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Die vorliegende, in kumulativer Schreibweise verfasste Arbeit erläutert die Entwicklung, Charakterisierung und Optimierung zweier unterschiedlicher Leitstrukturen, die als Agonisten von Peroxisomen Proliferator-aktivierten Rezeptoren (PPAR) und gleichsam als duale Inhibitoren der mikrosomalen Prostaglandin E2 Synthase-1 (mPGES-1) und der 5-Lipoxygenase (5-LO) wirken. Chemisch betrachtet sind dies zum ersten die Gruppe der alpha-n-Hexyl-Pirinixinsäurederivate und zum zweiten die Gruppe der 2-(Phenylthio)-hexansäurederivate. Die Publikation zur Synthese und in vitro-pharmakologischen Charakterisierung der alpha-n-Hexyl-Pirinixinsäurederivate an PPAR (Zettl et al., QSAR & Combinatorial Science, 28:576–586, 2009) enthält einerseits die strukturelle Optimierung durch Variation der Aryl-Substitution des zentralen Pyrimidinringes der Leitstruktur und andererseits die durch Docking-Verfahren gestützte Untersuchung des Einflusses der Stereochemie auf die PPAR-Aktivierung. Letztlich konnte durch die Einführung von Biphenyl-Substituenten eine Verbesserung insbesondere der PPARalpha-Aktivität gegenüber der als strukturellen Referenz dienenden alpha-n-Hexyl-Pirinixinsäure (Rau et al., Archiv der Pharmazie, 341:191–195, 2008) erreicht werden. Mit Hilfe von präparativer enantioselektiver HPLC wurde eine ausgewählte Verbindung in ihre beiden Enantiomere getrennt. Deren in vitro-pharmakologische Charakterisierung ergab, dass das (R)-Enantiomer insbesondere bei PPARalpha als Eutomer fungiert. Dieses Ergebnis konnte mit Hilfe von Docking-Studien weiter untermauert werden. Hierbei wurde deutlich, dass die Besetzung der linken proximalen Bindetasche der PPARalpha-Liganden-Bindungs-Domäne durch den alpha-n-Hexyl-Rest lediglich im Fall einer (R)-Konfiguration optimal erfolgen kann. Die Synthese und die in vitro-pharmakologische Charakterisierung der Substanzklasse der 2-(Phenylthio)-hexansäurederivate an PPAR sind in Zettl et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 19: 4421-4426, 2009 zusammengefasst. Bei der Analyse der Struktur-Wirkungs-Beziehungen erwies sich die Leitstruktur als hochaktiv und sehr robust. Je nach Substitutionsmuster des lipophilen Molekülteils wurden potente selektive PPARalpha-Agonisten wie auch PPARalpha-präferenzielle duale PPARalpha/gamma-Agonisten dargestellt. Durch die Synthese von Kohlenstoff-Analoga und alpha-unsubstituierten Verbindungen wurde des Weiteren der Einfluss des Schwefelatoms und des n-Butylrestes in alpha-Position zur Carbonsäure auf die PPAR-Aktivität untersucht. Hierbei konnte gezeigt werden, dass beide Strukturelemente einen großen Beitrag zur hohen PPARalpha-Aktivität der Leitstruktur leisten. Wie auch bei den alpha-n-Hexyl-Pirinixinsäurederivaten wurde eine ausgewählte Verbindung in ihre Enantiomere getrennt und der Einfluss des Stereozentrums in alpha-Position zur Carbonsäure untersucht. Das Ergebnis bestätigte die Resultate der vorangegangenen Studie: Das (R)-Enantiomer wirkte als Eutomer, wobei der stereochemische Einfluss bei PPARalpha besonders deutlich war. Ausgewählte Synthesen und die in vitro-pharmakologische Charakterisierung von Pirinixinsäurederivaten an mPGES-1, 5-LO sowie der Cyclooxygenase (COX) sind in Koeberle und Zettl et al., Journal of Medicinal Chemistry, 51:8068–8076, 2009 publiziert. Die Arbeit beinhaltet eine umfassende Reihe an Pirinixinsäurederivaten mit Strukturvariationen in alpha-Position zur Carbonsäure und im Aryl-Substitutionsmuster des Pyrimidinringes. Hinsichtlich der alpha-Substitution zeigte sich, dass für Alkylreste eine Kettenlänge von mindestens 6 Kohlenstoffatomen für einen dualen Wirkmechanismus erforderlich ist. Als Leitstruktur für duale mPGES-1/5-LO-Inhibitoren ergab sich somit alpha-n-Hexyl-substituierte Pirinixinsäure, deren Aryl-Substitutionsmuster am zentralen Pyrimidin weiter optimiert wurde. Als vorteilhaft erwies sich die Substitution mit Biphenylresten, wodurch die Darstellung von niedrig mikromolar aktiven dualen mPGES-1/5-LO-Inhibitoren gelang. Bei der Analyse der Strukur-Wirkungs-Beziehungen von unterschiedlichen Biphenylresten zeigte sich eine hohe strukturelle Toleranz hinsichtlich der dualen inhibitorischen Aktivität an der mPGES-1 und der 5-LO. Somit stellen die alpha-n-Hexyl-Pirinixinsäurederivate die ersten publizierten dualen mPGES-1/5-LO-Inhibitoren dar.
Entwicklung einer In-vitro-Methode zur Detektion von residualer Toxizität in Tetanusimpfstoffen
(2004)
Die vorliegende Arbeit beschreibt die Entwicklung und Optimierung eines sensitiven, schnellen, immunologischen in-vitro-Nachweises für die Endoprotease Tetanustoxin. Der klassische ELlSA, bei dem an eine Festphase immobilisiertes Antigen detektiert wird, wurde hier um einen endoproteolytischen Schritt erweitert, in dem das gebundene Substrat des Tetanustoxins an der Festphase in das nachzuweisende Antigen gespalten wird. Somit wird die Enzymaktivität des Tetanustoxins indirekt bestimmt. Bei dem Substrat handelt es sich um rekombinantes Synaptobrevin-2 (rSyb2), das von Tetanustoxin spezifisch und selektiv an einer Peptidbindung hydrolysiert wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurden mit molekularbiologischen Methoden drei unterschiedliche rSyb2 Fragmente in Escherichia coli hergestellt, die einen unterschiedlichen Aufbau des TeNT-Endopeptidase-Assays ermöglichen. Zur Maximierung der Proteinausbeute wurde die Expression in drei verschiedenen E. co/i-Stämmen miteinander verglichen. Der Stamm mit der höchsten Expressionsleistung wurde in 500ml-Schüttelkulturen sowie im 101-Maßstab fermentiert. Es wurde ein Protokoll zur Aufreinigung des rekombinanten Synaptobrevin-2 erstellt und optimiert. Zur immunologischen Detektion des durch Tetanustoxin gespaltenen rSyb2s standen zwei in Eigenarbeit hergestellte Antikörper zur Verfügung. Im Gegensatz zu den kommerziell erhältlichen Antikörpern gegen Synaptobrevin-2, deren Epitope inmitten der rSyb2-Aminosäuresequenz liegen, detektieren die beiden selbst hergestellten Antikörper die Aminosäuresequenzen, die die N- bzw. die C-terminale Seite der Tetanus-Spaltstelle in Synaptobrevin-2 darstellen. Beide Antikörper vermögen zwischen ungespaltenem und gespaltenem rSyb2 zu differenzieren. Besonders der gegen das N-terminale Spaltfragment gerichtete Antikörper ist ein hochspezifisches Werkzeug, das nur die von Tetanustoxin generierte, terminale Aminosäuresequenz an der SpaltsteIle detektiert. Im ELISA wurde zunächst untersucht, in welcher Reihenfolge Spaltung und Immobilisierung an die Festphase durchgeführt werden sollten. Die Immobilisierung des rSyb2s mit anschließender Spaltung durch Tetanustoxin erwies sich als die sensitivere Methode und wurde deshalb weiter optimiert. Dazu gehörte die Wahl der Festphase, die Untersuchung unterschiedlicher Beschichtungsmethoden, der Vergleich verschiedener Umgebungsbedingungen in der enzymatischen Reaktion sowie die Titration der eingesetzten Antikörper und die Auswahl der geeignetsten Pufferzusammensetzungen und Inkubationszeiträume. Zur Optimierung der Beschichtung wurden die drei rSyb2-Fragmente an unterschiedliche Polystyrenoberflächen gebunden. Die gezielte Ausrichtung der Moleküle, mit der nach der Inkubation mit Tetanustoxin nur ein bestimmtes Spaltfragment an der Platte gebunden bleibt und mit dem entsprechenden Antikörper detektiert werden kann, bringt dabei keinen Vorteil gegenüber der ungerichteten Bindung. Insgesamt differiert die Bindung an die Festphase zwischen Plattentypen und rSyb2-Fragmenten und hat einen großen Einfluss auf die Aktivität des Tetanustoxins und auf die Bindung des jeweiligen Antikörpers. Diese binden in Abhängigkeit vom Plattentyp teils stark an ungespaltenes rSyb2; offensichtlich ist das Epitop des jeweils eingesetzten Antikörpers in diesen Fällen also auch vor der Spaltung schon exponiert. Insgesamt zeigen die Versuche, dass die ungerichtete Bindung des Fragments rSyb2(N;1-97) mit der Detektion des N-terminalen Spaltfragments die sensitivste Methode zur Detektion von Tetanustoxin ist. Durch die Optimierung der weiteren InkubationsschriUe konnte die Nachweisgrenze des ELISA auf 0,54ng/ml Tetanustoxin gesenkt werden. Sie liegt damit im Bereich von Literaturdaten für eine Meerschweinchen-LD5o und könnte bereits unter der Nachweisgrenze des Tierversuchs liegen. Der Mangel an Daten zur Toxizität des in der Testentwicklung verwendeten, hochaufgereinigten Toxins lässt keine genauere Einschätzung zu. Der Vergleich mit der Empfindlichkeit von Tieren ist aber relevant, weil der ELiSA die Detektion des Toxins im Tierversuch ersetzen soll und eine vergleichbare Sensitivität aufweisen muss. Eine bessere Einschätzung kann mit einem krudem Tetanustoxin vorgenommen werden, für das die Meerschweinchen-LD5o vom Hersteller bestimmt wurde. Mit diesem Toxin wurde eine Nachweisgrenze des ELISA von 0,049 Meerschweinchen-LD5o ermittelt. Der ELISA scheint somit eine vielversprechende Methode zur Detektion von Tetanustoxin zu sein und könnte sich deshalb zum Ersatz des Tierversuchs eignen.
Der Extrakt des indischen Weihrauchs (Boswellia serrata) ist eines der wenigen pflanzlichen Heilmittel, dem von der EMEA der Orphan Drug Status zur Behandlung des peritumoralen Hirnödems verliehen wurde. Boswellia serrata Extrakt und die Boswelliasäuren, die wirksamen Inhaltsstoffe des Weihrauchs, zeigten in zahlreichen in vitro-Untersuchungen antiinflammatorische und antitumorale Wirksamkeit. Diese Wirkungen konnten auch in mehreren klinischen Studien nachgewiesen werden. Untersuchungen zum pharmakokinetischen Verhalten der Boswelliasäuren zeigten, dass Weihrauch nur eine geringe orale Bioverfügbarkeit aufweist. Ziel der Arbeit war es daher, den Einfluss von Löslichkeit, Metabolismus und Permeabilität auf die Bioverfügbarkeit der Boswelliasäuren zu untersuchen. Weihrauchextrakte sind in wässrigen Medien schlecht löslich. In einer Rattenstudie wurde deshalb untersucht, inwieweit die verbesserte Löslichkeit des Extrakts in einer nanoskaligen Boswellia serrata Formulierung zu einer verbesserten Bioverfügbarkeit führt. Eine bestehende LC-MS-Methode zur Bestimmung von KBA und AKBA aus Plasma und Hirngewebe wurde optimiert und revalidiert. Zur Vervollständigung des pharmakokinetischen Profils wurden die KBA- und AKBA-Konzentrationen auch in der Leber der Ratten bestimmt. Die analytische Methode wurde hierfür nach den anerkannten FDA-Richtlinien erfolgreich validiert. Die Plasma- und Leberkonzentrationen waren jedoch bei den Ratten, die die nanoskalige Boswellia serrata Formulierung bekamen, in den ersten Stunden nach der oralen Verabreichung nicht signifikant höher als bei den Ratten, die den unbehandelten Extrakt erhielten. Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen zur metabolischen Stabilität von KBA und AKBA in Rattenlebermikrosomen (RLM), Humanlebermikrosomen (HLM) und Rattenhepatozyten (RH) zeigten, dass KBA einer stark ausgeprägten hepatischen Metabolisierung unterliegt. AKBA hingegen erscheint metabolisch relativ stabil. Die Identifizierung der Metabolite ergab, dass Boswelliasäuren in RLM hauptsächlich Phase-I-Metabolite wie mono-, di-, und seltener auch trihydroxylierte Metabolite bilden. Von AaBA und AbBA konnten keine Metabolite detektiert werden. Das metabolische Profil von KBA und AKBA in RH war mit dem in RLM vergleichbar. In einer Rattenstudie konnten dann im Plasma und in der Leber jedoch nicht im Hirn der Ratten KBA-Metabolite nachgewiesen werden, während für AKBA in vivo keine Metabolite detektiert wurden. Phase-II-Metabolite konnten weder von KBA noch von AKBA nachgewiesen werden. Bisher war man davon ausgegangen, dass die niedrigen Plasmakonzentrationen von AKBA in vivo durch eine Deacetylierung zu KBA zustande kommen. Diese These konnte im Rahmen dieser Arbeit widerlegt werden. Im Caco-2-Zellmodell zeigte KBA eine mittlere Permeabilität. Es konnte gezeigt werden, dass KBA und AKBA offensichtlich keinem Efflux-Transport unterliegen. AKBA erwies sich sowohl in absorptiver und sekretorischer Richtung als auch bei 4° C als schlecht permeabel. Da KBA und AKBA die Aktivität des ABC-Transportproteins Pgp modulieren, wurde in dieser Arbeit überprüft, ob diese beiden Boswelliasäuren auch Substrate des Pgp sind. Die Permeation von KBA und AKBA war in Anwesenheit des Pgp-Inhibitors Verapamil jedoch nicht signifikant verändert, was darauf hindeutet, dass KBA und AKBA keine Pgp-Substrate sind. Die Ergebnisse dieser Arbeit bilden einen wichtigen Baustein zur weiteren Aufklärung des pharmakokinetischen Verhaltens von KBA und AKBA. So ist die begrenzte systemische Verfügbarkeit von KBA auf eine mittlere Absorption aus dem Gastrointestinaltrakt in Kombination mit der umfangreichen hepatischen Metabolisierung zurückzuführen. Die niedrigen systemischen Konzentrationen von AKBA hingegen liegen eher in der schlechten Absorption begründet. Auf der Basis der extensiven Metabolisierung von KBA und der schlechten Permeabilität von AKBA stellt sich im Allgemeinen die Frage nach dem tatsächlichen Wirkmechanismus von KBA und AKBA. In keiner pharmakokinetischen Studie konnten die in vitro pharmakologisch aktiven Konzentrationen dieser beiden Boswelliasäuren erzielt werden. Es ist daher nicht auszuschließen, dass auch andere Wirkmechanismen als die bisher beschriebenen existieren. Unter dem Gesichtspunkt möglicher Arzneimittelinteraktionen wurde die Wirkung von KBA und AKBA auf MRP2 und OATP1B3 in zwei zellbasierten Assays untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass KBA und AKBA die Aktivität von MRP2 und OATP1B3 in Konzentrationen modulieren, welche im Rahmen dieser Arbeit in der Leber von Ratten nachgewiesen wurden. Da Weihrauchextrakt häufig in Comedikation verwendet wird, sollte im Hinblick auf die Arzneimittelsicherheit in Zukunft geprüft werden, ob es zu praxisrelevanten Arzneimittelinteraktionen mit klinisch relevanten MRP2- und OATP1B3-Substraten kommt.
Die Lyme-Borreliose, eine durch Zecken übertragene Multisystem-Erkrankung, wird durch die Spirochäte B. burgdorferi s. l. hervorgerufen. Die in vitro-Empfindlichkeit von Borrelien gegenüber einer ganzen Reihe von Substanzen ist bislang nicht oder nur unzureichend bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde daher die in vitro-Empfindlichkeit von B. burgdorferi gegenüber einer Reihe von neu entwickelten Antibiotika im Vergleich zu bekannten Substanzen unter standardisierten Bedingungen untersucht. Im 1. Teil der Arbeit wurde ein neues kolorimetrisches Mikrodilutionstestverfahren in Kombination mit konventioneller Subkultivierung in Flüssigmedium zur Bestimmung der in vitro-Empfindlichkeit von 17 repräsentativ ausgewählten Borrelienstämmen gegenüber dem neu entwickelten Ketolid Cethromycin eingesetzt. Das Verfahren ist standardisiert, gut reproduzierbar und erlaubt es, mehrere Antibiotika bzw. Isolate gleichzeitig effizient zu testen. Die MHK90 für Cethromycin lag für die getesteten Isolate einheitlich bei  0,002 µg/ml. Die MBK90 lag bei 0,75 µg/ml. Im 2. Teil der Arbeit wurden auf der Basis von konventionellen Zellzählungen mittels Dunkelfeldmikroskopie zusätzlich Untersuchungen zur Aktivität von Cethromycin, Sitafloxacin und Gemifloxacin im Vergleich zu Ciprofloxacin und den bekanntermaßen gut gegen Borrelien wirksamen Substanzen Doxycyclin und Ceftriaxon für je ein repräsentatives Isolat der humanpathogenen Genospezies B. burgdorferi s. s., B. garinii und B. afzelii durchgeführt. Von den untersuchten neuen Substanzen zeigten Cethromycin (MHK [Mittelwert]: ≤ 0,002 µg/ml; MBK [Mittelwert]: 0,3 µg/ml) und Gemifloxacin (MHK [Mittelwert]: 0,06 µg/ml; MBK [Mittelwert]: 8 µg/ml) im Vergleich zu den in der Therapie der Lyme-Borreliose bewährten Substanzen Ceftriaxon (MHK [Mittelwert]: 0,016 µg/ml; MBK [Mittelwert]: 1,2 µg/ml) und Doxycyclin (MHK [Mittelwert]: 0,25 µg/ml; MBK: von 24 bis >32 µg/ml) die vielversprechendste Aktivität gegen B. burgdorferi. Diese Ergebnisse konnten in Hinblick auf die Aktivität der getesteten Antibiotika gegenüber Borrelien durch die zusätzlich über 120 h durchgeführten Time-Kill-Experimenten abgesichert werden. Im 3. Teil der Arbeit wurden dann unter Zuhilfenahme eines theoretischen Modells mittels Einbeziehung weiterer pharmakologischer und pharmakokinetischer Daten für alle getesteten Substanzen sogenannte Bakterizidie-Indizes (BIs) auf der Basis der erzielten in vitro-Resultate berechnet. BIs von > 2,8 stehen dabei für eine gute bis sehr gute antimikrobielle Aktivität. Für Cethromycin zeigte sich bei den untersuchten Isolaten ein rascher Anstieg der BIs schon nach einer sehr kurzen Inkubationszeit von 48 h. Dabei lagen die Werte für Cethromycin (BIs 5,0-7,59) nach 120 h sogar über denen von Doxycyclin (BIs 2,81-3,15). Ebenso lagen die errechneten BIs für Gemifloxacin nach 120 h (BIs 3,33-8,05) höher als für Doxycyclin. Ceftriaxon war allerdings die bei weitem am besten wirksame Substanz und zeigte auch die höchsten BIs von 14,96 bis 18,48. Unter Berücksichtigung aller verfügbaren Daten ergab sich aus der vorliegenden Arbeit zusammenfassend folgende Rangordnung für die in vitro-Aktivität der getesteten antibiotischen Substanzen: Ceftriaxon > Cethromycin > Gemifloxacin > Doxycyclin > Sitafloxacin > Ciprofloxacin. Für neu entwickelte Antibiotika stellen in vitro-Untersuchungen einen ersten Schritt für eine Charakterisierung ihrer antimikrobiellen Wirksamkeit gegen Infektionserreger dar. Die Einbeziehung weiterer pharmakologischer Daten in die Interpretation solcher experimentell gewonnenen Ergebnisse ist innovativ, vermittelt zusätzliche Informationen und erlaubt eine vergleichende modellhafte Abschätzung der Aktivität solcher Substanzen unter Berücksichtigung wichtiger pharmakokinetischer und pharmakodynamischer Parameter. Zusammenfassend legen die in der vorliegenden Arbeit herausgearbeiteten Ergebnisse eine vielversprechende Aktivität von zwei neuen Substanzen (Cethromycin und Gemifloxacin) gegen B. burgdorferi nahe und lassen daher eine weitergehende klinische Prüfung dieser Antibiotika für eine mögliche therapeutische Anwendung bei Lyme-Borreliose sinnvoll erscheinen.
Pneumoperitoneum mit Kohlendioxid steht im Verdacht, die Proliferation intraabdomineller Tumorzellen zu beeinflussen. Vorangegangene Versuche haben bereits gezeigt, daß isobares Kohlendioxid die Proliferation von Kolonkarzinomzellen in vitro und in der Ratte stimulieren. In der vorliegenden Arbeit wurden Zellen des Colon-Karzinoms CX-2 und des Pancreas-Karzinoms DAN-G mit Kohlendioxid unter iso- und hyperbaren Bedingungen behandelt. Das Tumorwachstum wurde bis zum 15. Tag nach der Exposition durch DNA-Färbung mit Pico-Green gemessen. An den ersten vier Tagen nach Expositon ist das Tumorwachstum bei beiden Zellinien signifikant vermindert. Ab dem fünften Tag ist das Wachstum von DAN-G bei allen Drücken bis zum Ende des Untersuchungszeitraumes signifikant erhöht. Bei CX-2 hängen Ausmaß und Dauer der Proliferationssteigerung von der Höhe der jeweiligen Drücke ab. Schlußfolgerung: Kohlendioxid beeinflußt das Wachstum humaner Karzinomzellen. Das Ausmaß des Effektes hängt im Wesentlichen von der Höhe des Gasdruckes während der Exposition ab.
Im Hauptteil der Dissertation wird die Expression und Lokalisation organellärer und synaptischer Proteine in Astrocyten der transgenen PGFAPEGFP-Maus, die unter der Kontrolle des GFAP-Promotors EGFP exprimiert, analysiert. Zum einen wird ein grundlegender Vergleich der Expression synaptischer Proteine in kultivierten Astrocyten der Ratte und der PGFAPEGFP-Maus angestellt, zum anderen werden Kulturdauer- und Altersabhängigkeit der Expression untersucht. Des weiteren wird die Expression organellärer und synaptischer Proteine in Astrocyten der PGFAPEGFP-MauS in situ überprüft. Die immuncytologischen Untersuchungen zeigten zum einen die Expression und organelläre Lokalisation der synaptischen Proteine SNAP-25, SV2, VAMP2 und Synaptophysin in Astrocyten der transgenen PGFAPEGFP-Maus, zum anderen einen kulturdauerabhängigen Rückgang der Expression von SNAP-25, wie er für kultivierte Astrocyten aus Neopallia der Ratte beschrieben ist. Des weiteren wird festgestellt, dass die Expression organellärer und synaptischer Proteine in kultivierten Astrocyten der PGFAPEGFP-Maus keine Eigenschaft undifferenzierter Astrocyten oder Vorläuferzellen ist. Eine vergleichbare Expression solcher Proteine findet sich in astroglialen Primärkulturen, die aus den Gehirnen unterschiedlich alter Tiere gewonnen worden waren. In der vorliegenden Arbeit gelingt erstmals der Nachweis der Expression und organellären Lokalisation verschiedener organellärer und synaptischer Proteine (SNAP-23, SNAP-25, Synaptophysin, Cellubrevin, SCAMP, vATPase) in Astrocyten in situ. Dieser Befund birgt weitreichende Implikationen bezüglich der in der glialen Signalübertragung und bidirektionalen Kommunikation mit Neuronen verwendeten zellulären Mechanismen in sich. Aufgrund des proteinären Repertoires erscheint es möglich, dass Astrocyten in situ eine mit Neuronen vergleichbare molekulare Maschinerie zur regulierten exocytotischen Freisetzung besitzen. Ein weiterer Teil der Arbeit stellt die Expression und Calcium-abhängige Freisetzung des modulatorischen Neuropeptids Secretogranin II aus U373MG Astrocytoma-Zellen dar. Dieser Zelltyp wird als mögliches Modellsystem für kultivierte hippocampale Astrocyten vorgeschlagen.