Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität; nur lokal zugänglich)
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Die Chloroplastenbewegung ist eine der wichtigsten Anpassungen, die Pflanzen entwickelt haben, um eine effiziente Ausbeute an Lichtquanten für die Photosynthese zu gewährleisten. Auch wenn der genaue Mechanismus und die Signalwege, die diesen Prozess vermitteln, noch nicht vollständig verstanden sind, konnten einige an der Chloroplastenbewegung beteiligte Proteine (phot1, phot2, chup1, Aktin, Profilin) in den letzten Jahren identifiziert werden. Chup1, das an der äußeren Chloroplastenmembran verankerte Protein, wird als putativer Linker zwischen den Chloroplasten und dem Aktin-Zytoskelett gesehen. Durch die Interaktion mit Profilaktin reguliert chup1 die Aktin-Polymerisierung und somit auch die Chloroplastenbewegung. Die Analyse der intra- und intermolekularen Interaktionen von chup1, die in dieser Studie ermittelt wurden, deutet auf eine Homodimerisierung von chup1 durch die Coiled coil Domäne sowie auf eine Assoziation des N- mit dem C-terminalen Leuzin- Zipper hin. Neben diesen Interaktionen konnte für einen der vier putativen Interaktionspartner von chup1, der wall associated kinase 3, eine mögliche Funktion bei der Vermeidungsbewegung der Chloroplasten gezeigt werden. In Anbetracht dieser Interaktion und der postulierten Phosphorylierungsstellen in chup1, könnte eine Regulierung von chup1 durch Phosphorylierung erfolgen. Um die Funktionen von chup1 und phot2 besser zu verstehen, wurden die Pflanzen mit knock-out in diesen Gene genauer charakterisiert und die T-DNA Insertionslinien von chup1 und phot2 zeigen keine Reduzierung in der photosynthetischen Aktivität. Im Gegensatz dazu, bedingt der knock out von beiden Genen eine deutliche Verminderung der photosynthetischen Leistung. Infolge der fehlenden Chloroplastenbewegung im chup1phot2 Doppel knock out führt das möglicherweise zu einem verringerten Schutz der Photosynthese. Dies bestätigt weiter die Verbindung zwischen der durch phot2 induzierten Signalkaskade und der Aktin-Polymerisierung, die durch chup1 reguliert wird. Um den Einfluss von chup1, phot1 und phot2 auf die transkriptionelle Regulierung nach BL zu analysieren, wurde das globale Expressionsmuster nach BL-Behandlung untersucht. Bei der Analyse der Mutanten-Pflanzen mit einem Defekt in der Chloroplastenbewegung (chup1, phot1, phot2) konnte keine Beeinflussung der Regulierung der Genexpression in BL-gesteuerten Signalkaskaden durch diese Proteine beobachtet werden. Die Regulierung der Expression geschieht eher auf posttranskriptioneller Ebene und wird mit Hilfe von microRNA gesteuert.
In dieser Arbeit sollte der Einfluss von Trockenstress auf die Photosyntheserate von einer repräsentativen C3-Art und dreier repräsentativer Arten unterschiedlicher C4-Subtypen vergleichend untersucht werden, wobei die drei Subtypen der C4-Photosynthese im Vordergrund standen. Anhand der ausgewählten Arten der Modell-Gattung Panicum (s.l.), P. bisulcatum (C3), P. bulbosum (NADP-ME), P. miliaceum (NAD-ME) und P. maximum (PCK), konnten die unterschiedlichen Stoffwechseltypen, an phylogenetisch nah verwandten Arten, auf Unterschiede in der physiologischen Antwort auf den abiotischen Stressfaktor Trockenheit untersucht werden. Hierfür wurden zwei verschiedene Arten der Trockenstressinduktion durchgeführt. Ein Vergleich der Arten in Hinblick auf Unterschiede in der Trockentoleranz erfolgte anhand von Hydrokulturversuchen mit PEG6000 als Osmotikum. In diesem Fall wurde der jeweilige Stress sehr schnell induziert und über die Dauer von 6 Tagen in unterschiedlichen Intensitäten konstant gehalten. Anhand der durchgeführten Gaswechselmessungen und Bestimmungen der Chlorophyllfluoreszenzparameter konnte eindeutig die C3-Art P. bisulcatum als die am sensitivsten auf Trockenstress reagierende Art identifiziert werden. Die drei C4-Arten lagen in ihrer physiologischen Antwort auf die unterschiedlichen Trockenstressintensitäten verhältnismäßig nah zusammen. Bei schwächerem osmotischen Stress zeigte aber P. miliaceum, der Vertreter des NAD-ME Subtyps, eindeutig die geringste Beeinflussung der untersuchten Photosyntheseparameter, was im Wesentlichen auch bei stärkerem osmotischen Stress bestätigt wurde. Zudem zeigte P. miliaceum bei 1400 ppm CO2 im Messgas im Vergleich zu den anderen getesteten Arten eine signifikant höhere Wassernutzungseffizienz, was die bessere Anpassung des NAD-ME Subtypen an osmotischen Stress unterstreicht. Bei dem Trockenstressexperiment in Erde stand die physiologische Maximalantwort auf den natürlicheren, verhältnismäßig langsam induzierten, aber letztendlich starken Trockenstress im Vordergrund. Hier wurde für jede Art untersucht, welche limitierenden Faktoren unter Trockenstress auf die Photosyntheserate wirken. Dafür wurde neben Gaswechsel- und Chlorophyllfluoreszenzmessungen mit der Bestimmung der In-vitro-Aktivitäten der Enzyme des C4-Zyklus, der Bestimmung der PEPC und RubisCO-Gehalte anhand von SDS-PAGE und Western-Blot-Analysen, und der Bestimmung des Deepoxidationsgrades des Xanthophyllzykluses ausgewählte Teilreaktionen der C4-Photosynthese genauer untersucht. Bei allen untersuchten C4- Arten konnte bei dem starken Trockenstress eine eindeutige nicht-stomatäre Limitierung der Photosyntheserate festgestellt werden. Bei der C3-Art P. bisulcatum sprechen die Ergebnisse für eine Mischung aus stomatären und nicht-stomatären Faktoren, die die Photosynthese unter Trockenstress limitieren. Hier konnte eine Abnahme des RubisCO-Gehalts unter Trockenstress beobachtet werden, was ein möglicher Faktor für eine nicht-stomatäre Limitierung der Photosyntheserate unter Trockenstress sein kann. Aufgrund der im Mittel reduzierten In-vitro-Aktivitäten der Enzyme des NADP-ME C4-Zyklus (PPDK, PEPC, NADP-MDH und NADP-ME) und einer Abnahme des PEPC- und RubisCOGehalts bei trockengestressten P. bulbosum im Vergleich zu der entsprechenden Kontrolle, konnte bei dem Vertreter des NADP-ME Subtyps die nicht-stomatäre Limitierung der Photosyntheserate auf eine generelle Abnahme der an der C4-Photosynthese beteiligten Enzyme zurückgeführt werden. Anhand der Bestimmung der In-vitro-Aktivitäten von P. maximum konnte gezeigt werden, dass die als Nebenweg beschriebene Decarboxylierung des CO2 über das NAD-ME in den BSZ, wahrscheinlich im gleichen Maße abläuft wie der von KANAI und EDWARDS (1999) beschriebene Hauptweg (Decarboxylierung in den BSZ durch die PCK). Die beobachtete nicht-stomatäre Limitierung der Photosyntheserate unter Trockenstress wurde auf eine mögliche Abnahme der In-vitro-Aktivitäten des sogenannten Nebenweges zurückgeführt. Bei P. miliaceum, dem repräsentativen Vertreter des NAD-ME Subtyps, zeigte keines der C4-Enzyme eine Abnahme der In-vitro-Aktivität, noch konnte eine Abnahme des RubisCO Gehalts unter Trockenstress im Vergleich zur Kontrolle beobachtet werden. Diese Beobachtung deutete auf eine In-Situ-Inhibierung eines der C4-Enzyme hin. Aus diesem Grund wurden in dieser Arbeit bei P. miliaceum weiterführende Untersuchungen zur posttranslationalen Regulation der PEPC durchgeführt. Obwohl die PEPC unter Trockenstress in phosphorylierter und somit aktiver Form vorliegt, konnte gezeigt werden, dass bei trockengestressten P. miliaceum eine In-Situ-Inhibition der PEPC aufgrund einer Feedback-Inhibition durch das unter Trockenstress in den MZ akkumulierende Transportmetabolit Aspartat wahrscheinlich ist und somit die Photosyntheserate limitieren kann.
Die allogene Stammzelltransplantation (SZT) nach Hochdosischemotherapie ist oft die einzige Therapieoption für pädiatrische Patienten, die an einer Hochrisikoleukämie erkrankt sind. Bei Patienten mit einer sehr schlechten Prognose und ohne Aussicht auf einen passenden Spender werden auch haploidente SZT durchgeführt, bei der meist die Eltern als Spender dienen. Aufgrund der HLA-(Human Leukocyte Antigen) Inkompatibilität zwischen Spender und Empfänger birgt die haploidente SZT jedoch einerseits das hohe Risiko einer Abstoßung des Transplantats sowie andererseits die Gefahr einer lebensbedrohlichen Spender-gegen-Wirt Reaktion (Graft-versus-Host Disease, GvHD). Das Risiko für die Entstehung einer GvHD kann durch die selektive Anreicherung von CD34 positiven Stammzellen deutlich verringert werden. Dabei werden unter anderem immunkompetente T-Zellen entfernt, die maßgeblich an der Entstehung einer GvHD beteiligt sind. Diese Zellen spielen aber auch bei der Immunrekonstitution und der Reaktivität gegen residuale leukämische Blasten (Graft-versus-Leukemia (GvL) Effekt) nach SZT eine wichtige Rolle. Aufgrund dessen ist die SZT mit CD34-selektionierten Präparaten häufig mit schweren Infektionen und einer erhöhten Rezidivrate verbunden. Des Weiteren wächst das Transplantat deutlich schlechter an. Immuntherapeutische Ansätze mit Spenderlymphozyten-Infusionen (Donor Lymphocyte Infusion - DLI) können das Anwachsen des Transplantates und den GvL-Effekt fördern, steigern jedoch gleichzeitig das Risiko einer GvHD. Um die Entstehung einer GvHD zu kontrollieren, ohne dabei auf den Nutzen einer DLI verzichten zu müssen, wurde bereits vor über 10 Jahren ein aussichtsreicher Ansatz entwickelt. Hierbei werden Spender-T-Zellen vor der Infusion in den Patienten genetisch so modifiziert, dass sie ein Selbstmordgen („suicide gene“) exprimieren. Im Falle einer aufkeimenden GvHD ermöglicht die Aktivierung des Suizidmechanismus eine gezielte Eliminierung der alloreaktiven Spender-T-Zellen. Das zurzeit am häufigsten verwendete Selbstmordgen leitet sich von der Thymidinkinase (TK) des Herpes Simplex Virus (HSV) ab. In einer Reihe von klinischen Studien mit erwachsenen Patienten konnte nach allogener SZT die prinzipielle Wirksamkeit dieses Sicherheitskonzeptes bereits gezeigt werden. Im Verlauf der klinischen Anwendung wurde allerdings eine Reihe von Nachteilen festgestellt. So führte zum Beispiel die Immunogenität der HSV-TK in immunkompetenten Patienten zur Abstoßung der modifizierten T-Zellen. Des Weiteren zeigte sich eine mangelnde Effizienz hinsichtlich des Abtötens der T-Zellen. Außerdem ist die für die T-Zell-Eliminierung benötigte Menge an Ganciclovir (10 mg/kg Körpergewicht pro Tag) stammzelltoxisch, wodurch die Immunrekonstitution nach SZT deutlich vermindert sein kann. Ferner wurde beobachtet, dass die ex vivo modifizierten und expandierten T-Zellen in ihrer biologischen Funktionalität deutlich eingeschränkt waren. Um den immuntherapeutischen Ansatz der DLI vor allem hinsichtlich der Sicherheit weiter zu verbessern, wurden in den vergangenen Jahren verschiedene Suizidstrategien entwickelt und die Bedingungen der ex vivo Modifikation optimiert. Eine aussichtsreiche Suizidstrategie verwendet das B-Zell-Oberflächenantigen CD20 in Kombination mit einem bereits für die Klinik zugelassenen, monoklonalen anti-CD20 Antikörper (Rituximab). Im Gegensatz zu TK-modifizierten Zellen, deren Beseitigung in vivo mehrere Tage in Anspruch nimmt, können CD20 positive B-Zellen innerhalb weniger Stunden eliminiert werden. Der tatsächliche Wirkmechanismus von Rituximab in vivo ist bisher noch nicht vollständig aufgeklärt, allerdings konnte in vitro bereits gezeigt werden, dass die Eliminierung CD20 positiver Zellen mittels eines komplement-abhängigen (CDC) und/oder eines antikörperabhängigen Zelltodes (ADCC) erfolgt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung und Optimierung eines CD20-abhängigen Suizid-Vektorsystems für die effiziente Transduktion von primären T-Zellen und deren selektive Eliminierung mittels Rituximab. Dazu mussten verschiedene Teilziele erreicht werden: (1) Da nur genetisch modifizierte T-Zellen, die in vivo abgeschaltet werden können, infundiert werden dürfen, ist eine ex vivo Anreicherung der CD20 positiven Zellen zwingend erforderlich. Dementsprechend sollte untersucht werden, inwieweit sich CD20 als Oberflächenmarker für eine MACS- (Magnetic Associated Cell Sorting) basierte Aufreinigung eignet und gegebenenfalls alternative Ansätze geprüft werden. (2) Weiterführend sollte ein Transduktionsprotokoll etabliert werden, welches hohe Transduktionseffizienzen ermöglicht und die Funktionalität der genetisch modifizierten T-Zellen weitestgehend erhält. (3) Bezüglich der Wirksamkeit des CD20-Rituximab-Systems liegen bisher nur veröffentlichte in vitro Daten vor. Daher sollte die Effektivität des neu entwickelten Suizidsystems in einem GvHD-ähnlichen Mausmodell in vivo charakterisiert werden. Zu Beginn dieser Arbeit wurde ein gammaretroviraler Vektor verwendet, welcher die Wildtypsequenz des CD20 Gens unter der Kontrolle eines vom Myeloproliferativen Sarcoma Virus (MPSV) abgeleiteten LTR (long terminal repeat) exprimiert (M71CD20). Mit diesem Vektor konnten mit Hilfe einer 3-Plasmid-Transfektion von 293T-Zellen lediglich Virusüberstände mit einem sehr niedrigen Titer hergestellt werden (<1 x 105/ml). Demzufolge war es zwar möglich die humane T-Zelllinie HuT 78 durch eine RetroNectin-assistierte Transduktion genetisch zu modifizieren, primäre T-Zellen hingegen konnten gar nicht transduziert werden. Aufgrund der schwachen Expression von CD20 an der Zelloberfläche zeigten die transduzierten HuT 78 Zellen nur eine geringe Empfindlichkeit gegenüber der Rituximab-vermittelten Lyse. Unter Verwendung von humanem Serum als Komplementquelle konnte eine maximale Lyse von 20% erreicht werden. Zusätzlich war die immunomagnetische Aufreinigung der CD20 positiven Zellen mit Hilfe des anti-CD20 MACS Systems durch eine geringe Ausbeute (<1%) und einen niedrigen Reinheitsgrad (<90%) geprägt. Um die Suizidgenstrategie für eine potentielle klinische Anwendung weiterzuentwickeln, wurde eine Codon-Optimierung des CD20 Transgens vorgenommen (CD20op). Die Optimierung zielte darauf ab, selten verwendete Basentripletts (Codons) innerhalb der CD20 cDNA mit von Säugetierzellen häufig genutzten zu ersetzen und somit die Translationsrate zu steigern. Ferner wurde der GC-Gehalt auf 60% erhöht und einige RNA-Instabilitätsmotive entfernt, um die Stabilität der mRNA zu verbessern. Aufgrund dieser Optimierungen wurde ein 35-facher Anstieg des Virustiters beobachtet. Dies ermöglichte die Transduktion von HuT 78 Zellen mittels einer standardmäßig durchgeführten Zentrifugationsmethode. Durchflusszytometrische Analysen zeigten, dass die Oberflächenexpression der Codon-optimierten CD20 Variante im Vergleich zur Wildtypsequenz um ein Dreifaches gesteigert werden konnte. Die verbesserte Oberflächenexpression erhöhte die Rituximab-vermittelte Lyse deutlich. In vitro konnten so bis zu 80% der transduzierten HuT 78 Zellen eliminiert werden. Die geringe Ausbeute der immunomagnetischen anti-CD20-Selektion konnte allerdings nicht verbessert werden. Weiterführend wurde daher im Rahmen dieser Arbeit der CD20op Vektor mit einem zweiten Oberflächenmarker kombiniert, um eine effiziente Anreicherung der genetisch modifizierten Zellen zu gewährleisten. Da im klinischen Maßstab bereits ein System zur Aufreinigung von Stammzellen über den Oberflächenmarker CD34 etabliert ist, wurde eine C-terminal verkürzte Variante des CD34 Moleküls (tCD34) als Selektionsmarker gewählt. Für eine optimale Koexpression von CD20op und tCD34 wurde eine Fusionskassette unter Verwendung des 2A-Elementes des Thosea asigna Virus generiert (T2A). Dieses Element ermöglicht die effiziente Expression beider Transgene von einem Vektor. Im Verlauf der Translation kommt es innerhalb des T2A-Elementes zu einem ribosomalen Sprung und folglich zur Generierung von zwei voneinander unabhängigen Proteinen. Mit dem neu klonierten bicistronischen Vektor M71CD20opT2AtCD34 konnten gute Virustiter im Bereich von 2,3 ± 0,9 x 106/ml erzielt werden. Dies ermöglichte die Transduktion von HuT 78 Zellen durch Zentrifugation. Mittels Durchflusszytometrie und protein-biochemischer Methoden konnte gezeigt werden, dass CD20op und tCD34 korrekt in der Zelllinie exprimiert wurden. Die Anreicherung von CD20op/tCD34 positiven HuT 78 Zellen mit Hilfe immunomagnetischer anti-CD34-Selektion resultierte in einer deutlich verbesserten Ausbeute; ebenso konnte eine Reinheit von über 98% erreicht werden. In vergleichenden Analysen wurde gezeigt, dass die CD20op/tCD34 transduzierten Zellen eine ähnliche Sensitivität gegenüber Rituximab aufwiesen wie Zellen, die mit dem monocistronischen M71CD20op Vektor transduziert wurden. Nachdem die Effizienz des bicistronischen Vektors in der humanen T-Zelllinie HuT 78 nachgewiesen werden konnte, wurden weiterführende Versuche mit humanen primären T-Zellen initiiert. Für die genetische Modifikation von primären T-Zellen mit gammaretroviralen Vektoren ist die Aktivierung und eine damit einhergehende Proliferation der T-Zellen zwingend erforderlich. Deswegen wurden zunächst die Aktivierungs- und Kulturbedingungen für eine optimale Transduktion der T-Zellen bestimmt. In dieser Arbeit wurden die T-Zellen ausschließlich mit anti-CD3/anti-CD28 Antikörpern stimuliert, die auf paramagnetischen Partikeln immobilisiert wurden und dadurch eine dreidimensionale Aktivierung ermöglichten. Diese Art der Stimulation wird bereits in klinischen Studien verwendet und sollte im Gegensatz zu löslichen Antikörpern die biologische Funktionalität der T-Zellen weitestgehend erhalten. Primäre T-Zellen wurden mittels RetroNectin-beschichteter Platten an zwei aufeinander folgenden Tagen transduziert, dabei konnte eine durchschnittliche Transduktionseffizienz von 65% erzielt werden. Die korrekte Expression von CD20op und tCD34 konnte, wie bereits für HuT 78 Zellen beschrieben, ebenfalls in primären T-Zellen nachgewiesen werden. Mittels immunomagnetischer anti-CD34 Selektion von CD20op/tCD34 positiven primären T-Zellen wurde eine sehr gute Anreicherung mit 98%iger Reinheit und einer Ausbeute von 45% erreicht. Unter Verwendung von humanen natürlichen Killerzellen konnte eine Sensitivität der genetisch modifizierten Zellen gegenüber Rituximab-vermittelter zellulärer Toxizität (ADCC) nachgewiesen werden. Da die Funktionalität der T-Zellen aufgrund der benötigten Aktivierung und der Expansion ex vivo beeinträchtigt sein kann, wurden im Rahmen dieser Doktorarbeit die T-Zellen phänotypisch und funktionell genauer charakterisiert. Es konnte durchflusszytometrisch gezeigt werden, dass die Mehrheit der naiven T-Zellen aufgrund der anti-CD3/anti-CD28 Aktivierung einen „central memory“ Phänotyp erworben hatte, welcher durch die Expression des „Homing“-Oberflächenmarkers CD62L (L-Selectin) und den Verlust des Markers CD45RA gekennzeichnet war. Es ist bekannt, dass dieser T-Zell-Phänotyp ein hohes alloreaktives Potential sowie eine lange Lebensdauer in vivo aufweist. Da für eine effektive Immunantwort CD4 positive Helferzellen und CD8 positive zytotoxische T-Zellen essentiell sind, wurde im Rahmen dieser Arbeit die Transduktionseffizienz in beiden Subpopulationen bestimmt. CD4 positive und CD8 positive T-Zellen ließen sich gleichermaßen gut transduzieren und es konnte demonstriert werden, dass ein physiologisches CD4/CD8 Verhältnis von 1-2 erhalten blieb. Im Vergleich dazu wurde in veröffentlichten Studien häufig eine verstärkte Transduktion von CD8 positiven T-Zellen verzeichnet, was zu einer Verschiebung des CD4/CD8 Verhältnisses und somit zu einer beeinträchtigten Immunantwort führte. Des Weiteren wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit in vergleichenden Analysen das alloreaktive Potential der genetisch modifizierten Zellen bestimmt. Zur Charakterisierung der Alloreaktivität wurde eine „Mixed Lymphocyte Reaction“ (MLR) verwendet. Hierfür wurden die T-Zellen mit CFSE (Carboxy-Fluorescein Succinimidyl Ester) gefärbt und mit bestrahlten, allogenen mononukleären Zellen aus peripherem Blut (PBMCs) kultiviert. Das Maß der Alloreaktivität ließ sich durch die Verringerung des CFSE Signals bestimmen. In einer Reihe von Experimenten konnte gezeigt werden, dass der prozentuale Anteil an alloreaktiven, transduzierten T-Zellen vergleichbar zu frisch isolierten T-Zellen war. Auch wenn ein geringeres Proliferationspotential der genetisch modifizierten T-Zellen festgestellt wurde, deutet dieses Ergebnis dennoch auf einen teilweisen Erhalt der T-Zell-Funktionalität hin. Im letzten Drittel der vorliegenden Arbeit wurde neben der Langzeitexpression von CD20op und tCD34 ebenfalls die Effizienz des CD20op-Rituximab-Systems in vivo untersucht. Hierfür wurde ein Rag-1 defizientes Mausmodell verwendet. Aufgrund der vorliegenden Lymphopenie ermöglichte dieses Modell ein gutes Anwachsen der Spenderlymphozyten. Reife murine T-Zellen wurden an zwei aufeinander folgenden Tagen mit dem gammaretroviralen Vektor M71CD20opT2AtCD34 transduziert und vor der Transplantation mittels immunomagnetischer anti-CD34 Selektion angereichert (Reinheit: 98%). Fünf Wochen nach Transplantation wurde ein Teil der Mäuse mit 150 μg Rituximab pro Maus i.v. behandelt, als Negativkontrolle wurde Mäusen ein monoklonaler anti-HER2/neu Antikörper (Herceptin) gespritzt, der in diesem Zusammenhang nicht relevant war. Das Behandlungsschema wurde in zwei darauf folgenden Wochen wiederholt. Jeweils zwei Tage nach der Antikörperinjektion wurde der Anteil an transduzierten Spenderzellen im peripheren Blut durchflusszytometrisch bestimmt. Bereits nach der ersten Rituximab-Injektion konnte eine 95%ige Depletion der genetisch modifizierten T-Zellen gezeigt werden. Die beiden nachfolgenden Injektionen beeinflussten den Anteil der modifizierten T-Zellen im peripheren Blut nur noch geringfügig. In Herceptin behandelten Mäusen blieb der Anteil an genetisch modifizierten Zellen konstant. Am Ende der Untersuchungen (Woche 17) wurde in Rituximab behandelten Mäusen nur noch ein minimaler Prozentsatz an modifizierten Zellen nachgewiesen, welche durch eine geringe Oberflächenexpression von CD20op und tCD34 charakterisiert waren. Abschließend konnte die effektive Eliminierung der T-Zellen aus der Milz und den Lymphknoten sowohl durchflusszytometrisch als auch per quantitativer PCR nachgewiesen werden. Die erfolgreiche Depletion der T-Zellen wurde im weiteren Verlauf der Arbeit durch eine Zeitkinetik nach Rituximab Gabe genauer untersucht. Bereits zwei Stunden nach der Injektion des Antikörpers konnte im peripheren Blut nur noch ein kleiner Anteil an genetisch modifizierten Zellen nachgewiesen werden. Dieses Ergebnis entspricht Daten aus klinischen Studien mit Rituximab und verdeutlicht das Sicherheitspotential des CD20-Rituximab-Systems, geprägt durch eine schnelle und effiziente Eliminierung von reaktiven T-Zellen. Der adaptive Transfer von Spender T-Zellen führte in den Empfängertieren zur Entwicklung einer massiven Kolitis, die durch Gewichtsabnahme und Durchfall charakterisiert war. In dieser Arbeit konnte dies durch die Rituximab-vermittelte Eliminierung der reaktiven Zellen verhindert werden; Rituximab behandelte Mäuse zeigten keine Kolitissymptome, wohingegen Herceptin behandelte Tiere stetig an Gewicht verloren. Diese Gewichtsabnahme konnte zu einem späteren Zeitpunkt auch in der Herceptin Gruppe nach Behandlung mit Rituximab gestoppt werden. Außerdem wurde daraufhin in diesen Tieren eine schnelle Gewichtszunahme von bis 34% beobachtet. Die erfolgreiche Depletion der CD20op/tCD34 positiven T-Zellen stellte in den Rag-1 defizienten Empfängertieren vorübergehend erneut eine Lymphopenie her. Dabei kam es aber auch zur Expansion nichttransduzierter T-Zellen, welche mit einem Anteil von 2% im CD34-selektionierten T-Zell-Transplantat vertreten waren. Da diese T-Zellen nicht durch Rituximab eliminiert werden konnten, entwickelten die Empfängertiere unweigerlich Kolitissymptome. Mittels quantitativer PCR wurde anschließend nachgewiesen, dass es sich bei den in vivo expandierten Zellen zum Großteil um nicht-transduzierte T-Zellen handelte, da keine proviralen Integrationen nachgewiesen werden konnten. Das in dieser Arbeit verwendete Mausmodell lieferte wichtige Informationen hinsichtlich der Langzeitexpression der beiden Transgene sowie der Effizienz des CD20-Rituximab-Suizidsystems. Auch wenn die in dem verwendeten Modell induzierte Kolitis als Äquivalent einer GvHD angesehen werden kann, sollte die Effizienz des entwickelten Systems in einem klassischen bzw. haploidenten GvHD Modell verifiziert werden. Darauf aufbauend könnten dann prä-klinische Studien zur Effektivität und Sicherheit des optimierten Suizidansatzes initiiert werden. Zusammenfassend bietet das neue, in dieser Arbeit stufenweise optimierte CD20-Rituximab-System eine vielversprechende Alternative zu dem HSV-TK System. Im Hinblick auf die derzeitigen Entwicklungen bezüglich der Funktionalität der genetisch modifizierten Zellen und der schnellen Beseitigung durch Rituximab wäre die Weiterentwicklung des CD20op/tCD34 Ansatzes zur effektiven Kontrolle einer GvHD nach DLI im Rahmen einer allogenen Stammzelltransplantation wünschenswert.
Die Gattung Palaua gehört zur Tribus der Malveae (Malvaceae, Malvoideae). Sie umfasst fünfzehn einjährige oder ausdauernde krautige Arten, die für die Nebeloasen („Lomas“, „Desierto Florido“) der Küstenwüste Perus und Chiles endemisch sind. Abweichend von den meisten anderen Gattungen der Malveae besitzt Palaua (mit Ausnahme von P. sandemanii) unregelmäßig übereinander angeordnete Merikapien. Dieses Merkmal ist ansonsten nur von den beiden altweltlichen Gattungen Kitaibela und Malope bekannt, weshalb diese früher mit Palaua in der Tribus Malopeae vereint wurden. Palynologische, cytogenetische und molekulare Analysen zeigten jedoch, dass die Malopeae eine polyphyletische Gruppe bilden und dass die in Südamerika verbreiteten Gattungen Fuertesimalva und Urocarpidium die nächsten Verwandten von Palaua sind. Ebenso wie im Aufbau des Gynözeums unterscheidet sich Palaua auch durch das Fehlen eines Epicalyx vom Großteil der Malveae, einschließlich ihrer Schwestertaxa. Seit der Erstbeschreibung der Gattung durch Cavanilles im Jahr 1785 sind nur zwei detaillierte Bearbeitungen der Gattung Palaua veröffentlicht worden. Die umfassendste davon stammt von Ulbrich (1909). Auf der Grundlage der umfangreichen Aufsammlungen von August Weberbauer beschrieb er mehrere neue Arten in seinem Werk „Malvaceae austro-americanae imprimis andinae“, das er in nachfolgenden Jahren (1916, 1932) vervollständigte. Die zweite bedeutsame Bearbeitung ist die Revision der Gattung durch Macbride (1956) in der „Flora of Peru“. Seit den 50er Jahren des vorherigen Jahrhunderts kamen jedoch zahlreiche Aufsammlungen hinzu, insbesondere durch den peruanischen Botaniker Ramón A. Ferreyra (1912-2005), sowie durch Ernesto Günther (1870-?) zusammen mit Otto Buchtien (1859-1946), Gerd K. Müller (1929-) und Michael O. Dillon (1947-), so dass eine Neubearbeitung von Palaua erforderlich wurde. Darin bestand das Hauptziel der hier vorgestellten Dissertation. Für die Revision der Gattung wurden 618 Herbarbelege der wichtigsten Herbarien morphologisch untersucht. In den Jahren 2002 und 2003 wurden während mehrmonatiger Geländearbeiten in den Lomas-Standorten Perus und Chiles eigene botanische Aufsammlungen durchgeführt sowie Daten zur Verbreitung der Arten und ihrer Ökologie erfasst. Des Weiteren wurde aus dem mitgebrachten Samenmaterial eine mehrere Arten einschließende Lebendsammlung angelegt, mit deren Hilfe detaillierte Untersuchungen zur Blütenmorphologie und Karyologie realisiert werden konnten. Besonders schwierig gestaltete sich die Bearbeitung nomenklatorischer Fragestellungen, da viele der in Berlin (B) aufbewahrten Typusbelege von Weberbauer im Zweiten Weltkrieg zerstört wurden und somit eine Identifizierung vieler Arten problematisch war. Auch die Ermittlung des Typusbelegs der Gattung, den Cavanilles für seine Beschreibung vorliegen hatte, war mühsam. Neben dem Studium der Originalbelege und Protologe mussten auch die historischen Begebenheiten rekonstruiert und Reiseberichte zu den Aufsammlungen durchgesehen werden, um unter anderem den Holotypus der Gattung identifizieren zu können. Die eigenen taxonomischen Studien führten zur Festlegung von insgesamt 8 Lectotypen, 3 Epitypen and 2 Ikonotypen. Im Rahmen der morphologischen Untersuchungen wurden sämtliche taxonomisch relevanten Merkmale detailliert erfasst, einschließlich der verschiedenen Behaarungstypen. Neben den für die Malvaceen bekannten Sternhaaren, sind hier auch Drüsenhaare für Palaua beschrieben und charakterisiert worden. Die anatomischen Studien konzentrierten sich auf Blatt- und Samenmerkmale. Zusätzlich zu den morphologisch-anatomischen Studien wurden molekularsystematische Analysen durchgeführt. Zwei Methoden kamen dabei zur Anwendung: DNA-Sequenzierung und Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP). Letztere wurde eingesetzt, um insbesondere die Verwandtschaftsverhältnisse junger Taxa, die sich mit DNA-Sequenzdaten kaum auflösen lassen, zu rekonstruieren. In umfangreichen Versuchen stellte sich jedoch heraus, dass diese Methode keine reproduzierbaren Ergebnisse hervorbrachte, vermutlich bedingt durch den sehr hohen Polysaccharidgehalt der DNA-Template, wie es von Malvaceen her bekannt ist. Selbst die Erprobung zahlreicher Reinigungsschritte und –methoden ergab kein zufriedenstellendes Resultat. Für die phylogenetische Rekonstruktion wurden daher ausschließlich DNA-Daten verwendet, und zwar Kern-DNA (Internal Transcribed Spacer, ITS) und Plastiden-DNA (psbAtrnH Intergenic Spacer). Andere getestete Marker, wie z.B. die trnL-F-Region, wiesen zu wenig phylogenetisch informative Merkmale auf. Die morphologischen Analysen ergaben, dass Merkmale wie die Behaarung der Kelch- und Laubblätter, die Blattform und die Größe der Blüten besonders hilfreich für die Abgrenzung der Arten sind. Im Gegensatz zu anderen nah verwandten Gattungen ist die Form der Merikarpien in Palaua relativ uniform und daher als diakritisches Merkmal ungeeignet. Die Größe der Blüte nimmt in der Regel mit der Anzahl der Staubgefäße und Merikarpien zu. Die Palaua-Arten zeigen einige Anpassungen an ihren extrem trockenen Lebensraum. Die meisten Arten sind Annuelle und vollziehen eine rasche Entwicklung während der kurzen Zeit, in der ausreichend Feuchtigkeit verfügbar ist. Bei solchen Pflanzen findet man als Anpassung häufig eine Tendenz zur vermehrten Samenproduktion. In diesem Zusammenhang ließe sich auch die innerhalb des Verwandtschaftskreises ungewöhnliche Stellung der Merikarpien bei Palaua interpretieren, mit der es den Arten gelingt, mehr Samen als bei Arten mit einreihiger Merikarpienanordnung zu produzieren. Als weitere Anpassung findet man bei den ausdauernden Arten größtenteils eine sehr dichte Behaarung, wobei die Sternhaare mehrjähriger Arten wesentlich mehr Strahlen besitzen als die bei den einjährigen Arten. In der hier vorgestellten Revision der Gattung werden 15 Arten anerkannt: P. camanensis, P. dissecta, P. guentheri, P. inconspicua, P. malvifolia, P. modesta, P. mollendoensis, P. moschata, P. rhombifolia, P. sandemanii, P. tomentosa, P. trisepala, P. velutina, P. weberbaueri sowie die neu zu beschreibende P. spec. nov. Die morphologisch abweichende P. sandemanii wird aufgrund der molekularen Analysen ebenfalls zu Palaua gestellt. Die auch in der jüngeren Literatur meist als getrennte Arten aufgefassten P. concinna und P. moschata lassen sich nach Durchsicht des umfangreichen Materials nicht mehr als eigenständige Arten aufrechterhalten. Die vormals als chilenischer Endemit behandelte P. concinna wird hier in die Synonymie von P. moschata gestellt. Auch die peruanische P. micrantha var. hirsuta wurde in die Synonymie der zuvor rein chilenischen P. modesta verwiesen, was bedeutet, dass sich das Vorkommen von P. modesta nun auch auf Peru ausdehnt. Auf infraspezifischem Niveau wurden einige Varietäten und eine Form neu beschrieben, um die im Sammlungsmaterial vorhandene morphologische Variabilität besser zu gliedern. Das ist der Fall bei P. dissecta (2 Varietäten), P. tomentosa (1 Varietät), P. weberbaueri (1 Varietät) und P. mollendoensis (1 Form). Die neuen Taxa werden an anderer Stelle gültig publiziert. Die von Baker (1890) and Ulbrich (1909) gewählte infragenerische Klassifikation mit der Einteilung in die Sektionen Annuae (einjährige Arten) und Perennes (mehrjährige Arten) erweist sich als nicht haltbar. Weder die morphologischen noch die molekularen Daten bieten hierfür Unterstützung. Auch die von Hochreutiner (1956) vorgeschlagene Ausgliederung von P. trisepala als eigene Untergattung Rauhia, aufgrund des Vorkommens von lediglich drei statt fünf Kelchblättern, erscheint nicht sinnvoll. Abgesehen von ihrer reduzierten Kelchblattzahl (3 statt 5 Kelchblätter) ist diese Art morphologisch P. moschata und P. velutina sehr ähnlich. Die Aufstellung einer eigenen Untergattung würde die tatsächlichen Verwandtschaftsverhältnisse verwischen und vermutlich eine paraphyletische Einheit schaffen. Im Vergleich zur Anzahl der Kelchblätter sind Merkmale wie der Aufbau der Infloreszenzen, die Blütengröße und -farbe, sowie die Blattmorphologie (geteilte vs. ungeteilte Blätter) nützlicher für eine infragenerische Unterteilung. Die Form der Stipeln, die von Ulbrich (1909) für eine weitere Unterteilung seiner Sektionen verwendet wurde, ist weniger für eine infragenerische Gliederung als für die Abgrenzung mancher Arten geeignet. Formell wurde in der hiesigen Arbeit auf eine infragenerische Unterteilung verzichtet, da zunächst abgewartet werden soll, ob weiterführende molekularsystematische Untersuchungen nicht doch zu einer besseren Auflösung und auch Unterstützung der basalen Knoten der Palaua-Phylogenie führen. Andernfalls steht zu befürchten, dass wiederum künstliche Sippen geschaffen werden. Nichtsdestotrotz, sprechen die eigenen morphologischen und zum Teil auch die molekularen Daten für eine Gliederung der Gattung in drei taxonomische Einheiten (siehe unten). Die Ergebnisse der molekularen Analysen (kombinierte Analyse von ITS- und psbA-trnHSequenzen) ergaben drei mehr oder weniger gut gestützte Kladen innerhalb einer sehr gut gestützten monophyletischen Palaua. Interessanterweise bildeten die Arten P. inconspicua und P. modesta eine Klade (88% Jackknife-Unterstützung, JK), die die Schwestergruppe zu den restlichen Arten der Gattung darstellt. Beide Arten haben eine von der restlichen Gattung abweichende Blütenmorphologie (kleine Petalen, weniger Merikarpien) und die razemösen Infloreszenzen enthalten neben Einzelblüten in den Achseln der Trägblätter auch 2-4-blütige Teilinfloreszenzen, an denen die Blüten kein Tragblatt aufweisen. Die zweite Klade (JK 97%) beinhaltet die Arten des P. dissecta-Komplexes, dessen Arten sich durch tief geteilte Blätter und große, auffällig rosarot bis violett gefärbte Blüten mit zahlreichen Merikarpien auszeichnen. In der dritten Klade (JK 73%) bildet P. guentheri die Schwestergruppe zu den restlichen Arten. Die hier vereinten Arten sind durch den Besitz ungeteilter Blätter und meist großer, auffällig rosarot bis violett gefärbter Blüten mit zahlreichen Merikarpien gekennzeichnet. Eine Ausnahme bildet P. guentheri, die geteilte Blätter hat und von daher Übereinstimmungen mit den Arten um P. dissecta aufweist. Sie weicht jedoch von den Arten des P. dissecta-Komplexes aufgrund ihrer geringeren Blütengröße und der geringeren Merikarpienanzahl ab. Außerdem sind die Blätter meist stärker reduziert und weniger regelmäßig geteilt als jene. Allerdings bedarf die Stellung von P. guentheri innerhalb der Gattung noch einer eingehenderen Überprüfung mit zusätzlichen (molekularen) Daten, da die Unterstützung für diese Klade vergleichsweise moderat ausfällt. Interessanterweise schließt diese Klade auch die aberrante P. sandemanii ein. Eine phylogenetische Rekonstruktion der Karpellanordnung ergab, dass die einreihige Anordnung der Karpelle in P. sandemanii vermutlich sekundär in Palaua entstanden ist. Allerdings zeigten Hypothesentests (Templeton-Test, Shimodaira-Hasegawa-Test), dass die Datengrundlage nicht ausreichend robust ist, um auch die Alternativhypothese einer sekundären Entstehung der unregelmäßig übereinander angeordneten Karpelle, wie sie die restlichen Arten der Gattung kennzeichnen, zu verwerfen. Innerhalb der Integrifolia-Klade lassen sich außerdem zwei Gruppen von Arten morphologisch deutlich unterscheiden. Die erste Gruppe besteht aus den einjährigen P. malvifolia und P. rhombifolia, die sich durch ihr fast kahles Indumentum auszeichnen und in Nord- bis Zentral-Peru vorkommen. Die zweite Gruppe, gebildet von den ausdauernden P. moschata, P. trisepala und P. velutina, ist durch ein samtiges Indumentum gekennzeichnet. Während sich P. moschata über das gesamte Verbreitungsgebiet der Gattung erstreckt, kommen die anderen Arten nur in Südperu vor. Die Chromosomenzahl von Palaua ist ein wichtiges Merkmal und diente Bates (1968) für deren Zuordnung zur Sphaeralcea-Allianz. Bis dato sind Chromosomenzählungen nur für zwei Arten bekannt gewesen: P. rhombifolia und P. moschata (beide mit 2n = 10 Chromosomen). In dieser Arbeit wurden weitere Zählungen durchgeführt und es wurde bestätigt, dass es neben diploiden auch tetraploide Arten mit 2n = 20 Chromosomen gibt. Polyploidie scheint dabei auf die ausdauernden Arten beschränkt zu sein. In manchen Arten, insbesondere in denjenigen des P. dissecta-Komplexes und in P. tomentosa, findet man eine ausgeprägte phänotypische Variabilität, die die Abgrenzung derselben stark erschwert. Ohne die Ursachen abschließend klären zu können, erscheint diese Variabilität zumindest teilweise als Ergebnis von Hybridisierung, Introgression und Polyploidisierung zu sein. In Bezug auf die Biogeographie der Gattung, zeigt sich, dass 11 Palaua-Arten endemisch für Peru sind und 4 Arten auch in Chile vorkommen. Das Verbreitungszentrum von Palaua ist das Gebiet der Lomas im Süden Perus (Departments Arequipa, Moquegua, Tacna), in dem 12 der 15 Arten auftreten. Die Blütezeit der Palaua-Arten variiert von Jahr zu Jahr, abhängig davon, wie viel Nebelfeuchtigkeit in der südhemisphärischen Winter-/Frühlingszeit für die Pflanzen zur Verfügung steht. Die Entstehung der Nebel variiert außerdem von Norden nach Süden, so dass sich die Blühphasen entlang dieses Gradienten verschieben. So liegt die Blütezeit in Nordperu zwischen Juli und August, in Zentral-Peru zwischen August und September und in Südperu und Chile zwischen Oktober und November. Abweichungen von diesem Schema entstehen vor allem in El Niño-Jahren, in denen auch während des südhemisphärischen Sommers die Lomaspflanzen blühen. Die Lomasvegetation ist eine bedrohte Pflanzenformation, deren Artenvielfalt bisher aber nur in Form eines recht kleinen Naturreservats geschützt wird. Da sich viele Lomasstandorte in der Nähe von Siedlungen befinden, sind etliche der lokal nur begrenzt vorkommenden Arten in ihrem Bestand bedroht. Dies betrifft insbesondere P. rhombifolia und P. malvifolia, deren Verbreitungszentrum im Gebiet der Hauptstadt Lima liegt. Eigene Beobachtungen am Standort haben zudem bestätigt, dass einige Populationen dieser Arten durch von Käfern verursachter Herbivorie nahezu vollständig zerstört werden. Weitere Schutzmaßnahmen zum Erhalt der Palaua-Arten (wie auch der anderen Lomas-Arten) wären daher dringend geboten.
Erkrankungen des hämatopoietischen Systems treten oft als Folge balancierter chromosomaler Translokationen auf. Dabei ist das MLL Gen auf Chromosom 11 Bande q23 in zahlreiche reziproke chromosomale Translokationen involviert. Alle diese Veränderungen sind entweder mit einer akuten myeloischen oder lymphatischen Leukämie assoziiert. Translokationen mit Beteiligung des MLL Gens - mit Ausnahme der Translokation t(9;11) - werden aufgrund ihrer schlechten Therapierbarkeit und schlechten Prognose als Hochrisiko- Leukämien eingestuft. Das häufigste Partnergen ist das AF4 Gen (42% aller MLL Translokationen) auf Chromosom 4 Bande q21. Die daraus resultierende Translokation t(4;11) ist mit einer akuten lymphatischen Leukämie (pro-B ALL) assoziiert und tritt gehäuft bei Säuglingen und Kleinkindern auf. Das Resultat der Translokation t(4;11) ist letztendlich die Entstehung zweier reziproker Derivatchromosomen, die die beiden Fusionsgene MLL•AF4 und AF4•MLL kodieren. Welcher Mechanismus die Entstehung der Leukämie hervorruft, konnte bis heute nicht ausreichend geklärt werden. Basierend auf den Daten anderer MLLassoziierter Translokationen, dass ausschließlich das Derivat 11 Fusionsprotein onkogene Effekte vermittelt, wurde das Fusionsprotein MLL•AF4 intensiv erforscht. Erst Ende 2008 gelang es einer amerikanischen Arbeitsgruppe in einem Mll•AF4 knock-in Mausmodell den Krankheitsphänotyp einer AML bzw. einer prä-B ALL auszulösen. Allerdings exprimieren 80% aller t(4;11)-Patienten auch das reziproke AF4•MLL Fusionstranskript und die restlichen 20% tragen komplexe Aberrationen zwischen MLL, AF4 und einem dritten oder sogar einem vierten Partnergen. Deshalb befassen sich die Studien unserer Arbeitsgruppe hauptsächlich mit dem reziproken AF4•MLL Fusionsprotein. Die Ergebnisse dieser Studien zeigen, dass das AF4•MLL Fusionsprotein in den Zellen akkumuliert und dadurch onkogene Ereignisse auslöst, welche letztendlich in der Wachstumstransformation der Zellen resultieren. Aufgrund dieser Daten war davon auszugehen, dass das AF4•MLL Fusionsprotein ebenfalls einen entscheidenden Beitrag bei der Entstehung der Leukämie leistet. Um das leukämogene Potential der beiden Fusionsproteine MLL•AF4 und AF4•MLL in einem Mausmodell weiter zu untersuchen, wurde zunächst ein retrovirales Transduktionssystem in BA/F3-Zellen etabliert. Dabei wurden BA/F3-Zellen sowohl einzeln mit MLL•AF4 oder AF4•MLL als auch mit beiden Fusionsgenen der Translokation t(4;11) cotransduziert. Nachdem die Funktionalität der beiden Expressionskassetten, durch full-length Integration und durch Transkription erfolgreich nachgewiesen werden konnte, erfolgten erste Transduktions-/Transplantationsexperimente in Mäusen. Dafür wurden Lin-/Sca-1+ aufgereinigte Knochenmarkzellen mit retroviralen Überständen von MLL•AF4 und AF4•MLL einzeln- als auch co-transduziert. Mäuse denen MLL•AF4- oder Mock-transduzierte Lin-/Sca-1+-Zellen transplantiert wurden, entwickelten über einen Beobachtungszeitraum von 13 Monaten keinerlei Anzeichen einer leukämischen Erkrankung. Im Gegensatz dazu resultierte die Transplantation von AF4•MLLoder co-transduzierten Lin-/Sca-1+-Zellen in der Entwicklung einer leukämischen Erkrankung innerhalb von 7 Monaten. Anhand pathologischer Parameter, sowie durch histochemische, molekulare als auch durchflusszytometrische Analysen konnten drei verschiedene Immunophänotypen identifiziert werden. Die Expression des Fusionsproteins AF4•MLL resultierte in der Ausprägung des Phänotyps einer pro-B ALL oder einer B/T biphänotypischen akuten Leukämie (B/T BAL). In Anwesenheit beider Fusionsproteine der Translokation t(4;11) entwickelte sich ebenfalls eine B/T BAL oder einer Mixed Lineage Leukemia (MLL). Retransplantationsexperimente mit den primären leukämischen Blasten zeigten, dass die drei verschiedenen Krankheitsphänotypen stabil transplantierbar sind, wobei sich die Latenzzeit erheblich verkürzte. Damit wurde zum ersten Mal der Beweis erbracht, dass das Fusionsprotein AF4•MLL auch allein ohne die Gegenwart des Fusionsproteins MLL•AF4 in der Lage ist eine leukämische Erkrankung auszulösen. Aufgrund dieser Daten, vorausgehenden Studien unserer Arbeitsgruppe sowie den Studien zum Fusionsprotein MLL•AF4 ist davon auszugehen, dass der pathomolekulare Mechanismus der Translokation t(4;11) auf zwei Onkoproteinen basiert.
Außergewöhnliche Fortschritte in der Human- und Mausgenetik führten zur Charakterisierung einer Vielzahl von krankheitsrelevanten Mutationen, die entweder natürlich auftreten oder über genetische Manipulation im Tiermodell erzeugt wurden. Die nahezu vollständige Sequenzierung der Genome von Mensch und Maus im Rahmen der internationalen Sequenzierungsprojekte ebnete den Weg für groß angelegte, internationale Mutagenese-Programme, die zum Ziel haben jedes einzelne Gen funktionell zu charakterisieren. Der hierfür bevorzugte Organismus ist die Maus, weil der Aufbau des Mausgenoms dem menschlichen Genom sehr ähnlich ist und weil für die Maus embryonale Stammzellen (mES Zellen) existieren, die ohne Einschränkung ihres pluripotenten Status in Gewebekultur genetisch manipuliert werden können. Darüber hinaus lassen sich mES Zellen über Blastozysteninjektion in Mäuse konvertieren. Dadurch können die Folgen von in vitro gesetzten Mutationen im Kontext eines Gesamtorganismus analysiert werden. Die so genannte „Knock out“ Maus ist ein weit verbreitetes Tiermodell, das nicht nur Genfunktionen in vivo offenbart, sondern auch die Modellierung humaner genetischer Erkrankungen ermöglicht. Außergewöhnliche Fortschritte in der Human- und Mausgenetik führten zur Charakterisierung einer Vielzahl von krankheitsrelevanten Mutationen, die entweder natürlich auftreten oder über genetische Manipulation im Tiermodell erzeugt wurden. Die nahezu vollständige Sequenzierung der Genome von Mensch und Maus im Rahmen der internationalen Sequenzierungsprojekte ebnete den Weg für groß angelegte, internationale Mutagenese-Programme, die zum Ziel haben jedes einzelne Gen funktionell zu charakterisieren. Der hierfür bevorzugte Organismus ist die Maus, weil der Aufbau des Mausgenoms dem menschlichen Genom sehr ähnlich ist und weil für die Maus embryonale Stammzellen (mES Zellen) existieren, die ohne Einschränkung ihres pluripotenten Status in Gewebekultur genetisch manipuliert werden können. Darüber hinaus lassen sich mES Zellen über Blastozysteninjektion in Mäuse konvertieren. Dadurch können die Folgen von in vitro gesetzten Mutationen im Kontext eines Gesamtorganismus analysiert werden. Die so genannte „Knock out“ Maus ist ein weit verbreitetes Tiermodell, das nicht nur Genfunktionen in vivo offenbart, sondern auch die Modellierung humaner genetischer Erkrankungen ermöglicht. Mit dem Ziel Kranheitsgene ihren Signalwegen zuzuordnen wurde in dieser Dissertation ein in situ Proteinmarkierungssystem entwickelt, das Hochdurchsatz-proteomik in mES Zellen ermöglicht. Das System beinhaltet die Einführung einerProteinmarkierungskassette in mES Zellen, die konditionale FlipROSAβgeo-Genfal-lenintegrationen in proteinkodierenden Genen enthalten. Weil die Konditionalität der FlipROSAβgeo-Genfallenkassette auf einem sequenzspezifischen Rekombinations-mechanismus beruht, kann diese postinsertionell über Rekombinase-vermittelten Kassettenaustausch (RMCE) durch eine Proteinmarkierungskassette ersetzt werden. Das hierfür entwickelte Konstrukt entspricht einem durch 5’ Spleißakzeptor- und 3’ Spleißdonorsequenzen definierten dizistronischen Exon, in dem ein Hygromyzin-Resistenzgen über eine P2A Polyproteinspaltungssequenz mit einem für das egfp (enhanced green fluorescent protein) kodierenden nLAP-Tag (N-terminal localization and affinity purification) verbunden ist. Eine erste Validierung dieses Exons in einem retroviralen Genfallenansatz ergab, dass sämtliche in Hygromyzin selektierte und auf DNA-Kassettenintegrationen untersuchte Klone nLAP-markierte Proteine exprimierten. Im Folgenden wurden in den GGTC (German Gene Trap Consortium) und EUCOMM (European Conditional Mouse Mutagenesis Project) mES Zellressourcen Genfallenintergationen identifiziert, die sich für eine RMCE vermittelte, N-terminale in situ Proteinmarkierung eignen. Als kompatibel wurden Genfallenklone klassifiziert, die eine FlipROSAβgeo-Integration im ersten Intron eines proteinkodierenden Gens aufweisen, wobei diese Integration sowohl hinter einem ersten nichtkodierenden, als auch hinter einem ersten kodierenden Exon liegen kann. Allerdings darf im letzteren Fall die kodierende Sequenz keine funktionale Domäne enthalten und muss kurz genug sein, um bei Verlust nicht mit der endogenen Proteinfunktion zu interferieren. Auf diesen Kriterien basierend wurden in den GGTC und EUCOMM Ressourcen 25.130 Proteinmarkierungs-kompatible Genfallenklone identifiziert, die 3.695 mutierten Genen entsprechen. Hiervon wurden acht für die Validierung der RMCE-vermittelten Proteinmarkierungsstrategie ausgewählt. In jedem Fall gelang es die Genfallen-kassette mit dem Proteinmarkierungsexon zu ersetzten. Sowohl der Genfallen-, als auch der RMCE-Proteinmarkierungsansatz führte ohne Ausnahme zur Expression nLAP-Tag markierter Proteine, wobei in allen 13 untersuchten Klonen die Größe der markierten Proteine derjenigen der entsprechenden nativen Proteine mit zusätzlichem Marker entsprach. Weitere Untersuchungen haben gezeigt, dass die physiologische Expression der markierten Proteine sich von denen der Wildtypproteine in der Regel nicht unterscheidet und für Lokalisations- und massenspektrometrische Interaktionsstudien ausreicht. Darüber hinaus spiegelten 90% der hier untersuchten markierten Proteine das subzelluläre Lokalisationsmuster der entsprechenden nativen Proteine wider. Ähnlich verhielt es sich mit den Interaktionspartnern der jeweiligen Proteine, die sich aus bereits bekannten, aber auch noch bisher unbekannten Proteinen zusammensetzen. Insgesamt wurden in dieser Dissertation die Voraussetzungen zu einer Hochdurchsatzproteomanalyse in mES Zellen geschaffen. Während der RMCE-Ansatz die Markierung von über 3.600 Proteinen in mES Zellen ermöglicht, eignet sich der Genfallenansatz neben der Proteinmarkierung in murinen auch für die Markierung von Proteinen in humanen Zellen. In dieser Hinsicht ist die Markierung von Proteinen in humanen ES Zellen und in reprogrammierten Stammzellen (iPS) von Patienten mit unterschiedlichsten Erkrankungen besonders attraktiv, weil damit sowohl Spezies- als auch Krankheitsspezifische Unterschiede im Ablauf individueller Signaltransduktionskaskaden definiert werden können.
Riboswitche – Vorbilder für die Konstruktion synthetischer RNA Schalter Riboswitche sind natürliche RNA Regulatorelemente. Sie sind in den nicht kodierenden Regionen von messenger RNAs (mRNAs) lokalisiert und beeinflussen die Expression nachfolgender Gene. Riboswitche bestehen aus zwei Domänen. Die Binde- oder Aptamerdomäne bildet eine Bindetasche, die einen Liganden ohne die Hilfe zusätzlicher Faktoren hoch spezifisch und affin binden kann. Die zweite Domäne, die sogenannte Expressionsplattform, interpretiert den Bindestatus der Aptamerdomäne und beeinflusst die Expression der nachfolgenden Gene. Liganden sind meist kleine, organische Moleküle wie Nukleotide, Aminosäuren oder Vitamine. Riboswitche regulieren Gene, die für die Synthese oder Verwertung ihres jeweiligen Liganden in der Zelle von Bedeutung sind. Kontrolliert wird die Genexpression meist durch Transkriptionstermination oder durch Maskierung der ribosomalen Bindestelle (SD = Shine Dalgarno Sequenz). Auch Eukaryoten nutzen das Prinzip der direkten RNA-Ligand-Interaktion zur Genregulation, wenn gleich in geringerem Ausmaß. In Pilzen und Pflanzen wird durch Ligandenbindung alternatives Spleißen von prä-mRNAs induziert, was entweder zur mRNA Degradation durch alternative Polyadenylierung oder der Repression der Translation durch alternative Leserahmen (uORFs) führt. Charakteristisch für eine Regulation über Riboswitche ist die direkte Wechselwirkung des niedermolekularen Liganden mit der RNA. In trans kodierte Proteinfaktoren sind aufgrund dieser direkten Bindung nicht notwendig. Dies macht natürliche Riboswitche zu geeigneten Vorbildern für die Entwicklung künstlicher RNA Schalter. Synthetische Riboswitche Aptamere sind kleine, synthetisch hergestellte, einzelsträngige RNA oder DNA Moleküle, die hochaffin und sehr spezifisch ein Zielmolekül binden können. Man kann Aptamere gegen nahezu jedes Molekül der Wahl über einen Prozess der in vitro Selektion gewinnen (SELEX = systematic evolution of ligands by exponential enrichment). Eine Eigenschaft der meisten Aptamere ist, dass sie ihre endgültige Struktur erst in Gegenwart des spezifischen Liganden ausbilden („induced fit“). Dies kann ausgenutzt werden, um RNA Aptamere als regulatorische Elemente einzusetzen. Hierzu inseriert man Aptamere in nicht translatierte Regionen einer mRNA. In Abwesenheit des Liganden bildet sich die Struktur nur teilweise aus und interferiert nicht mit zellulären Funktionen. Erst im Komplex mit einem Liganden kommt es zur effizienten Beeinflussung der Genexpression. Inseriert man ein regulatorisch aktives Aptamer in den 5’ nicht translatierten Bereich (5’UTR) einer eukaryotischen mRNA, erlaubt das Aptamer in der nicht ligandengebundenen Form die Translation nachfolgender Gene. Erst der Aptamer-Ligand-Komplex interferiert mit der Translationsinitiation. Ist das Aptamer nahe der cap-Struktur positioniert, behindert es die initiale Bindung des Ribosoms an die mRNA. Bei einer weiter stromabwärts gelegenen Insertion interferiert es mit dem Scannen der kleinen ribosomalen Untereinheit nach dem Startcodon. Die beste Regulationseffizienz wird hierbei bei einer Insertion direkt vor dem Startcodon erreicht. Es zeigte sich jedoch, dass nur eine sehr geringe Anzahl an Aptameren in der Lage ist, als RNA Schalter aktiv zu sein. Dies führte dazu, dass bis heute nahezu alle Systeme entweder auf dem Theophyllin oder dem Tetrazyklin Aptamer basieren. Ziele dieser Arbeit In dieser Arbeit sollte untersucht werden, warum nur wenige Aptamere regulatorisch aktiv sind und was diese von inaktiven Varianten unterscheidet. Dafür wurden ein Tetrazyklin und ein Neomycin Aptamer detailliert charakterisiert. Desweiteren wurden neue RNA-basierte Regulationssysteme aufgebaut und ihr regulatorischer Mechanismus analysiert. Innerhalb dieser Arbeit wurde dabei ein System zur aptamerabhängigen Regulation des prä-mRNA Spleißens in Hefe etabliert. Außerdem konnte das bekannte Translationssystem für die Regulation essentieller Gene in Hefe weiter entwickelt werden. Folgende Ergebnisse wurden in dieser Arbeit erhalten: 1.Das Tetrazyklin Aptamer – In vitro Charakterisierung eines synthetischen Riboswitches. Das Tetrazyklin Aptamer ist 69 Nukleotide lang. Es besteht aus drei Stämmen (P1, P2 und P3) sowie drei einzelsträngigen Bereichen (J1/2, J2/3 und die Schleife L3; siehe Abbildung 1, links). Die Domäne oberhalb von P2 ist nicht an der Ligandenbindung beteiligt und kann ausgetauscht werden. Die Stämme P1-P3 sind bereits vor Ligandenbindung ausgebildet. Tetrazyklin wird über die drei einzelsträngigen Bereiche gebunden (siehe Abbildung 1, rechts). Durch fluorimetrische und kalorimetrische Methoden wurde eine Bindekonstante von Tetrazyklin an das Aptamer von 770 pM ermittelt. Diese Affinität ist außergewöhnlich hoch. Vergleichbare Aptamere und natürliche Riboswitche binden niedermolekulare Liganden 10- bis 1000-fach schlechter. Wir konnten zeigen, dass hohe Affinität eine Grundvoraussetzung für die regulatorische Aktivität ist, da Aptamermutanten mit verschlechterten Bindekonstanten keine in vivo Aktivität mehr aufweisen sind (Seiten 19-29). Durch Größenausschlußchromatographie konnte gezeigt werden, dass das Tetrazyklin Aptamer durch Ligandenbindung keine größeren globalen Konformationsänderungen erfährt. Dies weist auf eine weitgehende Vorformung der Bindetasche bereits ohne Tetrazyklin hin. Bei Ligandenbindung nimmt das Aptamer eine pseudoknotenähnliche Tertiärstruktur an, welche wahrscheinlich für die inhibitorische Wirkung auf das Ribosom verantwortlich ist (Seiten 19-29). Im Laufe dieser Arbeit wurde die Kristallstruktur des Aptamers im Komplex mit Tetrazyklin in der Arbeitsgruppe von A. R. Ferré-D’Amaré gelöst. Die Struktur zeigt, dass die Stämme P1 und P3 aufeinander gestapelt sind (Abbildung 1, rechts). Stamm P2 bildet die Verlängerung einer irregulären Helix, die aus den einzelsträngigen Bereichen J1/2 und J2/3 gebildet wird. Nukleotide der Schleife L3 interagieren mit dieser irregulären Helix und bilden mit ihr zusammen die Bindetasche für Tetrazyklin. Diese hochauflösende Struktur diente uns in weiteren Arbeiten als Ausgangspunkt für die detaillierte Charakterisierung von ligandeninduzierten Änderungen (siehe 6.). 2. Das Tetrazyklin Aptamer ist in der Lage, prä-mRNA Spleißen in Hefe zu inhibieren. Der Aptamer-Tetrazyklin-Komplex kann nicht nur mit der Translationsinitiation, sondern auch mit dem Spleißen der prä-mRNA in Hefe interferieren (Seiten 31-37). Dazu wurde ein Hefe-Intron in den Leserahmen von GFP inseriert. Nur bei korrektem prä-mRNA Spleißen wird die reife mRNA aus dem Kern transportiert und GFP exprimiert. Für eine RNA-basierte Regulation des Spleißens wurde die Konsensussequenz der 5’ Spleißstelle in den Stamm P1 des Tetrazyklin Aptamers integriert. Dieser ist nicht an der Ligandenbindung beteiligt und seine Sequenz daher variabel. Es konnte gezeigt werden, dass in Abwesenheit von Tetrazyklin das Intron vom Spleißosom erkannt und entfernt wird. Die Expression des Gens ist dann möglich. Durch die Zugabe von Tetrazyklin wird das Spleißen inhibiert und GFP nicht länger exprimiert. Biochemische Strukturkartierungen der RNA in An- und Abwesenheit von Tetrazyklin zeigten, dass der Stamm P1 durch Ligandenbindung verfestigt wird. Die Ligandenbindung beeinflusst also nicht nur die Struktur der Bindetasche, sondern wird auch auf angrenzende Stammbereiche übermittelt. Durch Stabilisierung des Stammes P1 wird die 5’ Spleißstelle für das Spleißosom maskiert. Somit konnten wir den Mechanismus für die Aptamer basierte Regulation des prä-mRNA Spleißens aufklären. 3. Die Tetrazyklin Aptamer basierte Inhibition der Translationsinitiation ermöglicht die Regulation essentieller Gene in Hefe. Frühere Arbeiten zeigten, dass die Insertion mehrerer Aptamerkopien in den 5’UTR zu einem effizienten Abschalten der Genexpression führt. Dies wurde genutzt, um ein neuartiges System für die konditionale Expression essentieller Gene in Hefe zu etablieren. In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. K.-D. Entian wurden Insertionskassetten für eine PCR-basierte chromosomale Integration von Tetrazyklin Aptameren unter Kontrolle verschieden starker Promotoren konstruiert. Dafür wurden 1-3 Kopien des Tetrazyklin Aptamers unter Kontrolle des hoch exprimierenden TDH3-Promoters und des etwas schwächeren ADH1-Promoters gestellt. Außerdem wurde eines HA-tag angefügt, um die Genexpression mittels Westernblot verfolgen zu können. Zur Überprüfung der chromosomalen Insertion diente eine Kanamycin-Resistenz. Das neue System wurde erfolgreich an von fünf essentiellen Genen getestet. Es zeigte sich, dass die Zugabe von Tetrazyklin zu einem schnellen und effizienten Abschalten aller getesteten Gene führt. Die Vorteile dieses neuartigen konditionalen Genexpressionssystems in Hefe liegen in der einfachen Handhabung und der Unabhängigkeit vom verwendeten Stamm. Es müssen keine in transkodierten Proteinfaktoren coexprimiert werden. Durch dieses System konnte zum ersten Mal die Aptamer-basierte Regulation endogener, essentieller Gene gezeigt werden (Seiten 49-57). 4. Die Kombination von in vitro Selektion und in vivo Screening ermöglicht die Identifikation neuer regulatorisch aktiver Aptamere – ein Neomycin Riboswitch. Nur wenige in vitro selektierte Aptamere sind als synthetischer Riboswitch aktiv. In unserer Arbeitsgruppe wurde daher ein in vivo Screeningsystem zur Identifizierung neuer Aptamere in Hefe entwickelt. Eine Bibliothek in vitro selektierter Aptamere wurde hierzu in den 5’UTR des GFP Gens kloniert und die Aktivität einzelner Kandidaten durch Vergleich der Fluoreszenz in An- und Abwesenheit des Liganden überprüft. Wir verwendeten eine Bibliothek aus Neomycin-bindenden Aptameren und analysierten 5000 Hefeklone. Hierbei konnten zehn Sequenzen isoliert werden, die abhängig von Neomycin die Initiation der Translation inhibieren. Das 33 Nukleotid lange Aptamer N1 zeigt eine 7,5-fache Regulation und wurde näher charakterisiert. Es besteht aus einer internen asymmetrischen und einer terminalen Schleife, die durch zwei GC Basenpaare getrennt sind. Enzymatische Strukturkartierung und Mutationsanalyse zeigten, dass beide einzelsträngigen Bereiche für die Ligandenbindung wichtig sind. Der abschließende Stamm ist nicht an der Ligandenbindung beteiligt und hat geringen Einfluss auf die regulatorische Aktivität. N1 kann außerdem gegen andere Aminoglykosidantibiotika diskriminieren (Seiten 39-47). Interessanterweise sind die regulatorisch aktiven Aptamere in der in vitro selektierten Bibliothek stark unterrepräsentiert und konnten durch zufälliges Sequenzieren nicht identifiziert werden. Dieses Beispiel verdeutlicht eindrucksvoll die Notwendigkeit eines Screenings in vivo. 5. Regulatorisch aktive Neomycin Aptamere unterscheiden sich von inaktiven durch eine größere thermische Stabilisierung bei Ligandenbindung. Durch weitere Mutationsanalysen von N1 konnte ein aktivitätsvermittelndes Element im Neomycin Riboswitch identifiziert werden. Dazu wurde entweder die terminale oder die interne asymmetrische Schleife mutiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Sequenz der terminalen Schleife nur einen modulierenden Einfluss auf die Aktivität hat, wobei die Asymmetrie der internen Schleife (aber nicht deren exakte Sequenz) ausschlaggebend für die regulatorische Aktivität ist. Für weitere Analysen wurde N1 mit fünf mutierten Varianten und dem inaktiven Neomycin bindenden Aptamer R23 verglichen. Alle sieben Aptamer haben eine ähnliche Sekundärstruktur und Ligandenaffinität, zeigen aber unterschiedliche Aktivität in vivo. Durch Bestimmung des Schmelzpunktes der verschiedenen Aptamere in An- und Abwesenheit von Neomycin zeigte sich, dass aktive Aptamere thermisch deutlich mehr durch Ligandenbindung stabilisiert werden als inaktive. Dabei ist die thermische Stabilität der Aptamer-Neomycin-Komplexe ähnlich. Jedoch ist die Stabilität ohne Ligand bei aktiven Aptameren gegenüber inaktiven Varianten deutlich erniedrigt. Durch NMR spektroskopische Untersuchungen in Zusammenarbeit mit Prof. J. Wöhnert konnte bestätigt werden, dass aktive Aptamere weniger stark vorgeformt sind als inaktive. Das in den Mutationsanalysen identifizierte Element nimmt nicht an der Ligandenbindung teil, sondern dient als Schalter, der den freien Zustand das Aptamers destabilisiert. Damit sorgt es für den großen Unterschied in der thermischen Stabilität des freien und des gebundenen Zustandes aktiver Aptamere. Dies zeigt, dass Unterschiede in der Stabilität die regulatorische Aktivität vermitteln (Seiten 73-102). Laufende Arbeiten sollen nun klären, ob thermische Stabilisierung durch Ligandenbindung ein allgemeingültiger Vermittler von regulatorischer Aktivität ist. Dazu werden weitere Aptamere überprüft, welche in Abwesenheit des Liganden unterschiedlich stark strukturiert sind und eventuell durch Ligandenbindung unterschiedlich stabilisiert werden. Außerdem werden wir testen, ob es die gewonnen Erkenntnisse erlauben, durch rationelles Design synthetische Riboswitche zu verbessern oder inaktive Aptamere in aktive zu verwandeln. 6. Was macht ein Aptamer zu einem regulatorisch aktiven Riboswitch? Für das Tetrazyklin Aptamer konnten wir zeigen, dass zum einen eine extrem hohe Bindekonstante und zum anderen eine hoch komplexe Bindetasche für die regulatorische Aktivität entscheidend sind. Dabei ist die Bindetasche in Abwesenheit des Liganden stark vorstrukturiert und erfährt keine globalen strukturellen Änderungen (Seiten 19-29). In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. J. Wachtveitl untersuchen wir den Einfluss von Bindekinetik und Lebensdauer des Aptamer-Tetrazyklin-Komplexes auf die regulatorische Aktivität. Dafür vergleichen wir das Tetrazyklin Aptamer mit drei regulatorisch inaktiven Mutanten. Für die Messungen nutzen wir die Eigenfluoreszenz des Tetrazyklins. Diese ist in wässriger Lösung geqenched und steigt bei Bindung an die RNA deutlich an. Erste Ergebnisse zeigen große Unterschiede zwischen den Aptameren in der Geschwindigkeit der Ligandenbindung. Außerdem zeigen sich geringe Unterschiede in der Lebensdauer der verschiedenen Komplexe. Durch NMR spektroskopische Untersuchungen in der Arbeitsgruppe von Prof. J. Wöhnert können die Veränderungen einzelner Basen bei Ligandenbindung untersucht werden. Hierbei zeigen erste Messungen am Tetrazyklin Aptamer, unterschiedliches Verhalten einzelner an der Bindung beteiligter Nukleotide. Eine detaillierte Aufklärung der ligandeninduzierten Veränderungen gewährt uns weitere Einblicke, warum das Tetrazyklin Aptamer als Riboswitch aktiv ist. Die regulatorische Aktivität Neomycin abhängiger Riboswitche wird durch thermische Stabilisierung bei Ligandenbindung vermittelt. Dabei zeigte sich, dass durch Neomycin neue Basenpaare und Basenstapelungen entstehen. Durch weiterführende strukturelle Untersuchungen sollen nun ligandeninduzierte Veränderungen in N1 detailliert geklärt werden. Größere globale Änderungen konnten bereits durch EPR Spektroskopie in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. T. F. Prisner ausgeschlossen werden. Hierzu wurden in der Arbeitsgruppe von Prof. J. W. Engels spinmarkierte Neomycin Aptamere hergestellt und die Abstände der Sonden in An- und Abwesenheit von Neomycin bestimmt. Es zeigte sich, dass sich der Abstand der Spinmarkierungen durch Zugabe von Neomycin (oder anderen Aminoglykosiden) nicht ändert (Seiten 59-72). Dies weist auf eher lokale Änderungen in der Bindetasche hin. Durch NMR Spektroskopie in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. J. Wöhnert werden im Moment die Strukturen verschiedener N1-Aminoglykosid-Komplexe gelöst. Dabei zeigt sich, dass in vivo aktive und inaktive Liganden eine ähnliche Struktur im Aptamer induzieren. Was die einzelnen Komplexe unterscheidet und damit die verschiedene Aktivität begründet ist Ziel der Analyse. Insgesamt konnte in dieser Arbeit ein Regulationssystem für die Aptamer-basierte Kontrolle des prä-mRNA Spleißens in Hefe entwickelt und das bestehende Translationssystem für die Applikation auf essentielle Gene angewendet werden. Außerdem wurden wichtige Punkte, warum Aptamere als Riboswitch funktionieren aufgeklärt. Damit legt diese Arbeit einen wertvollen Grundstein für die Weiterentwicklung RNA-basierter Genregulationselemente für die Anwendung in der synthetischen Biologie.
Teerfleckenpilze (Ascomycota, Phyllachorales) kommen weltweit vor, haben aber einen deutlichen Verbreitungsschwerpunkt in den Tropen. In dieser Studie wird die Diversität der Phyllachorales in Panama untersucht und taxonomische Grundlagenforschung durch molekulare Untersuchungen und ökologische Beobachtungen ergänzt. Arten der Phyllachorales bilden schwarz glänzende Flecken oder Krusten auf Blättern und Stängeln von Pflanzen. Die Fruchtkörper dieser Mikropilze sind meistens in das Wirtsgewebe eingesenkt, können aber auch oberflächlich angelegt sein. Die Größe der teerfleckenähnlichen Infektionen variiert zwischen 0,2 mm bis zu mehreren Zentimetern. Teerfleckenpilze mit eingesenkten Fruchtkörpern entwickeln in den meisten Fällen schildförmige, epidermale Deckstrukturen oberund/oder unterhalb der Perithecien. Die unitunicaten Asci können einen kleinen apikalen Ring besitzen, der sich in Jodlösung nicht blau färbt. Die hyaline Ascosporen sind meistens glatt und können von einer schleimigen Hülle umgeben sein. Die assoziierten Andromorphstadien sind durch fadenförmige Spermatien gekennzeichnet. Nur wenige morphologische Merkmale werden als verlässlich betrachtet und stehen für die Bestimmung von Arten zur Verfügung. Derzeit sind 1.226 Arten von Phyllachorales weltweit beschrieben. Puerto Rico gilt als eines der am besten untersuchten Länder in Bezug auf Teerfleckenpilze. Ungefähr 100 Arten sind derzeit von Puerto Rico bekannt, weitere Erstnachweise werden erwartet. Im Gegensatz dazu wurden in Panama bisher nur wenige mykologische Untersuchungen durchgeführt. Zwischen 1927 und 1991 wurden nur 39 Teerfleckenpilze nachgewiesen, obwohl die Landfläche Panamas achtmal größer ist als die von Puerto Rico und eine fast viermal höhere Pflanzendiversität aufweist. Aufgrund der Vielzahl potentieller neuer Wirtspflanzen in Panama und des von Teerfleckenpilzen bevorzugten tropischen Klimas wird eine weitaus höhere Anzahl an Arten der Phyllachorales erwartet. Zwischen 2005 und 2008 wurden mehreren Exkursionen in den Provinzen Bocas del Toro und Chiriquí durchgeführt, um die tatsächliche Diversität pflanzenparasitischer Mikropilze in Panama zu untersuchen. Über 1.000 Belege wurden von insgesamt vier Wissenschaftlern während 7 Sammelreisen von jeweils 2‐4 Wochen gesammelt. 185 Belege zeigen mehr oder weniger deutliche Symptome von Teerfleckenkrankheit und entsprechen 42 Arten der Phyllachorales, die bisher noch nicht für Panama bekannt sind. 81 Teerfleckenpilze aus Panama werden in dieser Arbeit mit detaillierten Beschreibungen, Zeichnungen und Fotos vorgestellt. Von den 66 bis zur Art bestimmten Phyllachorales werden 27 erstmalig für Panama, 19 für Zentralamerika und 3 für die Neue Welt genannt. Die Erstnachweise von Camarotella costaricensis, Coccodiella miconiicola, Ophiodothella galophila, Phyllachora amphibola, Ph. engleri und Ph. zanthoxylicola wurden bereits vorab publiziert. 21 Arten werden hier zum ersten Mal vorgestellt: Catacauma paramoense, Coccodiella miconiae, Ophiodothella cuervoi, Phyllachora acaciae subsp. pusaethae, Ph. acalyphae, Ph. araliarum, Ph. balansae, Ph. buddleiae, Ph. cynodontis, Ph. galavisii, Ph. gouaniae, Ph. leeae, Ph. meliosmae, Ph. microtheles, Ph. ocoteae, Ph. paraguaya, Ph. phyllanthophila var. phyllanthophila, Ph. puncta subsp. dalbergiicola, Ph. ruelliae, Ph. serjaniae und Ph. smilacicola. Zusätzlich konnte erstmals der Hyperparasit Perizomella inquinans auf Ph. ocoteae für Panama und der Teerfleckenpilz Ph. guazumae für Costa Rica nachgewiesen werden. Von den 15 bisher noch unbestimmten Teerfleckenpilzen sind 9 Arten der Gattungen Camarotella und Phyllachora wahrscheinlich neu für die Wissenschaft und 6 Arten müssen bis zur Bestimmung noch weiter untersucht werden. 10 Taxa wurden aufgrund von Synonymisierung, Zitierungsfehlern oder mangelhaftem Material ausgeschlossen. Für eine sichere Bestimmung der Arten aus Panama wurden alle weltweit bekannten Teerfleckenpilze auf nah verwandten Wirtspflanzen miteinander verglichen. Dazu wurden intensive Literaturrecherche und detaillierte lichtmikroskopische Studien durchgeführt. 190 Typen und autoritative Belege wurden zusätzlich aus 22 Herbarien weltweit ausgeliehen und untersucht. Dabei wurden einige Gruppen von Teerfleckenpilzen auf bestimmten Wirtsfamilien teilweise überarbeitet und Schlüssel für die Bestimmung der jeweiligen Arten erstellt. Ein Vergleich der charakteristischen Merkmale wird als tabellarische Übersicht in den Anmerkungen vorgestellt. Aufgrund der intensiven taxonomischen Arbeit konnten 7 neue Synonyme aufgedeckt werden. Catacauma contractum ist ein Synonym von Ph. gouaniae, Ph. clypeata von Ph. paraguaya, Ph. insueta von Ph. serjaniae, Ph. paulliniae von Ph. galavisii und Ph. swieteniae von Ph. balansae. Für Ph. roureae werden gleich zwei neue Synonyme vorgeschlagen, Ph. connari und Ph. panamensis. Einige der untersuchten Herbarbelege waren nur bruchstückhaft vorhanden oder in sehr schlechtem Zustand. Viele Belege konnten aufgrund mangelnder Informationen nicht gefunden oder wegen sehr langen Lieferungszeiten oder fehlender Kooperationen noch nicht untersucht werden. Die Erstbeschreibungen vieler Arten in der Literatur sind lückenhaft und für die wenigsten Arten sind Abbildungen vorhanden. Dadurch ist eine sichere Artbestimmung ohne Untersuchung des zugehörigen Herbarmaterials oft unmöglich. In dieser Arbeit werden alle 81 untersuchten Teerfleckenpilze mit detaillierten Beschreibungen, Zeichnungen und Fotografien dargestellt, um zukünftige Bestimmungsarbeiten zu erleichtern. 16 Teerfleckenpilze wurden im Rahmen dieser Arbeit zum ersten Mal illustriert: Catacauma paramoense, Ophiodothella cuervoi, O. galophila, Phyllachora acaciae var. enterolobii, Ph. acalyphae, Ph. araliarum, Ph. bonariensis, Ph. engleri, Ph. galavisii, Ph. leeae, Ph. meliosmae, Ph. ocoteae, Ph. ruelliae, Ph. smilacicola, Ph. verbesinae und Polystigma pusillum. Darüber hinaus wurden Ph. acaciae subsp. pusaethae, Ph. cecropiae, Ph. leptochloae, Ph. puncta subsp. dalbergiicola und Ph. weirii in ihrer Darstellung vervollständigt. Für einige Arten werden bislang unveröffentlichte morphologische Merkmale vorgestellt, z.B. chondroide Hyphen, Schleimhüllen oder Andromorphstadien, und die mögliche Verwendung dieser Merkmale zur Artabgrenzung diskutiert. Zusätzlich zu den morphologischen Merkmalen werden molekulare Daten hinzugezogen. Zu Beginn dieser Arbeit standen Sequenzen von nur acht verschiedenen Arten der Phyllachorales s.str. zur Verfügung, davon 3 aus der Gattung Phyllachora. Aufgrund der Tatsache, dass Arten der Phyllachorales auf lebendes Pflanzenmaterial angewiesen sind, ist es bisher noch nicht gelungen, diese Pilze in Kultur zu halten. Die Isolation von DNA‐Material aus eigenen Herbarbelegen oder von auf Silicagel getrockneten Proben erwies sich als wenig erfolgreich. Es war notwendig, das frisch gesammelte Material direkt vor Ort in Panama zu verarbeiten. Die Extraktion von reinem und geeignetem Pilzgewebe stellte sich aufgrund der sehr geringen Fruchtkörpergröße und der engen Anhaftung an das Pflanzengewebe als sehr mühsam dar. Trotzdem wurden 10 neue DNA‐Sequenzen, die jeweils für die kleine bzw. große ribosomale Untereinheit kodieren, von 7 Teerfleckenpilzen, Coccodiella miconiae, Coccodiella sp., Phyllachora engleri, Ph. graminis, Ph. leeae, Ph. ulei und Ph. zanthoxylicola, auf 10 verschiedenen Wirtspflanzen erfolgreich isoliert. Erste molekulare Untersuchungen mittels Maximum Likelihood, Maximum Parsimony und Bayesianischer Analyse eines kombinierten Datensatzes unterstützen die Zugehörigkeit der Phyllachorales zur Unterklasse Sordariomycetidae und deuten auf eine paraphyletische Entwicklung der Gattung Phyllachora hin. Die Typusart, Phyllachora graminis, könnte mit Arten der Gattung Coccodiella enger verwandt sein als mit anderen Arten der Gattung Phyllachora. Bisher fehlen aber noch entsprechende morphologische Merkmale die diese These unterstützen. Weitere Untersuchungen mit einem erweiterten Datensatz sollten unternommen werden. Aufgrund der biotrophen Lebensweise und der damit verbundenen engen Anpassung an die jeweilige Wirtspflanze wird eine hohe Spezifität der Teerfleckenpilze angenommen. Die Identifikation der Wirtspflanze bildet daher eine wichtige Grundlage bei der Bestimmung des Pilzes. Durch die Abwesenheit fertiler Strukturen, wie Blüten und Früchte, wurde eine eindeutige Bestimmung oft erschwert. Pflanzenspezialisten, Fachliteratur, Herbarmaterial und Internetdatenbanken wurden hinzugezogen, um eine möglichst genaue Bestimmung der Wirtspflanzen zu erreichen. Die 81 für Panama vorgestellten Teerfleckenpilze parasitierten auf ungefähr 93 verschiedenen Wirten aus 72 Gattungen und 43 Pflanzenfamilien. 73 Wirtspflanzen wurden bis zur Art bestimmt, 20 können mit Gattungsnamen angesprochen werden und sind von den bisher bestimmten Arten sicher verschieden. 5 Arten sind derzeit noch gänzlich unbestimmt. Von den 73 vollständig bestimmten Pflanzenarten werden 29 zum ersten Mal als Wirte für den entsprechenden Parasiten vorgestellt: Acalypha diversifolia für Phyllachora acalyphae, Anthurium concinnatum für Phyllachora engleri, Buddleja nitida für Phyllachora buddleiae, Cissus trianae für Phyllachora leeae, Croton draco und Croton hirtus für Phyllachora tragiae, Dalbergia brownei für Phyllachora puncta subsp. dalbergiicola, Dichanthelium acuminatum und Dichanthelium viscidellum für Phyllachora bonariensis Speg., Dicliptera iopus für Phyllachora ruelliae, Dioscorea trifida und Dioscorea urophylla für Phyllachora ulei, Entada polystachya für Phyllachora acaciae subsp. pusaethae, Inga punctata und Inga sierrae für Phyllachora amphibola, Luehea seemannii für Phyllachora paraguaya, Ocotea veraguensis für Phyllachora ocoteae, Oreopanax xalapensis für Phyllachora araliarum, Ossaea micrantha für Coccodiella miconiicola, Paspalum paniculatum und P. pilosum für Phyllachora paspalicola, Paullinia bracteosa für Phyllachora galavisii, Phyllanthus anisolobus für Phyllachora phyllanthophila var. phyllanthophila, Serjania atrolineata für Phyllachora serjaniicola, Serjania mexicana für Phyllachora serjaniae, Vaccinium floribundum für Catacauma paramoense und Ophiodothella cuervoi, Xylosma flexuosa für Trabutia xylosmae und Zanthoxylum melanostictum für Phyllachora zanthoxylicola. Teilweise wurden diese Erstnachweise schon vorab publiziert. Arten der Familien Fabaceae, Melastomataceae und Poaceae sind besonders häufig mit Teerfleckenpilzen infiziert und scheinen bevorzugte Wirtspflanzen für Arten der Phyllachorales zu sein. Für ökologische Studien wurden bestimmte Teerfleckenpilze an ausgesuchten Standorten wiederholt zu verschiedenen Jahreszeiten gesammelt und untersucht. Dabei zeigte sich, dass Arten der Ordnung Phyllachorales in zwei Habitaten besonders häufig anzutreffen sind: (1) in offenen, gestörten Gebieten mit Ruderalvegetation und deutlicher Trockenperiode sowie (2) in dichten, ungestörten Bergregenwäldern mit hoher relativer Luftfeuchtigkeit und kontinuierlichem Niederschlag. Eine hohe Pflanzendiversität korreliert nicht mit einer hohen Diversität an Teerfleckenpilzen. Vergleichende Untersuchungen zeigten, dass das Vorkommen von Arten der Phyllachorales wahrscheinlich stärker vom Vorkommen und der Dichte bevorzugter Wirtspflanzen abhängt als von ökologischen Faktoren wie z.B. Vegetationstyp, Höhenlage, relativer Lichtintensität, durchschnittlichem Jahresniederschlag oder jahreszeitlicher Temperaturentwicklung. Die in dieser Studie vorgestellten Teerfleckenpilze stammen aus nur 5 von 12 Provinzen Panamas: Bocas del Toro und Chiriquí im Westen sowie Colón, Kuna Yala und Panamá im Zentrum des Landes. Mithilfe einer Datenbank wurde eine Vielzahl verfügbarer Literaturdaten mit Internet‐Datensätzen ergänzt und daraus eine Verbreitungskarte von Arten der Phyllachorales in der Welt erstellt. Für viele Länder sind nur wenige oder gar keine Teerfleckenpilze bekannt. Das lückenhafte Vorkommen in Panama und anderen Ländern der Welt entspricht aber keinesfalls der natürlichen Verbreitung dieser Pilze, sondern gibt die unterschiedliche Intensität von Forschungsaktivitäten in Bezug auf die Teerfleckenpilze wieder. Weitere Erstnachweise und neue Arten der Ordnung Phyllachorales werden für Panama und die Welt erwartet, denn unser Wissenstand über diese Gruppe ist sehr lückenhaft und weite Gebiete sind bislang noch unzureichend untersucht.
Iron uptake is an essential process in all Gram-negative bacteria including cyanobacteria and therefore different transport systems evolved during evolution. In cyanobacteria, however, the iron demand is higher than in proteobacteria due to the function of iron as cofactor in e.g. photosynthesis and nitrogen fixation. Most of the transport systems depend on outer membrane localized TonB-dependent transporters (TBDTs), a periplasma-facing TonB protein and a plasma membrane localized machinery (ExbBD). So far, iron chelators (siderophores), oligosaccharides and polypeptides have been identified as substrates of TBDTs. However, in proteobacteria TonB-dependent outer membrane transporter represent a well-explored subject whereas for cyanobacteria almost nothing is known about possible TonB-dependent uptake systems for iron or other substrates. The heterocyst-forming filamentous cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120 is known to secrete the siderophore schizokinen, but its transport system has remained unidentified. For Anabaena sp. PCC 7120 22 genes were identified as putative TBDTs covering almost all known TBDT subclasses. This is a high number of TBDTs compared to other cyanobacteria. The expression of the 22 putative TBDTs individually depends on the presence of iron, copper or nitrogen. The atypical dependence of TBDT gene expression on different nutrition points to a yet unknown regulatory mechanism. In addition, the hypothesis of the absence of TonB in Anabaena sp. PCC 7120 was clarified by the identification of an according sequence, all5036. Inspection of the genome of Anabaena sp. PCC 7120 shows that only one gene encoding a putative TonB-dependent iron transporter, namely alr0397, is positioned close to genes encoding enzymes involved in the biosynthesis of a hydroxamate siderophore. The expression of alr0397 was elevated under iron-limited conditions. Inactivation of this gene caused a moderate phenotype of iron starvation in the mutant cells. The characterization of the mutant strain showed that Alr0397 is a TonB-dependent schizokinen transporter (SchT) of the outer membrane and that alr0397 expression and schizokinen production are regulated by the iron homeostasis of the cell. Additional two genes of Anabaena sp. PCC 7120 involved in this process were identified. SchE encoded by all4025 is a putative cytoplasmic membrane-localized transporter involved in TolC-dependent siderophore secretion. The mutation of schE resulted in an enhanced sensitivity to high metal concentrations and in drastically reduction of secretion of hydroxamate-type siderophores. IacT coded by all4026 is a predicted outer membrane-localized TonB-dependent iron transporter. Inactivation of iacT resulted in reduced sensitivity to elevated iron and copper levels, whereas decoupling the expression from putative regulation by exchange of the promoter resulted in sensitization against tested metals. Further analysis showed that iron and copper effects are synergistic because decrease of iron induced a significant decrease of copper levels in the iacT insertion mutant but an increase of those levels in Anabaena sp. PCC 7120 where expression of all4026 is under the trc-promoter. In consequence, the results unravel a link between iron and copper homeostasis.
By adopting a variety of shapes, proteins can perform a wide number of functions in the cell, from being structural elements or enabling communication with the environment to performing complex enzymatic reactions needed to sustain metabolism. The number of proteins in the cell is limited by the number of genes encoding them. However, several mechanisms exist to increase the overall number of protein functions. One of them are post-translational modifications, i.e. covalent attachment of various molecules onto proteins. Ubiquitin was the first protein to be found to modify other proteins, and, faithful to its evocative name, it is involved in nearly all the activities of a cell. Ubiquitylation of proteins was believed for a long time only to be responsible for proteasomal degradation of modified proteins. However, with the discovery of various types of ubiquitylation, such as mono-, multiple- or poly-ubiquitylation, new functions of this post-translational modification emerged. Mono-ubiquitylation has been implicated in endocytosis, chromatin remodelling and DNA repair, while poly-ubiquitylation influences the half-life of proteins or modulates signal transduction pathways. DNA damage repair and tolerance are example of pathways extensively regulated by ubiquitylation. PCNA, a protein involved in nearly all types of DNA transaction, can undergo both mono- and poly-ubiquitylation. These modifications are believed to change the spectrum of proteins that interact with PCNA. Monoubiquitylation of PCNA is induced by stalling of replication forks when replicative polymerases (pols) encounter an obstacle, such as DNA damage or tight DNA-protein complexes. It is believed that monoubiquitylation of PCNA stimulates the exchange between replicative pols to one of polymerases that can synthesize DNA across various lesions, a mechanism of damage tolerance known as translesion synthesis (TLS). Our work has helped to understand why monoubiqutylation of PCNA favours this polymerase switch. We have identified two novel domains with the ability to bind Ub non-covalently. These domains are present in all the members of Y polymerases performing TLS, and were named Ub-binding zinc finger (UBZ) (in polη and polκ) and Ub-binding motif (UBM) (in polι and Rev1). We have shown that these domains enable Y polymerases to preferentially gain access to PCNA upon stalling of replication, when the action of translesion polymerases is required. While the region of direct interaction between Y pols and PCNA had been known (BRCT domain in Rev1 and PIP box motif (PIP) in three others members), we propose that Ub-binding domains (UBDs) in translesion Y pols enhance the PIP- or BRCT-domain-mediated interaction between these polymerases and PCNA by binding to the Ub moiety attached onto PCNA. Following these initial studies, we have also discovered that Y polymerases themselves undergo monoubiquitylation and that their UBDs mediate this modification. This auto-ubiquitylation is believed to lead to an intramolecular interaction between UBD and Ub attached in cis onto the UBD-containing protein. We have mapped monoubiquitylation sites in polη in the C-terminal portion of the protein containing the nuclear localization signal (NLS) and the PIP box. Beside PIP, the NLS motif is also involved in direct interaction of polη with PCNA. Based on these findings, we propose that monoubiquitylation of either NLS or PIP masks them from potential interaction with PCNA. Lastly, using several functional assays, we have demonstrated the importance of all these three motifs in the C-terminus of polη (UBZ, NLS and PIP) for efficient TLS. We have also constructed a mimic of monoubiquitylated polη by genetically fusing polη with Ub. Interestingly, this chimera is deficient in TLS as compared to the wild-type protein. Altogether, these studies demonstrate that the C-terminus of polη constitutes a regulatory module involved in multiple-site interaction with monoubiquitylated PCNA, and that monoubiquitylation of this region inhibits the interaction between polη and PCNA. Our work has also revealed that the UBDs of Y pols as well as of other proteins implicated in DNA damage repair and tolerance, such as the Werner helicase-interacting protein 1 (Wrnip1), are required for their proper sub-nuclear localization. All these proteins localize to discrete focal structures inside the nucleus and mutation of their UBDs results in inability to accumulate in these foci. Interestingly, by exchanging UBDs between different proteins we have learned that each UBD seems to have a distinct functional role, surprisingly not limited to Ubbinding ability. In fact, swapping the UBZ of Wrnip1 with the UBM of polι abolished the localization of Wrnip1 to foci despite preserving the Ub-binding ability of the chimeric protein. In summary, this work provides an overview of how post-translation modification of proteins by Ub can regulate several DNA transactions. Firstly, key regulators (e.g. PCNA) can be differentially modified by Ub. Secondly, specialized UBDs (e.g. UBM, UBZ) embedded only in a subset of proteins act as modules able to recognize these modifications. Thirdly, by means of mediating auto-ubiquitylation, UBDs can modulate the behaviour of host proteins by allowing for either in cis or in trans Ub-UBD interactions.
The physiology of our most complex organ, the brain, is still not comprehensively understood. The brain basically serves the processing, storing and binding of external and internal information, and thereby generates amazing phenomena like the understanding of oneself as an individual entitiy. How exactly information is encoded and represented, how individual neurons or networks of neurons actually interact, is a gigantic puzzle, whose pieces were collected since many decades. Subject of scientific discussions are the basic spatiotemporal structures of neuronal representations. Suggestions and observations reach hereby from simple rate coding of individual neurons to synchronous activity of larger ensembles. To approach answers to these questions, our working group has used a combination of different recording techniques that allowed for the comparison of neuronal interactions on different spatial scales. We focused on prefrontal neuronal interactions during visual short-term memory. Herefore two rhesus monkeys had been trained to perform a visual short-term memory task. We measured and recorded their neuronal activity by means of a microelectrode matrix that could be inserted into the cortex via a closable chamber, which had been previously implanted above prefrontal cortex. The acquired signal was separated into two components: a high-frequency component, that represents the spiking output activity of few neurons in the vicinity of each electrode tip (multi-unit activity), and a low-frequency component, that results from dendritic input activity of larger neuronal assemblies (local field potential). From one of the experimental animals we also recorded mass signals of even larger neuronal populations by means of small silverball electrodes, that had been implated into the skull above prefrontal cortex (skull EEG) in the context of a pilot project. In the first subproject, we analyzed the selectivity of output signals with respect to the memorized stimulus and task performance. We compared selectivities of local recording sites (multi-unit activity) with the selectivities of patterns created by the combined activity of all recording sites, thus representing the activity of large and distributed ensembles. Local neuronal activity correlated with the course of the visual short-term memory task, but was not highly discriminative with respect to different visual stimuli. We could show that the population activity was significantly more specific. Concerning task performance, we obtained the same result, albeit less pronounced. Further analyses revealed that the patterns of distributed ensemble activity were only partly based on realtime coordination of neuronal activity, and in addition, did not remain stable across the time course of the short-term memory task. In the second subproject, we focused on the oscillatory behavior of the local field potential. After a time-frequency analysis, we studied different frequency bands concerning stimulus selectivity and task performance of the monkey. We hereby found significant modulations of oscillations in the beta- and gamma-frequency range, that correlated with different periods of the task. Especially for oscillations in beta- and low-gamma-range, we observed phase-locking of oscillations between different recording sites, which could play an important role as internal clock to coordinate spatially separate activity. Local high-gamma oscillations themselves seemed to be important for the maintenance of information. These results could be partly confirmed by mass signals of EEG. In sum, our results support the hypothesis that information is represented in the brain by means of concerted activity of spatially distributed neuronal ensembles. This activity again appears to be coordinated by oscillatory activity in beta- and low-gamma-frequency ranges. A deeper understanding of central nervous information processing could contribute to better treatment of diseases like Parkinson’s, Alzheimer’s as well as epilepsy, and neuropsychiatric disorders like schizophrenia.
Pharmakokinetische Charakterisierung der Terpenlaktone aus Ginkgo biloba im ZNS am Tiermodell
(2010)
Ginkgo biloba (Gb), eine der am besten untersuchten pharmazeutisch-medizinisch genutzten Pflanzen, wird heute in Form von Spezialextrakten im Sinne einer evidenzbasierten Phytopharmakatherapie eingesetzt. Grundlage hierfür sind die genaue Spezifikation der Zusammensetzung des Spezialextraktes in Bezug auf die wirksamkeitsbestimmenden Inhaltsstoffe, balstbare klinische Daten, das Erforschen des molekularen Wirkmechanismus‘ des Gesamtextraktes aber auch der Einzelbestandteile und die Pharmakokinetik im Targetgewebe. Heute werden im Sinne einer evidenzbasierten Phytopharmakatherapie lediglich Extrakte verwendet, die der Monographie der Komission E entsprechen (22 - 27% Flavonoide, 5 - 7% Terpenlaktone und weniger als 5 ppm Ginkgolsäuren). Der am besten klinisch und pharmakologisch untersuchte Gb-Spezialextrakt ist EGb 761® (Tebonin®), der im zentralen Fokus der vorliegenden Arbeit steht. Die im Jahr 2008 vom IQWiG veröffentlichte Metaanalyse zur Klinik von EGb 761® hat in äußerst detaillierter Form belastbare Daten zur Wirksamkeit dieses Extraktes beschrieben. Es kann festgehalten werden, dass ein Einsatz dieses Spezialextraktes im Rahmen der Therapie einer beginnenden Demenz zu befürworten ist. Basis des klinischen Einsatzes des EGb 761® sind in vitro und in vivo pharmakologische Untersuchungen. Es werden unterschiedliche Gesamtkonzepte zur Wirkung von EGb 761® bzw. Einzeleffekte der Inhaltsstoffe im ZNS diskutiert. Konsensfähig sind heute sicher die Mitochondrien-stabilisierende Wirkung der Terpenlaktone und ein antioxidativer Effekt der Flavonoide. Bb zeigt zusätzlich deutlich protektive Effekte in Bezug auf durch zerebrovaskuläre Ereignisse geschädigte Hirnareale. Darüber hinaus ist die Wirkung der Flavonoide auf die monoaminerge Neurotransmission aktueller Gegenstand der Forschung. Basis jeglicher pharmakologischen Betrachtung ist das pharmakokinetische Verhalten der wirksamen Inhaltsstoffe im Target-Gewebe. Nachdem die ZNS-Bioverfügbarkeit der Flavonoide nachgewiesen wurde, hat die vorliegende Arbeit das zentrale Ziel, die pharmakokinetische Charakteristik der Terpenlaktone aus Gb im ZNS zu untersuchen. Zur quantitativen Analyse der Terpenlaktone (GKA, GKB, GKC und Bb) in biologischen Matrices (Hirn-Homogenat, Plasma) und Hirn-Dialysat-Pufferlösung (aCSF-Puffer) wurde eine LC-MS-Analytik-Methode entwickelt und validiert. Unter Verwendung einer 250x4 mm, Multo High 100 RP18, 5 μm (CS-Chromatographie Service GmbH)-Säule und einer isokratischen Auftrennung mittels einer mobilen Phase bestehend aus 60% 0,1%-iger Ameisensäure und 40%-igem Methanol konnten alle vier genannten Terpenlaktone simultan innerhalb von 20 Minuten analysiert werden. Die beschriebene LC-MS(TOF)-Methode verfügt über eine ausreichende Sensitivität, um die Analyten im nanomolaren Bereich zu quantifizieren (z.B. LOQ Bb in aCSF-Puffer: 0,25 pg/μl; LOQ Bb in Hirnhomogenat: 1 ng/ml). Die Aufarbeitung der Plasma- bzw. Hirn-Homogenat-Proben erfolgte durch eine flüssig-flüssig-Extraktion mit Hilfe von Extrelut®-Säulen; die Hirn-Dialysat-Proben bedurften keiner Probenaufarbeitung. Mit Hilfe der beschriebenen Analytik-Methode war es möglich, GKA, GKB, GKC und Bb in Plasma und Hirnhomogenat von Ratten nach oraler Gabe von 600 mg/kg Körpergewicht EGb 761® bzw. einer vergleichbaren Menge der Reinsubstanzen zu bestimmen. Im Rahmen dieses Projektes wurde ein direkter Vergleich der erhalten Plasma-Konzentrationen nach Extrakt- bzw. Reinsubstanzgabe gezogen, wobei der Extrakt die höhere AUC (für GKA u. Bb) und daher bessere Bioverfügbarkeit aufwies. Es konnten in Plasma und Gehirngewebe sowohl GKA als auch GKB und Bb in nativer nicht metabolisierter Form nachgewiesen werden. GKC konnte weder in Plasma noch in Hirngewebe bestimmt werden, was die in der Literatur diskutierte These einer schnellen Metabolisierung (Methylierung) stärkt. Die Terpenlaktone sind im Plasma sehr schnell angeflutet und zeigten ein ebenfalls zügiges Abfallen, so dass 24 Stunden nach oraler Applikation keine Konzentrationen mehr zu detektieren waren. Bei der Untersuchung der Hirn-Gewebspiegel von GKA, GKB und Bb zeigten sich keine Unterschiede nach Gabe von Extrakt bzw. Reinsubstanz. Die Substanzen fluteten im Vergleich zum Plasma etwas verzögert an, fielen aber auch bis 24 Stunden nach Applikation wieder unter die Nachweisgrenze. Die Konzentrations-Zeit-Kurven ähnelten in ihrer Form stark denen aus Plasma, waren jedoch zeitlich nach rechts verschoben, so dass ausgeschlossen werden kann, dass es sich im Hirngewebe um Artefakt aus Restblut handelt. Wesentliches Resultat dieser Untersuchungen war, dass erstmalig nach oraler Gabe von EGb 761® gezeigt wurde, dass deutliche Gewebespiegel im Gehirn von Ratten zu erzielen sind und damit diese Substanzen im Target-Gewebe die postulierten pharmakologischen Wirkungen ausüben können. Aufbauend auf diesen Ergebnissen wurden mit Hilfe der Mikrodialyse-Technik und der bereits beschriebenen LC-MS-Analytik-Methode weitere pharmakokinetische Untersuchungen am Maus-Modell durchgeführt. Es konnte zunächst rein technisch im Rahmen von Wiederfindungsuntersuchungen gezeigt werden, dass die im Dialysat bestimmte Menge Bb ca. 6% der tatsächlich im Extrazellularraum des Maus-Hirns vorliegenden Bb-Konzentration entspricht. Weiterhin zeigten diese Versuche, dass Bb kaum an Plasma-Proteine bindet, da keine signifikanten Unterschiede bei der Dialyse von Bb aus Puffer, Blut oder Plasma zu sehen waren. In einem ersten Tierversuch an gesunden Mäusen konnten die pharmakokinetischen Charakteristika von Bb, die in der Fütterungsstudie an Ratten bestimmt wurden, reproduziert werden, obwohl es sich um einen völlig divergenten Versuchsaufbau, unterschiedliche Tierspezies und nicht um die gleichen Applikationsformen handelt. Diese Tatsache unterstreicht die Aussage beider Studien. Als zusätzliche Aussage ergibt sich aus dem Versuchsaufbau, dass Bb frei und biologisch aktiv im Extrazellularraum vorliegt und nicht z.B. in Membranen gebunden ist. Die Möglichkeit mittels Mikrodialyse und LC-MS-Technik Bb im Extrazellularraum definierter Hirnregionen nachzuweisen, erlaubte eine pharmakokinetische Charakterisierung von Bb in vom Schlaganfall geschädigten Hirngewebe. Es zeigte sich, dass bei Gabe von 10 mg/Kg Bb eine Stunde vor dem Schlaganfall die Bb-Konzentrationen zwar deutlich abfallen, aber dann relativ konstant bleiben, was durch einen fehlenden Abtransport durch die unterbrochene Blutversorgung zu erklären ist.
1. Die Rotatorienfauna des Darnsees in Epe bei Bramsche, Kr. Bersenbrück, wurde zum ersten Male untersucht. In der Beobachtungszeit vom 1. V. 1959-28. 11. 1961 konnten 174 Formen festgestellt werden, unter denen sich sowohl Vertreter des Eulimnoplanktons als auch des Heleoplanktons befanden. Die Fülle der Arten konzentriert sich auf das Litoral und fällt hier besonders im Algenbewuchs auf. Im Pelagial fanden sich bisher nur 32 Arten. 2. Eine große Anzahl der Illorikaten, insbesondere viele nach der Kontraktion unbestimmbare Bdelloidae, wurden nimt erfaßt. In der aufgestellten Faunenliste finden sich 3 nicht sicher bestimmte Spezies: Colurella oblonga DONNER, Dicranophorus uncinatus (MILNE) und Collotheca gracilipes (EDMONDSON). 3. Alle aufgefundenen Spezies sind zum Teil schon recht lange bekannt und von früheren Autoren beschrieben; doch sind einige davon bisher in Mitteleuropa nur selten gefunden worden: Macrochaetus subquadratus, Microcoides robustus, Lepadella dactyliseta, Lepadella amphitmpis, Lecane opias, Lecane perplexa, Lecane perpusilla, Lecane stenroosi, Trichocerca uncinata, Testudinella reflexa, Testudinella parva, Testudinella parva var. bidentata, Testudinella emarginula, Ptygura hachiata var. bispicata, Ptygura velata, Collotheca algicola. Auffallend ist die Armut an Brachionusarten und das Fehlen der Gattung Pedalia. Neu beschrieben wurde Brachionus angularis f. caudatoides. 4. Die Zusammensetzung der Rotatorienfauna im Verlauf emes Jahres ändert sich ständig: Als perennierende Arten zeigten sich: Braehionus angularis, Keratella eochlearls, Lepadella patella, Lepadella triptera, Lepadella acuminata, Colurella obtusa, Colurella uncinata var. bieuspidata, Lecane closterocerca, Monomnata longiseta, Trichocerca poreelfus, Asplanchna priodonta, Testudinella patina, Steph.-moeeros fimbriatus, Collotheca campanulata, C. ornata var. comuta, Rotaria tardigyada, Rotaria Totatoyia. Als kaltstenotherme Arten traten auf: Filinia maior und Notholca labis. Zu den warmstenothermen Formen gehören hier: Trichotria tetractis, Anuraeopsis fissa, Platyias quadricomis, Platyias patulus, Brachionus quadridentatus, Leeane quadridentata, Lecane biturea, Polyarthra euryptera, Pompholyx sulcata, Ploesoma truncatum, Aseomorpha sattans, Ascomorpha ecaudis, Chromogaster ovalis, Conoehiloides dossuarius, Collotheea pelagiea, Collotheea mutabilis. Manche dieser Arten, die ein starkes Herbstmaximum aufweisen, verschwinden erst nach den ersten Nachtfrösten. Brachionus angularis, Keratella cochlearis, Asplanehna priodonta, Pompholyx sulcata und Ascomorpba saltans zeigten sich als dicyclische Formen mit ausgeprägten Frühjahrs- und Herbstmaxima. Conoehiloides dossuarius kam nur im September zur Massenentwicklung. 5. Die Untersuchungen werden in den kommenden Jahren fortgesetzt und in einem besonderen Nachtrag zu dieser Arbeit veröffentlicht.
In this thesis I have investigated the regulation of eicosanoid synthesizing-enzymes by cannabinoid receptor agonists. Rat renal mesangial cells were used as a model system. I could show that all three (CB1, CB2, and GPR55) cannabinoid receptors are expressed on the mRNA level in rat renal mesangial cells – but with differing expression profiles. The CB1 and GPR55 receptors are expressed in comparable amounts, whereas the CB2 receptor is considerably less expressed than the CB1 and the GPR55 receptors. Furthermore I could show that stimulation of renal mesangial cells with CB1 receptor agonists, such as R(+)MA or ACEA, increased IL-1β-induced cPLA2, sPLA2-IIa, and COX2 protein and mRNA expression which subsequently led to an enhanced IL-1β-induced PGE2 formation. Additionally, the IL-1β- induced sPLA2-IIa promoter activity was also increased by CB1 receptor stimulation. Besides the modulated expression of the eicosanoid synthesizing enzymes, I could show that CB1 agonists also led to an increase of IL-1β-induced iNOS expression and subsequent NO formation. In contrast, stimulation with CB2 selective agonists led to a decrease in IL-1β- induced sPLA2-IIa protein expression and PGE2 formation. Accordingly, the IL-1β-induced sPLA2-IIa promoter activity was also reduced by CB2 receptor agonists. IL-1β-induced iNOS expression and subsequent NO formation were not influenced by CB2 recptor activation. Matching the results I obtained with CB1 receptor agonists on IL-1β-induced PGE2 formation, I could observe an increased cPLA2 protein and mRNA expression with a subsequent increase in IL-1β-induced PGE2 formation by GPR55 stimulation. Stimulation with THC, an unselective CB agonist, increased the IL-1β-induced sPLA2-IIa protein expression and subsequently led to an enhanced IL-1β-induced PGE2 formation. Subjecting the cells to higher THC concentrations surprisingly led to a reduction of the IL-1b-induced sPLA2-IIa protein expression and PGE2 formation. A possible explanation may be the differential expression of the three CB receptors. At low concentrations THC may predominantly activate CB1 and GPR55 and with increasing concentration CB2 receptors may also be activated, slightly reversing the enhancing effect. Moreover, I could show that the CB1 receptor stimulation mediated phosphorylation and hence the activation of ERK1/2 MAPK. Additionally to ERK1/2, there was also a phosphorylation and activation of NFkB observed by CB1 receptor stimulation. In my thesis I could show for the first time that PPARα was activated by IL-1β in rMC. The IL-1β-induced PPARα promoter activity was completely inhibited by addition of the CB2 receptor agonist, JWH015. These findings were confirmed by inhibition of the IL-1β-induced PGE2 formation by a PPARα antagonist (MK-886). In summary, I could show that activation of CB1 receptors in our system led to a worsening of an inflammatory condition, whereas activation of the CB2 receptors led to the complete opposite; namely a reduction of the inflammatory response by reducing the sPLA2-IIa expression and PGE2 formation. GPR55 activation did not display any alteration of inflammatory conditions, since the classical inflammatory pathway was not influenced.
Einige Teilergebnisse dieser Arbeit wurden bereits veröffentlicht: Mahnke K., Schönfeld K., Fondel S. et al (2007), Int. J. Cancer 120; 2723-2733 Depletion of CD4+CD25+ human regulatory T cells in vivo: Kinetics of Treg depletion and alterations in immune functions in vivo and in vitro Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Treg depletierende Wirkung von ONTAK, einem Fusionsprotein aus Interleukin-2 und Diphterietoxin, untersucht. Hierzu wurde ONTAK in Zellkultur auf humanen Lymphozyten getestet und anschließend Melanomapatienten verabreicht. ONTAK konnte sowohl in vitro als auch in vivo eine Depletion von Tregs induzieren, wenngleich der in vivo Effekt nicht vollständig war. Des Weiteren wurde der immunologische Effekt, der auf die Reduktion der Tregs zurückzuführen ist, untersucht. Hierzu wurden die Patienten mit DCP behandelt, welches normalerweise zu einer schwachen Entzündungsreaktion führt. Nach Treg Depletion wurden starke Kontaktekzeme in den Patienten induziert. Aufgrund dieser verstärkten Immunantwort erfolgte eine Applikation der Tumorpeptide MART1 und gp100 in das Kontaktekzem. Anschließend konnten peptidspezifische CD8 T-Zell Populationen detektiert werden, die sowohl INF-γ sekretierten, als auch zytotoxisch aktiv waren. Solche starken Immunantworten wurden bisher nur unter zu Hilfenahme starker Adjuvanzien induziert. ONATK führt bereits nach einmaliger Applikation zu einer Depletion regulatorischer T-Zellen in vivo. Dabei wird der Gehalt von 4 % regulatorischen T-Zellen im Blut auf einen Gehalt von 1 % gesenkt. Diese Depletion der Tregs verstärkt eine Immunisierung mit Peptiden, die eine starke CD8 T-Zell vermittelte Immunantwort induziert. Allerdings kam es zu keiner vollständigen Depletion der Tregs, was durch die geringe in vivo Halbwertszeit von ONTAK, sowie durch unbekannte Mechanismen der Treg Homöostase erklärt werden könnte. Die Wirkweise von ONTAK konnte nur im Blut, aber nicht in anderen Organen wie z.B. Lymphknoten erforscht werden, daher besteht die Möglichkeit, einer unvollständigen Depletion der Zellen in peripheren Organen. In wieweit Tregs im Blut mit anderen Zellen wechselwirken ist weitgehenst unerforscht. Die meisten Untersuchungen zeigen Zell-Zell Interaktionen in den Lymphknoten und im entzündeten Gewebe. Der Ort, an dem die Tregs aber wirklich ihr suppressives Potential auf andere Zellen entfalten, ist noch unbekannt. Hiermit beschäftigt sich der zweite Teil dieser Arbeit. Zur Beantwortung dieser Frage sollten Tregs in vivo in Mäusen in die Haut oder den Lymphknoten geleitet werden. Um das Vorhaben auszuführen, wurden die Zytokinrezeptoren CCR7, CCR9 und CCR10 sowie die Adhäsionsmoleküle PSGL-1, ESL-1 und CD103 kloniert und in zwei Expressionssystemen getestet. Ein lentivirales System zeigte eine schlechte Transduktionseffizienz, so dass ein zweites System mit einer Elektroporationstechnik, der Nucleofection gewählt wurde. Dieses führte zu Expressionseffizienzen von ca. 40 %. Zuerst wurde die Funktionalität der klonierten Moleküle in vitro in der murinen T-Zellline EL-4 in Transwell- und Flowchamberversuchen demonstriert, anschließend wurden murine in vitro expandierte Tregs nucleofiziert. Eine umfassende Analyse der nucleofizierten Zellen zeigte eine Heraufregulation von CD69 und eine Herunteregulation von CD62L, was auf eine Aktivierung der Zellen deutet. Mit einhergehender Aktivierung nahm auch die Apoptoserate der Zellen zu, diese konnte auch durch Modifikationen der Nucleofections- sowie der Kulturbedingungen nicht verringert werden. Nach einer Inkubationszeit von 16 Stunden nach der Nucleofection ließen sich noch adhäsive Eigenschaften der exprimierten Moleküle in der Flowchamber nachweisen. Im Suppressionstest, in dem die Zellen über einen Zeitraum von drei Tagen inkubiert wurden, waren die Zellen jedoch nicht mehr suppressiv. Daher wären die in vivo Versuche, die den suppressiven Einfluß der Tregs auf die Ohrschwellung in Abhängigkeit ihrer Lokalisation untersuchen sollten, erfolglos geblieben. Mit der Induktion der Apoptose stießen die hier verwendeten Methoden an ihre Grenzen. Zur Realisierung des Projekts müssten andere Transduktionssysteme oder Tregs aus knock out Mäusen verwendet werden. Regulatorische T-Zellen nehmen eine Schlüsselrolle bei der Suppression von anti-Tumor Immunantworten aber auch bei dem Schutz vor Autoimmunerkrankungen ein. Eine erfolgreiche Manipulation dieser Zellen in vivo oder in vitro bildet eine solide Basis für neuartige Immuntherapien gegen entsprechende Krankheiten. ONTAK ist ein wirkungsvolles Medikament, um die Anzahl der regulatorischen Zellen in vvo zu reduzieren. Es trägt dadurch zu einer verstärkten Immunantwort bei. Eine einmalige Gabe von ONTAK ist sicherlich nicht ausreichend, um Tumore zu bekämpfen, es kann aber Immuntherapien unterstützen. Eine Manipulation von Tregs, durch die Expression von Transgenen um ihr Migrationsverhalten in vivo zu beeinflussen und damit die Suppression von Autoimmunerkrankungen zu bedingen, ist noch nicht ausgereift und bedarf noch weiterer Forschung.
In der Vergangenheit wurden verschiedene Fusionstranskripte, welche normalerweise bei Leukämie-assoziierten chromosomalen Translokationen auftreten, in hämatopoetischen Zellen gesunder Personen gefunden. Da diese Personen keine entsprechenden chromosomalen Abberationen aufwiesen, ist es sehr wahrscheinlich, dass diese Fusionstranskripte durch trans-Spleißen entstehen. Während dieser Arbeit konnten durch inverse PCR, welche an unbehandelter cDNA gesunder Probanden durchgeführt wurde, intragenische trans-Spleiß-Produkte nachgewiesen werden. Interessanterweise weisen das MLL-Gen und seine fünf häufigsten Translokationspartner AF4, AF9, AF10, ELL und ENL ein großes Spektrum an trans-gespleißten RNAs auf. Nur in einem weiteren Mitglied der MLL-Familie (MLL3) konnte intragenisches trans-Spleißen nachgewiesen werden. Für verschiedene als Kontrolle verwendete Haushaltsgene konnte kein intragenisches trans-Spleißen nachgewiesen werden. Intergenische trans-Spleiß-Ereignisse konnten durch direkte PCR und RACEExperimente für die Gene MLL, ELL und ENL nachgewiesen werden. Bemerkenswerterweise entsprechen ein intragenisches trans-Spleiß-Produkt des MLL-Gens dem Transkript der chromosomalen Abberationen MLL-PTD und ein intergenisches trans-Spleiß-Produkt des MLL-Gens dem Transkript der chromosomalen Abberationen MLL•AF4. In Hefe konnte gezeigt werden, dass RNA als Vorlage für DNA-Reparaturen dienen kann. Somit lag der Schluß nahe, dass die oben genannten trans-gespleißten RNAs möglicherweise einen Einfluss auf die DNA-Reparatur haben. Dass RNA nicht nur in Hefen sondern auch in Menschen als Vorlage für DNA-Reparaturen dienen kann, konnte im Zuge dieser Arbeit durch mehrere in vitro Experimente mit Kernextrakten aus humanen Zelllinien bestätigt werden. Allerdings konnte keinerlei Einfluss von (trans-)gespleißter RNA auf die DNA-Reparatur in zahlreichen in vitro Experimenten nachgewiesen werden. Mit einem daraufhin etablierten in vivo System konnte ebenfalls ein Einfluss von (trans-) gespleißter RNA auf die DNA-Reparatur ausgeschlossen werden. Weiterhin konnten mit Hilfe der durchgeführten RACE-Experimente vorzeitige Polyadenylierungen von Transkripten in den Bruchpunktsregionen von MLL, AF4, AF9 und ENL identifiziert werden. Durch diese ungewöhnliche Termination der Transkription werden stark verkürzte Transkripte erzeugt, welche in kurze Proteinisoformen translatiert werden können. Ein Vergleich von 274 unterschiedlichen Bruchpunktsequenzen mit größeren direkten und indirekten Sequenzwiederholungen zwischen der Bruchpunktsregion von MLL und den Bruchpunktsregionen seiner häufigsten Translokationspartner wurde ebenfalls durchgeführt. Eine signifikante Korrelation zwischen den Sequenzwiederholungen und der Lokalisation der Bruchpunkte war jedoch nicht erkennbar. Bei diesem Vergleich fielen allerdings Häufungen von Bruchpunkten im MLL-Gen mit AF4, AF9 und ENL als Translokationspartner auf, wobei sich die Ursache für diese Häufungen auf Topoisomerase II Spaltstellen zurückführen ließ.
Mit den in dieser Arbeit entwickelten und getesteten Nachweismethoden konnte in verschiedenen Marktstudien gezeigt werden, dass sowohl molekularbiologische als auch immunologische Verfahren für den Nachweis von versteckten Allergenen in Lebensmitteln geeignet und auch miteinander vergleichbar sind. Dies wurde in zwei Studien deutlich, in denen beide Methoden sowohl für den Haselnuss- bzw. Erdnussnachweis miteinander verglichen wurden. In beiden Studien wurde eine sehr gute Übereinstimmung der beiden Verfahren gefunden. Nur in Einzelfällen gab zwischen beiden Methoden Abweichungen im Resultat, was aber fast ausschließlich Proben betraf, die einen sehr geringen Anteil (ca. 10 ppm Protein) Haselnuss bzw. Erdnuss enthielten. Damit konnte erstmals im direkten Vergleich gezeigt werden, dass PCR-basierte Methoden für den Allergennachweis in prozessierten Lebensmitteln genauso gut geeignet sind, wie antikörperbasierte Methoden. Allerdings besteht bis zum heutigen Zeitpunkt das Problem solche Anteile korrekt zu quantifizieren, da es an Referenzmaterialien mangelt, die es ermöglichen würden einen Mengenstandard für ein quantitatives Verfahren herzustellen. Momentan sind quantitative Messungen nur exakt möglich, wenn die zu untersuchende Lebensmittelmatrix genau bekannt ist und ein entsprechender Standard generiert werden kann. Trotzdem bieten beide Verfahren die Möglichkeit prozessierte Lebensmittel sehr empfindlich auf allergene Bestandteile zu untersuchen, um somit sicherzustellen dass die aktuellen gesetzlichen Regelungen und Richtlinien für die Etikettierung von Lebensmitteln, wie die EU-Richtlinie 2006/146/EU bzw. die Lebensmittelkennzeichnungsverordnung (LMKV), von den Lebensmittelherstellern eingehalten werden. Weiterhin bieten die etablierten Nachweismethoden den Herstellern die Möglichkeit, ihre Produktion im Hinblick auf potenzielle Kontaminationsrisiken mit allergenen Zutaten zu überprüfen bzw. die Effizienz der verwendeten Reinigungsmethoden einzuschätzen. Dies wurde erstmals im Rahmen an einer Modellstudie in Zusammenarbeit mit einem Aromenhersteller durchgeführt. In dieser Studie sollte die Effizienz von verschiedenen Reinigungsprozeduren hinsichtlich der Kontaminationsgefahr von allergenfreien Nachfolgeprodukten überprüft werden. Es konnte gezeigt werden, dass der verwendete Reinigungsprozess sehr effektiv abläuft und nicht mit Kontaminationen gerechnet werden muss. Diese Studie hat exemplarisch gezeigt, dass es möglich ist, allergenspezifische Nachweismethoden in einem Betrieb einzusetzen, um die Belastung der Produktionsanlage und der hergestellten Produkte mit potenziellen Allergenen zu überwachen. Prinzipiell sollte es also möglich sein allergenspezifische HAACCP Konzepte innerhalb eines Betriebes zu etablieren, um so die Produktsicherheit noch weiter zu verbessern. Abschließend kann man sagen, dass die Entwicklung von allergenspezifischen Nachweismethoden einen wichtigen Beitrag zur Gewährleistung der Lebensmittelsicherheit darstellt. Nicht nur dass diese Methoden wichtig sind, um bestehendes Recht zu überwachen, sie sind auch für die Lebensmittelproduzenten ein wichtiges Werkzeug die Qualität ihrer Produkte zu erhöhen.
The research presented in this thesis characterizes U2AF homology motifs (UHM) and their interactions with UHM ligand motifs (ULM) in the context of splicing regulation. UHM domains are a subgroup of RNA recognition motifs (RRM) originally discovered in the proteins U2AF65 and U2AF35. Whereas canonical RRMs are usually involved in binding of RNA, UHM domains bind tryptophan containing linear protein motifs (ULM) instead. In the first article, we analyze the complex network of interactions between splicing factors and RNA that initiate the assembly of the spliceosome at the 3´ splice site of an intron. The protein U2AF65 binds a pyrimidine-rich element in introns and recruits U2snRNP by binding its protein component SF3b155. My contribution was to define the binding site of the protein U2AF65 to the intrinsically unstructured N-terminus of the scaffolding protein SF3b155. I could show that the UHM domain of U2AF65 recognizes a ULM in SF3b155, and that this binding site is not overlapping with the binding sites of other splicing factors, like p14, to SF3b155. As the U2AF65-UHM:SF3b155-ULM interaction is mutually exclusive with an interaction between U2AF65-UHM and a ULM in the splicing factor SF1, which was reported to initially recognize the branch point sequence, my results provide the molecular details on how SF3b155 replaces SF1 during spliceosomal reorganizations. In the second article, we show that overexpression of the UHM domain of the splicing factor SPF45 induces exon 6 skipping in the pre-mRNA of Fas (CD95/APO-1). I provide evidence for in vitro binding of SPF45-UHM to ULM sequences in the splicing factors U2AF65, SF1, and SF3b155. I crystallized free and SF3b155-bound SPF45 UHM and solved both structures by X-ray crystallography. The analysis of the complex interface and sequence differences in the ULMs allowed me to design mutations of SPF45-UHM, which selectively inhibit binding to distinct ULMs. After assessing the ULM binding properties in vitro, we could show that the activity of SPF45-UHM in influencing the splicing pattern of Fas relies on interactions with SF3b155 and/or SF1, but that an interaction with U2AF65 is dispensable. A mechanism for the activity of SPF45-UHM could thus be engaging in ULM interactions and thus interfering with the network of interactions that initiate the assembly of the spliceosome at the 3´splice site, as described above. In the third article, we describe an unusual flexible homodimerization mode of the UHM in the splicing factor Puf60, which enables simultaneous interactions with ULM sequences on other splicing factors. I could show that the NMR relaxation properties of Puf60-UHM are inconsistent with a model of a rigid dimer, but rather indicate a dimerization via a flexible linker. I identified a flexible loop in the peptide backbone of Puf60-UHM, and showed that mutiation of acidic residues in this loop impairs the dimerization. To analyze the dimerization interface in further detail, I solved the structure of Puf60-UHM by X-ray crystallography. The acidic residues in the flexible loop of one UHM dimer subunit mediate the dimerization by contacting basic residues on the β-sheet surface of the other dimer subunit. Differences in the four dimer interfaces observed for the eight molecules in the asymmetric unit of the crystal support the model of an undescribed, flexible mode of dimerization, and thus complement the NMR relaxation data. Furthermore, I could show that the Puf60-UHM dimer and U2AF65-UHM contact different ULM sequences on the SF3b155 N-terminus in vitro, thus providing a possible explanation for the mutual cooperative activation of Puf60 and U2AF65 in splicing assays described in the literature. The fourth article is a review about recent research on the recognition of DNA double strand breaks (DSB) by covalent histone modifications. The p53 binding protein 1 (53BP1) is a DSB sensor and a checkpoint protein for mitosis. Recent crystallographic evidence indicates that 53BP1 recognizes DSB sites by binding histone H4 dimetylated at lysine 20 (H4-K20). We provide a comprehensive overview of the atomic resolution structures that revealed how proteins can specifically recognize histone tail modifications, especially methylated lysines, to read the information stored in what is called the histone code.
Acetaldehydaddukte an Hämoglobin werden als potentieller biochemischer Marker für Alkoholmissbrauch betrachtet, konnten aber bisher in vivo noch nicht eindeutig nachgewiesen werden. Es wurden Methoden entwickelt, um Acetaldehydmodifiziertes Hämoglobin sowohl nach Inkubation in vitro als auch in humanen Blutproben nachzuweisen. Verwendung fanden sowohl chromatographische als auch elektrophoretische Trennmethoden in Kombination mit unterschiedlichen Massenspektrometern zur Detektion. Es wurden unterschiedliche Patienten- und Probandenkollektive betrachtet. Aus Blutproben von Patienten aus Alkoholentzugskliniken, von Probanden eines kontrollierten Trinkversuches und Blutproben von Personen mit moderatem Alkoholkonsumverhalten wurde versucht, modifiziertes Hämoglobin mit Alkoholkonsum zu korrelieren. Desweiteren wurden Blutproben von Kindern untersucht, bei denen keine Alkoholexposition zu erwarten war, um eventuell vorhandenes endogenes modifiziertes Hämoglobin nachzuweisen. Zusätzlich zu den Untersuchungen in vitro und in vivo wurden auch post-mortale Proben analysiert, um modifiziertes Hämoglobin mit einem prämortalem Alkoholkonsum zu korrelieren und auf mögliche andere Einflüsse, insbesondere hinsichtlich post-mortaler Parameter zu untersuchen. Modifizierte Globinketten waren nach Synthese aus Hämoglobin und Acetaldehyd zugänglich und konnten in vitro nachgewiesen werden. Hierbei zeigte sich, dass Acetaldehyd auch mehrfach kovalent an beide Hämoglobinketten binden kann. Weder mehr- noch einfach modifizierte Hämoglobinketten konnten allerdings in authentischen humanen Blutproben nachgewiesen werden. Die Empfindlichkeit konnte jedoch nach proteolytischem Verdau so weit gesteigert werden, dass Acetaldehydmodifizierte Hämoglobinpeptide nicht nur nach Inkubation von Hämoglobin mit Acetaldehyd, sondern auch in authentischen Blutproben sämtlicher untersuchter Kollektive nachweisbar waren. Es wurde gezeigt, dass ein intermolekularer Austausch von Acetaldehyd nach proteolytischem Verdau zur Bildung eines Peptidadduktes am neu entstandenen N-Terminus des jeweiligen Peptides führen kann. Ein Hinweis auf andere mögliche Bindungsstellen ergab die Analyse des in vitro synthetisierten Peptides Hbα(17-31)2Ach mit zwei gebundenen Molekülen Acetaldehyd. Insgesamt konnten in authentischen Proben 10 Peptide mit Acetaldehydmodifikation, welche jeweils als chromatographisch trennbare Stereoisomere auftraten, nachgewiesen werden. Dies geht einher mit einer bereits vorgeschlagenen Bildung diastereomerer Imidazolidinonderivate. Acetaldehydmodifizierte Hämoglobinpeptide waren nicht nur in Proben von Patienten und Probanden mit nachweisbarem Blutalkohol vorhanden, sondern auch in Blutproben von Alkoholikern, Studenten und Kindern ohne akuten Alkoholkonsum. Der Nachweis dieser Addukte auch ohne exogene Alkohol- oder Acetaldehydexposition lässt darauf schliessen, dass diese posttranslationale Modifikation im menschlichen Körper abläuft, Acetaldehydaddukte also auch endogen gebildet werden. Ein erhöhtes Verhältnis von modifizierten Peptiden zu deren unmodifizierten Homologen zeigte sich konzentrationsabhängig nach Inkubation von Hämoglobin mit Acetaldehyd in vitro. Langfristiger zurückliegender Alkoholkonsum konnte in Studien mit Patienten einer Rehabilitationseinrichtung und mit Probanden mit moderatem Alkoholkonsum nicht mit Hämoglobinaddukten korreliert werden. Erhöhte Adduktverhältnisse im Vergleich mit Proben ohne Blutalkoholkonzentration des gleichen Kollektivs konnten bei Patienten einer Alkoholentzugsklinik, in post-mortalen Proben und im Rahmen eines kontrollierten Trinkversuches nachgewiesen werden. Die Kinetik der Bildung und Elimination Acetaldehydmodifizierten Hämoglobins wurde sowohl anhand von Blutproben von Patienten einer Alkoholentzugsklinik untersucht, erhöhte Adduktverhältnisse waren hier nur kürzer als 5 Tage nachweisbar. Diese schnelle Elimination wurde im Rahmen eines kontrollierten Trinkversuches bestätigt. Hierbei fand sich ein signifikanter Anstieg Acetaldehydmodifizierter Hämoglobinpeptide bereits nach einmaligem moderatem Alkoholkonsum, welcher bereits bei Blutalkoholkonzentrationen von durchschnittlich 0,12 g/L auftrat und noch mindestens 6 Stunden, aber nicht mehr 24 Stunden nach Trinkende anhielt. Daher liegt die mögliche Anwendung dieses empfindlichen Assays im Nachweis eines kurzfristigen Alkoholkonsums. Sämtliche Peptide wurden hinsichtlich Empfindlichkeit und Spezifität zur Identifizierung eines Alkoholkonsums sowohl in vivo als auch in post-mortalen Proben anhand unterschiedlicher Schwellenwerte untersucht. Desweiteren wurde für diese Peptide die analytische Präzision betrachtet. Als Markerpeptid eines kurzfristigen Alkoholkonsum sowohl in vivo als auch in post-mortalen Blutproben wird hierbei Hbα(32-40)Ach vorgeschlagen. Der mögliche Vorteil bei der Betrachtung dieses Peptids im Vergleich mit anderen bereits etablierten Markern zum Nachweis eines kurzfristigen Alkoholkonsums liegt in der für den Nachweis benötigten geringen Materialmenge, welche bei der Bestimmung mittels HPLC/TOF-MS 80μg Hämoglobin betrug, was etwa der Hämoglobinmenge entspricht, die in etwa 2,5 Millionen Erythrozyten, entsprechend 0,6 μl Blut enthalten ist. Denkbar ist dadurch die Bestimmung in Blutspuren, aus denen ansonsten kein Nachweis von Ethanol oder anderer Marker eines Alkoholkonsums möglich wäre, z.B. aus getrockneten Blutspuren.
1. Die Deletionsderivate der Kompetenzproteine ComZ und PilO wurden als Fusionsproteine mit einem Maltosebindeprotein überproduziert, über eine Amylosesäule aufgereinigt und in denaturierter Form für die Generierung von polyklonalen Antikörpern in Kaninchen eingesetzt. Es konnten spezifische Antikörper gegen PilO generiert werden. 2. Mittels Western-Blot-Analysen subzellulärer Fraktionen des Wildtyps und der pilO::kat-Insertionsmutante konnte das PilO-Protein mit einer molekularen Masse von 21 kDa in der inneren Membran detektiert werden. 3. Mutantenstudien ergaben, dass in der pilO::kat-Mutante andere Kompetenzproteine in ihrer Lokalisation nicht beeinträchtigt sind und dass die Lokalisation des PilO-Proteins in anderen transformationsdefekten Mutanten nicht beeinträchtigt ist. Einzig eine verringerte Menge des PilF-Proteins in der inneren Membran der pilO::kat-Mutante wurde detektiert. Diese Ergebnisse indizieren eine Interaktion des PilO- und des PilFProteins. 4. Für die Analysen des DNA-Transports wurde ein Testsystem etabliert. 5. Durch DNase-Behandlung konnte zwischen gebundener und aufgenommener DNA differenziert werden. 6. Durch den Einsatz des Komplexbildners EDTA konnte gezeigt werden, dass die DNABindung bzw. auch die DNA-Aufnahme in Thermus von zweiwertigen Ionen beeinflusst wird. 7. Unterschiedliche DNA-Formen, wie z. B. lineare, zirkuläre Plasmid-DNA und chromosomale DNA, werden zu gleichen Mengen gebunden und aufgenommen. Die Transformationshäufigkeiten in unterschiedlichen DNA-Formen jedoch zeigen Unterschiede. Dabei wird lineares Plasmid um einen Faktor von ca. 100 schlechter transformiert als zirkuläres Plasmid. Nukleotide werden von Thermus nicht gebunden und aufgenommen. 8. Kinetische Analysen des DNA-Binde- und -Aufnahmeapparates in Thermus ergaben eine Geschwindigkeit der DNA-Akkumulation von 1,5 μg DNA pro mg Protein und min und einen Km-Wert von 48 μg DNA/ml. 9. Chromosomale DNA aus Vertretern der unterschiedlichen Domänen Archaeen, Bakterien und Eukarya werden von Thermus gleichermaßen gut gebunden und aufgenommen. 10. Entkoppler sowie ATPase-Inhibitoren verhindern DNA-Aufnahme. Dies führt zu dem Schluß, dass DNA-Aufnahme in Thermus energieabhängig ist. 11. Die aufgenommene DNA kann nicht als Kohlenstoff-, Stickstoff- oder Phosphatquelle genutzt werden, und die Nukleotide werden nicht als Vorstufen bei der Nukleinsäuresynthese weiterverwendet. 12. Durch DNA-Binde- und -Aufnahmestudien unterschiedlicher transformationsdefekter Mutanten konnte die Rolle einzelner Kompetenzproteine bei der DNA-Bindung und/oder -Aufnahme geklärt werden. Die Ergebnisse indizieren, dass PilQ an der DNA-Bindung und -Aufnahme beteiligt ist. 13. DNA-Binde- und -Aufnahmestudien mit comEA::kat-, pilA4::kat-, pilF::kat-, pilD::kat- und pilW::kat-Mutanten indizieren, dass die Proteine an dem DNA-Transport über die äußere Membran beteiligt sind. 14. Mutanten mit Defekten in den Kompetenzproteinen ComEC, DprA, PilA1, PilA2, PilA3, ComZ, PilM, PilN, PilO, PilC akkumulieren DNA im DNase-resistenten Zustand, vergleichbar dem Wildtyp. Dies indiziert eine Rolle dieser Proteine am DNA-Transport über das Periplasma und/oder die innere Membran.