Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität; nur lokal zugänglich)
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Signal-dependent regulation of actin dynamics is essential for many cellular processes, including directional cell migration. In particular, cell migration is initiated by lamellipodia, actin-based protrusions of the plasma membrane. The formation of these protruding structures require incessant assembly and disassembly of actin filaments. The Arp2/3 complex and WAVE proteins are essential for both lamellipodium formation and its dynamics. WAVEs mediate the activation of the Arp2/3 complex downstream of the small GTPase Rac, thus being critical for Rac- and RTK-induced actin polymerization and cell migration. The WAVE-family proteins are always found associated with multiprotein complexes. The most abundant WAVE-based complex is referred to as the WANP (WAVE2-Abi-1-Nap1-PIR121) complex. IQGAP1 is a huge scaffolding protein with multiple protein-interacting domains. IQGAP1 participates in many fundamental activities, including regulation of the actin cytoskeleton, mitogenic, adhesive and migratory responses, as well as in cell polarity and cellular trafficking. IQGAP1 binds to N-WASP, thus raising the possibility that it might control actin nucleation by the Arp2/3 complex. In this study, IQGAP1 was found co-immunoprecipitated not only with WAVE, but also with the endogenous WANP-complex subunits. Correspondingly, IQGAP1 associated to both anti-WAVE and anti-Abi-1 immuno-complexes. Pull-down experiments proved that IQGAP1 binds directly to the WANP-complex subunits. Physical interaction between IQGAP1 and the reconstituted WANP complex could also be demonstrated. Together, these data indicate that IQGAP1 is an accessory component of the WANP complex. Interestingly, the IQGAP-WANP complex disassembled after either EGF stimulation or transfection with constitutively active Cdc42 and Rac1. HeLa cells devoid of IQGAP1 showed diminished and less persistent ruffling upon EGF, but not HGF, stimulation in comparison with the control. This phenotype was accompanied by a strong reduction in chemotaxis towards both growth factors, which was as dramatic as in WANP-complex knockdown (KD) cells. Moreover, GM130 and Giantin showed a polarized and flat ribbon-like pattern in control cells, as it is expected for cis- and cis/medial-Golgi markers. Conversely, small and dispersed vesicular structures were found in both IQGAP1 KD and WANP-complex KD cells. Importantly, Arp2/3-complex silencing resulted in the same phenotypes. Consistently, Brefeldin A-induced disassembly of the Golgi strongly inhibited the IQGAP1-WANP-complex interaction and chemotaxis towards EGF in wild-type cells. The re-expression of an RNAi-resistant wild-type IQGAP1 in IQGAP1 KD cells fully rescued both the ruffling abilities and Golgi structure. A constitutively active mutant, unable to bind to neither Rac1 /Cdc42 nor the WANP complex, could reconstitute only the former defect. Hence, this study shows that actin dynamics regulated by the IQGAP1-WANP complex controls Golgi-apparatus architecture and its contribution to cell chemotaxis. The working model here proposes that at the Golgi apparatus, recruitment of the WANP complex by IQGAP1 leads to the assembly of actin filaments required to maintain the appropriated Golgi morphology. The dissociation of the complex may be required to allow the remodeling of the Golgi membranes in order to respond following a chemoattractant gradient.
Succinate:quinone oxidoreductases (SQORs) are integral membrane protein complexes, which couple the two-electron oxidation of succinate to fumarate (succinate → fumarate + 2H+ + 2e-) to the two-electron reduction of quinone to quinol (quinone + 2H+ + 2e- → quinol) as well as catalyzing the opposite reaction, the reduction of fumarate by quinol. In mitochondria and some aerobic bacteria, succinate:ubiquinone reductase, also known as complex II of the aerobic respiratory chain or as succinate dehydrogenase from the tricarboxylic acid (TCA or Krebs) cycle, catalyzes the oxidation of succinate by ubiquinone, which is mildly exergonic under standart conditions and not directly associated with energy storage in the form of a transmembrane electrochemical proton potential (Δp). Gram-positive bacteria do not contain ubiquinone but rather menaquinone, a quinone with significantly lower oxidation-reduction (“redox”) midpoint potential. In these cases, the catalyzed oxidation of succinate by quinone is endergonic under standard conditions. Consequently, these bacteria face a thermodynamic problem in supporting the catalysis of this reaction in vivo. Based on experimental evidence obtained on whole cells and purified membranes, it had previously been proposed that the SQR from Gram-positive bacteria supports this reaction at the expense of the protonmotive force, Δp. Nonetheless, it has been argued that the observed Δp dependence is not associated specifically with the activity of SQR because the occurrence of artifacts in experiments with bacterial membranes and whole cells can not be fully excluded. Clearly, definitive insight into the mechanism of catalysis of this intriguing reaction required a corresponding functional characterization of an isolated, membranebound SQR from a Gram-positive bacterium. The first aim of the present work addresses the question if the general feasibility of the energetically uphill electron transfer from succinate to menaquinone is associated specifically to a single enzyme complex, the SQR. The prerequisite to achieve this goal was stable preparation of this enzyme.
In dieser Arbeit wurden die physiologische Funktion innerhalb der Ribosomenbiogenese und die physikalischen Interaktionen des nukleolären, essentiellen Proteins Nep1p in der Hefe Saccharomyces cerevisiae untersucht. Durch Hefe-Zwei-Hybrid-Experimente und biochemische Analysen konnte eine Homodimerisierung des Proteins festgestellt sowie eine strukturabgeleitete Dimerisierungsmutante identifiziert werden. Ebenfalls aus der Struktur des Nep1p-Homologs aus Methanocaldococcus jannaschii konnte eine Nop14p-Bindungsregion auf der der Dimerkontaktfläche abgewandten Seite des Hefeproteins vorhergesagt und nach in vitro-Mutagenese bestätigt werden. Innerhalb des Nop14-Proteins wurden zwei Domänen charakterisiert, die im Zwei-Hybrid-System mit Nep1p interagieren. Aus Strukturdaten in Kombination mit Hefe-Drei-Hybrid-Experimenten konnte die RNA-Bindungsregion an der Dimerkontaktfläche des Nep1-Proteins lokalisiert werden. In Drei-Hybrid-Selektionen wurden RNA-Sequenzen mit hoher Affinität zu dem M. jannaschii Nep1p identifiziert, die auf eine Bindung des Proteins bei Helix 35 der 16S rRNA schließen lassen. Aufgrund der hohen Konservierung dieser rRNA-Region ist eine Bindung des Hefeproteins an die 18S rRNA-Schleife von Nukleotid 1189-1196 sehr wahrscheinlich. Da Nep1p eine große Ähnlichkeit zu Proteinen der SPOUTFamilie von Methyltransferasen aufweist, war von einer rRNA-Methylierung im Verlauf der Ribosomenbiogenese als katalytische Funktion des Proteins auszugehen. Aus verschiedenen Drei-Hybrid-Experimenten zur RNA-Bindungungsspezifität ergab sich als mögliche Reaktion die N1-Methylierung des Nukleotids 1-Methyl-3-(3-Amino-3-Carboxypropyl)-Pseudouridin (m1acp3Y) 1191 der 18S rRNA. Durch eine spezifische radioaktive Markierung der acp-Gruppe konnte gezeigt werden, dass Nep1p keinen Einfluss auf die spätere Aminocarboxypropylmodifizierung hat. Diese findet auch bei einer Deletion der snoRNA35 statt, also auch an einem Uridin, und ist unabhängig von dem cytoplasmatischen Protein Tma20p. In RP-HPLC-Experimenten konnte nachgewiesen werden, dass die 18S rRNA einer Dnep1Dnop6-Doppelmutante ein Aminocarboxypropyl-modifiziertes Nukleosid enthält, dass sich in seinem Retensionsverhalten von dem m1acp3Y eines Wildtyps unterscheidet. Bei dem in diesem Stamm detektierten acp-modifizierten Nukleosid handelt es sich vermutlich um ein nicht-methyliertes acpY, was eine Funktion von Nep1p als N1-Methyltransferase des Nukleotids Y1191 der 18S rRNA höchst wahrscheinlich macht. Diese katalytische Funktion konnte in Zusammenarbeit mit Prof. Wöhnert auch für das M. jannaschii Nep1p gezeigt werden. Dass sowohl eine snr35- Deletion als auch eine 18S rRNA-Mutation des Nukleotids 1191 nicht letal sind, machte deutlich, dass die N1-Methylierung nicht die essentielle Funktion von Nep1p darstellen kann. Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass die Suppression der nep1-1ts-Mutante durch S-Adenosylmethionin nicht auf der Unterstützung der Methyltransferase-Aktivität des Proteins, sondern vermutlich eher auf einer generellen Stabilisierung des temperatursensitiven Proteins beruht. Sowohl im Hefe-Nep1p als auch im humanen Homolog wurden durch biochemische und genetische Experimente mehrere Phänotypen der Bowen-Conradi-Mutation (Aspartat 90 zu Glycin in ScNep1p) nachgewiesen. Diese lassen auf eine Aggregation des mutierten Proteins sowie eine dadurch bedingte Fehllokalisation innerhalb der Zelle schließen. Zusätzlich ist aber auch ein RNA-Bindungsdefekt durch den Aminosäureaustausch wahrscheinlich. Nichtsdestotrotz liegt offensichtlich ausreichend Nep1p-Protein vor, dass seine essentielle Funktion erfüllen kann, da die Mutation selbst zu keinem Wachstumsphänotyp führt. Erst bei einer partiellen Translationsrepression des mutierten Proteins unter Verwendung des artifiziellen Tetrazyklin-Aptamer-Systems ist ein verlangsamtes Wachstum von Hefezellen zu beobachten, was dieses System geeignet zur Analyse von möglichen Therapeutika macht.
The mTOR kinase inhibitor rapamycin (sirolimus) is a drug with potent immunosuppressive and antiproliferative properties. We found that rapamycin induces the TGF/Smad signaling cascade in rat mesangial cells (MC) as depicted by the nuclear translocation of phospho-Smads 2, -3 and Smad-4, respectively. Concomitantly rapamycin increases the nuclear DNA binding of receptor (R)- and co-Smad proteins to a cognate Smad-binding element (SBE) which in turn causes an increase in profibrotic gene expression as exemplified by the connective tissue growth factor (CTGF) and plasminogen activator inhibitor 1 (PAI-1). Using small interfering (si)RNA we demonstrate that Smad 2/3 activation by rapamycin depends on its endogenous receptor FK-binding protein 12 (FKBP12). Mechanistically, Smad induction by rapamycin is initiated by an increase in active TGF1 as shown by ELISA and by the inhibitory effects of a neutralizing TGF antibody. Using an activin receptor-like kinase (ALK)-5 inhibitor and by siRNA against the TGF type II receptor TGF-RII) we furthermore demonstrate a functional involvement of both types of TGF receptors. However, rapamycin did not compete with TGFfor TGF-receptor binding as found in radioligand-binding assay. Besides SB203580, a specific inhibitor of the p38 MAPK, the reactive oxygen species (ROS) scavenger N-acetyl-cysteine (NAC) and a cell-permeable superoxide dismutase (SOD) mimetic strongly abrogated the stimulatory effects of rapamycin on Smad 2 and 3 phosphorylation. Furthermore, the rapid increase in Dichlorofluorescein (DCF) formation implies that rapamycin mainly acts through ROS. In conclusion, activation of the profibrotic TGFSmad signaling cascade accompanies the immunosuppressive and antiproliferative actions of rapamycin. Keywords: FK506 binding protein; p38 MAP kinase; rapamycin; renal fibrosis; Smads; TGFβ
The documentation of life on Earth, that is, the inventorization of nature and the naming and classification of organisms found therein, is a major task for biologists today and a fundamental precondition for nature conservation efforts. This study aimed at contributing to the inventory of amphibians and reptiles in selected, previously understudied ecoregions of Bolivia. I strove to document diversity patterns and seek possible ecological and historical reasons for these patterns. Special attention was paid to the Chiquitano Region situated in the eastern lowlands of Bolivia in a climatic transition zone between the humid evergreen Amazon Forests and the deciduous thorn-scrub vegetation of the Gran Chaco. In congruence with its location in the transition zone, the Chiquitano Region displays a mosaic of habitats: The vegetation is dominated by the endemic Chiquitano Dry Forest, which is probably the largest extant patch of Seasonal Dry Tropical Forest, with enclaves of savanna, the western outliers of the Cerrado biome of central Brazil. Taxonomic revisions: The taxonomic data in this study are used as a tool to measure biodiversity, to assess biogeographic relationships, and to evaluate conservation needs. Since all is predicated on the taxonomic decisions made, an adequate taxonomy is essential, and taxonomy can be regarded as the foundation of this study. The methodology encompassed a variety of herpetological field techniques, such as different survey methods, preparation and documentation of voucher specimens, recording of frog calls, and herpetological laboratory techniques, such as morphology, molecular procedures with mtDNA, phylogenetic analyses, and bioacoustic analysis and descriptions of frog calls. A total of 1251 specimens belonging to 200 species were obtained during this study, including 87 amphibian and 123 reptile species. This constitutes about 36% of the herpetofauna currently known for Bolivia, about 34% of the amphibians currently known for Bolivia and about 40% of the reptiles, respectively. In the course of this study, a new species of frog was described from the study site Caparu in the eastern lowlands of Bolivia; this species, Hydrolaetare caparu Jansen, Gonzales & G. Köhler 2007, differs from the other two congeners in external morphology (e.g., lateral fringes and relative length of fingers, size of palmar tubercle, webbing of toes, and colouration) and advertisement call. Two new colubrid snake species were also described from the study site San Sebastián. Thus far, both are known only from the Chiquitano Region, Provincia Ñuflo de Chávez. Phalotris sansebastiani Jansen & G. Köhler 2008 differs from all the other species in the genus in having a triangular projection of the red snout colouration reaching onto the parietals. Xenopholis werdingorum Jansen, Gonzales & G. Köhler 2009 can be identified as a member of the genus Xenopholis by its vertebral morphology. It differs from the other two species of Xenopholis in having a unique uniform dorsal colour pattern, and from X. scalaris in having two prefrontals and a narrow septum within the neural spine and perpendicular to its long axis as evident in the x-ray images. A review of a small collection of pitvipers from different lowland localities and from the Inter-Andean dry valleys of the region of Pampagrande revealed one new species of Bothrops and one of Bothrocophias (both to be formally described elsewhere). The two pitviper species differ morphologically and genetically from their congeners. The results of a brief review of a small collection of frogs of the genus Scinax (Anura: Hylidae) from different localities in the lowlands, together with analyses of their bioacoustics, suggest an unknown cryptic diversity in Bolivian species of Scinax cf. fuscomarginatus and allies. However, further studies are necessary to clarify the taxonomic status of these populations. In addition, this study provides new data on the morphology (e.g., pholidosis) of snakes, many of them previously known only from few museum specimens. Keys to the Bolivian lizard species of Cercosaura and the Bolivian snake species of Chironius, Clelia, Liophis, Lystrophis, Phalotris, and Xenodon are presented here for the first time. New information on distribution includes many range extensions of amphibian and reptile species, such as five new country records (one frog species, four snake species) and six new departmental records (two frog species, four snake species). Observations on ecology and natural history: Several observations on ecology and natural history were made during field work. Visual signaling, an aspect of territorial behavior that was already known for several species of the genus Phyllomedusa, could be described for the first time for Phyllomedusa boliviana (Jansen & J. Köhler 2007). Furthermore, during audio surveys of an anuran community at the study site San Sebastián from 2005 to 2007, a decline of certain amphibian populations was observed in the rainy season 2006/2007 (Jansen et al., in press). This is possibly related to an extreme drought in the dry season of 2006 where 158 consecutive days without rainfall were recorded. In addition, a new method for measuring intensity of anuran choruses by means of a continuous sound pressure metre was developed (Jansen 2009). The method was suitable to detect calling phenology (during one night), as well as differences in calling activity (between two nights). Biodiversity and biogeographical relationships: Species lists were compiled at the six study sites Pampagrande, Los Volcanes, San Sebastián, Caparú, El Espinal und El Corbalan. The total amphibian and reptile species numbers observed ranged from 37 to 101 with the highest species numbers in San Sebastián (101) and Caparú (89) and the lowest in Los Volcanes (37) and El Espinal (41). A preliminary species list of the herpetofauna of the Chiquitano Region was presented, including 60 amphibian and 84 reptile species. The majority of the amphibians of the Chiquitano Region are classified predominantly as inhabitants of open formations (41 species, 68.3%). Interestingly, even the majority of species recorded from the Chiquitano Dry Forest (32 species) are usually associated with open formations (22 species, 66.7%), followed by the number of species associated with open and forest formations (8 species, 24.4%). Only two of the observed species (6.0%) are predominant forest dwellers. The amphibian assemblage of the Chiquitano Region is most similar in composition to that of the Cerrado biome: 46 species (76.7%) occur in the Cerrado as well, and three species are regarded as Cerrado endemics (5.0%). The Chiquitano Region shares considerably fewer amphibian species with the other biomes (Amazon: 22 species, 36.7%; Gran Chaco: 13 species, 21.7%; Caatinga: 16 species, 26.7%). The reptile assemblage also has significant affinities to the Cerrado, which can be seen in the high proportion of reptile species distributed in that biome (68 species; 81.0%). Affinities to the other biomes are as follows: Amazon (48 species, 57.1%), Chaco (37 species, 40.1%), and Caatinga (30 species, 35.7%). When arranged in mutually exclusive biome categories, reptiles and amphibians showed similar patterns so that the majority of both amphibians and reptiles of the Chiquitano Region can be regarded as widespread. The high proportion of reptile species probably endemic to this region (5 species, 6.0%) is remarkable (i.e. Tropidurus xanthochilus, Apostolepis phillipsi, Phalotris sansebastiani, Xenopholis werdingorum, and Micrurus diana). In an analysis of the biodiversity patterns and biogeographical relationships of the herpetofauna of the study sites, these sites were compared with literature data from 37 localities and included in a presence/absence matrix with a total of 657 amphibian and reptile species in the surrounding South American biomes Amazon, Cerrado and Gran Chaco. The biogeographic relationships between these sites were evaluated using the Coefficient of Biogeographic Resemblance (CBR), cluster analysis, and multidimensional scaling (MDS) of sites. The analyses were first conducted on amphibians and reptiles combined, and than group-specific each for amphibians, reptiles, lizards, and snakes, separately. A “bias-reduced analysis” was developed for a better understanding of the affinities of the amphibians. In this analysis, e.g., the distinct habitat types of the Chiquitano Region, the Chiquitano Dry Forest and the Cerrado were taken into account. Analyses of the biodiversity patterns revealed that the sites in the Amazon comprise highest species numbers, as expected, followed successively by the sites in the Cerrado biome and sites in-between the two biomes. Within the eastern lowlands of Bolivia, the Chiquitano Region is the most rich in species. Comparing it with the other South American sites, the Chiquitano Region has a surprisingly high alpha diversity, especially in amphibians. The microgeographic variation in species composition (beta diversity) in the Chiquitano Region is also remarkably high and obviously related to the mosaic character of the vegetation and habitats. However, the bias-reduced analysis revealed that the amphibian fauna of the open areas and savannas at Hacienda San Sebastián (with 36 species in the Cerrado and pastureland) was one of the most species-rich savanna sites known for amphibians in South America. Considering that the Hacienda San Sebastián site is only ca. 3300 ha (= 1.29 amphibian species per km2), this outcome is particularly suprising. The results of the analyses of the biogeographical relationships suggest that the herpetofauna of Bolivia’s lowlands, including the Beni, the Pantanal and the Chiquitano Region, is as distinct from the herpetofauna of the Gran Chaco, Amazon, and Cerrado as these biomes are from each other. The Chiquitano herpetofauna in particular represents a unique and well-defined herpetofaunal assemblage when compared to all surrounding localities and biomes. This is supported by high CBR-values, findings from the cluster analysis, as well as a clear separation of the Chiquitano sites in the MDS. Biogeographic relations exist in all the surrounding biomes, but are strongest to Cerrado, followed by the Amazon. This study strongly suggests that the Chiquitano herpetofauna is composite and has multiple affinities. This is congruent with a well-defined Chiquitano flora, avifauna and mammalian fauna, suggesting a similar history. The bias-reduced analysis revealed a more detailed picture of the biogeographic relations of the Chiquitano Region, especially the Chiquitano Dry Forest. I argue here that the Chiquitano Dry Forest herpetofauna is a “young”, and “former savanna herpetofauna”. Whereas the Chiquitano Dry Forest is rather poor in amphibian and reptile species, and endemics are lacking from this forest type, the isolated Cerrado enclaves are especially diverse in species and probably contain locally endemic species, such as Phalotris sansebastiani and Xenopholis werdingorum. The colonization of the young Chiquitano Dry Forest may have taken place from savannas by mainly open area species, and only briefly through the Amazon. The results emphasise the importance of bias-reduction in studies of biogeography, e.g., by using group-specific analyses or by taking into account criterias as area size and heterogeneity of compared sites. The different biogeographic patterns of reptiles and amphibians of the Andean valleys indicate a different history of these two groups. In regard to reptiles, dispersals and withdrawals into the valleys in warm humid and dry cool periods in the Pleistocene seem likely, supported by a relation between the valleys and the dry lowland (e.g., Chaco). However, it is more plausible that, during these climatic fluctuations, amphibians migrated to adjacent, more humid regions, such as Yungas. The study verified the known patterns of sister-species pairs in the Inter-Andean Dry Forest and the lowlands. Additionally, pairs of populations with slight differences in morphology were found in the valleys and in the lowlands (Cercosaura parkeri and Xenodon rhapdocephalus). Further studies must test the taxonomic status of these populations. The discovery of new species of Bothrops and Bothrocophias from the Andean valleys has several implications, and possible reasons for the high endemism in the dry valleys are discussed. Conservation and outlook: The high local alpha and beta diversity of the Chiquitano herpetofauna shows that this is a region of complex faunal interaction, which reflects the present heterogeneity of the region, but which is possibly also related to a complex geological and environmental history. The Chiquitano Region can be assessed as a region of distinct regional herpetofaunal diversity charaterised by small scale diversity patterns. It therefore merits recognition as a unique ecoregion, and conservation effort should be increased. Further research is necessary to solve the taxonomic problems addressed in this study. Moreover, future work should be directed towards the development and institution of longterm monitoring programs to evaluate the effects of climate change and changes in land-use on biodiversity, especially that of the Chiquitano Region.
Orthopoxviruses are large DNA viruses that replicate within the cytoplasm of infected cells encoding over a hundred different proteins. The orthopoxviral 68k ankyrin‐like protein (68k‐ank) is highly conserved among orthopoxviruses, and this study aimed at elucidating the function of 68k‐ank. The 68k‐ank protein is composed of four ankyrin repeats (ANK) and an F‐box‐like domain; both motifs are known proteinprotein interaction domains. The F‐box is found in cellular F‐box proteins (FBP), crucial components of cellular E3 ubiquitin (Ub) ligases. With yeast‐two‐hybrid screens and subsequent co‐immunoprecipitation analyses, it was possible to identify S‐phase kinase‐associated protein 1a (Skp1a) as a cellular counterpart of 68k‐ank via binding to the F‐box‐like domain. Additionally, Cullin‐1 was co‐precipitated, suggesting the formation of a viral‐cellular SCF E3 Ub ligase complex. Modified Vaccinia virus Ankara (MVA) ‐ being attenuated and unable to replicate in most mammalian cell lines due to a block in morphogenesis – nevertheless, expresses its complete genetic information attributing to its properties as promising vector vaccine. Conservation of 68k‐ank as the only ANK protein encoded by MVA implied a substantial role of this viral factor. Hence, its function in the viral life cycle was assessed by studying a 68k‐ank knock‐out MVA. A mutant phenotype manifested in nonpermissive mammalian cells characterized by a block succeeding viral early gene expression and by a reduced ability of the virus to shutoff host protein synthesis. Studies with MVA encoding a 68k‐ank F‐box‐like domain truncated protein revealed that viral‐cellular SCF complex formation and maintenance of viral gene expression are two distinct, unrelated functions fulfilled by 68k‐ank. Moreover, K1, a well‐described VACV host range factor of the ANK protein family, is able to complement 68k‐ank function. This suggests that gene expression of MVA putatively depends on the ANKs encoded in 68k‐ank. In addition to the important findings in vitro, first virulence studies with the mouse pox agent, ectromelia virus (ECTV) deleted of the 68k‐ank ortholog (C11) suggested that this factor contributes to ECTV virulence in vivo.
Gepaarte assoziative Magnetstimulation (PAS) kann im primären menschlichen Motorkortex (M1) sowohl langzeitpotenzierungs- (LTP) als auch langzeitdepressionsähnliche (LTD) Erregbarkeitsveränderungen hervorrufen. Dies kann durch die Untersuchung magnetisch evozierter Potentiale (MEP) erfasst werden. Dagegen ist wenig über die Auswirkungen von PAS auf willkürliche Aktivität des motorischen Kortex bekannt. Im ersten Experiment haben wir bewegungsabhängige kortikale Potentiale (MRCP) bei zehn gesunden Probanden im EEG registriert, um die willkürliche Aktivität im Motorkortex während der Vorbereitung zweier motorischer Aufgaben zu erfassen. Die Probanden mussten dabei entweder den Daumen abduzieren (Hauptmuskel: Musculus abductor pollicis brevis, APB) oder das Handgelenk strecken (Hauptmuskel: Musculus extensor carpi radialis, ECR). Die Amplituden der motorisch evozierten Potentiale im APB wurden dabei durch PASLTP gesteigert, durch PASLTD vermindert und blieben bei PAScontrol unverändert. Im Gegensatz dazu wurden sie im ECR durch keine PAS-Bedingungen verändert. PASLTP verminderte die Negativität der MRCP während des späten Bereitschaftspotentials (-500 bis 0 ms vor Bewegungsbeginn) nur in der APB-Aufgabe. Diese Veränderungen zeigten sich hauptsächlich über zentralen Elektroden kontralateral zur bewegten Hand. Dieser Effekt korrelierte negativ mit dem durch PASLTP induzierten MEP-Anstieg im APB. PASLTD und PAScontrol hatten dagegen keinen Einfluss auf die MRCP Amplituden. Unsere Ergebnisse deuten auf eine spezifische Wechselwirkung von PAS mit willkürlicher Aktivität im Motorkortex während der Vorbereitung motorischer Aufgaben hin. Dies könnte durch ein Zusammenspiel aus erhöhter Exzitabilität von M1 und einer unterbrochenen effektiven Konnektivität zwischen prämotorischen Arealen und M1 erklärt werden. Die Modulation des dorsolateralen prämotorischen Kortex (PMd) durch repetitive transkranielle Magnetstimulation (rTMS) verändert die kortikospinale Erregbarkeit in M1. Die Auswirkungen von PMd-rTMS auf vorbereitende Prozesse für willkürliche Bewegungsabläufe sind jedoch unklar. Contingent negative variation (CNV) repräsentiert im EEG kortikale Vorbereitungsprozesse äußerlich getriggerter Bewegungen während das Bereitschaftspotential (BP) Vorbereitungsprozesse intern getriggerter Bewegungen repräsentiert. Im zweiten Experiment wurden CNV und BP jeweils vor und nach PMd-rTMS untersucht. Das Experiment bestand aus drei CNV-Versuchsblöcken mit insgesamt 243 Durchgängen. Dabei mussten die Probanden auf visuelle Anweisung hin eine zwei-Item Finger-Bewegungssequenz durchführen. RTMS wurde sowohl mit 1 Hz als auch mit 5 Hz bei einer Intensität von 110% der aktiven motorischen Schwelle (AMT) unter individueller MR-Navigation appliziert. Die Erfassung des BP erfolgte während der Durchführung derselben motorischen Aufgaben, allerdings bekamen die Probanden keine Anweisungen. Die Durchschnittsamplituden der frühen und späten Komponente von CNV (CNV1:1500-500 ms vor dem Startsignal (S2); CNV: 500-0 ms vor S2) und der frühen und späten Komponente des BP (BP1: 1500-500 ms vor EMG Beginn; BP2: 500-0 ms vor EMG-Beginn) wurden quantitativ für 25 zentrale Elektrodenpositionen verglichen. CNV2 zeigte eine signifikante Bahnung über dem frontal-zentralen Bereich nach 1 Hz PMd-rTMS, blieb aber unverändert nach 5 Hz PMd-rTMS. CNV1, BP1 und BP2 blieben durch 1 Hz und 5 Hz PMd-rTMS unbeeinflusst. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass der dominante PMd eine wichtigere Rolle in der Vorbereitung extern getriggerter Bewegungen spielt, als dies bei intern getriggerten Bewegungen der Fall zu sein scheint. Die CNV2-Antwort könnte eine intensive Interaktion innerhalb des menschlichen motorischen Kontrollnetzwerks anzeigen, die möglicherweise auf kompensationsähnlichen Mechanismen beruht.
Paleoecology is the study of organismal interactions with the environment in the geological past. Organisms are influenced in their distribution and abundance by abiotic factors such as temperature and precipitation. A change in these factors, for example by major climatic shifts, would then affect the communities of organisms. Studying this hypothesized causal link between climatic and faunal change is especially interesting for the Plio-Pleistocene of East Africa due to the fact that our own ancestors also inhabited these regions. Both the Turkana basin in Kenya and the Lake Albert region in Uganda offer unique opportunities to investigate these paleoecological issues. Their late Miocene through Pleistocene deposits provide a very good record of climatic, vegetation and faunal change in East Africa (Pickford et al. 1993, Leakey et al. 1995, 1998, McDougall & Feibel 2003, Wynn 2004). This study focuses on the mammal family Bovidae as they are good indicator of vegetation and environment (e.g. Vrba 1980, 1995, Shipman & Harris 1988, Bobe & Eck 2001, Bobe & Behrensmeyer 2004, Bobe et al. 2007). Bovidae are quite species-rich and inhabit a wide range of habitats from tropical rain forests to deserts which predicates their array of morphological adaptations (ecovariables) to these environments. Diet is the ecovariable that is most to climate and thus habitat change. Therefore, the fossil Bovidae are especially suitable for reconstructing past environments. The objective of this thesis is to test the hypothesis that, from the late Miocene through the Holocene, Africa has experienced an overall increase in aridity and concomitant pulses of habitat change. The hypothesis predicts that increasing aridity causes a likewise growth in the abundance of taxa adapted to open arid environments. In particular, an increase in bovid grazers should be observed in combination with a decrease of bovid browsers. To test this hypothesis, I examine the fossil bovid communities from each stratigraphic member of Lake Turkana (Lothagam, Kanapoi, West Turkana and Koobi Fora) and Lake Albert (Nkondo-Kaiso region) and through a taxonomic and a functional perspective reconstruct the paleoenvironments and -climates from approximately 8 to 0.6 Ma. This study is the first to use taxonomic and ecomorphological data together to reconstruct the paleoenvironments of the Turkana basin and the Nkondo-Kaiso region of Lake Albert. In a first analysis, mesowear, as introduced by Fortelius & Solounias (2000), is used to gather information about the diet of bovids. As a result of my preliminary investigations on upper vs. lower molars of recent species, the sample of fossil bovid specimens from the Turkana basin and Lake Albert were found to be unsuitable to reveal a meaningful diet reconstruction. Therefore, the bovids are assigned to diet categories based on literature. For each member of the time period from 8.0 to 0.6 Ma, I provide a detailed characterization of the bovid fauna in terms of α- and β- diversity both on tribe and diet level based on presence-absence as well as for the Turkana basin on abundance data. Statistical comparisons between the fossil bovid communities and those in modern protected areas with known vegetation and climatic conditions have yielded modern analogues for each stratigraphic member. Following that I provide paleoclimatic conditions such as assumed mean annual temperature for each member. Based on abundance of diet categories in the bovid communities, the paleoclimate of the Turkana basin was in general cooler and considerably more humid during the late Miocene to the Pleistocene than today. The mean annual temperature at Lothagam is assumed as 22.2 °C, the annual precipitation as 685 mm for 8.0 – 6.54 Ma and 4.9 – 3.4 Ma. The intervening time period is characterized by a slightly lower mean annual temperature and precipitation (20.3 °C, 583 mm). From 4.17 to 4.07 Ma Kanapoi faced 21.3 °C and 592 mm rainfall. In the eastern part of the basin the climate was warmer and more humid (3.4 – 2.68 Ma: 26.2, 961 mm; 2.68 – 1.3 Ma: 27.1 °C, 935 mm) from 3.4 to 1.3 Ma than in the preceeding eras. In the western part, the climate became warmer and more humid ~500,000 years later and was more variable than that in the eastern basin. From 2.94 to 2.52 Ma the mean annual temperature was 26.2 °C and the annual precipitation 961 mm. Between 2.34 and 1.6 Ma the climate again cooled and became drier as before 2.94 Ma. A second shift to higher temperature and precipitation occurred after 1.6 Ma (27.1 °C, 935 mm) lasted until 1.34 Ma. The results of the bovid community analyses do not support the hypothesis of increasing aridity in Eastern Africa during the late Mio- to Pleistocene. Instead, the results show that the bovid communities differed much over time and on a relatively small spatial scale. Regional paleovegetation and paleoclimate exhibit fluctuations through the studied time period at western Turkana and differences between the western and eastern part of the Turkana basin. This is indicative of a patchy habitat distribution both on temporal and spatial levels. Increased climate variability predicts an increase in landscape complexity as proposed by the ‘variability selection hypothesis’ (Potts 1998a+b). Therefore, this thesis research supports the hypothesis of increased landscape complexity on the spatial level. This study has important implications for future research. First, an analysis based on ecovariable characteristics such as diet may be preferred to a taxonomic analysis. Second, abundance data should be used for an ecovariable analysis because the results then provide more precise information on the paleovegetation and –climate than just the presence of these adaptations in the faunal community. Lastly, as this study is based on one mammal family, further studies on other mammal groups should be conducted to increase the database of exploited resource by the entire faunal community. Most significantly this study provides a basis for new interpretations of faunal community distributions. It also raises the question whether small scale spatial community variability is also to be expected at other fossil sites. If so then this methodology has important implications for reconstructions of paleovegetation and paleoclimate.
Die Brustdrüse (glandula mammaris) bietet ein einzigartiges Modellsystem zum Studium der adulten Stammzellen und der molekularen Signalwege, welche die Selbsterneuerung dieserZellen sowie die Proliferation und Differenzierung der Vorläuferzellen kontrollieren. Die Brustdrüse besteht aus dem Brustepithel und dem Stroma, das zum größten Teil aus dem Fettgewebe gebaut ist. Es enthält auch andere Zelltypen z. B. Fibroblasten und Makrophagen. Die Entwicklung der Brustdrüse findet hauptsächlich nach der Geburt, während der Pubertät, Schwangerschaft und Laktation statt. Ein funktionelles Brustepithel wird während der aufeinander folgenden Zyklen von Schwangerschaft, Laktation und Abstillen auf- und wieder abgebaut. Diese Regenerations-Kapazität kann für die Organrekonstitution genutzt werden. Die Transplantation der kleinen Anzahl von Brustepithelzellen oder des Drüsenfragments in das Fettgewebe einer Empfängermaus, deren eigenes Brustepithel entfernt wurde (cleared fat pad), führt zur vollständigen Epithelregeneration. Die zyklische Entwicklung und Regenerations-Fähigkeit des Epithelgewebes lässt auf die Existenz von Stammzellen schließen, die im Verbund der Epithelzellen überdauern. Diese gewebespezifischen Stammzellen sind in der Lage sich durch asymmetrische Zellteilung zu erneuern (self-renewal) und gleichzeitig die differenzierenden Vorläuferzellen zu bilden. Die während der Pubertät und Schwangerschaft erhöhten systemischen Hormone, lokalen Wachstumsfaktoren und Zytokine kontrollieren die Stammzellen-Proliferation und die Differenzierung der Vorläuferzellen in den verschiedenen Brustepithel-Zelllinien: Myoepithel-, Luminal- und Alveolarzellen. Aufgrund der Tatsache, dass die Entstehung von Brustkrebs mit aberranten Proliferations- und Differenzierungsprogrammen in malignanten Stamm-/ Vorläuferzellen (cancer stem cells) einhergeht, ist die Identifizierung der Signalwege, die diese Prozesse regulieren, für die Stammzellen- und Krebs-Forschung sehr bedeutend. Basierend auf diesen Erkenntnissen wurden im Rahmen des vorliegenden Projektes die Methoden zur genetischen Manipulation von nicht-angereicherten Brustdrüsen-Stammzellen entwickelt. Durch effiziente lentivirale Transduktion von adhärenten Primärzellen wurden nahezu 90% der Zellen, einschließlich der Stammzellen, transduziert. Diese Optimierung erfolgte durch 1) die Anwendung von konzentrierten Lentiviren mit hoher Qualität, 2) Passagierung der Primärzellen und Entfernung von Gewebeklumpen von den VIII Primärzellkulturen, und besonders 3) durch die Reduzierung der Zelldichte während der viralen Transduktion. Für Brust-Stammzellen sind keine spezifischen Oberflächen-Marker bekannt und daher ist ihre Isolierung deutlich erschwert. Man konnte sie bis jetzt nur anhand der moderaten Expression von CD24 (hitzestabilen Antigen) und hoher Expression von CD49f oder CD29 (α6- oder β1-Integrin) ungefähr 10-fach anreichern. Allerdings haben andere Studien gezeigt, dass die Transplantation der FACS-sortierten Stammzellen zu einer Schädigung der Stammzellen und folglich zu einer Reduktion der Repopulation-Frequenz führen kann. Aus diesem Grund wurden die genetisch modifizierten Stammzellen nicht sortiert. Durch die Transplantationen der transduzierten Primärzellen wurde ihr Stammzellen-Anteil in ihrer natürlichen Nische (cleared fat pad) selektiert. Die transplantierten Stammzellen sind in der Lage duktale Auswüchse zu entwickeln. Mit dieser Strategie konnten Transplantate mit homogener Expression von Fluoreszenz-Markergenen, wie z. B. GFP, erzielt werden. FACS Analysen der Zellen, die aus Transplantaten isoliert werden, haben gezeigt, dass alle drei Brustepithelzell-Populationen, nämlich Luminal-, Basal- und Stammzellen, transduziert waren und GFP exprimierten und daher aus transduzierten Zellen hervor gingen. Die Transplantationen einer Mischung der unterschiedlich fluoreszenzmarkierten Stammzellen ergaben einzelne verzweigte Auswüchse, in denen jeweils nur ein Fluoreszenz-Markerprotein exprimiert wurde. Sie stammen sehr wahrscheinlich von einzelnen transduzierten Stammzellen ab und wachsen jeweils in einem begrenzten Bereich des Brustfettgewebes aus. Die Immun-Antwort der Empfängermäuse gegen Fluoreszenz- Markerproteine könnte das Auswachsen der Transplantate inhibieren. Brustepithelium-Rekonstitutionen waren daher in den Rag2-/-γc-/- Empfängermäusen mit geschwächtem Immunsystem besonders effiziert. Die lentivirale Manipulation von Stammzellen und deren Einsatz in Brustepithelium-Rekonstitutionen kann als alternative Methode zur gewebsspezifischen Knockout-Technik angesehen werden. Für die Etablierung dieser Methode wurde im Rahmen dieser Arbeit ein zentraler Transkriptionsfaktor in der Brustentwicklung, signal transducer and activator of transcription 5 (Stat5), untersucht. (...)
Bioaktive Sphingolipide spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation vieler entscheidender Prozesse in Endothelzellen. Speziell dem S1P wird eine Schlüsselfunktion in der Regulation der Proliferation und Migration von Endothelzellen beigemessen. Diese Prozesse sind notwendige Teilschritte in der Angiogenese, welche eine wichtige biologische und medizinische Bedeutung hat. So ist die umorangiogenese eine Voraussetzung für die adäquate Versorgung des Tumors mit Sauerstoff und Nährstoffen und trägt des Weiteren zu dessen Aggressivität bei. Ein weiteres Merkmal vieler solider Tumoren ist das Vorkommen hypoxischer Bereiche und erhöhter NO-Spiegel, die zudem, je nach Konzentration, als proangiogene Faktoren wirken können. Das Hauptziel dieser Arbeit lag in der Untersuchung des Einflusses hypoxischer Bedingungen und des Signalmoleküls NO auf das Sphingolipidgleichgewicht in der humanen Endothelzelllinie EA.hy 926. Ein spezieller Fokus wurde dabei auf die Regulation der S1P synthetisierenden Sphingosinkinasen (SK) und der daraus resultierenden Beeinflussung angiogener Zellantworten gelegt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass sowohl Hypoxie als auch NO die Aktivität der SK-1, jedoch nicht der SK-2, langanhaltend erhöhten. Dieser Aktivitätsanstieg wurde durch eine Aktivierung des SK-1-Promotors mit einer nachfolgenden verstärkten mRNA- und Proteinexpression vermittelt. Dabei war unter Hypoxie der Transkriptionsfaktor HIF-1α der entscheidende SK-1 regulierende Faktor. Zusätzlich führte die durch Hypoxie ausgelöste Hochregulation der SK-1 zu einem Anstieg der zellulären S1P-Spiegel und zu einer Reduktion der Sphingosinkonzentration. Mechanistische Untersuchungen des Effekts von NO auf die SK-1 zeigten, dass dieser unabhängig von erhöhten cGMP-Konzentrationen aufgrund einer Aktivierung der löslichen Guanylatzyklase (sGC) durch NO war. Zum einen hatte die Verwendung des cGMP-Analogons 8-Bromo-cGMP und des Aktivators der sGC YC-1 keinen Einfluss auf die SK-1-Proteinexpression, und zum anderen hatte die Kostimulation mit dem sGC-Inhibitor ODQ keinen hemmenden Effekt auf die durch NO ausgelöste Hochregulation der SK-1. Demgegenüber ist die klassische MAPK-Kaskade essenziell für die Wirkung von NO auf die SK-1, da der MEK-Inhibitor U0126 die erhöhte Proteinexpression der SK-1 verhindern konnte. Die Aktivierung des vorgeschalteten kleinen GTP-bindenden Proteins p21ras ist ein möglicher Mechanismus, über den NO die Aktivierung der MAPKKaskade verursachen könnte (Lander et al, 1995). In einem weiteren Teil der Arbeit wurde die funktionelle Konsequenz einer Regulation der SK-1 durch Hypoxie und NO in EA.hy 926 Zellen untersucht. Sowohl Hypoxie als auch NO wurden als pro-angiogene Faktoren beschrieben. Daher wurde anhand von Migrationsassays und in-vitro-Angiogeneseassays untersucht, ob die SK-1 bei diesen Zellantworten eine Rolle spielt. Die Depletion der SK-1 durch die Verwendung einer spezifischen siRNA oder mit Hilfe von lentiviralen shRNA-Konstrukten zeigte, dass die Hochregulation der SK-1 unter Hypoxie und NO essenziell für die erhöhte Migration der Endothelzellen ist. Zusammenfassend zeigen die Daten, dass hypoxische Bedingungen und NO zu einer Hochregulation der SK-1 in EA.hy 926 Zellen führten und eine erhöhte Migrationsrate dieser Zellen zur Folge hatten. Somit ist die SK-1 ein interessanter therapeutischer Ansatzpunkt zur Behandlung von Krankheiten, die mit einer pathologischen Angiogenese einhergehen, wie es im Tumorgeschehen der Fall ist.
Die Chloroplastenbewegung ist eine der wichtigsten Anpassungen, die Pflanzen entwickelt haben, um eine effiziente Ausbeute an Lichtquanten für die Photosynthese zu gewährleisten. Auch wenn der genaue Mechanismus und die Signalwege, die diesen Prozess vermitteln, noch nicht vollständig verstanden sind, konnten einige an der Chloroplastenbewegung beteiligte Proteine (phot1, phot2, chup1, Aktin, Profilin) in den letzten Jahren identifiziert werden. Chup1, das an der äußeren Chloroplastenmembran verankerte Protein, wird als putativer Linker zwischen den Chloroplasten und dem Aktin-Zytoskelett gesehen. Durch die Interaktion mit Profilaktin reguliert chup1 die Aktin-Polymerisierung und somit auch die Chloroplastenbewegung. Die Analyse der intra- und intermolekularen Interaktionen von chup1, die in dieser Studie ermittelt wurden, deutet auf eine Homodimerisierung von chup1 durch die Coiled coil Domäne sowie auf eine Assoziation des N- mit dem C-terminalen Leuzin- Zipper hin. Neben diesen Interaktionen konnte für einen der vier putativen Interaktionspartner von chup1, der wall associated kinase 3, eine mögliche Funktion bei der Vermeidungsbewegung der Chloroplasten gezeigt werden. In Anbetracht dieser Interaktion und der postulierten Phosphorylierungsstellen in chup1, könnte eine Regulierung von chup1 durch Phosphorylierung erfolgen. Um die Funktionen von chup1 und phot2 besser zu verstehen, wurden die Pflanzen mit knock-out in diesen Gene genauer charakterisiert und die T-DNA Insertionslinien von chup1 und phot2 zeigen keine Reduzierung in der photosynthetischen Aktivität. Im Gegensatz dazu, bedingt der knock out von beiden Genen eine deutliche Verminderung der photosynthetischen Leistung. Infolge der fehlenden Chloroplastenbewegung im chup1phot2 Doppel knock out führt das möglicherweise zu einem verringerten Schutz der Photosynthese. Dies bestätigt weiter die Verbindung zwischen der durch phot2 induzierten Signalkaskade und der Aktin-Polymerisierung, die durch chup1 reguliert wird. Um den Einfluss von chup1, phot1 und phot2 auf die transkriptionelle Regulierung nach BL zu analysieren, wurde das globale Expressionsmuster nach BL-Behandlung untersucht. Bei der Analyse der Mutanten-Pflanzen mit einem Defekt in der Chloroplastenbewegung (chup1, phot1, phot2) konnte keine Beeinflussung der Regulierung der Genexpression in BL-gesteuerten Signalkaskaden durch diese Proteine beobachtet werden. Die Regulierung der Expression geschieht eher auf posttranskriptioneller Ebene und wird mit Hilfe von microRNA gesteuert.
In dieser Arbeit sollte der Einfluss von Trockenstress auf die Photosyntheserate von einer repräsentativen C3-Art und dreier repräsentativer Arten unterschiedlicher C4-Subtypen vergleichend untersucht werden, wobei die drei Subtypen der C4-Photosynthese im Vordergrund standen. Anhand der ausgewählten Arten der Modell-Gattung Panicum (s.l.), P. bisulcatum (C3), P. bulbosum (NADP-ME), P. miliaceum (NAD-ME) und P. maximum (PCK), konnten die unterschiedlichen Stoffwechseltypen, an phylogenetisch nah verwandten Arten, auf Unterschiede in der physiologischen Antwort auf den abiotischen Stressfaktor Trockenheit untersucht werden. Hierfür wurden zwei verschiedene Arten der Trockenstressinduktion durchgeführt. Ein Vergleich der Arten in Hinblick auf Unterschiede in der Trockentoleranz erfolgte anhand von Hydrokulturversuchen mit PEG6000 als Osmotikum. In diesem Fall wurde der jeweilige Stress sehr schnell induziert und über die Dauer von 6 Tagen in unterschiedlichen Intensitäten konstant gehalten. Anhand der durchgeführten Gaswechselmessungen und Bestimmungen der Chlorophyllfluoreszenzparameter konnte eindeutig die C3-Art P. bisulcatum als die am sensitivsten auf Trockenstress reagierende Art identifiziert werden. Die drei C4-Arten lagen in ihrer physiologischen Antwort auf die unterschiedlichen Trockenstressintensitäten verhältnismäßig nah zusammen. Bei schwächerem osmotischen Stress zeigte aber P. miliaceum, der Vertreter des NAD-ME Subtyps, eindeutig die geringste Beeinflussung der untersuchten Photosyntheseparameter, was im Wesentlichen auch bei stärkerem osmotischen Stress bestätigt wurde. Zudem zeigte P. miliaceum bei 1400 ppm CO2 im Messgas im Vergleich zu den anderen getesteten Arten eine signifikant höhere Wassernutzungseffizienz, was die bessere Anpassung des NAD-ME Subtypen an osmotischen Stress unterstreicht. Bei dem Trockenstressexperiment in Erde stand die physiologische Maximalantwort auf den natürlicheren, verhältnismäßig langsam induzierten, aber letztendlich starken Trockenstress im Vordergrund. Hier wurde für jede Art untersucht, welche limitierenden Faktoren unter Trockenstress auf die Photosyntheserate wirken. Dafür wurde neben Gaswechsel- und Chlorophyllfluoreszenzmessungen mit der Bestimmung der In-vitro-Aktivitäten der Enzyme des C4-Zyklus, der Bestimmung der PEPC und RubisCO-Gehalte anhand von SDS-PAGE und Western-Blot-Analysen, und der Bestimmung des Deepoxidationsgrades des Xanthophyllzykluses ausgewählte Teilreaktionen der C4-Photosynthese genauer untersucht. Bei allen untersuchten C4- Arten konnte bei dem starken Trockenstress eine eindeutige nicht-stomatäre Limitierung der Photosyntheserate festgestellt werden. Bei der C3-Art P. bisulcatum sprechen die Ergebnisse für eine Mischung aus stomatären und nicht-stomatären Faktoren, die die Photosynthese unter Trockenstress limitieren. Hier konnte eine Abnahme des RubisCO-Gehalts unter Trockenstress beobachtet werden, was ein möglicher Faktor für eine nicht-stomatäre Limitierung der Photosyntheserate unter Trockenstress sein kann. Aufgrund der im Mittel reduzierten In-vitro-Aktivitäten der Enzyme des NADP-ME C4-Zyklus (PPDK, PEPC, NADP-MDH und NADP-ME) und einer Abnahme des PEPC- und RubisCOGehalts bei trockengestressten P. bulbosum im Vergleich zu der entsprechenden Kontrolle, konnte bei dem Vertreter des NADP-ME Subtyps die nicht-stomatäre Limitierung der Photosyntheserate auf eine generelle Abnahme der an der C4-Photosynthese beteiligten Enzyme zurückgeführt werden. Anhand der Bestimmung der In-vitro-Aktivitäten von P. maximum konnte gezeigt werden, dass die als Nebenweg beschriebene Decarboxylierung des CO2 über das NAD-ME in den BSZ, wahrscheinlich im gleichen Maße abläuft wie der von KANAI und EDWARDS (1999) beschriebene Hauptweg (Decarboxylierung in den BSZ durch die PCK). Die beobachtete nicht-stomatäre Limitierung der Photosyntheserate unter Trockenstress wurde auf eine mögliche Abnahme der In-vitro-Aktivitäten des sogenannten Nebenweges zurückgeführt. Bei P. miliaceum, dem repräsentativen Vertreter des NAD-ME Subtyps, zeigte keines der C4-Enzyme eine Abnahme der In-vitro-Aktivität, noch konnte eine Abnahme des RubisCO Gehalts unter Trockenstress im Vergleich zur Kontrolle beobachtet werden. Diese Beobachtung deutete auf eine In-Situ-Inhibierung eines der C4-Enzyme hin. Aus diesem Grund wurden in dieser Arbeit bei P. miliaceum weiterführende Untersuchungen zur posttranslationalen Regulation der PEPC durchgeführt. Obwohl die PEPC unter Trockenstress in phosphorylierter und somit aktiver Form vorliegt, konnte gezeigt werden, dass bei trockengestressten P. miliaceum eine In-Situ-Inhibition der PEPC aufgrund einer Feedback-Inhibition durch das unter Trockenstress in den MZ akkumulierende Transportmetabolit Aspartat wahrscheinlich ist und somit die Photosyntheserate limitieren kann.
Die allogene Stammzelltransplantation (SZT) nach Hochdosischemotherapie ist oft die einzige Therapieoption für pädiatrische Patienten, die an einer Hochrisikoleukämie erkrankt sind. Bei Patienten mit einer sehr schlechten Prognose und ohne Aussicht auf einen passenden Spender werden auch haploidente SZT durchgeführt, bei der meist die Eltern als Spender dienen. Aufgrund der HLA-(Human Leukocyte Antigen) Inkompatibilität zwischen Spender und Empfänger birgt die haploidente SZT jedoch einerseits das hohe Risiko einer Abstoßung des Transplantats sowie andererseits die Gefahr einer lebensbedrohlichen Spender-gegen-Wirt Reaktion (Graft-versus-Host Disease, GvHD). Das Risiko für die Entstehung einer GvHD kann durch die selektive Anreicherung von CD34 positiven Stammzellen deutlich verringert werden. Dabei werden unter anderem immunkompetente T-Zellen entfernt, die maßgeblich an der Entstehung einer GvHD beteiligt sind. Diese Zellen spielen aber auch bei der Immunrekonstitution und der Reaktivität gegen residuale leukämische Blasten (Graft-versus-Leukemia (GvL) Effekt) nach SZT eine wichtige Rolle. Aufgrund dessen ist die SZT mit CD34-selektionierten Präparaten häufig mit schweren Infektionen und einer erhöhten Rezidivrate verbunden. Des Weiteren wächst das Transplantat deutlich schlechter an. Immuntherapeutische Ansätze mit Spenderlymphozyten-Infusionen (Donor Lymphocyte Infusion - DLI) können das Anwachsen des Transplantates und den GvL-Effekt fördern, steigern jedoch gleichzeitig das Risiko einer GvHD. Um die Entstehung einer GvHD zu kontrollieren, ohne dabei auf den Nutzen einer DLI verzichten zu müssen, wurde bereits vor über 10 Jahren ein aussichtsreicher Ansatz entwickelt. Hierbei werden Spender-T-Zellen vor der Infusion in den Patienten genetisch so modifiziert, dass sie ein Selbstmordgen („suicide gene“) exprimieren. Im Falle einer aufkeimenden GvHD ermöglicht die Aktivierung des Suizidmechanismus eine gezielte Eliminierung der alloreaktiven Spender-T-Zellen. Das zurzeit am häufigsten verwendete Selbstmordgen leitet sich von der Thymidinkinase (TK) des Herpes Simplex Virus (HSV) ab. In einer Reihe von klinischen Studien mit erwachsenen Patienten konnte nach allogener SZT die prinzipielle Wirksamkeit dieses Sicherheitskonzeptes bereits gezeigt werden. Im Verlauf der klinischen Anwendung wurde allerdings eine Reihe von Nachteilen festgestellt. So führte zum Beispiel die Immunogenität der HSV-TK in immunkompetenten Patienten zur Abstoßung der modifizierten T-Zellen. Des Weiteren zeigte sich eine mangelnde Effizienz hinsichtlich des Abtötens der T-Zellen. Außerdem ist die für die T-Zell-Eliminierung benötigte Menge an Ganciclovir (10 mg/kg Körpergewicht pro Tag) stammzelltoxisch, wodurch die Immunrekonstitution nach SZT deutlich vermindert sein kann. Ferner wurde beobachtet, dass die ex vivo modifizierten und expandierten T-Zellen in ihrer biologischen Funktionalität deutlich eingeschränkt waren. Um den immuntherapeutischen Ansatz der DLI vor allem hinsichtlich der Sicherheit weiter zu verbessern, wurden in den vergangenen Jahren verschiedene Suizidstrategien entwickelt und die Bedingungen der ex vivo Modifikation optimiert. Eine aussichtsreiche Suizidstrategie verwendet das B-Zell-Oberflächenantigen CD20 in Kombination mit einem bereits für die Klinik zugelassenen, monoklonalen anti-CD20 Antikörper (Rituximab). Im Gegensatz zu TK-modifizierten Zellen, deren Beseitigung in vivo mehrere Tage in Anspruch nimmt, können CD20 positive B-Zellen innerhalb weniger Stunden eliminiert werden. Der tatsächliche Wirkmechanismus von Rituximab in vivo ist bisher noch nicht vollständig aufgeklärt, allerdings konnte in vitro bereits gezeigt werden, dass die Eliminierung CD20 positiver Zellen mittels eines komplement-abhängigen (CDC) und/oder eines antikörperabhängigen Zelltodes (ADCC) erfolgt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung und Optimierung eines CD20-abhängigen Suizid-Vektorsystems für die effiziente Transduktion von primären T-Zellen und deren selektive Eliminierung mittels Rituximab. Dazu mussten verschiedene Teilziele erreicht werden: (1) Da nur genetisch modifizierte T-Zellen, die in vivo abgeschaltet werden können, infundiert werden dürfen, ist eine ex vivo Anreicherung der CD20 positiven Zellen zwingend erforderlich. Dementsprechend sollte untersucht werden, inwieweit sich CD20 als Oberflächenmarker für eine MACS- (Magnetic Associated Cell Sorting) basierte Aufreinigung eignet und gegebenenfalls alternative Ansätze geprüft werden. (2) Weiterführend sollte ein Transduktionsprotokoll etabliert werden, welches hohe Transduktionseffizienzen ermöglicht und die Funktionalität der genetisch modifizierten T-Zellen weitestgehend erhält. (3) Bezüglich der Wirksamkeit des CD20-Rituximab-Systems liegen bisher nur veröffentlichte in vitro Daten vor. Daher sollte die Effektivität des neu entwickelten Suizidsystems in einem GvHD-ähnlichen Mausmodell in vivo charakterisiert werden. Zu Beginn dieser Arbeit wurde ein gammaretroviraler Vektor verwendet, welcher die Wildtypsequenz des CD20 Gens unter der Kontrolle eines vom Myeloproliferativen Sarcoma Virus (MPSV) abgeleiteten LTR (long terminal repeat) exprimiert (M71CD20). Mit diesem Vektor konnten mit Hilfe einer 3-Plasmid-Transfektion von 293T-Zellen lediglich Virusüberstände mit einem sehr niedrigen Titer hergestellt werden (<1 x 105/ml). Demzufolge war es zwar möglich die humane T-Zelllinie HuT 78 durch eine RetroNectin-assistierte Transduktion genetisch zu modifizieren, primäre T-Zellen hingegen konnten gar nicht transduziert werden. Aufgrund der schwachen Expression von CD20 an der Zelloberfläche zeigten die transduzierten HuT 78 Zellen nur eine geringe Empfindlichkeit gegenüber der Rituximab-vermittelten Lyse. Unter Verwendung von humanem Serum als Komplementquelle konnte eine maximale Lyse von 20% erreicht werden. Zusätzlich war die immunomagnetische Aufreinigung der CD20 positiven Zellen mit Hilfe des anti-CD20 MACS Systems durch eine geringe Ausbeute (<1%) und einen niedrigen Reinheitsgrad (<90%) geprägt. Um die Suizidgenstrategie für eine potentielle klinische Anwendung weiterzuentwickeln, wurde eine Codon-Optimierung des CD20 Transgens vorgenommen (CD20op). Die Optimierung zielte darauf ab, selten verwendete Basentripletts (Codons) innerhalb der CD20 cDNA mit von Säugetierzellen häufig genutzten zu ersetzen und somit die Translationsrate zu steigern. Ferner wurde der GC-Gehalt auf 60% erhöht und einige RNA-Instabilitätsmotive entfernt, um die Stabilität der mRNA zu verbessern. Aufgrund dieser Optimierungen wurde ein 35-facher Anstieg des Virustiters beobachtet. Dies ermöglichte die Transduktion von HuT 78 Zellen mittels einer standardmäßig durchgeführten Zentrifugationsmethode. Durchflusszytometrische Analysen zeigten, dass die Oberflächenexpression der Codon-optimierten CD20 Variante im Vergleich zur Wildtypsequenz um ein Dreifaches gesteigert werden konnte. Die verbesserte Oberflächenexpression erhöhte die Rituximab-vermittelte Lyse deutlich. In vitro konnten so bis zu 80% der transduzierten HuT 78 Zellen eliminiert werden. Die geringe Ausbeute der immunomagnetischen anti-CD20-Selektion konnte allerdings nicht verbessert werden. Weiterführend wurde daher im Rahmen dieser Arbeit der CD20op Vektor mit einem zweiten Oberflächenmarker kombiniert, um eine effiziente Anreicherung der genetisch modifizierten Zellen zu gewährleisten. Da im klinischen Maßstab bereits ein System zur Aufreinigung von Stammzellen über den Oberflächenmarker CD34 etabliert ist, wurde eine C-terminal verkürzte Variante des CD34 Moleküls (tCD34) als Selektionsmarker gewählt. Für eine optimale Koexpression von CD20op und tCD34 wurde eine Fusionskassette unter Verwendung des 2A-Elementes des Thosea asigna Virus generiert (T2A). Dieses Element ermöglicht die effiziente Expression beider Transgene von einem Vektor. Im Verlauf der Translation kommt es innerhalb des T2A-Elementes zu einem ribosomalen Sprung und folglich zur Generierung von zwei voneinander unabhängigen Proteinen. Mit dem neu klonierten bicistronischen Vektor M71CD20opT2AtCD34 konnten gute Virustiter im Bereich von 2,3 ± 0,9 x 106/ml erzielt werden. Dies ermöglichte die Transduktion von HuT 78 Zellen durch Zentrifugation. Mittels Durchflusszytometrie und protein-biochemischer Methoden konnte gezeigt werden, dass CD20op und tCD34 korrekt in der Zelllinie exprimiert wurden. Die Anreicherung von CD20op/tCD34 positiven HuT 78 Zellen mit Hilfe immunomagnetischer anti-CD34-Selektion resultierte in einer deutlich verbesserten Ausbeute; ebenso konnte eine Reinheit von über 98% erreicht werden. In vergleichenden Analysen wurde gezeigt, dass die CD20op/tCD34 transduzierten Zellen eine ähnliche Sensitivität gegenüber Rituximab aufwiesen wie Zellen, die mit dem monocistronischen M71CD20op Vektor transduziert wurden. Nachdem die Effizienz des bicistronischen Vektors in der humanen T-Zelllinie HuT 78 nachgewiesen werden konnte, wurden weiterführende Versuche mit humanen primären T-Zellen initiiert. Für die genetische Modifikation von primären T-Zellen mit gammaretroviralen Vektoren ist die Aktivierung und eine damit einhergehende Proliferation der T-Zellen zwingend erforderlich. Deswegen wurden zunächst die Aktivierungs- und Kulturbedingungen für eine optimale Transduktion der T-Zellen bestimmt. In dieser Arbeit wurden die T-Zellen ausschließlich mit anti-CD3/anti-CD28 Antikörpern stimuliert, die auf paramagnetischen Partikeln immobilisiert wurden und dadurch eine dreidimensionale Aktivierung ermöglichten. Diese Art der Stimulation wird bereits in klinischen Studien verwendet und sollte im Gegensatz zu löslichen Antikörpern die biologische Funktionalität der T-Zellen weitestgehend erhalten. Primäre T-Zellen wurden mittels RetroNectin-beschichteter Platten an zwei aufeinander folgenden Tagen transduziert, dabei konnte eine durchschnittliche Transduktionseffizienz von 65% erzielt werden. Die korrekte Expression von CD20op und tCD34 konnte, wie bereits für HuT 78 Zellen beschrieben, ebenfalls in primären T-Zellen nachgewiesen werden. Mittels immunomagnetischer anti-CD34 Selektion von CD20op/tCD34 positiven primären T-Zellen wurde eine sehr gute Anreicherung mit 98%iger Reinheit und einer Ausbeute von 45% erreicht. Unter Verwendung von humanen natürlichen Killerzellen konnte eine Sensitivität der genetisch modifizierten Zellen gegenüber Rituximab-vermittelter zellulärer Toxizität (ADCC) nachgewiesen werden. Da die Funktionalität der T-Zellen aufgrund der benötigten Aktivierung und der Expansion ex vivo beeinträchtigt sein kann, wurden im Rahmen dieser Doktorarbeit die T-Zellen phänotypisch und funktionell genauer charakterisiert. Es konnte durchflusszytometrisch gezeigt werden, dass die Mehrheit der naiven T-Zellen aufgrund der anti-CD3/anti-CD28 Aktivierung einen „central memory“ Phänotyp erworben hatte, welcher durch die Expression des „Homing“-Oberflächenmarkers CD62L (L-Selectin) und den Verlust des Markers CD45RA gekennzeichnet war. Es ist bekannt, dass dieser T-Zell-Phänotyp ein hohes alloreaktives Potential sowie eine lange Lebensdauer in vivo aufweist. Da für eine effektive Immunantwort CD4 positive Helferzellen und CD8 positive zytotoxische T-Zellen essentiell sind, wurde im Rahmen dieser Arbeit die Transduktionseffizienz in beiden Subpopulationen bestimmt. CD4 positive und CD8 positive T-Zellen ließen sich gleichermaßen gut transduzieren und es konnte demonstriert werden, dass ein physiologisches CD4/CD8 Verhältnis von 1-2 erhalten blieb. Im Vergleich dazu wurde in veröffentlichten Studien häufig eine verstärkte Transduktion von CD8 positiven T-Zellen verzeichnet, was zu einer Verschiebung des CD4/CD8 Verhältnisses und somit zu einer beeinträchtigten Immunantwort führte. Des Weiteren wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit in vergleichenden Analysen das alloreaktive Potential der genetisch modifizierten Zellen bestimmt. Zur Charakterisierung der Alloreaktivität wurde eine „Mixed Lymphocyte Reaction“ (MLR) verwendet. Hierfür wurden die T-Zellen mit CFSE (Carboxy-Fluorescein Succinimidyl Ester) gefärbt und mit bestrahlten, allogenen mononukleären Zellen aus peripherem Blut (PBMCs) kultiviert. Das Maß der Alloreaktivität ließ sich durch die Verringerung des CFSE Signals bestimmen. In einer Reihe von Experimenten konnte gezeigt werden, dass der prozentuale Anteil an alloreaktiven, transduzierten T-Zellen vergleichbar zu frisch isolierten T-Zellen war. Auch wenn ein geringeres Proliferationspotential der genetisch modifizierten T-Zellen festgestellt wurde, deutet dieses Ergebnis dennoch auf einen teilweisen Erhalt der T-Zell-Funktionalität hin. Im letzten Drittel der vorliegenden Arbeit wurde neben der Langzeitexpression von CD20op und tCD34 ebenfalls die Effizienz des CD20op-Rituximab-Systems in vivo untersucht. Hierfür wurde ein Rag-1 defizientes Mausmodell verwendet. Aufgrund der vorliegenden Lymphopenie ermöglichte dieses Modell ein gutes Anwachsen der Spenderlymphozyten. Reife murine T-Zellen wurden an zwei aufeinander folgenden Tagen mit dem gammaretroviralen Vektor M71CD20opT2AtCD34 transduziert und vor der Transplantation mittels immunomagnetischer anti-CD34 Selektion angereichert (Reinheit: 98%). Fünf Wochen nach Transplantation wurde ein Teil der Mäuse mit 150 μg Rituximab pro Maus i.v. behandelt, als Negativkontrolle wurde Mäusen ein monoklonaler anti-HER2/neu Antikörper (Herceptin) gespritzt, der in diesem Zusammenhang nicht relevant war. Das Behandlungsschema wurde in zwei darauf folgenden Wochen wiederholt. Jeweils zwei Tage nach der Antikörperinjektion wurde der Anteil an transduzierten Spenderzellen im peripheren Blut durchflusszytometrisch bestimmt. Bereits nach der ersten Rituximab-Injektion konnte eine 95%ige Depletion der genetisch modifizierten T-Zellen gezeigt werden. Die beiden nachfolgenden Injektionen beeinflussten den Anteil der modifizierten T-Zellen im peripheren Blut nur noch geringfügig. In Herceptin behandelten Mäusen blieb der Anteil an genetisch modifizierten Zellen konstant. Am Ende der Untersuchungen (Woche 17) wurde in Rituximab behandelten Mäusen nur noch ein minimaler Prozentsatz an modifizierten Zellen nachgewiesen, welche durch eine geringe Oberflächenexpression von CD20op und tCD34 charakterisiert waren. Abschließend konnte die effektive Eliminierung der T-Zellen aus der Milz und den Lymphknoten sowohl durchflusszytometrisch als auch per quantitativer PCR nachgewiesen werden. Die erfolgreiche Depletion der T-Zellen wurde im weiteren Verlauf der Arbeit durch eine Zeitkinetik nach Rituximab Gabe genauer untersucht. Bereits zwei Stunden nach der Injektion des Antikörpers konnte im peripheren Blut nur noch ein kleiner Anteil an genetisch modifizierten Zellen nachgewiesen werden. Dieses Ergebnis entspricht Daten aus klinischen Studien mit Rituximab und verdeutlicht das Sicherheitspotential des CD20-Rituximab-Systems, geprägt durch eine schnelle und effiziente Eliminierung von reaktiven T-Zellen. Der adaptive Transfer von Spender T-Zellen führte in den Empfängertieren zur Entwicklung einer massiven Kolitis, die durch Gewichtsabnahme und Durchfall charakterisiert war. In dieser Arbeit konnte dies durch die Rituximab-vermittelte Eliminierung der reaktiven Zellen verhindert werden; Rituximab behandelte Mäuse zeigten keine Kolitissymptome, wohingegen Herceptin behandelte Tiere stetig an Gewicht verloren. Diese Gewichtsabnahme konnte zu einem späteren Zeitpunkt auch in der Herceptin Gruppe nach Behandlung mit Rituximab gestoppt werden. Außerdem wurde daraufhin in diesen Tieren eine schnelle Gewichtszunahme von bis 34% beobachtet. Die erfolgreiche Depletion der CD20op/tCD34 positiven T-Zellen stellte in den Rag-1 defizienten Empfängertieren vorübergehend erneut eine Lymphopenie her. Dabei kam es aber auch zur Expansion nichttransduzierter T-Zellen, welche mit einem Anteil von 2% im CD34-selektionierten T-Zell-Transplantat vertreten waren. Da diese T-Zellen nicht durch Rituximab eliminiert werden konnten, entwickelten die Empfängertiere unweigerlich Kolitissymptome. Mittels quantitativer PCR wurde anschließend nachgewiesen, dass es sich bei den in vivo expandierten Zellen zum Großteil um nicht-transduzierte T-Zellen handelte, da keine proviralen Integrationen nachgewiesen werden konnten. Das in dieser Arbeit verwendete Mausmodell lieferte wichtige Informationen hinsichtlich der Langzeitexpression der beiden Transgene sowie der Effizienz des CD20-Rituximab-Suizidsystems. Auch wenn die in dem verwendeten Modell induzierte Kolitis als Äquivalent einer GvHD angesehen werden kann, sollte die Effizienz des entwickelten Systems in einem klassischen bzw. haploidenten GvHD Modell verifiziert werden. Darauf aufbauend könnten dann prä-klinische Studien zur Effektivität und Sicherheit des optimierten Suizidansatzes initiiert werden. Zusammenfassend bietet das neue, in dieser Arbeit stufenweise optimierte CD20-Rituximab-System eine vielversprechende Alternative zu dem HSV-TK System. Im Hinblick auf die derzeitigen Entwicklungen bezüglich der Funktionalität der genetisch modifizierten Zellen und der schnellen Beseitigung durch Rituximab wäre die Weiterentwicklung des CD20op/tCD34 Ansatzes zur effektiven Kontrolle einer GvHD nach DLI im Rahmen einer allogenen Stammzelltransplantation wünschenswert.
Die Gattung Palaua gehört zur Tribus der Malveae (Malvaceae, Malvoideae). Sie umfasst fünfzehn einjährige oder ausdauernde krautige Arten, die für die Nebeloasen („Lomas“, „Desierto Florido“) der Küstenwüste Perus und Chiles endemisch sind. Abweichend von den meisten anderen Gattungen der Malveae besitzt Palaua (mit Ausnahme von P. sandemanii) unregelmäßig übereinander angeordnete Merikapien. Dieses Merkmal ist ansonsten nur von den beiden altweltlichen Gattungen Kitaibela und Malope bekannt, weshalb diese früher mit Palaua in der Tribus Malopeae vereint wurden. Palynologische, cytogenetische und molekulare Analysen zeigten jedoch, dass die Malopeae eine polyphyletische Gruppe bilden und dass die in Südamerika verbreiteten Gattungen Fuertesimalva und Urocarpidium die nächsten Verwandten von Palaua sind. Ebenso wie im Aufbau des Gynözeums unterscheidet sich Palaua auch durch das Fehlen eines Epicalyx vom Großteil der Malveae, einschließlich ihrer Schwestertaxa. Seit der Erstbeschreibung der Gattung durch Cavanilles im Jahr 1785 sind nur zwei detaillierte Bearbeitungen der Gattung Palaua veröffentlicht worden. Die umfassendste davon stammt von Ulbrich (1909). Auf der Grundlage der umfangreichen Aufsammlungen von August Weberbauer beschrieb er mehrere neue Arten in seinem Werk „Malvaceae austro-americanae imprimis andinae“, das er in nachfolgenden Jahren (1916, 1932) vervollständigte. Die zweite bedeutsame Bearbeitung ist die Revision der Gattung durch Macbride (1956) in der „Flora of Peru“. Seit den 50er Jahren des vorherigen Jahrhunderts kamen jedoch zahlreiche Aufsammlungen hinzu, insbesondere durch den peruanischen Botaniker Ramón A. Ferreyra (1912-2005), sowie durch Ernesto Günther (1870-?) zusammen mit Otto Buchtien (1859-1946), Gerd K. Müller (1929-) und Michael O. Dillon (1947-), so dass eine Neubearbeitung von Palaua erforderlich wurde. Darin bestand das Hauptziel der hier vorgestellten Dissertation. Für die Revision der Gattung wurden 618 Herbarbelege der wichtigsten Herbarien morphologisch untersucht. In den Jahren 2002 und 2003 wurden während mehrmonatiger Geländearbeiten in den Lomas-Standorten Perus und Chiles eigene botanische Aufsammlungen durchgeführt sowie Daten zur Verbreitung der Arten und ihrer Ökologie erfasst. Des Weiteren wurde aus dem mitgebrachten Samenmaterial eine mehrere Arten einschließende Lebendsammlung angelegt, mit deren Hilfe detaillierte Untersuchungen zur Blütenmorphologie und Karyologie realisiert werden konnten. Besonders schwierig gestaltete sich die Bearbeitung nomenklatorischer Fragestellungen, da viele der in Berlin (B) aufbewahrten Typusbelege von Weberbauer im Zweiten Weltkrieg zerstört wurden und somit eine Identifizierung vieler Arten problematisch war. Auch die Ermittlung des Typusbelegs der Gattung, den Cavanilles für seine Beschreibung vorliegen hatte, war mühsam. Neben dem Studium der Originalbelege und Protologe mussten auch die historischen Begebenheiten rekonstruiert und Reiseberichte zu den Aufsammlungen durchgesehen werden, um unter anderem den Holotypus der Gattung identifizieren zu können. Die eigenen taxonomischen Studien führten zur Festlegung von insgesamt 8 Lectotypen, 3 Epitypen and 2 Ikonotypen. Im Rahmen der morphologischen Untersuchungen wurden sämtliche taxonomisch relevanten Merkmale detailliert erfasst, einschließlich der verschiedenen Behaarungstypen. Neben den für die Malvaceen bekannten Sternhaaren, sind hier auch Drüsenhaare für Palaua beschrieben und charakterisiert worden. Die anatomischen Studien konzentrierten sich auf Blatt- und Samenmerkmale. Zusätzlich zu den morphologisch-anatomischen Studien wurden molekularsystematische Analysen durchgeführt. Zwei Methoden kamen dabei zur Anwendung: DNA-Sequenzierung und Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP). Letztere wurde eingesetzt, um insbesondere die Verwandtschaftsverhältnisse junger Taxa, die sich mit DNA-Sequenzdaten kaum auflösen lassen, zu rekonstruieren. In umfangreichen Versuchen stellte sich jedoch heraus, dass diese Methode keine reproduzierbaren Ergebnisse hervorbrachte, vermutlich bedingt durch den sehr hohen Polysaccharidgehalt der DNA-Template, wie es von Malvaceen her bekannt ist. Selbst die Erprobung zahlreicher Reinigungsschritte und –methoden ergab kein zufriedenstellendes Resultat. Für die phylogenetische Rekonstruktion wurden daher ausschließlich DNA-Daten verwendet, und zwar Kern-DNA (Internal Transcribed Spacer, ITS) und Plastiden-DNA (psbAtrnH Intergenic Spacer). Andere getestete Marker, wie z.B. die trnL-F-Region, wiesen zu wenig phylogenetisch informative Merkmale auf. Die morphologischen Analysen ergaben, dass Merkmale wie die Behaarung der Kelch- und Laubblätter, die Blattform und die Größe der Blüten besonders hilfreich für die Abgrenzung der Arten sind. Im Gegensatz zu anderen nah verwandten Gattungen ist die Form der Merikarpien in Palaua relativ uniform und daher als diakritisches Merkmal ungeeignet. Die Größe der Blüte nimmt in der Regel mit der Anzahl der Staubgefäße und Merikarpien zu. Die Palaua-Arten zeigen einige Anpassungen an ihren extrem trockenen Lebensraum. Die meisten Arten sind Annuelle und vollziehen eine rasche Entwicklung während der kurzen Zeit, in der ausreichend Feuchtigkeit verfügbar ist. Bei solchen Pflanzen findet man als Anpassung häufig eine Tendenz zur vermehrten Samenproduktion. In diesem Zusammenhang ließe sich auch die innerhalb des Verwandtschaftskreises ungewöhnliche Stellung der Merikarpien bei Palaua interpretieren, mit der es den Arten gelingt, mehr Samen als bei Arten mit einreihiger Merikarpienanordnung zu produzieren. Als weitere Anpassung findet man bei den ausdauernden Arten größtenteils eine sehr dichte Behaarung, wobei die Sternhaare mehrjähriger Arten wesentlich mehr Strahlen besitzen als die bei den einjährigen Arten. In der hier vorgestellten Revision der Gattung werden 15 Arten anerkannt: P. camanensis, P. dissecta, P. guentheri, P. inconspicua, P. malvifolia, P. modesta, P. mollendoensis, P. moschata, P. rhombifolia, P. sandemanii, P. tomentosa, P. trisepala, P. velutina, P. weberbaueri sowie die neu zu beschreibende P. spec. nov. Die morphologisch abweichende P. sandemanii wird aufgrund der molekularen Analysen ebenfalls zu Palaua gestellt. Die auch in der jüngeren Literatur meist als getrennte Arten aufgefassten P. concinna und P. moschata lassen sich nach Durchsicht des umfangreichen Materials nicht mehr als eigenständige Arten aufrechterhalten. Die vormals als chilenischer Endemit behandelte P. concinna wird hier in die Synonymie von P. moschata gestellt. Auch die peruanische P. micrantha var. hirsuta wurde in die Synonymie der zuvor rein chilenischen P. modesta verwiesen, was bedeutet, dass sich das Vorkommen von P. modesta nun auch auf Peru ausdehnt. Auf infraspezifischem Niveau wurden einige Varietäten und eine Form neu beschrieben, um die im Sammlungsmaterial vorhandene morphologische Variabilität besser zu gliedern. Das ist der Fall bei P. dissecta (2 Varietäten), P. tomentosa (1 Varietät), P. weberbaueri (1 Varietät) und P. mollendoensis (1 Form). Die neuen Taxa werden an anderer Stelle gültig publiziert. Die von Baker (1890) and Ulbrich (1909) gewählte infragenerische Klassifikation mit der Einteilung in die Sektionen Annuae (einjährige Arten) und Perennes (mehrjährige Arten) erweist sich als nicht haltbar. Weder die morphologischen noch die molekularen Daten bieten hierfür Unterstützung. Auch die von Hochreutiner (1956) vorgeschlagene Ausgliederung von P. trisepala als eigene Untergattung Rauhia, aufgrund des Vorkommens von lediglich drei statt fünf Kelchblättern, erscheint nicht sinnvoll. Abgesehen von ihrer reduzierten Kelchblattzahl (3 statt 5 Kelchblätter) ist diese Art morphologisch P. moschata und P. velutina sehr ähnlich. Die Aufstellung einer eigenen Untergattung würde die tatsächlichen Verwandtschaftsverhältnisse verwischen und vermutlich eine paraphyletische Einheit schaffen. Im Vergleich zur Anzahl der Kelchblätter sind Merkmale wie der Aufbau der Infloreszenzen, die Blütengröße und -farbe, sowie die Blattmorphologie (geteilte vs. ungeteilte Blätter) nützlicher für eine infragenerische Unterteilung. Die Form der Stipeln, die von Ulbrich (1909) für eine weitere Unterteilung seiner Sektionen verwendet wurde, ist weniger für eine infragenerische Gliederung als für die Abgrenzung mancher Arten geeignet. Formell wurde in der hiesigen Arbeit auf eine infragenerische Unterteilung verzichtet, da zunächst abgewartet werden soll, ob weiterführende molekularsystematische Untersuchungen nicht doch zu einer besseren Auflösung und auch Unterstützung der basalen Knoten der Palaua-Phylogenie führen. Andernfalls steht zu befürchten, dass wiederum künstliche Sippen geschaffen werden. Nichtsdestotrotz, sprechen die eigenen morphologischen und zum Teil auch die molekularen Daten für eine Gliederung der Gattung in drei taxonomische Einheiten (siehe unten). Die Ergebnisse der molekularen Analysen (kombinierte Analyse von ITS- und psbA-trnHSequenzen) ergaben drei mehr oder weniger gut gestützte Kladen innerhalb einer sehr gut gestützten monophyletischen Palaua. Interessanterweise bildeten die Arten P. inconspicua und P. modesta eine Klade (88% Jackknife-Unterstützung, JK), die die Schwestergruppe zu den restlichen Arten der Gattung darstellt. Beide Arten haben eine von der restlichen Gattung abweichende Blütenmorphologie (kleine Petalen, weniger Merikarpien) und die razemösen Infloreszenzen enthalten neben Einzelblüten in den Achseln der Trägblätter auch 2-4-blütige Teilinfloreszenzen, an denen die Blüten kein Tragblatt aufweisen. Die zweite Klade (JK 97%) beinhaltet die Arten des P. dissecta-Komplexes, dessen Arten sich durch tief geteilte Blätter und große, auffällig rosarot bis violett gefärbte Blüten mit zahlreichen Merikarpien auszeichnen. In der dritten Klade (JK 73%) bildet P. guentheri die Schwestergruppe zu den restlichen Arten. Die hier vereinten Arten sind durch den Besitz ungeteilter Blätter und meist großer, auffällig rosarot bis violett gefärbter Blüten mit zahlreichen Merikarpien gekennzeichnet. Eine Ausnahme bildet P. guentheri, die geteilte Blätter hat und von daher Übereinstimmungen mit den Arten um P. dissecta aufweist. Sie weicht jedoch von den Arten des P. dissecta-Komplexes aufgrund ihrer geringeren Blütengröße und der geringeren Merikarpienanzahl ab. Außerdem sind die Blätter meist stärker reduziert und weniger regelmäßig geteilt als jene. Allerdings bedarf die Stellung von P. guentheri innerhalb der Gattung noch einer eingehenderen Überprüfung mit zusätzlichen (molekularen) Daten, da die Unterstützung für diese Klade vergleichsweise moderat ausfällt. Interessanterweise schließt diese Klade auch die aberrante P. sandemanii ein. Eine phylogenetische Rekonstruktion der Karpellanordnung ergab, dass die einreihige Anordnung der Karpelle in P. sandemanii vermutlich sekundär in Palaua entstanden ist. Allerdings zeigten Hypothesentests (Templeton-Test, Shimodaira-Hasegawa-Test), dass die Datengrundlage nicht ausreichend robust ist, um auch die Alternativhypothese einer sekundären Entstehung der unregelmäßig übereinander angeordneten Karpelle, wie sie die restlichen Arten der Gattung kennzeichnen, zu verwerfen. Innerhalb der Integrifolia-Klade lassen sich außerdem zwei Gruppen von Arten morphologisch deutlich unterscheiden. Die erste Gruppe besteht aus den einjährigen P. malvifolia und P. rhombifolia, die sich durch ihr fast kahles Indumentum auszeichnen und in Nord- bis Zentral-Peru vorkommen. Die zweite Gruppe, gebildet von den ausdauernden P. moschata, P. trisepala und P. velutina, ist durch ein samtiges Indumentum gekennzeichnet. Während sich P. moschata über das gesamte Verbreitungsgebiet der Gattung erstreckt, kommen die anderen Arten nur in Südperu vor. Die Chromosomenzahl von Palaua ist ein wichtiges Merkmal und diente Bates (1968) für deren Zuordnung zur Sphaeralcea-Allianz. Bis dato sind Chromosomenzählungen nur für zwei Arten bekannt gewesen: P. rhombifolia und P. moschata (beide mit 2n = 10 Chromosomen). In dieser Arbeit wurden weitere Zählungen durchgeführt und es wurde bestätigt, dass es neben diploiden auch tetraploide Arten mit 2n = 20 Chromosomen gibt. Polyploidie scheint dabei auf die ausdauernden Arten beschränkt zu sein. In manchen Arten, insbesondere in denjenigen des P. dissecta-Komplexes und in P. tomentosa, findet man eine ausgeprägte phänotypische Variabilität, die die Abgrenzung derselben stark erschwert. Ohne die Ursachen abschließend klären zu können, erscheint diese Variabilität zumindest teilweise als Ergebnis von Hybridisierung, Introgression und Polyploidisierung zu sein. In Bezug auf die Biogeographie der Gattung, zeigt sich, dass 11 Palaua-Arten endemisch für Peru sind und 4 Arten auch in Chile vorkommen. Das Verbreitungszentrum von Palaua ist das Gebiet der Lomas im Süden Perus (Departments Arequipa, Moquegua, Tacna), in dem 12 der 15 Arten auftreten. Die Blütezeit der Palaua-Arten variiert von Jahr zu Jahr, abhängig davon, wie viel Nebelfeuchtigkeit in der südhemisphärischen Winter-/Frühlingszeit für die Pflanzen zur Verfügung steht. Die Entstehung der Nebel variiert außerdem von Norden nach Süden, so dass sich die Blühphasen entlang dieses Gradienten verschieben. So liegt die Blütezeit in Nordperu zwischen Juli und August, in Zentral-Peru zwischen August und September und in Südperu und Chile zwischen Oktober und November. Abweichungen von diesem Schema entstehen vor allem in El Niño-Jahren, in denen auch während des südhemisphärischen Sommers die Lomaspflanzen blühen. Die Lomasvegetation ist eine bedrohte Pflanzenformation, deren Artenvielfalt bisher aber nur in Form eines recht kleinen Naturreservats geschützt wird. Da sich viele Lomasstandorte in der Nähe von Siedlungen befinden, sind etliche der lokal nur begrenzt vorkommenden Arten in ihrem Bestand bedroht. Dies betrifft insbesondere P. rhombifolia und P. malvifolia, deren Verbreitungszentrum im Gebiet der Hauptstadt Lima liegt. Eigene Beobachtungen am Standort haben zudem bestätigt, dass einige Populationen dieser Arten durch von Käfern verursachter Herbivorie nahezu vollständig zerstört werden. Weitere Schutzmaßnahmen zum Erhalt der Palaua-Arten (wie auch der anderen Lomas-Arten) wären daher dringend geboten.
Erkrankungen des hämatopoietischen Systems treten oft als Folge balancierter chromosomaler Translokationen auf. Dabei ist das MLL Gen auf Chromosom 11 Bande q23 in zahlreiche reziproke chromosomale Translokationen involviert. Alle diese Veränderungen sind entweder mit einer akuten myeloischen oder lymphatischen Leukämie assoziiert. Translokationen mit Beteiligung des MLL Gens - mit Ausnahme der Translokation t(9;11) - werden aufgrund ihrer schlechten Therapierbarkeit und schlechten Prognose als Hochrisiko- Leukämien eingestuft. Das häufigste Partnergen ist das AF4 Gen (42% aller MLL Translokationen) auf Chromosom 4 Bande q21. Die daraus resultierende Translokation t(4;11) ist mit einer akuten lymphatischen Leukämie (pro-B ALL) assoziiert und tritt gehäuft bei Säuglingen und Kleinkindern auf. Das Resultat der Translokation t(4;11) ist letztendlich die Entstehung zweier reziproker Derivatchromosomen, die die beiden Fusionsgene MLL•AF4 und AF4•MLL kodieren. Welcher Mechanismus die Entstehung der Leukämie hervorruft, konnte bis heute nicht ausreichend geklärt werden. Basierend auf den Daten anderer MLLassoziierter Translokationen, dass ausschließlich das Derivat 11 Fusionsprotein onkogene Effekte vermittelt, wurde das Fusionsprotein MLL•AF4 intensiv erforscht. Erst Ende 2008 gelang es einer amerikanischen Arbeitsgruppe in einem Mll•AF4 knock-in Mausmodell den Krankheitsphänotyp einer AML bzw. einer prä-B ALL auszulösen. Allerdings exprimieren 80% aller t(4;11)-Patienten auch das reziproke AF4•MLL Fusionstranskript und die restlichen 20% tragen komplexe Aberrationen zwischen MLL, AF4 und einem dritten oder sogar einem vierten Partnergen. Deshalb befassen sich die Studien unserer Arbeitsgruppe hauptsächlich mit dem reziproken AF4•MLL Fusionsprotein. Die Ergebnisse dieser Studien zeigen, dass das AF4•MLL Fusionsprotein in den Zellen akkumuliert und dadurch onkogene Ereignisse auslöst, welche letztendlich in der Wachstumstransformation der Zellen resultieren. Aufgrund dieser Daten war davon auszugehen, dass das AF4•MLL Fusionsprotein ebenfalls einen entscheidenden Beitrag bei der Entstehung der Leukämie leistet. Um das leukämogene Potential der beiden Fusionsproteine MLL•AF4 und AF4•MLL in einem Mausmodell weiter zu untersuchen, wurde zunächst ein retrovirales Transduktionssystem in BA/F3-Zellen etabliert. Dabei wurden BA/F3-Zellen sowohl einzeln mit MLL•AF4 oder AF4•MLL als auch mit beiden Fusionsgenen der Translokation t(4;11) cotransduziert. Nachdem die Funktionalität der beiden Expressionskassetten, durch full-length Integration und durch Transkription erfolgreich nachgewiesen werden konnte, erfolgten erste Transduktions-/Transplantationsexperimente in Mäusen. Dafür wurden Lin-/Sca-1+ aufgereinigte Knochenmarkzellen mit retroviralen Überständen von MLL•AF4 und AF4•MLL einzeln- als auch co-transduziert. Mäuse denen MLL•AF4- oder Mock-transduzierte Lin-/Sca-1+-Zellen transplantiert wurden, entwickelten über einen Beobachtungszeitraum von 13 Monaten keinerlei Anzeichen einer leukämischen Erkrankung. Im Gegensatz dazu resultierte die Transplantation von AF4•MLLoder co-transduzierten Lin-/Sca-1+-Zellen in der Entwicklung einer leukämischen Erkrankung innerhalb von 7 Monaten. Anhand pathologischer Parameter, sowie durch histochemische, molekulare als auch durchflusszytometrische Analysen konnten drei verschiedene Immunophänotypen identifiziert werden. Die Expression des Fusionsproteins AF4•MLL resultierte in der Ausprägung des Phänotyps einer pro-B ALL oder einer B/T biphänotypischen akuten Leukämie (B/T BAL). In Anwesenheit beider Fusionsproteine der Translokation t(4;11) entwickelte sich ebenfalls eine B/T BAL oder einer Mixed Lineage Leukemia (MLL). Retransplantationsexperimente mit den primären leukämischen Blasten zeigten, dass die drei verschiedenen Krankheitsphänotypen stabil transplantierbar sind, wobei sich die Latenzzeit erheblich verkürzte. Damit wurde zum ersten Mal der Beweis erbracht, dass das Fusionsprotein AF4•MLL auch allein ohne die Gegenwart des Fusionsproteins MLL•AF4 in der Lage ist eine leukämische Erkrankung auszulösen. Aufgrund dieser Daten, vorausgehenden Studien unserer Arbeitsgruppe sowie den Studien zum Fusionsprotein MLL•AF4 ist davon auszugehen, dass der pathomolekulare Mechanismus der Translokation t(4;11) auf zwei Onkoproteinen basiert.
Außergewöhnliche Fortschritte in der Human- und Mausgenetik führten zur Charakterisierung einer Vielzahl von krankheitsrelevanten Mutationen, die entweder natürlich auftreten oder über genetische Manipulation im Tiermodell erzeugt wurden. Die nahezu vollständige Sequenzierung der Genome von Mensch und Maus im Rahmen der internationalen Sequenzierungsprojekte ebnete den Weg für groß angelegte, internationale Mutagenese-Programme, die zum Ziel haben jedes einzelne Gen funktionell zu charakterisieren. Der hierfür bevorzugte Organismus ist die Maus, weil der Aufbau des Mausgenoms dem menschlichen Genom sehr ähnlich ist und weil für die Maus embryonale Stammzellen (mES Zellen) existieren, die ohne Einschränkung ihres pluripotenten Status in Gewebekultur genetisch manipuliert werden können. Darüber hinaus lassen sich mES Zellen über Blastozysteninjektion in Mäuse konvertieren. Dadurch können die Folgen von in vitro gesetzten Mutationen im Kontext eines Gesamtorganismus analysiert werden. Die so genannte „Knock out“ Maus ist ein weit verbreitetes Tiermodell, das nicht nur Genfunktionen in vivo offenbart, sondern auch die Modellierung humaner genetischer Erkrankungen ermöglicht. Außergewöhnliche Fortschritte in der Human- und Mausgenetik führten zur Charakterisierung einer Vielzahl von krankheitsrelevanten Mutationen, die entweder natürlich auftreten oder über genetische Manipulation im Tiermodell erzeugt wurden. Die nahezu vollständige Sequenzierung der Genome von Mensch und Maus im Rahmen der internationalen Sequenzierungsprojekte ebnete den Weg für groß angelegte, internationale Mutagenese-Programme, die zum Ziel haben jedes einzelne Gen funktionell zu charakterisieren. Der hierfür bevorzugte Organismus ist die Maus, weil der Aufbau des Mausgenoms dem menschlichen Genom sehr ähnlich ist und weil für die Maus embryonale Stammzellen (mES Zellen) existieren, die ohne Einschränkung ihres pluripotenten Status in Gewebekultur genetisch manipuliert werden können. Darüber hinaus lassen sich mES Zellen über Blastozysteninjektion in Mäuse konvertieren. Dadurch können die Folgen von in vitro gesetzten Mutationen im Kontext eines Gesamtorganismus analysiert werden. Die so genannte „Knock out“ Maus ist ein weit verbreitetes Tiermodell, das nicht nur Genfunktionen in vivo offenbart, sondern auch die Modellierung humaner genetischer Erkrankungen ermöglicht. Mit dem Ziel Kranheitsgene ihren Signalwegen zuzuordnen wurde in dieser Dissertation ein in situ Proteinmarkierungssystem entwickelt, das Hochdurchsatz-proteomik in mES Zellen ermöglicht. Das System beinhaltet die Einführung einerProteinmarkierungskassette in mES Zellen, die konditionale FlipROSAβgeo-Genfal-lenintegrationen in proteinkodierenden Genen enthalten. Weil die Konditionalität der FlipROSAβgeo-Genfallenkassette auf einem sequenzspezifischen Rekombinations-mechanismus beruht, kann diese postinsertionell über Rekombinase-vermittelten Kassettenaustausch (RMCE) durch eine Proteinmarkierungskassette ersetzt werden. Das hierfür entwickelte Konstrukt entspricht einem durch 5’ Spleißakzeptor- und 3’ Spleißdonorsequenzen definierten dizistronischen Exon, in dem ein Hygromyzin-Resistenzgen über eine P2A Polyproteinspaltungssequenz mit einem für das egfp (enhanced green fluorescent protein) kodierenden nLAP-Tag (N-terminal localization and affinity purification) verbunden ist. Eine erste Validierung dieses Exons in einem retroviralen Genfallenansatz ergab, dass sämtliche in Hygromyzin selektierte und auf DNA-Kassettenintegrationen untersuchte Klone nLAP-markierte Proteine exprimierten. Im Folgenden wurden in den GGTC (German Gene Trap Consortium) und EUCOMM (European Conditional Mouse Mutagenesis Project) mES Zellressourcen Genfallenintergationen identifiziert, die sich für eine RMCE vermittelte, N-terminale in situ Proteinmarkierung eignen. Als kompatibel wurden Genfallenklone klassifiziert, die eine FlipROSAβgeo-Integration im ersten Intron eines proteinkodierenden Gens aufweisen, wobei diese Integration sowohl hinter einem ersten nichtkodierenden, als auch hinter einem ersten kodierenden Exon liegen kann. Allerdings darf im letzteren Fall die kodierende Sequenz keine funktionale Domäne enthalten und muss kurz genug sein, um bei Verlust nicht mit der endogenen Proteinfunktion zu interferieren. Auf diesen Kriterien basierend wurden in den GGTC und EUCOMM Ressourcen 25.130 Proteinmarkierungs-kompatible Genfallenklone identifiziert, die 3.695 mutierten Genen entsprechen. Hiervon wurden acht für die Validierung der RMCE-vermittelten Proteinmarkierungsstrategie ausgewählt. In jedem Fall gelang es die Genfallen-kassette mit dem Proteinmarkierungsexon zu ersetzten. Sowohl der Genfallen-, als auch der RMCE-Proteinmarkierungsansatz führte ohne Ausnahme zur Expression nLAP-Tag markierter Proteine, wobei in allen 13 untersuchten Klonen die Größe der markierten Proteine derjenigen der entsprechenden nativen Proteine mit zusätzlichem Marker entsprach. Weitere Untersuchungen haben gezeigt, dass die physiologische Expression der markierten Proteine sich von denen der Wildtypproteine in der Regel nicht unterscheidet und für Lokalisations- und massenspektrometrische Interaktionsstudien ausreicht. Darüber hinaus spiegelten 90% der hier untersuchten markierten Proteine das subzelluläre Lokalisationsmuster der entsprechenden nativen Proteine wider. Ähnlich verhielt es sich mit den Interaktionspartnern der jeweiligen Proteine, die sich aus bereits bekannten, aber auch noch bisher unbekannten Proteinen zusammensetzen. Insgesamt wurden in dieser Dissertation die Voraussetzungen zu einer Hochdurchsatzproteomanalyse in mES Zellen geschaffen. Während der RMCE-Ansatz die Markierung von über 3.600 Proteinen in mES Zellen ermöglicht, eignet sich der Genfallenansatz neben der Proteinmarkierung in murinen auch für die Markierung von Proteinen in humanen Zellen. In dieser Hinsicht ist die Markierung von Proteinen in humanen ES Zellen und in reprogrammierten Stammzellen (iPS) von Patienten mit unterschiedlichsten Erkrankungen besonders attraktiv, weil damit sowohl Spezies- als auch Krankheitsspezifische Unterschiede im Ablauf individueller Signaltransduktionskaskaden definiert werden können.
Riboswitche – Vorbilder für die Konstruktion synthetischer RNA Schalter Riboswitche sind natürliche RNA Regulatorelemente. Sie sind in den nicht kodierenden Regionen von messenger RNAs (mRNAs) lokalisiert und beeinflussen die Expression nachfolgender Gene. Riboswitche bestehen aus zwei Domänen. Die Binde- oder Aptamerdomäne bildet eine Bindetasche, die einen Liganden ohne die Hilfe zusätzlicher Faktoren hoch spezifisch und affin binden kann. Die zweite Domäne, die sogenannte Expressionsplattform, interpretiert den Bindestatus der Aptamerdomäne und beeinflusst die Expression der nachfolgenden Gene. Liganden sind meist kleine, organische Moleküle wie Nukleotide, Aminosäuren oder Vitamine. Riboswitche regulieren Gene, die für die Synthese oder Verwertung ihres jeweiligen Liganden in der Zelle von Bedeutung sind. Kontrolliert wird die Genexpression meist durch Transkriptionstermination oder durch Maskierung der ribosomalen Bindestelle (SD = Shine Dalgarno Sequenz). Auch Eukaryoten nutzen das Prinzip der direkten RNA-Ligand-Interaktion zur Genregulation, wenn gleich in geringerem Ausmaß. In Pilzen und Pflanzen wird durch Ligandenbindung alternatives Spleißen von prä-mRNAs induziert, was entweder zur mRNA Degradation durch alternative Polyadenylierung oder der Repression der Translation durch alternative Leserahmen (uORFs) führt. Charakteristisch für eine Regulation über Riboswitche ist die direkte Wechselwirkung des niedermolekularen Liganden mit der RNA. In trans kodierte Proteinfaktoren sind aufgrund dieser direkten Bindung nicht notwendig. Dies macht natürliche Riboswitche zu geeigneten Vorbildern für die Entwicklung künstlicher RNA Schalter. Synthetische Riboswitche Aptamere sind kleine, synthetisch hergestellte, einzelsträngige RNA oder DNA Moleküle, die hochaffin und sehr spezifisch ein Zielmolekül binden können. Man kann Aptamere gegen nahezu jedes Molekül der Wahl über einen Prozess der in vitro Selektion gewinnen (SELEX = systematic evolution of ligands by exponential enrichment). Eine Eigenschaft der meisten Aptamere ist, dass sie ihre endgültige Struktur erst in Gegenwart des spezifischen Liganden ausbilden („induced fit“). Dies kann ausgenutzt werden, um RNA Aptamere als regulatorische Elemente einzusetzen. Hierzu inseriert man Aptamere in nicht translatierte Regionen einer mRNA. In Abwesenheit des Liganden bildet sich die Struktur nur teilweise aus und interferiert nicht mit zellulären Funktionen. Erst im Komplex mit einem Liganden kommt es zur effizienten Beeinflussung der Genexpression. Inseriert man ein regulatorisch aktives Aptamer in den 5’ nicht translatierten Bereich (5’UTR) einer eukaryotischen mRNA, erlaubt das Aptamer in der nicht ligandengebundenen Form die Translation nachfolgender Gene. Erst der Aptamer-Ligand-Komplex interferiert mit der Translationsinitiation. Ist das Aptamer nahe der cap-Struktur positioniert, behindert es die initiale Bindung des Ribosoms an die mRNA. Bei einer weiter stromabwärts gelegenen Insertion interferiert es mit dem Scannen der kleinen ribosomalen Untereinheit nach dem Startcodon. Die beste Regulationseffizienz wird hierbei bei einer Insertion direkt vor dem Startcodon erreicht. Es zeigte sich jedoch, dass nur eine sehr geringe Anzahl an Aptameren in der Lage ist, als RNA Schalter aktiv zu sein. Dies führte dazu, dass bis heute nahezu alle Systeme entweder auf dem Theophyllin oder dem Tetrazyklin Aptamer basieren. Ziele dieser Arbeit In dieser Arbeit sollte untersucht werden, warum nur wenige Aptamere regulatorisch aktiv sind und was diese von inaktiven Varianten unterscheidet. Dafür wurden ein Tetrazyklin und ein Neomycin Aptamer detailliert charakterisiert. Desweiteren wurden neue RNA-basierte Regulationssysteme aufgebaut und ihr regulatorischer Mechanismus analysiert. Innerhalb dieser Arbeit wurde dabei ein System zur aptamerabhängigen Regulation des prä-mRNA Spleißens in Hefe etabliert. Außerdem konnte das bekannte Translationssystem für die Regulation essentieller Gene in Hefe weiter entwickelt werden. Folgende Ergebnisse wurden in dieser Arbeit erhalten: 1.Das Tetrazyklin Aptamer – In vitro Charakterisierung eines synthetischen Riboswitches. Das Tetrazyklin Aptamer ist 69 Nukleotide lang. Es besteht aus drei Stämmen (P1, P2 und P3) sowie drei einzelsträngigen Bereichen (J1/2, J2/3 und die Schleife L3; siehe Abbildung 1, links). Die Domäne oberhalb von P2 ist nicht an der Ligandenbindung beteiligt und kann ausgetauscht werden. Die Stämme P1-P3 sind bereits vor Ligandenbindung ausgebildet. Tetrazyklin wird über die drei einzelsträngigen Bereiche gebunden (siehe Abbildung 1, rechts). Durch fluorimetrische und kalorimetrische Methoden wurde eine Bindekonstante von Tetrazyklin an das Aptamer von 770 pM ermittelt. Diese Affinität ist außergewöhnlich hoch. Vergleichbare Aptamere und natürliche Riboswitche binden niedermolekulare Liganden 10- bis 1000-fach schlechter. Wir konnten zeigen, dass hohe Affinität eine Grundvoraussetzung für die regulatorische Aktivität ist, da Aptamermutanten mit verschlechterten Bindekonstanten keine in vivo Aktivität mehr aufweisen sind (Seiten 19-29). Durch Größenausschlußchromatographie konnte gezeigt werden, dass das Tetrazyklin Aptamer durch Ligandenbindung keine größeren globalen Konformationsänderungen erfährt. Dies weist auf eine weitgehende Vorformung der Bindetasche bereits ohne Tetrazyklin hin. Bei Ligandenbindung nimmt das Aptamer eine pseudoknotenähnliche Tertiärstruktur an, welche wahrscheinlich für die inhibitorische Wirkung auf das Ribosom verantwortlich ist (Seiten 19-29). Im Laufe dieser Arbeit wurde die Kristallstruktur des Aptamers im Komplex mit Tetrazyklin in der Arbeitsgruppe von A. R. Ferré-D’Amaré gelöst. Die Struktur zeigt, dass die Stämme P1 und P3 aufeinander gestapelt sind (Abbildung 1, rechts). Stamm P2 bildet die Verlängerung einer irregulären Helix, die aus den einzelsträngigen Bereichen J1/2 und J2/3 gebildet wird. Nukleotide der Schleife L3 interagieren mit dieser irregulären Helix und bilden mit ihr zusammen die Bindetasche für Tetrazyklin. Diese hochauflösende Struktur diente uns in weiteren Arbeiten als Ausgangspunkt für die detaillierte Charakterisierung von ligandeninduzierten Änderungen (siehe 6.). 2. Das Tetrazyklin Aptamer ist in der Lage, prä-mRNA Spleißen in Hefe zu inhibieren. Der Aptamer-Tetrazyklin-Komplex kann nicht nur mit der Translationsinitiation, sondern auch mit dem Spleißen der prä-mRNA in Hefe interferieren (Seiten 31-37). Dazu wurde ein Hefe-Intron in den Leserahmen von GFP inseriert. Nur bei korrektem prä-mRNA Spleißen wird die reife mRNA aus dem Kern transportiert und GFP exprimiert. Für eine RNA-basierte Regulation des Spleißens wurde die Konsensussequenz der 5’ Spleißstelle in den Stamm P1 des Tetrazyklin Aptamers integriert. Dieser ist nicht an der Ligandenbindung beteiligt und seine Sequenz daher variabel. Es konnte gezeigt werden, dass in Abwesenheit von Tetrazyklin das Intron vom Spleißosom erkannt und entfernt wird. Die Expression des Gens ist dann möglich. Durch die Zugabe von Tetrazyklin wird das Spleißen inhibiert und GFP nicht länger exprimiert. Biochemische Strukturkartierungen der RNA in An- und Abwesenheit von Tetrazyklin zeigten, dass der Stamm P1 durch Ligandenbindung verfestigt wird. Die Ligandenbindung beeinflusst also nicht nur die Struktur der Bindetasche, sondern wird auch auf angrenzende Stammbereiche übermittelt. Durch Stabilisierung des Stammes P1 wird die 5’ Spleißstelle für das Spleißosom maskiert. Somit konnten wir den Mechanismus für die Aptamer basierte Regulation des prä-mRNA Spleißens aufklären. 3. Die Tetrazyklin Aptamer basierte Inhibition der Translationsinitiation ermöglicht die Regulation essentieller Gene in Hefe. Frühere Arbeiten zeigten, dass die Insertion mehrerer Aptamerkopien in den 5’UTR zu einem effizienten Abschalten der Genexpression führt. Dies wurde genutzt, um ein neuartiges System für die konditionale Expression essentieller Gene in Hefe zu etablieren. In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. K.-D. Entian wurden Insertionskassetten für eine PCR-basierte chromosomale Integration von Tetrazyklin Aptameren unter Kontrolle verschieden starker Promotoren konstruiert. Dafür wurden 1-3 Kopien des Tetrazyklin Aptamers unter Kontrolle des hoch exprimierenden TDH3-Promoters und des etwas schwächeren ADH1-Promoters gestellt. Außerdem wurde eines HA-tag angefügt, um die Genexpression mittels Westernblot verfolgen zu können. Zur Überprüfung der chromosomalen Insertion diente eine Kanamycin-Resistenz. Das neue System wurde erfolgreich an von fünf essentiellen Genen getestet. Es zeigte sich, dass die Zugabe von Tetrazyklin zu einem schnellen und effizienten Abschalten aller getesteten Gene führt. Die Vorteile dieses neuartigen konditionalen Genexpressionssystems in Hefe liegen in der einfachen Handhabung und der Unabhängigkeit vom verwendeten Stamm. Es müssen keine in transkodierten Proteinfaktoren coexprimiert werden. Durch dieses System konnte zum ersten Mal die Aptamer-basierte Regulation endogener, essentieller Gene gezeigt werden (Seiten 49-57). 4. Die Kombination von in vitro Selektion und in vivo Screening ermöglicht die Identifikation neuer regulatorisch aktiver Aptamere – ein Neomycin Riboswitch. Nur wenige in vitro selektierte Aptamere sind als synthetischer Riboswitch aktiv. In unserer Arbeitsgruppe wurde daher ein in vivo Screeningsystem zur Identifizierung neuer Aptamere in Hefe entwickelt. Eine Bibliothek in vitro selektierter Aptamere wurde hierzu in den 5’UTR des GFP Gens kloniert und die Aktivität einzelner Kandidaten durch Vergleich der Fluoreszenz in An- und Abwesenheit des Liganden überprüft. Wir verwendeten eine Bibliothek aus Neomycin-bindenden Aptameren und analysierten 5000 Hefeklone. Hierbei konnten zehn Sequenzen isoliert werden, die abhängig von Neomycin die Initiation der Translation inhibieren. Das 33 Nukleotid lange Aptamer N1 zeigt eine 7,5-fache Regulation und wurde näher charakterisiert. Es besteht aus einer internen asymmetrischen und einer terminalen Schleife, die durch zwei GC Basenpaare getrennt sind. Enzymatische Strukturkartierung und Mutationsanalyse zeigten, dass beide einzelsträngigen Bereiche für die Ligandenbindung wichtig sind. Der abschließende Stamm ist nicht an der Ligandenbindung beteiligt und hat geringen Einfluss auf die regulatorische Aktivität. N1 kann außerdem gegen andere Aminoglykosidantibiotika diskriminieren (Seiten 39-47). Interessanterweise sind die regulatorisch aktiven Aptamere in der in vitro selektierten Bibliothek stark unterrepräsentiert und konnten durch zufälliges Sequenzieren nicht identifiziert werden. Dieses Beispiel verdeutlicht eindrucksvoll die Notwendigkeit eines Screenings in vivo. 5. Regulatorisch aktive Neomycin Aptamere unterscheiden sich von inaktiven durch eine größere thermische Stabilisierung bei Ligandenbindung. Durch weitere Mutationsanalysen von N1 konnte ein aktivitätsvermittelndes Element im Neomycin Riboswitch identifiziert werden. Dazu wurde entweder die terminale oder die interne asymmetrische Schleife mutiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Sequenz der terminalen Schleife nur einen modulierenden Einfluss auf die Aktivität hat, wobei die Asymmetrie der internen Schleife (aber nicht deren exakte Sequenz) ausschlaggebend für die regulatorische Aktivität ist. Für weitere Analysen wurde N1 mit fünf mutierten Varianten und dem inaktiven Neomycin bindenden Aptamer R23 verglichen. Alle sieben Aptamer haben eine ähnliche Sekundärstruktur und Ligandenaffinität, zeigen aber unterschiedliche Aktivität in vivo. Durch Bestimmung des Schmelzpunktes der verschiedenen Aptamere in An- und Abwesenheit von Neomycin zeigte sich, dass aktive Aptamere thermisch deutlich mehr durch Ligandenbindung stabilisiert werden als inaktive. Dabei ist die thermische Stabilität der Aptamer-Neomycin-Komplexe ähnlich. Jedoch ist die Stabilität ohne Ligand bei aktiven Aptameren gegenüber inaktiven Varianten deutlich erniedrigt. Durch NMR spektroskopische Untersuchungen in Zusammenarbeit mit Prof. J. Wöhnert konnte bestätigt werden, dass aktive Aptamere weniger stark vorgeformt sind als inaktive. Das in den Mutationsanalysen identifizierte Element nimmt nicht an der Ligandenbindung teil, sondern dient als Schalter, der den freien Zustand das Aptamers destabilisiert. Damit sorgt es für den großen Unterschied in der thermischen Stabilität des freien und des gebundenen Zustandes aktiver Aptamere. Dies zeigt, dass Unterschiede in der Stabilität die regulatorische Aktivität vermitteln (Seiten 73-102). Laufende Arbeiten sollen nun klären, ob thermische Stabilisierung durch Ligandenbindung ein allgemeingültiger Vermittler von regulatorischer Aktivität ist. Dazu werden weitere Aptamere überprüft, welche in Abwesenheit des Liganden unterschiedlich stark strukturiert sind und eventuell durch Ligandenbindung unterschiedlich stabilisiert werden. Außerdem werden wir testen, ob es die gewonnen Erkenntnisse erlauben, durch rationelles Design synthetische Riboswitche zu verbessern oder inaktive Aptamere in aktive zu verwandeln. 6. Was macht ein Aptamer zu einem regulatorisch aktiven Riboswitch? Für das Tetrazyklin Aptamer konnten wir zeigen, dass zum einen eine extrem hohe Bindekonstante und zum anderen eine hoch komplexe Bindetasche für die regulatorische Aktivität entscheidend sind. Dabei ist die Bindetasche in Abwesenheit des Liganden stark vorstrukturiert und erfährt keine globalen strukturellen Änderungen (Seiten 19-29). In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. J. Wachtveitl untersuchen wir den Einfluss von Bindekinetik und Lebensdauer des Aptamer-Tetrazyklin-Komplexes auf die regulatorische Aktivität. Dafür vergleichen wir das Tetrazyklin Aptamer mit drei regulatorisch inaktiven Mutanten. Für die Messungen nutzen wir die Eigenfluoreszenz des Tetrazyklins. Diese ist in wässriger Lösung geqenched und steigt bei Bindung an die RNA deutlich an. Erste Ergebnisse zeigen große Unterschiede zwischen den Aptameren in der Geschwindigkeit der Ligandenbindung. Außerdem zeigen sich geringe Unterschiede in der Lebensdauer der verschiedenen Komplexe. Durch NMR spektroskopische Untersuchungen in der Arbeitsgruppe von Prof. J. Wöhnert können die Veränderungen einzelner Basen bei Ligandenbindung untersucht werden. Hierbei zeigen erste Messungen am Tetrazyklin Aptamer, unterschiedliches Verhalten einzelner an der Bindung beteiligter Nukleotide. Eine detaillierte Aufklärung der ligandeninduzierten Veränderungen gewährt uns weitere Einblicke, warum das Tetrazyklin Aptamer als Riboswitch aktiv ist. Die regulatorische Aktivität Neomycin abhängiger Riboswitche wird durch thermische Stabilisierung bei Ligandenbindung vermittelt. Dabei zeigte sich, dass durch Neomycin neue Basenpaare und Basenstapelungen entstehen. Durch weiterführende strukturelle Untersuchungen sollen nun ligandeninduzierte Veränderungen in N1 detailliert geklärt werden. Größere globale Änderungen konnten bereits durch EPR Spektroskopie in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. T. F. Prisner ausgeschlossen werden. Hierzu wurden in der Arbeitsgruppe von Prof. J. W. Engels spinmarkierte Neomycin Aptamere hergestellt und die Abstände der Sonden in An- und Abwesenheit von Neomycin bestimmt. Es zeigte sich, dass sich der Abstand der Spinmarkierungen durch Zugabe von Neomycin (oder anderen Aminoglykosiden) nicht ändert (Seiten 59-72). Dies weist auf eher lokale Änderungen in der Bindetasche hin. Durch NMR Spektroskopie in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. J. Wöhnert werden im Moment die Strukturen verschiedener N1-Aminoglykosid-Komplexe gelöst. Dabei zeigt sich, dass in vivo aktive und inaktive Liganden eine ähnliche Struktur im Aptamer induzieren. Was die einzelnen Komplexe unterscheidet und damit die verschiedene Aktivität begründet ist Ziel der Analyse. Insgesamt konnte in dieser Arbeit ein Regulationssystem für die Aptamer-basierte Kontrolle des prä-mRNA Spleißens in Hefe entwickelt und das bestehende Translationssystem für die Applikation auf essentielle Gene angewendet werden. Außerdem wurden wichtige Punkte, warum Aptamere als Riboswitch funktionieren aufgeklärt. Damit legt diese Arbeit einen wertvollen Grundstein für die Weiterentwicklung RNA-basierter Genregulationselemente für die Anwendung in der synthetischen Biologie.
Teerfleckenpilze (Ascomycota, Phyllachorales) kommen weltweit vor, haben aber einen deutlichen Verbreitungsschwerpunkt in den Tropen. In dieser Studie wird die Diversität der Phyllachorales in Panama untersucht und taxonomische Grundlagenforschung durch molekulare Untersuchungen und ökologische Beobachtungen ergänzt. Arten der Phyllachorales bilden schwarz glänzende Flecken oder Krusten auf Blättern und Stängeln von Pflanzen. Die Fruchtkörper dieser Mikropilze sind meistens in das Wirtsgewebe eingesenkt, können aber auch oberflächlich angelegt sein. Die Größe der teerfleckenähnlichen Infektionen variiert zwischen 0,2 mm bis zu mehreren Zentimetern. Teerfleckenpilze mit eingesenkten Fruchtkörpern entwickeln in den meisten Fällen schildförmige, epidermale Deckstrukturen oberund/oder unterhalb der Perithecien. Die unitunicaten Asci können einen kleinen apikalen Ring besitzen, der sich in Jodlösung nicht blau färbt. Die hyaline Ascosporen sind meistens glatt und können von einer schleimigen Hülle umgeben sein. Die assoziierten Andromorphstadien sind durch fadenförmige Spermatien gekennzeichnet. Nur wenige morphologische Merkmale werden als verlässlich betrachtet und stehen für die Bestimmung von Arten zur Verfügung. Derzeit sind 1.226 Arten von Phyllachorales weltweit beschrieben. Puerto Rico gilt als eines der am besten untersuchten Länder in Bezug auf Teerfleckenpilze. Ungefähr 100 Arten sind derzeit von Puerto Rico bekannt, weitere Erstnachweise werden erwartet. Im Gegensatz dazu wurden in Panama bisher nur wenige mykologische Untersuchungen durchgeführt. Zwischen 1927 und 1991 wurden nur 39 Teerfleckenpilze nachgewiesen, obwohl die Landfläche Panamas achtmal größer ist als die von Puerto Rico und eine fast viermal höhere Pflanzendiversität aufweist. Aufgrund der Vielzahl potentieller neuer Wirtspflanzen in Panama und des von Teerfleckenpilzen bevorzugten tropischen Klimas wird eine weitaus höhere Anzahl an Arten der Phyllachorales erwartet. Zwischen 2005 und 2008 wurden mehreren Exkursionen in den Provinzen Bocas del Toro und Chiriquí durchgeführt, um die tatsächliche Diversität pflanzenparasitischer Mikropilze in Panama zu untersuchen. Über 1.000 Belege wurden von insgesamt vier Wissenschaftlern während 7 Sammelreisen von jeweils 2‐4 Wochen gesammelt. 185 Belege zeigen mehr oder weniger deutliche Symptome von Teerfleckenkrankheit und entsprechen 42 Arten der Phyllachorales, die bisher noch nicht für Panama bekannt sind. 81 Teerfleckenpilze aus Panama werden in dieser Arbeit mit detaillierten Beschreibungen, Zeichnungen und Fotos vorgestellt. Von den 66 bis zur Art bestimmten Phyllachorales werden 27 erstmalig für Panama, 19 für Zentralamerika und 3 für die Neue Welt genannt. Die Erstnachweise von Camarotella costaricensis, Coccodiella miconiicola, Ophiodothella galophila, Phyllachora amphibola, Ph. engleri und Ph. zanthoxylicola wurden bereits vorab publiziert. 21 Arten werden hier zum ersten Mal vorgestellt: Catacauma paramoense, Coccodiella miconiae, Ophiodothella cuervoi, Phyllachora acaciae subsp. pusaethae, Ph. acalyphae, Ph. araliarum, Ph. balansae, Ph. buddleiae, Ph. cynodontis, Ph. galavisii, Ph. gouaniae, Ph. leeae, Ph. meliosmae, Ph. microtheles, Ph. ocoteae, Ph. paraguaya, Ph. phyllanthophila var. phyllanthophila, Ph. puncta subsp. dalbergiicola, Ph. ruelliae, Ph. serjaniae und Ph. smilacicola. Zusätzlich konnte erstmals der Hyperparasit Perizomella inquinans auf Ph. ocoteae für Panama und der Teerfleckenpilz Ph. guazumae für Costa Rica nachgewiesen werden. Von den 15 bisher noch unbestimmten Teerfleckenpilzen sind 9 Arten der Gattungen Camarotella und Phyllachora wahrscheinlich neu für die Wissenschaft und 6 Arten müssen bis zur Bestimmung noch weiter untersucht werden. 10 Taxa wurden aufgrund von Synonymisierung, Zitierungsfehlern oder mangelhaftem Material ausgeschlossen. Für eine sichere Bestimmung der Arten aus Panama wurden alle weltweit bekannten Teerfleckenpilze auf nah verwandten Wirtspflanzen miteinander verglichen. Dazu wurden intensive Literaturrecherche und detaillierte lichtmikroskopische Studien durchgeführt. 190 Typen und autoritative Belege wurden zusätzlich aus 22 Herbarien weltweit ausgeliehen und untersucht. Dabei wurden einige Gruppen von Teerfleckenpilzen auf bestimmten Wirtsfamilien teilweise überarbeitet und Schlüssel für die Bestimmung der jeweiligen Arten erstellt. Ein Vergleich der charakteristischen Merkmale wird als tabellarische Übersicht in den Anmerkungen vorgestellt. Aufgrund der intensiven taxonomischen Arbeit konnten 7 neue Synonyme aufgedeckt werden. Catacauma contractum ist ein Synonym von Ph. gouaniae, Ph. clypeata von Ph. paraguaya, Ph. insueta von Ph. serjaniae, Ph. paulliniae von Ph. galavisii und Ph. swieteniae von Ph. balansae. Für Ph. roureae werden gleich zwei neue Synonyme vorgeschlagen, Ph. connari und Ph. panamensis. Einige der untersuchten Herbarbelege waren nur bruchstückhaft vorhanden oder in sehr schlechtem Zustand. Viele Belege konnten aufgrund mangelnder Informationen nicht gefunden oder wegen sehr langen Lieferungszeiten oder fehlender Kooperationen noch nicht untersucht werden. Die Erstbeschreibungen vieler Arten in der Literatur sind lückenhaft und für die wenigsten Arten sind Abbildungen vorhanden. Dadurch ist eine sichere Artbestimmung ohne Untersuchung des zugehörigen Herbarmaterials oft unmöglich. In dieser Arbeit werden alle 81 untersuchten Teerfleckenpilze mit detaillierten Beschreibungen, Zeichnungen und Fotografien dargestellt, um zukünftige Bestimmungsarbeiten zu erleichtern. 16 Teerfleckenpilze wurden im Rahmen dieser Arbeit zum ersten Mal illustriert: Catacauma paramoense, Ophiodothella cuervoi, O. galophila, Phyllachora acaciae var. enterolobii, Ph. acalyphae, Ph. araliarum, Ph. bonariensis, Ph. engleri, Ph. galavisii, Ph. leeae, Ph. meliosmae, Ph. ocoteae, Ph. ruelliae, Ph. smilacicola, Ph. verbesinae und Polystigma pusillum. Darüber hinaus wurden Ph. acaciae subsp. pusaethae, Ph. cecropiae, Ph. leptochloae, Ph. puncta subsp. dalbergiicola und Ph. weirii in ihrer Darstellung vervollständigt. Für einige Arten werden bislang unveröffentlichte morphologische Merkmale vorgestellt, z.B. chondroide Hyphen, Schleimhüllen oder Andromorphstadien, und die mögliche Verwendung dieser Merkmale zur Artabgrenzung diskutiert. Zusätzlich zu den morphologischen Merkmalen werden molekulare Daten hinzugezogen. Zu Beginn dieser Arbeit standen Sequenzen von nur acht verschiedenen Arten der Phyllachorales s.str. zur Verfügung, davon 3 aus der Gattung Phyllachora. Aufgrund der Tatsache, dass Arten der Phyllachorales auf lebendes Pflanzenmaterial angewiesen sind, ist es bisher noch nicht gelungen, diese Pilze in Kultur zu halten. Die Isolation von DNA‐Material aus eigenen Herbarbelegen oder von auf Silicagel getrockneten Proben erwies sich als wenig erfolgreich. Es war notwendig, das frisch gesammelte Material direkt vor Ort in Panama zu verarbeiten. Die Extraktion von reinem und geeignetem Pilzgewebe stellte sich aufgrund der sehr geringen Fruchtkörpergröße und der engen Anhaftung an das Pflanzengewebe als sehr mühsam dar. Trotzdem wurden 10 neue DNA‐Sequenzen, die jeweils für die kleine bzw. große ribosomale Untereinheit kodieren, von 7 Teerfleckenpilzen, Coccodiella miconiae, Coccodiella sp., Phyllachora engleri, Ph. graminis, Ph. leeae, Ph. ulei und Ph. zanthoxylicola, auf 10 verschiedenen Wirtspflanzen erfolgreich isoliert. Erste molekulare Untersuchungen mittels Maximum Likelihood, Maximum Parsimony und Bayesianischer Analyse eines kombinierten Datensatzes unterstützen die Zugehörigkeit der Phyllachorales zur Unterklasse Sordariomycetidae und deuten auf eine paraphyletische Entwicklung der Gattung Phyllachora hin. Die Typusart, Phyllachora graminis, könnte mit Arten der Gattung Coccodiella enger verwandt sein als mit anderen Arten der Gattung Phyllachora. Bisher fehlen aber noch entsprechende morphologische Merkmale die diese These unterstützen. Weitere Untersuchungen mit einem erweiterten Datensatz sollten unternommen werden. Aufgrund der biotrophen Lebensweise und der damit verbundenen engen Anpassung an die jeweilige Wirtspflanze wird eine hohe Spezifität der Teerfleckenpilze angenommen. Die Identifikation der Wirtspflanze bildet daher eine wichtige Grundlage bei der Bestimmung des Pilzes. Durch die Abwesenheit fertiler Strukturen, wie Blüten und Früchte, wurde eine eindeutige Bestimmung oft erschwert. Pflanzenspezialisten, Fachliteratur, Herbarmaterial und Internetdatenbanken wurden hinzugezogen, um eine möglichst genaue Bestimmung der Wirtspflanzen zu erreichen. Die 81 für Panama vorgestellten Teerfleckenpilze parasitierten auf ungefähr 93 verschiedenen Wirten aus 72 Gattungen und 43 Pflanzenfamilien. 73 Wirtspflanzen wurden bis zur Art bestimmt, 20 können mit Gattungsnamen angesprochen werden und sind von den bisher bestimmten Arten sicher verschieden. 5 Arten sind derzeit noch gänzlich unbestimmt. Von den 73 vollständig bestimmten Pflanzenarten werden 29 zum ersten Mal als Wirte für den entsprechenden Parasiten vorgestellt: Acalypha diversifolia für Phyllachora acalyphae, Anthurium concinnatum für Phyllachora engleri, Buddleja nitida für Phyllachora buddleiae, Cissus trianae für Phyllachora leeae, Croton draco und Croton hirtus für Phyllachora tragiae, Dalbergia brownei für Phyllachora puncta subsp. dalbergiicola, Dichanthelium acuminatum und Dichanthelium viscidellum für Phyllachora bonariensis Speg., Dicliptera iopus für Phyllachora ruelliae, Dioscorea trifida und Dioscorea urophylla für Phyllachora ulei, Entada polystachya für Phyllachora acaciae subsp. pusaethae, Inga punctata und Inga sierrae für Phyllachora amphibola, Luehea seemannii für Phyllachora paraguaya, Ocotea veraguensis für Phyllachora ocoteae, Oreopanax xalapensis für Phyllachora araliarum, Ossaea micrantha für Coccodiella miconiicola, Paspalum paniculatum und P. pilosum für Phyllachora paspalicola, Paullinia bracteosa für Phyllachora galavisii, Phyllanthus anisolobus für Phyllachora phyllanthophila var. phyllanthophila, Serjania atrolineata für Phyllachora serjaniicola, Serjania mexicana für Phyllachora serjaniae, Vaccinium floribundum für Catacauma paramoense und Ophiodothella cuervoi, Xylosma flexuosa für Trabutia xylosmae und Zanthoxylum melanostictum für Phyllachora zanthoxylicola. Teilweise wurden diese Erstnachweise schon vorab publiziert. Arten der Familien Fabaceae, Melastomataceae und Poaceae sind besonders häufig mit Teerfleckenpilzen infiziert und scheinen bevorzugte Wirtspflanzen für Arten der Phyllachorales zu sein. Für ökologische Studien wurden bestimmte Teerfleckenpilze an ausgesuchten Standorten wiederholt zu verschiedenen Jahreszeiten gesammelt und untersucht. Dabei zeigte sich, dass Arten der Ordnung Phyllachorales in zwei Habitaten besonders häufig anzutreffen sind: (1) in offenen, gestörten Gebieten mit Ruderalvegetation und deutlicher Trockenperiode sowie (2) in dichten, ungestörten Bergregenwäldern mit hoher relativer Luftfeuchtigkeit und kontinuierlichem Niederschlag. Eine hohe Pflanzendiversität korreliert nicht mit einer hohen Diversität an Teerfleckenpilzen. Vergleichende Untersuchungen zeigten, dass das Vorkommen von Arten der Phyllachorales wahrscheinlich stärker vom Vorkommen und der Dichte bevorzugter Wirtspflanzen abhängt als von ökologischen Faktoren wie z.B. Vegetationstyp, Höhenlage, relativer Lichtintensität, durchschnittlichem Jahresniederschlag oder jahreszeitlicher Temperaturentwicklung. Die in dieser Studie vorgestellten Teerfleckenpilze stammen aus nur 5 von 12 Provinzen Panamas: Bocas del Toro und Chiriquí im Westen sowie Colón, Kuna Yala und Panamá im Zentrum des Landes. Mithilfe einer Datenbank wurde eine Vielzahl verfügbarer Literaturdaten mit Internet‐Datensätzen ergänzt und daraus eine Verbreitungskarte von Arten der Phyllachorales in der Welt erstellt. Für viele Länder sind nur wenige oder gar keine Teerfleckenpilze bekannt. Das lückenhafte Vorkommen in Panama und anderen Ländern der Welt entspricht aber keinesfalls der natürlichen Verbreitung dieser Pilze, sondern gibt die unterschiedliche Intensität von Forschungsaktivitäten in Bezug auf die Teerfleckenpilze wieder. Weitere Erstnachweise und neue Arten der Ordnung Phyllachorales werden für Panama und die Welt erwartet, denn unser Wissenstand über diese Gruppe ist sehr lückenhaft und weite Gebiete sind bislang noch unzureichend untersucht.
Iron uptake is an essential process in all Gram-negative bacteria including cyanobacteria and therefore different transport systems evolved during evolution. In cyanobacteria, however, the iron demand is higher than in proteobacteria due to the function of iron as cofactor in e.g. photosynthesis and nitrogen fixation. Most of the transport systems depend on outer membrane localized TonB-dependent transporters (TBDTs), a periplasma-facing TonB protein and a plasma membrane localized machinery (ExbBD). So far, iron chelators (siderophores), oligosaccharides and polypeptides have been identified as substrates of TBDTs. However, in proteobacteria TonB-dependent outer membrane transporter represent a well-explored subject whereas for cyanobacteria almost nothing is known about possible TonB-dependent uptake systems for iron or other substrates. The heterocyst-forming filamentous cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120 is known to secrete the siderophore schizokinen, but its transport system has remained unidentified. For Anabaena sp. PCC 7120 22 genes were identified as putative TBDTs covering almost all known TBDT subclasses. This is a high number of TBDTs compared to other cyanobacteria. The expression of the 22 putative TBDTs individually depends on the presence of iron, copper or nitrogen. The atypical dependence of TBDT gene expression on different nutrition points to a yet unknown regulatory mechanism. In addition, the hypothesis of the absence of TonB in Anabaena sp. PCC 7120 was clarified by the identification of an according sequence, all5036. Inspection of the genome of Anabaena sp. PCC 7120 shows that only one gene encoding a putative TonB-dependent iron transporter, namely alr0397, is positioned close to genes encoding enzymes involved in the biosynthesis of a hydroxamate siderophore. The expression of alr0397 was elevated under iron-limited conditions. Inactivation of this gene caused a moderate phenotype of iron starvation in the mutant cells. The characterization of the mutant strain showed that Alr0397 is a TonB-dependent schizokinen transporter (SchT) of the outer membrane and that alr0397 expression and schizokinen production are regulated by the iron homeostasis of the cell. Additional two genes of Anabaena sp. PCC 7120 involved in this process were identified. SchE encoded by all4025 is a putative cytoplasmic membrane-localized transporter involved in TolC-dependent siderophore secretion. The mutation of schE resulted in an enhanced sensitivity to high metal concentrations and in drastically reduction of secretion of hydroxamate-type siderophores. IacT coded by all4026 is a predicted outer membrane-localized TonB-dependent iron transporter. Inactivation of iacT resulted in reduced sensitivity to elevated iron and copper levels, whereas decoupling the expression from putative regulation by exchange of the promoter resulted in sensitization against tested metals. Further analysis showed that iron and copper effects are synergistic because decrease of iron induced a significant decrease of copper levels in the iacT insertion mutant but an increase of those levels in Anabaena sp. PCC 7120 where expression of all4026 is under the trc-promoter. In consequence, the results unravel a link between iron and copper homeostasis.
By adopting a variety of shapes, proteins can perform a wide number of functions in the cell, from being structural elements or enabling communication with the environment to performing complex enzymatic reactions needed to sustain metabolism. The number of proteins in the cell is limited by the number of genes encoding them. However, several mechanisms exist to increase the overall number of protein functions. One of them are post-translational modifications, i.e. covalent attachment of various molecules onto proteins. Ubiquitin was the first protein to be found to modify other proteins, and, faithful to its evocative name, it is involved in nearly all the activities of a cell. Ubiquitylation of proteins was believed for a long time only to be responsible for proteasomal degradation of modified proteins. However, with the discovery of various types of ubiquitylation, such as mono-, multiple- or poly-ubiquitylation, new functions of this post-translational modification emerged. Mono-ubiquitylation has been implicated in endocytosis, chromatin remodelling and DNA repair, while poly-ubiquitylation influences the half-life of proteins or modulates signal transduction pathways. DNA damage repair and tolerance are example of pathways extensively regulated by ubiquitylation. PCNA, a protein involved in nearly all types of DNA transaction, can undergo both mono- and poly-ubiquitylation. These modifications are believed to change the spectrum of proteins that interact with PCNA. Monoubiquitylation of PCNA is induced by stalling of replication forks when replicative polymerases (pols) encounter an obstacle, such as DNA damage or tight DNA-protein complexes. It is believed that monoubiquitylation of PCNA stimulates the exchange between replicative pols to one of polymerases that can synthesize DNA across various lesions, a mechanism of damage tolerance known as translesion synthesis (TLS). Our work has helped to understand why monoubiqutylation of PCNA favours this polymerase switch. We have identified two novel domains with the ability to bind Ub non-covalently. These domains are present in all the members of Y polymerases performing TLS, and were named Ub-binding zinc finger (UBZ) (in polη and polκ) and Ub-binding motif (UBM) (in polι and Rev1). We have shown that these domains enable Y polymerases to preferentially gain access to PCNA upon stalling of replication, when the action of translesion polymerases is required. While the region of direct interaction between Y pols and PCNA had been known (BRCT domain in Rev1 and PIP box motif (PIP) in three others members), we propose that Ub-binding domains (UBDs) in translesion Y pols enhance the PIP- or BRCT-domain-mediated interaction between these polymerases and PCNA by binding to the Ub moiety attached onto PCNA. Following these initial studies, we have also discovered that Y polymerases themselves undergo monoubiquitylation and that their UBDs mediate this modification. This auto-ubiquitylation is believed to lead to an intramolecular interaction between UBD and Ub attached in cis onto the UBD-containing protein. We have mapped monoubiquitylation sites in polη in the C-terminal portion of the protein containing the nuclear localization signal (NLS) and the PIP box. Beside PIP, the NLS motif is also involved in direct interaction of polη with PCNA. Based on these findings, we propose that monoubiquitylation of either NLS or PIP masks them from potential interaction with PCNA. Lastly, using several functional assays, we have demonstrated the importance of all these three motifs in the C-terminus of polη (UBZ, NLS and PIP) for efficient TLS. We have also constructed a mimic of monoubiquitylated polη by genetically fusing polη with Ub. Interestingly, this chimera is deficient in TLS as compared to the wild-type protein. Altogether, these studies demonstrate that the C-terminus of polη constitutes a regulatory module involved in multiple-site interaction with monoubiquitylated PCNA, and that monoubiquitylation of this region inhibits the interaction between polη and PCNA. Our work has also revealed that the UBDs of Y pols as well as of other proteins implicated in DNA damage repair and tolerance, such as the Werner helicase-interacting protein 1 (Wrnip1), are required for their proper sub-nuclear localization. All these proteins localize to discrete focal structures inside the nucleus and mutation of their UBDs results in inability to accumulate in these foci. Interestingly, by exchanging UBDs between different proteins we have learned that each UBD seems to have a distinct functional role, surprisingly not limited to Ubbinding ability. In fact, swapping the UBZ of Wrnip1 with the UBM of polι abolished the localization of Wrnip1 to foci despite preserving the Ub-binding ability of the chimeric protein. In summary, this work provides an overview of how post-translation modification of proteins by Ub can regulate several DNA transactions. Firstly, key regulators (e.g. PCNA) can be differentially modified by Ub. Secondly, specialized UBDs (e.g. UBM, UBZ) embedded only in a subset of proteins act as modules able to recognize these modifications. Thirdly, by means of mediating auto-ubiquitylation, UBDs can modulate the behaviour of host proteins by allowing for either in cis or in trans Ub-UBD interactions.