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Der Lichtsammelkomplex II (LHCII) dient als Lichtantenne für das photosynthetische Reaktionszentrum II der höheren Pflanzen. Seine Trimere stellen das häufigste Protein in der Thylakoidmembran dar. Ungefähr die Hälfte des Chlorophylls der Pflanze befindet sich in diesem Komplex. Der LHCII ist ein integrales Membranprotein und bindet neben Chlorophyll a und b auch verschiedene Carotinoide. Seine Pigmente absorbieren Licht und geben die dadurch aufgenommene Energie an die photosynthetischen Reaktionszentren weiter, wo sie ausgehend von einer Ladungstrennung chemisch konserviert wird. Die Weiterleitung der Anregungsenergie im LHCII geschieht über spezifische Pfade und mit ultraschneller Kinetik im Femtosekundenbereich. Der LHCII ist das einzige Antennenprotein der höheren Pflanzen, dessen dreidimensionale Struktur bei einer fast atomaren Auflösung von 3.4Å gelöst wurde. Bei dieser Auflösung war es jedoch nicht möglich, den Unterschied zwischen Chlorophyll a und b zu bestimmen, außerdem waren nur zwei der insgesamt drei bis vier gebundenen Carotinoide sichtbar. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, die einzelnen Pigmente, deren Positionen aus der Struktur bekannt waren, nach ihrer chemischen Natur zuzuordnen. Hierzu wurden mutierte Komplexe untersucht, bei denen jeweils ein bestimmtes Chlorophyllmolekül fehlte. Dies wurde durch Punktmutationen im Polypeptid erreicht, bei denen diejenige Aminosäure ausgetauscht war, an die ein bestimmtes Chlorophyllmolekül über das zentrale Mg 2 Atom gebunden war. Die veränderten Proteine wurden durch ortsgerichtete Mutagenese und Überexpression des Polypeptids in E. coli hergestellt, wo sie ohne die Pigmente aggregiert in Einschlusskörpern vorlagen. Die Rückfaltung in Gegenwart von Pigmenten und Detergenzien erfolgte auf einer NickelAffinitätssäule, an die das LHC Protein mittels einer HexaHistidinmarkierung gebunden war. So konnte in einem biochemischen Schritt das Protein gefaltet, die Pigmente inkorporiert und die native, trimere Form gebildet werden. Die Rückfaltung von histidinmarkierten Proteinen auf Metallaffinitätssäulen kann als generelle Methode auch für andere, schwierig zu faltende, lösliche und Membranproteine angewandt werden. Der native Zustand des rückgefalteten LHCII wurde folgendermaßen bewiesen: Der Pigmentgehalt, der durch HPLC Analyse bestimmt worden war, war identisch zum nativ isolierten Protein. Auch ein Absorptionsspektrum zeigte bei 4K die charakteristische Aufspaltung in mehrere Chlorophyllmaxima. Es konnte gezeigt werden, dass in einem Fluoreszenzexperiment die Anregungsenergie, die bei kurzwelligem Chlorophyll b eingestrahlt wurde, im Komplex komplett auf das langwelligste Chlorophyll a übertragen wurde. Schließlich wurden aus dem rekombinanten Protein zweidimensionale Kristalle erzeugt, deren elektronenmikroskopische Projektionsbilder identisch zu denen des Nativproteins waren. Der Austausch der Chlorophylle an einigen Bindungsstellen durch Chlorophyllderivate, die entweder im Zentralatom oder in der Porphyrinringstruktur verändert waren, zeigte, dass das Zentralatom den entscheidenden Faktor zur Stabilisierung der Chlorophyllbindung darstellt. Es wurden neun Mutanten erzeugt, bei denen jeweils derjenige Aminosäurerest ausgetauscht war, von dem aus der Struktur bekannt war, dass er den fünften Liganden für das zentrale Mg 2 Atom eines bestimmten Chlorophylls darstellt. Die HPLC Analyse ihrer Pigmente zeigte, dass die Mutanten tatsächlich jeweils ungefähr ein Chlorophyllmolekül verloren hatten; dies diente dazu, die jeweilige Bindungstasche zu Chl a oder Chl b zuzuordnen. Nur sechs Mutanten bildeten Trimere, ihre biochemischen Daten zeigten, dass die in der Struktur vorgenommene Zuordnung bis auf das Chl b3 korrekt war. Einige Chlorophyllmutanten waren auch in ihrem Gehalt an Neoxanthin reduziert, daraus konnte die ungefähre Lage des Neoxanthins in der Nähe der Helix C abgeleitet werden. Die mutierten Proteine lieferten nicht nur die Zuordnung einer Bindungstasche zu einem bestimmten Chlorophylltyp, sondern es konnte aus den Differenzspektren im Vergleich zum Wildtyp auch die Wellenlänge eines bestimmten Chlorophylls abgeleitet werden. Um eine höhere spektrale Auflösung zu erzielen, wurden die Spektren bei 4K aufgenommen. Die Zuordnung einzelner spektraler Banden zu bestimmten Chlorophyllen zeigte, dass in einer bestimmten Bindungstasche nur entweder Chlorophyll a oder Chlorophyll b gebunden war, da sich nur eine einzige Differenzbande im Spektrum ergab. Weiterhin implizieren die gefundenen Einzelbanden, dass die Pigmente keiner starken excitonischen Kopplung unterliegen, wie dies zum Beispiel im B850 Ring des bakteriellen Lichtsammelkomplexes der Fall ist. Bei LHCII Komplexen, die nur mit Chlorophyll b rückgefaltet worden waren, zeigte sich eine ungewöhnlich langwellige Fluoreszenz bei 77K. Dies könnte auf eine räumlich limitierte Kopplung eines einzelnen Chlorpohyllpaars hinweisen. Bei der Mutante der Chl a2 Bindungsstelle zeigte sich, dass dies das langwelligste der untersuchten Pigmente war. Der zugehörige Koomplex war auch der einzige, bei dem die Fluoreszenz ins Kürzerwellige verschoben war. Die Lage des Chlorophylls a2 an der Außenseite des Proteins ist prädestiniert für die Energieübertragung zum photosynthetischen Reaktionszentrum oder zu benachbarten LHC Komplexen.
Der Nachweis nichtkovalenter Komplexe mittels ESIMS erfordert Analysebedingungen, die sich deutlich von den Bedingungen der etablierten Standard-ESIMS kovalent gebundener Biopolymere unterscheiden. Für die ESIMS-Analyse nichtkovalenter Komplexe ist insbesondere die Einschränkungen auf das Lösungsmittel Wasser mit Zusatz von Salzen oder Puffern problematisch, was den Nachweis vollständig desolvatisierter Analytionen unter Erhalt der häufig relativ schwachen nichtkovalenten Wechselwirkungen erschwert. Die Problematik für die massenspektrometrische Analyse nichtkovalenter Komplexe steht dabei in engem Zusammenhang mit dem Mechanismus der ElektrosprayIonisierung. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, grundlegende Phänomene des ESIProzesses zu untersuchen und so ein besseres Verständnis der einzustellenden Randbedingungen beim ESImassenspektrometrischen Nachweis nichtkovalenter Komplexe zu erlangen. Die Untersuchungen erfolgten dabei unter Verwendung geeigneter Modellsysteme, wie Salze, Kohlenhydrate, Peptide und ausgewählte nichtkovalente Komplexe. Eine wesentliche Bedeutung kam der Charakterisierung der physikalischen Randbedingungen der im Rahmen der vorliegenden Arbeit eingesetzten ESIMS-Systeme zu. Auf experimenteller und theoretischer Basis wurden die verschiedenen Aufbautypen im Eingangsbereich des oTOFMS-Systems MICKEY verglichen, wobei ein besonderes Augenmerk auf deren desolvatisierende Wirkung gelegt wurde. Es ließ sich zeigen, daß an diesem oTOFMS-System der Aufbau mit geheizter Transferkapillare dem Aufbau mit Stickstoffgegenstrom vorzuziehen ist, um eine effiziente Desolvatisierung von Analytionen in der ESI zu erzielen. Am oTOFMS-System MARINER wurde die Bedeutung des Drucks in der ersten Druckstufe für die Desolvatisierung von Analytionen am Beispiel ausgewählter nichtkovalenter Proteinkomplexe demonstriert. Dabei konnte gezeigt werden, daß eine Erhöhung des Drucks den Nachweis vollständig desolvatisierter, aber dennoch intakter nichtkovalenter Komplexe dramatisch begünstigt. Dies kann auf die mit der Druckerhöhung einhergehenden Veränderungen der Stoßbedingungen der Analytionen mit dem Restgas beim Passieren der ersten Druckstufe sowie auf die größere Verweilzeit der Ionen in diesem Bereich zurückgeführt werden. Als weitere Randbedingung für Untersuchungen an ESIoTOFMS-Systemen wurde zudem der Einfluß der Axialgeschwindigkeit der Ionen auf das Erreichen des Detektors auf der Grundlage theoretischer und experimenteller Befunde charakterisiert. Die Bedeutung der Axialgeschwindigkeit insbesondere für den Nachweis von Analytionen mit hohen m/zVerhältnissen konnte dabei am Beispiel des nichtkovalenten Komplexes Hämoglobin gezeigt werden. Ebenfalls wurden ausgewählte Phasen des ESIProzesses bei der Überführung gelöster Analyte in massenspektrometrisch detektierbare Gasphasenionen untersucht. So wurde der Einfluß der Zerstäubungsbedingungen auf das resultierende Ionensignal am Beispiel der diskontinuierlichen Zerstäubung von Analytlösung getestet. Künstlich induzierte Zerstäubungsimpulse an der Spraykapillare wurden mit den Extraktionsimpulsen des verwendeten oTOFMSSystems synchronisiert, was die gezielte Analyse einzelner Phasen der diskontinuierlichen Emission von Flüssigkeit ermöglicht. Mit Hilfe des Modellanalyts Bariumbromid ließ sich anhand charakteristischer Indikatorsignale in den Massenspektren auf qualitativer Basis zeigen, daß zu Beginn einzelner Sprayimpulse zunächst kleine Tröpfchen an der Spraykapillare emittiert werden und die Tröpfchengröße im zeitlichen Verlauf des Emissionsimpulses zunimmt. Dieser Befund steht im Einklang mit der von Juraschek [Jur97] vorgestellten Verteilung der Tröpfchengrößen während der diskontinuierlichen Zerstäubung unter den Bedingungen der ESIMS. Ferner konnte durch synchronisierte ESIoTOFAnalyse am Modellsystem einer ZuckerPeptidMischung gezeigt werden, daß Analyte mit höherer Aufenthaltswahrscheinlichkeit an der Flüssigkeitsoberfläche bevorzugt (d.h. zu früheren Zeitpunkten der diskontinuierlichen Zerstäubung) in die geladenen Initialtröpfchen gelangen. Analyte, welche eine höhere Aufenthaltswahrscheinlichkeit im Flüssigkeitsinneren aufweisen, gelangen mit geringerer Wahrscheinlichkeit und somit zu einem späteren Zeitpunkt eines Zerstäubungsimpulses in die Tröpfchen. Die vorgestellten Resultate stehen im Einklang mit den Modellvorstellungen zur Verteilung der Analyte beim für die Desolvatisierung relevanten unsymmetrischen Tropfenzerfall, die unter anderem die geringere Nachweiseffizienz hydrophiler Analyte zu erklären vermag. Der Einfluß des Lösungsmittels auf das resultierende Ionensignal wurde im Rahmen dieser Arbeit im Hinblick auf seine Wirkung als chemische Umgebung des Analyten, auf seine Eigenschaften als Trägerkomponente des Analyten und auf seine Wirkung als Reaktionspartner der Analytionen in der Gasphase untersucht. Als Modellsystem diente der Analyt Bariumbromid in verschiedenen Alkoholen und AlkoholMischungen. Die Untersuchungen ergaben, daß insbesondere die Polarität des eingesetzten Lösungsmittels einen relevanten Aspekt für dessen Wirkung als chemische Umgebung des Modellanalyten darstellt. Eine hohe Polarität des eingesetzten Lösungsmittels begünstigt die Dissoziation des Analyten in Lösung und wirkt somit dem Nachweis von AnalytGegenionAddukten entgegen. Als maßgebliche Eigenschaft in der Rolle der Trägerkomponente ließ sich am Modellanalyt Bariumbromid die Verdampfbarkeit des Lösungsmittels identifizieren. Untersuchungen an einer Analytmischung aus Turanose und Octylglucosid ergaben ferner, daß ebenfalls ausgeprägte Wechselwirkungen zwischen Analyt und Lösungsmittelmolekülen der Verdampfung des Lösungsmittels entgegenwirken. Eine geringe Verdampfbarkeit des Lösungsmittels und eine starke Solvatisierung des Analyten erschweren somit die Desolvatisierung der Analytionen und haben geringe Analytsignalintensitäten in den Massenspektren zur Folge. Ebenfalls ist dem Einfluß der Leitfähigkeit der Analytlösung und somit der Polarität des Lösungsmittels auf die Intensität des resultierenden Ionensignals Rechnung zu tragen. Reaktionen in der Gasphase sind in den ausgewählten Modellsystemen im wesentlichen stoßinduzierte Elektronentransferreaktionen zwischen Lösungsmittel molekülen und zweiwertigen Metallkationen. Eine niedrige Ionisierungsenergie sowie ein hoher Energieeintrag während der Stoßaktivierung - und somit eine hohe Molekülmasse des Lösungsmittels - konnten dabei als begünstigende Faktoren für diese Reaktionen ermittelt werden. Die Resultate zum grundsätzlichen Einfluß des Lösungsmittels dienten als Basis zur Untersuchung des Lösungsmitteleinflusses auf die Bildung von Gramicidin DDimeren mit Hilfe der ESIMS. Am Beispiel dieser nichtkovalenten Peptidkomplexe konnte gezeigt werden, daß die resultierenden Massenspektren unter schonenden Desolvatisierungsbedingungen die Veränderungen des Dimerisierungsgleichgewichts bei Variation des Lösungsmittels widerspiegeln. Die verschiedenen Komponenten der Peptidmischung Gramicidin D bilden zudem in Lösung gemischte Dimere, deren Signale in den Massenspektren eine eindeutige Identifizierung auch geringer Mengen Dimere zulassen. Es ließ sich ferner zeigen, daß die Veränderung der Zusammensetzung von Lösungsmittelgemischen während der Desolvatisierung aus kinetischen Gründen keinen Einfluß auf den detektierbaren Anteil GramicidinDimere aufweist. Untersuchungen zur unspezifischen Adduktbildung in der ESIMS zwischen einem Analyten und weiteren Komponenten der Lösung wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit am Beispiel verschiedener PeptidAnionenAddukte durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, daß insbesondere im negativen Ionenmodus eine ausgeprägte unspezifische Adduktbildung eintritt, während im positiven Ionenmodus nur in geringem Maße PeptidAnionenAddukte zu beobachten sind. MS 2 Untersuchungen der Addukte im negativen Ionenmodus ergaben, daß deren Dissoziation unter Abspaltung der zum Anion korrespondierenden Säure erfolgt, wobei in der Reihe der untersuchten Anionen die Stabilität des Addukts mit abnehmender Gasphasenbasizität des Anions zunimmt. Es konnte aber ferner gezeigt werden, daß neben der Gasphasenbasizität noch weitere Faktoren für die Adduktstabilität von Bedeutung sind; insbesondere sind in diesem Zusammenhang dem Einfluß von CoulombWechselwirkungen und räumlichen Faktoren im Addukt Rechnung zu tragen. Soll die Adduktbildung eines Analyten mit in der Lösung vorhandenen Anionen generell vermindert werden, so ist eine Analyse im positiven Ionenmodus vorzuziehen. Untersuchungen zur Stabilität spezifischer nichtkovalenter Komplexe in der ESIMS wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit am Beispiel der HämGlobinKomplexe von Hämoglobin und Myoglobin durchgeführt. Unter schonenden Desolvatisierungsbedingungen sind die in Lösung vorhandenen nichtkovalenten Komplexe ebenfalls in den ESIMassenspektren detektierbar. Durch vergleichende Untersuchungen im positiven und negativen Ionenmodus sowie durch Variation des Ladungszustands der HämGruppe ließ sich allerdings zeigen, daß die Stabilisierung dieser Komplexe in der ESIMS im wesentlichen auf CoulombWechselwirkungen zwischen Protein und prosthetischer Gruppe in der Gasphase beruht. Die Resultate demonstrieren deutlich, daß die in der ESIMS beobachtete Stabilität nichtkovalenter Komplexe in der Gasphase unter Umständen erheblich von der biologisch relevanten Stabilität dieser Spezies in Lösung abweicht. Zwar kann mit Hilfe der ESIMS die Stöchiometrie nichtkovalenter Komplexe zuverlässig ermittelt werden; zur Ermittlung ihrer Stabilität sind jedoch analytische Untersuchungen in kondensierter Phase prinzipiell vorzuziehen. Zum Nachweis nichtkovalenter Komplexe mittels ESIMS ist für jedes Instrument und jede neue analytische Fragestellung stets eine Optimierung der Analysebedingungen erforderlich. Die vorgestellten Resultate bestätigen anhand ausgewählter Beispiele, daß in Lösung vorhandene spezifische Komplexe intakt in Gasphasenionen überführt und massenspektrometrisch detektiert werden können, sofern die Analyseparameter sorgfältig angepaßt wurden. Dabei stellt der Energieeintrag in die Analytionen während der Desolvatisierung ebenso einen bedeutenden Parameter dar wie die Stabilität des nichtkovalenten Komplexes in der Gasphase, welche in einigen Fällen durch die Wahl des ''richtigen" Ionenmodus zur Analyse beeinflußt werden kann. Ein grundsätzliches ''Patentrezept" zum erfolgreichen massenspektrometrischen Nachweis nichtkovalenter Komplexe kann jedoch nicht gegeben werden. Die Desolvatisierung von Analyten aus einem relativ schwer verdampfbaren Lösungsmittel, wie z.B. Wasser, ist problematisch, und die Freisetzung hydrophiler Analytionen wird durch die ausgeprägte Solvatisierung dieser Spezies erschwert. Um neben diesen unabänderlichen Schwierigkeiten weitere Probleme, wie die Bildung von Addukten, zu vermeiden, sollten für die ESIMSAnalyse möglichst saubere Proben Verwendung finden. Ist zur Stabilisierung des Komplexes in Lösung allerdings der Zusatz von Salzen erforderlich, so sollten unter anderem solche Anionen gewählt werden, die nur in geringem Maße Addukte bilden. Ferner ist im Hinblick auf eine Minimierung der Adduktbildung mit Anionen eine Untersuchung im positiven Ionenmodus vorzuziehen. Für die Weiterentwicklung der ESIMS zur Analyse nichtkovalenter Komplexe ist eine weitere Optimierung der grundsätzlichen Desolvatisierungsmöglichkeiten wünschenswert, welche eine schonende Desolvatisierung des Analyten unter Erhalt der spezifischen nicht kovalenten Wechselwirkungen ermöglichen. Ferner sind Methoden zu entwickeln, um Proben effizient und schnell zu reinigen, ohne die Proteinkomplexe irreversibel zu dissoziieren. Durch Entwicklungen dieser Art sollten erhebliche Fortschritte in der ESIMSAnalytik nichtkovalenter Komplexe möglich sein, die dem Ziel eines zuverlässige en Einsatzes dieser Methode in der Routineanalytik biologisch bedeutender Proben näherkommen.
Methodik: Die in dieser Arbeit entwickelte flowzytometrische Methode ist aufgrund der guten Korrelation zur gängigen Europium Immune Release Methode zur Bestimmung der NK-Zell-, bzw. CD 8 , zytotoxischen T-Lymphozyten Aktivität gut geeignet. Der geringe Zeit- und Kostenaufwand sprechen für die Anwendung dieser Methode. Enzympräparation: Die in dieser Arbeit verwendete Enzympräparation kann die NK-Zell bzw. CD 8 , zytotoxischen T-Lymphozyten Aktivität signifikant steigern. Eine signifikante Mehrfachstimulation ist ebenfalls möglich. Möglicherweise beruht dieser Effekt auf einer erhöhten Freisetzung von TNFa durch die Effektorzellen, die die Targetzellen zum (programmierten) Zelltod bringen. Ferner wird über die Freisetzung weiterer Zytokine berichtet, die eine Stimulierung der Effektorzellen bewirken (durch IL1b und IL6). Immunkomplex gebundene TNFa Moleküle können durch die proteolytische Aktivität freigesetzt werden. Die Ergebnisse weisen auf eine unspezifische Veränderung der Membranbestandteile der Effektorzellen hin, welche eine Freisetzung von Zytokinen bewirkt. Ferner kann die proteolytische Aktivität der Enzympräparate verschiedene Immunkomplexe und sogenannte Blockingfaktoren auflösen. Fazit: Eine signifikante und konzentrationsabhängig immunstimulierende Wirksamkeit der Enzyme ist gegeben. Diskussionswürdig dürfte hier nur die enterale Resorption bzw. Persorption sein (s.Kap I). Die parenterale Applikation ist wegen einer anaphylaktischen Reaktion risikoreich. Denkbar wäre eine ex vivo "Therapie" isolierter humaner Lymphozyten mit anschließender Wiederzufuhr in den Kreislauf. Die Aktivierenden Konzentrationen für die Enzyme liegen im Bereich von 20 bis 160 µg/ml bei einer Einfachstimulation. Bei höheren Konzentrationen als 320 µg/ml beginnt der toxische Bereich. Bei der Mehrfachstimulation von Lymphozyten liegt der aktivierende Bereich zwischen 10 bis 80 µg/ml, wobei die höheren Konzentrationen toxisch wirken. Retinoide: Eine konzentrationsabhängige signifikante Steigerung der NK-Zell- bzw. CD 8 , zytotoxischen T-Lymphozyten Aktivität ist gegeben. Die NK Zellaktivität konnte bei Konzentrationen von 10 8 bzw. 10 6 M mit Retinsäure und Retinol gesteigert werden, die Aktivität von CD 8 zytotoxischen T-Lymphozyten hingegen nur durch Retinsäure. Das Lösungsmittel DMSO bewirkte keine signifikante Aktivitätsänderungen. Diskutiert wird hier eine erhöhte Expression des IL2-Rezeptors sowie die des CD3 Rezeptors, als Ursache für die Aktivitätssteigerung führen soll. Der Fas-Ligand hingegen wird herabreguliert, was eine "Selbsttötung" der Effektorzellen verhindert. Die vermehrte Produktion von Zytokinen (IL2, IL4, IL6, IL10 und IFNgamma), deren Gehalt die im Überstand Retinol behandelter Zellen zunimmt, kann ebenfalls zur Aktivitätssteigerung führen.
Die G/F-Transition zytoskelettärer Elemente bildet die molekulare Basis zur Kontrolle der Zellform, Motilität, Migration und Invasivität von Zellen. Die Änderungen der Filamentlängen werden durch bindende Proteine kontrolliert, wodurch sich die viskoelastischen Eigenschaften des Zytoplasmas ändern. Die Kenntnis der mechanischen Eigenschaften der einzelnen Zytoskelettelemente in vitro (mit und ohne bindende Proteine) ist die Grundlage zum Verständnis der Zellmechanik. Daher wurde eine nicht destruktive Methode zur Bestimmung viskoelastischer Eigenschaften von Gelen und Flüssigkeiten entwickelt. Als Viskositätssensor dient ein kleines Glasstäbchen, welches in der zu untersuchenden Flüssigkeit in seiner Resonanzfrequenz schwingt. Aufgrund der Zähigkeit der Flüssigkeiten kommt es zur Mitbewegung angrenzender Flüssigkeitsschichten. Die Eindringtiefe der erzeugten Scherwellen ist eine Funktion der Viskosität und der Dichte der Flüssigkeit. Die extrem kleinen Auslenkungen (1100 nm) des Sensors werden von einem phasensensitiven akustischen Mikroskop detektiert, welches gleichzeitig die Detektion des Elastizitätsmoduls der Flüssigkeit ermöglicht. Nach Aufbau und Weiterentwicklung des Gerätes wurde die Viskoelastizität während der Polymerisation von Aktin, Tubulin und Neurofilamentprotein gemessen sowie während der Interaktion der Polymere mit einer Reihe spezifisch bindender Proteine, wie z.B. aAktinin, Profilin, Glykolyseenzyme, MAPs bzw. Zellgiften wie Cytochalasin D, Phalloidin, Colchizin und Taxol. Im Vergleich zu FAktinlösungen ist die dynamische Viskosität von Mikrotubulilösungen um eine Zehnerpotenz und die Schallgeschwindigkeit um etwa 100 m/s höher. Die Viskoelastizität von Nicht-Muskelaktin ist im Vergleich zu Muskelaktin etwa dreimal höher. Die steadystate-Viskositäten von F-Aktin und Mikrotubulilösungen nähern sich mit steigender Proteinkonzentration einem Maximalwert an, wohingegen die Elastizitäten sich einem Minimalwert annähern, was auf eine nematische Phasentransition zurückzuführen ist. Der Schallgeschwindigkeitsverlauf während der Polymerisation von Aktin und Tubulin ist biphasisch: er nimmt zunächst vor messbaren Viskositätsänderungen zu, was hinsichtlich des Aktins auf eine Zunahme steifer Aktinprimer und hinsichtlich des Tubulins auf die Bildung oligomerer Strukturen mit hoher intrinsischer Steifigkeit zurückzuführen ist. Für Proteinkonzentrationen >20 µM fällt dann die Schallgeschwindigkeit nach dem Erreichen des Viskositätsmaximums ab, was durch eine erhöhte Volumenkompressibilität infolge zunehmender Hydratation der Polymere begründet ist. Versuche mit polymerisationsfördernden bzw. depolymerisierenden Agenzien wie Taxol bzw. Colchizin und Kalzium zeigen, dass die hohe Elastizität von Mikrotubulilösungen durch die intrinsische Elastizität der Tubulinoligomere dominiert wird. Die Viskosität von Mikrotubuli mit assoziierten MAPs (MTP) ist im Vergleich zu FAktin ungefähr doppelt so hoch und im Vergleich zu PC-Tubulin ungefähr dreimal niedriger. Die Elastizität von MTP ist im Vergleich zu FAktin durchschnittlich 4 % höher und 3 % niedriger im Vergleich zu MAP-freien Mikrotubuli. Die Assoziationen von Neurofilamenten an Mikrotubuli induzierte einen Viskositätsanstieg, während die Elastizität fiel, was auf eine Destabilisation der Mikrotubuli während der Interaktion zurückzuführen ist. Die Destabilisation ist möglicherweise eine Folge einer GTP-Hydrolyse durch die an den Neurofilamenten assoziierte GTPase. Neben den zeitlich voneinander unabhängigen Verläufen der Schallgeschwindigkeit und der Viskosität konnte mit Hilfe der Detektion der Schalldämpfung während der Polymerisation von Aktin eine weitere zeitlich unabhängig verlaufende Kinetik bestimmt werden, welche mit der Quervernetzung und der Filamentlänge zusammenhängt. Die Schalldämpfung von Neurofilamenten ist im Vergleich zu F-Aktin etwa 10mal höher. Während der Polymerisation von Tubulin, mit und ohne MAPs, konnte aufgrund hoher Schallreflektionen, bedingt durch die festkörperähnlichen Strukturen, keine klar definierte Schalldämpfungskinetik bestimmt werden. Die Elastizität von Aktingelen (1 mg/ml) hängt nicht mit der Deformationsfrequenz (0,0533 kHz) zusammen. Nach der Zugabe von a-Aktinin steigt jedoch die Elastizität mit der Frequenz gemäß dem Verhalten eines elastischen Körpers an. Auch durch die Zugabe hoher ATP-Konzentrationen (2 mM) kann die Elastizität von Aktin erhöht werden. Impulsartige Modulationen der Schwingungsamplitude von ± 30 nm senkten die Viskosität von Aktingelen (< 25 µM) um 50 %, was auf ein Zerschlagen und Umorientieren von Filamenten zurückzuführen ist. Durch die Zugabe von aAktinin waren diese Viskositätsänderungen siebenmal niedriger. Die Viskosität von Aktingelen > 50 µM konnte durch impulsartige Erhöhungen der Schwingungsamplitude (> 40 nm) nicht verringert werden. Ebenso wurden die Viskositäten von Tubulingelen (15100 µM) und Neurofilamentlösungen (> 0,5 µM) durch impulsartige Deformationen im Nanometerbereich (10100 nm) nicht beeinflusst. Niedrige Profilinkonzentrationen (Aktin:Profilin 1) fördern die Polymerisation von Mg 2 bgGAktin. Ebenso führt die Zugabe von Profilin (Aktin:Profilin = 1:1) zu bereits polymerisiertem Aktin zu einer Viskositätszunahme. Profilin im Überschuss (Aktin:Profilin = 1:5) hemmt die Polymerisation von Mg 2 bgG Aktin. Im Gegensatz zu Muskelaktin verliert NichtMuskelaktin nach einiger Zeit (> 40 Minuten) seine Elastizität. Dieser Elastizitätsverlust kann durch die Zugabe von Profilin verzögert werden. Nach der Zugabe geringer Profilinkonzentrationen zu bgAktin wurde anhand von EM-Aufnahmen vermehrt nicht filamentöse Aktin-Aggregate gezeigt, welches besonders hohe Elastizitätswerte aufwies. Zusammen mit den rheologischen Befunden für Aktin und Mikrotubulilösungen kann geschlossen werden, dass nicht filamentöse Formen zytoskelettärer Elemente (Tubulinoligomere, Aktintrimere, GAktincluster) in hohem Maße zur Elastizität von Zellen beitragen. Hexokinase fördert die Polymerisation von Aktin. In Gegenwart hoher ATP-Konzentrationen wirkt sie durch Fragmentierung von Aktinfilamenten elastizitätsmindernd. In Gegenwart von Glukose wird dieser Effekt aufgehoben. LDHH 4 fördert in Gegenwart ihres Coenzyms NADH die Polymerisation von Aktin. Gibt man zusätzlich Pyruvat hinzu, so wird dieser Effekt nahezu umgekehrt. Unter diesen Bedingungen ist ferner die Enzymaktivität der LDHH 4 eingeschränkt. Umgekehrt fördert die LDHH 4 in Gegenwart von Laktat und NAD die Polymerisation von Aktin, wobei gleichzeitig die Enzymaktivität der LDHH 4 erhöht ist. Diese Befunde sprechen für eine deutliche Reziprozität zwischen LDHH 4 und Aktin. Aldolase reduziert deutlich die Viskoelastizität von F-Aktin, was in der Bildung von F-Aktin-Aldolase Parakristallen begründet ist. Die Zugabe des Substrates FBP erhöht hingegen die Viskoelastizität von F Aktin. Der Effekt hängt jedoch davon ab, ob Magnesium-Ionen an den Aldolase-G-Aktin-Komplex binden. Wird Aldolase zu polymerisierendem Aktin zugegeben, so bleibt die Viskosität der Lösung unverändert, während die Elastizität zunimmt. In diesem Falle wird die Steifigkeit der Filamente durch die Anla gerung der Aldolase erhöht. Zytosolische, nichtmembrangebundene Enzyme, wie die Aldolase, Hexokinase und LDH binden demnach an F-Aktin und modulieren seine Mechanik. Das Ausmaß der Modulation hängt von der Konzentration der Enzyme sowie der Gegenwart der jeweiligen Substrate ab. Ferner moduliert Aktin reziprok die Aktivität der Enzyme.
Exemplarisch anhand der Offenbacher Lohwald-Siedlung, einem klassischen sozialen Brennpunkt, der sich in den vergangenen drei Jahrzehnten vom Obdachlosen-Asyl hin zu einem modernen Ghetto verwandelt hat, werden Lebenssituation, Lebensentwürfe und die Lebensperspektiven jugendlicher Brennpunkt-BewohnerInnen beschrieben. Hierzu werden die Entwicklungsgeschichte und die Beschreibung der räumlichen Segregation des Wohngebietes sowie Angaben zur Sozial- und Infrastruktur des Stadtteils und die Beschreibung der Lebens- und Sozialisationsbedingungen ebenso herangezogen wie die analytische Betrachtung komplexer gesellschaftlicher Entwicklungen und die Selbsteinschätzungen und -deutungen junger Lohwald-BewohnerInnen, die im Rahmen einer empirischen Untersuchung ermittelt wurden. Zwar ergab die Gesamtuntersuchung, dass der Charakter der Lohwald-Siedlung als ein nach innen und aussen relativ geschlossenes Ghetto brüchig und nach beiden Seiten hin durchlässig geworden ist, und dass diese Entwicklung sich auch in den jugendlichen Orientierungsmustern niederschlägt. Doch dies ist nicht gleichbedeutend, dass sich dadurch der Brennpunktcharakter der Siedlung aufgelöst hat. Für viele junge Menschen ist Aufwachsen im sozialen Brennpunkt nach wie vor gleichbedeutend mit Unterversorgung, Beeinträchtigung, Benachteiligung und Stigmatisierung sowie fehlender Förderung in wesentlichen basalen Bereichen. Das Zusammenkommen defizitärer familiärer Sozialisation und einer häufig problempotenzierenden Sozialisation durch die Gleichaltrigengruppe (Peergroup) unter den Bedingungen begrenzter Erlebnis-, Erfahrungs- und Erkenntnismöglichkeiten, fehlender Lernfelder und mangelnder Erfolgs- sowie Anerkennungsmöglichkeiten haben u.a. zur Folge, dass wichtige Einstellungs- und Verhaltensmuster und Schlüsselqualifikationen fehlen bzw. nicht ausreichend ausgeprägt sind, um den unterschiedlichsten Anforderungen eines Lebens außerhalb des sozialen Brennpunktes und einer sich immer rascher wandelnden Gesellschaft entsprechen zu können. Doch nicht nur die subjektiven Dispositionen sondern auch die objektiv-gesellschaftlichen Bedingungen, die sich aus der Dynamik gesellschaftlichen Wandels ergeben erhöhen für viele Brennpunkjugendlichen die Wahrscheinlichkeit der Aufrechterhaltung ihrer Randgruppenexistenz und somit ihres Verbleibs im unteren Drittel, wenn nicht Zehntel der Gesellschaft. Dem entgegenzuwirken ist nicht nur Aufgabe von Sozialpolitik sondern auch von Sozialarbeit. Ausgehend von den ermittelten Bedarfen vor Ort werden Theorie und Praxis eines zielgruppenorientierten Konzeptes von Jugendarbeit vorgestellt, das sich nach wie vor dem emanzipatorischen Anspruch verpflichtet sieht, zur Persönlichkeitsentwicklung- und Bewusst- seinsbildung beizutragen. Nicht nur weil dies den Erfordernissen des gegenwärtigen Arbeitsmarktes entspricht oder zu einem gelingenderen Umgang mit den Anforderungen führt, die sich aus den gesellschaftlichen Strukturwandlungsprozessen ergeben, sondern weil dies als wichtiger Beitrag zu verstehen ist, junge Menschen in die Lage zu versetzen, sich, ihre Umwelt, ihre Situation und deren Ursachen aber auch ihre Zukunftsperspektiven verstehen und tendenziell auch verändern zu können. Es geht also um die Begründung und Beschreibung einer Jugendarbeit, die zur Bewusstmachung und Eröffnung von Handlungsfeldern führt. Anhand der Theorie, des Konzeptes und der Praxis erlebnisorientierter Jugend(kultur)arbeit im Lohwald und deren Evaluation u.a. durch empirische Befunde wird nicht nur aufgezeigt, dass eine solche Jugendarbeit erfolgreich sein kann, sondern auch, das die Debatten um die sozialisatorische und politische Produktivität von Jugendarbeit nach wie vor aktuell sind.
Soziokulturelle Funktionen von daytime Talkshows: Die den Untersuchungen zugrundeliegenden Annahme war, TV-Talkshows als Teil eines gesellschaftlichen Diskurses, als eine mit spezifischen Merkmalen ausgestattete Art der Sprachverwendung zu betrachten, die gerade als kollektive, gesellschaftliche Praxis determinierende Faktoren und spezifische Wirkungen hat. Ihre Manifestationen als Programm, Videoband oder (in reduzierter Form) als verschriftetes Transkript wurden als "Text" definiert, der innerhalb der soziokulturellen Ordnung bestimmte Aufgaben hat, und dessen Funktionen sich nicht allein als lokale Funktionen (die sich auf die unmittelbare Situation als gelenktes Gespräch im Studio vor Publikum beziehen) erklären lassen. Der gesellschaftliche Effekt (die Funktion?) der hier untersuchten daytime talkshows ist ein öffentliches In-Erscheinung-Treten und ein komplementär dazu wirkendes Wahrnehmen des Privatmenschen in seiner Alltäglichkeit, des Durchschnittsmenschen im Medium Fernsehen. Dieser alltägliche Durchschnittsmensch kann durchaus als "the nigger of tv" gesehen werden, denn außer seiner (bisweilen nackten) Haut - oder seinem Innenleben hat er dem Fernsehen nichts zu verkaufen, denn er ist ja gerade nicht prominent, attraktiv, glamourös oder aus anderen Gründen begehrenswert für ein Publikum. Doch zu der Bedingung, seine seelischen Defekte öffentlich vorzuführen, ist auch ihm jederzeit ein Platz im Glanz der Scheinwerfer gewiß. Daß sich so viele zu einer öffentlichen Innenschau entschließen können, hängt vermutlich mit einem medialen Narzißmus zusammen, der die Spiegelung im Blick des Anderen zum Beweis seiner Existenz braucht. In einer von den visuellen Medien, insbesondere dem Fernsehen durchdrungene Lebenswelt, ist das Bedürfnis des namenlosen, unscheinbaren Alltagsmenschen, ebenfalls als ein in dieser TV-Welt existierendes Subjekt wahrgenommen zu werden, möglicherweise verständlich. Dieses Subjekt der Talkshow wird jedoch erst durch Konventionen des Sprachgebrauchs und der Interaktion, durch gezielte Bildführung und Auswahl der Einstellungen, durch sozial signifizierte Formen von Makeup und Dresscodes, aber auch durch Zuschreibungen und Kategorisierungen sowie durch Möglichkeiten (oder Unmöglichkeiten) der zumeist konversationell narrativ realisierten Selbstdarstellung etc. konstituiert und als "Typus" entwickelt. Es ist ein Effekt des Talkshowspezifischen Diskurses. Gleichzeitig ist es Objekt dieses Diskurses, insofern sich alle Teilnehmer über dieses Subjekt (über sein Innenleben, seine Probleme, geeignete Korrekturverfahren etc.) unterhalten. Die soziale (nicht die individuelle!) Identität als Durchschnittsmensch in seiner öffentlichen, gesellschaftlichen Erscheinungsform wird in solchen TVDiskursen erst produziert, und historisch betrachtet ist sie noch eine junge Erscheinung: TV-Talkshows dieses Zuschnitts haben sich erst Ende der achtziger Jahre herausgebildet. Die Showproduzenten sehen explizit eine auf Selbsterkenntnis ausgerichtete, beratende, (alltags-)problemlösende Funktion ihrer Programme, "der Alltagsmensch in Not wird hier geholfen", so würde V. Feldbusch von Sat1 vermutlich formulieren. Als selbsternannte Fernsehvariante eines Ratgeberdiskurstyps ist das Alltagssubjekt aufgefordert, einen Diskurs über es selbst zu halten (Gestehen), Diskursen anderer über es selbst zuzuhören (Informiert-/Belehrt-/Ermahnt-Werden). In dieser Hinsicht ist die hier untersuchte Form von Talkshows auch als gesellschaftliche Praxis zu verstehen, die auf ihre triviale Weise ein "Wissen vom Subjekt" (über sog. subjektive, innere Verfaßtheit, psychische Eigenschaften) hervorbringt, täglich reproduziert und massenhaft verbreitet. Dieses weitgehend durch eine therapeutische Weltanschauung strukturierte, entblößende "Wissen" wird zwischen den Beteiligten jedoch in Formen verhandelt, die die Strukturen und Merkmale eines privates Gespräch simulieren. Das Sprechen über den Privatbereich wird formal auch als privates Gespräch simuliert, weist aber eine hybride Struktur zwischen Abfrageformat und informellem Gespräch auf. Dabei war festzustellen, daß die Teile des Hybrids den Teilnehmerkategorien GUE und HOST nicht zu gleichen Teilen zufallen, sondern die Moderatorin die Optionen informeller Gesprächsorganistationen und Merkmale nutzt, während den Gästen nur die Optionen des reaktiven Parts im Interviewrahmen zustehen und sie auch im Bereich der Lexis selten Gebrauch vom informellen Register machen . In einer merkwürdigen Umkehrung des Faktischen erweist sich die "Redeweise des Volkes" gerade ausschließlich als Option der Moderatorin, die eben nicht die Massen, sondern die Institution, das Medium verkörpert. Talkshowdiskurse formieren öffentlich wahrnehmbare, medial konstituierte soziale Subjekte, die jedoch nicht als Rollen und Statusträger oder Repräsentanten von Institutionen, auch nicht als "Popstars", sondern gerade als "einfache Durchschnittsmenschen" konstituiert werden. Diese Typisierung bzw. Konturierung einer öffentlichen Form des Alltagsmenschen erfolgt jedoch nicht allein über Bilder und Repräsentationen, sondern weitgehend, aber unmerklicher durch diskursive Praktiken, durch den Umgang mit dem Subjekt der Talkshow, durch Interaktionskonventionen und anderen Modalitäten des Sprechens wie Höflichkeitsstrategien oder bestimmte narrative Verfahren, die in selbstdarstellerischer Absicht Sprecheridentitäten artikulieren. Die je Talkshow spezifische Konfiguration solcher subjektkonstitutiver Praktiken auf verschiedenen Ebenen des Diskurses ergibt eine Kontur, einen durch die Talkshow produzierten und nur vermittels der Praktiken, nie jedoch explizit charakterisierten "Entwurf" des Alltagsmenschen (z.B. ohnmächtig, Autoritäten unterworfen, selbstermächtigt, einsichtsfähig, vereinzelt, einer neben vielen usw.). Diese Typisierung bzw. implizite Charakterisierung durch Konventionen des Sprachgebrauchs und der Gesprächsstruktur wird maßgeblich in der Differenz zu den Positionen der anderen Diskursteilnehmer (Experten, Studiopublikum, Moderatorin) herausgebildet. Diese Diskurssubjekte stehen in einem für den Diskurstyp je charakteristischen Verhältnis zum Diskurs, zu den Modalitäten des Sprechens und zu anderen Subjektpositionen, von denen aus gesprochen werden kann. Subjektpositionen sind die unabhängig vom jeweils auf dem Podium platznehmenden Individuum vorstrukturierten, mit bestimmten Möglichkeiten des Sprechens ausgestatteten, an bestimmte kommunikative Handlungen gebundenen, mit bestimmten interaktionellen Vorrechten ausgestatteten etc. transindividuellen Äußerungsmöglichkeiten, die, realisiert, ein typisches Exemplar dieser Subjektposition zur öffentlichen Erscheinung bringen. Insofern sind diskursiv positionierte (konstituierte) Subjekte bzw. Subjektpositionen gleichzusetzen mit den spezifischen Äußerungsmodalitäten des jeweiligen Diskurstyps. Unter der Perspektive einer kritischen Diskursanalyse werden diese Vorgänge als moderne Form von Machtausübung und Ideologie betrachtet. Der Fokus auf die diskursiven Praktiken, die unscheinbare Normalisierungs und Disziplinierungseffekte bewirken als explizite Repräsentationen und Repression, lenkt das Augenmerk auf das, was Foucault den technologischen Aspekt von Macht bezeichnet. Machttechnologien stellen über konventionalisierte Diskurspraktiken gesellschaftliche Ordnung und Dominanz her, regulieren über Kommunikationsverhalten die Masse der Bevölkerung bzw. reproduzieren diese (hegemoniale) Ordnung in unzähligen, alltäglichen Mikropraktiken zwischen Institutionen und ihrer Klientel. Nicht nur in Talkshows handelt es sich bei solchen Praktiken weitgehend um sprachlich strukturierte Praktiken. Auch sprachlich konstituierte Verhältnisse artikulieren Machtverhältnisse, sie strukturieren sich nach Gleichheit/Nähe oder Ungleichheit/Distanz. Subjektpositionen sind die Pole in diesem Verhältnis. Da jedoch Subjektpositionen von diskursiven Positionen, d.h., Sprecherpositionen bestimmt werden, gilt es die Formen und Möglichkeiten des Sprechens der unterschiedlichen Teilnehmerkategorien im Talkshowdiskurs genau zu analysieren: In welcher Form zu welchen Bedingungen kann wer was wem gegenüber wie artikulieren? Wer mit wem in welcher Form interagieren? Welche Implikationen hat das? Welche sprachlichen Strukturen und Prozesse strukturieren dieses Sprechen und inwiefern strukturieren die sprachlich diskursiven Formen das Verhältnis der Diskurspositionen? In welchen sprachlichen Formen wird das Subjekt/ive verhandelt, und vor allem: Welches Sprechen legitimiert den medial konstituierten Durchschnittsmenschen? Prämissen, Vorgehensweise und Ergebnisse Um sich der Problemstellung zu nähern und die Mikropraktiken des Sprachgebrauchs funktional zu erfassen, wurde eine systemischlinguistische sprachtheoretische Perspektive eingenommen, die die primären Funktionen von Sprache in eine repräsentationsorientierte, eine interpersonell ausgerichtete und eine textuelle Dimension gliedert. Da es galt, diskursive Praktiken hervorzuheben, die sich nur durch den Bezug auf Akteure und Handlungen zwischen diesen beschreiben lassen, lag der Schwerpunkt der Untersuchung auf den sprachlichdiskursiven Merkmalen, die die Verhältnisse zwischen den Diskursbeteiligten bzw. die der Teilnehmer zum Diskurs regulieren und artikulieren. Die Entscheidung, zwei unterschiedliche Talkshowreihen zu untersuchen, beruht auf der Annahme, daß erst der kontrastierende Blick es ermöglicht, wesentliche Merkmale und Spezifika des Diskurstyps zu erfassen. Oft rücken nur über vergleichende Analysen kennzeichnende Aspekte in den Mittelpunkt, die bei homogeneren Daten möglicherweise unterbeleuchtet blieben. So konnten unterschiedliche Optionen der Realisierung bestimmter funktional definierter Vorgänge (z.B. das Vorstellen, die Einführung, die Befragung usw.), die innerhalb ähnlich strukturierter Diskurstypen zur Verfügung stehen und für z.T. signifikante Unterschiede sorgen, präzisiert werden. Die Auswahl der zu untersuchenden Phänomene und Merkmale wurden durch dieses vergleichende Lesen der Transkripte erheblich beeinflußt. Der Reihe nach wurden mit sprachwissenschaftlichem sowie interaktionsanalytischem Instrumentarium die Gesprächsorganisation, die Fremddefinitionen und Kategorisierungen des Subjekts der Talkshow durch die Einführungs und Einleitungsverfahren auf verschiedenen (visuellen, graphischen und sprachlichen) Ebenen untersucht. Im Anschluß daran standen kommunikative Handlungen zwischen den Diskursteilnehmern im Mittelpunkt, mit dem Schwerpunkt auf Analysen von Fragehandlungen und Frageformaten der Moderatorinnen und persönlichen Erzählungen der Alltagsmenschen/Gäste. Implikationen der sprachlichen Organisation und der verbalen oder kommunikativen Strukturen für die Subjektpositionen der Beteiligten wurden herausgearbeitet. Sodann habe ich mich auf den Diskurs der Experten konzentriert und Strategien der Subjektkonstitution dargestellt. Dabei ging es vor allem darum, wie das "ExpertenWissen" in diesen Shows auf das Subjekt zurückwirkt, welche Formen der "Beratungs/Ratgeberdiskurs" annimmt und welche SubjektEffekte dies zeitigt. Dabei wurde deutlich, daß beide Showreihen unterschiedliche Subjektpositionen für den Fernseh Durchschnittsmenschen konstituieren, die sich aus den ebenfalls unterschiedlichen Strukturierungen und Differenzen zu den anderen Positionen (Experten, Moderatorinnen, Studiopublikum) ergeben. Um den Aspekt der Macht und die gesellschaftliche Funktion der Talkshowpraktiken in die Untersuchungen einzuführen, wurde auf das Konzept der Machttechnologien zurückgegriffen, wie von Foucault (z.B. 1977) skizziert. Er verweist auf zwei grundlegende Metastrategien, die ungeregelte "Masse Mensch" gesellschaftlich (staatlich, hegemonialkulturell) zu disziplinieren, zu steuern und letztenendes verwaltbar zu machen, auf seinen gesellschaftlichen Platz zu verweisen, indem sie zu Subjekten (gemacht) werden. Es handelt sich dabei um die Machttechnologien der Objektivierung und der Subjektivierung von Individuen, die sich jeweils durch verschiedene Verfahren auszeichnen, wie ein Wissen vom Menschen hervorgebracht wird, das dann von den Individuen als "ihre Wahrheit" bzw. als die Beschreibung ihres "wahren Selbst" von ihnen selbst angenommen und diskursiv reproduziert wird. Die Möglichkeiten, sich als Selbst wahrzunehmen, die Formen, in denen dies geschieht und die Repräsentationen, die damit verbunden sind, stehen daher immer in einem sei's konservierenden, sei's subversiven Verhältnis zu Macht. Die Kennzeichen beider Machttechnologien habe ich in Anlehnung an Ausführungen von Foucault (1977;1983) bzw. seiner Interpreten Dreyfus und Rabinow (1987) versuchsweise und relativ frei auf interaktionelle und diskursive Verfahren in den Talkshows übertragen, was mir allerdings unproblematisch erscheint, denn die "Strategien" sind in aller Regel in Verbindung mit Sprache realisierte Vorgänge. Insofern entspricht es nur einer Präzision auf konkreter sprachlicher Ebene (was Foucault schuldig bleibt). Es wurde also der Versuch unternommen, diskursive Korrelate zu den von Foucault nur sehr allgemein formulierten Merkmalen der Technologien zur Subjektkonstitution zu finden und gesprächsanalytisch erfaßbar zu machen. Als Objektivierungsprozesse lassen sich die Verfahren beschreiben, die die Diskursteilnehmer zu AusstellungsObjekten (des Blicks und der Rede) machen. Andererseits gibt es subjektivierende diskursive Verfahren, die die Teilnehmer als Subjekt konstituieren, indem sie zur relativ ungelenkten, freigewählten Diskursproduktion, d.h. zu längerem und ggf. auch eigenintitiativen Sprechen animiert werden, allerdings immer in Erwartung, ihr "wahres Selbst" der Öffentlichkeit auszustellen ("gestehen"), das im Anschluß daran von einer Experteninstanz ausgedeutet wird. Sprachlichdiskursiv realisierte Objektivierungsstrategien definieren sich z.B. durch Verfahren der (mit negativ konnotierten Werten beladenen) Identifizierung, Fremdkategorisierung, Aussonderung und Vereinzelung, die in überaus großem Maß in den Shows von Rolonda festzustellen sind. Das impliziert den Fokus auf das konkrete Individuum und den Einzelfall, der vor den Augen der Öffentlichkeit vorgeführt, belehrt und ermahnt wird. Durch Identifikation und Fremdkategorisierung wird das Subjekt der Talkshow zum Objekt der Rede gemacht, anstatt es selbst sprechen zu lassen. In dieser Hinsicht spielen vor allem die Untertitel, die Einleitungsdefinitionen der Moderatorin (v.a. in Rolonda) und der Gebrauch der Personalpronomen, insbesondere des persönlich gebrauchten, definiten "you" eine große Rolle, die als personalisierende Identifizierungspraktiken stark vereinzelnde Effekte haben. Kategorisierungen der Personen, die im Dienste der Show operieren und sie von vornherein auf bestimmte Wahrnehmungen festlegen, sind ebenfalls objektivierende Talkshowpraktiken: Reduktionen auf die "Eigenschaft" der Familienzughörigkeit, Subsumtion unter das Tagesthema und Definitionen in Abhängigkeit von selbstdefinierten Absichten der Showgestalter ("helfen, glücklich machen, bessern") klassifizieren das TalkshowSubjekt jeden Tag aufs Neue in den immer gleichen Mustern als unfähig zur Selbsthilfe, als Schädling und Problem für die anderen und als disziplinierungsbedürftig. In Rolonda fand sich zudem ein spezielles Aussonderungsverfahren, das in der Moderationsstrategie des inhaltlichthematisch definierten "Stehenlassens" der Fragerunden bei spektakulären Details besteht. Das hat den Effekt, ein grelles Schlaglicht auf das Individuum zu werfen, es in einem Detail bloßzulegen, ohne ihm im Anschluß weitere Relativierungen und Kommentare zu ermöglichen (da die Moderatorin schon zum nächsten Gast und nächsten Thema gewechselt hat). Dazu gehören die auf Lupeneffekte und Details ausgerichtete Frageführung der Moderatorin, die Hinführung der persönlichen Erzählungen auf MiniSzenen und affektiv aufgeladene Einzelmomente, die das Subjektive auf spektakuläre Ereignisse reduzieren und aus seinem lebensweltlichen Zusammenhang reißen. Spiegelvorhaltungstechniken als verdinglichende Disziplinierungsmaßnahme wurden ebenfalls identifiziert. In visuellen Repräsentationen soll das Subjekt sich spiegeln und wiedererkennen. Ein Verfahren in Rolonda ist es, den ZuschauerInnen das Alltagsleben der als Gäste eingeladenen Durchschnittsmenschen in Form eines pseudo dokumentarischen Filmclips zu präsentieren und sie im Anschluß daran mit dem (darin gezeigten) Fehlverhalten zu konfrontieren, sie zu veranlassen, es zu verurteilen und andere Stimmen zu diesen Spiegelungen Stellung nehmen zu lassen (in Form von Verurteilung, Tadel, Zurechtweisung). Ein weiteres Spiegelungverfahren (mit disziplinierender oder kathartischer Absicht) in Rolonda stellt die Strategie dar, das Fehlverhalten im Studio zu provozieren und live auf dem Podium in Szene zu setzen (z.B. der Streit zwischen Mutter und Tochter, der vorführt, daß die Mutter ihre Tochter nicht disziplinieren kann in Anger; Zornausbruch und Kommunikationszusammenbruch in der Auseinandersetzung von Jeremy und dem Mann im Publikum, wobie vorführt wird, daß Jeremy nicht in der Lage ist, seinen Frustrationen Ausdruck zu verleihen etc.). Dabei wird jedoch eher dem Publikum als den Gästen ein Spiegel vorgehalten, der vermutlich als Abschreckung dienen soll. Zum Objekt der Rede wird der FernsehPrivatmensch auch im Expertendiskurs, der seine Innenwelt analysiert oder ggf. korrigiert. Das Interaktionsarrangement in Rolonda ist dabei so, daß nicht GUE Dialogpartner dieser Analysen sind, sondern die Moderatorin. Das Subjekt wird so zum Gegenstand der Analyse eines Autoritätendiskurses, der aber mit anderen Autoritäten (nämlich mit der medienspezifischen Machtposition HOST) geführt wird. Durch Befragungstechniken und Frageformate wird die Innenschau auf das Subjekt möglich und seine diskursive Position gleichzeitig stark beschränkt und kontrolliert. Auf linguistischer Ebene korrespondiert dies mit Frageformaten in Deklarativformen, die inhaltlich aus vollständigen Propositionen bestehen, die nur noch bestätigt werden müssen. Dies schränkt den inhaltlichen wie den kommunikativen Spielraum der Befragten ein, weil es konversationell präferiert ist, eine Bestätigungshandlung im Anschluß zu produzieren, und weil es kommunikativ nur einer minimalen Antwort (ja/nein) bedarf, um die Replik zu vollziehen. Dadurch sind die Gäste, bereits schon in reaktiver Position durch den Interviewrahmen, abhängig von einer weiteren, expliziten Aufforderung, einen längeren oder einen inhaltlich konträren Redebeitrag zu liefern. Andererseits ist auf der interpersonellen Ebene eine Deklarativfrage der HOSTs prekärer als ein klassisches Frageformat mit Fragewort und Verbinversion. Denn HOST kann ihr (interaktionell definiertes) Gesicht verlieren, wenn sie eine unrichtige oder nur teilweise richtige Proposition formuliert. In dieser Hinsicht wurde die Präferenz für Deklarativfragen als Modus des informellen Sprechens definiert, weil eine gegenseitige Abhängigkeit entsteht, die in der Regel mit dem egalitär strukturierten ChatModus assoziiert wird. Es wurde festgestellt, daß HOST/Rolonda kaum, HOST/Winfrey jedoch häufig mit diesem Format operiert, sich also auch als gleichwertiger Interaktionspartner ihren Gästen gegenüber konstituiert. Normalisierung und Messen an Standards ist ein weiteres Merkmal der Machttechnologie durch Objektivierungspraktiken. Normalisierungsversuche verweisen das Subjekt auf seinen Platz, häufig im Zusammenhang mit Normgeboten, Aufforderungen zur Veränderung usw. Normalisierende Disziplinierungsdiskurse werden in Talkshows u.a. durch die Warnungen und Zurechtweisungen des Studiopublikums gegenüber den Gästen bzw. durch den kategorischen, einflußnehmenden Redestil der ExpertInnen realisiert. Das Subjekt wird immer wieder Gegenstand und Zielscheibe für disziplinierende Interventionen und Eingriffe. Ein Äquivalent zu den objektivierenden Teilungspraktiken, die durch klare Entweder/OderTrennungen Individuen bestimmten Klassen und Ordnungen zuteilen, findet sich in der emotionell aufgeheizten, und von HOST durch Unterlassen von Schlichtungshandlungen aktive unterstützten Frontenbildung bei Rolonda zwischen den Teilnehmerkategorien GUE und AUD (Saalpublikum). An der Grenze von objektivierenden zu subjektivierenden Praktiken liegen die Verfahren, die den SprecherInnen zwar Rede abverlangen, diese aber durch kommunikative Strategien und Dynamiken in den Beteiligunsstrukturen inhaltlich bereits vorgegeben ist. Hierzu gehören u.a. Selektion von und Präferenz für bestimmte Frageformate (in der grammatischen Form des Deklarativs) und Dynamiken des Zitierens der Rede der Gäste sowie das Suggerieren, Soufflieren und Vorsprechen dessen, was das zu erkennende Subjekt erwidern muß indem ihm die Wahrheit über sein Selbst bereits fertig in den Mund gelegt wird. Zu den subjektivierenden Praktiken in Talkshows, die die Teilnehmer zum freien Reden über sich selbst bringen und diskursproduktiv wirken, zählen besonders ChatMomente in den Shows. Passagen, in denen die Gäste auch längere Redebeiträge machen ohne vorstrukturierende Fragestellungen. Die Abwesenheit von Interviewtechniken bzw. sehr offen strukturierte Frageformate geben einen Hinweis auf solche Stellen im TalkshowDiskurs. Narrative Sequenzen, die nicht von Zwischenfragen unterbrochen werden verweisen in der Interaktion zwischen den Gästen (den Alltagssubjekten) und anderen TeilnehmerInnen auf subjektivierende Momente, genauso wie die Häufung bzw. Anwesenheit von Rückmelde und Hörersignalen der Moderatorinnen denn sie sind ein Signal zum Verlängern ihres Redebeitrags, das in keiner Hinsicht strukturierend oder einschränkend wirkt. Die Analysen der Subjektpositionen und Positionierungen geben so meines Erachtens den Blick frei für zwei unterschiedliche Möglichkeiten, Diskurse mit dem Durchschnittsmenschen über seine subjektive Verfaßtheit in der Öffentlichkeit zu führen (und ein Bild von ihm in der Öffentlichkeit zu zeichnen). Es stellt sich heraus, daß die beiden TalkshowReihen unterschiedliche Präferenzen und Gewichtungen der diskursiven Korrelate subjektkonstituierender Machttechnologien aufweisen. Objektivierende Praktiken fanden sich zahlreiche in der RolondaShowreihe, viele Verfahren ausschließlich dort (Spiegelungen, derogative Untertitel, auf Kommunikationsakte ausgerichtete Dressur etc.). Der Diskurs ist auch auf der sprachlichinteraktionellen Mikroebene stark von objektiverenden Praktiken des Aussonderns, Isolierens, dem spektakulären BlickFreigebens auf Details und des inhaltlichen Vorgebens bzw. Repetition der fremden Rede (Aufoktroyieren der fremden Perspektive) geprägt. Als Objekte der analytischen und interpretierenden Rede werden sie in ihrem Subjektstatus (z.B. als eigenständige Sprecher) reduziert und mit den Regeln und Normen eines Kollektivs konfrontiert. Durch diskursive Mikropraktiken werden auf verschiedenen Ebenen Machtgefälle konstruiert, die das Talkshowsubjekt unterordnen unter die Stimmen der Autorität und des Kollektivs, die fordernd und zurechtweisend auf den einzelnen einwirken und direkten Einfluß nehmen. Konfrontative Sequenzen führen auf interpersoneller Ebene zu einem hohen Gesichtsverlust für die Gäste, die gesichtsbedrohliche Sprechhandlungen in der Regel nicht parieren können, weil HOST ihnen keine Gelegenheit gibt und der Interaktion einen "zurechtstutzenden" Grundton gibt. Durch gesichtsbedrohende Akte wie Zurechtweisung und Ermahnung wird die Distanz zu den Gästen gering gehalten, was einem umgangssprachlichen "Zunahetreten" entspricht. Zudem zeichnet sich der Diskurs durch eine extrem dramatisierende Verlaufsform aus, die eine kommunikative Katastrophe (Zusammenbruch der Interaktionsordnung), einen Dressur bzw. Disziplinierungsakt durch eine Autorität (Expertin) und die Katharsis einschließen (Reue, von HOST evozierte, nach außen gekehrte Einsichtsbekundungen und Gutheißen der "Lektion"). Der dramatische Konflikt samt Eskalationen und Konfrontationen mit den kollektiven Forderungen wird dann erst mit Hilfe von anweisenden Autoritäten gelöst. Die Ermächtigung der Autoritäten geht einher mit Objektivierungen, der Degradierung zum Objekt von fremden Blicken, fremder Rede und fremden Regeln. Allerdings auch mit der Reduzierung der Position der Moderatorin, die sich gegenüber den Experten stark zurücknimmt. Die Übernahme von Wissen ("Lernen" und Erkenntnis gewinnen) wird artikuliert als Drill und Gefügigmachen (inklusive Dankbarkeit, vgl. HOSTFrage an GUE/Kathy: Are you happy now?), und baut nicht auf Einsicht. Vorhaltungen und negative Spiegelungen sollen zur Abschreckung und Besserung dienen. Das Subjekt muß zum Nutzen der Gemeinschaft erzogen werden und sich ihren Normen unterordnen. Der SubjektEffekt dieses Diskurses ist ein Autoritäten untergeordnetes Subjekt, das bei Fehlverhalten isoliert und "an den Pranger" gestellt wird, korrekturbedürftig ist und durch Drill (nicht Einsichtsfähigkeit) an die Forderungen einer größeren Gemeinschaft anzupassen ist. Das Verhältnis zu den Autoritäten und zur Gemeinschaft ist ein stark personalisiertes und das Individuum ist gleichzeitig extrem abhängig von diesen, aber auch durch die Detaillierung und die Fokussierung auf den Einzelfall stark überhöht. Diese Entwürfe vom Subjekt lassen sich mühelos in hierarchischautoritären Kontexten wiederfinden und könnten innerhalb eines traditionellen sozio politischen "RechtsMitteLinks"Schemas möglicherweise als Bestandteil eines recht(spopulistisch)en Diskurses betrachtet werden. Die Daten aus der WinfreyReihe zeichnen sich durch insgesamt weniger objektivierende Strategien aus und weisen an manchen Stellen Spuren von subjektivierenden Verfahren auf (die Gäste kommen ausführlicher und weniger als Ausgefragte zu Wort, haben bisweilen Möglichkeiten, sich als Partner in einem informellen Gespräch zu konstituieren etc.). Mehr noch als das Vorhandensein von subjektivierenden Techniken fällt das NichtVorhandensein vieler Objektivierungsstrategien auf. D.h., eine Vereinzelung und Ausrichtung auf das Subjekt im Besonderen ist nicht auffällig ausgeprägt (sie ist vorhanden und im Fernsehen auch medienstrukturell verankert). Viel eher findet ein verallgemeinernder Diskurs statt, der das Subjekt und seine Erfahrung als Ausgangspunkt für generalisierbare Erörterungen nimmt. In den Daten gab es kaum dissentive Sequenzen, wenn es zu spontanen Frontbildungen kam, wurden diese von HOST geschlichtet, die hier untersuchten Shows weisen keine dramatisch strukturierten Formen auf jedenfalls nicht im selben Maß wie die ihrer Kollegin. Natürlich kann man im Mikrobereich sicher ebenfalls Zuspitzungen finden. Aber im Gesamtablauf ist die Show zyklisch strukturiert. Hier erscheint eine zweite Option, wie durch die Praktiken einer "Show für den Privatmenschen in seiner Alltäglichkeit" dieser medial konstituiert wird. Der einzelne wird weder auffällig häufig zum Objekt, noch wirklich frei in seiner Rede, sondern vielmehr zum Ausgangspunkt für Verallgemeinerungen gemacht. Der im Vergleich relativ weitgehende Verzicht auf Aussonderung des konkreten Falls und die Bezugnahme auf den generellen Fall hat als diskursive Korrelate Möglichkeiten der Gleichheit zwischen den Diskursteilnehmern und die Relativierung der Stimme der Autorität (der Experten). Die Übernahme von Wissen und Erkenntnis wird durch die Abhandlung der Problembereiche als denkbare Fälle und Optionen fürs Handeln der Eigenverantwortlichkeit der Subjekte anheimgestellt (ohne evozierte Affirmation und Ausstellung von Akten der Einsicht). SubjektEffekte sind: der einzelne wird als wichtiger Träger von verallgemeinerbaren Erfahrungen konstituiert, allerdings auch als einer neben vielen anderen (vgl. auch die Funktion der AUD, die die Perspektiven der Aussagen erweiteren, keine Fronten zu GUE bilden), das Verhältnis zu den anderen Diskurspositionen, v.a. zu den Autoritäten ist distanzierter, gesichtsbedrohende Sprechhandlungen sind nicht direkt an GUE gerichtet usw. Das Subjekt wird als lernfähig durch rationale Einsicht konstituiert. Analog zur Einordung in ein gesellschaftspolitisches Spektrum, könnte behauptet werden, diese Subjektkonzeptionen reflektieren Normen eines neoliberalen Diskurses der bürgerlichen Mittelschicht über das Individuum, der sich über die Besetzung der Position "egalitär" bzw. "antiautoritär" und "eigenverantwortlich" in Opposition zu "hierarchisch", "autoritär" und fremddefiniert bzw. abhängig von übergeordneten Instanzen definiert. Insofern stehen die beiden Pole der Möglichkeiten der Subjektkonzeption (und medialen Konstitution des Durchschnittsmenschen als Subjekt) in direkter Abfolge hintereinander auf dem Programm USamerikanischer Fernseh Nachmittage. Eine Entscheidung darüber, ob der immense Erfolg von Winfreys neoliberalem Diskurs, der jeden für sich allein und individuell "verantwortlich" macht, oder die Absetzung der ReiheRolonda mit ihrem autoritären und explizit hierarchisch operierenden Diskursmodus Anlaß zur Hoffnung geben sollte, muß anderen medien und sozialkritischen Untersuchungen überlassen bleiben.
Für eine erhebliche Patientenanzahl gestaltet sich bei kurativ reseziertem Primärtumor eine hepatische Metastasierung zum limitierenden Faktor für die Überlebenszeit. Aufgrund des speziellen Metastasierungsverhaltens ist das hauptsächlich die Gruppe der kolorektalen Primärtumoren, die eine hohe Inzidenz an hepatischen Filiae aufweist. Bisher profitieren nur eine sehr geringe Anzahl der Betroffenen von der Möglichkeit der operativen Resektion solitärer Läsionen. Über 70% dieser Fälle erleiden jedoch wieder intrahepatische Tumorrezidive. Die systemische oder regionale Chemotherapie konnte bisher im Vergleich zu resezierten Patienten nur geringe Verbesserungen der Überlebenszeiten bei oftmals erheblichen Einschränkung der Lebensqualität erzielen. Vor diesem Hintergrund wurde die minimal invasive Laserinduzierte Thermotherapie (LITT) entwickelt, mit der es möglich ist, perkutan gezielt Tumoren in soliden parenchymatösen Organen zu zerstören. Dabei kann das umgebende Gewebe maximal geschont und der Eingriff in lokaler Anästhesie mit einem sehr kurzem Krankenhausaufenthalt und in Kürze auch ambulant durchgeführt werden. Voraussetzung für den optimalen Erfolg eines regionalen Verfahrens ist die genaue topographischen Darstellung der erzielten Koagulationsnekrose während und nach der Intervention. Die Magnetresonanztomographie hat sich bei dieser Aufgabe als nichtinvasives und genaues Instrument zur Dokumentation der intraoperativen Temperaturausbreitung durch temperatursensitive T1gew. Sequenzen und mittels optimierter Sequenzprotokolle zur Nachkontrolle der laserinduzierten Nekrosen erwiesen. Die vorliegenden Daten für eine Gruppe von 41 Patienten aus einer frühen klinischen Phase (Phase 2) behandelt mit konventionellen Applikatorsystemen und Leistungen bis zu maximal 5,6 Watt, dokumentieren eine gute lokale Tumorkontrollrate für 3 Monate und eine noch akzeptable Remissionsrate für die 6 MonatsKontrolle. Für die Gruppe der kolorektalen Karzinome konnten mittlere Überlebenszeiten von 29 Monaten dokumentiert werden. An Nebenwirkungen traten lediglich nicht therapiebedürftige Pleuraergüsse und subkapsuläre Hämatome auf, was den patientenschonenden, minimal invasiven Charakter des Verfahrens unterstreicht. Die nach der KaplanMeierMethode berechneten kumulativen Überlebensraten von etwa 28 Monaten im Vergleich zu unbehandelten Lebermetastasen sind unter der Berücksichtigung der überwiegend palliativen Ausgangssituation der Patienten als Erfolg zu betrachten. Hier können mit weiter optimierten Applikationssystemen in der 3. Phase der klinischen Entwicklung weit höhere lokale Kontrollraten dokumentiert werden, deren Auswirkung auf die Gesamtüberlebenszeit noch untersucht werden muß. Damit wurde mit der MRgesteuerten LITT ein neues minimal invasives Therapieverfahren zur Erlangung einer lokalen Tumorkontrolle entwickelt, das in palliativer, aber auch in einzelnen Fällen in kurativer Situation eine Therapieoption für Patienten mit Lebermetastasen vor allem kolorektaler Tumoren bietet. Die gute Verträglichkeit mit der Beschränkung auf Lokalanästhesie macht auch die Behandlung von Patienten vertretbar, die durch lange Chemotherapie stark in der Lebensqualität eingeschränkt sind.
In der vorliegenden Arbeit wird die Identifizierung von Genen der Carotinoid Biosynthese (crt) aus den Coryneformen Bakterien Brevibacterium linens und Brevibacterium flavum beschrieben. Hierbei konnten sechs neue crt Gene durch funktionelle Komplementierung bestimmt werden. Außerdem wurde erstmalig die Carotinoid Biosynthese von B. flavum, darunter auch drei neue Carotinoide, beschrieben. Voraussetzung für die Klonierung der crt Gene aus B. linens war die Entwicklung eines geeigneten Komplementierungssystems. Dieses System wurde in Carotinoidmutanten von B. flavum entwickelt. So konnte eine B. linens ExpressionsBibliothek nach Passage durch mehrere E. coliStämme, unter Umgehung des starken B. flavumRestriktionssystems, in B. flavumCarotinoidmutanten auf crt Genexpression hin untersucht werden. . Durch Komplementierung der Carotinoidmutanten von B. flavum konnte das Gen der Phytoen Synthase (crtB) aus B. linens funktionell kloniert werden. Mit diesem Gen als Sonde wurde aus einer B. linensCosmid Bibliothek das gesamte crt Gencluster isoliert. Auf dem sequenzierten DNAFragment von B. linens befanden sich 14 offene Leseraster mit Ähnlichkeiten zu Sequenzen aus Datenbanken. Durch Sequenzähnlichkeiten zu bekannten Genen konnte die Gene einer GGPP Synthase (crtE), einer Phytoen Synthase (crtB) und einer Phytoen Desaturase (crtI) bestimmt werden. Außerdem wurden erstmalig die Gene einer IPP Isomerase und einer DNAPhotolyase in einem crt Gencluster identifiziert. Durch heterologe Expression in B. flavum konnte das neue Gen einer bCarotin Desaturase (crtU) funktionell nachgewiesen werden. Dieses Gen kodiert für ein Enzym, das bCarotin in das aromatische Carotin Isorenieraten umsetzt. Ebenfalls durch heterologe Expression in B. flavum wurden zwei neue Gene (crtYc und crtYd) gefunden, deren Genprodukte gemeinsam die Zyklisierung von Lycopin zu bCarotin katalysieren. Die errechnete Molmasse dieser beiden Lycopin Zyklasen ist mit 12,5 und 13,9 kDa ungewöhnlich klein. Die zwei Lycopin Zyklasegene aus B. linens kodieren für eine neue Klasse von Lycopin Zyklasen. Es bestehen keine Sequenzähnlichkeiten dieser neuen Gene zu bisher bekannten Lycopin Zyklasegenen oder zu anderen Genen bekannter Funktion. Durch die partielle Deletion einer cDNA mit Lycopin Zyklase und Phytoen Synthaseaktivität (crtYB) aus dem Pilz Xanthophyllomyces dendrorhous konnte gezeigt werden, daß die Zentren der beiden Aktivitäten in unterschiedlichen Regionen des gebildeten Polypeptids sitzen. Die Phytoen Synthaseaktivität des Genproduktes geht auf einen Bereich des Polypeptids zurück, der Sequenzähnlichkeiten zu Phytoen Synthasen anderer Organismen aufweist. Das Zentrum der Lycopin Zyklaseaktivität liegt in dem Nterminalen Bereich des Polypeptids, der interessanterweise Sequenzähnlichkeiten zu den beiden Lycopin Zyklasen aus B. linens aufweist. Dieses Fusionsgen crtYB ist das erste bekannte Gen einer pilzlichen Lycopin Zyklase. Die Entwicklung der pilzlichen crtYB Fusionsgene aus crtB und Lycopin Zyklasegenen des in B. linens gefundenen Typs wird diskutiert. Die Hauptcarotinoide von B. flavum wurden als die C 50 Carotinoide Decaprenoxanthin, Decaprenoxanthin Monoglucosid und Decaprenoxanthin Diglucosid bestimmt. Bei der Analyse von B. flavumPigmentmutanten wurden außerdem die neuen Carotinoide Nonapren [2(3Methyl2butenyl)e, ycarotin], Flavuxanthin [2,2'Bis(4hydroxy3 methyl2butenyl)y, ycarotin] und Nonaflavuxanthin [2(4Hydroxy3methyl2 butenyl)y, ycarotin] als Intermediate identifiziert. Basierend auf den nachgewiesenen Carotinoiden konnte der vermutliche C 50 Carotinoid Biosyntheseweg für B. flavum vorgeschlagen werden. Durch Sequenzanalyse von B. flavumTransposonmutanten konnten erstmalig crt Gene der C 50 Carotinoid Biosynthese isoliert werden. Auf dem crt Gencluster von B. flavum konnten die Gene crtE, crtB und crtI aufgrund von Sequenzähnlichkeiten zu bekannten Genen bestimmt werden. Heterologe Expression in E. coli und Geninaktivierung durch homologe Rekombination in B. flavum zeigten, daß die Produkte von drei weiteren Genen ausreichen, um die C 50 Carotinoide von B. flavum zu bilden. Das Produkt eines neuen Lycopin Elongasegens (crtEb) verlängert Lycopin an Position C2 und C2' um jeweils eine C 5 Isopreneinheit und bildet ein azyklisches C 50 Carotinoid. Dieses wird von den Produkten der neuen C 50 Zyklasegene crtYe und crtYf zu einem zyklischen C 50 Carotinoid umgesetzt. Die Ergebnisse zeigen, daß entgegen früherer Vorstellungen, die Addition einer Isopreneinheit und die Zyklisierung bei der Bildung von zyklischen C 50 Carotinoiden zwei getrennte Schritte sind.