Georg-Speyer-Haus
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Einfluss des Transkriptionsfaktors Tal1 auf die Osteoklastogenese durch Regulation von DC-STAMP
(2012)
Das menschliche Knochengewebe unterliegt einem ständigen Auf- und Abbau. Der Knochenumbau, die so genannte Knochenremodellierung, findet stetig statt und etwa 10 % des gesamten Knochengewebes werden innerhalb eines Jahres erneuert (Lerner UH, 2006). Während der Knochenremodellierung befindet sich die Zellaktivität der Knochenaufbauenden Osteoblasten und der Knochen-abbauenden Osteoklasten in einem empfindlichen Gleichgewicht (Karsenty G und Wagner EF, 2002; Teitelbaum SL, 2000).
Durch Störung des Gleichgewichts zwischen Osteoblasten und Osteoklasten kann es zu Knochen-assoziierten Krankheiten wie Osteoporose oder Osteopetrose kommen (Helfrich MH, 2003; Sambrook P und Cooper C, 2006). Osteoklasten sind multinukleäre Zellen, die in der Lage sind die Knochenmatrix zu resorbieren (Teitelbaum SL, 2000). Sie entstehen aus pluripotenten, hämatopoetischen Stammzellen durch Differenzierung und Zellfusion von Monozyten/Makrophagen-Vorläuferzellen (Menaa C et al., 2000, Yavropoulou MP und Yovos JG, 2008). Die Osteoklasten-Differenzierung wird hauptsächlich durch die Zytokine M-CSF (macrophage colony stimulating factor) und RANKL (receptor activator of nuclear factor k b ligand) induziert. Sie initiieren ein spezifisches Expressionsmuster Osteoklasten-spezifischer Gene und aktivieren die Zellfusion in Osteoklasten-Vorläuferzellen zur Bildung reifer Osteoklasten (Boyle WJ et al., 2003; Asagiri M und Takayanagi H, 2007). Die RANKL-vermittelte Induktion der Osteoklastogenese beruht auf der Initiierung eines streng regulierten Netzwerks aus Transkriptionsfaktoren (Yang X und Karsenty G, 2002). Einige Transkriptionsfaktoren, die während der Osteoklasten-Differenzierung induziert und exprimiert werden, sind nicht auf Osteoklasten beschränkt. Sie erfüllen auch Aufgaben in anderen hämatopoetischen Differenzierungsprozessen (Engel I und Murre C et al., 1999), so dass vermutlich die Kombination der Transkriptionsfaktoren entscheidend für die Osteoklastogenese ist.
Der basic helix-loop-helix-Transkriptionsfaktor Tal1 (T-cell acute lymphocytic leukemia 1, auch Scl1, stem cell leukemia 1) ist ein entscheidender Faktor in der primitiven und der definitiven Hämatopoese (Bloor AJ et al., 2002; Shivdasani RA et al., 1996). Die Expression von Tal1 konnte bisher in verschiedenen hämatopoetischen Zelllinien gezeigt werden, u.a. in monozytischen Zellen (Elefanty AG et al., 1998; Green AR et al., 1992; Pulford K et al., 1995; Dey S et al., 2010).
In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss des Transkriptionsfaktors Tal1 in Monozyten und reifen Osteoklasten, vor allem in Bezug auf genregulatorische Prozesse während der Osteoklasten-Differenzierung, untersucht. Der Transkriptionsfaktor Tal1 wird in vitro und in vivo in Osteoklasten-Vorläuferzellen und reifen Osteoklasten exprimiert. Die Proteinexpression von Tal1 wird durch die Inkubation der Zellen mit RANKL induziert, jedoch wurde dies in Bezug auf die mRNA-Expression von Tal1 nicht beobachtet, so dass vermutlich eine posttranskriptionelle Regulation von Tal1 vorliegt.
Die Überexpression von Tal1 sorgte für eine Blockade der Differenzierung von Osteoklasten-Vorläuferzellen in reife Osteoklasten. Der Verlust von Tal1 in primären Monozyten/Makrophagen-Zellen führte zur veränderten Expression von über 1200 Genen, wobei jeweils etwa 600 Gene herauf- bzw. herabreguliert waren. Dies verdeutlicht, dass Tal1 sowohl an der Aktivierung als auch an der Reprimierung der Genexpression in Osteoklasten-Vorläuferzellen beteiligt ist. Die Liste der herabregulierten Gene beinhaltete u.a. das Osteoklasten-spezifische Enzym Acp5 (auch TRAP, tartrate resistant acid phosphatase), die Liste der herauf regulierten Gene beinhaltete u.a. DC-STAMP (dendritic cell specific transmembrane protein) und ATP6V0D2 (d2 isoform of vascuolar ATPase V0 domain), beide werden im Zusammenhang mit der Zellfusion während der Osteoklasten-Differenzierung beschrieben (Kim K et al., 2008; Kim T et al., 2010; Yagi M et al., 2005). Der Promotor von DC-STAMP beinhaltet mehrere potentielle Bindestellen für Tal1 und Osteoklastenspezifische Transkriptionsfaktoren. Es konnte gezeigt werden, dass Tal1, PU.1 und MITF im Bereich um 343 bp vor dem Transkriptionsstartpunkt des DC-STAMP-Promotors binden und dass Tal1 mit den Osteoklasten-spezifischen Transkriptionsfaktoren PU.1 und MITF interagiert. Der inhibitorische Effekt von Tal1 auf die Osteoklasten-Differenzierung kommt durch die Reprimierung der Aktivität der Osteoklasten-spezifischen Transkriptionsfaktoren PU.1 und MITF auf dem DC-STAMP-Promotor in Osteoklasten-Vorläuferzellen zustande. Während der Osteoklastogenese kommt es zu einer verringerten Tal1-Bindung auf dem DCSTAMP-Promotor, wodurch die Tal1-vermittelte Inhibierung der Expression aufgehoben wird.
Die Bindung von PU.1 und MITF auf dem Promotor von DC-STAMP nimmt während der Osteoklasten-Differenzierung zu. Die Expression von DC-STAMP wird im Verlauf der Osteoklastogenese induziert, wodurch es zur Zell-Zell-Fusion kommt.
Die Analyse des transkriptionellen Netzwerks, das die Fusion mononukleärer Zellen in reife Osteoklasten reguliert, vertieft das molekulare Verständnis der Osteoklasten-Differenzierung und kann zur Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze beitragen, die in der Behandlung von Osteoporose, Riesenzelltumoren und anderen Osteoklastenassoziierten Krankheiten verwendet werden können.
Die aktuellen HIV Medikamente basieren sich zum größten Teil auf Substanzen, die gegen virale Proteine gerichtet sind. Ein großer Nachteil dieser Medikamente besteht darin, dass das HI-Virus durch Mutationen Resistenzen gegen diese Substanzen entwickeln kann. Zelluläre Co-Faktoren als antivirales Ziel in der HIV-Therapie zu nutzen, könnte ein neuer Lösungsansatz sein, da das menschliche Genom stabiler ist als das virale. Der Schwerpunkt dieser Arbeit konzentriert sich auf die RNA Helikase DDX3, welche als zellulärer Co-Faktor für die HIV-1 Replikation identifiziert wurde.
Im Rahmen der Dissertation wurde die RNA-Helikase DDX3 durch biochemische Untersuchungen von DDX3Wt und DDX3-Mutanten näher charakterisiert. Die Versuche zeigten, dass die konservierten Motive V und VI bei DDX3Wt für die Bindung und Hydrolyse von ATP essentiell sind. Die spezifische DDX3 Insertion wies ebenfalls eine mutmaßliche Rolle bei der ATP-Bindung und bei Ausbildung der ATP-Bindestelle auf. Ferner konnte für die spezifische Insertion von DDX3 eine Funktion bei der Bindung von viraler RNA Bindungsnachweise nachgewiesen werden. Daher bietet diese Insertion von DDX3 ein mögliches Ziel für die spezifische Modulation bzw. Manipulation der Interaktion von DDX3Wt und viralen Interaktionspartnern sein, ohne weitere RNA Helikasen zu beeinflussen.
Zusätzlich wurden weitere Eigenschaften von DDX3Wt entdeckt. Die ATPase-Aktivität von DDX3Wt konnte durch die Zugabe von ssDNA deutlicher stimuliert werden, als durch die Zugabe ssRNA. Das DDX3Wt eine höhere katalytische Effizienz durch DNA aufweist ist neu, da die meisten DEAD-box Helikasen eine Präferenz für RNA als Co-Faktor für die ATPase-Aktivität besitzen. Des Weiteren konnte erstmalig nachgewiesen werden, dass DDX3 neben der ATPase-Aktivität auch eine Exonuklease-Aktivität besitzt. Die Versuche zeigten, dass DDX3Wt in der Lage war, ssDNA und dsDNA effizient zu spalten. In der DDX3Wt AS-Sequenz wurden fünf Aminosäuresequenz-Motive, sogenannte Exonuklease-Boxen identifiziert, die mit der Exonukleaseaktivität in Verbindung gebracht werden. Die Untersuchung der Bindungseigenschaften von DDX3Wt zeigte auf, dass DDX3Wt auch ohne den zellulären Co-Faktor XPO1 in der Lage ist, virale HIV-1 RNA und DNA direkt zu binden. Diese Erkenntnisse tragen dazu bei, die Funktionen von DDX3Wt im zellulären System besser zu verstehen. Eine genaue Analyse ist Voraussetzung für die Entwicklung von spezifischen Inhibitoren, die die Interaktion von HIV-1 und DDX3Wt hemmen sollen ohne dabei zelluläre Prozesse negativ zu beeinflussen.
Durch Lokalisationsstudien konnte ein neuer relevanter Angriffspunkt für die Inhibition der HIV-1 Replikation identifiziert werden. Denn entgegen den Literaturangaben spielt das putative Leucin-reiche Exportsignal im N-Terminus von DDX3Wt eine wichtige Rolle beim Export aus dem Zellkern und somit auch für die Interaktion mit XPO1.
Mithilfe der Phagen-Display-Technologie konnte im Rahmen dieser Arbeit ein Sequenz-spezifischer Peptid-Ligand für die Insertion von DDX3 identifiziert werden, der eine Aminosäurehomologie zu dem zellulären Co-Faktor XPO1 zeigt. Das identifizierte Peptid DDX3-INS1 wurde für weitere Untersuchungen in Verbindung mit einer Proteintransduktionsdomäne synthetisiert. Das Peptid DDX3-INS1 ist in HIV-1 infizierten Zellen funktionell aktiv und inhibiert die Produktion von HI-Viren ab einer Konzentration von 20 µM ohne dabei toxische oder virolytische Effekte auszuüben. Weitere funktionelle Untersuchungen werden zeigen, ob das selektionierte Peptid DDX3-INS1 als therapeutisches Medikament für die Inhibition von HIV-1 geeignet ist.
NK cells are part of the innate immune system, and are important players in the body’s first defence line against virus-infected and malignantly transformed cells. While T cells recognize neoplastic cells in an MHC-restricted fashion, NK cells do not require prior sensitization and education about the target. In leukemia and lymphoma patients undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation not only T cells but also NK cells have been found to mediate potent graft-versus-tumor effects. Hence, autologous or donor-derived NK cells hold great promise for cancer immunotherapy. Since the generation of highly purified NK cell products for clinical applications is labor-intensive and time consuming, established human NK cell lines such as NK-92 are also being considered for clinical protocols. NK-92 cells display phenotypic and functional characteristics similar to activated primary NK cells. While NK-92 cells are highly cytotoxic towards malignant cells of hematologic origin, they do not affect healthy human tissues. NK-92 cells can be expanded under GMP-compliant conditions, and can therefore be provided in sufficient numbers with defined phenotypic characteristics for clinical applications. Safety of NK-92 cells for adoptive immunotherapy was already shown in two phase I/II clinical trials...
Tumoren epithelialen Ursprungs weisen häufig eine vermehrte Expression und/oder Mutationen des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors (EGFR) auf. Durch die übermäßig starke bzw. permanente Vermittlung von Überlebens- und Proliferationssignalen an die betroffene Zelle trägt dies direkt zum Voranschreiten der Tumorerkrankung bei. Für eine Reihe von Tumorentitäten ist bekannt, dass eine abnorme Expression von EGFR mit einer schlechteren Prognose für den Krankheitsverlauf und die mittlere Überlebenszeit betroffener Krebspatienten korreliert. Begleitend zur systemischen Chemotherapie solcher Tumoren wird eine gerichtete Therapie zur Eindämmung der EGFR-vermittelten Signaltransduktion durch den Einsatz von Tyrosinkinase-Inhibitoren (TKI) oder EGFR-spezifischer monoklonaler Antikörper (mAb) erzielt. Bei der therapeutischen Anwendung monoklonaler anti-EGFR Antikörper wurden in einigen Fällen lediglich milde Nebenwirkungen wie z.B. Hautausschläge beobachtet, wobei das Auftreten dieser Effekte mit dem Therapieerfolg korrelierte. Eine Reihe von monoklonalen Antikörpern, die gegen ErbB Rezeptor-Tyrosinkinasen gerichtet sind, sind mittlerweile zur Tumortherapie zugelassen, darunter der chimäre anti-EGFR Antikörper Cetuximab (Erbitux®, ImClone/BMS/Merck) zur Behandlung von metastasierenden Kolonkarzinomen sowie Karzinomen des Kopf- und Halsbereichs, der humane anti-EGFR Antikörper Panitumumab (Vectibix®, Amgen) bei metastasierenden Kolonkarzinomen, und der humanisierte anti-ErbB2 Antikörper Trastuzumab (Herceptin®, Genentech/Roche) bei Brustkrebs. Weitere Antikörper befinden sich derzeit in fortgeschrittenen Phasen der klinischen Entwicklung, darunter der humanisierte anti-EGFR Antikörper Matuzumab (Merck/Takeda). Klinische Daten zeigen, dass Patienten mit EGFR positiven Tumoren, die gegenüber etablierter Chemotherapie resistent sind, von der Behandlung mit anti-EGFR Antikörpern profitieren. Durch aktivierte EGF-Rezeptoren induzierte mitogene Signale werden vermindert bzw. blockiert, indem die Antikörper mit hoher Affinität an ErbB Rezeptoren auf der Zelloberfläche binden und die Ligandenbindung bzw. die Dimerisierung verhindern, die zur Bildung aktivierter Rezeptor Dimere nötig ist. Auf diese Weise wird die mitogene Signalübertragung aktivierter ErbB-Rezeptor Dimere verhindert und die Proliferation der Tumorzelle wird verlangsamt oder kommt zum Stillstand. Es gibt Hinweise, dass darüber hinaus sekundäre Effektormechanismen des Immunsystems wie die antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC) oder die komplementabhängige Zytotoxizität (CDC) gegen Antikörper-markierte Tumorzellen die anti-tumorale Wirksamkeit dieser Antikörper noch verstärken. Die lebensverlängernde Wirkung der Behandlung mit diesen Antikörpern ist ein Beispiel für die erfolgreiche Anwendung einer zielgerichteten Krebstherapie durch passive Immuntherapie. Zu Beginn dieser Arbeit waren die genauen Bindungsstellen der therapeutischen anti-EGFR Antikörper Cetuximab und Matuzumab noch unbekannt. Die Kenntnis der Lage der Epitope auf dem EGFR Molekül könnte wichtige Hinweise zur Aufklärung der Wirkungsmechanismen dieser Antikörper liefern und Ansätze zur weiteren Optimierung dieser Therapeutika aufzeigen. Aus vorangegangenen Experimenten war bekannt, dass Cetuximab und Matuzumab Epitope auf dem EGFR erkennen, die eine intakte Raumstruktur des Rezeptors voraussetzen. Diese Beobachtungen konnten in dieser Arbeit bestätigt werden, ferner konnte die Lage der Epitope auf die EGFR Ektodomäne III/L2 eingegrenzt werden. Da sowohl Cetuximab als auch Matuzumab nicht-lineare, konformationelle Epitope erkennen, wurde eine Variante der Phage Display Methode zur Identifizierung von Peptiden gewählt, die mit den hypervariablen Regionen (CDR) dieser Antikörper interagieren, welche die Bindungsspezifität der Antikörper vermitteln. Ziel dieser Experimente war die Identifizierung von Peptiden, welche die konformationellen Epitope von Cetuximab bzw. Matuzumab in linearer bzw. zyklisch restringierter Form nachbilden. Die Aminosäuresequenzen solcher sogenannter Mimotope könnten zur Identifizierung entsprechender Oberflächenstrukturen am EGFR Molekül herangezogen werden. In der vorliegenden Arbeit wurden aus kommerziell erhältlichen Bibliotheken genetisch modifizierter M13 Bakteriophagen, die randomisierte lineare bzw. zyklische Peptide als N-terminale Fusion am Oberflächenprotein pIII exponieren (M13KE), unter Anwendung der „Delayed Infectivity Panning“ (DIP) Methode Peptide angereichert, die von Cetuximab bzw. Maztuzumab erkannt werden. Zur Anreicherung von M13KE Bakteriophagen mit CDR-spezifischen Fusionspeptiden mittels DIP wurde zunächst ein „single-chain“ Antikörperfragment aus der cDNA von Matuzumab konstruiert und in den bakteriellen Expressionsvektor pIB-Tx kloniert. Mit dem resultierenden Konstrukt pIB-Tx-scFv(E72K) bzw. dem bereits vorhandenen analogen Konstrukt pIB-Tx-scFv(225), welches das „single-chain“ Antikörperfragment von Cetuximab enthält, wurden E. coli HB101 Bakterien transformiert, um die bakterielle Oberflächenexpression dieser Antikörperfragmente zum Einsatz in DIP Experimenten zu erreichen. In alternierenden positiven und negativen Selektionsrunden wurden unter Einsatz dieser scFv-exprimierenden E. coli HB101 Bakterien in Biopanning Experimenten Phagen mit solchen Fusionspeptiden angereichert, die selektiv an die „single-chain“ Antikörperfragmente von Cetuximab bzw. Matuzumab binden. Phagen ELISA Experimente mit M13KE Einzelklonen zeigten, dass aus allen eingesetzten Bibliotheken Phagen mit Fusionspeptiden isoliert werden konnten, die an den jeweiligen parentalen Antikörper des zur Selektion eingesetzten „single-chain“ Antikörperfragmentes binden. Ein Teil der Phagenklone wies eine zumindest partielle Kreuzreaktivität zu dem entsprechenden anderen anti-EGFR Antikörper auf, obwohl sie auf Bindung an diesen nicht selektioniert worden waren. Die Sequenzanalyse der Fusionspeptide lieferte keine gemeinsame Consensus Sequenz, es konnten jedoch kurze, gemeinsame Sequenzmotive identifiziert werden. In MTT-Zytotoxizitätsassays wurden diese Klone als mögliche Kompetitoren der Bindung des gegen EGFR gerichteten Immuntoxins scFv(225)-ETA in MTT-Zytotoxizitätsassays eingesetzt. Ein Teil der selektionierten Fusionspeptide war in der Lage, die Bindung der aus dem „single-chain“ Antikörperfragment von Cetuximab scFv(225) bestehenden Zellbindungsdomäne des Immuntoxins scFv(225)-ETA an EGFR exprimierende Zellen zu kompetieren. Auch für einige Fusionspeptide, die zunächst nur auf Bindung an Matuzumab selektioniert worden waren, wurde dies beobachtet. Peptide, welche die Bindung des Immuntoxins an EGFR kompetieren, weisen in ihren pIII-Fusionspeptiden laut Sequenzanalyse die gemeinsamen Sequenzmotive KTL bzw. YPLG auf. Nach einem Abgleich der Sequenzen der kompetierenden, kreuzreaktiven Peptide mit KTL bzw. YPLG Motiven wurden zwei Peptide ausgewählt und zur Immunisierung von Kaninchen eingesetzt. In MTT-Zytotoxizitätsassays wurde zunächst bestätigt, dass die synthetischen Peptide in der Lage sind, durch Kompetition spezifisch die Bindung des gegen EGFR gerichteten Immuntoxins scFv(225)-ETA und dessen zytotoxische Wirkung auf EGFR exprimierende Zellen zu verhindern. Kaninchenseren und aus diesen affinitätsgereinigte anti-Peptid Antikörper zeigten in ELISA Experimenten konzentrationsabhängige Bindung an die immobilisierten synthetischen Peptide. Die Bindung der anti-EGFR Antikörper Cetuximab und Matuzumab an die synthetischen Peptide konnte ebenfalls bestätigt werden. In einer Reihe von Experimenten wurde untersucht, ob die Immunisierung mit potentiellen Mimotopen der anti-EGFR Antikörper eine endogene humorale Immunantwort gegen den humanen EGFR bewirkt hatte. Die Bindung der affinitätsgereinigten anti-Peptid Antikörper an den Rezeptor auf der Oberfläche EGFR-exprimierender Tumorzellen wurde zunächst in Durchflusszytometrie (FACS) Experimenten analysiert. Für die gereinigten anti-Peptid Antikörper wurde spezifische Bindung an murine Renca-lacZ/EGFR Zellen sowie an humane A431 Vulvakarzinomzellen detektiert, die den humanen EGFR auf der Oberfläche exprimieren. Die Bindung an A431 konnte durch Vorinkubation der Antikörper mit einem Überschuss der entsprechenden synthetischen Peptide vollständig verhindert werden. In einer weiteren Serie von FACS Experimenten konnte gezeigt werden, dass die Bindung der Antikörper Cetuximab und Matuzumab an EGFR durch eine Vorinkubation von Renca-lacZ/EGFR Zellen mit den gereinigten anti-Peptid Antikörpern deutlich reduziert werden konnte. Dies ist ein Beweis für die Fähigkeit der in Immunisierungsexperimenten generierten anti-Peptid Antikörper, die Bindungsstellen von Cetuximab und Matuzumab am EGFR zumindest teilweise zu besetzen. Diese Beobachtungen zeigen, dass durch Immunisierung mit den hier ausgewählten synthetischen Peptiden in Versuchstieren die Bildung von Antikörpern mit ähnlichen Eigenschaften wie Cetuximab bzw. Matuzumab und somit eine endogene Immunantwort gegen den humanen EGFR ausgelöst werden konnte. In Immunfluoreszenz Experimenten wurde die Bindung der anti-Peptid Antikörper an Renca-lacZ/EGFR Zellen erneut überprüft und mittels konfokaler Laser Scanning Mikroskopie (CLSM) visualisiert. In diesen Experimenten wurde für gereinigte anti-Peptid Antikörper (KTL Motiv bzw. YPLG Motiv) Bindung an die Zelloberfläche bzw. membrannahe intrazelluläre Strukturen beobachtet, die der Lokalisierung der Bindungssignale der parallel getesteten anti-EGFR Antikörper Cetuximab, Matuzumab und dem murinen anti-EGFR Antikörper R-1 entsprach. Die Bindung der anti-Peptid Antikörper konnte durch Zugabe eines Überschusses der jeweiligen synthetischen Peptide verhindet werden. In einer weiteren Serie von Immunfluoreszenz Experimenten wurde der humane EGFR auf Renca-lacZ/EGFR Zellen gleichzeitig mit anti-KTL bzw. anti-YPLG Peptid Antikörpern aus Kaninchen sowie dem murinen anti-EGFR Antikörper R-1 detektiert. Durch eine Überlagerung der Signale konnte eindeutig eine Kolokalisation nachgewiesen werden. Dies ist ein Beweis dafür, dass es sich bei der Bindung der anti-Peptid Antikörper an die Oberfläche von Renca-lacZ/EGFR um Bindung an den humanen EGFR handelt. In Lysaten von EGFR exprimierenden Zelllinien konnte mit gereinigten anti-Peptid Antikörpern ein Protein detektiert werden, dessen Größe dem humanen EGFR entspricht. Die durch Stimulation des humanen EGFR mit dem natürlichen Peptidliganden EGF hervorgerufene Autophosphorylierung des Rezeptors in A431 Zellen konnte durch Zugabe von anti-Peptid Antikörpern teilweise inhibiert werden, allerdings nicht in dem gleichen Ausmaß, wie dies für die als Positivkontrollen eingesetzten anti-EGFR Antikörper Cetuximab und Matuzumab beobachtet wurde. In MTT-Zytotoxizitätsassays konnte darüber hinaus eine teilweise Kompetition der Bindung des rekombinanten Toxins TGF!-ETA an EGFR-exprimierende A431 Zellen, und somit eine teilweise Kompetition des natürlichen Peptidliganden TGF! an EGFR durch Vorinkubation mit anti-Peptid Antikörpern nachgewiesen werden. Zur näherungsweisen Quantifizierung der Affinitäten der anti-Peptid Antikörper und der anti-EGFR Antikörper Cetuximab und Matuzumab für die synthetischen Peptide (KTL Motiv und YPLG Motiv) bzw. für die gereinigte extrazelluläre Domäne des humanen EGFR (sEGFR) wurden ELISA Bindungstests durchgeführt. Die aus den Bindungskurven berechneten Affinitätswerte zeigen, dass die anti-Peptid Antikörper an sEGFR im nanomolaren Bereich binden und damit ca. 200-fach niedrigere Affinitäten für den Rezeptor besitzen als die affinitätsoptimierten anti-EGFR Antikörper Cetuximab bzw. Matuzumab. Die Affinitäten der anti- Peptid Antikörper für die synthetischen Peptide liegen ebenfalls im nanomolaren Bereich, während Cetuximab und Matuzumab lediglich mikromolare Affinitäten für die Peptide besitzen. Durch „Epitope Mapping“ in silico vorhergesagte mögliche Oberflächenstrukturen auf EGFR, welche die Peptidmimotope mit KTL bzw. YPLG Motiven nachbilden, sind direkt benachbart zu den mittlerweile publizierten Bindungsstellen von Matuzumab und Cetuximab bzw. EGF in der Ektodomäne III/L2 von EGFR (Li et al., 2005; Schmiedel et al., 2008) und zeigten im Falle des Peptides mit KTL Motiv Übereinstimungen mit Teilen beider Epitope. Möglicherweise ist dieses Peptid in der Lage, alternative Strukturen mit KTL bzw. KTI Motiven an der Oberfläche von EGFR nachzubilden, die Gemeinsamkeiten mit beiden Epitopen von Cetuximab bzw. Matuzumab besitzen und daher von beiden Antikörpern erkannt werden können. Eine endgültige Klärung der Bindung der hier identifizierten Peptide an Cetuximab bzw. Matuzumab bzw. der Bindung der anti-Peptid Antikörper an EGFR könnte in nachfolgenden Untersuchungen mittels Röntgenkristallographie bzw. NMR strukturell aufgeklärt werden – die hierzu nötigen Peptide bzw. Proteine liegen bereits in gereinigter Form vor. Eine Optimierung der hier identifizierten Mimotope zur Steigerung der Affinitäten der induzierten anti-Peptid Antikörper für EGFR könnte zur Entwickung von Vakzinen führen, die eine Alternative zur wiederholten, kostenintensiven passiven Immunisierung von Patienten mit EGFR-exprimierenden Tumoren mit monoklonalen Antikörpern darstellen könnte.
Für eine erfolgreiche Gentherapie ist zunächst ein effizientes Gentransfersystem nötig, das das Transgen in möglichst vielen Zellen einbaut und es aktiv hält. Damit sich dann der Anteil der geschützten Zellen vergrößert, muss eine Selektivität der genmodifizierten Zellen gegenüber den nativen Zellen gegeben sein, wobei die Sicherheit nicht außer Acht gelassen werden darf, da ein ungünstiger Einbau des Transgens eine Insertionsmutagenese und somit Tumoren induzieren kann. Der durch die Arbeitsgruppe von Laer entwickelte retrovirale Vektor M87o codiert den membranständigen Fusionsinhibitor maC46 (membran-anchored C-Peptid 46), der den Eintritt von HIV (Human Immunodeficiency Virus) in die Zielzelle effektiv verhindert. Diese Gentherapie mit M87o wurde in einer klinischen Studie an T-Lymphozyten von 10 weit fortgeschrittenen AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome)-Patienten durchgeführt, wobei die Therapie gut verträglich war und keine Toxizität zeigte. Allerdings hatten die Patienten auch keinen klaren Vorteil von der Therapie. In der vorliegenden Arbeit wurden SIN Vektoren (Self-inactivating Vektoren) in 5 verschiedenen Konstruktionen getestet, um die optimale Vektordesign zu ermitteln und eine langfristige hohe Expression zu ermöglichen. Da die SIN Vektoren im Vergleich zu konventionellen gammaretroviralen Vektoren ein geringeres Risiko bezüglich der Insertionsmutagenese aufweisen, stellen sie ein sichereres Vektorsystem dar. Um eine bessere Transgenexpression zu erzielen, wurde in den SIN Vektoren entweder ein zellulärer Promotor oder ein viraler SFFV (spleen focus forming virus) als internen Promotor verwendet. Zusätzliche regulatorische Elemente, wie wPRE (Woodchuck Posttranscriptional Regulatory Element), cHS4 (chicken Hypersensitive Site) Insulator und SAR (Scaffold Attachment Region) Element wurden dann in unterschiedlichen Kombinationen zu stärkeren und langanhaltenden Expressionen integriert, wobei wPRE die RNA Prozessierung verbessert und somit die RNA Stabilität erhöht und SAR und cHS4 Insulator dem Silencing entgegenwirken und so die Expression aufrechterhalten. Diese fünf SIN Konfigurationen wurden untereinander und mit dem klassischen gammaretroviralen Vektor M87o bezüglich des Titers, der Expressionsstärke und der Langzeit-Genexpression verglichen. Dazu wurden zunächst humane T-Zelllinien PM-1 und primäre humane T-Zellen als Testzellen verwendet. Die Versuche wurden dann mit murinen T-Zellen wiederholt, die in die immundefiziten Mäuse transplantiert wurden, um die Genexpression in vivo weiter zu verfolgen. Die SIN Konstrukte zeigten jedoch eine deutlich schwächere Expression als die LTR (Long Terminal Repeat)-getriebene Vektoren und nur ein Konstrukt mit dem viralen Promotor und wPRE zeigte eine annähernd so hohe Expression wie die konventionellen Vektoren. Während der virale SFFV Promotor eine höhere Expressionsstärke gegenüber dem zellulären EF1α (Elongationsfaktor 1 alpha) Promotor zeigte, hatte der cHS4 Insulator nur geringfügige Einflüsse sowohl auf den Titer als auch auf die Expressionsstärke. Der Vektor mit dem SAR-Element zeigte zwar die geringsten Titer und Expressionsstärke, aber in Langzeitbeobachtung wies er sowohl in vitro als auch in vivo eine relativ konstante Anzahl von transgenpositiven Zellen auf. SIN Vektoren, in denen mit einer Kombination von wPRE und SAR-Element die RNA Prozessierung verbessert und das methylationsbedingte Silencing verhindert wird, könnten eine weitere Optimierungsmöglichkeit des Gentransfersystems bei der Gentherapie darstellen.
Die maligne Transformation von Zellen beruht auf der Mutation von Genen, die entartete Zellen der regulierenden Wachstumskontrolle entziehen, ihre Versorgung sicher stellen und sie unempfindlich gegen apoptoseinduzierende Signale machen (Hanahan und Weinberg, 2000). Klassische Behandlungsmethoden wie Strahlen- und Chemotherapie wirken häufig über die Aktivierung apoptotischer Signalwege, die jedoch in behandlungsresistenten Tumorzellen blockiert sein können. Das selektive Einbringen proapoptotischer Proteine in Tumorzellen stellt daher eine vielversprechende Strategie zur Umgehung solcher Blockaden dar. In dieser Arbeit wurden tumorspezifische Antikörperfusionsproteine generiert, die humane Zelltod auslösende Proteine als Effektorfunktion enthalten. Das mitochondriale Protein „apoptosis inducing factor“ (AIF) wird durch diverse Apoptosesignale in das Zytoplasma freigesetzt. AIF leitet nach der Translokation in den Zellkern Chromatinkondensation und Degradation der nukleären DNA ein (Cande et al., 2004b). Zur selektiven Einschleusung von zytoplasmatischem AIF (AIF!100) in ErbB2 exprimierende Tumorzellen wurde es an das ErbB2-spezifische „single chain“ Antikörperfragment scFv(FRP5) fusioniert, welches von dem monoklonalen Antikörper FRP5 abgeleitet ist (Wels et al., 1992b). Daneben enthält ein zunächst generiertes AIF!100-DT183-378-5 Fusionsprotein eine Translokationsdomäne aus Diphtherietoxin (AA 183-378) als mögliche „endosome escape“ Aktivität. Diese Domäne sollte der Effektordomäne nach rezeptorvermittelter Aufnahme den Übergang in das Zytoplasma erlauben. Die Expression dieses Moleküls in E. coli und der Hefe Pichia pastoris führte jedoch nicht zu funktionellen AIF!100-DT183-378-5 Proteinen. Daher wurde für nachfolgende Arbeiten ein ähnliches AIF-Fusionsprotein (5-E-AIF!100) aus früheren Arbeiten unserer Gruppe eingesetzt und sein Wirkmechanismus eingehend untersucht. Im Gegensatz zu AIF!100-DT183-378-5 enthält 5-E-AIF!100 die Translokationsdomäne aus Pseudomonas Exotoxin A. Bakteriell exprimiertes, gereinigtes und renaturiertes 5-E-AIF!100 zeigte eine hohe Spezifität für ErbB2 exprimierende Tumorzellen. Im Gegensatz zu unfusioniertem AIF!100 induzierte 5-E-AIF!100 nach Mikroinjektion in das Zytoplasma der Zielzellen keine Apoptose. Dies deutet darauf hin, dass möglicherweise die N-terminale Antikörperdomäne die proapoptotische Aktivität der AIF-Domäne blockiert. Erst die rezeptorvermittelte Aufnahme von 5-E-AIF!100 in Anwesenheit von Chloroquin resultierte in einer hohen Zytotoxizität. Auf diesem Weg wird sehr wahrscheinlich durch proteolytische Spaltung der innerhalb der Translokationsdomäne vorhandenen Furin-Schnittstelle der N-terminale Bereich des Fusionsproteins entfernt. Die eigentliche Translokation der AIF-Domäne findet jedoch ohne die Zugabe endosomolytischer Reagenzien nicht statt, was für eine unzureichende Aktivität der Translokationsdomäne spricht. Die vollständige Entfernung der Translokationsdomäne führte dennoch zu einem AIF-Fusionsprotein, das weder in Abwesenheit noch in Gegenwart von Chloroquin zytotoxisch aktiv ist (Dälken, 2005). Somit ist die in der Translokationsdomäne enthaltene Furin- Schnittstelle sehr wahrscheinlich für die Aktivierung von 5-E-AIF!100 von entscheidender Bedeutung. Im Fall des natürlichen Exotoxin A ist zusätzlich zu der in 5-E-AIF!100 verwendeten Translokationsdomäne ein C-terminales ER-Retentionssignal für einen effizienten Übertritt der katalytisch aktiven Toxindomäne ins Zytoplasma notwendig (Jackson et al., 1999). Das Anfügen eines KDEL-Signals an den C-Terminus von 5-E-AIF!100 führte jedoch nicht zur Erhöhung der „endosome escape“ Aktivität der Translokationsdomäne. Die ladungsabhängige DNA-Bindungsaktivität von AIF ist für die proapoptotische Funktion des Proteins essentiell. Bindung an DNA wurde auch für 5-E-AIF!100 nachgewiesen, und konnte durch Vorinkubation mit negativ geladenem Heparin inhibiert werden. Die Komplexierung mit Heparin führte zu einer erheblichen Reduktion der zytotoxischen Aktivität von 5-E-AIF!100. Mit großer Wahrscheinlichkeit ist die Abschwächung der Zytotoxizität auf die intrazelluläre Inhibition der AIF/DNA-Interaktion zurückzuführen. Dies bestätigt, dass diese Wechselwirkung für die zelltodinduzierende Eigenschaft von 5-E-AIF!100 von Bedeutung ist. Die Freisetzung Immuntoxin-ähnlicher Proteine, die sich nach rezeptorvermittelter Aufnahme in endosomalen Kompartimenten finden, erfordert häufig die Zugabe endosomolytischer Reagenzien. Um eine von endosomolytischen Reagenzien unabhängige Zytotoxizität der Antikörperfusionsproteine zu erreichen, wurden in dieser Arbeit Möglichkeiten zur Umgehung dieser Abhängigkeit untersucht. Hierzu wurde die Natürliche Killerzelllinie NK-92 eingesetzt. Die Eliminierung von infizierten und transformierten Zellen durch NK-Zellen geschieht hauptsächlich über die Ausschüttung von zytotoxischen Granula, die das porenbildende Protein Perforin und verschiedene Serinproteasen wie Granzym B (GrB) enthalten (Atkinson et al., 1990; Smyth et al., 2001). Dabei ist Perforin für die zytosolische Translokation der Proteasen verantwortlich (Browne et al., 1999). Anhand des Modellproteins Granzym B-scFv(FRP5) (GrB-5) wurde untersucht, ob Antikörperfusionsproteine mit Hilfe von Perforin in das Zytoplasma der Zielzellen gelangen können. GrB-5 wurde in NK-92 Zellen unter Beibehaltung der Spezifität und enzymatischen Aktivität exprimiert. GrB-5 ist wie Wildtyp GrB in zytotoxischen Granula lokalisiert und wird nach der Degranulation sehr wahrscheinlich zusammen mit Perforin sekretiert. Freigesetztes GrB-5 zeigte Bindung an ErbB2 exprimierende Zellen. Zudem wiesen Überstände von aktivierten NK-92 Zellen, die GrB-5 und Perforin enthielten, im Vergleich zu Überständen von Kontrollzellen eine höhere Zytotoxizität gegenüber ErbB2-positiven Tumorzellen auf. Dies lässt darauf schließen, dass GrB-5 in Abwesenheit exogener endosomolytischer Reagenzien durch einen Perforin-vermittelten Mechanismus in die Zielzellen gelangen konnte. Weiterhin wurden NK-92 Zellen generiert, die den GrB-Inhibitor Protease Inhibitor-9 (PI-9) exprimieren. Diese Zellen zeigten im Vergleich zu parentalen Zellen eine höhere Zytotoxizität, die sich auf eine verbesserte Inaktivierung fehlgeleiteter, zytoplasmatischer GrB-Moleküle durch das ektopisch exprimierte PI-9 zurückführen lässt. NK-92-PI-9 Zellen könnten genutzt werden, um größere Mengen von GrB-Fusionsproteinen zu exprimieren, ohne dabei die Zellen durch die Erhöhung der zytoplasmatischen GrB-Konzentration zu gefährden. Die in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse zeigen, dass AIF für den Einsatz als Effektorfunktion in Immuntoxin-ähnlichen Fusionsproteinen geeignet ist. Die Anwendung von NK-Zellen zur Expression und Sekretion tumorspezifischer Antikörperfusionsproteinen zusammen mit Perforin zeigt einen möglichen Lösungsweg für das generelle Aufnahmeproblem von Immuntoxin-ähnlichen Proteinen. Die erzielten Ergebnisse können nun für die weitere Optimierung humanisierter Antikörperfusionsproteine genutzt werden.
Resistenz polyklonaler, reifer T-Zellen gegenüber der Transformation durch retrovirale Transduktion
(2008)
Nach den ersten Erfolgen der Gentherapie bei angeborenen Immundefekten wurden einige Fälle von Leukämie nach gammaretroviralem Gentransfer in Blutstammzellen bei Patienten mit „severe combined immunodeficiency“ (SCID-X1) veröffentlicht. Diese entfachten eine Diskussion über das Risiko der Insertionsmutagenese bei der Verwendung gammaretroviraler Vektoren. Durch eine insertionsbedingte Transaktivierung potentieller Onkogene und damit verbundenen malignen Veränderungen können gammaretroviral transduzierte Blutstammzellen Leukämien hervorrufen. Aber nicht nur Blutstammzellen werden als Zielzellen in der Gentherapie genutzt. In der Gruppe von Laer wurde in den letzten Jahren eine neue Gentherapie der HIV-1 Infektion entwickelt. Hierbei werden dem Patienten genetisch geschützte, autologe T-Lymphozyten infundiert. Die Gefahr einer Leukämie durch Insertionsmutagenese sollte im Zuge dieser Studie für reife T-Lymphozyten evaluiert werden. In einer vergleichenden Analyse wurde untersucht, ob der gammaretrovirale Gentransfer in reife T-Lymphozyten die gleiche Genotoxizität birgt wie in hämatopoetische Stammzellen. Hierzu wurden reife T-Lymphozyten und hämatopoetische Progenitoren von C57BL/6(Ly5.1)-Mäusen mit multiplen Kopien gammaretroviraler Vektoren transduziert, die für die potenten T-Zell Onkogene LMO2, TCL1, dTrkA oder das Kontrollgen GFP kodierten. Es wurden sehr hohe Transduktionseffizienzen mit bis zu 70% für reife T-Lymphozyten und bis zu 98% für hämatopoetische Progenitoren erzielt, um möglichst leukämiefördernde Bedingungen zu schaffen. Nach Transplantation in kongene Rag-1 defiziente Empfängertiere (Ly5.2) entwickelten Onkogen-modifizierte Stammzellen nach einer charakteristischen Latenzperiode Leukämien/Lymphome. Am häufigsten wurden unreife, CD8+CD4+ doppelpositive T-Vorläufer Leukämien/Lymphome beobachtet. In einigen Rezipienten führte außerdem eine Überexpression von TCL1 in hämatopoetischen Stammzellen zu der Entwicklung von reifzelligen T-Zell Leukämien/Lymphomen und B-Zell Leukämien/Lymphomen. Die Integrationsanalyse ergab oligo- bis monoklonale Tumore, wobei keine offensichtlich tumorfördernden, die gammaretroviralen Insertionen flankierenden Gene identifiziert werden konnten. Bemerkenswerterweise entwickelte keines der T-Zell transplantierten Empfängertiere ein/e Lymphom/Leukämie, obwohl auch diese Zellen mit den gleichen Vektoren modifiziert wurden und über einen sehr langen Zeitraum persistierten. Um die Kontrollmechanismen dieser Resistenz näher zu untersuchen, wurde eine für den TCR monoklonale, adulte T-Zell Population mit dTrkA transduziert. Nach einer kurzen Latenzperiode entwickelten sich reifzellige T-Zell Leukämien/Lymphome. Anscheinend existiert eine Verbindung zwischen der relativen Transformationsresistenz reifer T-Lymphozyten und dem Konkurrenzverhalten verschiedener T-Zell Klone um stimulatorische MHC-TCR Nischen. Weiterhin wurde in vitro durch gammaretroviralen Transfer von LMO2 ein immortalisierter T-Zell Klon generiert. Dieser zeigte zwar nach einer langen Beobachtungszeit einen CD8-CD4-doppelnegativen Phänotyp, aber auch einen rekombinierten TCR. In vitro überwuchs er eine unmanipulierte Kompetitorpopulation, konnte jedoch nach Transplantation kein/e T-Zell Lymphom/Leukämie induzieren. Die LM-PCR Analyse des Klons lieferte eine sehr interessante Integration zwischen den Genen für die alpha-Ketten des IL-2 und des IL-15 Rezeptors, welche dadurch konstitutiv exprimiert wurden. Dies könnte das erste Beispiel für eine insertionsbedingte Immortalisierung eines adulten T-Zell Klons sein. In der vorliegenden Arbeit konnte zum ersten Mal eindeutig gezeigt werden, dass polyklonale, reife T-Zell Populationen in vivo eine hohe Transformationsresistenz aufweisen. Durch bestimmte Bedingungen können jedoch durchaus maligne Veränderung adulter, reifer T-Lymphozyten induziert werden. Für die Sicherheitsabschätzung gammaretroviraler Gentherapie-Studien mit reifen T-Lymphozyten sind die vorgestellten Ergebnisse von großer Bedeutung und könnten darüber hinaus Aufschluss über die populationsdynamischen Kontrollmechanismen reifer T-Zell Leukämien/Lymphome geben.
Funktionelle Charakterisierung von Peptidliganden für das komplexe HIV-1-RNA-Verpackungssignal PSI
(2008)
Im Laufe der vergangenen Jahre hat die Identifizierung von Peptidleitstrukturen in der Wirkstoffentwicklung zunehmend an Bedeutung gewonnen. Die Phage Display Technologie ist eine Methode, welche zur Selektion von inhibitorischen Peptiden weit verbreitet ist. Prinzipiell eignet sich dieser Ansatz auch für die Suche nach neuen Leitstrukturen für die Therapie der HIV-Infektion, welche in hochspezifische und -regulierte Schritte im HIV-Replikationszyklus eingreifen sollen. Bei der Verpackung viraler RNA in neu entstehende Virionen handelt es sich um einen Prozess, welcher auf der gezielten Erkennung der dreidimensionalen Struktur der PSI-Region am 5'-Ende ungespleißter, viraler RNA durch die NCp7-Domäne des Gagp55-Vorläuferproteins basiert. Darüber hinaus partizipiert das NCp7-Protein noch an der Reversen Transkription der HIV-RNA sowie an der Integration proviraler DNA und spielt somit eine zentrale Rolle im HIV-1 Replikationszyklus. In vorangegangenen Arbeiten konnten wir mittels der Phage Display Technologie Peptidliganden für die HIV-1 PSI-RNA selektieren, welche die PSI-RNA-NCp7-Interaktion hemmten und in Folge dessen die Verpackung viraler RNA verhindern sollten. Die Bindung der identifizierten tryptophanreichen Peptide an die PSI-RNA konnte zwar zum Teil in vitro mit NCp7 kompetitiert werden, jedoch wiesen die Peptide eine relativ geringe Affinität für die PSI-RNA auf. Im Vordergrund der vorliegenden Arbeit stand nach Optimierung der Affinität eine umfassende funktionelle Charakterisierung der Peptide hinsichtlich ihrer antiviralen Aktivität in vitro. Zunächst gelang es mittels Spot-Synthese-Membranen die Affinität der PSI-RNA-bindenden Peptide um etwa das 30-fache zu verbessern. Der KD-Wert des optimierten HKWPWW-Peptids lag bei 1,1 µM für ein Teilelement der PSI-RNA, das allein über Verpackungsaktivitäten verfügt. Die folgende Analyse der Bindungseigenschaften des HKWPWW-Peptids an die PSI-RNA über NMR und Fluoreszenz-Spektroskopie offenbarte, dass das Peptid über die hydrophoben Aminosäuren an eine charakteristische Schleifenregion in der Sekundärstruktur der PSI-RNA bindet, ähnlich wie der natürliche Ligand NCp7. Gestützt auf diese Ergebnisse, wurde im Hauptteil des Projekts untersucht, ob das HKWPWW-Peptid in der Lage ist, die Verpackung viraler RNA in HI-Virionen zu hemmen. Hierfür erfolgte die Etablierung diverser Testsysteme, welche die intrazelluläre Expression des Peptids ermöglichten. Die Expression von HKWPWW in Fusion mit RFP in Pseudoviren-produzierenden Zellen über transiente Transfektion führte in der höchsten getesteten DNA-Konzentration (2,5 µg) zu einer 95%igen Reduktion des infektiösen Titers. Dieser inhibitorische Effekt war spezifisch für lentivirale Pseudoviren, da die Produktion gammaretroviraler Pseudoviren nicht durch die Anwesenheit des Peptids beeinflusst wurde. Mittels einer stabilen HKWPWW-exprimierenden T-Zelllinie gelang es nachzuweisen, dass das Peptid sogar in der Lage ist, replikationskompetentes HIV über einen Zeitraum von fünf Tagen zu hemmen. Die Synthese des HKWPWW-Peptids in Fusion mit einer Proteintransduktionsdomäne ermöglichte die direkte Behandlung von HIV-infizierten Zellen und führte zu einer verminderten Freisetzung infektiöser HI-Viren in die Zellkulturüberstände. Dabei lagen die IC50- und IC90-Werte des HKWPWW-Peptids nach zweimaliger Peptidzugabe bei 5, 7 bzw. 28,6 µM. Eine in der Literatur oftmals beschriebene Beobachtung ist, dass bei einer reinen Hemmung der HIV-Verpackung Viren entstehen, welche keine virale RNA enthalten. Das Phänomen war in Anwesenheit des HKWPWW-Peptids wenig ausgeprägt wie Korrelationen von p24-Antigen-ELISA und die Quantifizierung viraler RNA in Viruspartikeln zeigten. Diese Gegebenheit sowie das Wissen über die mannigfaltigen Funktionen des NCp7-Proteins im HIV-Replikationszyklus ließen vermuten, dass HKWPWW noch zusätzlich andere Schritte im HIV-Replikationszyklus hemmen könnte. Unterstützt wurde diese Annahme dadurch, dass HKWPWW Ähnlichkeiten zu der hydrophoben Plattform von NCp7 aufweist, welche essentiell für die Verpackung viraler RNA sowie die Reverse Transkription ist. Damit in Einklang steht, das neben einer Bindung an die PSI-RNA auch eine schwächere Interaktion des HKWPWW-Peptids mit den viralen TAR- und PBS-Strukturen nachgewiesen werden konnte. Die auch beobachtete Hemmung der frühen HIV-Replikationsschritte durch HKWPWW könnte somit mit einer möglichen Hemmung der Transkription viraler Gene, der Reversen Transkription oder Integration erklärt werden. Jedoch zeigte die elektronenmikroskopische Analyse, dass nicht nur weniger Viren in Anwesenheit des HKWPWW-Peptids entstehen, sondern dass diese zum Teil einen weniger kondensierten Kern aufweisen. Dies kann als ein Anhaltspunkt angesehen werden, dass HKWPWW tatsächlich auch auf der Ebene der RNA-Verpackung bzw. der viralen Partikelentstehung einen hemmenden Effekt ausübt. Somit resultiert die beobachtete antivirale Aktivität des HKWPWW-Peptids vermutlich aus kombinierten inhibitorischen Effekten auf mehreren Ebenen der HIV-Replikation.
Tumorerkrankungen, insbesondere solche im metastasierenden Stadium, erfordern effiziente Therapien. Krebstherapien wie Bestrahlung oder Chemotherapie wirken über die Induktion von Apoptose. Resistenz gegen diese Behandlungsansätze geht einher mit der Blockierung relevanter apoptotischer Signalwege. Dennoch haben Tumorzellen nicht grundsätzlich die Fähigkeit verloren, apoptotischen Zelltod zu sterben, d. h. mit einem geeigneten Stimulus kann in jeder Tumorzelle Apoptose induziert werden. In dieser Arbeit wurden Proteine entwickelt, die Enzyme apoptotischer Signalkaskaden selektiv in Tumorzellen einschleusen. Um Spezifität für transformierte Zellen zu erlangen, wurden diese Proteine mit Zellbindungsdomänen gekoppelt, die an tumorassoziierte Antigene binden. Als Zielstrukturen auf der Oberfläche von Krebszellen dienten die Rezeptoren der ErbB Familie „epidermal growth factor receptor“ (EGFR) und ErbB2. Überexpression dieser Rezeptoren wird auf einer Vielzahl von Tumoren epithelialen Ursprungs beobachtet und ist ursächlich beteiligt an der malignen Transformation. Als Apoptoseinduktoren wurden die Serinprotease Granzym B (GrB) sowie das Protein „apoptosis inducing factor“ (AIF) eingesetzt. GrB induziert Apoptose durch direkte Aktivierung von Caspasen und Spaltung zentraler Caspasen-Substrate. Damit greift die Protease am unteren Effektorende apoptotischer Signalwege ein und umgeht so die meisten Resistenzmechanismen transformierter Zellen. Um GrB in Tumorzellen einzuschleusen, wurde die Protease mit dem ErbB2 spezifischen Antikörperfragment scFv(FRP5) gekoppelt. Zunächst wurde eine biotinylierte Variante der Protease (bGrB) über die hochaffine Streptavidin/ Biotin Interaktion mit einem Fusionsprotein komplexiert, das aus dem scFv(FRP5) und Streptavidin besteht (SA-5). Komplexe aus enzymatisch aktivem bGrB und SA-5 wiesen selektive cytotoxische Aktivität gegenüber ErbB2 exprimierenden Zellen auf, die allerdings von der Präsenz des endosomolytischen Reagenz Chloroquin abhing. Dies zeigt die Notwendigkeit einer Translokation vom endosomalen Kompartiment, um internalisiertem GrB Zugang zu seinen cytosolischen Substraten zu ermöglichen. Aufbauend auf diesen Ergebnissen, die grundsätzlich nachweisen, daß das Einbringen von GrB in Tumorzellen ausreichend ist, um in diesen Zellen Apoptose zu induzieren, wurden Fusionsproteine abgeleitet, in denen GrB direkt mit Zellbindungsdomänen fusioniert ist. Neben dem scFv(FRP5) wurde auch der EGFR-Ligand TGFalpha eingesetzt. Fusionsproteine bestehend aus reifem GrB und scFv(FRP5) (GrB-5) bzw. TGFalpha (GrB-T) wurden in der Hefe Pichia pastoris exprimiert und mit hohen Ausbeuten gereinigt. GrB-5 und GrB-T zeigten enzymatische Aktivität und wiesen Affinität zu ErbB2 bzw. EGFR auf. In Gegenwart von Chloroquin zeigten GrB-5 und GrB-T selektive cytotoxische Aktivität gegenüber Zellen, die den jeweiligen Zielrezeptor exprimieren. Die IC50 Werte der Proteine lagen im pico- bis nanomolaren Bereich und sind damit vergleichbar mit denen rekombinanter Immun- bzw. Wachstumsfaktortoxine, die Exotoxin A (ETA) aus Pseudomonas aeruginosa als Effektor nutzen. Induktion von Apoptose erfolgte durch GrB-5 und GrB-T allerdings deutlich schneller (3 h) als durch ETA Fusionsproteine (72 h), da GrB im Gegensatz zu ETA direkt in apoptotische Signalkaskaden eingreift. Um die weitere Charakterisierung von GrB-5 und GrB-T zu erleichtern, wurden in der vorliegenden Arbeit Möglichkeiten für eine Optimierung der Expression dieser Fusionsproteine in Hefe untersucht. Dazu wurde eine Strategie entwickelt, die auf der Beobachtung beruht, daß die Löslichkeit und Stabilität von Proteinen durch Fusion mit solchen Domänen erhöht werden kann, die selbst eine hohe Löslichkeit und Stabilität besitzen. Ein Protein mit diesen Eigenschaften ist das Maltose Bindungsprotein (MBP) aus E. coli. In dieser Arbeit wurde MBP bei der Expression rekombinanter Proteine in P. pastoris eingesetzt, um die Ausbeute löslicher Proteine zu steigern. Es wurde eine Strategie entwickelt, die es erlaubt, MBP posttranslational in vivo vom Fusionspartner zu trennen. Hierzu wurde eine Erkennungssequenz der Protease Furin (furS) zwischen MBP und Fusionspartner eingefügt. Zunächst wurde untersucht, ob GrB als MBP Fusionsprotein in enzymatisch aktiver Form exprimiert werden kann, was eine Grundvoraussetzung für die Expression tumorspezifischer GrB Fusionsproteine in diesem System darstellt. Die Ausbeute von GrB konnte durch diese Strategie erheblich gesteigert werden. Daneben war eine vollständige Prozessierung der Fusionsproteine innerhalb der Furin-Erkennungssequenz nachweisbar. Als MBP Fusionsprotein exprimiertes GrB wies allerdings keine enzymatische Aktivität auf. Weitere Untersuchungen zeigten, daß das terminale Serin der furS-Sequenz, das nach Spaltung durch Furin am N-Terminus von GrB zurückbleibt, die enzymatische Aktivität der Serinprotease inhibiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher nicht weiter versucht, die Ausbeute an tumorspezifischen GrB Fusionsproteinen durch Fusion mit löslichen Proteindomänen zu erhöhen. Für Proteine, die ein N-terminales Serin tolerieren, stellt das hier entwickelte System allerdings eine neuartige Strategie dar, um die Ausbeute in P. pastoris um ein Vielfaches zu steigern. Dies wurde anhand von rekombinantem ErbB2 als Modellprotein bestätigt. Als alternativer Effektor in tumorspezifischen Fusionsproteinen wurde AIF als caspasenunabhängig agierendes proapoptotisches Signalmolekül eingesetzt. In apoptotischen Zellen bewirkt die Freisetzung von AIF aus dem mitochondrialen Intermembranraum die nachfolgende Translokation des Proteins in den Zellkern, woraufhin DNA-Fragmentierung induziert wird. Zum Einschleusen von AIF in Tumorzellen wurde das Flavoprotein mit dem scFv(FRP5) fusioniert (5-AIF). Um eine cytosolische Translokation von AIF zu erreichen, wurde ein Konstrukt abgeleitet, das zusätzlich die Translokationsdomäne von Exotoxin A enthält (5-E-AIF). Diese Domäne ist beim Wildtyp-Toxin notwendig für dessen retrograden Transport vom Endosom über den Golgi Apparat und das ER in das Cytosol. Innerhalb der Translokationsdomäne findet zudem eine Prozessierung durch die endosomale Protease Furin statt. AIF Fusionsproteine wurden in E. coli exprimiert, gereinigt und renaturiert. Die Proteine wiesen Affinität für ErbB2 auf und interagierten mit DNA, eine Eigenschaft, die essentiell für die proapoptotische Aktivität von AIF ist. 5-E-AIF zeigte gegenüber ErbB2 exprimierenden Zellen cytotoxische Aktivität, die vergleichbar mit der des Immuntoxins scFv(FRP5)-ETA war. Diese Aktivität war allerdings nur in Gegenwart von Chloroquin gegeben. Das Protein 5-AIF, in dem die Translokationsdomäne fehlt, zeigte auch in Kombination mit Chloroquin keine Cytotoxizität. Eine mögliche Folgerung hieraus ist, daß die N-terminale Antikörperdomäne der Fusionsproteine die proapoptotische Aktivität der AIF Domäne blockiert. 5-E-A wird sehr wahrscheinlich durch die endosomale Protease Furin „aktiviert“, die den scFv(FRP5) durch proteolytische Spaltung innerhalb der ETA-Domäne entfernt haben könnte. Für die eigentliche Translokation reicht der ETA-Anteil allerdings nicht aus, wahrscheinlich, weil in dem hier abgeleiteten Konstrukt ein für die Funktionsweise des Wildtyp-Toxins essentielles ER Retentionssignal fehlte. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, daß durch Einsatz apoptotischer Signalmoleküle in tumorzellspezifischen Fusionsproteinen hohe und selektive cytotoxische Aktivitäten erzielt werden können. Eine weitere Entwicklung dieser Proteine als mögliche Tumortherapeutika erscheint daher sinnvoll.
Präklinische Untersuchungen zur Gentherapie der HIV-Infektion mit dem retroviralen Vektor M87o
(2007)
Mit der Einführung der hochaktiven antiretroviralen Therapie (HAART) 1995 wandelte sich die HIV-Infektion in den Industrieländern von einer akut lebensbedrohlichen zu einer chronisch verlaufenden und scheinbar gut kontrollierten Erkrankung. Das Virus wird allerdings nie vollständig aus dem Körper eliminiert, sodass die Betroffenen zeitlebens Medikamente einnehmen müssen. Die Langzeit-Medikation wird häufig von schweren Nebenwirkungen begleitet, führt zur Selektion resistenter Viren und muss häufig umgestellt werden. Gentherapeutische Verfahren, die die CD4+ Zielzellen durch die Expression antiviraler Gene vor der Infektion durch HIV schützen („intrazelluläre Immunisierung“), stellen viel versprechende Therapiealternativen dar. Der in der Arbeitsgruppe von Laer entwickelte retrovirale Vektor M87o (EGELHOFER et al. 2004, EGELHOFER 2004) exprimiert das 46 Aminosäuren lange membran-verankerte Peptid C46, das in der Lage ist, die gp41-vermittelte Fusion von Virus- und Zellmembran zu inhibieren. In Zelllinien und primären Lymphozyten konnte gezeigt werden, dass M87o die Infektion durch unterschiedliche HIV-Isolate sehr effektiv verhindert. Im Rahmen vorklinischer Untersuchungen konnte in vitro gezeigt werden, dass die retrovirale Transduktion mit M87o das Transformationsrisiko und damit das Risiko der Entstehung von Neoplasien nicht steigert. An primären peripheren T-Zellen konnte zeigt werden, dass M87o die Zielzellen weder phänotypische noch funktionelle verändert. Für die Untersuchung der retroviralen Gentherapie im Rhesusaffenmodell wurde zunächst ein Gentransferprotokoll für periphere Affenlymphozyten entwickelt, mit dem in Vorversuchen Gentransferraten von ca. 50% erreicht werden konnten. Das Transduktionsprotokoll wurde anschließend im Rahmen einer präklinischen Studie zur Toxizität und Immunogenität der M87o-Gentherapie, bei der Herstellung zweier Studientransplantate angewandt. Beide Zellpräparate wurden den Versuchstieren transplantiert. Während des Eingriffs traten keine akuttoxischen Reaktionen auf. M87o+-Zellen konnten bis 140 Tage nach der Transplantation mittels PCR nachgewiesen werden. Immunologische Untersuchungen (Cytokinfärbung, Proliferationsassay, ELISPOT) ergaben keine Hinweise auf zelluläre oder humorale Immunreaktionen. M87o-spezifische Antikörper waren im Serum nicht nachweisbar. Für die Durchführung einer klinischen Studie zur Toxizität und Wirksamkeit (Phase I/II) an HIV-infizierten Probanden wurde ein Protokoll zur Produktion M87o-modifizierter T-Zellen (mindestens 5 × 108 M87o+ CD4-T-Zellen pro Spender) entwickelt. In die klinische Prüfung wurden Patienten aufgenommen, die nach multiplem Therapieversagen durch das Auftreten multiresistenter HIV eine CD4-Zellzahl von 50 bis 200 µl-1 Blut, sowie eine Viruslast von >5.000 Kopien ml-1 Blut aufwiesen. Im Versuchsmaßstab konnte ein Transduktionsprotokoll erarbeitet werden, mit dem im Mittel 46% der CD4+ T-Zellen mit M87o transduziert werden konnten. Innerhalb von 10 Tagen expandierte die Zellzahl im Mittel um den Faktor 153, wobei die HIV-Replikation vollständig inhibiert wurde. Das Protokoll wurde erfolgreich vom Versuchsmaßstab in den klinisch relevanten Produktionsmaßstab übersetzt. In drei Versuchsläufen wurde im Mittel eine Transduktionsrate von 29% erreicht und die Zellzahl um den Faktor 44 vermehrt. Der Anteil an CD3+/CD4+ Zellen an der Gesamtpopulation lag im Mittel bei 91%. Insgesamt konnten mit dem etablierten Protokoll durchschnittlich 2,3 × 109 CD3+/CD4+/M87o+ Zellen, bei gleichzeitig vollständiger Inhibition der HIV-Replikation, generiert werden. Im Rahmen einer klinischen Studie zur Toxizität und Wirksamkeit der M87o-Gentherapie wurden 10 Studientransplantate gemäß dem im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Protokoll hergestellt. Alle Transplantate wurden am Universitäts-Krankenhaus Eppendorf in Hamburg transfundiert und von den Patienten sehr gut vertragen.