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Hitze-Stress-Transkriptionsfaktoren (Hsfs) stellen die zentralen regulatorischen Komponenten einer Signal-Transduktionskette dar, welche die Aktivierung von Hitze-Stress-induzierbaren Genen bewirken. Die Sequenzierung des Genoms von Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) führte zu der Entdeckung von 21 Genen, die für putative Hsfs codieren. Aufgrund struktureller Charakteristika und phylogenetischer Analysen wurden die 21 Hsfs in die Klassen A, B und C aufgeteilt. Der Hauptteil der vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit der funktionellen Charakterisierung der Hsf Familie aus Arabidopsis. Um generelle Konzepte zur Funktion von pflanzlichen Hsfs als Aktivatoren zu unterstützen, wurden als Ausgangspunkt ausgewählte Hsfs aus Lycopersicon peruvianum (Tomate) zu detaillierten Analysen herangezogen. Hsfs besitzen, ähnlich anderen Transkriptions -aktivierenden Proteinen, eine modulare Struktur. In der vorliegenden Arbeit wurden funktionelle Module der 21 Arabidopsis Hsfs untersucht, die für den Oligomerisierungs-Zustand, die intrazelluläre Lokalisation sowie das Transkriptions-aktivierende Potential von Bedeutung sind. Essentiell für die Funktion von Klasse A Hsfs als Transkriptions-Aktivatoren sind kurze Peptidmotive, die durch aromatische und große hydrophobe Aminosäure-Seitenketten geprägt sind, die in einer sauren Umgebung eingebettet sind (AHA Motive: aromatic, large hydrophobic and acid amino acid residues). Es wurde mit GST pull-down Assays gezeigt, dass AHA Motive mit ausgewählten Transkriptions-Komplexen interagieren. Das generelle Konzept für AHA Motive als kohäsive Elemente zur Interaktion mit der Transkriptions- Maschinerie wurde durch Mutationsanalysen verifiziert, besonders detailliert am Beispiel von LpHsfA2 und LpHsfA1 aus Tomate in Reporter-Assays in Tabak-Protoplasten und Hefe als auch GST pull-down Experimenten gezeigt. Im Kontrast zu den Klasse A Hsfs besitzen Klasse B und C Hsfs keine AHA Motive. Diese zeigten auch keine eigene Aktivator-Funktion aber Experimente deuten darauf hin, daß sie Coregulatoren für Klasse A Hsfs darstellen. Es wurde gezeigt, dass diese pflanzliche Besonderheit bei Tomate als auch Arabidopsis existiert. Alle 21 Arabidopsis Hsfs wurden als Transkripte nachgewiesen, ihre Expression verhält sich sehr dynamisch in bezug auf Hitze-Stress als auch Entwicklungssignale. Die präsentierte funktionelle Charakterisierung der Hsf Familie von Arabidopsis gibt erste Einsichten in das komplexe Netzwerk der Hsfs und demonstriert bereits, dass im Vergleich zu anderen Organismen, wie z.B. Drosophila und Hefe mit einem Hsf und Säugern mit drei Hsfs, das komplexe pflanzliche Hsf System eine fein regulierte und effiziente Voraussetzung für Pflanzen darstellt, um schnell und vor allem erfolgreich auf Umwelteinflüsse zu reagieren, denen sie nicht entfliehen können.
Orthopoxviruses are large DNA viruses that replicate within the cytoplasm of infected cells encoding over a hundred different proteins. The orthopoxviral 68k ankyrin‐like protein (68k‐ank) is highly conserved among orthopoxviruses, and this study aimed at elucidating the function of 68k‐ank. The 68k‐ank protein is composed of four ankyrin repeats (ANK) and an F‐box‐like domain; both motifs are known proteinprotein interaction domains. The F‐box is found in cellular F‐box proteins (FBP), crucial components of cellular E3 ubiquitin (Ub) ligases. With yeast‐two‐hybrid screens and subsequent co‐immunoprecipitation analyses, it was possible to identify S‐phase kinase‐associated protein 1a (Skp1a) as a cellular counterpart of 68k‐ank via binding to the F‐box‐like domain. Additionally, Cullin‐1 was co‐precipitated, suggesting the formation of a viral‐cellular SCF E3 Ub ligase complex. Modified Vaccinia virus Ankara (MVA) ‐ being attenuated and unable to replicate in most mammalian cell lines due to a block in morphogenesis – nevertheless, expresses its complete genetic information attributing to its properties as promising vector vaccine. Conservation of 68k‐ank as the only ANK protein encoded by MVA implied a substantial role of this viral factor. Hence, its function in the viral life cycle was assessed by studying a 68k‐ank knock‐out MVA. A mutant phenotype manifested in nonpermissive mammalian cells characterized by a block succeeding viral early gene expression and by a reduced ability of the virus to shutoff host protein synthesis. Studies with MVA encoding a 68k‐ank F‐box‐like domain truncated protein revealed that viral‐cellular SCF complex formation and maintenance of viral gene expression are two distinct, unrelated functions fulfilled by 68k‐ank. Moreover, K1, a well‐described VACV host range factor of the ANK protein family, is able to complement 68k‐ank function. This suggests that gene expression of MVA putatively depends on the ANKs encoded in 68k‐ank. In addition to the important findings in vitro, first virulence studies with the mouse pox agent, ectromelia virus (ECTV) deleted of the 68k‐ank ortholog (C11) suggested that this factor contributes to ECTV virulence in vivo.
Die chromosomale Translokation t(4;11) ist mit einer aggressiven pro-B ALL im Kleinkindesalter assoziiert und stellt eine der häufigsten genetischen Veränderungen des MLL Gens dar. Bei bis zu 40 % der untersuchten Translokationen des MLL Gens wurde das AF4 Gen als Translokationspartner identifiziert. Durch Arbeiten in unserer Arbeitsgruppe konnte in Focus Formation Experimenten das wachstumstrans-formierende Potenzial sowohl des Wildtyp AF4 Proteins, als auch des bei der Translokation entstehenden AF4•MLL Fusionsproteins, nachgewiesen werden. Es kann somit als gesichert angesehen werden, daß es sich bei dem Wildtyp-AF4 Protein um ein Proto-Onkoprotein und bei dem AF4•MLL Fusionsprotein um ein Onkoprotein handelt. Der für beide Proteine identische Bereich beschränkt sich auf die ersten 360 Aminosäuren des AF4 Proteins, was der Hypothese führte, daß der N-Terminale Bereich des AF4 Proteins (AF4•N) für das beobachtete onkogene Potential in murinen embryonalen Fibroblasten verantwortlich ist. Ein mit dem AF4•N Protein durchgeführter Hefe-2-Hybrid Screen identifizierte die beiden E3-Ligasen SIAH1 und SIAH2 als Bindungspartner. Hierbei handelt es sich um Tumorsupressor- Proteine, die durch Ubiquitinylierung von Zielproteinen diese dem proteasomalen Abbau zuführen. Unter normalen physiologischen Bedingungen unterliegt das AF4 Protein einem raschen Abbau am Proteasom. Dies ist für das AF4•MLL Fusionsprotein nur noch eingeschränkt möglich, da es wie für das Wildtyp-MLL beobachetet proteolytisch gespalten wird, mit sich selbst dimerisiert und dann nicht mehr über das Proteasom abgebaut werden kann. Eine Bindung der beiden E3-Ligasen SIAH1 und SIAH2 konnte jedoch noch beobachtet werden, deshalb sollte die AF4 und SIAH Protein-Protein-Interaktion genauer untersucht werden. Hierzu wurden Hefe-2-Hybrid Experimente mit Deletionsmutanten durchgeführt, um die minimalen Kontakt-domänen zu identifiziert. Die Stärke der Interaktionen wurde durch ß-Galaktosidasetests ermittelt. Die identifizierte minimale AF4 Proteindomäne enthält das für die Erkennung durch die E3-Ligasen notwendige PxAxVxP Motiv und hat eine Länge von 25 Aminosäuren. Für die E3-Ligasen SIAH1 und SIAH2 konnte der für die Interaktion notwendige Kontaktbereich innerhalb der sogenannten Substrat-Bindungs-Domäne (SBD) lokalisiert werden. Interessanterweise ist nicht die große Furche des Dimerisierungsinterfaces der beiden SIAH Monomere der Kontaktbereich, sondern der proximale Zink-Finger Bereich. Die experimentell ermittelten Proteindomänen wurden in geeignete bakterielle Expressionssysteme kloniert und ihre in vitro Interaktion durch Pulldown-Experimente bestätigt. Die strukturelle Aufklärung der Kontaktdomäne erfolgte dann mit Hilfe der NMR-Fast-Mapping Methode. Mit dieser kombinatorischen Methode wurden die an der AF4 Bindung beteiligten Aminosäuren des SIAH Proteins durch Änderung ihrer chemischen Verschiebung im [15N,1H] HSQC-Spektrum nach Titration mit steigenden AF4 Konzentrationen identifiziert. Aus den erhaltenen Daten und anhand der bekannten SIAH Röntgenstruktur konnte ein Modell für die Bindung des AF4 Proteins an die E3-Ligase SIAH1 erstellt werden. Über die Funktion des Proto-Onkoproteins AF4 ist bis dato wenig bekannt. Es gibt Hinweise, daß alle Vertreter der ALF Proteinfamilie über transkriptionsaktivierende Eigenschaften verfügen. Da posttranslationale Modifikationen von Proteinen, wie z.B. Sumoylierung, häufig zur Regulation von Transkriptionsfaktoren beobachtet werden, wurden Untersuchungen auf posttranslationale Modifikationen des AF4 Proteins durchgeführt. Hierzu wurde durch Mutation der E3-Ligase Erkennungssequenz PxAxVxP eine stabilisierte AF4 Mutante hergestellt. Durch Immunopräzipitations Experimente nach Transfektion in 293T Zellen konnte sowohl die Sumoylierung, als auch Tyrosin Phosphorylierungen des AF4 Proteins nachgewiesen werden.
Bei Untersuchungen HBV-positiver Zellen konnte zunächst, anders als für HCV, eine deutlich gesteigerte Menge an TIP47 im Western Blot nachgewiesen werden. Da außerdem auch die zellulären mRNA-Spiegel von TIP47 erhöht waren, wurde in Promotorstudien der genaue Regulationsmechanismus untersucht. Für HBV sind zwei wichtige Faktoren bekannt, welche diverse zelluläre Signalkaskaden, wie z. B. die c-Raf/MAP-Kinase-Kaskade, modulieren, die PreS2-Aktivatordomäne des LHBsAg und das HBx-Protein [360]. Diese regulieren via c-Raf die Expression der unterschiedlichsten Gene. Nach eingehenden Analysen lässt sich dazu auch TIP47 zählen, dessen Expression durch HBx und LHBs gesteigert werden kann. Außerdem konnte in CLSM-Analysen eine partielle Colokalisation von LHBs und TIP47 beobachtet werden. Durch Modulation der TIP47-Expression in HBV-positiven Zellen konnte anschließend die Relevanz für die Virus-Sekretion untersucht werden. Durch gezielten knockdown von TIP47 durch spezifische siRNAs wurde die Freisetzung von viralen Partikeln gestört, wohingegen die Menge an freigesetzten subviralen Partikeln erhöht war. Die Überexpression von TIP47 hingegen konnte die Virus-Sekretion steigern, während das Niveau der subviralen Partikel nahezu gleich blieb. Des Weiteren konnte auch für HBV die Rab9-Bindung an TIP47 als essentielle Funktion Charakterisiert werden, da eine Inhibition dieser Interaktion eine Hemmung der Sekretion viraler Partikel zur Folge hatte. Auch hier konnte kein Einfluss auf die subviralen Partikel beobachtet werden. In Studien wurde a-Taxilin als neuer Bindungspartner von Proteinen der Syntaxin-Familie entdeckt. Es spielt daher eine wichtige Rolle im intrazellulären Vesikeltransport. Vor allem die Interaktion mit Syntaxin-4 ist gut untersucht [132]. Es wird vermutet, dass a-Taxilin durch die Bindung an freies Syntaxin-4 die v-SNARE-Bildung verhindert und so einen inhibitorischen Effekt auf den vesikulären Transport ausübt. Des Weiteren konnten Untersuchungen beim Hepatitis-B-Virus demonstrieren, dass die Expression von a-Taxilin durch die Virus-Replikation drastisch erhöht ist und die Sekretion der subviralen Partikel, welche mittels Vesikeln aus der Zelle transportiert werden, negativ beeinflusst. Andererseits interagiert a-Taxilin mit dem großen viralen Oberflächenprotein LHBs und dient so als Adapter zwischen LHBs und tsg101 beim ESCRT-vermittelten Export des Virus via MVBs - einem Zusammenschluss aus vielen späten Endosomen [126].Anders als für HBV, welches aktiv die Menge an intrazellulärem a-Taxilin erhöht, konnte in früheren RNA-Expressionsexperimenten mit transgenen Mäusen, welche Leberspezifisch das regulatorische HCV-Protein NS5A produzieren, eine deutlich verminderte Expression von a-Taxilin beobachtet werden [140]. Durch Analysen von Leberzelllysaten im Western Blot konnte dieser Effekt auch auf Proteinebene bestätigt werden. Dieanschließende Analyse HCV-replizierender Zellen in vitro ergab ebenfalls eine verminderte a-Taxilin-Expression und in der Folge eine reduzierte Proteinmenge. Weiterhin konnte diese Arbeit klären, dass HCV via NS5A den a-Taxilin-Promotor negativ beeinflusst und dafür den bereits für NS5A beschriebenen Mechanismus der c-Raf-Modulation nutzt [234]. Darüber hinaus wird a-Taxilin durch HCV destabilisiert, da in HCV-replizierenden Zellen die Proteinhalbwertszeit von a-Taxilin in etwa halbiert war. Der genaue Mechanismus hierfür muss jedoch noch genauer untersucht werden. Es kann aber aufgrund von anderen aktuellen Studien davon ausgegangen werden, dass a-Taxilin höchstwahrscheinlich durch HCV-Strukturproteine abgefangen wird, welche nicht am Aufbau neuer Virionen beteiligt sind. Diese werden dann, zusammen mit dem gebundenen a-Taxilin, im autophagosomalen Kompartiment recycelt. Gestützt wird diese Hypothese durch die Beobachtungen in CLSM-Analysen, dass die HCV- Strukturproteine E1, E2 und Core partiell mit a-Taxilin colokalisieren und auch durch Co-Immunpräzipitationen sowie yeast-2-hybrid-Analysen eine direkte Interaktion nachgewiesen werden konnte. Dabei konnten vor allem für das Core-Protein zwei unterschiedliche Fraktionen nachgewiesen werden, von denen nur die zytoplasmatisch lokalisierte Fraktion mit a-Taxilin colokalisierte, nicht aber mit dem an den lipid droplets gebundenen Core. Neben der Untersuchung der funktionellen Zusammenhänge wurde außerdem die Relevanz von a-Taxilin für den HCV-Lebenszyklus charakterisiert. Dabei wurde die Expression von a-Taxilin moduliert und der Einfluss auf die Freisetzung infektiöser HCV-Partikel untersucht. Durch die Überexpression von a-Taxilin konnte die Sekretion von Virionen verhindert werden, wohingegen die weitere Reduktion der a-Taxilin-Menge mittels spezifischer siRNA zu einer verstärkten Virus-Freisetzung führte. In einem parallel durchgeführten Projekt konnten durch die Modulation von Syntaxin-4 genau gegenteilige Beobachtungen gemacht werden. Demnach verstärkte eine Überexpression von Syntaxin-4 die HCV-Sekretion, während der knockdown zur Inhibition des Prozesses führte. Abschließend lässt sich festhalten, dass im Rahmen dieser Arbeit zwei zelluläre Proteine in Bezug auf die Morphogenese und Sekretion von HBV und HCV näher Charakterisiert wurden, denen zuvor für das jeweils andere Virus eine entscheidende Rolle im viralen Lebenszyklus zugeordnet werden konnte. TIP47 wurde somit als positiver Regulator für die HBV-Sekretion identifiziert, auch wenn die genaue funktionelle Relevanz bzw. der Funktionsmechanismus bisher noch nicht eindeutig geklärt werden konnte. So liegt jedoch der Schluss nahe, dass es nur die Freisetzung der viralen Partikel via MVBs beeinflusst und nicht an der Sekretion der subviralen Partikel beteiligt ist. Für HCV konnte mit a-Taxilin erstmals ein viraler Restriktionsfaktor beschrieben werden, da es entscheidend die Sekretion infektiöser Viruspartikel verhindert. Im Gegenzug hat HCV, durch die Deregulation des Promotors und durch das Abfangen von a-Taxilin, Mechanismen entwickelt, welche diesem restriktiven Effekt entgegen wirken.
Eine Infektion mit dem Hepatitis B Virus (HBV) kann bei 5-10 % der infizierten Erwachsenen und 70-90 % der infizierten Kinder chronisch verlaufen. Trotz einer verfügbaren Impfung gegen die Erkrankung sind heute nach Angaben der WHO weltweit etwa 350 Mio. Menschen chronisch HBV-infiziert [Lupberger and Hildt, 2007, Hollinger and Liang, 2001]. In 5-10 % der Fälle führt eine chronische Infektion zu einer Leberfibrose und Zirrhose, welche letztlich zur Ausbildung eines hepatozellulären Karzinoms (HCC) führen kann. HCCs sind die dritthäufigste karzinomassoziierte Todesursache weltweit [Blum, 2005]. Um Therapien gegen eine HBV-Infektion und das damit erhöhte Risiko einer HCC-Entstehung entwickeln zu können, müssen die einzelnen Schritte des HBV-Replikationszyklus verstanden sein. Wesentliche Schritte der frühen Infektionsphase, insbesondere der Rezeptor bzw. Rezeptorkomplex, welcher den Zelleintritt des Virus vermittelt sowie der Transport des Virusgenoms in den Zellkern, sind bisher noch unklar. Auch der Exportprozess und die Freisetzung der Viruspartikel ist bisher noch nicht im Detail verstanden. Es ist jedoch bekannt, dass die Viruspartikel unter Nutzung der zellulären ESCRT (endosomal sorting complex required for transport)-Maschinerie aus der Zelle freigesetzt werden [Lambert et al., 2007]. Auf der Suche nach Faktoren, die in diese Vorgänge involviert sind, konnte in dieser Arbeit das vesikeltransportassoziierte Protein α-Taxilin identifiziert werden. Der Einfluss von HBV auf die α-Taxilin-Bildung und seine mögliche Beteiligung am viralen Export wurden dabei näher charakterisiert. In HBV-positiven Zellen konnte in vivo und in vitro eine signifikante Steigerung der α-Taxilin-Expression nachgewiesen werden. Diese wird hierbei durch die HBV-Proteine HBx und LHBs über den Raf/Mek/Erk-Signalweg induziert [Glatzel, 2011]. Mithilfe von knockdown-Experimenten konnte beobachtet werden, dass α-Taxilin für den Export der Viruspartikel, nicht aber für den Export subviraler Partikel (SVPs) essentiell ist. Der Export der Virionen findet hierbei über das ESCRT-System statt. Den HBV-Strukturproteinen fehlen jedoch die für die Interaktion mit dem ESCRT-System essentiellen late-Domänen. Die Proteinstruktur von α-Taxilin dagegen weist diese late-Domänen auf. In dieser Arbeit konnte diese interaktionsvermittelnde Funktion von α-Taxilin zwischen dem Virus und dem ESCRT-System charakterisiert werden. Über eine Interaktion von α-Taxilin mit dem viralen LHBs-Protein auf der einen Seite und der tsg101-Komponente des ESCRT-I-Komplexes auf der anderen Seite agiert α-Taxilin als eine Art Linker zwischen dem ESCRT-System und HBV.
Darüber hinaus wurde Annexin A5 als zellulärer Interaktionspartner für α-Taxilin identifiziert [Röttger, 2011]. Es dirigiert α-Taxilin in einer Art shuttle-Funktion auf die Zellmembran suszeptibler Zellen und bindet es an deren Zelloberfläche. Diese Exposition von α-Taxilin nimmt während der Dedifferenzierung in Korrelation mit dem Suszeptibilitätsverlust primärer Hepatozyten ab. Eine Maskierung von α-Taxilin durch eine vorherige Inkubation der Zellen mit α-Taxilin-spezifischen Antikörpern konnte die Bindung und die Aufnahme der Viren inhibieren. Überexpressionsstudien bestätigten die essentielle Rezeptorfunktion von α-Taxilin. Die verstärkte Produktion von α-Taxilin führte zur Suszeptibilität der Zellen. Auch die Speziesspezifität der Bindung zwischen humanem α-Taxilin und HBV konnte in einem Co-Immunpräzipitationsexperiment mit den rezeptorbindenden Domänen von HBV, WHV und DHBV identifiziert werden.
In der vorliegenden Arbeit konnte somit zum ersten Mal eine Rezeptorfunktion von α-Taxilin bei der Aufnahme von HBV in die Wirtszelle nachgewiesen werden. Darüber hinaus schreiben die in dieser Arbeit gemachten Beobachtungen α-Taxilin eine essentielle Funktion für die Vermittlung des ESCRT-abhängigen Exports der Virionen aus der Zelle zu. Die hierbei gewonnen Erkenntnisse sind von hoher Relevanz für die weitere Erforschung der HBV-assoziierten Pathogenese und die Etablierung eines in vivo Infektions-Modells.
Die NO-sensitive Guanylat-Cyclase (GC), der wichtigste physiologische Rezeptor für Stickstoffmonoxid (NO), ist an der Produktion des sekundären Botenstoffes cGMP beteiligt. Die GC ist ein obligates Heterodimer bestehend aus je einer alpha- und einer beta-Untereinheit, wobei die alphabeta-Isoform am häufigsten vorkommt. Die Bindung von NO an die prosthetische Häm-Gruppe der beta-Untereinheit führt zur Aktivierung des Enzyms. Das dabei gebildete cGMP bindet an Effektorproteine wie Proteinkinase G, Phosphodiesterasen und Ionenkanäle und vermittelt dadurch seine zellulären Effekte. Der Mechanismus der NO-induzierten Aktivierung der GC ist weitgehend bekannt; hingegen ist bisher nur wenig über alternative Regulationsmodi der GC wie zum Beispiel Phosphorylierung, Protein-Protein-Interaktion oder Translokation bekannt. Aufgabe der vorliegenden Arbeit war es daher, die Phosphorylierung der GC durch Tyrosinkinasen der Src-Familie sowie den GC-Interaktionspartner AGAP1 zu untersuchen. Die Tyrosinphosphorylierung der GC konnte in Gegenwart von Protein-Tyrosinphosphatase-Inhibitoren wie Pervanadat erstmals in endogenen Zellen wie Thrombozyten und vaskulären glatten Muskelzellen nachgewiesen werden. Untersuchungen mit dem Inhibitor SU6656 zeigten, dass Kinasen der Src-Familie an der Pervanadat-induzierten Phosphorylierung beteiligt sind. In Überexpressionssystemen wurde die GC durch Src und Fyn phosphoryliert, wobei Src hier deutlich effektiver war. Zudem kann Src die beta-Untereinheit der GC in vitro direkt phosphorylieren. Die Verwendung von Kinase-knockout-Zellen zeigte, dass neben Src auch andere Kinasen die GC-Phosphorylierung vermitteln können. Src interagiert mit dem Holoenzym der GC, wenn der Tyrosinrest 192 der beta-Untereinheit phosphoryliert ist. Hierbei bindet Src über seine SH2-Domäne an die GC. Mit der GC assoziiertes Src kann mindestens einen weiteren Tyrosinrest der beta-Untereinheit phosphorylieren. Ferner weisen einige Resultate auf eine zweite Bindungsstelle hin, die unabhängig von Tyrosin-192 und der SH2-Domäne ist. Experimente zur Lokalisation deuten auf eine möglicherweise durch Src vermittelte Translokation der Guanylat-Cyclase zur Plasmamembran hin. Ein weiterer Teil dieser Arbeit befasste sich mit AGAP1, einem etablierten Interaktionspartner der GC. AGAP1 ist am endosomalen Vesikeltransport beteiligt, indem es die Aktivität von Arf-GTPasen Phospholipid-abhängig stimulieren kann. In dieser Arbeit zeigte sich, dass AGAP1 über seinen N-Terminus sowie einen oder mehrere Segmente des C-Terminus dimerisiert. Außerdem kann AGAP1 über seine Pleckstrin-Homologie-Domäne an Phosphatidylinositol- Monophosphate und Phosphatidylinositol 3,4-bisphosphat binden. Zusammenfassend betrachtet zeigt diese Arbeit neue potentielle Regulationsmechanismen der NO-sensitiven Guanylat-Cyclase durch Tyrosinphosphorylierung und durch die Interaktion mit der Tyrosinkinase Src und dem Multidomänen-Protein AGAP1 auf. Hierbei wird deutlich, dass der NO/cGMP-Signalweg, die Tyrosinphosphorylierungs-Kaskaden und der Vesikeltransport regulatorisch ineinander greifen.
Die aktuellen HIV Medikamente basieren sich zum größten Teil auf Substanzen, die gegen virale Proteine gerichtet sind. Ein großer Nachteil dieser Medikamente besteht darin, dass das HI-Virus durch Mutationen Resistenzen gegen diese Substanzen entwickeln kann. Zelluläre Co-Faktoren als antivirales Ziel in der HIV-Therapie zu nutzen, könnte ein neuer Lösungsansatz sein, da das menschliche Genom stabiler ist als das virale. Der Schwerpunkt dieser Arbeit konzentriert sich auf die RNA Helikase DDX3, welche als zellulärer Co-Faktor für die HIV-1 Replikation identifiziert wurde.
Im Rahmen der Dissertation wurde die RNA-Helikase DDX3 durch biochemische Untersuchungen von DDX3Wt und DDX3-Mutanten näher charakterisiert. Die Versuche zeigten, dass die konservierten Motive V und VI bei DDX3Wt für die Bindung und Hydrolyse von ATP essentiell sind. Die spezifische DDX3 Insertion wies ebenfalls eine mutmaßliche Rolle bei der ATP-Bindung und bei Ausbildung der ATP-Bindestelle auf. Ferner konnte für die spezifische Insertion von DDX3 eine Funktion bei der Bindung von viraler RNA Bindungsnachweise nachgewiesen werden. Daher bietet diese Insertion von DDX3 ein mögliches Ziel für die spezifische Modulation bzw. Manipulation der Interaktion von DDX3Wt und viralen Interaktionspartnern sein, ohne weitere RNA Helikasen zu beeinflussen.
Zusätzlich wurden weitere Eigenschaften von DDX3Wt entdeckt. Die ATPase-Aktivität von DDX3Wt konnte durch die Zugabe von ssDNA deutlicher stimuliert werden, als durch die Zugabe ssRNA. Das DDX3Wt eine höhere katalytische Effizienz durch DNA aufweist ist neu, da die meisten DEAD-box Helikasen eine Präferenz für RNA als Co-Faktor für die ATPase-Aktivität besitzen. Des Weiteren konnte erstmalig nachgewiesen werden, dass DDX3 neben der ATPase-Aktivität auch eine Exonuklease-Aktivität besitzt. Die Versuche zeigten, dass DDX3Wt in der Lage war, ssDNA und dsDNA effizient zu spalten. In der DDX3Wt AS-Sequenz wurden fünf Aminosäuresequenz-Motive, sogenannte Exonuklease-Boxen identifiziert, die mit der Exonukleaseaktivität in Verbindung gebracht werden. Die Untersuchung der Bindungseigenschaften von DDX3Wt zeigte auf, dass DDX3Wt auch ohne den zellulären Co-Faktor XPO1 in der Lage ist, virale HIV-1 RNA und DNA direkt zu binden. Diese Erkenntnisse tragen dazu bei, die Funktionen von DDX3Wt im zellulären System besser zu verstehen. Eine genaue Analyse ist Voraussetzung für die Entwicklung von spezifischen Inhibitoren, die die Interaktion von HIV-1 und DDX3Wt hemmen sollen ohne dabei zelluläre Prozesse negativ zu beeinflussen.
Durch Lokalisationsstudien konnte ein neuer relevanter Angriffspunkt für die Inhibition der HIV-1 Replikation identifiziert werden. Denn entgegen den Literaturangaben spielt das putative Leucin-reiche Exportsignal im N-Terminus von DDX3Wt eine wichtige Rolle beim Export aus dem Zellkern und somit auch für die Interaktion mit XPO1.
Mithilfe der Phagen-Display-Technologie konnte im Rahmen dieser Arbeit ein Sequenz-spezifischer Peptid-Ligand für die Insertion von DDX3 identifiziert werden, der eine Aminosäurehomologie zu dem zellulären Co-Faktor XPO1 zeigt. Das identifizierte Peptid DDX3-INS1 wurde für weitere Untersuchungen in Verbindung mit einer Proteintransduktionsdomäne synthetisiert. Das Peptid DDX3-INS1 ist in HIV-1 infizierten Zellen funktionell aktiv und inhibiert die Produktion von HI-Viren ab einer Konzentration von 20 µM ohne dabei toxische oder virolytische Effekte auszuüben. Weitere funktionelle Untersuchungen werden zeigen, ob das selektionierte Peptid DDX3-INS1 als therapeutisches Medikament für die Inhibition von HIV-1 geeignet ist.
1. Die Deletionsderivate der Kompetenzproteine PilN und PilQ wurden als Fusionsproteine mit dem Maltosebindeprotein überproduziert, über eine Amylosesäule aufgereinigt und in nativer Form für die Generierung von polyklonalen Kaninchen-Antikörpern eingesetzt. 2. Unter Einsatz der spezifischen alpha-PilN- und alpha-PilQ-Antikörpern konnte das PilN-und PilQ-Kompetenzprotein im Rohextrakt von T. thermophilus HB27 detektiert werden. 3. Die Überprüfung bereits vorliegender Antikörper gegen die Kompetenzproteine PilM, PilW und PilA4 ergaben, dass es sich hier ebenfalls um spezifische Antikörper handelt. 4. Mittels Western-Blot-Analysen unterschiedlicher Mutanten konnte gezeigt werden, dass die Markerinsertion in den Genen pilM, pilN, pilO und pilW zu keinem polaren Effekt der jeweils stromabwärts gelegenen Gene führt. 5. Analysen der subzellulären Lokalisation der Kompetenzproteine ergaben, dass PilM und PilN ausschließlich in der inneren Membran lokalisiert sind, während PilW, PilQ und PilA4 sowohl in der inneren als auch äußeren Membran detektiert wurden. Die größte Menge an PilQ wurde allerdings in der äußeren Membran gefunden. 6. Mutantenstudien ergaben, dass eine pilQ-Mutantion zur Abwesenheit von PilW und PilA4 in der äußeren Membran führte. Ebenso führte eine pilW-Mutantion zu Abwesenheit von PilQ und PilA4 in der äußeren Membran. Diese Ergebnisse indizieren Interaktionen zwischen PilW, PilQ und PilA4. 7. In der pilD-Mutante wurde kein PilA4 mehr in der äußeren Membran detektiert. Dieser Befund untermauert den Schluss, dass es sich bei PilD um eine PilA4 prozessierende Präpilin-Peptidase handelt. 8. Western-Blot-Analysen der gereinigten Pili führen zu dem Schluss, dass das Kompetenzprotein PilA4 die strukturelle Untereinheit der Pilus-Struktur repräsentiert. Das Sekretin-ähnliche Kompetenzprotein PilQ wurde ebenfalls in der gereinigten Pilus-Fraktion detektiert und könnte Teil der globulären Struktur an den Pilusenden sein. 9. Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Dünnschnitten durch T. thermophilus HB27 Zellen ließen den ungewöhnlichen Aufbau der Zellperipherie erkennen. Zwischen der inneren Membran (8 nm dick) und der äußeren Membran (8 nm dick) befand sich neben dem dünnen Peptidoglykan (8 nm dick) eine 40 nm dicke kontrastarme Schicht, die radial von Fäden durchzogen schien. 10. Die Dünnschnitte wurden für Immunogoldmarkierungen mit alpha-PilQ-Antikörpern eingesetzt, um PilQ zu detektieren. Allerdings konnte in den elektronenmikroskopischen Analysen keine spezifische Goldmarkierung nachgewiesen werden. Ursache hierfür könnte die Unzugänglichkeit des nativen PilQ in den Dünnschnitten sein. 11. Die Immunogoldmarkierung des Gefrierbruchs von ganzen Thermus-Zellen mit alpha-PilQ-Antikörpern führte zur Detektion von PilQ-haltigen Ring-ähnlichen Strukturen in der äußeren Membran. Der Durchmesser des PilQ-Komplexes mit 17 - 18 nm ist mit denen der aus Sekretinen bestehenden Ringsystemen anderer Organismen vergleichbar. 12. In den T. thermophilus HB27 Membransolubilisaten wurde ein >669 kDa PilW-PilQ-Komplex identifiziert. Dieser Komplex ließ sich optimal mit n-Dodecyl-beta-D-maltosid (1 mg Detergenz pro mg Membranprotein) aus der Membranfraktion solubilisieren. Stabilitätsuntersuchungen ergaben, dass dieser Komplex bei 4 °C einige Tage, bei Raumtemperatur und bei Anwesenheit von 1 M NaCl einige Stunden stabil ist. 13. Mittels einer DEAE-Austausch-Chromatographie konnte der PilW-PilQ-Komplex angereichert werden. Die Western-Blot-Analysen ergaben, dass das Kompetenzprotein PilM mit dem PilW-PilQ-Komplex koeluiert. 14. In der MALDI-TOF-Massenspektrometrie konnte das Kompetenzprotein PilQ und Untereinheiten der DNA-gerichteten RNA-Polymerase, ein Membran-Lipoprotein sowie Energie-Stoffwechsel-Proteine in der angereicherten PilW-PilQ-haltigen Fraktion nachgewiesen werden. Diese Proteine müssen auf die Beteiligung an der Transformation untersucht werden. 15. Immunelektronenmikroskopische Analysen des angereicherten PilW-PilQ-Komplexes führten zur Identifizierung von Ringstrukturen mit einem Durchmesser von 17 nm. Dieser Durchmesser entspricht den Sekretin-Komplexen von P. aeruginosa (18,3 ± 1,2 nm) bzw. N. gonorrhoeae (15,5 - 16,5 nm) und dem Durchmesser der über Immunogoldmarkierung detektierten PilQ-haltigen Strukturen in T. thermophilus HB27.
The importance of RNA in molecular and cell biology has long been underestimated. Besides transmitting genetic information, studies of recent years have revealed crucial tasks of RNA especially in gene regulation. Riboswitches are natural RNA-based genetic switches and known only for ten years. They directly sense small-molecule metabolites and regulate in response the expression of the corresponding metabolic genes. Within recent years, artificial riboswitches have been developed that operate according to user-defined demands. Hence, they represent powerful tools for synthetic biology.
This study focused on the development of engineered catalytic riboswitches for conditional gene expression in eukaryotes. A self-cleaving hammerhead ribozyme was linked to a tetracycline binding aptamer in order to regulate ribozyme cleavage allosterically with tetracycline. By integrating such a hybrid molecule into a gene of interest, mRNA cleavage and thereby gene expression is controllable in a ligand dependent manner. The linking domain between ribozyme and aptamer was randomised. Tetracycline inducible ribozymes were isolated after eleven cycles of in vitro selection (SELEX). 80% of the analysed ribozymes show cleavage that strongly depends on tetracycline. In the presence of 1 μM tetracycline, their cleavage rates are comparable to that of the parental hammerhead ribozyme. In the absence of tetracycline, cleavage rates are inhibited up to 333-fold. The allosteric ribozymes bind tetracycline with similar affinity and specificity as the parental aptamer. Ribozyme cleavage is fully induced within minutes after addition of tetracycline. Interestingly, the isolated linker domains exhibit structural consensus motives rather than consensus sequences.
When transferred to yeast, three switches reduced reporter gene expression by 30 - 60% in the presence of tetracycline; none of them controlled gene expression in mammalian cells. In vitro selected molecules do not necessarily retain their characteristics when applied in a cellular context. Therefore, high throughput screening and selection systems have been developed in mammalian cells. The screening system is based on two fluorescent reporter proteins (GFP and mCherry). 1152 individual constructs of the selected ribozyme pool were tested, but none of them reduced reporter gene expression significantly in the presence of tetracycline. The selection system employs a fusion peptide encoding two selection markers (Hygromycin B phosphotransferase and HSV thymidine kinase) facilitating both negative and positive selection. 6.5 x 104 individual constructs of the selected ribozyme pool are currently under investigation.
Der Nucleus suprachiasmaticus (SCN) ist der übergeordnete circadiane Schrittmacher (die “Tageszeitenuhr“) der Säugetiere. Er generiert den circadianen Rhythmus und synchronisiert diesen mit den diurnalen Signalen (Zeitgebern) aus der physikalischen Umwelt. Die Generierung der circadianen Rhythmik findet innerhalb einzelner SCN-Neurone (“clock cells“), die einen Multi-Oszillatoren-Veband bilden, statt. Die asynchronen Individualrhythmen der “clock cells“ werden zu einem gemeinsamen Haupt-Rhythmus, den circadianen Rhythmus, synchronisiert. Die entscheidende Rolle bei der Synchronisation der Individual-Rhythmen wird dem inhibitorischen – in fast allen SCN-Neuronen vorkommenden – Neurotransmitter Gamma- Amino-Buttersäure (GABA) zugeschrieben. Der gemeinsame Haupt-Rhythmus wird weiterhin durch exogene Zeitgeber auf die 24-stündige Periodik der Umweltsignale getriggert. Der dafür wichtigste Zeitgeber ist das Licht. Die Licht-Informationen werden retinal perzipiert und chemisch durch den Neurotransmitter Glutamat an den SCN übermittelt. Der Schlaf – als prominente Komponente circadianer Rhythmen – scheint ebenso vom GABAergen System des SCN gesteuert zu werden. In der vorliegenden Arbeit wurde das GABAerge System von Goldhamstern einschließlich seines glutamatergen Eingangssystems und der GABAergen Efferenzen analysiert. Diurnale Fluktuationen der untersuchten Komponenten des GABAergen Netzwerkes wurden auf ihre Beteiligung an Synchronisationsvorgängen im SCN beleuchtet. Die semiquantitative Analyse mit Hilfe von HPLC, Immuncytochemie und Immunoblot- Verfahren erbrachte eindeutige diurnale Fluktuationen aller untersuchten Komponenten des GABAergen Systems im Goldhamster-SCN. Während der Dunkelphase wurde das GABAerge-System aktiviert: die GABA-Synthese (GAD56/67), der Gesamt-GABA-Gehalt und die GABA-Wiederaufnahme (Entsorgung) aus dem synaptischen Spalt durch GABA-Transporter (GAT-1) zeigten eine nächtliche Reaktivitätssteigerung. Dies wurde durch die Erhöhung der nächtlichen GABA-Freisetzung aus SCN-Gewebekulturen (slice-Kulturen) ergänzt. In einer weiteren Untersuchung wurde die Zusammensetzung des GABAA-Rezeptors, der an den Synchronisationsvorgängen im SCN beteiligt ist, näher charakterisiert. Im SCN von Goldhamstern wurden die GABAA-Rezeptor- Untereinheiten alpha 2, alpha 3, beta 1 und beta 2/3 (schwach vertreten) nachgewiesen. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass das GABAerge System an der Schlafregulation beteiligt ist. Die Komponenten des GABAergen Systems (Gesamt-GABA, GAD56/67, GAT-1) im SCN von Goldhamstern wiesen während des Schlafs im Vergleich zum wachen Tier identischer photoperiodischer Phasenlage erhöhte Reaktivität auf. Die Komponenten des glutamatergen Systems, welchem die Lichtinformationsübermittlung an das GABAerge System im SCN obliegt, zeigten ebenfalls eine diurnale Fluktuation. Die Maxima der Immunreaktivität für die AMPA-Rezeptor-Untereinheiten (GluR1, GluR2/3) am Tage deuten auf eine optimale Beteiligung dieser Komponenten an der Lichtvermittlung und auf einen Triggereffekt von Glutamat hin. Der Gesamt-Glutamat-Gehalt im SCN wies zwar erhöhte Werte während der Nacht auf, jedoch konnte keine Aussage über die Menge des funktionellen Neurotransmitters gemacht werden, da nur ein Bruchteil der Gesamt-Glutamat- Menge als Neurotransmitter wirkt. Die AMPA-Rezeptor-Untereinheiten zeigten eine – im Vergleich zu wachen Tieren derselben photischen Phasenlage – erhöhte Reaktivität bei schlafenden Goldhamstern. Die Hochregulation der GABAergen Systems während der Nacht unterstützt die Hypothese, dass GABA-Pulse – verabreicht zu einem bestimmten Tageszeit – Rhythmen individueller SCN-Neurone (“clock cells“) synchronisieren können. Die Synchronisation der GABAAusschüttung zu bestimmten Tageszeiten aus allen SCN-Neuronen wird durch das glutamaterge System getrieben. Alle untersuchten Komponenten zeigten dabei konsensuelle Reaktivitätsmuster, die als erhebliche Kontrastverstärkung der Hell- und Dunkelphase gewertet werden müssen. Die Unterschiede in der Reaktivität des GABAergen und glutamatergen Systems zwischen schlafenden und phasengleich untersuchten wachen Tieren stellen deren große Bedeutung für die Schlafregulation heraus.
Das humane endogene Retrovirus-K: Grundlagenforschung und Nutzen als Tumor-assoziiertes Antigen
(2011)
Fast die Hälfte des humanen Genoms besteht aus Retroelementen, die während der evolutiven Entwicklung des Menschen im Genom fixiert wurden. Im Wesentlichen kann man diese Retroelemente in DNA-Transposons, LINEs, SINEs und humane endogene Retroviren unterteilen, dabei nehmen die humanen endogenen Retroviren (HERV) 8% des humanen Genoms ein. Bei einer Unterfamilie, der HERV-K Familie, sind bis heute alle offenen Leserahmen erhalten geblieben. Nach heutigem Erkenntnisstand wird eine Expression dieser Elemente in somatischen Zellen jedoch strikt unterdrückt, denn eine Expression von Retroelementen könnte zu Insertionsmutagenesen führen und letztlich dem Organismus erheblichen Schaden zufügen.
Im Gegensatz dazu wird eine reaktivierte Expression von HERV-K häufig in einigen Tumorarten beobachtet: allen voran Keimzelltumore, Melanome und Brustkrebs. Außerdem können in Patienten, die an solchen Tumoren erkranken, häufig HERV-K spezifische Antikörper und mitunter auch gegen HERV-K-gerichtete T-Zellen nachgewiesen werden. Die strikte Unterdrückung der HERV-K Expression in gesunden, somatischen und eine reaktivierte Expression in entarteten Zellen machen HERV-K Proteine daher zu idealen Tumor-assoziierten Antigenen.
Auf Grundlage dieser Untersuchungen wurden, in dieser Arbeit, zwei potentielle Tumorvakzine, basierend auf dem hoch attenuierten Modifizierten Vacciniavirus Ankara (MVA) hergestellt. Durch homologe Rekombination wurde ein HERV-K gag-pro-pol transgenes MVAHKcon und ein HERV-K env transgenes MVAHKEnv hergestellt und charakterisiert. Darüber hinaus wurden die rekombinanten Viren in einem neu etablierten, syngenen Maus-Tumor-Modell untersucht. MVAHKcon immunisierte Mäuse zeigten eine starke humorale Immunantwort und waren in der Lage subkutane, HERV-K Gag positive Tumore fast vollständig zu eliminieren. MVAHKEnv immunisierte Mäuse zeigten dagegen eine moderate humorale Immunantwort und eine starke T-Zellantwort. Nach therapeutischer Immunisierung mit MVAHKEnv konnte im Mausmodell eine signifikante Reduktion an HERV-K Env positiven Lungenmetasten beobachtet werden. Außerdem konnte durch eine prophylaktische Immunisierung mit MVAHKEnv ein vollständiger Schutz der Mäuse vor der Ansiedlung HERV-K Env-exprimierender Tumore erreicht werden. Die hier vorgestellten HERV-K rekombinanten MVA könnten daher der erste Schritt zu einer Immuntherapie gegen reaktivierte Retroelemente in malignen Tumoren darstellen.
MVAHKcon infizierte Zellen produzieren und sekretieren große Mengen HERV-K Virus-ähnlicher Partikel (VLP) somit konnten auch grundlegende Fragestellungen der HERV-K Biologie geklärt
Zusammenfassung
123
werden. Durch die Kombination massenspektrometrischer Analysen und N-terminaler Sequenzierungen konnten, die noch nicht bekannten Schnittstellen der retroviralen Protease im HERV-K Gag Protein identifiziert werden. Zudem wurde eine späte Domäne von HERV-K identifiziert und darüber hinaus Wechselwirkungen von HERV-K VLPs mit zellulären Restriktionsfaktoren wie APOBEC3G und CD317 studiert.
The biogenesis and function of photosynthetically active chloroplasts relies on the import of thousands of nuclear encoded proteins via the coordinated actions of two multiprotein translocon machineries in the outer and inner envelope membrane. Trafficking of preproteins across the soluble compartment of InterMembrane Space (IMS) is currently envisioned to be facilitated by an IMS complex composed of outer envelope proteins Toc64 and Toc12, a soluble IMS component, Tic22 and an IMS-localized Hsp70. Among them, currently Tic22 is the only component that stands undisputed in terms of its existence. Having two closely related homologs in A. thaliana, their biochemical and functional characterization was still lacking. A critical analysis of Tic22 knockout mutants displayed growth phenotype reminiscent of ppi1, the mutant of Toc33. However, both the genes have similar expression patterns with no clear preference for photosynthetic or nonphotosynthetic tissues, which explained the absence of a detectable phenotype in single mutants. In addition, transgenic complementation study with either of the homolog affirmed the identical localization of both proteins in the IMS which characterizes the two homologs as functionally redundant. Based on the pale-yellow phenotype exhibited by the double mutant plants, an attempt to analyze the import capacity of a stromal substrate in the double mutant revealed threefold reduction when compared to wild-type acknowledging the essential role of Tic22 in the import mechanism. Initially, Tic22 was identified together with another protein, Tic20, which has been heavily discussed as a protein conducting channel in the inner membrane. Despite being characterized, in A. thaliana, two out of four homologs of Tic20 are differentially localized with one being additionally localized in mitochondria and the other, exclusively residing in the thylakoids.
According to in silico analysis, for all the Tic20 proteins, a four-helix transmembrane topology was predicted. Accordingly, its topology was mapped by employing the recently established selfassembling GFP-based in vivo experiments. Astonishingly, the expression of one of the inner envelope localized Tic20 homolog enforces inner membrane proliferation affecting the shape and organization of the membrane. Therefore this study focuses on analyzing the effects of high envelope protein concentrations on membrane structures, which together with the existing results, an imbalance in the lipid to protein ratio and a possible role of signaling pathway regulating membrane biogenesis is discussed.
Prokaryotische Organismen werden in ihrer natürlichen Umgebung mit schwankenden Umwelteinflüssen konfrontiert oder müssen gegebenenfalls extremen Bedingungen standhalten. Um sich an derartige Veränderungen anpassen zu können und damit ein weiteres Überleben zu sichern, ist es wichtig neue genetische Informationen zu akquirieren. Die molekulare Basis dieser Anpassung sind Genmutationen, Genverlust, intramolekulare Rekombination und/oder horizontaler Gentransfer. Der vorliegende Selektionsdruck der Umwelt begünstigt schlussendlich die Spezialisierung und damit die Erschließung neuer Standorte aufgrund des Erwerbs neuer metabolischer Eigenschaften, Resistenzgene oder Pathogenitätsfaktoren. Vergleichende Analysen bakterieller Genome, welche auf Analysen der GC-Gehalte, der Codon- und Aminosäurenutzung und der Genlokalisation beruhen, zeigten, dass bei diesem evolutiven Prozess bzw. der Weiterentwicklung der bakteriellen Genome der horizontale Gentransfer als treibende Kraft eine entscheidende Rolle spielt. So indizieren Genomstudien, dass 0-22% der gesamten bakteriellen und 5-15% der archaeellen Gene horizontal erworben wurden, wobei der DNA-Transfer nicht ausschließlich zwischen Vertretern einer Domäne, sondern ebenfalls zwischen Organismen unterschiedlicher Domänen stattgefunden hat. So sind z.B. 24 bzw. 16% der Gene von Genomen hyperthermophiler Organismen wie Thermotoga maritima oder Aquifex aeolicus archaeellen Ursprungs. Ebenso finden sich Gene für Chaperone und DNA-Reparaturenzyme im Genom des thermophilen Bakteriums Thermus thermophilus wieder, welche wahrscheinlich ebenfalls durch horizontalen Gentransfer aus hyperthermophilen und archaeellen Genomen erworben wurden um eine Anpassung an extreme Standorte zu ermöglichen. Durch vergleichende Genomstudien wurde ebenfalls festgestellt, dass die durch horizontalen Gentransfer erworbenen Gene oftmals zu einer Neuorganisation von Transkriptionseinheiten und zu einer veränderten Genomorganisation führten. Dennoch finden sich immer wieder Beispiele von horizontal erworbenen Operonen in den verschiedenen Organismen. Gut charakterisierte Vertreter horizontal übertragener Operone sind dabei z.B. das archaeelle H+-ATPase-Operon, das Operon der Na+-translozierenden NADH:Ubichitonoxidoreduktase oder das Nitratreduktase-Operon.
Man unterscheidet bei dem horizontalen Gentransfer zwischen drei Mechanismen der DNAAufnahme: Konjugation, Transduktion und Transformation. Die DNA-Übertragung durch Konjugation ist durch einen spezifischen Zell-Zell-Kontakt definiert, der durch einen von der Donorzelle ausgehenden, sogenannten F-Pilus hergestellt wird. Die Donorzelle überträgt schließlich Plasmid-kodierte genetische Informationen und oftmals Eigenschaften für die eigenständige Konjugation auf eine Rezipientenzelle. Die Transduktion hingegen beschreibt die DNA-Übertragung von Bakteriophagen auf eine Wirtszelle, wobei hier eine hohe Wirtsspezifität Voraussetzung ist. Die Übertragung der DNA von einer Bakterienzelle in eine andere erfolgt dabei ohne Kontakt der Zellen. Die natürliche Transformation ist definiert als Transfer von freier DNA und ermöglicht damit im Gegensatz zu den beiden ersten spezifischen Mechanismen der DNA-Übertragung ein größeres Spektrum der Verbreitung genetischer Informationen. Freie DNA, welche entweder durch Zelllyse oder Typ-IVSekretion ausgeschieden wird und aufgrund von Adsorption an mineralische Oberflächen über längere Zeiträume stabil in der Umgebung vorliegen kann, kann unter der Voraussetzung der Existenz eines speziellen Aufnahmesystems von Bakterien aufgenommen werden. Mittlerweile sind über 44 Bakterien aus unterschiedlichen taxonomischen Gruppen beschrieben, die eine natürliche Kompetenz ausbilden können. Die bekanntesten Beispiele für natürlich transformierbare Gram-negative Bakterien sind Heliobacter pylori, Neisseria gonorrhoeae, Pseudomonas stutzeri, Haemophilus influenzae, T. thermophilus und Acinetobacter baylyi. Auch unter den Gram-positiven Bakterien finden sich einige Vertreter, die natürlich kompetent sind, wie Deinococcus radiodurans, Bacillus subtilis und Streptococcus pneumoniae. Ungeachtet der relevanten Rolle der Transformation im horizontalen Gentransfer, ist über die Struktur und Funktion der komplexen DNA-Aufnahmesysteme wenig bekannt.
1. Die Deletionsderivate der Kompetenzproteine ComZ und PilO wurden als Fusionsproteine mit einem Maltosebindeprotein überproduziert, über eine Amylosesäule aufgereinigt und in denaturierter Form für die Generierung von polyklonalen Antikörpern in Kaninchen eingesetzt. Es konnten spezifische Antikörper gegen PilO generiert werden. 2. Mittels Western-Blot-Analysen subzellulärer Fraktionen des Wildtyps und der pilO::kat-Insertionsmutante konnte das PilO-Protein mit einer molekularen Masse von 21 kDa in der inneren Membran detektiert werden. 3. Mutantenstudien ergaben, dass in der pilO::kat-Mutante andere Kompetenzproteine in ihrer Lokalisation nicht beeinträchtigt sind und dass die Lokalisation des PilO-Proteins in anderen transformationsdefekten Mutanten nicht beeinträchtigt ist. Einzig eine verringerte Menge des PilF-Proteins in der inneren Membran der pilO::kat-Mutante wurde detektiert. Diese Ergebnisse indizieren eine Interaktion des PilO- und des PilFProteins. 4. Für die Analysen des DNA-Transports wurde ein Testsystem etabliert. 5. Durch DNase-Behandlung konnte zwischen gebundener und aufgenommener DNA differenziert werden. 6. Durch den Einsatz des Komplexbildners EDTA konnte gezeigt werden, dass die DNABindung bzw. auch die DNA-Aufnahme in Thermus von zweiwertigen Ionen beeinflusst wird. 7. Unterschiedliche DNA-Formen, wie z. B. lineare, zirkuläre Plasmid-DNA und chromosomale DNA, werden zu gleichen Mengen gebunden und aufgenommen. Die Transformationshäufigkeiten in unterschiedlichen DNA-Formen jedoch zeigen Unterschiede. Dabei wird lineares Plasmid um einen Faktor von ca. 100 schlechter transformiert als zirkuläres Plasmid. Nukleotide werden von Thermus nicht gebunden und aufgenommen. 8. Kinetische Analysen des DNA-Binde- und -Aufnahmeapparates in Thermus ergaben eine Geschwindigkeit der DNA-Akkumulation von 1,5 μg DNA pro mg Protein und min und einen Km-Wert von 48 μg DNA/ml. 9. Chromosomale DNA aus Vertretern der unterschiedlichen Domänen Archaeen, Bakterien und Eukarya werden von Thermus gleichermaßen gut gebunden und aufgenommen. 10. Entkoppler sowie ATPase-Inhibitoren verhindern DNA-Aufnahme. Dies führt zu dem Schluß, dass DNA-Aufnahme in Thermus energieabhängig ist. 11. Die aufgenommene DNA kann nicht als Kohlenstoff-, Stickstoff- oder Phosphatquelle genutzt werden, und die Nukleotide werden nicht als Vorstufen bei der Nukleinsäuresynthese weiterverwendet. 12. Durch DNA-Binde- und -Aufnahmestudien unterschiedlicher transformationsdefekter Mutanten konnte die Rolle einzelner Kompetenzproteine bei der DNA-Bindung und/oder -Aufnahme geklärt werden. Die Ergebnisse indizieren, dass PilQ an der DNA-Bindung und -Aufnahme beteiligt ist. 13. DNA-Binde- und -Aufnahmestudien mit comEA::kat-, pilA4::kat-, pilF::kat-, pilD::kat- und pilW::kat-Mutanten indizieren, dass die Proteine an dem DNA-Transport über die äußere Membran beteiligt sind. 14. Mutanten mit Defekten in den Kompetenzproteinen ComEC, DprA, PilA1, PilA2, PilA3, ComZ, PilM, PilN, PilO, PilC akkumulieren DNA im DNase-resistenten Zustand, vergleichbar dem Wildtyp. Dies indiziert eine Rolle dieser Proteine am DNA-Transport über das Periplasma und/oder die innere Membran.
Einleitung: Die kurzkettige Fettsäure Butyrat, die im Gastrointestinaltrakt durch bakterielle Fermentation aus nicht resorbierten Ballaststoffen und komplexen Kohlenhydraten der Nahrung gebildet wird, konnte in zahlreichen in vitro-Untersuchungen ihre chemopräventiven Eigenschaften demonstrieren. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die molekularen Mechanismen der Butyrat-induzierten Differenzierung und Wachstumshemmung von Kolonkarzinomzellen näher zu charakterisieren. Methodik: Die Versuche wurden an den kolorektalen Karzinomzelllinien Caco-2 und SW620 durchgeführt, die unter Standardbedingungen kultiviert wurden. Für einen Teil der Experimente wurden zusätzlich die Pankreaskarzinomzelllinien MiaPaca-2 und Capan-1 verwendet. Zytotoxische Effekte wurden durch Messung des Enzyms Laktatdehydrogenase im Überstand ausgeschlossen. Die Zellzahl wurde mittels Kristallviolettfärbung und die Proliferation über den Einbau von 5-Bromo-2‘-deoxyuridin (BrdU) während der DNA-Synthese bestimmt. Die Zelldifferenzierung wurde anhand der Aktivität des Enzyms alkalische Phosphatase quantifiziert. Rezeptorbindungsstudien mit [3H]1,25-Dihydroxyvitamin D3 wurden zur Ermittlung der Vitamin D Rezeptor- (VDR-) Bindungsaktivität durchgeführt, die Menge an VDR mRNA wurde über PCR quantifiziert. Die Proteine wurden mittels Western Blot und die Zellzyklusdistribution mit Hilfe eines Durchflusszytometers analysiert. Ergebnisse: Butyrat [3 mmol/L] sowie sein Prodrug Tributyrin, in 3-fach niedrigerer Konzentration eingesetzt ([1 mmol/L]), hemmten das Wachstum der Pankreaskarzinom-zelllinien MiaPaca-2 und Capan-1 ähnlich effektiv. Auch die apoptose- und differenzierungsfördernden Wirkungen von Butyrat und Tributyrin waren vergleichbar. In der Kolonkarzinomzelllinie Caco-2 erwies sich Butyrat in der Wachstumshemmung und Differenzierungsinduktion als etwas stärker wirksam. 1,25-Dihydroxyvitamin D3 (1,25-(OH)2D3) [10-6 mol/L] besaß in der Zelllinie Caco-2 ebenfalls proliferationshemmende und differenzierungsinduzierende Eigenschaften, die allerdings nur mäßig ausgeprägt waren. Die Kombination aus Butyrat und 1,25-(OH)2D3 wies in etwa eine additive antiproliferative Wirkung auf, wohingegen die Zelldifferenzierung synergistisch verstärkt wurde. Der potenzierende Effekt auf die Differenzierung ließ sich in der Pankreaskarzinomzelllinie Capan-1 bestätigen. Rezeptorbindungsstudien in Caco-2 Zellen ergaben, dass Tributyrin die spezifische Bindung von 1,25-(OH)2D3 an seinen Rezeptor erhöhte, ohne die Affinität des Liganden zu seinem Rezeptor zu beeinflussen. Auf RNA- und Proteinebene ließ sich eine zeit- und dosisabhängige Steigerung der VDR-Expression durch Tributyrin oder Butyrat in den Kolonkarzinomzelllinien Caco-2 und SW620 beobachten. Andere kurzkettige Fettsäuren ähnlicher Struktur beeinflussten hingegen die VDR-Expression in Caco-2 Zellen nur geringfügig oder gar nicht. Die Butyrat-induzierte Differenzierung von Caco-2, SW620 und Capan-1 Zellen ließ sich durch die Kombination mit dem VDR-Antagonisten ZK 191732 [10-5 mol/L] aufheben. Auch der durch die 48-stündige Butyrat-Behandlung von Caco-2 und SW620 Zellen verursachte G0/G1-Zellzyklusstop verschwand vollständig nach Koinkubation mit ZK 191732. Die genauere Untersuchung des molekularen Mechanismus, der dem Butyrat-induzierten Zellzyklusstop zugrundelag, erbrachte eine verminderte Expression der zellzyklusregulierenden Proteine Cyclin D1, E und A sowie der cyclinabhängigen Kinasen cdk2, 4 und 6 durch Butyrat. Weiterhin verstärkte Butyrat die Expression der cdk-Inhibitoren p21Waf1/Cip1 und p27Kip1. Die Butyat-induzierten Veränderungen in den Proteinmengen von p21Waf1/Cip1, cdk6 und Cyclin A ließen sich durch die Kombination mit 1,25-(OH)2D3 synergistisch verstärken und durch die Koinkubation mit ZK 191732 aufheben. Im Gegensatz hierzu wurden die durch Butyrat verursachten Änderungen in der Expression von p27Kip1, cdk2, cdk4, Cyclin D1 und Cyclin E weder durch 1,25-(OH)2D3 verstärkt noch durch den VDR-Antagonisten vermindert. Schlussfolgerung: Die Ergebnisse demonstrieren, dass Butyrat, das natürlicherweise durch die Nahrung im Darmlumen präsent ist, eine Reihe zellulärer Prozesse in Kolonkarzinomzellen beeinflusst, die schließlich in einer Proliferationshemmung, Differenzierung und Apoptose der Zellen resultieren. An der Regulation dieser Prozesse durch Butyrat ist der VDR zumindest teilweise beteiligt. Dies erklärt die synergistische Wirkung der Kombination aus Butyrat und 1,25-(OH)2D3 auf die Zelldifferenzierung, den Zellzyklusstop sowie auf die Expression verschiedener zellzyklusregulatorischer Proteine in Karzinomzellen. Die vorliegenden Daten weisen darauf hin, dass Butyrat, als Prodrug in Form von Tributyrin verabreicht, von pharmakologischem Interesse hinsichtlich der Chemoprävention oder -therapie des Kolonkarzinoms sein könnte.
Drug toxicity and viral resistance limit long-term efficacy of antiviral drug treatment for HIV
infection. Thus, alternative therapies need to be explored. Previously, group of “Prof. von Laer”
tested the infusion of T lymphocytes transduced with a retroviral vector (M87o) that expresses an
HIV entry inhibitory peptide (maC46). Gene-modified autologous T cells were infused into 10
HIV-infected patients with advanced disease and multidrug resistant virus during antiretroviral
combination therapy. T cell infusions were tolerated well with no severe side effects. A
significant increase of CD4 counts was observed post infusion. At the end of the one-year
follow-up, the CD4 counts of all patients were still around or above baseline. Gene-modified
cells could be detected in peripheral blood, lymph nodes and bone marrow throughout the oneyear
follow-up, whereby marking levels correlated with the cell dose. No significant changes of
viral load were observed during the first four months. Four of the seven patients that changed
their antiviral drug regimen thereafter responded with a significant decline in plasma viral load.
In conclusion, the transfer of gene-modified cells was safe, led to sustained levels of gene
marking and may improve immune competence in HIV-infected patients with advanced disease
and multidrug resistant virus. However, the low level of gene marking and the lack of substantial
long-term in vivo accumulation of gene-protected cells observed in this trial clearly demonstrate
the requirement for new vectors with new strategy.
In this thesis self‐inactivating lentiviral vectors harboring internal promoters and RNA elements
were therefore evaluated for their potential use in a clinical gene‐therapy trial. The results from
this work provide the basis for the selection of a suitable candidate vector for extensive
preclinical testing. Apart from being capable of transducing non‐dividing cells, lentiviral vectors
incorporate a number of additional features that are of potential value for gene therapeutic
applications. These include a larger packaging capacity, higher titers than γ‐retroviral vectors
and, most importantly, a reduced risk of deregulating cellular genes due to its natural integration
profile. The use of internal promoters to drive expression of the therapeutic transgene maC46
should further improve the safety profile of these new‐generation vectors, while an additional
artificial splice acceptor (SA) into the 5‟UTR of the transgene over all elevate transgene
expression. The rationale for this is that hematopoietic stem and progenitor cells will be
Summary
98
protected from enhancer‐mediated transactivation effects and also from potential side effects due
to the aberrant expression of maC46 while at the same time the full clinical benefit for the
patients is maintained.
In order to find a suitable candidate for preclinical studies, two candidate therapeutic vectors
harboring different regulatory elements were selected based on results from pilot experiments.
The internal promoters used to drive expression of codon optimized maC46 were the PGK
promoter and MPSV promoter. This work focuses on the transgene expression levels in
lymphoid cells and antiviral activity. The issues of long term expression, propensity to
methylation mediated silencing of the promoters, and genotoxicity were also touched. In a first
step the performance of different vectors was evaluated in the human T cell lines. Based on
promising data from ex vivo human peripheral blood mononuclear cells, the vector carrying the
MPSV promoter along with intron were selected for in vivo transplantation experiments.
In summary, the ex vivo data suggested the long term survival of lentiviral gene modified cells,
along with maintained expression of introduced genes. It was observed that the expression of
these constructs depends strongly on the activation and differentiation status of the targeted T
cells. This regulation was not linked to any specific promotor. In vivo study shows that maC46
can be introduced into murine multiple hematopoietic lineages via lentiviral vector and expressed
at high levels in their mulilineage progeny, without altering the hematopoiesis. There was no
sign of any kind of hematopoietic or lymphoid malignancies. Although gene-modified
lymphocytes persisted in-vivo, the downregulation of transgene expression was consistent with
the ex-vivo observation. In contrast to that the T cells transplanted group showed delayed
engraftment of donor cells and there was no expression of C46 in blood and lymphatic organs. .
In conclusion, when considering HIV gene therapy focusing CD4+ T cells, potential problems of
T cell activation status as related to the desired clinical effect must be addressed. These results
might open the way for a gene therapy targeting mainly or exclusively activated T cells and
could be exploited for immunostimulatory as well as suppressive approaches.
Development of lentiviral vectors for the gene therapy of X-linked chronic granulomatous disease
(2010)
Es gibt eine Vielzahl von Erkrankungen, die auf einen einzelnen Gendefekt zurückzuführen sind (monogene Erkrankungen). Darunter befindet sich auch die Gruppe der primären Immundefizienzen (PIDs), von denen aktuell über 150 verschiedene Typen von der Weltgesundheitsorganisation registriert sind. In vielen fällen leiden betroffene Individuen unter einem stark erhöhten Infektionsrisiko durch bakterielle oder virale Pathogene, sowie den damit verbundenen schweren Symptomen - bis hin zum verfrühten Tod der Patienten. Meist können PIDs mit konventionellen Methoden präventiv behandelt werden. Dazu gehören zum Beispiel die regelmässige Gabe von Antibiotika, Antimykotika, Zytokinen oder Immunglobulinen. Der einzige zur Verfügung stehende kurative Behandlungsansatz beruht auf der Transplantation von hämatopoietischen Stammzellen (HSZT) eines gesunden und passenden Spenders. Häufig steht jedoch kein histokompatibler Spender zur Verfügung.
Für diese Patientengruppe hat sich die gentherapeutische Behandlung mit autologen hämatopoietischen Stammzellen als eine gute Option herausgestellt. Der Beweis hierfür wurde eindrucksvoll in klinischen Heilversuchen für zwei Formen des Schweren Kombinierten Immundefekts (X-SCID und ADA-SCID) geführt, einer Erkrankung die durch das vollständige Fehlen bzw. die nicht-Funktionalität der lymphoiden Immunzellen charakterisiert ist. Autologe hämatopoietische Stammzellen der Patienten wurden hier ex vivo mittels eines gamma-retroviralen Vektors mit einer funktionellen Kopie der defekten cDNA genetisch modifiziert und anschliessend zurück infundiert. In der Summe wurde bei über 30 Patienten eine deutliche Verbesserung des Gesundheitszustandes bis hin zur vollständigen Heilung erzielt. Bei einem vergleichbaren Ansatz wurden in Frankfurt, in einem Heilversuch für die septische Granulomatose (X-CGD), erstmals klinisch relevante Erfolge in der Gentherapie für einen Defekt in der myeloischen Linie von Immunzellen erzielt. Ursache der X-chromosomal gekoppelten Form der septischen Granulomatose sind Mutationen in dem Gen für gp91phox (CYBB), einer essentiellen Untereinheit des in Phagozyten benötigten NADPH-Oxidase Komplexes. In der Folge sind die Phagozyten dieser Patienten nicht mehr in der Lage, die für das Abtöten von Krankheitserregern nötigen reaktiven Sauerstoffspezies zu bilden. Ständig wiederkehrende schwere Infektionen mit sonst unproblematischen Erregern sind die Folge.
Neben klaren gesundheitlichen Verbesserungen in der Mehrzahl der Patienten hatte diese Gentherapeutische Behandlungsstrategie in einigen Fällen auch klare Nebenwirkungen. In fünf von 20 Patienten mit X-SCID, sowie in beiden behandelten X-CGD Patienten, kam es infolge der Therapie zu hämatologischen Veränderungen, die in der Ausbildung eines myelodysplastischen Syndroms (bei X-CGD) und Leukämie (bei X-SCID) mündeten. In allen Fällen war die Ursache eine Hochregulierung von Proto-Onkogenen in der Nähe von g-retroviralen Integrationsstellen. Diese Probleme demonstrieren deutlich die unbedingte Notwendigkeit zur Verbesserung der verwendeten therapeutischen Vektoren.
In der vorliegenden Arbeit wurden lentivirale Vektoren mit myeloid-spezifischen Promotoren entwickelt und auf ihre Eignung für die Gentherapie der X-chromosomal gekoppelten septischen Granulomatose getestet. Lentivirale Vektoren besitzen ein stark verringertes Risiko für Insertionsmutagenese, sowie die exklusive Fähigkeit ruhende Zellen zu transduzieren. Die Verwendung von myeloid-spezifischen Promotoren für die Transgenexpression verringert die Wahrscheinlichkeit der Proto-Onkogen Aktivierung in unreifen Stamm- und Vorläuferzellen – einer Zellpopulation die besonders sensitiv für die in der Leukämieentstehung obligaten Schritte der Immortalisierung und Transformation ist. Gleichzeitig bleibt der volle therapeutische Nutzen erhalten, da das Transgen gp91phox nur in reifen myeloischen Zellen benötigt wird.
Die entwickelten lentiviralen Vektoren exprimieren eine kodonoptimierte gp91phox cDNA unter der Kontrolle des microRNA223-Promoters (223), des MRP8-Promotors (M) oder eines chimären Fusionspromoters bestehend aus den regulatorischen Bereichen des Cathepsin G und des cFes-Promotors (Chim). Zusätzlich wurde ein sogenanntes „ubiquitär aktives Chromatin-öffnendes Element“ (UCOE) in beiden Orientierungen vor den MRP8-Promotor kloniert, um eine erhöhte und stabile Langzeitexpression des Transgens zu erreichen. Ziel der Arbeit war die Selektion eines geeigneten Kandidaten für präklinische Versuchsreihen.
Die für die Evaluierung der Vektoren relevanten Parameter waren die Transgenexpressionslevel, die Spezifität der Expression für myeloische Zellen sowie die vermittelte funktionelle Rekonstitution der NADPH-Oxidase Aktivität. Die Fragestellungen der Langzeitexpression, der Anfälligkeit für CpG-Methylierung sowie der Genotoxizität der Vektoren wurden ebenfalls bearbeitet. Die Vektoren wurden in vitro in verschiedenen Zelllinien sowie in in vitro differenzierten primären murinen und humanen Blutstammzellen getestet. Die beiden besten Kandidaten (223 und Chim) wurden in vivo in Maustransplantationsexperimenten (Maus-Maus und humane Stammzellen in NOD/SCID-Mäuse) analysiert.
Die beiden lentiviralen Vektoren 223 und Chim eignen sich beide für eine effiziente Expression in myeloische Zellen, die zur funktionellen Rekonstitution der NADPH-Oxidase Aktivität in vitro und in vivo führen. Sie sind den bisher in klinischen Anwendungen verwendeten Vektoren in allen Parametern klar überlegen. Daher ist in zukünftigen klinischen Anwendungen ein verbesserter therapeutischer Nutzen für die Patienten sowie eine Verminderung des Risikos von Nebenwirkungen zu erwarten.
Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen führten zu folgenden Ergebnissen:
1. In-silico Analysen von putativen Apoptose-Faktoren im Genom von P. anserina
Es konnten mehrere Gene, die in einer Apoptose-Maschinerie involviert sein könnten, im Genom von P. anserina identifiziert werden. Diese Homologen wurden in zwei Ka-tegorien unterteilt: (i) die nicht-mitochondrialen Proteine PaMCA1, PaMCA2 und PaPARP und (ii) die Homologen des Apoptose-induzierenden Faktors AIF.
2. Einfluss der Metacaspase-Aktivität auf programmierte Zelltodprozesse
Mithilfe von Aktivitätsmessungen konnte eine Arginin-spezifische Aktivität der Meta-caspasen nachgewiesen werden. Diese Metacaspase-Aktivität nimmt in seneszenten Kulturen und nach H2O2-Behandlung signifikant zu. Diese Ergebnisse unterstützen die Hypothese eines programmierten, ROS-induzierten Zelltods im letzten Entwicklungs-stadium des Alternsmodell P. anserina.
3. Die Rolle von AIF-Homologen in der Entwicklung von P. anserina
GFP-Fusionsproteine identifizierten eine mitochondriale Lokalisation der AIF-Homologen PaAIF2, PaAMID2 und PaPRG3. Desweiteren konnte eine altersabhängige PaAIF2-Translokation von den Mitochondrien zum Zellkern gezeigt werden, ähnlich der Apoptose-induzierenden Translokation von humanem AIF. Die Deletion von PaAif2 und PaAmid2 führte zu einer signifikanten Resistenz gegenüber oxidativem Stress und zu einer Verlängerung der Lebensspanne. Diese Befunde weisen auf einen ROS-induzierten, AIF-vermittelten Zelltod hin, der an der Lebensspannen-Kontrolle von P. anserina beteiligt ist.
4. Die Funktion des Proteins PaCYPD bei Seneszenz und programmiertem Zelltod
Membranpotential-Messungen konnten einen Rückgang des mitochondrialen Memb-ranpotentials von 21 % bei den PaCYPD-Überexpressionsstämmen nachweisen. Durch die Behandlung mit dem spezifischen PaCYPD-Inhibitor CSA konnte das Membranpo-tential wieder normalisiert werden. Zusammen mit dem detektierten Verlust von
7 Zusammenfassung
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Cytochrom c in den Mitochondrien der Überexpressionsstämme wird durch diese Studi-en die Vermutung einer PaCYPD-abhängigen Öffnung der mPTP untermauert. Die Pa-PaCypD-Deletion führte zu einer signifikanten Resistenz gegenüber mitochondrial-abhängigem, oxidativem Stress und gegenüber verschiedenen Apoptose-Induktoren. Die Überexpression von PaCypD hingegen führte zu einem beschleunigten Alterungspro-zess (Präseneszenz), einem verschlechterten Resistenzverhalten gegenüber Stress- und Apoptose-Induktoren und zu einer massiven Verkürzung der Lebensspanne. Die Le-bensspanne konnte aber durch die Behandlung mit CSA wieder auf Wildtyp-Niveau verbessert werden. Dies weist auf einen PaCYPD-vermittelte Zelltod hin. Interessan-terweise konnte durch das Wachstum auf CSA-haltigem Medium auch die Lebensspanne des Wildtyps verlängert werden. Um die hier nachgewiesene, lebensver-längernde Wirkung von CSA zu verifizieren, könnte diese Studie leicht auf andere Modellorganismen übertragen werden.
Reziproke chromosomale Translokationen sind häufig mit Leukämien assoziiert und gelten in den meisten Fällen als Erkrankungsursache. Das MLL-Gen auf der Chromosomenbande q23 des Chromosoms 11 ist an einer Vielzahl chromosomaler Translokationen beteiligt, und die dadurch erzeugten reziproken MLL-Fusionsgene sind ausschließlich mit Hochrisikoleukämien assoziiert. Die häufigste Aberration ist eine reziproke Translokation zwischen den beiden Genen MLL und AF4 (4q21), die t(4;11)-Translokation, die in ca. 80% aller Akuten Lymphatischen Leukämien bei Kleinkindern, aber auch bei älteren Patienten mit einer Sekundärleukämie, auftritt. Die leukämischen Blasten dieser Patienten sind meist gegen konventionelle Therapien resistent, so dass t(4;11) Leukämien mit einer ungewöhnlich schlechten Prognose verbunden sind. Welches der beiden Fusionsproteine, MLL-AF4 oder AF4-MLL, die bei der t(4;11)-Translokation entstehen für die Entstehung der Leukämie verantwortlich ist, wird noch kontrovers diskutiert. Bisherige Publikationen zeigen die Onkogenität beider Fusionsproteine, und ihr Potential, Leukämien im Mausmodell hervorzurufen. Frühere Studien dieser Arbeitsgruppe zeigen die onkogene Wirkung des AF4-MLL Fusionsproteins, dessen Expression zur Wachstumstransformation von murinen Zellen und einer Akuten Lymphatischen Leukämie in der Maus führt. Die onkogene Wirkung von AF4-MLL entsteht, sobald das Fusionsprotein nach seiner Prozessierung durch die Endopeptidase Taspase1 heterodimerisiert und dadurch vor SIAH-vermitteltem proteasomalen Abbau geschützt wird. So kann sich das heterodimerisierte Protein - anders als das AF4-Wildtyp Protein - in den Zellen anhäufen und zu unkontrolliertem Wachstum führen. Um die Heterodimerisierung des AF4-MLL Fusionsproteins kompetitiv zu inhibieren, wurden im Rahmen dieser Arbeit kleine Fragmente aus der C-terminalen Interaktionsdomäne FYRC von MLL exprimiert. Dazu wurde die Interaktion kleiner Peptide aus der FYRC-Domäne mit dem N-terminalen Fragment des AF4-MLL Proteins mithilfe eines Biosensorsystems und Co-Immunopräzipitationen getestet. Anschließend wurden die kleinsten Peptide, die noch an das N-terminale Fragment binden können (B1 und B3), ausgewählt, und zusammen mit AF4-MLL co-exprimiert. Mithilfe von Western Blot-Analysen von gereinigtem AF4-MLL·N konnte gezeigt werden, dass die Expression dieser Peptide dazu führt, dass das C-terminale Fragment nicht mehr an das N-terminale Fragment binden kann. Durch diese Inhibition der Heterodimerisierung kann der AF4-MLL Multiproteinkomplex nicht vollständig aufgebaut werden, da auch die C-terminalen Komplexpartner WDR5 und RBBP5 nur noch eingeschränkt binden können. Zusätzlich wurde die Stabilität der prozessierten Fragmente AF4-MLL·N und MLL·C im Falle einer Inhibition der Dimerisierung untersucht. Offensichtlich sind beide Fragmente nur stabil, wenn sie miteinander heterodimerisiert sind. Eine Blockierung der Interaktion durch kompetitive Peptide führt dazu, dass sowohl AF4-MLL·N als auch MLL·C proteasomal degradiert werden. Da auch das MLL-Wildtyp Protein über die Interaktionsdomänen FYRN und FYRC heterodimerisiert, wurde zusätzlich der Effekt der Expression der Peptide auf die Viabilität von MLL-exprimierenden Zellen untersucht. Dazu wurden die Peptide B1 und B3 in sechs unterschiedlichen Zelllinen, von denen zwei die t(4;11)-Translokation tragen, exprimiert. Anschließend wurde nach einer PI-Färbung der Anteil apoptotischer Zellen mithilfe eines Durchflusszytometers ermittelt. Die vorliegenden Daten deuten darauf hin, dass keines der beiden Peptide einen starken Einfluss auf Zelllinien hat, die das Wildtyp-MLL Gen besitzen. Die Apoptose der vier untersuchten Zelllinien war kaum erhöht, wenn diese Peptide exprimiert wurden. Interessanterweise scheint das Peptid B1 dagegen einen Apoptosefördernden Effekt auf diejenigen Zellen zu haben, die das AF4-MLL Protein exprimieren. Basierend auf den vorliegenden Daten kann die Aussage getroffen werden, dass es prinzipiell möglich ist, das AF4-MLL Fusionsprotein spezifisch anzugreifen. Eine Blockierung der Heterodimerisierung blockiert die Ausbildung des onkogenen AF4-MLL Multiproteinkomplexes. Dies führt zudem dazu, dass die beiden Taspase1-prozessierten Fragmente AF4-MLL·N und MLL·C proteasomal degradiert werden. Die Inhibition der Heterodimerisierung von AF4-MLL ist mit einer leicht erhöhten Apoptoserate in t(4;11)-positiven Zellen verbunden. Diese Beobachtung könnte in Zukunft von Bedeutung sein, wenn über neue Therapieansätze bei t(4;11) Leukämien nachgedacht werden sollte.