- und dunkeladaptiert) dargestellt. Im Folgenden konnte durch Beobachtung der Dunkeladaption bei verschiedenen Temperaturen die Aktivierungsenergie des Lichtzustandes bestimmt werden. Des Weiteren wurden zum ersten Mal phosphordetektierte NMR-Experimente erfolgreich angewandt, um einen biologisch relevanten Vorgang zeitabhängig näher zu bestimmen.
Meliolaceae aus Panama
(2006)
Die Meliolaceae (Meliolales, Ascomycota), die auch „Schwarze Mehltaupilze“ (dark oder black mildews) genannt werden, umfassen weltweit ca. 1583 bekannte Arten in 20 Gattungen. Meliolaceae-Arten kommen hauptsächlich in den Tropen vor. Es handelt sich um obligate Parasiten auf Pflanzen, die über 330 verschiedenen Pflanzenfamilien angehören. Von August 2002 bis September 2005 wurden Meliolaceae-Arten mit ihren Wirtspflanzen in Panama hauptsächlich im Westen des Landes gesammelt. Die Wirtspflanzen wurden bestimmt. In Rahmen dieser Arbeit wurden 90 Belege von schwarzen Pilzen auf Blättern lichtmikroskopisch untersucht. Von diesen stellten sich 69 Belege als mit Meliolaceae-Arten parasitierte Blätter heraus. 55 der Belege mit Meliolaceae-Arten wurden bis zur Art bestimmt. Die restlichen 14 Belege waren problematisch zu bestimmen, weil die Meliolaceae von Hyperparasiten befallen waren. Die 55 Belege repräsentieren 42 verschiedene Meliolaceae-Arten, nämlich vier Appendiculella-Arten, sechs Asteridiella-Arten, fünf Irenopsis-Arten und 27 Meliola-Arten. Fünf neue Meliolaceae-Arten wurden im Rahmen dieser Arbeit entdeckt, drei Appendiculella-Arten, eine auf Lozanella enantiophylla (Ulmaceae/Cannabaceae), eine auf Cupania guatemalensis (Sapindaceae) bzw. eine auf Monstera deliciosa (Araceae), eine Asteridiella Art auf Buddleja nitida (Buddlejaceae), eine Irenopsis-Art auf Chrysophyllum sp. (Sapotaceae). Außerdem werden 21 Meliolaceae-Arten zum ersten Mal für Panama nachgewiesen: Appendiculella calostroma, Asteridiella formosensis, A. hymenaeicola, A. solanacearum, A. vegabajensis, Irenopsis miconiicola, Meliola anacardii, M. byrsonimicola, M. cf. cucurbitacearum, M. crescentiae, M. dissotidis, M. gesneriae, M. indica, M. lanosa, M. lundiae, M. mammeae, M. nigra, M. ocoteicola, M. cf. orchidacearum, M. pisoniae und M. ripogoni. Nur 16 der 42 gesammelten Meliolaceae-Arten sind schon für Panama bekannt. Die vorherige Anzahl der bekannten Meliolaceae-Arten für Panama lag bei 105 Arten. Nach dieser Untersuchung liegt diese Anzahl bei 131 Arten. Für das Nachbarland Costa Rica liegt diese Anzahl bei 84 Arten, und beide Ländern teilen nur 25 bekannte Meliolaceae-Arten. Die untersuchten Meliolaceae-Arten parasitieren Arten aus 36 verschiedenen Gattungen der Pflanzen, die zu 30 verschiedenen Pflanzenfamilien gehören. Für bekannte Meliolaceae-Arten werden 31 Wirtspflanzen-Arten zum ersten Mal für Panama nachgewiesen. Von diesen gehören vier zu Gattungen, von denen bisher keine Wirtsarten für Meliolaceae bekannt waren, nämlich Attalea (Arecaceae) für Meliola melanococcae, Crucea (Rubiaceae) für Asteridiella vegabajensis, Phinaea (Gesneriaceae) für M. gesneriae und Rytidostylis (Cucurbitaceae) für M. cf. cucurbitacearum. Im Vergleich zu Indien mit der größten Anzahl bekannter Meliolaceae-Arten (461) gibt es andere tropische Länder, in denen die Anzahl der bekannten Meliolaceae bisher null ist, weil diese Gruppe dort noch nicht erforscht worden ist. Durch die vorliegende Arbeit wird deutlich, dass die Meliolaceae in den Tropen höchst divers und bisher nur ansatzweise erforscht worden sind.
Die ribosomal synthetisierten und posttranslational modifizierten antimikrobiellen Peptide Subtilin aus B. subtilis und Nisin A aus L. lactis gehören zur Klasse der lanthioninhaltigen Bakteriocine, die als Lantibiotika bezeichnet werden. Die Regulation der Biosynthese beider Lantibiotika unterliegt der dichteabhängigen Genregulation, die auch als Quorum Sensing bezeichnet wird. Dabei wirken die Peptide als Pheromon autoinduzierend auf die eigene Biosynthese durch Signaltransduktion über die Zwei-Komponenten-Regulationssysteme SpaRK bzw. NisRK. Durch die Konstruktion und Anwendung zweier spezifischer Reportersysteme, die auf der transkriptionellen Induktion einer chromosomal integrierten PspaS-lacZ bzw. PnisA-gusA-Fusion beruhen, wurde die autoinduzierende Fähigkeit der Peptide sowohl qualitativ durch chromogene Analysen auf Agarplatten als auch quantitativ in Mikrotiterplatten spezifisch nachgewiesen. Beide Reportersysteme wurden zur Analyse von Struktur-Funktionsbeziehungen in Bezug zur autoinduzierenden Wirkung der Peptide verwendet. Dabei wurden neben dem Subtilinproduzenten B. subtilis ATCC 6633 acht weitere Subtilin-produzierende Bacillus-Stämme identifiziert. Durch die Konstruktion eines Expressionssystems zur Produktion von durch ortsgerichteter in vitro Mutagenese erstellten Subtilinvarianten bzw. Subtilin/Nisin AHybriden wurden mehr als 80 verschiedene Peptide durch rationales Design generiert. Deren Biosynthese wurde durch MALDI-TOF MS spezifisch nachgewiesen und hinsichtlich ihrer Wirkung als induzierende Peptide über beide Reportersysteme untersucht. Durch Überexpression des Responsregulators SpaR wurde eine Induktion der Promotorfusion unabhängig von der Autoinduktion durch die jeweiligen Peptide gezeigt. Dies ermöglicht die Produktion und Charakterisierung von induktionsdefizienten Varianten. Durch die Analysen der generierten Peptide wurde eine Beteiligung des N-terminalen Bereichs von Subtilin an der Sensierung durch die Histidinkinase SpaK identifiziert. Die in vivo Produktion von verkürzten Subtilinvarianten und proteolytische Analysen von Subtilin und Nisin A zur Generierung von N-terminalen Fragmenten der Peptide bestätigte die essentielle Rolle des Nterminalen Bereichs der Lantibiotika in Bezug zur Autoinduktion. Für beide Peptide und deren jeweilige N-terminalen Fragmente, bestehend aus den ersten zwanzig Aminosäuren, wurde keine Kreuzinduktion in den Reportersystemen zur Bestimmung der Autoinduktion festgestellt. Bei simultaner Applikation des nativen Induktors mit dem korrespondierenden Peptid bzw. den jeweiligen N-terminalen Fragmenten wurde eine signifikante Reduktion der vermittelten Enzymaktivität detektiert. Dieser Effekt wurde aufgrund der Inhibition der Signaltransduktion als Quorum Quenching bezeichnet und erstmalig für lantibiotische Peptide beschrieben. Da diese Reduktion durch die gleichzeitige Zugabe von Lipid II-bindenden Substanzen, wie Vancomycin und Bacitracin, nachgewiesen wurde, konnte erstmals eine Beteiligung von Lipid II an der Signalkaskade verdeutlicht werden. Lantibiotika wirken aufgrund hochaffiner Bindung an Lipid II und anschließender Porenbildung in der cytoplasmatischen Membran überwiegend antimikrobiell gegen Gram-positive Organismen. Da die Bindung an Lipid II über ein konserviertes Bindemotiv im Nterminalen Bereich der Peptide erfolgt, wird die Beteiligung von Lipid II an der Sensierung des externen Stimulus durch die Histidinkinase LanK unterstützt.
Die Alzheimer-Demenz (AD) ist gekennzeichnet durch extrazelluläre Ablagerungen bestehend aus dem Amyloidbeta-Peptid (Aß), durch neurofibrilläre Bündel bestehend aus dem Tau-Protein, massiven Neuronenverlust und synaptische Dysfunktion. Weiterhin ist bekannt, dass mitochondriale Dysfunktion eine entscheidende Rolle bei der AD spielt. Mit Hilfe von dissoziierten Hirnzellen von NMRI, Thy1-APP-, P301L Tau- und JNK-Knockout-Mäusen wurden Veränderungen, verursacht durch genetisch, alters- und geschlechtsbedingten Risikofaktoren, auf die mitochondriale Funktion untersucht. Die Abeta-Belastung der untersuchten Thy1-APP Mäuse führte zu einer mitochondrialen Fehlfunktion durch intrazelluläres Abeta und damit zu einem Energiedefizit. Aß hemmte die Atmungskette, vor allem die COX-Aktivität, indem es an die COX-Untereinheit bindet und damit die Anlagerung von Cytochrom C verhindert. Eine zusätzliche Mutation wie PS1M146L verursacht eine größere und früher einsetzende Abeta-Akkumulation im Gehirn der Mäuse und führte zu größerer mitochondrialer Schädigung im Vergleich zu den APP transgenen Mäusen. Der Grad der Abeta-Schädigung ist auch von dem Aggregationszustand von Abeta abhängig. Eine Akkumulation von intra- und extrazellulären Oligomeren reicht aus, um das mitochondriale Membranpotential zu erniedrigen. Die Aß-Belastung nimmt im Alter zu und es bilden sich ab dem 6. Monat Amyloid-Plaques im Gehirn der Thy1-APP Mäuse aus, die zu einem veränderten Verhältnis von Bcl-xL und Bax in Richtung Bax führten. Bax und Bcl-2 sind an der Bildung der mitochondrialen Pore beteiligt. Durch die Öffnung der mitochondrialen Pore sinkt das mitochondriale Membranpotential und die ATP-Spiegel. Bax begünstigt zusätzlich die Freisetzung von Cytochrom C und Smac. Der Abfall des mitochondrialen Membranpotentials, die geringen ATP-Spiegel und die Cytochrom C Freisetzung werden mit der Apoptose in Verbindung gebracht und erklären die erhöhte Empfindlichkeit der Mäuse gegenüber oxidativem Stress. Desweiteren muss die JNK3 berücksichtigt werden. Sie ist der mitochondrialen Fehlfunktion vorgeschaltet und löst eine degenerative Apoptose aus. Abeta und Tau werden bei der Entstehung von AD miteinander in Verbindung gebracht. Dieser Synergismus führt zu einer mitochondrialen Fehlfunktion im Kortex der Mäuse. Aufgrund des unveränderten Transmembranpotentials der dissoziierten Hirnzellen im Gehirn der Thy1APP Mäuse ab dem 6. Monat scheinen nur die aggregierten Polypeptide für die Neurotoxizität bei der AD eine Rolle zu spielen. Die COX-Aktivität wurde im Alter ebenfalls wieder verbessert und stabilisierte dadurch die ATPSpiegel. Die P301L-Taumäuse entwickeln ebenfalls erst im Alter neurofibrilläre Bündel (NFT) durch die Akkumulation von hyperphosphorylierten Tau. Ab dem 2. Lebensjahr der Mäuse wurde ein starker signifikanter Abfall des mitochondrialen Membranpotentials und der ATPSpiegel beobachtet. Der Anstieg der ROS-Spiegel der zwei Jahre alten Mäuse führte direkt zu einer Reduzierung der Komplex-I-Aktivität. Für diese Neurotoxizität scheint die Bildung der NFT verantwortlich zu sein. Die Wirkung von Ginkgo-biloba-Extrakt (EGb 761) und Piracetam auf die mitochondriale Fehlfunktion in jungen und alten NMRI-Mäusen untersucht. Eine Stabilisierung des mitochondrialen Membranpotentials und die Normalisierung der ATP-Spiegel konnte mit Hilfe von EGb 761 und Piracetam festgestellt werden. Besonders bei alten Mäusen konnte die schon angefangene mitochondriale Fehlfunktion fast komplett kompensiert werden. EGb 761 und Piracetam waren in der Lage nach zweiwöchiger Behandlung der APP transgenen Mäusen die löslichen Abeta-Spiegel im Gehirn signifikant zu senken. Durch diese Entlastung wurde die durch Abeta-verursachte Destabilisierung der mitochondrialen Membranen aufgehoben und die Mitochondrien vor oxidativen Schädigungen geschützt. Drei wichtige Angriffspunkte werden aufgrund der Daten für Piracetam vorgeschlagen: 1. die Senkung der Abeta-Spiegel im Gehirn, 2. die Stabilisierung der mitochondrialen Membranen und eine dadurch verbesserte Membranfluidität und 3. die Verbesserung der mitochondrialen Funktion vor altersbedingten Schädigungen. Die drei Punkte sind miteinander verknüpft, aufgrunddessen, dass Abeta die mitochondriale Membranen destabilisiert und dies zu einer mitochondrialen Fehlfunktion führen kann. Die neuroprotektiven Effekte von EGb 761 wurden durch 1. Senkung der Aß-Spiegel, 2. Mitochondrienmembranstabilisierende Wirkungen, 3. antioxidative Effekte, und 4. durch Modulation von Chloridkanälen hervorgerufen. In APP transgenen Mäusen wird trotz gleicher APP Expression in weiblichen Mäuse eine erhöhte Beta-Sekretasespaltung von APP mit verstärkter Bildung von C99 und Abeta (unlösliches und lösliches) im Vergleich zu den männlichen Tieren gebildet. Die in dieser Arbeit vorgestellten Daten zeigen, dass die erhöhten Abeta-Spiegel und der damit verbundene oxidative Stress in transgenen Mäusen zusätzlich die Mitochondrien der weiblichen Tiere besonders schädigen und die Atmungskette beeinträchtigen. Damit bestätigt sich, dass das Geschlecht ein weiterer Risikofaktor der AD ist. Daher unterstützen die im Rahmen dieser Doktorarbeit erhobenen Befunde grundsätzlich die weitere Erforschung pharmakologischer Ansätze besonders von Ginkgo-biloba-Extrakt und Piracetam zur Verbesserung kognitiver Störungen als Therapie oder auch zur Prophylaxe der Alzheimer Krankheit. Der Schutz von EGb 761 und Piracetam auf die Mitochondrien vor oxidativem Stress kann daher zur Vorbeugung vor allgemeinen Alterungsprozessen dienen. Abeta und Tau spielen zusammen beim Untergang der Neurone eine große Rolle. Therapien, welche die Ablagerungen von Abeta im Gehirn verringern, sollten in einem frühen Stadium der Krankheit besonders wirksam sein. In einem späteren Stadium wären hingegen zusätzlich Medikamente nötig, die gegen die neurofibrilläre Bündel gerichtet sind. Damit ließe sich theoretisch der fortschreitende Zelluntergang bei Alzheimerpatienten zu mindestens verlangsamen.
Die akute lymphatische Leukämie (ALL) ist eine aggressive Krankheit des hämatopoetischen Systems. Die Gegenwart des Philadelphia - Chromosoms (Ph), das die Translokation t(9;22) kodiert, oder die t(4,11) definieren Hochrisiko - ALL - Patienten mit einer besonders schlechten Prognose (Hoelzer and Gokbuget 2000; Hoelzer et al. 2002; Hoelzer et al. 2002)]. Das Ph Chromosom führt je nach Bruchpunkt der Translokation zur Expression von p185(BCR-ABL) oder p210(BCR-ABL). Die Fusion der Abl-Tyrosin Kinase an Bcr führt zur konstitutiven Aktivierung der Abl-Kinase, die hauptsächlich für die Transformation der Zellen verantwortlich ist. Die Überlebensrate durch aktuelle zytostatische Therapien der Ph+ ALL liegt bei 0-10%, trotz initialer Komplettremission (CR) von 80%, die ähnlich hoch wie die von Ph– Patienten ist. Imatinib (GleevecTM, GlivecTM, früher STI571) ist ein spezifischer Inhibitor der Abl – Kinase mit hoher Effizienz für die Behandlung der Ph+ ALL. Trotz der effektiven Hemmung von BCR-ABL durch Imatinib kommt es beinahe immer zum Rezidiv. Dies verschlechtert weiter die Prognose (Donato et al. 2004). Die Entstehung von Mutationen ist die häufigste Ursache für Resistenz gegen Imatinib, Nilotinib und/oder Dasatinib - Therapie. In dieser Arbeit wurden alternative Therapiestrategien für die Behandlung der ALL untersucht. Dazu wurden zwei Ansätze gewählt, wobei 1.) Gene identifiziert wurden, die zur Imatinib – Resistenz führen, um der Resistenzentwicklung vorzubeugen oder die Resistenz zu überwinden. Weiterhin wurde 2.) versucht die aberrante Transkription leukämischer Zellen zu verhindern. Dazu wurde die Inhibition der Histon – Deazetylierung, die für die aberrante Remodellierung des Chromatins verantwortlich ist, untersucht. ...
Der metabotrope Glutamatrezeptor Untertyp 4 gehört zusammen mit den Untertypen 6, 7 und 8 zur Gruppe III der metabotropen Glutamatrezeptoren (mGluRs). Diese präsynaptisch lokalisierten Rezeptoren sind an der Regulation der Neurotransmission an glutamatergen und nicht-glutamatergen Synapsen beteiligt. In der vorliegenden Arbeit sollten bisher unbekannte intrazelluläre Interaktionspartner für den metabotropen Glutamatrezeptor Untertyp 4 (mGluR4) identifiziert werden, um neue Erkenntnisse zur Regulation und Funktion dieses Rezeptors zu gewinnen. Dazu wurden Bindungsstudien mit Fusionsprotein aus Glutathion-S-Transferase (GST) und der kompletten C-terminalen Domäne des mGluR4 (mGluR4-C) durchgeführt. Die gebundenen Proteine wurden auf silbergefärbten SDS-Polyacrylamidgelen analysiert und anschließend über MALDI-TOF-Massenspektrometrie und Datenbank-gestützte Computerprogramme identifiziert. Außerdem wurden in Zusammenarbeit mit Dr. John Caldwell Proteine über Tandemmassenspektrometrie identifiziert. Mit diesem Ansatz konnten zwölf potentielle mGluR4-Interaktionspartner identifiziert werden. Die Bindung an mGluR4 konnte für drei dieser Proteine durch Immunoblotanalyse mit spezifischen Antikörpern bestätigt werden: für das Mikrotubuli-assoziierte Protein 1B (MAP1B), das stable tubule-only polypeptide protein (STOP-Protein) und, in geringerem Ausmaß, für die schwere Kette des nicht-muskulären Myosin II-B (MHCIIB). Die Interaktion zwischen mGluR4 und MAP1B wurde im folgenden näher charakterisiert. Bindungsstudien mit GST-Fusionsproteinen zeigten, daß MAP1B auch an die C-terminalen Domänen von mGluR6, mGluR7 und mGluR8 und damit an alle mGluRs der Gruppe III bindet. Für die mGluRs der Gruppe II konnte keine Interaktion mit MAP1B belegt werden. Weitere Bindungsstudien mit Deletionsmutanten konnten die für die MAP1B-Bindung verantwortliche Binderegion auf die 24 bzw. 38 N-terminalen Aminosäuren der C-terminalen Domänen von mGluR7 bzw. mGluR8 eingrenzen. Es wurde gezeigt, daß das Ca2+-abhängig an dieselbe Rezeptorregion bindende Calmodulin mit MAP1B um die Bindung an mGluR4 konkurriert. Immuncytochemische Experimente konnten eine partielle Kolokalisation von MAP1B und mGluR4 in transfizierten Säugetierzellen nachweisen. In kultivierten Primärneuronen konnte eine partielle Kolokalisation von endogenem mGluR4 mit endogenem MAP1B gezeigt werden. Die teilweise Überlappung der Immunreaktivitäten von mGluR4 und MAP1B läßt darauf schließen, daß eine Interaktion der beiden Proteine auch unter physiologischen Bedingungen möglich ist.
Ziele der vorliegenden Arbeit waren einerseits die Inventarisierung der Neo- und Archäophyten, die im Stadtgebiet von Frankfurt am Main im Zeitraum 1700-2006 nachweisbar sind, und die Analyse der Veränderungen während dieses Zeitraumes, andererseits die Untersuchung möglicher Auswirkungen von Neo- und Archäophyten auf die Biodiversität am Beispiel von Brachestandorten. Zur Inventarisierung wurde eine Kombination aus Literatur- und Herbarrecherche im Herbarium Senckenbergianum (FR) mit Feldarbeit in Form einer Rasterkartierung zwischen September 2002 und September 2005 mit Nachträgen aus dem Jahr 2006 durchgeführt. 609 Arten (unter Berücksichtigung von Unterarten/Varietäten 634 Sippen) aus 84 Familien wurden über den Gesamtzeitraum nachgewiesen, wobei mehr als 75 % der Sippen zu 20 Familien gehören. Die erfassten Sippen wurden nach ihrer Einwanderungsgeschichte, Einwanderungsweise und ihrem Einbürgerungsgrad bewertet. 54 % aller Sippen erwiesen sich als Ergasiophygophyten. Aktuell wurden 462 anthropochore Sippen nachgewiesen. Die Familie mit den meisten anthropochoren Vertretern sind sowohl aktuell als auch im Gesamtzeitraum die Asteraceae, die auch auf Brachen eine heruasragende Stellung einnehmen. Der gesamte Untersuchungszeitraum wurde in neun Abschnitte untergliedert. Die Häufigkeit jeder Sippe wurde für die einzelnen Abschnitte in einer sechsstufigen Skala, die sich an die Ergebnisse der Rasterkartierung anlehnt, eingeschätzt. Dadurch wurde es erstmals möglich die starke Zunahme der Neophyten in der Stadtflora sowie den Rückgang von Archäophyten für einen Zeitraum von 300 Jahren quantitativ darzustellen. Untersuchungen zur Diversität erfolgten auf Brachestandorten im Stadtgebiet. Dazu wurden 2003 und 2004 insgesamt 220 Vegetationsaufnahmen nach Braun-Blanquet durchgeführt. Die Probeflächen wurden nach geschätztem Alter in vier Kategorien unterteilt und mit Hilfe von Diversitätsindizes (Evenness, Simpsonund Shannon-Index) verglichen. Es zeigte sich, dass die Diversität auf jungen, d.h. 1-2 Jahre alten Brachen, am höchsten ist und mit zunehmendem Alter abnimmt. Brachen, die erst im Untersuchungsjahr angelegt worden waren, zeigten die größte Variabilität. Auf nährstoffreichen Böden war die Diversität besonders hoch, auf nährstoffarmen Böden extrem niedrig. Brachen, die älter als 5 Jahre waren, zeigten die geringste Diversität und die niedrigsten Zahlen von Archäo- und Neophytenarten. Die höchste Gesamtartenzahl auf 25 m² betrug 58, wobei maximal 16 Archäophyten- und 19 Neophytenarten, im Mittel jedoch nur drei Archäophyten- und vier Neophytenarten, nachgewiesen wurden. Zwischen der Gesamtartenzahl auf Brachen und der Artenzahl von Neo- und Archäophyten ließ sich kein signifikanter Zusammenhang feststellen. Allerdings sind Neophyten auf Brachen aller Altersklassen gleich erfolgreich, während Archäophyten ihren Schwerpunkt auf jungen Brachen haben und mit zunehmendem Brachealter zurückgehen. Die beiden am häufigsten auf Brachen gefundenen Sippen sind die indigenen Hypericum perforatum und Artemisia vulagris. Der Neophyt Fallopia x bohemica und das einheimische Calamagrostis epigejos sind als einzige im Untersuchungsgebiet in der Lage Einart-Bestände zu bilden. Andere, auf den ersten Blick von einer Art (z.B. Solidago canadensis) dominierte Flächen, wiesen bei näherer Untersuchung eine für Brachen durchschnittliche Diversität auf. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass jungen Brachen bis zum 3. Jahr eine besondere Bedeutung in der Stadtökologie zukommt. Sie bieten z.B. Segetalarten Lebens- und Rückzugsraum. Die Diversität alter Brachen beruht auf ihrem Mosaik verschiedener Lebensräume, die mit dieser Untersuchung nicht erfasst werden konnten.
(1) Die genomweite Expressionsanalyse von salzadaptierten Zellen von M. mazei Gö1 identifizierte eine Reihe von salzregulierten Genen. Neben den beiden Operone ota und abl, die für die Akkumulierung von Glycin-Betain und Ne-Azetyl-b-Lysin verantwortlich sind, konnte ein ABC-Transporter (MM0953), der in seiner Genumgebung weitere Transporter sowie Proteine mit konservierten S-Layer-Domänen aufweist, als salzreguliert erkannt werden. Dies deutet auf ein S-Layer-Exportsystem hin, das eine Rolle in salzadaptierten Zellen spielen könnte. (2) Eine genomweite Expressionsanalyse von Zellen von M. mazei Gö1 zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach einem hyperosmotischen Schock auf 400 mM NaCl ermöglichte Einblicke in den Verlauf der Genexpression. Die Erhöhung der externen Osmolarität resultierte in der erhöhten Expression von Genen, die für die Aufnahme und Biosynthese von kompatiblen Soluten verantwortlich sind sowie von Genen deren Produkte regulatorische Funktion haben könnten. (3) Genomweite Expressionsanalysen von Zellen von M. mazei Gö1 nach einem hypoosmotischen Schock zeigten erhöhte Expression von Genen, die an der Regulation und an der generellen Stressantwort beteiligt sind. Gene, deren Produkte im Stoffwechsel wichtig sind – besonders Gene, die für Methylamin-Corrinoid-Methyltransferasen kodieren – erscheinen stark reprimiert. (4) Die Bestimmung der intrazellulären Ionenkonzentrationen zeigte ein unspezifisches Einströmen von den Ionen, die den osmotischen Schock auslösen sofort nach dem Schock, sowie den Ausstrom derselben Ionen im Verlauf von 5 Minuten. Die Ionenkonzentrationen der Ionen, die den Schock auslösten, blieben intrazellulär erhöht. Das Ein- und Ausströmen der Ionen nach einem hyperosmotischen Stress ist nicht energieabhängig. (5) M. mazei akkumulierte nach einem hyperosmotischen Schock kein K+, zeigte aber eine erhöhte intrazelluläre Konzentration dieses Ions, wenn die Zellen in Medium mit erhöhter Osmolarität angezogen wurden. (6) Durch hyperosmotische Schocks mit verschiedenen Salzen und Zuckern konnte gezeigt werden, dass die kurzzeitige Akkumulation von Ionen keine gerichtete Antwort auf den osmotischen Stress ist. (7) Es konnte weiters gezeigt werden, dass Zellen von M. mazei Gö1, die mit dem kompatiblen Solut Betain inkubiert wurden, nach einem hyperosmotischen Schock K+ akkumulieren. Dies bedeutet möglicherweise eine K+-abhängige Regulation des Glycin-Betain-Transporters. (8) Die Funktion der drei im Genom kodierten Na+/H+-Antiporter konnte auf transkriptioneller Ebene nicht geklärt werden. Trotzdem zeigt ein Hydrophobizitätsplot des Proteins eine mögliche Beteiligung von Nha1 (MM0294) an der Osmoregulation durch eine hydrophile C-terminale Domäne. (9) Nach einem hyperosmotischen Schock von 38,5 auf 400 mM NaCl erhöhte sich die intrazelluläre Konzentration an Glutamat, das in M. mazei als kompatibles Solut fungiert, bereits nach drei Stunden. Zellen, die bereits an die erhöhte Salzkonzentration adaptiert waren, enthielten 1,4 μmol Glutamat/mg Protein. (10) Die Glutamin-Synthetase zeigte eine erhöhte Transkription nach einem hyperosmotischen Schock. Das Protein wird aber nicht salzabhängig produziert und zeigt keine Enzymaktivität. Die Biosynthese des Solutes über eine Glutamat-Dehydrogenase ist die wahrscheinliche Alternative. (11) Aufgrund der generierten Expressionsprofile und der physiologischen Daten konnte ein Modell der Osmoadaptation in Methanosarcina mazei Gö1 erstellt werden.
1. Die Deletionsderivate der Kompetenzproteine PilN und PilQ wurden als Fusionsproteine mit dem Maltosebindeprotein überproduziert, über eine Amylosesäule aufgereinigt und in nativer Form für die Generierung von polyklonalen Kaninchen-Antikörpern eingesetzt. 2. Unter Einsatz der spezifischen alpha-PilN- und alpha-PilQ-Antikörpern konnte das PilN-und PilQ-Kompetenzprotein im Rohextrakt von T. thermophilus HB27 detektiert werden. 3. Die Überprüfung bereits vorliegender Antikörper gegen die Kompetenzproteine PilM, PilW und PilA4 ergaben, dass es sich hier ebenfalls um spezifische Antikörper handelt. 4. Mittels Western-Blot-Analysen unterschiedlicher Mutanten konnte gezeigt werden, dass die Markerinsertion in den Genen pilM, pilN, pilO und pilW zu keinem polaren Effekt der jeweils stromabwärts gelegenen Gene führt. 5. Analysen der subzellulären Lokalisation der Kompetenzproteine ergaben, dass PilM und PilN ausschließlich in der inneren Membran lokalisiert sind, während PilW, PilQ und PilA4 sowohl in der inneren als auch äußeren Membran detektiert wurden. Die größte Menge an PilQ wurde allerdings in der äußeren Membran gefunden. 6. Mutantenstudien ergaben, dass eine pilQ-Mutantion zur Abwesenheit von PilW und PilA4 in der äußeren Membran führte. Ebenso führte eine pilW-Mutantion zu Abwesenheit von PilQ und PilA4 in der äußeren Membran. Diese Ergebnisse indizieren Interaktionen zwischen PilW, PilQ und PilA4. 7. In der pilD-Mutante wurde kein PilA4 mehr in der äußeren Membran detektiert. Dieser Befund untermauert den Schluss, dass es sich bei PilD um eine PilA4 prozessierende Präpilin-Peptidase handelt. 8. Western-Blot-Analysen der gereinigten Pili führen zu dem Schluss, dass das Kompetenzprotein PilA4 die strukturelle Untereinheit der Pilus-Struktur repräsentiert. Das Sekretin-ähnliche Kompetenzprotein PilQ wurde ebenfalls in der gereinigten Pilus-Fraktion detektiert und könnte Teil der globulären Struktur an den Pilusenden sein. 9. Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Dünnschnitten durch T. thermophilus HB27 Zellen ließen den ungewöhnlichen Aufbau der Zellperipherie erkennen. Zwischen der inneren Membran (8 nm dick) und der äußeren Membran (8 nm dick) befand sich neben dem dünnen Peptidoglykan (8 nm dick) eine 40 nm dicke kontrastarme Schicht, die radial von Fäden durchzogen schien. 10. Die Dünnschnitte wurden für Immunogoldmarkierungen mit alpha-PilQ-Antikörpern eingesetzt, um PilQ zu detektieren. Allerdings konnte in den elektronenmikroskopischen Analysen keine spezifische Goldmarkierung nachgewiesen werden. Ursache hierfür könnte die Unzugänglichkeit des nativen PilQ in den Dünnschnitten sein. 11. Die Immunogoldmarkierung des Gefrierbruchs von ganzen Thermus-Zellen mit alpha-PilQ-Antikörpern führte zur Detektion von PilQ-haltigen Ring-ähnlichen Strukturen in der äußeren Membran. Der Durchmesser des PilQ-Komplexes mit 17 - 18 nm ist mit denen der aus Sekretinen bestehenden Ringsystemen anderer Organismen vergleichbar. 12. In den T. thermophilus HB27 Membransolubilisaten wurde ein >669 kDa PilW-PilQ-Komplex identifiziert. Dieser Komplex ließ sich optimal mit n-Dodecyl-beta-D-maltosid (1 mg Detergenz pro mg Membranprotein) aus der Membranfraktion solubilisieren. Stabilitätsuntersuchungen ergaben, dass dieser Komplex bei 4 °C einige Tage, bei Raumtemperatur und bei Anwesenheit von 1 M NaCl einige Stunden stabil ist. 13. Mittels einer DEAE-Austausch-Chromatographie konnte der PilW-PilQ-Komplex angereichert werden. Die Western-Blot-Analysen ergaben, dass das Kompetenzprotein PilM mit dem PilW-PilQ-Komplex koeluiert. 14. In der MALDI-TOF-Massenspektrometrie konnte das Kompetenzprotein PilQ und Untereinheiten der DNA-gerichteten RNA-Polymerase, ein Membran-Lipoprotein sowie Energie-Stoffwechsel-Proteine in der angereicherten PilW-PilQ-haltigen Fraktion nachgewiesen werden. Diese Proteine müssen auf die Beteiligung an der Transformation untersucht werden. 15. Immunelektronenmikroskopische Analysen des angereicherten PilW-PilQ-Komplexes führten zur Identifizierung von Ringstrukturen mit einem Durchmesser von 17 nm. Dieser Durchmesser entspricht den Sekretin-Komplexen von P. aeruginosa (18,3 ± 1,2 nm) bzw. N. gonorrhoeae (15,5 - 16,5 nm) und dem Durchmesser der über Immunogoldmarkierung detektierten PilQ-haltigen Strukturen in T. thermophilus HB27.