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Angiogenesis, the formation of blood vessels from pre-existing ones, is a vital process in growth, development, and wound healing. However, in the context of solid tumors, chronic inflammation, and wAMD, angiogenesis is often dysregulated, contributing to the progression of the disease. As a result, several anti-angiogenic therapies have been developed and used with some success in the treatment of wAMD and cancer. However, while these treatments have significantly improved the outcome of these diseases, their efficacy is still limited. This is because resistance is common in cancer, while in wAMD, the underlying inflammatory processes can still drive the disease. In addition, angiogenesis is still not routinely targeted in chronic inflammatory diseases. Thus, there is still a great need for anti-angiogenic agents, and combined inhibition of angiogenesis and inflammation is desirable. 2-Desaza-annomontine, also called C81, is a synthetically available derivative of the alkaloid annomontine, which is found in the plant family Annonaceae. Derivatives of annomontine have previously been characterized as bioactive compounds. As one of them, C81 has been shown to affect inflammatory processes of the endothelium and restore endothelial barrier function against immune cells by Krishnathas et al. (2021), who also discovered that C81 inhibits DYRK2, PIM3, and the splicing kinases CLK1 and CLK4. Therefore, we hypothesized that C81 could also inhibit endothelial angiogenic functionality, making it a promising compound for the treatment of diseases that depend on angiogenesis and inflammation. As an initial test of this hypothesis, a murine laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model was used. In this model, 3 and 10 µM C81 strongly inhibited vascular permeability and endothelial infiltration into the choroid, indicating that C81 inhibits angiogenesis. Since VEGF is one of the most important pro-angiogenic signaling molecules in CNV, we next tested whether C81 specifically affects VEGF-induced angiogenesis. A murine aortic ring model was used for this purpose. In this model, 3 µM C81 significantly inhibited aortic sprouting, demonstrating that C81 is an inhibitor of VEGF-induced angiogenesis. To elucidate the processes by which C81 affects angiogenesis, assays testing individual steps of the angiogenic cascade were performed in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). In these assays, C81 inhibited the ability of HUVECs to form VEGF-induced sprouts from spheroids, reduced the formation of capillary-like structures on Matrigel, abrogated proliferation, and inhibited migration. Because angiogenesis in vivo is mediated by the microvascular endothelium, key experiments were repeated in the microvascular cell line HMEC-1. Since C81 also reduced proliferation, sprouting, and migration of HMEC-1, we concluded that C81 impedes angiogenesis by inhibiting angiogenesis-related cellular functions of the endothelium. We then investigated the pathways by which C81 affects angiogenic cellular functions. We found that C81 reduced the activity of the VEGF/VEGFR2 signaling pathway by abrogating VEGFR2 protein expression. This reduction in VEGFR2 protein expression was, in turn, caused by impaired VEGFR2 mRNA expression in C81-treated cells. Taken together, these results indicate that C81 impairs angiogenesis by downregulating VEGFR2 expression. To find the targets responsible for the C81-induced effects, we tested established chemical probes against the targeted kinases. This revealed that only inhibition of CLKs resulted in a significant downregulation of VEGFR2. Subsequently, we discovered that C81 is a pan-CLK inhibitor. Moreover, the CLK inhibitors MU1210 and T3-CLK were also able to phenocopy C81-derived effects on the sprouting of VEGF-stimulated HUVEC spheroids. These results suggest that the CLKs are the targets responsible for the anti-angiogenic effects of C81. This was confirmed by the knockdown of individual CLKs. Knockdowns of all CLK isoforms inhibited VEGFR2 mRNA expression and VEGF-induced sprouting of HUVEC spheroids. We could not identify an alternative splicing event associated with VEGFR2 in C81- or MU1210-treated HUVECs. Therefore, alternative splicing of VEGFR2 is unlikely to be the responsible mechanism. However, a GO term analysis followed by a reporter gene assay confirmed the previously published finding that CLK inhibitors abolish the WNT/β-catenin signaling pathway activity. This pathway has been shown to affect VEGFR2 expression in HUVECs and CNS endothelial cells. Therefore, we induced the activity of this pathway by using a GSK3β inhibitor, which increased the expression of VEGFR2. Conversely, knockdown of β-catenin inhibited VEGFR2 expression, confirming the involvement of this pathway. In summary, this work shows that CLK inhibitors are promising compounds in the treatment of angiogenesis related diseases. Especially in the therapy of inflammation related diseases and tumors they could be relevant, as CLK inhibitors have previously shown promising disease modifying properties in this context.

Transport proteins exhibiting broad substrate specificities are major determinants for the phenomenon of multidrug resistance. The Escherichia coli multidrug transporter EmrE, a 4-transmembrane, helical 12-kDa membrane protein, forms a functional dimer to transport a diverse array of aromatic, positively charged substrates in a proton/drug antiport fashion. Here, we report (13)C chemical shifts of the essential residue Glu(14) within the binding pocket. To ensure a native environment, EmrE was reconstituted into E. coli lipids. Experiments were carried out using one- and two-dimensional double quantum filtered (13)C solid state NMR. For an unambiguous assignment of Glu(14), an E25A mutation was introduced to create a single glutamate mutant. Glu(14) was (13)C-labeled using cell-free expression. Purity, labeling, homogeneity, and functionality were probed by mass spectrometry, NMR spectroscopy, freeze fracture electron microscopy, and transport assays. For Glu(14), two distinct sets of chemical shifts were observed that indicates structural asymmetry in the binding pocket of homodimeric EmrE. Upon addition of ethidium bromide, chemical shift changes and altered line shapes were observed, demonstrating substrate coordination by both Glu(14) in the dimer.

Leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is a large multidomain protein containing two catalytic domains, a kinase and a GTPase, as well as protein interactions domains, including a WD40 domain. The association of increased LRRK2 kinase activity with both the familial and sporadic forms of Parkinson’s disease has led to an intense interest in determining its cellular function. However, small molecule probes that can bind to LRRK2 and report on or affect its cellular activity are needed. Here, we report the identification and characterization of the first high-affinity LRRK2-binding designed ankyrin-repeat protein (DARPin), named E11. Using cryo-EM, we show that DARPin E11 binds to the LRRK2 WD40 domain. LRRK2 bound to DARPin E11 showed improved behavior on cryo-EM grids, resulting in higher resolution LRRK2 structures. DARPin E11 did not affect the catalytic activity of a truncated form of LRRK2 in vitro but decreased the phosphorylation of Rab8A, a LRRK2 substrate, in cells. We also found that DARPin E11 disrupts the formation of microtubule-associated LRRK2 filaments in cells, which are known to require WD40-based dimerization. Thus, DARPin E11 is a new tool to explore the function and dysfunction of LRRK2 and guide the development of LRRK2 kinase inhibitors that target the WD40 domain instead of the kinase.

Many drugs can act on multiple targets or disease pathways, regardless of their original purpose. Drug repurposing involves reevaluating existing compounds for new medical uses. This can include repositioning approved drugs, redeveloping unapproved drugs, or repurposing any chemical, nutraceutical, or biotherapeutic product for new applications. Traditional drug development is slow, expensive, and has high failure rates. Drug repurposing can speed up the process, costing less and saving time. This approach can save 6–7 years of early-stage research time. Drug repurposing benefits from existing compounds with optimized structures and approved for clinical use with associated structure-activity relationship publications, supporting the development of new effective compounds. Drug repurposes can now utilize advanced in silico screening enabled by artificial intelligence (AI) and sophisticated tissue and organ-level in vitro models. These models more accurately replicate human physiology and improve the selection of existing drugs for further pre-clinical testing and, eventually, clinical trials for new indications. This mini-review discusses some examples of drug repurposing and novel strategies for further development of compounds for targets of the arachidonic acid cascade. In particular, we will delve into the prospect of repurposing antiplatelet agents for cancer prevention and addressing the emerging noncanonical functionalities of 5-lipoxygenase, potentially for leukemia therapy.

In den letzten Jahren trat der wissenschaftliche Bereich der Epigenetik immer stärker in den Fokus der Forschung. Epigenetik beschreibt - im Vergleich zur Genetik – Modifikationen, welche die Aktivität von Genen beeinflussen, die eigentliche Nukleotidsequenz der DNA selbst allerdings nicht verändern. Eine der wichtigsten epigenetischen Modifikation ist die DNAMethylierung, welcher Gegenstand dieser Arbeit ist. Epigenetische Modifikationen haben einen Effekt auf die Chromatinstruktur der DNA, wodurch das Ablesen von Genen aktiviert, aber auch deaktiviert werden kann. Diese Modifikationen werden bereits während der Entwicklung festgelegt und genau wie die Nukleotidsequenz der DNA selbst, werden auch epigenetische Faktoren an die Nachkommen weitergegeben. Zudem können sie aber auch durch äußere Umweltfaktoren beeinflusst werden. In den letzten Jahrzehnten hat die Forschung gezeigt, dass Epigenetik auch eine wichtige Rolle bei der Entstehung und dem Fortschreiten vieler häufiger chronischer, nicht übertragbarer Krankheiten spielt. Dabei spielt das Muster der Genexpression, welches durch epigenetische molekulare Marker bestimmt wird, eine entscheidende Rolle. Zusätzlich spielen stabile epigenetische Modifikationen der DNA eine wichtige Rolle bei der Differenzierung von Zellen sowie der Reaktion von Organismen auf Umweltreize. Dazu nutzen diese mehrere Mechanismen, sowohl adaptive als auch nicht-adaptive, um sich den spezifischen Umgebungen anzupassen. Tatsächlich kann eine längere Exposition mit veränderten Stoffwechselbedingungen epigenetische Auswirkungen auch auf menschliche Zellen haben. Epigenetische Faktoren regulieren die Chromatinstruktur und synchronisieren dadurch Stoffwechselinformationen über die Genexpression. Insbesondere die DNA-Methylierung ist in der Lage, die Reminiszenz an den Stoffwechselzustand aufrechtzuerhalten und zur zellulären Entwicklungsplastizität beizutragen. Dieser Mechanismus spielt eine entscheidende Rolle bei pathologischen Veränderungen von Krankheitsbildern. Veränderungen in DNAMethylierungsmustern menschlicher Zellen konnten bereits mit Autoimmunerkrankungen, neurologischen und psychiatrischen Erkrankungen, anormaler Stammzellentwicklung sowie Krebs, Diabetes und Herz-Kreislauferkrankungen in Verbindung gebracht werden. DNAMethyltransferasen (DNMTs) sind die Enzyme, welche für die Methylierungsmuster der DNA in den Zellen verantwortlich sind. Dazu kommen zehn bis elf Translokationsproteine (TETs) und eine Thymin-DNA-Glykosylase (TDG), welche für die aktive Demethylierung der DNA verantwortlich sind. Da epigenetische Veränderungen im Gegensatz zu genetischen Mutationen aktiv aufrechterhalten werden müssen, stellt die pharmakologische Intervention auf diese DNAMethylierungs- und Demethylierungsprozesse eine attraktive Strategie zur Umkehrung epigenetischer Modifikationen dar. Hierbei sind die zuvor beschriebenen Enzyme DNMTs, TET-Enzyme und TDG Basis für die Medikamentenentwicklung. Die Synthese und biologische Entwicklung von Molekülen, welche mit Cytosin-Modifikationen, wie unter anderem DNMTund TET-Liganden, interagieren oder diese entfernen, kann dazu genutzt werden, ein tieferes Verständnis der epigenetischen Wirkmaschinerie sowie der zugrundeliegenden molekularen Mechanismen zu gewinnen. Daher ist es Ziel dieser Arbeit, epigenetische Modulatoren durch Untersuchung von Bibliotheken neuer chemischer Verbindungen zu identifizieren. Die Hemmung der menschlichen DNMT ist ein vielversprechender Ansatz, um die epigenetische Dysregulation der Genexpression in verschiedenen Krankheitsbildern zu untersuchen. Inspiriert von dem validierten virtuellen Screening-Treffer NSC137546, wurde eine Reihe von N-Benzoyl-Aminosäureanaloga synthetisiert und die erhaltenen Verbindungen wurden auf ihre Fähigkeit zur Hemmung der DNMT-abhängigen DNA-Methylierung in vitro untersucht. Das biologische Screening ermöglichte die Definition einer Reihe von vorläufigen Struktur-Aktivitäts-Beziehungen und die Identifizierung von Verbindungen, die vielversprechend für die weitere Entwicklung sind. Unter den synthetisierten Verbindungen zeigten die getesteten L-Glutaminsäurederivate 22, 23 und 24 die höchsten Aktivitäten auf die Hemmung der DNA-Methylierung in einem Gesamtzelllysat. Da allerdings weder Leitverbindungen noch kristalline Strukturen von Proteinen der TET-Familie verfügbar waren, wurde im Rahmen dieses Projektes NSC137546 als Leitverbindung ausgewählt, basierend auf dem bisherigen Wissenstand rund um TET-Substrate und deren chemischen Wirkmechanismen. TET-Enzyme sind eine gut konservierte Gruppe von Proteinen, die 5- Methylcytosin (5mC) über 5-Hydroxymethylcytosin (5hmC) zu 5-Formylcytosin (5fC) sowie in geringer Konzentration, 5-Carboxycytosin (5caC) in Gegenwart von α-Ketoglutarat (αKG), Sauerstoff und Eisen (II) oxidieren. Ein weiteres charakteristisches Merkmal von Proteinen der TET-Familie ist die Zink-Finger-Domäne CXXC, eine cysteinreiche Proteindomäne. Diese Strukturinformationen ermöglichten es uns, spezifische Liganden zu entwerfen und zu synthetisieren, die TET-Enzyme aufgrund ihrer Ähnlichkeit mit endogen Substraten und ihrer Fähigkeit, als Eisenchelatoren zu fungieren, hemmen oder aktivieren können. Auch in diesem Zusammenhang ermöglichte das biologische Screening die Identifizierung von Verbindungen, die in der Lage sind, die TET-vermittelte DNA-Methylierung in vitro zu modulieren sowie eine Reihe vorläufiger Struktur-Aktivitäts-Beziehungen zu definieren. Die in diesem Rahmen identifizierten Moleküle können als pharmakologische Werkzeuge genutzt werden, um neue Erkenntnisse über unbekannte pathophysiologische Wirkmechanismen zu liefern. Zudem kann man diese Moleküle, sollten sie zusätzlich epigenetische Aktivität aufweisen, für die Entwicklung neuer präklinischer oder klinischer Anwendungen nutzen. Tatsächlich führten die Ergebnisse dieser Arbeit zur Identifizierung und Charakterisierung einer neuen Verbindung, AA6, einem kleinen Molekül, welches die αKG-Synthese sowie DNA-Demethylierung reguliert. Es konnte gezeigt werden, dass dieses Molekül zu einem intrazellulären Anstieg von αKG führt, TET und TDG aktiviert sowie den Gehalt an modifiziertem Cytosin in vitro und in vivo reduziert. Daher wurde angenommen, dass diese epimetabolische Modulation der DNADemethylierung einen wichtigen konzeptionellen Fortschritt für die zukünftige Entwicklung von Medikamenten sowie medikamentöse Behandlung von Krankheiten darstellen und wichtige Werkzeuge liefern könnte, um die Rolle dieser spezifischen Enzyme bei der epigenetischen Regulation pathologischer Erkrankungen wie Typ-2-Diabetes und Brustkrebs zu verstehen. Aus diesem Grund wurde im Rahmen dieser Studie die AA6-Aktivität in menschlichen kardialen mesenchymalen Stammzellen (CMSCs) untersucht. CMSCs sind eine therapeutisch relevante Primärzelllinie. Die Funktion dieser Zellen ist bei Diabetes mellitus als Folge metabolischer sowie stabiler epigenetischer Veränderungen beeinträchtigt. Durch quantitative globale Analysen, Sequenzierung methylierter und hydroxymethylierter DNA sowie Detektion gen-spezifischer GC-Methylierungen konnte eine Anhäufung von 5mC, 5hmC und 5fC in der genomischen DNA von humanen CMSCs von diabetischen Spendern gezeigt werden. Darüber hinaus ergab die Analyse genomischer DNA isoliert aus dem gesamten Herzen von Mäusen, welche entweder einer fettreichen Ernährung (HFD) ausgesetzt waren, Streptozotocin (STZ) injiziert bekamen oder beides in Kombination (Streptozotocin/HFD), eine iterative oxidative Anhäufung von Cytosinmodifikationen. Sowohl ungezielte als auch gezielte metabolische Untersuchungen zeigten eine intrazelluläre Reduktion der αKG-Synthese in diabetischen CMSCs und im Herzen von HFD-Mäusen. Diese Beobachtung wurde durch eine kompromittierte TDG- und TET1-Assoziation und -Funktion ergänzt, wobei TET1 aus dem Kern verlagert wurde. Untersuchungen der molekularen Dynamik und Mutationsanalysen zeigten, dass αKG TDG am Arg275 bindet und eine enzymatische allosterische Aktivierung auslöst. Infolgedessen erhöhte das Enzym signifikant seine Fähigkeit, G/T-NukleotidFehlpaarungen oder 5fC zu entfernen. Dementsprechend stellte eine exogene Quelle von αKG den DNA-Demethylierungszyklus wieder her, indem sie die TDG-Funktion, die Lokalisierung von TET1 im Kern sowie die TET/TDG-Vereinigung förderte. Die TDG-Inaktivierung durch CRISPR/Cas9-Knockout oder TET/TDG-siRNA-Knockdown induzierte eine Anreicherung von 5fC und imitierte damit teilweise den diabetischen epigenetischen Phänotyp in Zellen nichtdiabetischen Ursprungs. Die neuartige Verbindung AA6, die als αKG-Dehydrogenase (OGDH)-Hemmer wirkt, erhöhte den αKG-Spiegel in diabetischen CMSCs sowie im Herzen von HFD- und Streptozotocin-induzierten Mäusen, wodurch die DNA-Demethylierung erhöht sowie Glukoseaufnahme und Insulinantwort bei HFD wiederhergestellt wird. Die Aktivierung der epimetabolischen Kontrolle des DNA-Demethylierungszyklus durch αKG verspricht positive Auswirkungen auf Zellen, die durch Umweltveränderungen beeinträchtigt werden. Zusätzlich zu den bereits beschriebenen Assoziationen, konnten Veränderungen der DNAMethylierung auch als relevante epigenetische Merkmale in Zusammenhang mit einem erhöhten Risiko für Tumorprogression und Metastasenbildung assoziiert werden. Der hyperaktive Stoffwechsel der Krebszellen unterstützt ihre extreme Anpassungsfähigkeit und Plastizität und erleichtert die Resistenz gegen gängige Krebstherapien. Die Metastasierung erfordert eine aktive Energieproduktion und wird auf mehreren Ebenen durch den mitochondrialen Stoffwechsel reguliert. Trotz der möglichen Relevanz dieser Regulation liegen bisher wenige Studien in diese Richtung vor. Daher war Gegenstand dieser Arbeit, die zuvor entdeckte epigenetische Wirksamkeit von AA6 auch in ihrer potentiellen Wirkung auf ein orthotopes Mausmodell für Brustkrebs 4T1 sowie anderen menschlichen Brustkrebszelllinien zu untersuchen. Unter allen Bedingungen veränderte AA6 den Krebszyklus und verursachte eine intrazelluläre Anreicherung von α-KG. Infolgedessen stieg die Aktivität der von α-KGabhängigen epigenetischen Enzyme, einschließlich TET-Hydroxylasen, an. Bei Mäusen reduzierte die AA6-Injektion die Metastasierung und erhöhte den 5hmC-Spiegel bei Primärtumoren. Darüber hinaus resultierte die Behandlung mit AA6 in einer Anreicherung von α-KG in vitro und in vivo, die mit einer erhöhten Produktion von Stickoxid (NO) einherging. Dieses epigenetisch veränderte Stoffwechselumfeld wirkte den einleitenden Schritten der Tumorinvasion, die den epithelial-mesenchymalen Übergangsprozess (EMT) hemmten, effizient entgegen. Mechanistisch konnte die AA6-Aktivität mit der Hochregulierung der NOsensitiven anti-metastatisierenden miRNA 200-Familie und der Herunteregulierung des EMTassoziierten Transkriptionsfaktors Zeb1 und seines Kofaktors CtBP1 assoziiert werden. Dieser Mechanismus führt zu einer Abnahme der Expression der Matrix-Metalloproteinase 3 (MMP3) und zu einer Beeinträchtigung der Aggressivität von 4T1 Zellen. Insgesamt deuten die Daten dieser Arbeit darauf hin, dass AA6 die α-KG-abhängige Regulation der TET-miR200- Zeb1/CtBP1-MMP3-Achse, die mit der anti-metastatische Wirkung in einem Mausmodell metastasierenden Brustkrebs assoziiert werden kann, epigenetisch beeinflusst. Abschließend ist es im Rahmen dieses Projektes gelungen, inspiriert durch die Struktur der validierten Trefferverbindung NSC137546, eine Reihe von N-Benzoylaminosäuren zu synthetisieren und ihre Fähigkeit zur Modulation der DNMT- und TET-Enzymaktivität zu untersuchen. Die daraus abgeleitete Struktur-Aktivitäts-Beziehung zeigte an, dass das N-Benzoyl-substituierte L-Glutaminsäure-Gerüst die Mindestanforderung für diese Klasse von Benzamidderivaten mit DNMT-hemmender Aktivität ist. Vor allem die Verbindung 22 hemmte sowohl DNMT1- als auch DNMT3A-vermittelte DNA-Methylierung in konzentrationsabhängiger Weise und erwies sich als aktiv sowohl auf DNMT1 als auch auf DNMT3A, nachgewiesen durch Immunpräzipitation. Molekulare Andockstudien deuteten auf eine mögliche Bindung an die Substratoberfläche beider DNMT-Isoformen hin. AA6 erwies sich dagegen als die vielversprechendste Verbindung für die Modulation der demethylierenden Aktivität von TETs. Fasziniert von der Neuartigkeit unserer Ergebnisse, konzentrierten wir unsere Bemühungen auf die Charakterisierung von AA6. Im Laufe dieser Studie haben die Untersuchungen gezeigt, dass pathophysiologische Bedingungen, die in Zusammenhang mit einem beeinträchtigten Glukosehaushalt stehen, wie z. B. Diabetes mellitus, Signale im Herzen und anderen Organen auslösen, welche zu einem reduzierten intrazellulären αKG-Gehalt führen. Dadurch wird die TET- und TDG-Aktivität vermindert, was wiederum einen Effekt auf den DNA-Demethylierungsprozess hat und zu einer Akkumulation von 5mC, 5hmC und 5fC führt. Diese Veränderungen sind bei humanen CMSCs von diabetischen Spendern ex vivo nachweisbar. Die daraus resultierenden Auswirkungen sollten demnach im Rahmen möglicher therapeutischer Anwendungen berücksichtigt werden. In diesem metabolisch gefährdeten Zustand führte die neuartige Verbindung AA6, die auf OGDH abzielt, zu einer Erhöhung von αKG und zur Wiederherstellung der epimetabolischen Kontrolle des DNADemethylierungszyklus, wodurch die Glukosereaktion wieder aktiviert wurde. Darüber hinaus liefert diese Arbeit Belege dafür, dass AA6 auch die Progression von Krebszellen stören könnte. In Brustkrebsmodellen bestimmt AA6 über eine kalibrierte OGDH-Funktionskontrolle eine αKG-abhängige epigenetische Regulation, die sowohl die TET-abhängige DNADemethylierung als auch die NO-Produktion aktiviert und den EMT-Prozess hemmt. Infolgedessen hemmte AA6 die Invasionsfähigkeit von 4T1-Zellen in vitro und in vivo und resultierte in einem anti-metastatischen Effekt in einem Mausmodell der Brustkrebsassoziierten Lungenmetastase. Abschließend kann geschlussfolgert werden, dass AA6 den Prototyp eines metabolischen Verstärkers der DNA-Demethylierung repräsentiert und somit ein neues Werkzeug zur Aufklärung des Mechanismus zur Eingliederung stabiler DNACytosin-Modifikationen in Zellen und Geweben darstellt. Tatsächlich kann AA6 als neuartiges epimetabolisch aktives kleines Molekül neue Wege zur Prävention oder Behandlung genetischer Folgen von chronischen Krankheiten ausgelöst durch unausgewogene Stoffwechselbedingungen wie beispielsweise dem veränderten Glukosestoffwechsel in Herzzellen oder der Metastasierung von Brustkrebs eröffnen.