570 Biowissenschaften; Biologie
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Impact of pectin dietary supplementation on experimental food allergy via gut microbiota modulation
(2023)
In recent years, dietary fibers gained focus in regard of their immune-modulatory effects and the potentially beneficial effect on allergies. The dietary fiber and prebiotic pectin is able to promote growth and activity of beneficial bacteria and thereby induce modulation of different immune responses. However, structurally different types of pectin might promote different immune-modulatory responses and to date the optimal pectin type for induction of beneficial health effects is not identified. Furthermore, it is still unclear, whether pectins provide a beneficial effect on certain allergies, such as food allergy.
Having this in consideration, this study examined the immune-modulatory effects of structurally different pectins on naive as well as peach allergic mice. Furhtermore, the impact of dietary pectin supplementation on composition and diversity of the murine gut microbiota was determined.
This study showed that dietary pectin intervention was able to suppress allergy-related Th2 responses considering humoral and cellular immune responses. Only apple-derived high-methoxyl pectin revealed an impact on total IgA levels and affected the microbial richness. Furthermore, it is not known whether the effects observed with the two pectins are caused by modulations of the bacterial composition or induced at least partly by direct interaction with the immune cells. Further studies are required to fully understand the mechanisms underlying the immune-modulatory capacities of different pectins.
Finally, the obtained results generated evidence that dietary pectin intervention can beneficially modulate the immune response in healthy mice and – at least partially – suppress allergy-related immune responses in a model of food allergy, depending on the structural characteristics of the used pectin.
Mitochondria perform essential energetic, metabolic and signalling functions within the cell. To fulfil these, the integrity of the mitochondrial proteome has to be preserved. Therefore, each mitochondrial subcompartment harbours its own system for protein quality control. However, if the capacity of mitochondrial chaperones and proteases is overloaded, mitochondrial misfolding stress (MMS) occurs. Upon this stress condition, mitochondria communicate with the nucleus to increase the transcription of nuclear encoded mitochondrial chaperones and proteases. This proteotoxic stress pathway was termed the mitochondrial unfolded protein response (UPRmt) aiming at restoring protein homeostasis. Despite being discovered over 25 years ago, the signalling molecules released by stressed mitochondria as well as the corresponding receptor and transcription factor remain poorly understood. With this study, we aimed at characterising the underlying signalling events and mechanisms of how mitochondria react to misfolded proteins. First, we aimed to establish different methods to induce MMS that triggers the transcriptional induction of mitochondrial chaperones and proteases detected by quantitative polymerase chain reaction. We were able to induce UPRmt signalling by overexpression of an aggregation-prone protein and by knock-down or inhibition of mitochondrial protein quality control components. To study the signalling in a time-resolved manner, we focused on the usage of the mitochondrial HSP90 inhibitor GTPP and the mitochondrial LONP1 protease inhibitor CDDO.
Early time point RNA sequencing analysis of cells stressed with GTPP or CDDO revealed upregulated genes in response to oxidative stress. Indeed, measurements of mitochondrial superoxide with the fluorescent dye MitoSOX showed increased levels of reactive oxygen species (ROS) upon MMS induction. In contrast, there was no induction of mitochondrial chaperones and proteases when combining MMS with antioxidants. Compartment-specific targeting of the hydrogen peroxide sensor HyPer7 revealed increased ROS levels in the intermembrane space and matrix of mitochondria, followed by elevated ROS levels in the cytosol at later time points. The importance of cytosolic ROS for the signalling was supported by preventing UPRmt induction with an inhibitor blocking the outer mitochondrial membrane pore. Thus, ROS were identified as an essential UPRmt signal.
To understand which cytosolic factor is modified by ROS, redox proteomics was performed. Here, reversible changes on cysteine residues of the HSP40 co-chaperone DNAJA1 were observed upon MMS. Consequently, transcriptional induction of UPRmt genes was abolished by DNAJA1 knock-down. To understand the function of DNAJA1 during UPRmt signalling, quantitative interaction proteomics upon MMS revealed an increased binding to mitochondrial proteins and its interaction partner HSP70. Immunoprecipitation confirmed a ROS-dependent interaction between HSP40 and HSP70. Increased binding to mitochondrial proteins represented a cytosolic interaction of DNAJA1 with mitochondrial precursor proteins, whose accumulation was confirmed by western blot. Moreover, a fluorescent protein targeted to mitochondria accumulated in the cytosol during GTPP treatment, confirming a reduced import efficiency upon MMS. Preventing the accumulation of precursors by a translation inhibitor or depletion of a general mitochondrial transcription factor resulted in reduced UPRmt activation. Thus, DNAJA1 is essential for UPRmt signalling, since its oxidation by mitochondrial ROS and its enhanced recruitment to mitochondrial precursors allows the integration of both MMS-induced signals.
To link these findings to an increased transcription of mitochondrial chaperones and proteases, we screened for transcription factors accumulating in the nucleus upon MMS by cellular fractionation mass spectrometry. We demonstrated that specifically HSF1 accumulates in nuclei of cells stressed with GTPP or CDDO. Depletion of HSF1 by knock-down or knock-out resulted in the abrogation of the UPRmt-specific transcriptional response. HSF1 activation was visualised by nuclear accumulation on western blot, a process inhibited by ROS and precursor suppression. Moreover, DNAJA1 depletion prevented HSF1 activation. Ultimately, we proved by immunoprecipitation that the inhibitory interaction between HSF1 and HSP70 is reduced upon MMS.
Thus, we conclude that MMS increases mitochondrial ROS that are released into the cytosol. In addition, the import efficiency is reduced upon MMS, resulting in the accumulation of non-imported mitochondrial precursor proteins in the cytosol. Both signals are recognised via DNAJA1 oxidation and substrate binding. The concurrent recruitment of HSP70 to DNAJA1 results in the loss of the inhibitory HSP70-HSF1 interaction. Thus, active HSF1 can migrate to the nucleus to initiate transcription of mitochondrial chaperones and proteases. These findings are in accordance with observations in yeast, where mistargeted mitochondrial proteins activate cellular stress responses. Our results highlight a surprising interconnection and dependence of the mitochondrial and the cytosolic proteostasis network, in which the UPRmt is activated by a combination of two mitochondria-specific proteotoxic stress signals.
Die Bande q23 auf Chromosom 11 ist in zahlreiche reziproke chromosomale Translokationen verwickelt. Diese sind dominant mit dem Krankheitsphänotyp einer AML, ALL und seltener mit malignen Lymphomen und myelodysplastischen Syndromen assoziiert. Mittlerweile sind fünfundachtzig cytogenetische Aberrationen der Bande 11q23 bekannt. Das auf 11q23 betroffene Gen wird als das Mixed Lineage Leukemia (MLL), Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL-1), Human Homolog of trithorax (HRX) oder als Human Trithorax 1 (Htrx1) bezeichnet. Die häufigsten Partnergene des MLL sind AF4 (40 %), AF9 (27 %), sowie ENL, AF6, ELL und AF10 (4-7 %).
Die Bruchpunkte von t(11;V) Translokationen sind nicht gleichmäßig über das gesamte, 92 kb große humane MLL-Gen verteilt, sondern liegen alle in der 8,3 kb großen Bruchpunktsregion Bpr. Auch innerhalb der Bpr ist die Verteilung der Translokationsbruchpunkte nicht homogen. Die Bruchpunkte von Patienten mit de novo Leukämien und einem Alter über einem Jahr liegen mehrheitlich in der 5’-Hälfte der Bpr, dem Subcluster I. Dagegen liegen die Bruchpunkte von Patienten mit therapiebedingten Leukämien und einem Alter unter einem Jahr überwiegend in der 3’-Hälfte der Bpr, dem Subcluster II.
Neuere Forschungsergebnisse zeigten, daß DNA-Doppelstrangbrüche auf zwei verschiedenen Chromosomen eine hinreichende Voraussetzung für das Entstehen chromosomaler Translokationen sind. Aufgrund der inhomogenen Verteilung der Translokationsbruchpunkte im MLL-Gen stellte sich die Frage, ob bestimmte Regionen dieses Gens für DNA-Doppelstrangbrüche prädisponiert sind. Interessanterweise ist Subcluster II extrem sensitiv gegenüber DNA-Doppelstrangbrüchen, die durch cytotoxische Agenzien oder Apoptose-auslösende Ereignisse induziert werden können. In unserer Arbeitsgruppe konnte eine etwa 200 bp große Region lokalisiert werden, über die sich nahezu alle Etoposid-induzierten DNA-Doppelstrangbrüche verteilten.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß die Bildung von DNA-Doppelstrangbrüchen in dieser Region durch die Gabe eines Caspase-Inhibitors gehemmt werden kann. Eine Etoposid-induzierte Protein-DNA-Wechselwirkung konnte allerdings nicht nachgewiesen werden. In der Literatur fanden sich Hinweise darauf, daß Subcluster II im Gegensatz zu Subcluster I eine verstärkte Histonacetylierung aufweist. Basierend auf diesen Hinweisen sollte die Arbeitshypothese untersucht werden, ob Subcluster II einen geninternen Promotor des MLL-Gens darstellt.
Die potentielle Promotorregion wurde zunächst durch Computeranalysen eingegrenzt. Mit RT-PCR Experimenten wurde anschließend der potentielle geninterne Promotor des murinen Mll-Gens in einer murinen Fibroblastenzellinie lokalisiert, die einen Transkriptionsstop und eine Polyadenylierungssequenz in Exon 4 des Mll-Gens trug. Um die am Mausmodell gewonnenen Erkenntnisse auch im humanen System zu überprüfen, wurde die geninterne Promotorregion des humanen MLL Gens vor ein Luciferasereportergen kloniert. Durch RTPCR konnte der geninterne Transkriptionsstart im Subcluster II des humanen MLL-Gens lokalisiert werden. Damit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, daß Transkriptionsinitiation und genetische Instabilität im Subcluster II des humanen MLL-Gens kolokalisieren.
Durch Deletionsmutanten wurde die Bedeutung der einzelnen Module dieser Promotorregion ermittelt. Dabei zeigte sich, daß die Anwesenheit von zwei retromobilen Elementen eine Enhancer-Funktion haben. Demgegenüber zeigte die homologe murine Sequenz, die in unserer Arbeitsgruppe gleichzeitig von S. Scharf untersucht wurde und für die keine erhöhte Anfälligkeit für DNA-Doppelstrangbrüche bekannt ist, nur eine schwache Promotoraktivität. Dies weist auf einen Zusammenhang zwischen der genetischen Instabilität von Subcluster II und der Rate geninterner Transkriptionsinitiationsprozesse hin.
Das Protein, für das das Transkript des geninternen murinen Promotors kodiert, wurde mittels immunhistologischer und Western Blot Experimente nachgewiesen. Dabei konnte gezeigt werden, daß dieses Protein, wie auch das MLL-Protein, proteolytisch durch Taspase1 und daß sich ein Mini-MLL-Komplex bildet.
Bioactive small molecules are used in many research areas as important tools to uncover biological pathways, interpret phenotypic changes, deconvolute protein functions and explore new therapeutic strategies in disease relevant cellular model systems. To unlock the full potential of these small molecules and to ensure reliability of results obtained in cellular assays, it is crucial to understand the properties of these small molecules. These properties encompass their activity and potency on their designated target(s), their selectivity towards unintended off-targets and their phenotypic effects in a cellular system. Approved drugs often engage with multiple targets, which can be beneficial for some applications such as treatment of cancer where several pathways need to be inhibited for treatment efficacy. However, targeting multiple key proteins in diverse pathways also increases the possibility for unspecific or unwanted side effects. For many drugs the entire target space that they modulate is not known. This makes it difficult to use these drugs for target deconvolution or functional assays with the aim to understand the underlying biological processes. In contrast to drugs, for mechanistic studies, a good alternative are chemical tool compounds so called chemical probes that are usually exclusively selective as well as chemogenomic compounds, that inhibit several targets but have narrow selectivity profiles. Because they are mechanistic tools, chemical tool compounds must meet stringent quality criteria and they are therefore well characterized in terms of their potency, selectivity and cellular on-target activity. To ensure that an observed phenotypic effect caused by a compound can be attributed to the described target(s), it is essential to study also properties of chemical tools leading to unspecific cellular effects. There are a variety of unspecific effects that can be caused by physiochemical compound properties that can interfere with phenotypic assays as well as functional compound evaluations. One of these effects is low solubility causing toxicity or intrinsic fluorescence potentially interfering with assay readouts. But unanticipated cellular responses can also arise from unspecific binding, accumulation in cellular compartments or damage caused to organelles such as mitochondria or the cytoskeleton that can result in the induction of diverse forms of cell death.
In this study, we investigated the influence of a variety of small molecules on distinct cell states, by establishing and validating high-content imaging assays, which we called Multiplex assay. This assay portfolio enabled us to detect different cellular responses using diverse fluorescent reporters, such as the influence of a compound on cell viability, induction of cell death programs and modulation of the cell cycle. Additionally, general compound properties such as precipitation and intrinsic fluorescence were simultaneously detected. The assay is adaptable to assess other cellular properties of interest, such as mitochondrial health, changes in cytoskeletal morphology or phospholipidosis. A significant advantage of the assay is that we are using live cells, so we can capture dynamic cellular changes and fluctuations that can be crucial for the understanding of cellular responses.
Der Hirntumor Glioblastom (GBM) ist aufgrund seines infiltrativen Wachstums, der hohen intra- und intertumoralen Heterogenität, der hohen Therapieresistenz als auch aufgrund der sogenannten gliomartigen Stammzellen sehr schwer zu behandeln und führt fast immer zu Rezidiven. Da es in den letzten Jahrzehnten kaum Fortschritte in der Behandlung des GBMs gab, bis auf die Therapie mit Tumortherapiefeldern, wird weiterhin nach alternativen Zelltodtherapien geforscht, wie zum Beispiel dem Autophagie-abhängigen Zelltod. Der Autophagie-abhängige Zelltod ist durch einen erhöhten autophagischen Flux gekennzeichnet und obwohl die Autophagie, als auch selektive Formen wie die Lysophagie und Mitophagie, normalerweise als überlebensfördernde Mechanismen gelten, konnten viele Studien eine duale Rolle in der Tumorentstehung, -progression und -behandlung aufzeigen, die vor allem vom Tumortyp und stadium abhängt. Um die zugrunde liegenden Mechanismen des durch Medikamente induzierten Autophagie-abhängigen Zelltods im GBM weiter zu entschlüsseln, habe ich in meiner Dissertation verschiedene Substanzen untersucht, die einen Autophagie-abhängigen Zelltod induzieren.
In einer zuvor in unserem Labor durchgeführten Studie konnte gezeigt werden, dass das Antipsychotikum Pimozid (PIMO) und der Opioidrezeptor-Antagonist Loperamid (LOP) einen Autophagie-abhängigen Zelltod in GBM Zellen induzieren können. Darauf aufbauend habe ich die Fähigkeit zur Induktion des Autophagie-abhängigen Zelltods in weiteren Zellmodellen validiert. Dies bestätigte einen erhöhten autophagischen Flux nach PIMO und LOP Behandlung, während der Zelltod als auch der autophagische Flux in Autophagie-defizienten Zellen reduziert war. In weiteren Versuchen konnte ich die Involvierung der LC3-assoziierten Phagozytose (LAP), ein Signalweg der auf die Funktion einiger autophagischer Proteine angewiesen ist, ausschließen. Weiterhin konnte ich eine massive Störung des Cholesterin- und Lipidstoffwechsels beobachten. Unter anderem akkumulierte Cholesterin in den Lysosomen gefolgt von massiven Schäden des lysosomalen Kompartiments und der Permeabiliserung der lysosomalen Membran. Dies trug einerseits zur Aktivierung überlebensfördernder Lysophagie als auch der Zell-schädigenden „Bulk“-Autophagie bei. Letztendlich konnte aber die erhöhte Lysophagie die Zellen nicht vor dem Zelltod retten und die Zellen starben einen Autophagie-abhängigen lysosomalen Zelltod. Da die Eignung von LOP als Therapie für das GBM aufgrund der fehlenden Blut-Hirn-Schranken Permeabilität und von dem Antipsychotikum PIMO aufgrund teils schwerer Nebenwirkungen eingeschränkt ist, habe ich mich im weiteren Verlauf meiner Dissertation mit einer Substanz mit einem anderen Wirkmechanismus beschäftigt.
Der Eisenchelator und oxidative Phosphorylierungs (OXPHOS) Inhibitor VLX600 wurde zuvor berichtet mitochondriale Dysfunktion und Zelltod in Kolonkarzinomzellen zu induzieren. Allerdings hat meines Wissens nach bisher noch keine Studie die therapeutische Eignung von VLX600 für das GBM untersucht. Hier zeige ich eine neuartige Autophagie-abhängige Zelltod-induzierende Fähigkeit von VLX600 für GBM Zellen, da der Zelltod signifikant in Autophagie-defizienten Zellen aber nicht durch Caspase-Inhibitoren gehemmt wurde und der autophagische Flux erhöht war. Darüber hinaus konnte ich die Hemmung der OXPHOS und die Induktion von mitochondrialem Stress in GBM Zellen bestätigen und weiterhin aufzeigen, dass VLX600 nicht nur die mitochondriale Homöostase stört, sondern auch zu einer BNIP3-BNIP3L-abhängigen Mitophagie führt, die wahrscheinlich durch HIF1A reguliert wird aber keinen erkennbaren Nettoeffekt auf den von VLX600 induzierten Zelltod hat. Demnach induziert VLX600 letale „Bulk“-Autophagie in den hier verwendeten Zellmodellen. Darüber hinaus konnte ich zeigen, dass die Eisenchelatierung durch VLX600 eine große Rolle für den von VLX600-induzierten Zelltod spielt aber auch für die Mitophagie Induktion, Histon Lysin Methylierung und den ribosomalen Stress. Letztendlich ist es wahrscheinlich ein Zusammenspiel all dieser Faktoren, die zur Zelltodinduktion durch VLX600 führen und interessanterweise werden Eisenchelatoren bereits in präklinischen und klinischen Studien für Krebstherapien untersucht. Dabei könnten gewisse metabolische Eigenschaften verschiedener Tumorzellen die Sensitivität von Wirkstoffen, die auf den Metabolismus wirken wie VLX600, beeinflussen was in zukünftigen Studien beachtet werden sollte um den bestmöglichsten Therapieerfolg zu erzielen. Zusammenfassend unterstützt meine Dissertation die duale Rolle der Autophagie, die stark vom jeweiligen Kontext abhängt und befürwortet die weitere Forschung von Substanzen, die einen Autophagie-abhängigen Zelltod induzieren, für das GBM.
Alzheimer’s disease (AD) is characterized by the deposition of aggregated species of amyloid beta (Aβ) in the brain, which leads to progressive cognitive deficits and dementia. Aβ is generated by the successive cleavage of the amyloid precursor protein (APP), first by β-site APP cleaving enzyme 1 (BACE1) and subsequently by the γ-secretase complex. Those conditions which enhace or reduce its clearance predispose to Aβ aggregation and the development of AD. In vitro studies have demonstrated that Aβ assemblies spark a feed-forward loop heightening Aβ production. However, the underlying mechanism remains unknown. Here, we show that oligomers and fibrils of Aβ enhance colocalization and physical interaction of APP and BACE1 in recycling endosomes of human neurons derived from induced pluripotent stem cells and other cell types, which leads to exacerbated amyloidogenic processing of APP and intracellular accumulation of Aβ42. In cells that are overexpressing the mutant forms of APP which are unable to bind Aβ or to activate Go protein, we have found that treatment with aggregated Aβ fails to increase colocalization of APP with BACE1 indicating that Aβ-APP/Go signaling is involved in this process. Moreover, inhibition of Gβγ subunit signaling with βARKct or gallein prevents Aβ-dependent interaction of APP and BACE1 in endosomes, β-processing of APP, and intracellular accumulation of Aβ42. Collectively, our findings uncover a signaling mechanism leading to a feed-forward loop of amyloidogenesis that might contribute to Aβ pathology in the early stages of AD and suggest that gallein could have therapeutic potential.
Gram-negative Tripartite Resistance Nodulation and cell Division (RND) superfamily efflux pumps confer various functions, including multidrug and bile salt resistance, quorum-sensing, virulence and can influence the rate of mutations on the chromosome. Multidrug RND efflux systems are often characterized by a wide substrate specificity. Similarly to many other RND efflux pump systems, AcrAD-TolC confers resistance toward SDS, novobiocin and deoxycholate. In contrast to the other pumps, however, it in addition confers resistance against aminoglycosides and dianionic β-lactams, such as sulbenicillin, aztreonam and carbenicillin. Here, we could show that AcrD from Salmonella typhimurium confers resistance toward several hitherto unreported AcrD substrates such as temocillin, dicloxacillin, cefazolin and fusidic acid. In order to address the molecular determinants of the S. typhimurium AcrD substrate specificity, we conducted substitution analyses in the putative access and deep binding pockets and in the TM1/TM2 groove region. The variants were tested in E. coli ΔacrBΔacrD against β-lactams oxacillin, carbenicillin, aztreonam and temocillin. Deep binding pocket variants N136A, D276A and Y327A; access pocket variant R625A; and variants with substitutions in the groove region between TM1 and TM2 conferred a sensitive phenotype and might, therefore, be involved in anionic β-lactam export. In contrast, lower susceptibilities were observed for E. coli cells harbouring deep binding pocket variants T139A, D176A, S180A, F609A, T611A and F627A and the TM1/TM2 groove variant I337A. This study provides the first insights of side chains involved in drug binding and transport for AcrD from S. typhimurium.
Das positions-spezifisch integrierende TRE5-A Retrotransposon besitzt zwei Promotorregionen (A- und C-Modul). Für das C-Modul konnte ein spezifisch bindendes Protein (CbfA) gefunden werden, das vermutlich über die Expression des Minusstrang-Transkripts regulativ in den Transpositionsmechanismus eingreift. Gleichzeitig stellt CbfA in D. discoideum einen kritischen Faktor dar, der sowohl auf das Wachstum als auch auf die Differenzierung Einfluss nimmt.
Es konnte gezeigt werden:
• Der AT-Haken in CbfA ist für die DNA-Bindung essentiell. Die Inaktivierung hat zur Folge, dass keine Differenzierung stattfindet. Es scheint, dass primär der AT-Haken für die DNA-Bindung sorgt und von den Zinkfingern unterstützt wird.
• Die JmjC-Domäne in CbfA ist essentiell. Transformanden mit CbfA ohne aktive JmjC-Domäne zeigen Defekte sowohl in Wachstum als auch Differenzierung.
• CbfA ist ein nukleares Protein. Es konnte zwar keine Kernlokalisationssequenz identifiziert werden, jedoch weisen die Versuche auf zumindest eine Kernlokalisierungssequenz im C-Terminus des cbfA hin.
• Ein C-terminal verkürztes CbfA ist funktionslos: wahrscheinlich aufgrund fehlender Kernlokalisation und somit fehlender DNA-Bindung.
• Ein N-terminal verkürztes CbfA ist teilweise funktionsfähig: die Komplementation in JH.D2-Zellen führt zu einer partiellen Revertierung hin zum Phänotyp der AX2-Zellen.
• Struktur-Homologien der JmjC-Domäne in CbfA zu Mitgliedern aus der Familie der Fe(II)/2OG-Oxygenasen, DNA-bindende Motive und die Lokalisation im Zellkern weisen auf eine Funktion des CbfAs als Chromatin-Remodeller im Zellkern hin.
• In der Transit von Wachstums- zu Entwicklungsphase kann der CbfA-Mangel durch artifizielle Proteinase A-Expression ausgeglichen werden, aber nicht durch Komplementation mit YakA, Adenylat-Zyklase oder cAMP Rezeptor 1.
• CbfA fungiert wahrscheinlich als Regulator der acaA-Transkription auf Ebene der chromosomalen Strukturen.
• cbfB, ein weiteres Gen mit einer JmjC-Domäne wurde in D. discoideum identifiziert, die Gensequenz vervollständigt und vom Dictyostelium Genom-Projekt verifiziert.
Human serum albumin (HSA) nanoparticles represent a promising tool for targeted drug delivery to tumor cells. The coupling of the antibody trastuzumab to nanoparticles uses the capability of human epidermal growth factor receptor 2 (HER2)-positive cells to incorporate agents linked to HER2. In our present study, we developed targeted nanoparticles loaded with antisense oligonucleotides (ASOs) against polo-like kinase 1 (Plk1). We evaluated the receptor-mediated uptake into HER2-positive and -negative breast cancer and murine cell lines. We performed quantitative real-time PCR and Western blot analyses to monitor the impact on Plk1 expression in HER2-positive breast cancer cells. Antibody-conjugated nanoparticles showed a specific targeting to HER2-overexpressing cells with cellular uptake by receptor-mediated endocytosis and a release into HER2-positive BT-474 cells. We observed a significant reduction of Plk1 mRNA and protein expression and increased activation of Caspase 3/7. Thus, this is the first report about ASO-loaded HSA nanoparticles, where an impact on gene expression could be observed. The data provide the basis for the further development of carrier systems for Plk1-specific ASOs to reduce off-target effects evoked by systemically administered ASOs and to achieve a better penetration into primary and metastatic target cells. Treatment of tumors using trastuzumab-conjugated ASO-loaded HSA nanoparticles could be a promising approach to reach this goal.
The transcriptional regulator RcsB controls the expression of a minimum of 20 different genes having diverse functionalities and biosynthetic operons in the family of Enterobacteriaceae. While in the heterodimeric complex with the co activator RcsA, the RcsAB box consensus is recognized, DNA binding sites for RcsB without RcsA have also been identified. The conformation of RcsB might therefore be modulated upon interaction with various co activators, resulting in recognition of different DNA targets. In this study the interaction of RcsB with some of these DNA targets have been analysed by a diverse array of techniques including gel shift assay and SPR. The solution structure of the C-terminal DNA-binding domain of RcsB from Erwinia amylovora spanning amino acid residues 129-215 has been solved in this study by heteronuclear NMR spectroscopy. The C-terminal domain is composed of four α-helices where the two central helices of the H-T-H motif are similar to the structures of the regulatory proteins GerE, NarL and TraR. The DNA-binding activity of the C-terminal domain alone is established for the first time in this study and was specified by fluorescence spectroscopy, SPR and NMR titration experiments. The molecular interaction between the individual RcsB domains was analysed by cross-linking experiments and heteronuclear NMR spectroscopy and the amino acid residues of the C-terminal domain involved in this interaction were identified precisely. Another important part of this project was the cell-free production of different Trp analogue labelled RcsB protein. RcsB protein was produced in quite a good yield with different Trp analogue having spectrally enhanced properties. The isolated RcsB alloproteins proved to be ideal for protein interaction studies by fluorescence spectroscopy and the very first evidence of an oligomerization of RcsB due to molecular association has been put forth from these studies. The phosphorylated state of the RcsB protein was mimicked by a beryllofluoride complex in order to study its role in transcriptional regulation. It was found that RcsB alone could bind to DNA targets upon this modification by the beryllofluoride complex. Thus the phosphorylation of the protein that involves the Asp 56 residue induces a structural change of the protein followed probably by a domain movement also, so that the C-terminal domain having the H-T-H DNA binding motif that was previously eclipsed by the N-terminal domain is relieved of this constraint.