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Die Translokation von gelösten Stoffen über zelluläre Membranen ist ein essentieller biologischer Prozess, der durch eine Vielfalt an integralen Membranproteinen vermittelt wird. Diese sind in den selektiven Austausch verschiedenster Stoffe bzw. Teilchen involviert und ermöglichen somit die Kommunikation zwischen den einzelnen Zellkompartimenten untereinander bzw. mit der extrazellulären Umgebung. Eine der größten Familien paraloger Proteine, die den vektoriellen Transport von Substanzen über Zellmembranen katalysieren, stellen die ATP‐binding cassette (ABC)‐Transporter dar. Mitglieder dieser Proteinfamilie sind in allen bisher untersuchten Organismen von Prokaryoten bis hin zu höheren Eukaryoten vertreten und übernehmen essentielle Funktionen in einer Vielzahl von zellulären Abläufen. ABC‐Transporter zeichnen sich durch eine breite Substratdiversität aus, d.h. sie energetisieren unter ATP‐Verbrauch die Translokation zahlreicher, strukturell und chemisch unterschiedlicher Substanzen wie Zucker, Lipide, Ionen, Aminosäuren, Proteine oder auch zelltoxische Stoffe. In Bakterien können sie sowohl als Importproteine fungieren, welche hauptsächlich die Aufnahme von Nährstoffen vermitteln, als auch als Exportproteine, deren Hauptaufgabe es ist, zelltoxische Substanzen aus der Zelle heraus zu schleusen. Eukaryotische ABC‐Transporter sind sowohl in der Plasmamembran als auch in den intrazellulären Membranen zu finden – beispielsweise in denen des Endoplasmatischen Retikulums, des Golgi Apparats, der Lysosomen, der Peroxisomen und der Mitochondrien. Sie fungieren als Exportproteine und sind z.B. an der Ionen‐Homöostase, der Antigenprozessierung, der Insulinfreisetzung oder am Cholesterol‐ und Lipidtransport beteiligt. ...
Fuer die schlechte Prognose von Glioblastompatienten mit einer ueberlebenszeit von 9-15 Monaten (Norden and Wen, 2006) ist vor allem die hohe Invasivitaet dieser Tumore verantwortlich. Nach operativer Entfernung des Haupttumors entstehen aus den verbleibenden invadierten Zellen sekundaere Tumore, die sich mitunter ueber weite Bereiche des Hirns verteilen. Des Weitern sind die hochinvasiven Tumorzellen oft resistent gegen Chemo- und Strahlentherapie (Drappatz et al., 2009; Lefranc et al., 2005). In Maustumormodellen und Pateinten konnte zudem gezeigt werden, dass die neuartige antiangiogenetische Therapie zwar das Tumorwachstum verringert, jedoch die Invasivitaet stark erhoeht. (Norden et al., 2008; Ebos et al., 2009; Paez-Ribes et al., 2009). Ueber die Mechanismen die diese hohen Invasivitaet induzieren, ist bislang nur sehr wenig bekannt. Die durch Reduktion von Blutgefaessen steigende Hypoxie des Tumors foerdert die Expression von Matrix-Metalloproteinasen (MMPs). Dies fuehrt zum Abbau der extrazelluaeren Matrix des umgebenden gesunden Gewebes und beguenstigt dadurch die Tumorzellinvasion (Indelicato et al., 2010; Miyazaki et al., 2008; Shyu et al., 2007). Die Umformung des Aktinzytoskeletts und damit die Mobilitaet von Zellen wird vorwiegend durch ein akkurates Zusammenspeil der Rho GTPasen Rac, Rho und Cdc42, kontrolliert (Ridley et al., 2003). Fuer die Organisation von Axonen im Nervensystem und fuer die Blut- und Lymphgefaessbildung wurde gezeigt, dass die Interaktion der Eph-Rezeptortyrosinkinasen und Ihrer Ephrin-Liganden Signalwege induziert, die in die Regulation dieses Zusammenspiels involviert sind (Egea and Klein, 2007; Makinen et al., 2005; Palmer et al., 2002; Sawamiphak et al., 2010). Des Weiteren zeigt die Analyse der Genloci von Eph-Rezeptoren und Ephrinen in verschieden Hirntumoren eine gehaeufte Deletionen des Ephrin-B2-Gens. Die Quantifizierung von Ephrin-B2 mRNA in diesen Tumoren hat ausserdem ergeben, dass mit zunehmender Malignitaet die Expression von Ephrin-B2 sinkt. Aus diesen Gruenden wurden die Untersuchungen in dieser Arbeit auf die Rolle von Ephrin-B2 anhaengigen Signalwegen in der Glioblastomzellinvasion konzentriert. In einem modifiziertem Boyden-Chamber-Assay konnte gezeigt werden, dass das Ephrin-B2 induzierte EphB4 forward signaling und EphB4 induzierte Ephrin-B2 reverse signaling die Invasivitaet der human Glioblastomzelllinien LN-229, G55 und SNB-19 reduziert. In einem Maustumormodel konnte weiterhin gezeigt werden, dass Ephrin-B2 Knock-Out (KO) Astrozytomzellen, im Vergleich zu Wild-Typ (WT) Zellen, Tumore mit einem groesseren Volumen und einer erhoehten Invasivitaet bilden. Da die Expressionslevel fuer die Ephrin-B2 bindenden Rezeptoren EphA4, EphB1 EphB3 und EphB6 auch im adulten Hirn hoch sind (Hafner et al., 2004), weisen diese in vitro und in vivo Ergebnisse auf eine Tumorsupressorfunktion von Ephrin-B2 hin, die durch repulsive Effekte des Ephrin-B2 reverse signaling vermittelte werden koennten. Dies geht mit Erkenntnissen ueber kolorektale Tumore einher (Batlle et al., 2005). Die in einem Sphaeroid-Invasionsassay mit einer EphB-Rezeptoren freien Umgebung beobachtete verminderte Invasion von Ephrin-B2 WT deutet auf eine zusaetzliche invasionsblockierende Rolle der Ephrin-B2-Eph-Rezeptor Interaktion zwischen benachbarten Tumorzellen hin, wie sie auch in Brusttumoren gefunden wurde (Noren et al., 2006). Es scheint als sei Tumorprogression und Invasion erst moeglich, nachdem die Expression von Ephrin-B2 vermindert wurde. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass in hypoxischen Glioblastomzellen die Ephrin-B2 Expression durch die direkte Bindung des den Transkriptionsfaktors ZEB2 an den Ephrin-B2 Promoter reprimiert wird. In einem Weiteren Maustumormodel konnte gezeigt werden, dass die Blockierung der ZEB2 Expression mittels shRNA und die damit einhergehenden Inhibition der hypoxie induzierten Ephrin-B2 Repression das Wachstum und die Invasivitaet von Glioblastomen verringert. Zusaetzlich wurde gezeigt, dass der Verlust von ZEB2 ausreicht, die durch antiangiogenetische Therapie induzierte stark erhoehte Invasivitaet zu vermeiden. Die in dieser Arbeit gewonnen Erkenntnisse fuehren zu folgendem Modelmechanismus. In kleinen normoxischen Tumoren koennen repulsive Effekte des Ephrin-B2 reverse signalings und EphB forward signalings zwischen Tumorzellen und Zellen des umgebenden Gewebes die Ausbreitung und Invasion des Tumors unterdruecken. Zusaetzlich koennte das Ephrin-B2 induzierte EphB forward signaling zwischen benachbarten Tumorzellen die Mobilitaet der Tumorzellen wie in Brusttumoren inhibieren. Beim Erreichen einer bestimmten Tumorgroesse tritt Hypoxie auf, wodurch HIF-1alpha stabilisiert wird. Dies fuehrt dann zur ZEB2 Expression und leitet die Repression von Ephrin-B2 ein, was wiederum zur erhoehten Tumorzellemobilitaet und im Zusammenspiel mit MMPs zu Invasion fuehren kann. Gleichzeitig werden durch den HIF-induzierten VEGF-Gradienten neue Blutgefaesse rekrutiert. Damit wird der hypoxie-induzierten Invasivitaet entgegengewirkt. Wird mittels antiangiogenetischer Behandlung versucht Tumorprogression entgegenzuwirken, resultiert daraus eine erneut gesteigerte Hypoxie, die dann durch die ZEB2 vermittelte Repression von Ephrin-B2 wieder eine erhoehte Invasivitaet induzieren kann. Das Blockieren der ZEB2 Expression kann dieser durch antiangiogenetischen Behandlung induzierten Invasivitaet entgegenwirken.
The technique of site-specific fluorescence labelling with Tetramethylrhodaminemaleimide (TMRM) in combination with two electrode voltage-clamp technique (TEVC), an approach that has been named voltage clamp fluorometry (VCF), has been used in this work to study the Na,K-ATPase. The TMRM dye has the ability to attach covalently to cysteine residues and it responds to changes in the hydrophobicity of its local environment. We exploited this property using a construct of the Na-pump in which the native, extracellularly accessible cysteines were removed and cysteine residues were introduced by site-directed mutagenesis in specific positions of the Na-pump. In this way it was possible to detect site-specific conformational rearrangements of the Na-pump in a time-resolved fashion within a native membrane environment. In particular this technique allows to resolve reactions with low electrogenicity that cannot be satisfactorily analyzed with purely electrophysiological techniques and to identify the conformations of the enzyme under specific ionic composition of the measuring buffers. We used VCF to study the influence that several cations like Na+, K+, NMG+, TEA+ and BTEA+ exert on the distribution of the Na,K-ATPase between several enzymatic intermediates and on some of the reactions related to cation transport. To this end we utilized the mutants N790C in the loop M5-M6 and the mutant E307C, T309C, L311C and E312C in the loop M3-M4. From the correspondence of the fluorescence changes with the activation and inhibition of pumping current, by K+ and ouabain respectively, and from the fact that in Na+/Na+ exchange conditions the voltage distribution of charge movement and fluorescence changes evoked by voltage jumps are in reasonable agreement we conclude that through the fluorescence signals measured from these mutants, we can indeed monitor conformational changes linked to transport activity of the enzyme. For the mutants N790 and L311, it was found that the Na+ dependence of the amplitude and kinetics of the fluorescence signal associated with the E1P-E2P transition is in agreement with the prediction of an access channel model describing the regulation of the access of extracellular Na+ to its binding site. In particular for the mutants E307 and T309 it was found that in Na+/Na+ exchange conditions, the conformational change tracked by the fluorescence was much slower than the charge relaxation at hyperpolarized potentials while the kinetics was very similar at depolarized potentials. This implies that at hyperpolarized potentials the conformational change connected to the E1P-E2P transition does not give a large contribution to the electrogenicity of the process which is also consistent with the access channel model. On the mutant N790C it was found that the external pH does not seem to have any effect on the E1P-E2P equilibrium even if it seems to modulate the fluorescence quantum yield of the dye. Fluorescence quenching experiments with iodide and D2O indicate that at hyperpolarized potentials the local environment of the mutant N790C, experiences a small change in the accessibility to water without major changes in the local electrostatic field ...
Die halophilen Archaea Haloferax volcanii und Halobacterium salinarum haben sich aufgrund ihrer metabolischen Vielseitigkeit und der Verfügbarkeit vieler molekulargenetischer und biochemischer Techniken zu archaealen Modellorganismen für die Untersuchung zellulärer Prozesse entwickelt. In den vergangenen Jahren wurden eine Vielzahl prokaryaler Genome sequenziert, es zeigte sich jedoch, dass ca. 30% aller Gene keine Funktion zugeordnet werden kann. Die funktionelle Genomforschung zielt darauf, durch parallele genomweite Untersuchung der Genexpression die Funktion der Transkripte bzw. der Proteine aufzuklären. In der vorliegenden Arbeit wurden für beide halophilen Archaea genomweite Genexpressionsanalysen unter Verwendung der DNA-Mikroarray- Technologie etabliert. Aufgrund der derzeit nicht vorhandenen Genomsequenz wurde für die Untersuchung der Genexpression von H. volcanii der erste und bisher einzig beschriebene genomweite shotgun-DNA-Mikroarray konstruiert. Dazu wurde zunächst eine Genombibliothek mit einer durchschnittlichen Fragmentgröße von 1,5 kb hergestellt. Die Genombibliothek wurde anschließend in eine PCR-Produkt-Bibliothek umgewandelt, die dazu genutzt wurde, in einem hochdichten Raster zwei DNA-Mikroarrays herzustellen, einen 960-Sonden DNA-Mikroarray zur Etablierung und Optimierung der Methode und einen 2880-Sonden DNA-Mikroarray, der einer einfachen Genomabdeckung entspricht. Für den Vergleich der Genexpression nach einer Änderung der Kohlenstoffquelle wurden Zellen von H. volcanii einem Wechsel von Wachstum mit Aminosäuren zu Wachstum mit Glukose als alleiniger Kohlenstoff-Quelle unterzogen. Die Transkriptomänderungen vom Wechsel der Kohlenstoff-Quelle bis zum erneuten Beginn des exponentiellen Wachstums wurden zu fünf Zeitpunkten mit dem 2880-Sonden DNA-Mikroarray analysiert. Es wurden fünf verschiedene Klassen kinetisch gleichregulierter Gene gefunden, die entweder induziert, reprimiert oder transient induziert waren. Insgesamt wurden ca. 10% aller Gene zu mindestens einem Zeitpunkt mehr als 2,5 fach reguliert. Für Gene aller fünf Klassen wurden die Ergebnisse durch Northern-Analysen verifiziert. Die Identität der regulierten Gene wurde durch Sequenzierung der PCR-Produkte von beiden Enden ermittelt. Es wurde ein breites Spektrum an Genen identifiziert, deren Genprodukte für unterschiedliche funktionelle Kategorien wie Stoffwechselenzyme, ABC-Transporter, regulatorische Proteine und hypothetische Proteine usw. kodieren. Viele gleichregulierte Gene kodieren für Proteine gemeinsamer Funktion. Erwartete wie auch unerwartete Ergebnisse erlaubten Vorhersagen über den zentralen Metabolismus, die Transportkapazität und der zellulären Organisation bei Wachstum von H. volcanii auf Aminosäuren bzw. Glukose. Die Mikroarray-Analysen stehen im Einklang mit der Wachstumsrate und dem Ribosomengehalt von H. volcanii bei Wachstum auf den alternativen Kohlenstoffquellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass ein shotgun-DNA-Mikroarray mit einfacher Genomabdeckung die Charakterisierung der Regulation metabolischer Prozesse sowie die funktionelle Charakterisierung von Proteinen bzw. Proteinkomplexen erlaubt. Für Halobacterium salinarum, dessen Genomsequenz bekannt ist, wurde ein genomweiter genspezifischer DNA-Mikroarray konstruiert. Hierzu wurde jeder ORF des Genoms unter Verwendung von ORF-spezifischen Oligonukleotiden mittels PCR amplifiziert. Zur Etablierung dieses Systems wurden zunächst mit einem 200-Sonden DNA-Mikroarray exemplarisch Genexpressionsanalysen für zwei verschiedene Wachstumsbedingungen durchgeführt. Bei anaeroben Wachstum von H. salinarum durch fermentativen Argininabbau wurden im Vergleich zu aeroben Wachstum die für die Argininfermentation essentiellen Gene induziert. Dagegen wurden charakteristische Gene des aeroben Stoffwechsels reprimiert. Zur Untersuchung des Zellzyklusses von H. salinarum wurde der genomweite genspezifische DNAMikroarray verwendet. Um erstmals genomweit die zellzyklusspezifische Genexpression eines Archaeons zu analysieren, wurden Zellen von H. salinarum durch eine reversible Zellzyklusblockade mit Aphidicolin, einem DNA-Polymerase Inhibitor, synchronisiert. Vorläufige Transkriptomstudien mit einer synchron wachsenden H. salinarum-Kultur deuten an, dass die Transkription der Mehrzahl der Gene im Verlauf des Zellzyklusses nicht reguliert wird. Die Untersuchungen dieser Arbeit bilden die Grundlage für genomweite funktionelle Charakterisierungen haloarchaealer Genexpression und Regulationsprozesse.
The importance of RNA in molecular and cell biology has long been underestimated. Besides transmitting genetic information, studies of recent years have revealed crucial tasks of RNA especially in gene regulation. Riboswitches are natural RNA-based genetic switches and known only for ten years. They directly sense small-molecule metabolites and regulate in response the expression of the corresponding metabolic genes. Within recent years, artificial riboswitches have been developed that operate according to user-defined demands. Hence, they represent powerful tools for synthetic biology.
This study focused on the development of engineered catalytic riboswitches for conditional gene expression in eukaryotes. A self-cleaving hammerhead ribozyme was linked to a tetracycline binding aptamer in order to regulate ribozyme cleavage allosterically with tetracycline. By integrating such a hybrid molecule into a gene of interest, mRNA cleavage and thereby gene expression is controllable in a ligand dependent manner. The linking domain between ribozyme and aptamer was randomised. Tetracycline inducible ribozymes were isolated after eleven cycles of in vitro selection (SELEX). 80% of the analysed ribozymes show cleavage that strongly depends on tetracycline. In the presence of 1 μM tetracycline, their cleavage rates are comparable to that of the parental hammerhead ribozyme. In the absence of tetracycline, cleavage rates are inhibited up to 333-fold. The allosteric ribozymes bind tetracycline with similar affinity and specificity as the parental aptamer. Ribozyme cleavage is fully induced within minutes after addition of tetracycline. Interestingly, the isolated linker domains exhibit structural consensus motives rather than consensus sequences.
When transferred to yeast, three switches reduced reporter gene expression by 30 - 60% in the presence of tetracycline; none of them controlled gene expression in mammalian cells. In vitro selected molecules do not necessarily retain their characteristics when applied in a cellular context. Therefore, high throughput screening and selection systems have been developed in mammalian cells. The screening system is based on two fluorescent reporter proteins (GFP and mCherry). 1152 individual constructs of the selected ribozyme pool were tested, but none of them reduced reporter gene expression significantly in the presence of tetracycline. The selection system employs a fusion peptide encoding two selection markers (Hygromycin B phosphotransferase and HSV thymidine kinase) facilitating both negative and positive selection. 6.5 x 104 individual constructs of the selected ribozyme pool are currently under investigation.
Die Chemoresistenz von Tumoren ist ein schwerwiegendes Problem in der Krebstherapie. Insbesondere das maligne Melanom gilt aufgrund seiner ausgeprägten Therapieresistenz als nahezu unheilbar. Ein erster Schritt zur Verbesserung der Chemotherapie von Tumoren ist das Verständnis von Mechanismen, die der Resistenz zugrunde liegen. Für die Aufklärung der Mechanismen ist die Molekularbiologie des chemoresistenten Phänotyps von großem Interesse. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Veränderungen im Transkriptionsmuster analysiert, die mit dem Erwerb von Chemoresistenz in Melanomzellinien einhergehen. Die Melanomzellinie MeWo wurde mit Abkömmlingen, die erworbene Resistenz gegen die DNA-schädigenden Agenzien Etoposid (MeWoEto1), Cisplatin (MeWoCis1) und Fotemustin (MeWoFote40) aufweisen, bezüglich ihres Transkriptionsmusters verglichen. Um zunächst eine möglichst große Anzahl von Genen in die Analyse einzubeziehen, wurden initiale Genexpressionsanalysen unter Verwendung des RZPD UniGene 1 Arrays durchgeführt. Dieses Array repräsentiert ca. 31.500 cDNA Sequenzen, die bei einer geschätzten Redundanz von 1,44 einer Anzahl von 21.875 verschiedenen Transkripten entsprechen. Geht man davon aus, dass der Mensch insgesamt über ca. 30.000 Gene verfügt, wurde durch die Verwendung dieses Arrays ein großer Teil aller humanen Gene untersucht. Unter definierten Selektionskriterien wurden 126 Gene ausgewählt, die als im chemoresistenten Phänotyp differentiell exprimiert angesehen wurden. Diese 126 Gene wurden mit 1.143 weiteren tumorassoziierten Genen für die Zusammenstellung und Produktion eines chemoresistenzspezifischen Kandidatengen-Arrays ausgewählt. In verifizierenden Analysen unter Verwendung des Kandidatengen-Arrays wurde eine differentielle Expression für 57 der initial selektierten Gene sowie für weitere 209 tumorassoziierte Gene festgestellt. Die in diesen Analysen angewandten Kriterien für die Definition differentieller Genexpression wurden in exemplarischen Northernblot-Analysen geprüft. Hier zeigte sich eine qualitative Übereinstimmung der Ergebnisse beider Methoden von 81,4%. Da zur Zeit noch keine Hochdurchsatz-Methoden für funktionelle Analysen zur Verfügung stehen, wurde versucht, den Kreis vielversprechender Kandidaten durch eine Integration von Ergebnissen anderer Experimente einzuengen. In Clusteranalysen zur Untersuchung von Verwandtschaftsgraden zwischen den resistenten Zellpopulationen zeigte die MeWoEto1-Zellinie eine vergleichsweise hohe Stabilität in ihrem Genexpressionsmuster über einen Zeitraum von ca. 2,5 Jahren, während MeWoCis1 und MeWoFote40 hier beträchtliche Schwankungen aufwiesen. Die Expressionsmuster der letzteren resistenten Linien zeigten zum spätesten analysierten Zeitpunkt Konvergenz, nachdem sie zunächst deutlich voneinander abwichen. Da die Wirkung sowohl von Cisplatin als auch von Fotemustin zur Bildung von DNA-Addukten führt, kann die Konvergenz als Ergebnis einer fortschreitenden Optimierung der Resistenz in beiden Linien gedeutet werden. Einzelne Gene wie z.B. PEPP2 und CRYAB, die konvergierend differentielle Expression zeigten, können demnach als vielversprechende Kandidaten für eine funktionelle Relevanz in der Resistenz gegen Cisplatin und Fotemustin betrachtet werden. Neben der Clusteranalyse wurden Ergebnisse von vergleichenden genomischen Hybridisierungen (CGH), der Untersuchung einer Deregulation von Kandidatengenen in mehreren der resistenten Linien oder nach Kurzzeitbehandlung von MeWo-Zellen mit den Zytostatika sowie Literaturdaten verwendet, um die Relevanz der differentiellen Expression für einzelne Gene zu validieren. Danach wurden unter anderen die apoptoserelevanten Gene CRYAB und STK17A sowie MPP1, AHCYL1, CYR61 und STMN3 als vielversprechende Kandidaten eingestuft. Ein weiteres bis dahin unbekanntes Gen aus der C2H2-Zinkfinger-Genfamilie, für das in initialen Analysen sowie in Northernblot und RT-PCR-Experimenten eine Überexpression in MeWoCis1 und MeWoEto1 nachgewiesen werden konnte, wurde bezüglich seiner mRNA-Sequenz vervollständigt und im Detail analysiert. Für dieses Gen konnte phänotyp- bzw. gewebespezifisches differentielles Spleissen sowie differentielle Polyadenylierung nachgewiesen werden. Das alternative Spleissen von Exon 3, dem aufgrund seiner ausgeprägten Homologie zu bereits charakterisierten KRAB A Domänen die Funktion der transkriptionalen Repression zugewiesen werden kann, könnte für ein phänotypspezifisches Transkriptionsprogramm verantwortlich sein. Ausgehend von insgesamt 267 differentiell exprimierten Genen konnte der Kreis vielversprechender Kandidaten durch die Integration von Daten aus anderen Experimenten auf ca. 20 Gene eingeengt werden. Unmittelbar im Anschluss and die Dissertation werden diese Gene in funktionellen Analysen bezüglich ihrer Relevanz für den chemoresistenten Phänotyp analysiert.
Plants absorb sunlight via photosynthetic pigments and convert light energy intochemical energy in the process of photosynthesis. These pigments are mainly bound to antenna protein complexes that funnel the excitation energy to the photosynthetic reaction centres. The peripheral antenna of plant photosystem II (PSII) consists of the major light-harvesting complex of PSII (LHC-II) and the minor LHCs CP29, CP26 and CP24. Light intensity can change frequently and plants need to adapt to high-light conditions in order to avoid photodamage. When more photons are absorbed than can be utilised by the photosynthetic machinery, excessive excitation energy is dissipated as heat by short-term adaptation processes collectively known as non-photochemical quenching (NPQ). A decrease in PSII antenna chlorophyll (Chl) fluorescence yield and a reduction in the average Chl fluorescence lifetime are associated with NPQ. The main component of NPQ is the so-called energy-dependent quenching (qE), and it is triggered by the rapid drop in thylakoid lumenal pH resulting from the plant’s photosynthetic activity. This process is thought to take place at the PSII antenna complexes, which therefore not only capture and transfer light energy but are also involved in balancing the energy flow. The decrease in lumenal pH acivates the enzyme violaxanthin de-epoxidase (VDE), which converts the xanthophyll violaxanthin (Vio) into zeaxanthin (Zea) in the xanthophyll cycle. In addition, the PSII subunit PsbS was discovered to be essential for qE by screening qE-deficient Arabidopsis thaliana mutants. This membrane protein is considered a member of the LHC superfamily, which also includes LHC-II and the minor LHCs. Previous studies on PsbS isolated either from native source or refolded in vitro have produced inconsistent results on its pigment binding capacity. Interestingly, a pH-dependent change in the quaternary structure of PsbS under high light conditions has been reported. This observed dimer-tomonomer transition very likely follows the protonation of lumenal glutamates upon the drop in pH and is accompanied by a change in PSII supercomplex localisation. PsbS dimers are preferentially found in association with the PSII core, whereas PsbS monomers co-localise with LHC-II.Despite the identification of !pH, Zea and PsbS as key players in qE, both the nature of the quencher(s) as well as the underlying molecular mechanism leading to excess energy dissipation still remain unknown. Several models have been put forward to explain the reversible switch in the antenna from an energy-transmitting to a quenched state. Proposals include a simple pigment exchange of Vio for Zea, and aggregation or an internal conformational change of LHC-II. Charge transfer (CT)quenching in the minor LHCs or quenching by carotenoid dark state (Car S1)-Chl interactions have also been suggested. However, none of these qE models has so far been capable of accommodating all the physiological observations and available experimental data. Most importantly, the function of PsbS remains an enigma. A recent qE model suggested that monomerisation of PsbS enables the protein to transiently bind a carotenoid and form a quenching unit with a Chl of a PSII LHC. In view of the various proposed qE mechanisms, this thesis aimed at understanding the interplay of the different qE components and the contribution of the PSII subunits LHC-II, the minor LHCs and PsbS to qE. The initial approach was to investigate the properties of the PSII subunits in the most simple in vitro model system, namely in detergent solution. For this purpose, LHC-II was isolated either from native source or refolded from recombinantly produced protein. Investigation of the minor LHCs and PsbS required heterologous expression and refolding. In addition, experiments were performed on aggregated LHC-II. Aggregates of LHC-II have been used as a popular model system for qE because they exhibit highly quenched Chl fluorescence. At the final stage of this doctoral work, a more sophisticated model system to approximate the thylakoid membrane was developed by reconstitution of the PSII subunits LHC-II and PsbS into liposomes. This system not only allowed for investigation of these membrane proteins in their native environment, but also for mimicking the xanthophyll cycle by distribution of Zea within the membrane as well as !pH by outside buffer exchange. The role of Zea in qE was first investigated with detergent solubilised antenna proteins. The requirement of this xanthophyll for qE is well-known, but the specific contribution to the molecular quenching mechansim is unclear. Previous work had shown that replacement of Vio for Zea in LHC-II was not sufficient to induce Chl fluorescence quenching in Zea-LHC-II, as suggested by the so-called molecular gearshift mechanism. However, by means of selective two-photon excitation spectroscopy, an increase in electronic interactions between Car S1 and Chls was observed for LHC-II upon lowering the pH of the detergent buffer. Electronic Car S1-Chl coupling became even stronger when Zea-LHC-II was probed. The extent of Car S1-Chl coupling correlated directly with the extent of Chl fluorescence quenching, in a similar way as observed previously in live plants under high-light conditions. However, very similar results were obtained with LHC-II aggregates. This implied that the increase in electronic interactions and fluorescence quenching was independent of Zea and low pH. Further experiments on aggregates of LHC-II Chl mutants indicated that the targeted pigments were also not essential for the observed effects. It is proposed that the same molecular mechanism causes an increase in electronic Car S1-Chl interactions and Chl fluorescence quenching in Zea-LHC-II at low pH as well as in aggregated LHC-II. Most likely, surface exposed pigments form random quenching centres in both cases. On the other hand, it was possible that Zea could act as a direct quencher of excess excitation energy in the minor LHCs. However, enrichment of refolded CP29, CP26 and CP24 with Zea did not lead to a change in the Chl excited state lifetime. Formation of a carotenoid radical cation, previously implied in CT quenching, was also not observed, although artificial generation of such a radical cation was principally possible as shown for CP29. During the course of this work, a study reporting the formation of Zea radical cations in minor LHCs was published. Therefore, Zea-enriched minor LHCs were again investigated on the experimental apparatus used in the reported study. Indeed, the presence of at least one carotenoid radical cation for each minor complex was detected. It is suggested that either the preparation method of incubating the refolded minor LHCs with Zea in contrast to refolding the complexes with only Zea and lutein causes the observed differences or that the observed spectral radical cation signatures are due to experimental artifacts. While the experiments with LHC-II and the minor LHCs gave useful insights into the putative qE mechanism, the quencher site and the mode of action of Zea could still not be unambiguously identified. Most importantly, these studies could not explain the function of the qE keyplayer PsbS. Therefore, the focus of the work was shifted to PsbS protein production, purification and characterisation. In view of inconsistent reports on the pigment binding capacity of this PSII subunit, refolding trials with and without photosynthetic pigments were conducted. The formation of a specific pigmentprotein complex typical for other LHCs was not observed and neither was the earlier reported “activation” of Zea for qE by binding to this protein. Nevertheless, PsbS refolded without pigments displayed secondary structure content in agreement with previous studies, indicating pigment-independent folding. Reconstitution of pigmentfree, refolded PsbS into liposomes confirmed that the protein is stable in the absence of pigments. Zea distributed in PsbS-containing liposomes also showed no spectral alteration that would indicate its “activation”. With the ability to reconstitute PsbS, it was then possible to proceed to modelling qE in a proteoliposome system. For this purpose, PsbS was co-reconstituted with LHC-II, which has been reported to interact with PsbS. One-photon excitation (OPE) and two-photon excitation (TPE) spectroscopy measurements were performed on LHC-II- and LHC-II/PsbS-containing liposomes. This enabled both quantification of Chl fluorescence quenching as well as determination of the extent of electronic Car S1-Chl interactions. The effect of Zea was investigated by incorporating it in the proteoliposome membrane. It was shown that Zea alone was not able to induce significant Chl fluorescence quenching when only LHC-II was present. However, when LHC-II and PsbS were co-reconstituted, pronounced Chl fluorescence quenching and an increase in electronic Car S1-Chl interactions were observed and both effects were enhanced when Zea was present. Western blot analysis indicated the presence of a LHC-II/PsbS-heterodimer in these proteoliposomes. In addition to the OPE and TPE measurements, the average Chl fluorescence lifetime was determined in detergent-free buffer at neutral pH and directly after buffer exchange to low pH. No significant changes in the average lifetime were observed for LHC-II proteoliposomes when either Zea was present or after exchange for low pH buffer. This indicated that Zea alone cannot act as a direct quencher, which concurs with the OPE measurements. Moreover, the complex was also properly reconstituted as no aggregation or significant Chl fluorescence quenching were observed. The average lifetime was not significantly affected in LHC-II/PsbS-proteoliposomes, independent of Zea or pH. However, a shortlived component in the presence of a long-lived component was not resolvable with the time resolution of the fluorescence lifetime apparatus.
Implications for qE model systems and the in vivo quenching mechanism are discussed based on the experiments in detergent solution, on LHC-II aggregates and with the proteoliposome model system.
(1) Die genomweite Expressionsanalyse von salzadaptierten Zellen von M. mazei Gö1 identifizierte eine Reihe von salzregulierten Genen. Neben den beiden Operone ota und abl, die für die Akkumulierung von Glycin-Betain und Ne-Azetyl-b-Lysin verantwortlich sind, konnte ein ABC-Transporter (MM0953), der in seiner Genumgebung weitere Transporter sowie Proteine mit konservierten S-Layer-Domänen aufweist, als salzreguliert erkannt werden. Dies deutet auf ein S-Layer-Exportsystem hin, das eine Rolle in salzadaptierten Zellen spielen könnte. (2) Eine genomweite Expressionsanalyse von Zellen von M. mazei Gö1 zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach einem hyperosmotischen Schock auf 400 mM NaCl ermöglichte Einblicke in den Verlauf der Genexpression. Die Erhöhung der externen Osmolarität resultierte in der erhöhten Expression von Genen, die für die Aufnahme und Biosynthese von kompatiblen Soluten verantwortlich sind sowie von Genen deren Produkte regulatorische Funktion haben könnten. (3) Genomweite Expressionsanalysen von Zellen von M. mazei Gö1 nach einem hypoosmotischen Schock zeigten erhöhte Expression von Genen, die an der Regulation und an der generellen Stressantwort beteiligt sind. Gene, deren Produkte im Stoffwechsel wichtig sind – besonders Gene, die für Methylamin-Corrinoid-Methyltransferasen kodieren – erscheinen stark reprimiert. (4) Die Bestimmung der intrazellulären Ionenkonzentrationen zeigte ein unspezifisches Einströmen von den Ionen, die den osmotischen Schock auslösen sofort nach dem Schock, sowie den Ausstrom derselben Ionen im Verlauf von 5 Minuten. Die Ionenkonzentrationen der Ionen, die den Schock auslösten, blieben intrazellulär erhöht. Das Ein- und Ausströmen der Ionen nach einem hyperosmotischen Stress ist nicht energieabhängig. (5) M. mazei akkumulierte nach einem hyperosmotischen Schock kein K+, zeigte aber eine erhöhte intrazelluläre Konzentration dieses Ions, wenn die Zellen in Medium mit erhöhter Osmolarität angezogen wurden. (6) Durch hyperosmotische Schocks mit verschiedenen Salzen und Zuckern konnte gezeigt werden, dass die kurzzeitige Akkumulation von Ionen keine gerichtete Antwort auf den osmotischen Stress ist. (7) Es konnte weiters gezeigt werden, dass Zellen von M. mazei Gö1, die mit dem kompatiblen Solut Betain inkubiert wurden, nach einem hyperosmotischen Schock K+ akkumulieren. Dies bedeutet möglicherweise eine K+-abhängige Regulation des Glycin-Betain-Transporters. (8) Die Funktion der drei im Genom kodierten Na+/H+-Antiporter konnte auf transkriptioneller Ebene nicht geklärt werden. Trotzdem zeigt ein Hydrophobizitätsplot des Proteins eine mögliche Beteiligung von Nha1 (MM0294) an der Osmoregulation durch eine hydrophile C-terminale Domäne. (9) Nach einem hyperosmotischen Schock von 38,5 auf 400 mM NaCl erhöhte sich die intrazelluläre Konzentration an Glutamat, das in M. mazei als kompatibles Solut fungiert, bereits nach drei Stunden. Zellen, die bereits an die erhöhte Salzkonzentration adaptiert waren, enthielten 1,4 μmol Glutamat/mg Protein. (10) Die Glutamin-Synthetase zeigte eine erhöhte Transkription nach einem hyperosmotischen Schock. Das Protein wird aber nicht salzabhängig produziert und zeigt keine Enzymaktivität. Die Biosynthese des Solutes über eine Glutamat-Dehydrogenase ist die wahrscheinliche Alternative. (11) Aufgrund der generierten Expressionsprofile und der physiologischen Daten konnte ein Modell der Osmoadaptation in Methanosarcina mazei Gö1 erstellt werden.
Lichtsensitive Proteine bzw. Photorezeptoren eignen sich hervorragend für das Studium des Zusammenhangs von Proteinstruktur und –funktion. Lichtrezeptorproteine werden leicht durch Licht angeregt, wodurch eine gute Zeitauflösung für deren Untersuchung erreicht werden kann. Weiterhin sind sie als Signalproteine während der Etablierung des aktiven Zustandes und dessen Zerfalls großen konformationellen und strukturellen Änderungen unterworfen. Ausgehend von diesen Eigenschaften wurde bereits eine große Zahl von Lichtrezeptorproteinen genauer untersucht. Diese vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit lichtinduzierten konformationellen Änderungen in Membranproteinen. Dafür wurden drei verschiedene Systeme herangezogen: das kleine α-helikale Peptid Gramicidin A, der G-Protein gekoppelte Rezeptor Rhodopsin and die BLUF (blue light using FAD) Domäne des hypthetischen Membranproteins Blrp (blue-light regulated phosphodiesterase) aus E. coli. Gramicidin A (gA) ist ein aus dem Bodenbakterium B. brevis isoliertes Antibiotikum, das Transportkanäle für einwertige Kationen wie Lithium, Natrium und Kalium ausbildet. Gelöst in Detergenzmizellen, wurde für gA unerwartet eine Wechselwirkung mit Blaulicht fest gestellt (Abbildung 1). Diese Beobachtung wurde mit statischen und zeitaufgelösten NMRspektroskopischen Methoden genauer untersucht und ist in Kapitel 2 näher beschrieben. Basierend auf den gewonnenen Erkenntnissen wird postuliert, dass einer der Tryptophanreste (Trp9) eine lichtinduzierte konformationelle Änderung erfährt. Ausgehend von der Konformation in Lösung befindet sich die Seitenkette von Trp9 in einem Gleichgewicht (70:30) mit einer zweiten Konformation. Bei der zweiten Konformation handelt es sich möglicherweise um die Orientierung, die der Tryptophanrest unter Festkörper-NMR Bedingungen einnimmt. Die Lebensdauer der neuen Konformation beträgt in etwa eine Sekunde. Der G-Protein gekoppelte Rezeptor Rhodopsin ist verantwortlich für die Verarbeitung von Lichtsignalen in den Stäbchenzellen der Retina. Die Absorption eines einzelnen Photons führt zur Isomerisierung des kovalent gebundenen Chromophors 11-cis-Retinal, wodurch konformationelle Änderungen im Protein veranlasst werden. Der aktivierte Metarhodopsin II (MetaII) Zustand induziert eine Enzymkaskade und schließlich einen Nervenimpuls, das Säugern das Kontrastsehen ermöglicht. Eine große Bandbreite an hochauflösenden NMRspektroskopischen Methoden, (einschließlich zeitaufgelöster und Festkörper-NMR Methoden) wurde im Laufe dieser Arbeit angewandt, um Konformation und Dynamik von bovinem Rhodopsin näher zu untersuchen. In Kapitel 3.1 sind zu Beginn mehrere Optimierungsschritte im Hinblick auf ein kostengünstiges, isotopenmarkiertes Säugerzellenmedium beschrieben. In diesem Zusammenhang wurden mehrere Rhodopsin NMR-Proben hergestellt, wobei der Gehalt an isotopenmarkierten Aminosäuren ca. 50% betrug. Anhand dieser Proben konnte bewiesen werden dass sich mit Lösungs-NMR-Spektroskopie auch sehr große, in Detergenzmizellen stabilisierte Membranproteine (~150 kD Gesamtmasse) detailliert studieren lassen. Die Untersuchungen konzentrierten sich auf den C-Terminus, für den nach sequentieller Zuordnung (Abbildung 2a) und heteronuklearern Relaxationsmessungen ein Mobilitätsverhalten bestimmt wurde, das dem mittelgroßer Proteine ähnelt. Des Weiteren konnten keinerlei definierte Strukturelemente innerhalb des C-Terminus identifiziert werden, u.a. durch einen Vergleich mit eines 19mer Peptids, dessen Primärsequenz des Rhodopsin C-Terminus entspricht (Abbildung 2a und 2b). In Kapitel 3.2 wird die nichtinvasive Zuordnung der Rückgratresonanzen aller fünf Trytophane mit Hilfe einer Kombination aus Lösungs- und Festkörper-NMR beschrieben. Dazu wurden verschiedene Rhodopsinproben hergestellt, die alle möglichen 13C’i-1-Carbonyl/15Ni-Tryptophan isotopenmarkierten Amidpaare enthielten. Eine Teilzuordnung der Tryptophanindolsignale konnte in Lösung durch Protonen-/Deuteriumaustausch und heteronukleare Relaxationsmessungen erreicht werden. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Kombination aus Lösungs- und Festkörper-NMR-Spektroskopie sehr gut geeignet ist um komplementäre Informationen zu strukturellen und dynamischen Eigenschaften von Rhodopsin zu liefern. Fehlende Zuordnungen in den Lösungspektren konnten durch den Verglich mit Festkörperspektren ergänzt werden und umgekehrt (Abbildung 3). In Kapitel 3.3 ist die erfolgreiche Adaption der zeitaufgelösten NMR-Spektroskopie für die Untersuchung des Rhodopsin MetaII Zerfalls in vitro beschrieben. Die zeitaufgelösten protonendetektieren NMR-Experimente wurden mit unmarkiertem, in Detergenzmizellen stabilisiertem Protein bei verschiedenen Temperaturen aufgenommen, wobei sich die anschließende Auswertung auf die stark tieffeldverschobene Indolregion konzentrierte (Abbildung 4). Für die berücksichtigten Signale traten nach Induktion des aktivierten Zustandes deutliche chemische Verschiebungsänderungen auf, außerdem zeigten sie unterschiedlich schnellen MetaII Zerfall. Zusätzlich zu der erwarteten Zeitkonstante des MetaII Zerfalls (~6 min bei 298 K) konnte erstmalig eine zweite, ca. zehnmal langsamere Zeitkonstante bestimmt werden. Diese zweite Zeitkonstante ist möglicherweise ein Ausdruck für die langsame Entfaltung von Sekundärstrukturelementen nach dem Zerfall des Proteins in Opsin und Retinal. Die BLUF-Domänen verwenden Flavinadeninnukleotid (FAD) als Chromophor und gehören zu der Familie der Blaulichtrezeptoren. In Kapitel 4 wird die Untersuchung des lichtadaptierten Zustandes der E. coli BLUF Domäne auf Protein- und Ligandenebene mit zeitaufgelösten proton- und phosphordetektierten NMR-Experimenten beschrieben. In Abbildung 5 sind die statischen Licht- und Dunkelspektren (jeweils licht- und dunkeladaptiert) dargestellt. Im Folgenden konnte durch Beobachtung der Dunkeladaption bei verschiedenen Temperaturen die Aktivierungsenergie des Lichtzustandes bestimmt werden. Des Weiteren wurden zum ersten Mal phosphordetektierte NMR-Experimente erfolgreich angewandt, um einen biologisch relevanten Vorgang zeitabhängig näher zu bestimmen.
Das extrem thermophile Eubakterium Thermus thermophilus ist in den letzten Jahren zu einem Modell für thermophile Organismen geworden und verdankt seinen Statuszum Teil seiner hohe Wachstumsrate, den guten Zellerträgen und der konstitutivenExpression eines natürlichen Kompetenzapparates, der seine genetische Manipulation ermöglicht. Die Verfügbarkeit von kompatiblen Plasmiden und bis zu vier thermostabilen Antibiotikaresistenzmarkern konnten den Wert des Organismus in Hinblick auf biotechnologische Anwendungen noch weiter steigern und tatsächlich besteht nach wie vor ein ungebrochenes Interesse an der Struktur- und Funktionsaufklärung thermophiler Proteine. Der Focus der hier vorliegenden Arbeit richtete sich auf eine der insgesamt zwei terminalen Oxidasen der Atmungskette von T. thermophilus, die Cytochrom ba3 Oxidase. Es wurden verschiedene rekombinante Varianten des Proteins, die sich hinsichtlich der Position und Länge des verwendeten Histidin-Tags unterschieden, kloniert, exprimiert und aufgereinigt. Das Einfügen eines internen His12-Tags in einen periplasmatischen Loop zwischen den Transmembranhelices IV und V führte zu einer rekombinanten Version der Oxidase, die in ihren Eigenschaften dem nativen Wildtyp entsprach und sich durch die in dieser Arbeit etablierte Aufreinigungsstrategie relativ schnell, in guten Ausbeuten und hoher Reinheit aufreinigen ließ. Weiterhin konnten verschiedene Punktmutationen von möglicherweise am Elektronentransfer beteiligten Aminosäureresten generiert und die resultierenden Proteine aufgereinigt und über ihre enzymatische Aktivität charakterisiert werden. Eine weiterführende Charakterisierung der Mutanten erfolgte im Rahmen einer Kooperation und ist bisher noch nicht abgeschlossen. Das Herzstück dieser Arbeit machte jedoch die Definition der Transkriptionseinheit der Cytochrom ba3 Oxidase und die sich daraus ergebenden Fragestellungen aus. So konnte gezeigt werden, dass das ba3 Operon zusätzlich zu den Strukturgenen der dort kodierten Untereinheiten noch mindestens ein, höchst wahrscheinlich jedoch zwei zusätzliche Gene enthält: cbaX und cbaY. Bioinformatische Charakterisierungen ordneten CbaY der diversen Gruppe von sekundären Transportern zu, und es konnte experimentell gezeigt werden, dass seine Anwesenheit für die Expression der Cytochrom ba3 Oxidase förderlich ist. CbaX hingegen konnte über die durchgeführte Homologiesuche keine Funktion zugeordnet werden; uncharakterisierte Homologe waren einzig in der Thermaceae Gruppe zu finden. Durch Deletions- und Komplementationsstudien konnte dem Protein eine entscheidende Rolle in der Assemblierung der ba3 Oxidase bescheinigt werden. CbaX scheint eine zentrale Aufgabe bei der Häm a Insertion in Untereinheit I zu spielen und könnte, ohne Sequenzhomologie aufzuweisen, die Rolle des Surf1-Proteins übernehmen, welches in den sequenzierten Organismen der Thermaceae Gruppe nicht konserviert ist. Die homologe Expression und Aufreinigung von CbaX führte nicht zur erwarteten Ausbeute und Reinheit des Proteins, konnte aber durch immunologische Experimente eine potentielle Interaktion von CbaX und der Cytochrom ba3 Oxidase nachweisen.