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Elche stellen eine Problemart in der Zootierhaltung dar. Sie erreichen im Zoo entgegen dem Trend, dass Tiere in Menschenobhut älter werden als ihre frei lebenden Artgenossen, meist weniger als die Hälfte des biologisch möglichen Alters. Besonders schwierig gestaltet sich die adäquate Fütterung, da die Tiere sehr stark von der Gabe frischer Laubäsung abhängen und die Fütterung mit Ersatzfuttermitteln, wie z.B. Heu, langfristig nicht erfolgsversprechend ist. Zudem sind die Tiere sehr anfällig für Parasiten und eine von Schafen übertragene Viruserkrankung (Bösartiges Katarrhalfieber). Ihr hoher Platzbedarf und das Problem der innerartlichen Aggression machen die Haltung dieser größten Hirschart zusätzlich kompliziert. In dieser Arbeit wird die Methode der Angewandten Chronoethologie in der Zootierhaltung vorgestellt, die sich die von der Inneren Uhr gesteuerten Verhaltensrhythmen einer Tierart zur Beurteilung ihres Wohlbefindens und ihrer Haltungsbedingungen in der künstlichen Zooumwelt zu Nutze macht. Der Besitz einer Inneren Uhr stellt in der hochgradig rhythmisch organisierten Umwelt einen Selektionsvorteil im Sinne einer frühzeitigen Anpassung an wiederkehrende Umweltbedingungen dar. Die Innere Uhr ist so alt wie das Leben selbst, genetisch fixiert, über Zeitgeberreize mit ihrer Umwelt synchronisiert und regelt die Lebensvorgänge von Organismen auf allen organisatorischen Ebenen, auch auf der Ebene des Verhaltens. Ist der normale Verhaltensrhythmus einer Tierart bzw. eines Individuums bekannt, ist es möglich, aus Abweichungen von der Norm auf Störungen des Organismus - auf Unwohlsein - zu schließen. Anhand des Vergleiches von drei Elchhaltungen mit jeweils zwei Tieren, die unter verschiedenen Bedingungen gehalten wurden, konnten mit Hilfe zeitgeraffter Videoaufzeichnung und dem Einsatz eines Speichertelemetriesystems die folgenden Faktoren als einflussreich auf das Verhaltensmuster von Elchen in Menschenobhut identifiziert werden. Die nächtliche Aufstauung von Elchen ist aufgrund des Raum- und Reizmangels in den Boxen ein erheblicher Eingriff in das natürliche, gleichmäßig über Tag und Nacht verteilte Verhaltensmuster der Tiere. Außerdem sind sie in ihrem Verhalten hochgradig vom täglichen Ablauf des Pflegeralltags im Zoo beeinflusst. Feste Fütterungszeiten können einen starken Zeilgeberreiz darstellen- den die Elche in den beiden naturferneren Haltungen stärker zu antizipieren scheinen als den Zeitgeber „Licht". Größe und vor allem Strukturierung des Außengeheges haben einen Einfluss auf dessen zeitliche und räumliche Nutzung. Abschüssige Gehegeteile können die unerwünschte Verhaltensweise Grasen fördern. In unseren mitteleuropäischen Breiten leiden die Elche im Sommer unter Hitzestress, was sich in verringerter Aktivität widerspiegelt. Ein hohes Besucheraufkommen kann die Tiere ebenfalls in ihrem Verhalten beeinflussen. Es hat sich jedoch gezeigt, dass sich der Elch schnell an die Zoogegebenheiten und viele Besucher gewöhnt. Durch den Vergleich der verschiedenen Haltungsbedingungen konnten in der vorliegen Arbeit Vorschläge zur Verbesserung der Haltung von Elchen in Menschenobhut und zu ihrem zeitlichen Management gemacht werden. Der Elch hat sich aufgrund des für Wiederkäuer typischen, sehr geregelten Verhaltensrhythmus aus alternierenden Aktivitäts- und Ruhephasen, der auch unter den verschiedenen Haltungsbedingungen prinzipiell bestehen bleibt, als sehr gut geeignetes Modelltier für die Anwendbarkeit der Methode der Angewandten Chronoethologie in der Zootierhaltung herausgestellt. Abweichungen von der Norm können leicht erkannt werden. Änderungen im Verhaltensmuster m Form erhöhter lokomotorischer Aktivität lassen bei den untersuchten Tieren auf Unwohlsein (Krankheit, Abweichungen von der täglichen Routine, unterbundenes Brunftverhalten) schließen und können im Sinne eines chronoethologischen Paradigmas als eine indikative Verhaltensweise gewertet werden. Das Ziel einer vollständig automatisierten Verhaltenserfassung- und Auswertung mittels Bewegungsmeldern soll im restringierten Raum der Elchbox in einem weiteren Projekt verwirklicht werden, um damit Tierpflegern, Zooveterinären und Verantwortlichen ein gut handhabbares Mittel zur objektiven und langfristigen Beurteilung des Wohlbefindens ihrer Schützlinge zur Verfügung stellen zu können.
Um die Biodiversität Burkina Fasos darzustellen und auszuwerten, wurden umfangreiche Diversitätsdaten aus Sammlungsbelegen, Vegetationsaufnahmen und Literatur zusammengestellt. Die eigene Datenerhebung während dreier Feldaufenthalte hat mit > 300 Vegetationsaufnahmen (einschließlich der Biodiversitätsobservatorien) und > 1200 Herbarbelegen dazu beigetragen. Die Verwendung von relationalen Datenbanken (Microsoft Access) und GIS ermöglichte eine umfassende Analyse dieser enormen Datenmengen (> 100 000 Verbreitungspunkte) unter Einbeziehung von weiteren Art- oder ortsgebundenen Informationen. Datenbankstrukturen und Prozeduren wurden zu einem großen Teil selbst entwickelt. Unregelmäßigkeiten in den Primärdaten konnten durch Artverbreitungsmodelle ausgeglichen werden, die rasterbasierte Umweltdaten verwenden, insbesondere Satellitenbilder, Klima- und Höhendaten. Für die zusammenfassenden Analysen (Artenreichtum nach Familie, Lebensform, Photosynthesetyp; turnover) mussten wiederum eigene Prozeduren entwickelt werden. Räumliche Muster der Biodiversität wurden im landesweiten Rahmen, wie auch lokal für die Regionen Oudalan und Gourma, dargestellt. Die Zusammenfassung der Flora nach taxonomischen und ökologischen Gruppen gewährt dabei Einblicke in ökologische Zusammenhänge und die Eignung einzelner Gruppen als Indikatoren. Deutlich zeigen sich die Veränderungen des Lebensformspektrums und des Artenreichtums sowohl auf Landesebene im Zusammenhang mit dem Makroklima als auch in einer detaillierten Analyse des Oudalan – wo der Einfluss von Boden und Relief deutlich wird. Die großräumigen Muster der Artenvielfalt sind hauptsächlich durch klimatische Faktoren geprägt, auch der menschliche Einfluss ist in Form verschiedener Nutzungsformen vom Klima abhängig und schwer davon zu trennen. Umso deutlicher werden die Folgen intensiver Landnutzung aber in den Detailstudien der nordsudanischen Biodiversitätsobservatorien und des sahelischen Wiederbegrünungsprojektes. Über die in diesem Rahmen dargestellten Ergebnisse hinaus ergeben sich insbesondere aus der umfassenden Datenbasis und der interdisziplinären Zusammenarbeit mit Fernerkundung und Ethnobotanik weitere vielversprechende Möglichkeiten. Unter anderem wird auf der Grundlage der Datenbanken und ergänzender Literaturrecherchen eine aktualisierte Checklist der Gefäßpflanzen Burkina Fasos erstellt und eine Revision der phytogeographischen Zonen für Burkina Faso ist geplant.
Da viele Primärtumoren in die Leber metastasieren ist bei 30-50 % der Patienten, die an malignen Neoplasien leiden, mit Lebermetastasen zu rechnen. Die Leber ist dabei nach den Lymphknoten der Hauptsitz von Metastasen. Als einzige kurative Therapie ist bisher die chirurgische Resektion anzusehen, wobei weniger als 25 % der Lebermetastasen potentiell kurativ resezierbar sind. Falls der Tumor inoperabel ist werden viele Patienten einer systemischen Chemotherapie zugeführt. Alternativ kommen verschiedene minmal invasive Therapieformen zur lokalen Tumorablation zum Einsatz. Die LITT von Lebertumoren stellt als minimal invasive Therapie eine Alternative zur chirurgischen Resektion oder der systemischen Chemotherapie dar. Dabei führen koagulative Effekte zur Tumordestruktion in soliden Organen wie der Leber. Optische Fasern in einem wassergekühlten Applikatorset werden in die Läsion eingebracht. Das energiereiche Licht eines Nd:YAG-Lasers wird dann von dem Gewebe um den Applikator absorbiert und führt so zur Thermokoagulation des Tumors. Durch thermosensitive Gradientenecho-Sequenzen im MRT ist ein Online-Monitoring der Thermokoagulation möglich. Mittels TACE läßt sich das Volumen von Lebertumoren reduzieren, so daß auch Patienten mit primär zu großen Tumordurchmessern therapierbar werden. Durch die Embolisation der arteriellen Gefäße wird der Blutfluß eingeschränkt, was bei anschließender LITT zu einer größeren Hitzeeinlagerung und ausgedehnteren Nekrosebildung führt. In der vorliegenden Arbeit sollte gezeigt werden, daß die intensive Nekrosebildung bei vorembolisierten Patienten nicht durch mehr applizierte Energie während LITT, sondern durch eingeschränkte Durchblutung als TACE Effekt zustande kommt. Dazu wurden im Zeitraum zwischen Februar 2000 und Februar 2001 214 Patienten mit LITT behandelt. 64 Patienten wurden erst einer TACE unterzogen und anschließend mit LITT behandelt. Die applizierte Energie während der LITT Sitzung wurde jeweils aus der Laserleistung und der Einschaltdauer bestimmt. Mit T1- und T2- gewichteten Spin-Echo und Gradienten-Echo MR-Sequenzen in drei Ebenen wurde das Volumen der induzierten Nekrose gemessen. Es wurden Gruppen nach korrespondierendem Nekrosevolumen gebildet, jeweils getrennt nach Patienten die mit TACE und LITT therapiert wurden und denjenigen die nur mit LITT behandelt wurden. Die Nekroserückbildung im Verlauf wurde dann in dreimonatigen Abständen paarweise verglichen. Außerdem wurde die applizierte Energie in Beziehung gesetzt zum Nekrosevolumen. Auch hier wurde nach den Subgruppen getrennt ausgewertet, um Unterschiede in der Hitzeeinlagerung und Ausdehnung des nekrotischen Areals ausmachen zu können. Die Ergebnisse dieser Studie zeigten bei gleicher applizierter Energie ein größeres Nekrosevolumen bei den vorembolisierten Patienten als bei der nicht embolisierten Gruppe. Im Mittel stieg das Nekrosevolumen in den einzelnen Größengruppen von 41,36 cm3 bis 343,29 cm3, bei den nicht embolisierten Patienten jedoch nur von 33,73 cm3 bis 117,96 cm3. Der Anteil um den sich das Nekrosevolumen von einer Verlaufskontrolle zur nächsten verringert war in beiden Therapiegruppen vergleichbar. Die Nekroserückbildung im Verlauf wurde durch neoadjuvante TACE demnach nicht beeinflußt. Die Analyse der Überlebenszeit erbrachte statistisch signifikante Unterschiede bezüglich der Aufschlüsselung nach der angewandten Therapie. Der p-Wert betrug im Log-Rank-Test 0,0151. Für die Patienten aus der Gruppe der LITT-Monotherapie ergab sich ein mittlerer Überlebensvorteil von 6 Monaten (Median 26) gegenüber der Gruppe mit der TACE&LITT-Kombitherapie (Median 20). Für kleine Läsionen die primär LITT-fähig sind und nicht neoadjuvant mit TACE behandelt werden müssen zeichnete sich ein besseres Outcome ab. Am Ende des Beobachtungszeitraums von 54 Monaten waren noch 38,32 % (n=82) Patienten aus der LITT-Monogruppe und 29,69 % (n=19) aus der TACE und LITT-Kombigruppe am Leben. Als Schlußfolgerung liegt nahe daß der verminderte Blutfluß in embolisierten Lebern tatsächlich zu stärkerer Hitzeeinlagerung und größerer Nekrosebildung führt. Durch TACE vor LITT lassen sich größere Nekrosen erzielen bei gleicher applizierter Energie als durch LITT alleine. Außerdem gibt es keine negativen Auswirkungen auf die Nekroserückbildung. Eine generelle Kombination aus neoadjuvanter TACE und LITT scheint aus Kostengründen und erhöhtem apparativen Aufwand sowie einer möglicherweise höheren Komplikationsrate nicht empfehlenswert. Dennoch bietet das kombinierte Therapieprotokoll denjenigen Patienten mit Läsionen über 5 cm Durchmesser eine palliative und potentiell kurative Therapieoption.
Im Rahmen dieser Dissertation sollte der Effekt der Zelldichte auf Proliferation und Apoptose bei der RKO-Rektumkarzinomzelllinie untersucht werden. Neben Invasion, Entdifferenzierung und Metastasierung kann bei Krebserkrankungen auch eine hohe Wachstumsgeschwindigkeit zu den Charakteristika der Malignität gezählt werden. Bei Leukämien, Lymphomen und bestimmten soliden Tumoren, bei denen eine chirurgische Resektion nur eingeschränkt möglich ist, bedeutet jedoch ein langsames Wachstum, d.h. eine geringe Proliferation der Tumorzellen, in der Regel keine verbesserte Prognose, da sie mit schlechterem Ansprechen auf Chemotherapie und Bestrahlung einhergeht. Die molekularen Ursachen dieser Behandlungsresistenz sind bisher nicht vollständig geklärt und wahrscheinlich nicht bei allen Krebserkrankungen auf identischen Mechanismen beruhend. Vorstellbar ist, dass sich das Gesamtsystem der Zelle während des Teilungsprozesses sensibler gegenüber Schädigungen der DNA, wie sie durch Bestrahlung und die meisten Chemotherapeutika ausgelöst werden, präsentiert. Dies kann durch unterschiedlichste molekulare Mechanismen verursacht sein. Um den möglichen Einfluss des Proliferationsverhaltens einer Zellpopulation auf das Apoptose-Verhalten zu untersuchen, wurde im Rahmen dieser Arbeit versucht, die Proliferationsgeschwindigkeit einer Zellkultur mittels Dichte-Arretierung zu senken. Hierzu wurden RKO-Zellen in konfluenter und subkonfluenter Dichte kultiviert. Ebenfalls wurden Unterschiede bei der Verteilung der Zellen auf die verschiedenen Zellzyklusphasen ermittelt. Durch Inkubation mit CD95L konnte dann ein Zusammenhang von Proliferation und Apoptosesensitivität ermittelt werden, d.h. die „Zellzyklusabhängigkeit“ der CD95L-induzierte Apoptose untersucht werden. Hierbei zeigten sich Zellen mit geringerer Proliferationsrate resistenter gegenüber CD95L. Verschiedene Methoden (z.B. Western-Blot-Analyse, FACS-Messungen) wurden zur Aufklärung der molekularen Ursachen genutzt. Die Arbeit zeigte auch das Vorhandensein eines molekular nicht identifizierten, autokrin in das Medium sezernierten Faktors, der zu verstärkter Resistenz gegenüber CD95L führte. Dieser Faktor erhöhte auch die Migration und Invasivität der RKO-Zellen und verstärkte damit die malignen Eigenschaften der Tumorzellen. Die zukünftige molekulare Identifikation dieses Faktors könnte therapeutisch bedeutsam sein.
The development of resistance to multiple drugs is a major problem in treatment of number of infectious diseases and cancer. The phenomenon of multidrug resistance (MDR) is based on the synergetic interplay of a number of mechanisms such as target inactivation, target alteration, prevention of drug influx as well as active extrusion of drugs from the cell. The latter is mediated by over-expression of multidrug efflux pumps. The first discovered and the best characterized until now the human MDR transporter is P-glycoprotein. It is a member of the ATP binding cassette (ABC) superfamily and acts as an active transporter for a variety of anticancer agents using the energy released by ATP hydrolysis. The closest structure and functional homologue of P-glycoprotein found in bacteria is LmrA from Lactococcus lactis. The major goals of this work are to establish the selective isotope labelling of LmrA in Lactococcus lactis, to optimize LmrA sample preparation for solid-state NMR, and finally to perform first solidstate NMR investigations on LmrA shedding light on its catalytic cycle and substrate binding. For a long time the solid-state NMR applications to biological science has been limited to investigation of small molecules mostly. Recently, the solid-state NMR methods have shown potential for structuraland non-perturbing, site directed functional studies of large membrane proteins as well as ligands bound to them. However, to our knowledge neither selective isotope amino acid labelling of any ABC transporter, nor NMR investigations on full-length ABC transporter have been reported to date. Solidstate NMR experiments on a membrane protein require reconstitution of purified proteins into a membrane environment at a high density and either isotopic enrichment of the protein or bound drugs or inhibitors. Therefore, the large quantities of LmrA reconstituted at a high density in lipid membranes, sufficient for advanced NMR studies have been produced and its functional state in reconstituted form has been assessed. In the next step, a procedure for cost effective selective amino acids isotope labelling of LmrA in Lactococcus lactis has been established. Using this protocol deuterium alanine labelled LmrA reconstituted into E. coli liposomes has been prepared. Deuterium NMR has been used extensively to assess the proteins dynamics in past. However, it has never been applied to ABC transporter. Here, we report 2H NMR on selective alanine isotope labelled LmrA which has been used to shed light on the dynamics changes in the protein occurred under AMP-PNP, non-hydrolysable ATP analogue, binding and in ATP/ADP-Vanadate trapped state. It has been found that the major conformation changes affecting the protein motional characteristics occur in the ATP binding domains but not in the transmembrane domains. Additionally, the binding of several substrates to LmrA has been studied by fluorescence spectroscopy as well as by 19F and 31P solid-state NMR. The binding constants for several LmrA substrates have been obtained by fitting the concentration dependant tryptophan intrinsic fluorescence quenching curves. Based on the fluorescence studies and solid-state NMR data, the conformation changes in LmrA under substrate binding have been discussed. In addition, the preferable location of nine LmrA and P-glycoprotein substrates within the model membrane has been studied via 1H-MAS-NOESY-NMR. The results have been interpreted with respect to LmrA and P-glycoprotein binding site accessibility from the membrane interface region.
Pharmazeutische Proteomics
(2006)
Die vorliegende Arbeit setzt sich mit der Implementierung, Validierung und Anwendung der 2-dimensionalen Gelelektrophorese und der MALDI-TOF Massenspektrometrie unter pharmazeutischen Gesichtspunkten auseinander. Es wurde ein breites Spektrum aus dem Bereich der Pharmazeutischen Proteomics bearbeitet, beginnend mit einer detaillierten Methodenentwicklung für 2-DE, um die Methode zu optimieren, ihre Robustheit zu evaluieren und die Grenzen der Methode kennen zu lernen. Daran schließt sich eine Validierung für 2-DE / Silberfärbung an. Der Validierungsansatz orientiert sich an den üblicherweise in der pharmazeutischen Industrie bei der Validierung analytischer Methoden untersuchten Parametern. Hierzu zählen Präzision, Linearität, Richtigkeit und Spezifität. Ferner wurden Untersuchungen angestellt, inwiefern Daten aus unterschiedlichen Labors zusammengefasst werden können. Zur Dokumentation wurde ein auf MS Access® basierendes Laborinformationssystem erstellt. Hiermit können die von verschiedenen Mitarbeitern erzeugten Daten einheitlich und nachvollziehbar erfasst werden. Nach der Etablierung der methodischen Grundlagen wurden unterschiedliche, pharmazeutisch relevante Fragestellungen mittels 2-DE und MALDI-TOF-MS bearbeitet. Proben unterschiedlicher Komplexität wurden untersucht, die Milch eines transgenen Kaninchens, welches bovines FSH exprimiert, wurde analysiert. Über diese Versuche wurde der Einstieg in die Analytik rekombinanter Arzneistoffe geschaffen. Die 2-DE eignet sich sehr gut um die bei posttranslational modifizierten rekombinanten Proteinen auftretende Mikroheterogenität abzubilden. 2-DE und MALD-TOF MS sind alternative Methoden zu denen, die im europäischen Arzneibuch für die Analytik rekombinanter Arzneistoffe beschriebenen werden. Erythropoietin, einer der weltweit umsatzstärksten rekombinanten Arzneistoffe, zu dem auch eine Monographie im EuAB existiert, wurde näher untersucht. Bei diesem Protein wurden die Zuckerseitenketten selektiv abgespalten und es wurde untersucht, welche Auswirkung die Zucker auf das eletrophoretische Verhalten des Erythropoietins haben. Eine MALDI-TOF-MS Analytik von Erythropoietin war auch erst nach Abspaltung der Zuckerseitenketten möglich. Die Sequenzabdeckung konnte durch Verdau mit unterschiedlichen Enzymen gesteigert werden. Eine Technologie zur Sequenzierung von Proteinen mittels MALDI-TOF-MS wurde mit CAFTM für rekombinantes Chicken Annexin V etabliert. Weitere rekombinante Proteine, die im Rahmen dieser Arbeit untersucht wurden, sind Interferon-alfa-2a, Interferon-alf-2b, rh-HCG, Trastuzumab und Rituximab. Das anti-apoptotischen Bcl-xL ist ein Zielprotein für den Einsatz von Antisense Oligonucleotiden in der Tumortherapie. Für dieses Protein wurde eine 2-DE / Western blot-Methode entwickelt, die als in vitro Testsystem für das Screening von Oligonucleotiden genutzt werden kann. Aus dem Bereich der klinischen Proteomics wurden Serum, CSF und Urinproben von Patienten mit Bence Jones Proteinämie untersucht und mit den üblicherweise in der Klinik verwendeten CE-Analysen verglichen. In einzelnen Fällen konnten in vermeintlich Bence Jones negativen Proben mittels 2-DE doch noch Bence Jones Proteine nachgewiesen werden. Zusammenfassend kann man sagen, dass 2-DE und MALDI-TOF-MS vielseitig in der Pharmazie angewendet werden können. Die Komplexität eines jeden Proteoms und die physikochemische Heterogenität von Proteinen muss beachtet werden. In komplexen Proteinmischungen sind aufgrund sehr unterschiedlicher Konzentrationen, Löslichkeiten und der Heterogenität durch posttranslationale Modifikationen viele Proteine einem globalen 2-DE Ansatz nicht zugänglich, nichtsdestotrotz ist die 2-DE derzeit eine der leistungsfähigsten Methoden in der Proteomanalytik.
Anfänglich wurde darauf hingewiesen, dass das Ziel, das sich die Ethnologie als Zweig der Anthropologie gesetzt hat, war, die Klischees und Stereotypen über den Menschen der europäischen Peripherie wissenschaftlich zu überwinden. Wie Frobenius diese Klischees und Stereotypen überwunden hat, ist in seiner Erarbeitung der Kategorien zur Analyse und zur Rekonstruktion der afrikanischen Kultur und in der politischen Implikation seiner Kulturtheorie zu sehen, welche die Afrikaner und die Deutschen zu Mitgliedern derselben geistigen Familie machte. Um dies zeigen zu können, sind mithilfe der diskursanalytischen Methode die unterschiedlichen Zentren der Produktion von Diskursen untersucht worden. Daraus ist hervorgegangen, dass Frobenius´ Kunst- und Literaturdiskurs sowie seine Kulturtheorie von den institutionellen Diskursen aus den wissenschaftlichen, wirtschaftlichen, akademischen und politischen Institutionen und von den philosophischen und geisteswissenschaftlichen Diskursen des deutschen Idealismus beeinflusst sind. Die „Geburt“ der Ethnologie, die mit seiner eigenen Geburt kongruierte, konnte nicht anders geschehen. Als neue Disziplin brauchte die Ethnologie das Wissen anderer Disziplinen und Gedankenströmungen, die Unterstützung von akademischen, wirtschaftlichen und politischen Institutionen, um sich als Wissenschaft zu definieren und die Beschäftigung mit außereuropäischen fremdkulturellen Realitäten zu legitimieren...
Im Rahmen dieser Arbeit wurden mehrere Zielrichtungen verfolgt: 1. Vergleichende Testung von Kavainhaltsstoffen, Kava-Fertigarzneimitteln und chemischen Anxiolytika auf Hepatotoxizität Mit Hilfe der Hepatocarcinom-Zelllinie Hep-G2 wurden alle noch verfügbaren Kava-Fertigarzneimittel einem Cytotoxizitätstest unterzogen, durch die Herkunft der Zelllinie aus der Leber handelt es sich um eine spezifische Cytotoxizität – um Hepatotoxizität. Ebenso wurden isolierte, reine Inhaltsstoffe von Piper methysticum, Strukturverwandte und chemische Anxiolytika diesen Hepatotoxizitätstests unterzogen. Da alle Tests unter den gleichen Bedingungen durchgeführt wurden und bei jedem Test auf den microtiter-plates Kontrollen mitgeführt wurden, erlauben die Ergebnisse eine vergleichende Aussage zur Cytotoxizität. Besonders die Kava-Fertigarzneimittel, weniger die reinen Kava-Inhaltsstoffe (Kava-Lactone) fallen durch eine gewisse Cytotoxizität bei Hep-G2 auf. Die mit getesteten, handelsüblichen, chemischen Anxiolytika waren deutlich weniger cytotoxisch im Hep-G2-Assay. 2. Aufklärung der möglichen Ursache für die Fälle von Hepatotoxizität in Zusammenhang mit Kava Parallel zu den Hep-G2-Tests wurde eine Arbeit über die starke Hepatotoxizität des Kava-Alkaloids Pipermethystin publiziert. Nach Extraktion und Synthese von Pipermethystin wurden noch zwei weitere Kava-Alkaloide synthetisiert und Strukturverwandte mit in die Tests aufgenommen. Die starke Hepatotoxizität des Pipermethystins konnte bestätigt werden. Durch weitere Versuche mit Abbauprodukten und Strukturverwandten des Pipermethystins konnte ein Dihydropyridon-Heterocyclus als toxisches Prinzip des Pipermethystins bestimmt werden. 3. Vergleichende Untersuchung der Ergebnisse mit Primärzellen, humanen Hepatocyten Durch Kooperation mit der Universität Mainz war es möglich, die in den Hep-G2-Tests aufgefallenen Substanzen an humanen Hepatocyten zu testen. Teilweise gab es bei diesen Untersuchungen Parallelen, teilweise variierten die Ergebnisse erheblich. Der Grund liegt in den unterschiedlichen enzymatischen Ausstattungen der Hep-G2-Zellen bzw. der humanen Hepatocyten und den daraus resultierenden unterschiedlichen metabolischen Fähigkeiten.
Studies and measurements of linear coupling and nonlinearities in hadron circular accelerators
(2006)
In this thesis a beam-based method has been developed to measure the strength and the polarity of corrector magnets (skew quadrupoles and sextupoles) in circular accelerators. The algorithm is based on the harmonic analysis (via FFT) of beam position monitor (BPM) data taken turn by turn from an accelerator in operation. It has been shown that, from the differences of the spectral line amplitudes between two consecutive BPMs, both the strength and the polarity of non-linear elements placed in between can be measured. The method has been successfully tested using existing BPM data from the SPS of CERN, since presently the SIS-18 is not equipped with the necessary hardware. The magnet strength of seven SPS extraction sextupoles was measured with a precision of about 10%. The polarities have been unambiguously measured. This method can be used to detect polarity errors and wrong power supply connections during machine commissioning, as well as for a continuous monitoring of the "nonlinearity budget" in superconducting machines. A second beam-based method has been studied for a fast measurement and correction of betatron coupling driven by skew quadrupole field errors and tilted focusing quadrupoles. Traditional methods usually require a time-consuming scan of the corrector magnets in order to minimize the coupling stop band |C|. In this thesis it has been shown how the same correction can be performed in a single machine cycle from the harmonic analysis of multi-BPM data. The method has been successfully applied to RHIC. It has been shown that the stop band |C| (also known in the American literature as Delta-Qmin) measured in a single machine cycle with the new algorithm is compatible with the value obtained by traditional methods. The measurement of the resonance phase Theta defines automatically the best corrector setting, which was found in agreement with the one obtained with a traditional scan. A third theoretical achievement is a new description of the betatron motion close to the difference resonance in presence of linear coupling. Compared to the matrix formalism the motion is parametrized as a function of the resonance driving term f1001 only (which is proven to be an observable), whereas making use of the matrix approach four parameters need to be measured. Formulae describing the exchange of RMS emittances when approaching the resonances have been already derived in the 70s in the smooth approximation. New formulae have been derived here making use of Lie algebra providing a better description of the emittance behavior. The emittance exchange curves are predicted by new formulae with excellent agreement with multi-particle simulations and the counter-intuitive emittance variation along the ring of the emittance is proven to be related to the variation of f1001. A new way to decouple the equations of motion and explicit expressions for the individual single particle invariants have been found. For the first time emittance exchange studies have been carried out in the SIS-18 of GSI. Transverse RMS emittances have been measured during 2005 from rest gas monitor (RGM) data. Crossing the linear coupling resonance, the transverse emittances exchange completely. It has been observed that this effect is reversible. Applications of this manipulation are: emittance equilibration under consideration for future operations of the SIS-18 as booster for the SIS-100; emittance transfer during multi-turn injection to improve the eficiency and to protect the injection septum in high intensity operations, by shifting part of the horizontal emittance into the vertical plane. The emittance exchange curves obtained experimentally have been compared with analytic formulae providing a fast measurement (in few machine cycles only) of the linear coupling stop band |C|. Technical problems prevented the use of the eight skew quadrupoles installed in the SIS-18 to compensate the linear coupling resonance. It has been observed that the emittance exchange curve is highly sensitive to the beam intensity. Multi-particle simulations with 2D PIC space-charge solver have been run to infer heuristic scaling laws able to quantify the observable stop band, to be used for the resonance compensation. The analysis of BPM and RGM data has been performed making use of new software applications developed for this purpose. The bpm2rdt code for the harmonic analysis of BPM data has been written and tested with real data. The software reads the BPM turn-by-turn data and the Twiss parameters. Then it performs the FFT of these data, finds the peaks of the Fourier spectra and infers the RDT fjklm, the strengths ^hjklm and the local terms lambda-jklm. All these observables are printed out together with the corresponding values of the model, computed from the nominal values of strengths and the Twiss parameters. From the FFT of dual-plane BPM data the linear optics (beta functions and phase advances Delta phi) at the corresponding location is also inferred. From the measurement of f1000, the linear coupling coeffcient C (amplitude and phase) is also computed. The code has been tested by using existing SPS data and new RHIC data. For the on-line analysis of RGM data the rgm2emitt code has been written. The application reads in input the raw data files from the RGM and the beam loss monitor (BLM) respectively, the latter created by the RGM on-line software itself. From the RGM data the transverse beam sizes and emittances are inferred and used together with the BLM data to compute the tune shift during the machine cycle.
Alzheimer’s Disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder marked by progressive loss of memory and cognitive ability. The pathology of AD is characterised by the presence of amyloid plaques, intracellular neurofibrillary tangles and pronounced cell death. The aim of this thesis was to investigate pathways involved in the Aß cascade of neurodegeneration. Since novel findings indicate that already this Aß species exerts neurotoxic effects long before hyperphosphorylated tau, neurofibrillary tangles and extracellular Aß plaques appear, the investigations were accomplished with specific regard to the effects of intracellular Aß. The Swedish double mutation in the APP gene results in six- to eightfold increased Aß production of both Aß1-40 and Aß1-42 compared to human wildtype APP cells (APPwt). Data obtained from PC12 cells indicate that it is possible to specifically increase the Aß load without enhancing APP expression levels. On the basis of these findings, it seemed possible to investigate dose-dependent effects of Aß in multiple experimental designs. These assay designs were created in order to mimick different in-vivo situations that are discussed to occur in AD patients: APPsw PC12 cells exhibit low physiological concentrations of Aß within picomolar range in contrast to APPsw HEK cells, expressing Aß levels within the nanomolar range. Of note, the APPsw HEK cells showed a specific and highly significant increase in the intracellular accumulation of insoluble Aß1-42. Moreover, an intracellular accumulation of Aß and APP was found in the mitochondria of the HEK APPsw cells suggesting a direct impact on mitochondrial function on these cells. This effect might finally lead to disturbances in the energy metabolism of the cell or to increased cell death. Furthermore, baseline g- and ß-secretase activity was assessed since these enzymes represent promising therapeutic targets to slow or halt the disease process. As expected, ß-secretase activity was significantly elevated in all APPsw cell lines. This might be due to the proximity of the Swedish double mutation next to the N-terminus of the Aß sequence. Interestingly, g-secretase activity was similarly increased in PC12 APPsw cells. In addition, the toxicity of different Aß species was investigated in SY5Y and PC12 cells with regard to their effect on cellular viability mirrored by mitochondrial activity using MTT assay. Here, it turned out that not monomers, but already dimers are neurotoxic correlates. Fibrillar Aß species showed the highest toxicity. In the next step, SY5Y cells forming endogenous, dimeric APP and Aß were investigated. In accordance with previous findings, these cells showed a decreased MTT reduction potential in comparison to APPwt and control SY5Y cells reflecting a decrease of cellular viability. The impaired energy metabolism of the cells was even more drastically mirrored by reduced baseline ATP levels. In the second part of this thesis, the expression and intracellular distribution of Bcl-2 family proteins and pro-apoptotic mitochondrial factors under baseline conditions and during oxidative stress were analyzed in the APPwt and APPsw bearing cells. The most prominent finding was the reduction of expression levels of the anti-apoptotic factor Bcl-xL in the cytosolic fractions of APPwt and APPsw PC12 cells. This might indicate that a lack of anti-apoptotic factors or their altered intracellular distribution, rather than an increase in caspase-dependent pro-apoptotic factors, could be responsible for the increased vulnerability of APPwt- and APPsw-transfected PC12 cells against oxidative stress. Since total Bcl-xL expression was unaffected in PC12 cells, in contrast to APPwt and APPsw-expressing SY5Y and HEK cells revealing significantly decreased Bcl-xL expression levels. Thus, alterations in Bcl-xL distribution seem to be an early event in the disease process. Increasing Bcl-xL expression might potentially be one promising strategy for AD modification. PC12 and HEK cells bearing APPsw or APPwt were treated with the potent g-secretase inhibitor DAPT. Of note, DAPT did not only efficiently block Aß production, but additionally led to an elevation of the MTT reduction potential, reflecting an increase in cellular viability. As another disease-modifying strategy, several efforts are undertaken to ameliorate AD-relevant symptoms by the treatment with nerve growth factor (NGF). Generally, it is known that substituted pyrimidines have modest growth-promoting effects. Here, KP544, a novel substituted pyrimidine, was characterised. This drug increased MTT reduction potential in terminally differentiated and undifferentiated PC12 cells. Furthermore, treatment with KP544 led to a reduction in Aß1-40 secretion. Thus, one may conclude that the target of KP544, GSK-3ß, represents a connecting link between the two main pathological hallmarks of AD and might thus be a very promising therapeutic target for AD.
The focus of this thesis is on quantum Heisenberg magnets in low dimensions. We modify the method of spin-wave theory in order to address two distinct issues. In the first part we develop a variant of spin-wave theory for low-dimensional systems, where thermodynamic observables are calculated from the Gibbs free energy for fixed order parameter. We are able to go beyond linear spin-wave theory and systematically calculate two-loop correction to the free energy. We use our method to determine the low-temperature physics of Heisenberg ferromagnets in one, two and three spatial dimensions. In the second part of the thesis, we treat a two-dimensional Heisenberg antiferromagnet in the presence of a uniform external magnetic field. We determine the low-temperature behavior of the magnetization curve within spin-wave theory by taking the absence of the spontaneous staggered magnetization into account. Additionally, we perform quantum Monte Carlo simulations and subsequently show that numerical findings are qualitatively comparable to spin-wave results. Finally, we apply our method to an experimentally motivated case of the distorted honeycomb lattice in order to determine the strength of the exchange interactions.
ATP-binding cassette (ABC) Transporter sind ubiquitäre Membranproteine, die die Hydrolyse von ATP in der Regel an die Translokation unterschiedlichster Substrate über biologische Membranen koppeln. Sie bilden eine der größten Familien von aktiven Transportern, werden in allen drei Reichen des Lebens gefunden und sind an einer Vielzahl physiologischer und pathophysiologischer Vorgänge beteiligt. Auf Grund ihrer zentralen Bedeutung für viele zelluläre Prozesse wurden in der hier vorliegenden Arbeit ausgewählte ABC-Transporter bzw. ihre Komponenten strukturell untersucht, mit dem Ziel einen Beitrag zur Aufklärung ihrer molekularen Mechanismen zu leisten. Das erste untersuchte System war der MDR-ABC-Transporter LmrA aus L. lactis, der auf Grund seiner funktionalen Austauschbarkeit mit dem humanen P-Glykoprotein ein geeignetes Modellsystem zur strukturellen Untersuchung dieser medizinisch relevanten Klasse von ABC-Transportern darstellte. In einem ersten Schritt zu seiner Kristallisation wurde durch die Analyse von 43 Protein-Detergens-Kombinationen eine für strukturbiologische Untersuchungen geeignete Proteinpräparation etabliert. Unter Verwendung von FOS-CHOLINE-16 wurde eine bis zur Homogenität gereinigte, monodisperse und stabile Proteinlösung zur Kristallisation gewonnen, mit der eine breit angelegte Analyse des n-dimensionalen Kristallisationsraums von LmrA durchgeführt wurde. Im Zuge der Analyse von insgesamt 9600 Bedingungen wurden vier verschiedene Kristallformen erhalten. Die Datenaufnahme lieferte für die Kristallform 2 unter Verwendung von Synchrotronstrahlung eine schwache Streuung bis zu einer Auflösung von 20 Å. In einem weiteren Projekt wurden die molekularen Grundlagen der Substratspezifität des ABC-Importers Ehu aus S. meliloti untersucht. Hierfür wurde die Kristallstruktur seines Substratbindeproteins EhuB im Komplex mit den kompatiblen Soluten Ectoin bzw. Hydroxyectoin mit einer Auflösung von 1,9 Å bzw. 2,5 Å gelöst. Die beiden erhaltenen Strukturen zeigten einen für Substratbindeproteine der Gruppe II typischen Aufbau aus zwei globulären Domänen, die durch zwei Segmente der Polypeptidkette verbunden wurden. Die Substratbindungsstelle von EhuB war, wie für Substratbindeproteine erwartet, in der Spalte zwischen den beiden globulären Domänen lokalisiert. Ihre Analyse zeigte eine Interaktion des Proteins mit der negativ geladenen Carboxylat-Gruppe der Substrate durch die Bildung von Salzbrücken mit der Seitenkette von Arg85 sowie mittels Wasserstoffbrückenbindungen mit den Hauptketten-Stickstoffatomen von Phe80 und Thr133. Im Unterschied dazu waren für die Bindung des kationischen Anteils der Substrate wesentlich seine Wechselwirkungen mit den aromatischen Resten Phe24, Tyr60 und Phe80 verantwortlich, die durch ihre räumliche Anordnung eine optimale Bindungsstelle für die delokalisierte positive Ladung der Substrate bildeten. Die Bedeutung dieser wahrscheinlich auf Kation-TT und van der Waals Interaktionen beruhenden Wechselwirkungen für die Substratbindung konnten – aufbauend auf der Kristallstruktur – in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. E. Bremer (Universität Marburg) bestätigt werden. Neben den beschriebenen Interaktionen wurde der kationische Anteil der Substrate durch zwei Salzbrücken mit der Seitenkette von Glu21 sowie durch eine Wasserstoffbrückenbindung mit der Hauptketten-Carbonyl-Funktion von Gly78 gebunden. Bei der Bindung des Substrats Hydroxyectoin wurde im Vergleich zu Ectoin eine zusätzliche Wasserstoffbrückenbindung zwischen der Seitenkette von Glu134 und der lediglich in diesem Substrat vorhandenen Hydroxyl-Gruppe beobachtet, die für die dreieinhalbfach höhere Bindungsaffinität von EhuB für Hydroxyectoin gegenüber Ectoin verantwortlich zu sein scheint. Der Vergleich der an der Substratbindung beteiligten Interaktionen in EhuB mit den ebenfalls für kompatible Solute spezifischen Substratbindeproteinen ProX aus E. coli, ProX aus A. fulgidus und OpuAC aus B. subtilis enthüllte gemeinsame Prinzipen der untersuchten Proteine zur Bindung dieser Klasse von Substraten. Von besonderer Bedeutung waren dabei die von bestimmten aromatischen Resten ausgehenden Wechselwirkungen mit dem kationischen Anteil der Substrate, die wahrscheinlich auf Kation-TT und van der Waals Interaktionen beruhen. Im Detail zeigten die Substratbindungsstellen der untersuchten Proteine jedoch signifikante Unterschiede, die eine Anpassung an die für ihre Aufgabe benötigte Bindungsaffinität und das zu bindende Substrat zu sein scheinen.
Struktur und Bindungsverhalten der N-terminalen p85-src-homology-2-Domäne mittels NMR-Spektroskopie
(2006)
Induktion verschiedener Aktivitätsmuster über differentielle Rezeptor-Rekrutierung von Typ I IFN
(2006)
Für die grundlagenorientierte Forschung sowie für die Entwicklung neuer Wirkstoffe spielt der Mechanismus der interzellullären Kommunikation über Botenstoffe, wie Cytokine, eine einflussreiche Rolle. Cytokine sind Proteine, welche von Leukozyten sekretiert werden und von großer Bedeutung für die Stimulierung des angeborenen Immunsystems sind. Hierbei bewirken die Typ I Interferone (Interferone, IFN) durch ihre antivirale, immunmodulatorische, antiproliferative und antiflammatorische Wirkung. Zudem stellen sie eine Verbindung zu der zellulären Immunantwort dar, wirken bei antionkogenen Prozessen mit und aktivieren eine Vielzahl an weiteren Funktionen in der Zelle. Bekannt sind bisher eine Vielzahl verschiedener humaner Interferone (verschiedene IFNa-Subtypen, b, w und e), die über einen gemeinsamen Rezeptor wirken, der sich aus den Untereinheiten ifnar1 und ifnar2 zusammensetzt. Auffallend ist, dass verschiedene Interferone unterschiedliche zelluläre Aktivitätsmuster induzieren. Mit dieser Arbeit sollte daher ein möglicher Zusammenhang zwischen der differentiellen Rezeptor-Rekrutierung verschiedener Interferone und der Induktion verschiedener Aktivitäten geklärt werden. Voraussetzung hierfür war die Aufreinigung verschiedener Interferone (IFNa1, IFNa2, IFNa8, IFNa21, IFNb), Mutanten sowie Cystein-Mutanten zur selektiven Fluoreszenzmarkierung in ausreichender Menge und Reinheit. Um den Einfluss der Bindungsaffinität auf die Aktivität zu untersuchen, wurden Aminosäuren innerhalb der Bindungsstellen zu den Rezeptoruntereinheiten ausgetauscht. Die Änderung der Bindungsaffinität sowie deren Effekt auf die Aktivität wurden überprüft. Mit Hilfe der Cystein-Mutanten an der Position a2S136C / a/wS137C konnte eine ortsspezifische Fluoreszenzmarkierung durchgeführt werden. Für die Untersuchung der Interaktion wurden die extrazellulären Domänen von ifnar1 (ifnar1-EC) und ifnar2 (ifnar2-EC) über einen Deka-Histidin-tag immobilisiert wurden. Die Interaktion wurde in Echtzeit mit der markierungsfreien reflektometrische Interferenzspektroskopie (RIfS) und der totalinternen Reflektions-Fluoreszenzspektroskopie (TIRFS) detektiert. Hierzu wurden die Stöchiometrie, die Kinetik der Interaktion sowie die Bindungsstelle durch Kompetition zu den Rezeptoruntereinheiten charakterisiert. Dabei zeigten sich in der Stöchiometrie (binärer/ternärer Komplex), den Bindungsstellen oder der Konformationsänderung durch ifnar1 keine Unterschiede zwischen den IFN. Als einziges Unterscheidungsmerkmal konnten signifikant unterschiedliche Bindungsaffinitäten an die Rezeptoruntereinheiten ifnar1 und ifnar2 nachgewiesen werden. Dabei war die Rezeptoruntereinheit ifnar2 gegenüber ifnar1 stets die höher affine Komponente mit deutlichen Affinitätsunterschieden von bis zu drei Größenordnungen. Ebenfalls wurde die Assemblierung eines ternären Komplexes untersucht, für den eine 1:1:1-Stöchiometrie für alle IFN beobachtet wurde. Für Assemblierung ternärer Komplexe konnte ein Einfluss durch die Bindungsaffinitäten sowie den relativen sowie absoluten Konzentration der Rezeptoruntereinheiten nachgewiesen werden. Für die Untersuchung verschiedener zellulärer Aktivitäten, die durch die IFN induziert werden, wurde die Assemblierung des Transkriptionsfaktors ISGF3 (Interferon stimulierten Genfaktors 3), die antivirale Aktivität gegen vesikuläre Stomatitis Viren (VSV) sowie die antiproliferative Aktivität überprüft. Für die ISGF3-Aktivität konnten große Unterschiede für die effektiven Konzentrationen (EC50) zwischen den IFN beobachtet werden (pM- bis nM-Bereich). Für eine antiproliferative Aktivität wurde Konzentrationen im nM-Bereich benötigt. Insbesondere konnten Unterschiede zwischen den Aktivitätsmustern beobachtet werden. Durch die Korrelation der Bindungsaffinitäten mit den jeweiligen Aktivitäten konnte ein deutlicher Zusammenhang beobachtet werden. So wurde für die Induktion der ISGF3-Assemblierung eine Abhängigkeit zu der ifnar2-Affinität nachgewiesen. Bei niedrigen IFN-Konzentrationen wird über die ifnar2-Affinität die Verweildauer der Interferone auf der Oberfläche beeinflusst, wodurch Einfluss auf die Anzahl an ternären Komplexen genommen wird. Im Gegensatz hierzu zeigte sich für die antiproliferative Aktivität eine Korrelation zu der Affinität an ifnar1. Auffällig war zudem die Korrelation der differentiellen antiproliferativen Aktivität zu der relativen Bindungsaffinität von ifnar1 zu ifnar2. Dies lässt sich durch eine mögliche Adaption der Zellen gegenüber IFN erklären, die eine Regulation der Rezeptorkonzentration auf der Membran bewirkt. Durch die Modulation der Bindungsaffinität zu ifnar2 und ifnar1 konnte der Einfluss auf die Aktivität bestätigt werden. In der Medizin könnte dies für eine verbesserte therapeutische Anwendung von Bedeutung sein, da der Einsatz von Interferonen zurzeit durch eine Vielzahl an Nebenwirkungen eingeschränkt ist.
Bei der 1590 datierten Monstranz mit Reliquien der Passion Christi handelt es sich um das zentrale Stück des ab dem frühen 17. Jahrhunderts in der Geheimen Cammerkapelle der Residenz München aufbewahrten Reliquienschatzes, den die bayerischen Herzöge Wilhelm V. und Maximilian I. als ihren kostbarsten Besitz ansahen. Die über 1,15 m hohe Monstranz aus getriebenen und gegossenem Silberteilen und graviertem Glas ist sehr reich mit goldgeschmelzten Figuren und Ornamentapplikationen, mit gefassten Smaragden, Rubinen, Diamanten und Perlen verziert. Sie kann als ein bedeutendes Monument der süddeutschen Goldschmiedekunst aber auch der konfessionellen Politik der Herzöge von Bayern gelten, die mit der Reliquienverehrung eine von der Reformation verdammte Kultpraxis propagierten. Die Arbeit diskutiert zuerst die relevante kunsthistorische Literatur. Dann wird die Bedeutung der Reliquien, das ikonographische Programm und die Funktion der Monstranz als Kultmittel des kirchlich geleiteten Reliquienkults und dessen Ausprägung am Münchner Hof um 1600 – im Speziellen innerhalb der Geheimen Cammerkapelle – betrachtet. Die Reliquienmonstranz war nicht nur Ausdruck der Frömmigkeit, sondern Teil einer Repräsentationsstrategie der Herzöge und soll daher auch im Zusammenhang mit anderen wichtigen Elementen der fürstlichen Selbstdarstellung gesehen werden. Es schließen sich stilkritische Betrachtungen über die in verschiedenen Goldschmiede- und Juweliertechniken gearbeiteten Bestandteile der Monstranz an. Dabei werden die Treibarbeiten und gegossenen Teile, die Emailkunst und die Art und Weise der Edelsteinfassungen ebenso behandelt, wie die architektonischen oder ornamentalen Verzierungen. Neben der Beurteilung der bisherigen Datierung werden in den stilkritischen Betrachtungen auch eine Gruppe von verwandten Goldschmiedewerken herausarbeitet, die aus derselben Werkstatt stammen dürften. Als Schöpfer der Monstranz wird Georg Bernhard angenommen, der zwar kein zünftiger Meister war, jedoch für den Münchner Hof über viele Jahre meisterliches gearbeitet hat.
Hydroxyethylstärke (HES) ist das in Deutschland vorrangig eingesetzte Präparat für die Indikationen Volumenersatz und Hämodilution. Mögliche Störungen der Gerinnung werden häufig als eine nicht ungefährliche Nebenwirkung beim Einsatz von HES angesehen. Allerdings ist offen, ob alle HES-Präparate mit unterschiedlicher physikalisch-chemischer Struktur diese Nebenwirkung in gleicher Form hervorrufen. Da bislang systematische Untersuchungen zur Beeinflussung der Blutgerinnung durch HES weitgehend fehlen, sollten entsprechende Untersuchungen an freiwilligen Versuchspersonen vorgenommen werden. Als Prüfpräparat wurde hochsubstituierte, hochmolekulare 6% HES 450/0,7 ausgewählt, da ein solches am stärksten chemisch verändertes Präparat des natürlichen Amylopektins am ehesten für die Auslösung von Nebenwirkungen in Frage kommen könnte. Die Untersuchungen wurden an 10 gesunden, freiwilligen, männlichen Probanden vorgenommen. Dabei wurde den Probanden an drei aufeinander folgenden Tagen jeweils ein Liter einer 6%igen HES Lösung HES 450/0,7, (Hextend®) innerhalb von 240 Minuten intravenös infundiert. Durch regelmäßige Blutentnahmen wurden über einen Zeitraum von 30 Tagen die HES-Konzentration und die Gerinnungsparameter kontrolliert. Dabei sollte insbesondere die Rotationsthrombelastographie eingesetzt werden, da dieser relativ neu entwickelten Methode besondere Aussagekraft zugemessen wird. Wie bereits in früheren Studien aufgezeigt, konnte erneut bestätigt werden, dass hochsubstituierte 6% HES 450/0,7 nur verlangsamt aus dem Kreislaufsystem eliminiert wird und dementsprechend auch Wochen nach der Applikation als persistierende Fraktion noch deutlich nachweisbar ist. Die HES-Konzentration erreichte ein Maximum von 18,8 mg/dl am dritten Infusionstag und war am zehnten Folgetag noch mit 6,6mg/dl nachzuweisen. Die erhebliche Beeinflussung der Blutgerinnung durch die verwendete hochsubstituierte 6% HES 450/0,7 konnte über die verschiedenen Gerinnungsparameter sichergestellt werden. Sowohl alle gemessenen Gerinnungsparameter, als auch die Konzentrationen wichtiger Gerinnungsfaktoren, erreichten am dritten Infusionstag ihre maximale hypokoagulatorische Abweichung vom Ausgangswert vor der Infusionsserie. Die Coagulation Time (CT) + 21%, die Clot Formation Time (CFT) + 132%, die Maximum Clot Firmness (MCF) – 21%, die aktivierte partielle Thromboplastin-Zeit (Time) (aPTT) + 45%, die International Normalized Ration (INR) der Thromboplastinzeit (Quick-Test) + 14%. Die Konzentration von Fibrinogen nahm um 22% ab, die Faktor VIII-Aktivität (FVIII:C) um minus 74%, weshalb auch die Konzentration des von-Willebrand-Faktors (vWF-Ag) abnehmen musste, und zwar um bis zu 80%. Der einzige Gerinnungsparameter, der sich im Sinne einer Hyperkoagulabilität veränderte, war die Thrombinzeit (TZ), die sich im Gegensatz zu den anderen Messungen der Gerinnungsabläufe um bis zu 23% beschleunigt zeigt. Auf die Calciumkonzentration hatte die Applikation von insgesamt drei Litern 6% HES 450/0,7 über die gesamte Messperiode keinen erkennbaren Einfluss. Am 2. Folgetag war die CT um +14% und die CFT am 10. Folgetag um + 155%, die MCF am 10. Folgetag um - 18%, die aPTT am 6. Folgetag um + 9% im Sinne einer Hypokoagulabilität statistisch signifikant verändert. Die Erhöhung der INR-Werte war hingegen ab dem ersten Folgetag nicht mehr statistisch signifikant. Die Fibrinogenkonzentration war am 10. Folgetag noch um 15% ähnlich verringert wie FVIII:C mit minus 22%. Die Konzentration von vWF-Ag war am 2. Folgetag um 77% erniedrigt. Auch an den Folgetagen blieb die TZ der einzige hyperkoagulatorisch veränderte Wert mit -9% am 10. Folgetag. Der Hämatokritwert erniedrigte sich infolge der Hämodilution um maximal 25% am dritten Infusionstag und blieb am zehnten Folgetag noch um 15% verringert. Die Werte von CT, CFT, MCF, aPTT, TZ und Fibrinogen veränderten sich entsprechend der durch die HES-Applikation bedingten Hämodilution, die sich gut am Hämatokritwert abschätzen lässt. Als besonders wichtig erscheint in diesem Zusammenhang jedoch das Ergebnis, dass auch noch 10 Tage nach HES-Applikation die Störung der Gerinnung (CT, CFT, MCF, aPTT) nachgewiesen werden kann. Die bei den Untersuchungen verwendete Dosierung (3x60g in drei Tagen) liegt deutlich unter den Empfehlungen zur Maximaldosierung von hochsubstituierter 6% HES 450/0,7. Es ist dementsprechend davon auszugehen, dass die signifikanten Gerinnungsstörungen bei Ausschöpfung der Empfehlungen erheblich stärker ausgeprägt wären und zu einer erheblichen Gefährdung der Patienten führen könnten. Die Gerinnungsstörung bei hochdosierter Applikation von hochsubstituierter 6% HES 450/07 in einer Dosierung innerhalb der therapeutischen Grenzen ist dementsprechend als mögliche Komplikation und unter Umständen als erhebliche Gefährdung des Patienten zu beachten. Die derzeitig gültigen Dosierungsrichtlinien für hochsubstituierte 6% HES 450/0,7, aber auch HES 200/0,6, wären unter Berücksichtigung der vorhersehbaren Störung der Gerinnung insbesondere für Mehrfachinfusionsen zu überdenken. Diese Überlegungen zur Dosisbegrenzung gelten nicht für mittelsubstituierte HES 0,4 und 0,5.
1.) Zahlreiche Medikamente werden nach Einnahme nahezu unverändert wieder ausgeschieden und gelangen über Abwasser und Kläranlagen in die aquatische Umwelt. 2.) Die gemessenen Konzentrationen erscheinen gegenüber anderen Kontaminantengruppen vergleichsweise niedrig, sind jedoch angesichts der Tatsache, dass Medikamente biologisch hoch aktive Substanzen sind, besorgniserregend. Das Beispiel Ethinylöstradiol zeigt, dass bereits im ng/l-Bereich Effekte auftreten. Abgesehen vom Beispiel Ethinylöstradiol lagen bislang keine Erkenntnisse über chronische Effekte von Medikamenten bei umweltrelevanten Konzentrationen vor. 3.) Die in der Umwelt festgestellten Arzneimittelwirkstoffe werden fast ausschließlich in Ab-, Oberflächen- und Grundwasser detektiert. Angaben über Medikamentanreicherungen in Sedimenten liegen nur vereinzelt vor. 4.) Angaben über die Ökotoxizität von Medikamenten beruhen bislang fast ausschließlich auf bei sehr hohen Substanzkonzentrationen durchgeführten Akuttests. Die Übertragung auf umweltrelevante Verhältnisse erfolgte durch Einbeziehung hoher Sicherheitsfaktoren. 5.) Die vorliegende Arbeit zeigt, dass in komplexeren Tests bereits bei sehr viel niedrigeren Konzentrationen Effekte auftreten. Diese Effekte sind nicht unmittelbar toxisch, beeinträchtigen jedoch die Entwicklung und Fortpflanzung der Versuchsorganismen nachhaltig. 6.) Als Modellsubstanzen für die in Oberflächengewässern nachgewiesenen Pharmaka wurden das Antiepileptikum Carbamazepin, Clofibrinsäure als Metabolit zahlreicher Lipidsenker, das Antibiotikum Ciprofloxacin und das Antidepressivum Fluoxetin ausgewählt. Sämtliche Pharmaka werden in der Umwelt weit verbreitet nachgewiesen. 7.) Als Testorganismen dienten die Zuckmücke Chironomus riparius, die Zwergdeckelschnecke Potamopyrgus antipodarum und der aquatische Annelide Lumbriculus variegatus. C. riparius ist ein bereits standardisierter Versuchsorganismus, L. variegatus ist zur Zeit im Standardisierungsverfahren (OECD 2004B) und für ökotoxikologische Untersuchungen empfohlen (ASTM 1995). Außerdem wurde mit den Einzellern Blepharisma japonicum und Tetrahymena thermophila ein Destruentenmikrokosmos entwickelt. Beide Einzeller sind ebenfalls erprobte Versuchsorganismen (PAULI 1996, FOX & MORIN 2001). 8.) Von den vier untersuchten Pharmaka erwiesen sich im getesteten Konzentrationsbereich Carbamazepin und Fluoxetin für jeweils einen der Testorganismen als schädlich. Carbamazepin blockierte ab einer Sedimentkonzentration von 234 µg/kg Sediment (Trockengewicht) die Entwicklung von C. riparius. Fluoxetin führte ab einer Testkonzentration von 2 µg/l zu einer Reduzierung der Embryonenzahl bei P. antipodarum. Die EC10 für Carbamazepin wurde zu 113 µg/kg Sediment berechnet, die EC10 für Fluoxetin zu 0,81 µg/l. Beide Konzentrationen sind bei Berücksichtigung der im TGD vorgesehenen Sicherheitsfaktoren umweltrelevant (PEC/PNEC > 1). Als Grundlage dieser Berechnung dienten gemessene Umweltkonzentrationen im Sediment beziehungsweise Wasser. Ein negativer Effekt von Ciprofloxacin auf L. variegatus erschien anhand der Daten zwar möglich, konnte jedoch nicht statistisch belegt werden. Für Clofibrinsäure ergaben sich keine Hinweise auf negative Effekte im getesteten Konzentrationsbereich. 9.) Die vorliegenden Berechnungen sind weitaus tragfähiger als bisher vorliegende, da sie auf chronischen Toxizitätsdaten und gemessenen Umweltkonzentrationen beruhen, statt auf Akutdaten und geschätzten Umweltkonzentrationen. 10.) Die in den Versuchen festgestellten, sehr niedrigen Effektkonzentrationen lassen Effekte auch bei umweltrelevanten Konzentrationen als wahrscheinlich erscheinen. Indirekte Effekte wie vermindertes Futterangebot für Prädatoren oder Verschiebungen im Artenspektrum sind denkbar. 11.) Der Destruentenmikrokosmos erwies sich als prinzipiell geeignet, Effekte von Xenobiotika auf Einzeller zu untersuchen, da die Positivkontrolle funktionierte. Die Daten aus den Versuchsansätzen zeigen jedoch, dass Versuchsdesign und Haltung der Testorganismen weiter entwickelt werden müssen. 12.) Die vorliegenden Daten zeigen, dass Pharmaka bei umweltrelevanten Konzentrationen ein ökologisches Risiko darstellen können. Maßnahmen zur Risikominderung sind dringend erforderlich. Angesichts des therapeutischen Nutzens der Substanzen erscheinen Verbote nicht durchsetzbar.
One of the central research topics in the field of biophysical chemistry is the structure and function of membrane proteins involved in energy transduction. Both, the aerobic and the anaerobic respiration include electron transfer and proton translocation across the mitochondrial and bacterial membranes. These electron transfer processes lead to changes in oxidation states of cofactors some of which are paramagnetic. Therefore, EPR spectroscopy is the method of choice to obtain electronic and structural information directly related to the function of the respiratory chain proteins. In this work, multifrequency continuous wave (CW) and pulsed EPR spectroscopy has been used to characterize the molybdenum active site of polysulfide reductase (Psr) from the anaerobic bacterium Wolinella succinogenes and the protein-protein complex between cytochrome c oxidase (CcO) and cytochrome c from the aerobic bacterium Paracoccus denitrificans. Molybdenum in Psr-Psr is an enzyme essential for the sulfur respiration of Wolinella succinogenes. Biochemical studies suggested that the active site of this enzyme contains a mononuclear Mo center, which catalyzes the reduction of the substrate polysulfide to sulfide. Until now there is no crystal structure available for Psr. Consequently, current characterizations of this enzyme have to rely on biochemical and spectroscopic investigations. Within the present work, CW and modern pulsed EPR techniques were applied to investigate its catalytically active site. In the first part of this thesis, different redox agents have been used to generate paramagnetic states of Psr. Multifrequency CW-EPR spectroscopy was applied to identify the Mo(V) states. Using simulations of the experimental spectra, three spectroscopically distinct states have been identified based on the Mo hyperfine- and g-tensor values. Comparison of their EPR parameters with those of related enzymes indicated five or six sulfur ligands at the Mo center depending on the state. The state generated by addition of polysulfide is suggested to be the catalytically active form, in which the Mo is coordinated by a sulfur of the polysulfide chain as the sixth ligand. 33S (I = 3/2) labeled polysulfide was prepared to probe the proximity of the polysulfide to the molybdenum center via its hyperfine coupling. 1D-ESEEM and 2D122 HYSCORE spectroscopy was used to detect these hyperfine and quadrupole interactions, which are too small to be observed in conventional CW EPR spectra. To date there has been only one pulsed-EPR study involving a 33S nucleus [Finazzo et.al. 2003]. The reasons are that this nucleus has a high nuclear spin of I = 3/2 and a large nuclear quadrupole moment in addition to the low Larmor frequency. All these make the detection of sulfur and the extraction of structural information demanding. However, analysis of the 2D-data led to a Mo(V) 33S distance in a range of about 2 to 2.5 Å. Mo-S distances found in molybdenum enzymes of the same family are in a range of 1.8 to 2.8 Å suggesting that the 33S is indeed the sixth ligand of the Mo(V) center and demonstrating that polysulfide is the actual substrate for this enzyme. Thus HYSCORE experiments have been proved to be a powerful technique to gain further insight into the active site structures of molybdenum enzymes and the trafficking of substrate atoms during catalysis. Density functional theory (DFT) calculations together with quantitative numerical simulations of the 2D-data will help to obtain more structural details about the molybdenum binding site in Psr. CcO:cytochrome c complex Protein-protein complex formation is an important step in energy conversion biological processes such as respiration and photosynthesis. These protein-protein complexes are involved in long range electron transfer reactions and are known to be of transient nature. Within the bacterial and mitochondrial respiratory electron transport chains such a complex is formed between CcO and cytochrome c. Upon complex formation cytochrome c donates the electrons required for the CcO catalyzed reduction of dioxygen to water. Here, the protein-protein complex formation between CcO and cytochrome c from Paracoccus denitrificans was investigated by pulsed EPR spectroscopy. The idea was to use the relaxation enhancement due to the distance and orientation dependent magnetic dipole-dipole interaction between the paramagnetic centers in the different CcO constructs and cytochromes. Two-pulse electron spin echo experiments were carried out on mixtures of the CuA containing soluble subunit II or the full size CcO with the physiological partner cytochrome c552 or horse heart cytochrome c. Significantly enhanced relaxation of CuA due to specific protein-protein complex formation has been observed in all four cases. In contrast the non-binding cytochrome c1 showed only a very weak relaxation enhancement due to unspecific protein-protein interactions. The echo decays of the slowly relaxing observer spin (CuA of CcO) measured in the absence and presence of the fast relaxing spin (Fe(III) of cytochrome c) permitted the extraction of the pure dipolar relaxation contributions for the different complexes. Measurements at different temperatures proved the dipolar nature of the relaxation enhancement. Furthermore, it was demonstrated experimentally that this approach also works for the full-size CcO, which contains four paramagnetic metal centers, in complex with cytochrome c. Quantitative simulations of the data suggest a broad distribution in distances (2 - 4 nm) and orientations between the CuA and Fe(III) in the complex between CcO and cytochrome c. High-field EPR spectroscopy will be useful to further analyze and prove these complex structures. Within the present work, it has been shown that pulsed relaxation enhancement experiments can be used to investigate the distance and relative orientation between paramagnetic metal centers. Furthermore, it has been demonstrated on a qualitative level, that this method can be used complimentary to other biophysical approaches to study transient electron transfer protein-protein complexes. Finally, within this work it has been proven that this method can be applied also to biological systems where more than two paramagnetic centers are present. This is particularly interesting for supercomplexes between membrane proteins.
Der Prävention und Therapie von diabetischer Nephropathie kommt immer mehr Bedeutung zu, da sie der Hauptgrund für terminale Niereninsuffizienz ist. Ein möglicher Therapieansatz ist die Hemmung des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems mit Angiotensin Converting Enzyme Inhibitoren oder kombinierten ACE und neutrale Endopaptidase (Vasopeptidase) Inhibitoren. Trotz der therapeutischen Effektivität einer pharmakologischen Hemmung des RAAS ist die Bedeutung von ACE und NEP in der Pathogenese der diabetischen Nephropathie noch nicht vollständig geklärt. Auf Gewebsebene kann die erhöhte Bildung und Akkumulation von AGEs zur Entwicklung von diabetischer Nephropathie beitragen (73) und der ACE-Inhibitor Ramipril kann die Anreicherung von fluoreszierenden AGEs in der Niere und im Serum von Typ I diabetischen, hypertensiven Ratten verhindern (73). Da AGEs unterschiedliche Strukturen und Effekte auf Proteine haben, sollte der Einfluss des ACEInhibitors Ramipril und des Vasopeptidase Inhibitors AVE7688 auf die Akkumulation von den drei prototypischen AGEs 3-DG-Imidazolon, Pentosidin und CML in einem Typ II diabetischen Tiermodell untersucht werden. Für den AGE-Subtyp CML wurde zusätzlich noch die Konzentration im Serum und die CML Clearance in ZDF Ratten bestimmt. Des Weiteren sollte der Effekt von Ramipril und AVE7688 auf die AGE Bildung in vitro analysiert werden. Die Charakterisierung der ZDF Ratten ergab, dass es zu einer 40, 50 und 55%igen Akkumulation der AGE-Subtypen 3-DG-Imidazolon, Pentosidin und CML in der Niere von 37 Wochen alten ZDF Ratten kommt. Diese Akkumulation konnte durch die Behandlung mit AVE7688 komplett verhindert werden, während Ramipril nur die CML Akkumulation in 37 Wochen alten ZDF Ratten leicht reduzierte. Auch wurde die CML Akkumulation im Serum von 37 Wochen alten ZDF Ratten durch AVE7688 verhindert. AVE7688 reduzierte nicht nur die AGE Akkumulation, sondern verbesserte auch die CML Clearance, während Ramipril keinen Effekt hatte. Die Effekte zur AGE Reduktion gingen einher mit einer Verhinderung der Albuminurie durch AVE7688 und einer 30%igen Reduktion durch Ramipril. In vitro Studien zu AGE Bildung zeigten, dass AVE7688 die Bildung von CML und Pentosidin verhindern kann und dass chelatierende Eigenschaften von AVE7688 an diesem Effekt beteiligt sein könnten. Ramipril hatte nur sehr schwach chelatierende Eigenschaften und keinen Einfluss auf die in vitro Bildung von CML oder Pentosidin. Neben der Akkumulation von AGEs trägt auch die Aktivierung der intrazellulären Signaltransduktion des Receptor of Advanced Glycation End Products (RAGE) zur Entwicklung von diabetischer Nephropathie bei. Dies wurde in doppelt transgenen diabetischen Mäusen gezeigt, die aufgrund der RAGE Überexpression verstärkt diabetische Nephropathie im Vergleich zu diabetischen Mäusen mit normaler RAGE Expression entwickeln (64). Die Aktivierung der RAGE Signaltransduktion mit den Liganden AGEs und S100B führt zu Entzündungsprozessen und zu einer Hochregulation der RAGE Expression (97). Da es in ZDF Ratten zur Akkumulation von AGEs kommt, wurde untersucht, ob ihr Rezeptor RAGE vermehrt in ZDF Ratten exprimiert wird und ob AVE7688 oder Ramipril die RAGE Expression beeinflussen. Die Substanzen könnten zum einen die RAGE-Liganden Interaktion direkt beeinflussen oder über eine Reduktion der Liganden die RAGE Expression verändern. Um dies zu untersuchen, wurde zunächst biochemisch die Interaktion von RAGE mit den Liganden AGEs und S100B näher analysiert, und die Bindedomaine von RAGE charakterisiert. Anhand dieser Daten wurde der Effekt von AVE7688 und Ramipril auf die biochemische RAGE-Liganden Interaktion und zelluläre RAGE Aktivierung in Makrophagen im Vergleich zu einem RAGE Antagonisten untersucht. In den ZDF Ratten korrelierte die AGE Akkumulation mit einer erhöhten RAGE Expression in der Niere von 37 Wochen alten ZDF Ratten. AVE7688, nicht jedoch Ramipril, reduzierte die erhöhte RAGE Expression in den ZDF Ratten. Bei der Charakterisierung der RAGE-Liganden Interaktion stellte sich heraus, dass AGEs, die Pentosidin und CML enthalten, ebenso wie S100B an RAGE binden und dass die V-Domaine von RAGE ausreichend für die Bindung der Liganden ist. Kreuzkompetitionen zeigten, dass AGEs und S100B innerhalb der gleichen Bindungsstelle von RAGE binden und dass AGEs, die Pentosidin enthalten, wesentlich affiner an RAGE binden als reine CML AGEs, wobei S100B von den untersuchten Liganden am affinsten an RAGE gebunden hat. Eine Untersuchung des Einflusses der Substanzen auf die RAGE-Liganden Interaktion ergab, dass die aktiven Metabolite von AVE7688 und Ramipril in physiologisch relevanten Konzentrationen keinen Effekt auf die Interaktion von RAGE mit AGEs oder S100B hatten. Da weder AVE7688 noch Ramipril die RAGE-Liganden Interaktion beeinflussten, wurde ein Homologiemodell der RAGE V-Domaine erstellt, um die Struktur eines RAGE Antagonisten besser vorhersagen zu können. Anhand des Modells konnte eine stark positiv geladene Fläche identifiziert werden, was vermuten lies, dass elektrostatische Wechselwirkungen an der RAGE-Liganden Interaktion beteiligt sein könnten. Diese Hypothese wurde durch die Daten unterstützt, dass Heparin aufgrund seiner negativen Ladung an die RAGE V-Domaine bindet und die Bindung von AGEs und S100B an RAGE kompetieren kann. Punktmutationen von ausgewählten positiven Resten innerhalb der RAGE V-Domaine zeigten, dass die Mutation von einer Aminosäure kaum einen Effekt hatte, während die Mutation von drei oder fünf positiv geladenen Resten, die Bindung der Liganden an RAGE reduzierte. Auch zellulär konnte Heparin die RAGE vermittelte Sekretion von TNFα in Makrophagen verhindern. Die erhöhte AGE Clearance und die Inhibition der AGE Bildung, vermutlich durch die chelatierenden Eigenschaften von AVE7688, könnten zur Reduktion der renalen AGE Akkumulation und einer Verbesserung der Nephropathie bei Typ II Diabetes beitragen. Die Daten lassen auch vermuten, dass die Aktivierung der RAGE Signaltransduktion bei Diabetes durch AVE7688 verhindert werden kann, wobei AVE7688 keinen Effekt auf die Bindung der pathogenen RAGE-Liganden AGEs und S100B an RAGE hatte. Die Inhibition der RAGE Signaltransduktion könnte auf eine Reduktion der Liganden zurückgeführt werden, wobei der Effekt eine differenzielle Regulation der Expression von sRAGE nicht ausgeschlossen werden kann. Dieser neu identifizierte Wirkungsmechanismus der Vasopeptidasehemmung trägt mutmaßlich zur hohen Wirksamkeit dieser Substanzklasse bei diabetischer Nephropathie bei.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Spindephasierung optisch angeregter itineranter Ladungsträger in magnetisch dotierten Volumenhalbleitern mit Methoden der zeitaufgelösten magneto-optischen Ultra-Kurzzeit-Spektroskopie untersucht und eine theoretische Beschreibung der Spindephasierung entwickelt, die ein hohes Maß an Übereinstimmung mit den experimentellen Ergebnissen aufweist. Beim untersuchten Material Cd1-xMnxTe handelt es sich um einen sog. magnetischen Halbleiter, der die elektronischen Eigenschaften eines Halbleiters mit den magnetischen Eigenschaften eines Paramagneten vereint. Bedingt durch die starke sp/d-Austauschwechselwirkung zwischen den Spins der lokalisierten magnetischen Ionen und denen der optisch angeregten itineranten Ladungsträger, kommt es zur Ausbildung vieler neuer, bisher unbekannter, aber auch zur Modifikation bereits bekannter Effekte. Die Wirkungsweise der sp/d-Austauschkopplung in magnetischen Halbleitern kann stark vereinfacht gesprochen als eine Art „Verstärker“ verstanden werden, der unter anderem zu einer Intensivierung all solcher Effekte führt, die durch Magnetfelder, seien sie externer oder interner Natur, bedingt sind. Durch diese starke Respons auf externe Magnetfelder kommt es in magnetischen Halbleitern zu einer starken Überhöhung der Zeeman-Aufspaltung, so daß eine getrennte Beobachtung der ansonsten entarteten Spinzustände möglich wird. Die Methode der Wahl zur Untersuchung der zeitlichen Entwicklung der energetisch aufgespaltenen Spinzustände ist die Detektion der zeitaufgelösten Spinquantenschwebungen der Ladungsträger, die das zeitaufgelöste Analogon zur Detektion des Hanle-Effektes in Gasen darstellt. Hierfür kam ein magneto-optischer Detektionsaufbau zum Einsatz, der es ermöglichte, die zeitliche Entwicklung der Komponenten der transienten Magnetisierungen der im Magnetfeld präzedierenden Ladungsträgerspins zu erfassen und so Rückschlüsse auf die Lebensdauer der angeregten Zustände zu schließen. Da die so bestimmten Dephasierungszeiten der detektierten Transienten der Spinquantenschwebungen eine starke Abhängigkeit von den externen Parametern wie der Temperatur, dem Magnetfeld und der magnetischen Dotierung aufweisen, war es ein Ziel dieser Arbeit, eine systematische Untersuchung der gefundenen Abhängigkeiten durchzuführen, um so eine möglichst breite Datenbasis für die weitere theoretische Untersuchung der gefundenen Ergebnisse zu schaffen. Im Zuge dieser Untersuchungen gelang uns unter anderem der erste experimentelle Nachweis der oszillatorischen Signaturen von kohärenten Lochspinquantenschwebungen in magnetisch dotierten Halbleitern. Obwohl magnetisch dotierte Halbleiter bereits seit mehr als 30 Jahren experimentell untersucht werden, konnten unsere experimentellen Befunde zur Spindephasierung optisch angeregter Ladungsträger durch keines der etablierten Modelle zur Beschreibung der Spindephasierung, sei es in magnetisch dotierten oder in undotierten Halbleitern, beschrieben werden. Aus diesem Grund wurde ausgehend vom Gedanken, daß lokale Fluktuationen der Magnetisierung der magnetischen Ionen einen starken Einfluß auf die Lebensdauer der itineranten Spins haben, ein neues Modell entwickelt. Dieses Modell beruht auf der Adaption einer Beschreibung der Spindephasierung, die im Rahmen von Kernresonanzexperimenten entwickelt wurde und der Orientierung der Störungen der Magnetisierung in bezug zur Orientierung der Spins der itineranten Ladungsträger besonders Rechnung trägt. Durch die konsequente Ableitung quantitativer Ausdrücke für die Stärke der Magnetisierungsfluktuationen unter Berücksichtigung quantenmechanischer Fluktuationen gelang es uns, eine einfache Beschreibung für die Spindephasierung optisch angeregter Elektronen und Löcher in magnetischen Halbleitern in Abhängigkeit von der Temperatur, dem Magnetfeld und der Mangan-Dotierung zu formulieren. Die im Rahmen unseres Modells berechneten Dephasierungszeiten weisen im Bereich geringer Mangan-Konzentrationen (x <4 %) ein hohes Maß an Übereinstimmung mit den experimentellen Daten auf und können die beobachteten Temperatur- und Magnetfeldabhängigkeiten sehr gut wiedergeben. Für noch höhere Konzentrationen der Mangan-Ionen treten zunehmend Abweichungen der berechneten Dephasierungszeiten von den experimentellen Daten auf, die allerdings immer noch eine qualitative Aussage über das Verhalten der Spindephasierung erlauben. So reproduziert unser Modell unter anderem den experimentell für alle Proben gefundenen, an sich nicht direkt einsichtigen Befund, zunehmender Spinlebenszeiten mit steigender Temperatur, der allgemein als "motional narrowing" bezeichnet wird. Da das von uns vorgestellte Modell ohne wahlfreie Parameter auskommt und die zur Berechnung der Spindephasierungszeiten notwendigen Größen der Literatur entnommen oder experimentell bestimmt werden können, ist der hohe Grad an Übereinstimmung mit den experimentellen Ergebnissen beachtlich. Weitere Verfeinerungen des Modells könnten zu einer weiteren Steigerung der Übereinstimmung vor allem im Bereich hoher Mangan-Konzentrationen führen, jedoch würde dies unserer Meinung nach den Rahmen des vorgestellten Modells sprengen. Wir verstehen unsere theoretische Untersuchung zur Spindephasierung vielmehr als einen Startpunkt für eine nun durchzuführende exakte quantenmechanische theoretische Untersuchung der Spindephasierung optisch angeregter Ladungsträger in magnetischen Halbleitern. Weitere Untersuchungen müssen nun klären, inwieweit das von uns für die Beschreibung der Spindephasierung in magnetisch dotierten CdTe-Volumenhalbleitern entwickelte Modell auf II-VI-Volumenhalbleiter allgemein und andere magnetisch dotierte Materialien wie z.B. magnetische III-V-Halbleiter vom Typ Ga1-xMnxAs übertragbar sind, die speziell im Hinblick auf ihre ferromagnetische Ordnung unter dem Einfluß der RKKY-Wechselwirkung und deren möglichen Einfluß auf die Spindephasierung von besonderem Interesse sind.
Erfolgreich wurde die biochemische Synthese eines Kernbereiches der spleißosomalen U4/U6-RNA etabliert und die Sekundärstruktur mittels NMR-spektroskopischer Methoden charakterisiert. Die Konformationen von zwei molekularen Regeleinheiten, des auf Gramicidin A basierenden Ionenkanals Minigramicidin sowie einem aus zwei cis-Dekalinen aufgebautenmolekularen Schalters konnten in unterschiedlichen Umgebungen mit Hilfe der NMR-Spektroskopie erfolgreich bestimmt werden. Die Synthese des RNA-Konstruktes u4u6a46phh2 erfolgte durch Transkription von plasmidischer Templat-DNA mit T7-Polymerase und anschließender Aufreinigung mittels Gelelektrophorese und Homogenisierung am 3’-Ende mit Hilfe eines passenden Hammerhead-Ribozyms. u4u6a46phh2-RNA kann als Konstrukt für die Synthese von 13C/15N-gelabelter RNA dienen, da die Schneidreaktion und die daraus resultierende RNA definiert ist und die Integrale der Iminoprotonen für eine einzige Konformation der RNA sprechen. Das von Dr. Hans-Dieter Arndt in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Koert an der Humboldt-Universität zu Berlin hergestellte Minigramicidin ist aus zwei verkürzten Gramicidin A-Einheiten aufgebaut, die in einer Kopf-an-Kopf Anordnung durch einen Bernsteinsäure-Linker kovalent verknüpft sind. In dieser Arbeit wurden die Strukturen von Minigramicidin in zwei unterschiedlichen Umgebungen aufgeklärt: in Benzol/Aceton (10:1, v/v) ohne Zusatz von Kationen und in gesättigter Cäsiumchlorid-Chloroform/Methanol (3:1, v/v)-Lösung. Im ersten Fall findet man ein doppelt helikales linksgängiges Dimer von Minigramicidin mit ca. 5.7 Resten pro Windung. Diese Struktur hat eine Länge von ca. 38 Å und einen Durchmesser von ca. 1.2 Å. Mit Cäsium-Kationen liegt die Verbindung als Monomer vor. Sie bildet eine rechtsgängige pi-Helix mit ca. 6.3 Resten pro Windung. Die Struktur hat eine Länge von 17 Å und einen Durchmesser von ca. 4.5 Å. Es konnte erstmals eine zur ionenkanalaktiven Form des gA ähnliche Konformation eines auf gA basierenden künstlichen Ionenkanals in organischen Lösemitteln nachgewiesen werden. Der von Dr. Michael Karle aus der Arbeitsgruppe von Prof. Koert an der Philipps-Universität Marburg synthetisierte molekulare Schalter besteht aus zwei cis-Dekalineinheiten, die durch einen 14-gliedrigen Bislactam-Ring miteinander gekoppelt sind. Der Schaltprozeß wurde dabei durch die saure Spaltung des Ley-Acetals in 13 ausgelöst. Es wurde für die Verbindung 13 eine all-axial Stellung für den Makrozyklus gefunden. Diese Struktur wird auch durch die gefundenen Kopplungskonstanten gestützt. Nach dem Schaltprozeß wurde die Struktur von 16 ermittelt. Wie erwartet, wurde durch das Lösen der konformativen Klammer ein Doppelringflip im linken Dekalingerüst ausgelöst und durch den Makrozyklus auf das rechte Dekalingerüst übertragen. Die gefundenen ROE-Abstände und Kopplungskonstanten für bestimmte Dekalinprotonen bestätigen die umgeschaltete Struktur.
Die Zusammensetzung der Plasmamembran tierischer Zellen kann unter anderem durch regulierte Exozytose und durch hydrolytische Abspaltung von Ektodomänen membran-assoziierter Proteine (Ectodomain Shedding) modifiziert werden. Regulierte Exozytose spezialisierter Vesikel, den sogenannten GSVs (GLUT4 containing small vesicles), dient der intrazellulären Speicherung des Glucosetransporters4 (GLUT4) sowie seinem insulin-abhängigen Einbau in die Plasmamembran. Die proteolytische Abspaltung der Ektodomänen von Zelloberflächenproteinen wie z.B. des Heparin-bindenden epidermalen Wachstums-faktors (heparin binding-epidermal growth factor = HB-EGF) führt zur Modifikation der Plasmamembranzusammensetzung. Wir zeigten, dass GSVs in vielen Säugerzellen für die intrazelluläre Speicherung spezifischer Plasmamembranproteine und deren stimulations-abhängigen Transfer in die Plasmamembran zuständig sind. Um GSVs eindeutig identifizieren zu können, wurden Rat1-Zellen stabil mit GLUT4myc als heterologem Marker für dieses spezifische Speicherkompartiment transfiziert. Die intrazelluläre GLUT4-Lokalisation in den als positiv identifizierten Rat1/GLUT4myc-Klonen entsprach dem für CHO/GLUT4-Zellen beschriebenen Verteilungsmuster. In der Folge wurden mehrere potentiell vesikel-assoziierte Membranproteine in die Untersuchungen zur Membran-zusammensetzung einbezogen: eine endogene proHB-EGF hydrolysierende Proteaseaktivität und die Metalloproteasen ADAM10 und TACE. Es zeigte sich, dass GSVs eine Proteaseaktivität enthielten, die VSVG-proHB-EGF hydrolysierte. Eine Colokalisation der beiden endogenen Metalloproteasen ADAM10 und TACE mit GLUT4 in GSVs konnte gezeigt werden. Untersuchungen zeigten, dass beide endogenen Proteasen ADAM10 und TACE in Rat1/GLUT4myc-Zellen mit einer Subpopulation von GSVs assoziiert zu sein scheinen. Die Stimulation des G-Protein-gekoppelten Thrombinrezeptors löste in diesen Zellen eine regulierte Exozytose der GSVs aus. Die Metalloproteasen-enthaltenden GSVs reagierten jedoch nicht auf diese Art der Stimulation. Sie bildeten möglicherweise eine Reservepopulation von GSVs, die erst bei stärkerer Stimulation mobilisiert werden kann. Unter Ruhebedingungen schien auch diese Vesikelpopulation über andere intrazelluläre Kompartimente, nicht jedoch über die Plasmamembran, zu rezirkulieren.
In der vorliegenden Arbeit wird die Kopplung von Bloch- und Zyklotron-Oszillationen in Halbleiterübergittern unter dem Einfluss eines elektrischen und magnetischen Feldes zeitaufgelöst-elektro-optisch untersucht. Hierbei hängen sowohl die Stärke der Bloch-Zyklotron-Kopplung als auch die Charakteristika der kohärenten Ladungsträgerbewegung sensitiv von der relativen Anordnung der äußeren Felder ab. Bei gekreuzter Feldanordnung wird der Kohärente Hall-Effekt beobachtet. Semiklassisch lässt sich die Ladungsträgerdynamik in diesem Fall mit der Bewegungsgleichung eines nicht getriebenen, ungedämpften Pendels beschreiben. Abhängig vom Verhältnis E/B der äußeren Feldstärken lassen sich zwei Bewegungsregime mit gegensätzlicher Feldabhängigkeit der Frequenz der Ladungsträgeroszillationen unterscheiden. Bei schiefer Feldanordnung kommt es durch die nichtlineare Kopplung der Bloch-Oszillation mit der Zyklotron-Oszillation in der Übergitterebene zu einer phasenempfindlichen Gleichrichtung der transienten Oszillationen entlang der Wachstumsrichtung, wobei man in Resonanz eine Überhöhung dieses selbstinduzierten Gleichstroms beobachtet. In Anlehnung an ein analoges Phänomen, das an Josephson-Kontakten beobachtet wird, sprechen wir hierbei vom Fiske-Effekt. Für die räumliche Auslenkung X("unendlich") entlang der Wachstumsrichtung nach Abklingen der Kohärenz kann im Rahmen einer analytischen semiklassischen Näherung ein geschlossener Ausdruck angegeben werden. Die zeitaufgelösten Experimente zur Bloch-Zyklotron-Kopplung werden an zwei GaAs/Al0,3Ga0,7As-Übergitterstrukturen mit unterschiedlicher Quantentopfbreite durchgeführt. Im Spezialfall der gekreuzten Feldanordnung wird der Kohärente Hall-Effekt anhand der Existenz zweier Bewegungsregime mit ihrem charakteristischen Frequenz- und Dephasierungsverhalten in Abhängigkeit der äußeren Felder nachgewiesen und die lineare Abhängigkeit des Magnetfeldes am Übergang zwischen den Bewegungsregimen vom elektrischen Feld gezeigt. Die gleichermaßen prognostizierte Zunahme der Intensität höherer harmonischer Moden der Ladungsträgeroszillationen in der Nähe des Übergangs wird jedoch in der elektro-optischen Respons nicht beobachtet, wenngleich die verwendeten elektro-optischen Messtechniken im Vergleich zur Terahertz-Emissionsspektroskopie zur Untersuchung des Übergangsbereichs und höher frequenter Oszillationen prinzipiell besser geeignet sein sollten. Hierbei bestehende Einschränkungen werden diskutiert. Der für den Fall der schiefen Feldanordnung vorhergesagte selbstinduzierte Gleichstrom manifestiert sich experimentell in einem resonanzartigen Verlauf des elektro-optischen Signals nach Abklingen der Oszillationen in Abhängigkeit des Magnetfeldes. Durch Vergleich mit dem analytisch hergeleiteten Ausdruck für die räumliche Auslenkung lassen sich hieraus die relevanten Dämpfungskonstanten abschätzen und durch iterative Anpassung bestimmen. Die bei schiefer Feldanordnung mittels elektro-optischer Spektroskopie gemessenen Signale weisen nach Abklingen der kohärenten Ladungsträgeroszillationen nur einen sehr schwachen Driftanteil auf. Eine schlüssige Erklärung für diese Beobachtung ergibt sich, wenn bei der Behandlung der Ladungsträgerdynamik die Impuls- und Energierelaxation des Bloch-Oszillators unterschieden werden und eine sehr kleine Energiedämpfung angenommen wird.
Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Synthese und der Einkristallzüchtung der beiden Spin-Leiter-Verbindungen SrCu203 und Sr2Cu3O5 unter hohem Druck. Zunächst wird in einer Reihe von Versuchen ein geeignetes Tiegelmaterial ermittelt. Dabei stellen sich eine Doppeltiegelkonstuktion mit einem einkristallinen Magnesiumoxid-Innentiegel und einem verschweißbaren äußeren Platintiegel als beste Materialkombination heraus. Die Standzeit eines Versuchs lässt sich hiermit von den in der Literatur üblichen 30 Minuten um das 50 bis 100-fache verlängern. Durch Verwendung dieser Tiegelkombination können erstmals Züchtungsexperimente von SrCu203 und Sr2Cu305 aus der Schmelze erfolgreich durchgeführt werden. Für beide Zusammensetzungen konnten Kristalle mit Kantenlängen bis zu 2 mm hergestellt werden. Die besten Wachstumsbedingungen für SrCu203 liegen zwischen 3 und 5 GPa und zwischen 1400°C und etwa 1200°C. Diese Bedingungen wurden für stöchiometrische und auf etwa 70% Cu0 erhöhte Einwaagenzusammensetzungen ermittelt. Für Sr2Cu305 gelten ähnliche Züchtungsparameter. Durch die Züchtungsexperimente wurden neue Phasen, wie eine unbekannte Modifikation von Sr2Cu305 und eine nicht näher identifizierte ,243'-Phase gefunden. Das Auftreten der Fremdphase Sr2Cu02(C03) war zunächst überraschend und klärte sich durch den Herstellungsprozess der MgO-Einkristalle auf. Der Einbau des aus dem Tiegel stammenden gelösten Magnesiums wird in der die Cu203-Schichten trennenden Strontiumschicht erwartet. Damit erlangt es keine Wirkung auf die Spin-Leiter-typischen Effekte. Durch zahlreiche Messungen mit wellenlängendispersiver Röntgenanalyse am Rasterelektronenmikroskop wurden die maßgeblichen Reaktionswege aufgeklärt und die besten Wachtumsbedingungen sowie die Fremdphasenreaktionen ermittelt. Die Ergebnisse der Raman- und IR-Spektroskopie bestätigen das Auftreten der Struktur- beziehungsweise verbindungstypischen 2-Magnonen- und 2-Magnonplus-Phonon-Quasiteilchen. Durch Polarisationsmikroskopie und optische Transmissionsuntersuchungen konnte nachgewiesen werden, dass es sich bei den Proben um Einkristalle handelt. Die thermische Ausdehnung zeigt eine deutliche Anisotropie. Die Achsen in a- und b-Richtung besitzen niedrige und von der C-Richtung deutliche verschiedene lineare Ausdehnungskoeffizienten.
Durch das Semantische Web soll es Maschinen ermöglicht werden Metadaten zu verstehen. Hierin steckt ein enormes Potenzial, wodurch sich der Umgang mit dem heutigen Internet grundlegend ändern kann. Das Semantische Web steht jedoch noch am Anfang. Es gilt noch einige offene und strittige Punkte zu klären. Das Fundament des Semantischen Webs wird durch das Resource Description Framework (RDF) gebildet, worauf sich diese Arbeit konzentriert. Hauptziel meiner Arbeit war die Verbesserung der Funktionalität und der Nutzungsfreundlichkeit für RDF-Speicher- und Anfragesysteme. Dabei stand die allgemeine Nutzung für ein Informationsportal oder eine Internetsuchmaschine im Vordergrund. Meine Überlegungen hierzu wurden in dem Speichersystem RDF-Source related Storage System (RDF-S3) und der darauf aufsetzenden Anfragesprache easy RDF Query Language (eRQL) umgesetzt. Insbesondere wurden die folgende Kernpunkte berücksichtigt: • Allgemeine Nutzbarkeit der Anfragesprache, sodass auch unerfahrene Nutzer einfach und schnell Anfragen erstellen können. Um auch von unerfahrenen Nutzern bedient werden zu können, konnte keine komplexe Syntax verwendet werden, wie dies bei den meisten existierenden Anfragesprachen der Fall ist. Es wurde sich daher an Anfragesprachen existierender Suchmaschinen angelehnt. Entsprechend bilden sogenannte Ein-Wort-Anfragen, die den Suchbegriffen entsprechen, eine wichtige Rolle. Um gezieltere Anfragen stellen zu können, sind jedoch die Schemainformationen der gespeicherten Daten sehr wichtig. Hier bietet bereits die RDF Query Language (RQL) viele hilfreiche Kurzschreibweisen, an die sich eRQL anlehnt. • Bereitstellung glaubwürdiger Metadaten, sodass den Anfrageergebnissen vertraut werden kann. Das Semantische Web ist ein verteiltes System, wobei keine Kontrolle auf die Datenquellen ausgeübt werden kann. Den Daten kann daher nicht ohne weiteres vertraut werden. Anders ist dies mit Metadaten, die von eigenen Systemen erzeugt wurden. Man weiß wie sie erzeugt wurden und kann ihnen entsprechend vertrauen. Wichtig ist eine klare Trennung zwischen den Daten und den Metadaten über diese, da sonst eine absichtliche Nachbildung der Metadaten von außen (Suchmaschinen-Spamming) das System unterlaufen kann. Für die Glaubwürdigkeit von Anfrageergebnissen sind vor allem die Herkunft der Daten und deren Aktualität entscheidend. In den umgesetzten Entwicklungen zu dieser Arbeit wurde sich daher auf diese Informationen konzentriert. In RDF-S3 wird die Verknüpfung der RDF-Aussage mit ihren Herkunftsdaten im Speichermodell abgebildet. Dies ermöglicht eine gezielte Ausnutzung dieser Daten in eRQL-Anfragen. Durch den sogenannten Dokumenten-Modus bietet eRQL die Möglichkeit Anfragen auf eine Gruppe von Quellen zu begrenzen oder bestimmte unglaubwürdige Quellen auszuschließen. Auch können die Herkunftsdaten das Anfrageergebniss erweitern und dadurch das Verständnis und die Glaubwürdigkeit für das Ergebnis erhöhen. • Anfrageergebnisse können um ihre Umgebung erweitert werden, sodass sie besser verstanden werden können. Für eRQL-Anfragen besteht die Möglichkeit die Umgebnung zu den Treffern (RDF-Aussagen) mit zu berücksichtigen und im Ergebnis mit anzuzeigen. Dies erhöht das Verständnis für die Ergebnisse. Weiterhin ergeben sich hierdurch neue Möglichkeiten wie das Auffinden von Pfaden zwischen Teilergebnissen einer Anfrage. • Unterstützung und Kombination von Daten- und Schemaanfragen. Mit eRQL werden beide Anfragetypen unterstützt und können sinnvoll miteinander kombiniert werden. Die Einbeziehung der Umgebung ermöglicht für die Kombination von Daten- und Schemaanfragen neue Möglichkeiten. Dabei werden sowohl Daten- als auch Schemaanfragen (oder deren Kombination) durch das Speichermodell von RDF-S3 optimal unterstützt. Weitere nennenswerte Eigenschaften von RDF-S3 und eRQL sind: • Durch die Möglichkeit gezielt einzelne Quellen wieder zu entfernen oder zu aktualisieren, bietet RDF-S3 eine gute Wartbarkeit der gespeicherten Daten. • RDF-S3 und eRQL sind zu 100 % in Java entwickelt, wodurch ihr Einsatz unabhängig vom Betriebssystem möglich ist. • Der Datenbankzugriff erfolgt über JDBC, wobei keine besonderen Eigenschaften für die verwendete RDBMS nötig sind . Dies sorgt für eine hohe Portabilität. RDF-S3 und eRQL wurden als Beispielimplementierungen entwickelt. Für einen produktiven Einsatz sollten die Systeme an die gegebene Hardware-Umgebung und Anwendungsfall angepasst werden. In Kapitel 6 werden Erweiterungen und Änderungsmöglichkeiten genannt, die je nach Situation geprüft werden sollten. Ein noch vorhandenes Problem für einen produktiven Einsatz auf großen Datenmengen ist die aufwendige Berechnung der Umgebungen für Anfrageergebnisse. Die Berechnung von Umgebungen im Vorhinein könnte hier eine Lösung sein, die jedoch durch die Möglichkeit der Einschränkung auf glaubwürdige Quellen erschwert wird.
Das Ziel dieser Arbeit ist es, Chronologie und Erscheinungsform volkssprachlicher Schriftzeugnisse zwischen ca. 750 und 1250 im fränkischen Gesamtreich, im ostfränkischen Reich, im entstehenden ‚Deutschen Reich‘, als Folge geistesgeschichtlichen und politischen Wandels in dieser Zeitspanne darzustellen. Explizite soll die disparate Erscheinungsform ‚deutscher‘, volkssprachlicher Texte als Folge sich wandelnder Ziele der Herrscher dargestellt werden: Zielsetzungen, die sich aus dem sich verändernden Weltbild und der sich verändernden politischen Lage ergeben und die das Handeln des Herrschers bestimmen. Anders gefragt: Welche politischen Gründe können fränkische und sächsische Könige und Kaiser im Mittelalter bewogen haben, die ‚deutsche‘ Volkssprache zu fördern und – steht das in Zusammenhang mit der jeweils gültigen Reichsideologie?
It is commonly agreed that cortical information processing is based on the electric discharges (spikes') of nerve cells. Evidence is accumulating which suggests that the temporal interaction among a large number of neurons can take place with high precision, indicating that the efficiency of cortical processing may depend crucially on the precise spike timing of many cells. This work focuses on two temporal properties of parallel spike trains that attracted growing interest in the recent years: In the first place, specific delays (phase offsets') between the firing times of two spike trains are investigated. In particular, it is studied whether small phase offsets can be identified with confidence between two spike trains that have the tendency to fire almost simultaneously. Second, the temporal relations between multiple spike trains are investigated on the basis of such small offsets between pairs of processes. Since the analysis of all delays among the firing activity of n neurons is extremely complex, a method is required with which this highly dimensional information can be collapsed in a straightforward manner such that the temporal interaction among a large number of neurons can be represented consistently in a single temporal map. Finally, a stochastic model is presented that provides a framework to integrate and explain the observed temporal relations that result from the previous analyses.
Die Blut-Hirn-Schranke macht das Gehirn zum streng kontrollierten extraterritorialen Raum. Die sensiblen Hirnfunktionen laufen unabhängig und ungestört von den vielfältigen Prozessen der anderen Organe ab. Neben den wichtigen Funktionen dieser Barriere hält sie jedoch auch nötige Medikamente von ihrem Wirkort, dem Gehirn, fern. Die in-vitro-BHS soll Mechanismen aufklären und Tierversuche ersetzen. In den letzten Jahren konnte so das Bild von einem statischen Computer, Gehirn, durch das Bild eines hoch plastischen Arbeitsspeicher-Netzwerkes mit verschiedensten Verbindungen ersetzt werden. Die vorliegende Arbeit ist ein zwei Bereiche gegliedert: 1. Transportstudien von Nanopartikeln und Substanzen im Transwell-System 2. Aufklärung von Transportmechanismen für Nanopartikel an der BHS Die Transportuntersuchungen erfolgten in einem Zwei-Kammer- Transwell-System. Dieses besteht aus zwei Kompartimenten, die zum einen das Blut-Kreislauf-System und zum anderen das Gehirn darstellen sollen. Diese Kompartimente sind durch eine Membran getrennt, auf welche Gehirn-Kapillar-Endothelzellen ausgebracht werden. Membran und ausgebrachte Zellen stellen die BHS dar. Der Transport von Nanopartikeln oder Substanzen wurde durch den Nachweis von Fluoreszenz im Medium der zwei Kompartimente nachgewiesen. Die fluoreszierenden Nanopartikel oder die fluoreszierende Substanz wurden in das obere Donor-Kompartiment gegeben und zu den Zeitpunkten 2, 4, 6 und 24 Stunden wird die Fluoreszenz in Donor- und Akzeptor-Kompartiment gemessen und beurteilt. Bei diesen Transportstudien konnte gezeigt werden, dass dieses System für den Nachweis von Nanopartikel-Transport ungeeignet ist. So benötigen die Nanopartikel zur Überwindung der Membran ohne Zelllayer schon über 24 Stunden. Die Menge der ankommenden Nanopartikel im Akzeptor-Kompartiment war sehr gering. Substanz-Transport und BHS-charakteristische Eigenschaften lassen sich in diesem Modell jedoch gut nachweisen. So konnte die Aktivität der Efflux-Pumpe PgP anhand des Transportes von Rhodamin, einem PgP-Substrat, belegt werden. Während der Transport von Rhodamin nach Zugabe des PgP-Substrates nur eingeschränkt beobachtbar war, konnte der Transport des Rhodamins vom Donor-Kompartiment in das Akzeptor-Kompartiment nach Zugabe des PgP-Hemmers Verapamil innerhalb 4 Stunden nachgewiesen werden. Auch die TEER-erhöhende Wirkung von Hydrokortisol und somit verbesserter Barriereeigenschaften der Zellschicht konnte an diesem Modell nachgewiesen werden. Zur Aufklärung des Mechanismus eines erfolgreichen Nanopartikel-Transports über die Blut-Hirn-Schranke wurde zunächst der rezeptor-vermittelte Transport über den LDL-Rezeptor untersucht. Der LDL-R ist ein Mitglied der LDL-R-Familie welche neben anderen Organen vermehrt in Gehirn und BHS lokalisiert sind. Als Ligand fungiert bei dieser Rezeptorfamilie und insbesondere bei dem LDL-R das ApoE. Mittels ApoE-modifizierter HSA-Nanopartikel sollte eine spezifische Bindung der Transportsysteme über den gebundenen Liganden ApoE an zielspezifische Transport-Mechanismen wie den LDL-R nachgewiesen werden. Über diesen könnten die Nanopartikel endocytiert und der Arzneistoff an seinen Wirkort gebracht werden. Untersuchungen zu diesem Transport-Mechanismus erfolgten in verschiedenen Arbeitsschritten. So wird erst eine Optimierung des LDL-R-Nachweises auf den Zellen durchgeführt. Eine Leberzelllinie wurde auf LDL-R hin untersucht und die Rezeptorkonzentration durch Mehrfachkultivierung der Zellen optimiert. Nach 2-tägiger Kultivierung in lipidfreiem Serum und dem zweimaligen Sorten der Zellen mit einem Antikörper gegen den LDL-Rezeptor konnte ein Nachweis des Rezeptors von 70-90% erreicht werden. Nächster Schritt war die Untersuchung der Bindung von ApoE-modifizierten Nanopartikeln an verschiedenen Zelllinien mit unterschiedlichem LDL-R-Nachweis, gefolgt von Untersuchungen zur Bindungsspezifität. In diesen Untersuchungen sollte die Spezifität dieser Bindung durch Präinkubationen mit einen Antikörper gegen die Liganden-Bindungsstelle und freiem ApoE nachgewiesen werden. Eine Bindung der ApoE-modifierten HSA-Nanopartikel konnte an Endothelzellen des Gehirns nachgewiesen werden. Sowohl die primär isolierten porcinen brain capillary endothelial cells (pBCEC), als auch die Maus-Gehirn-Endothelzelllinie bEnd3 wiesen eine prozentuale Bindung von ApoE-modifizierten Nanopartikeln von über 70% auf. Eine Bindung dieser Partikel an andere getestete Zelllinien mit BHS-Eigenschaften oder einem hohen Nachweis an LDL-R konnte nicht gezeigt werden. Eine Hemmung der Bindung von ApoEmodifizierten Nanopartikeln an Gehirn-Endothelzellen war nicht oder nur geringfügig möglich. So konnte durch eine Präinkubation mit dem Antikörper keine Reduktion der Bindung erreicht werden. Die Präinkubation mit freiem ApoE führte hingegen zu einer sehr geringen Erniedrigung der Bindungsaffinität der ApoE-modifizierten Nanopartikel. Zu beachten war hierbei noch die geringe nachweisbare Bindung von freiem ApoE an die Zellen. In Versuchen zur Bindung von freiem ApoE war eine prozentuale Bindung von freiem ApoE an die Zellen von nur etwa 20% nachweisbar. Bei einer solch geringen Bindung des freien Liganden kann also auch nicht von einer hohen Hemm-Wirkung ausgegangen werden. Es muß nach diesen Untersuchungen davon ausgegangen werden, dass ein ApoE- und Gehirn-Endothelzell-spezifischer Mechansimus am Transport von ApoEmodifizierten Nanopartikeln beteiligt ist. Der untersuchte LDL-R spielt hierbei keine oder nur eine sehr untergeordnete Rolle. Abschließend wurden noch Nanopartikel mit gebundenen ApoE-Mutanten auf ihre Bindung an Zellen getestet. Die modifizierten ApoE-Liganden unterschieden sich in dem Austausch von Aminosäuren in der Ligand-Bindunsdomäne. In Bindungsuntersuchungen konnte bei diesen ApoE-Varianten kein Unterschied in deren Affinität zu Zellen aufgezeigt werden. Dieser Austausch von Aminosäuren in der Liganden-Bindungsstelle hatte keinerlei Auswirkung auf deren Bindung an die Zellen, was wiederum für einen LDL-R unabhängigen Transport-Mechanismus spricht. Am Ende der vorliegenden Arbeit wurde noch ein alternativer Transport-Mechanismus untersucht. Das Heparansulfat-Proteoglykan (HSPG) als alternativer Mechansimus weist Heparin-Bindungsdomänen auf, die der LDL-R Bindungsdomäne sehr ähnlich sind und bekannterweise in der Lage sind, LDL-Partikel zu internalisiseren. Heparinase I kann die anionischen Heparansulfat-Seitenketten entfernen und somit den Internalisierungsmechanismus über das HSPG beeinträchtigen. Untersuchungen zum HSPG und eine Vorinkubation mit verschiedenen Konzentrationen an Heparinase I deuteten auf eine wichtige Rolle des HSPG im Bindungs- und Internalisierungsmechanismus für ApoE-PEG-HSA-NP hin. Die Affinität der ApoE- modifizierten Nanopartikel konnte durch einen Heparinase-Enzymverdau deutlich erniedrigt werden. Auch führte der Einsatz unterschiedlicher Heparinase I-Konzentrationen zu der Annahme, dass es sich um eine konzentrationsabhängige Beeinträchtigung des Mechanimus handelte. So erreichten 10 Units/ml eine weitaus größere Hemmung der ApoE-PEG-HSA-NP-Bindung als Konzentrationen von 2-5 Units/ml. Strukturelle Ähnlichkeiten des ApoEs mit zellpenetrierenden Peptiden sprechen dafür, dass neben dem HSPG noch andere Translokationsmechanismen von Bedeutung sein könnten.
Reinigung, biochemische Charakterisierung und Struktur der A1AO-ATPase aus Methanococcus jannaschii
(2006)
Die A1AO-ATPase wurde aus Membranen von M. jannaschii unter Erhalt der Struktur isoliert. Das Enzym wurde durch eine Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation, eine Anionenaustauschchromato-graphie an DEAE und eine Gelfiltration zur Homogenität gereinigt. Alle 9 aus der Operon-Struktur vorhergesagten Untereinheiten konnten mittels Western-Blot-Analyse oder einer N-terminalen Sequenzierung identifiziert werden. Die funktionelle Kopplung der A1- und AO-Domäne wurde durch Studien mit dem Inhibitor DCCD nachgewiesen. Das gereinigte Enzym hatte eine Masse von 670 kDa. Die ATP-Hydrolyseaktivität war bei einer Temperatur von 80°C und einem pH-Wert von 6 optimal. Der KM-Wert für MgATP wurde zu 1,2±0,2 mM bestimmt. Bei den Versuchen zur Entwicklung eines Na+-freien Tespuffers trat die strikte Abhängikeit des Enzyms von Hydrogensulfit oder Sulfit als Problem zu Tage. Aus Membranen von M. jannaschii wurden durch Chloroform/Methanol Lipide extrahiert, aus denen dann Liposomen hergestellt wurden. Die A1AO-ATPase aus M. jannaschii wurde in diese Liposomen erfolgreich rekonstituiert, eine ATP-Synthese konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. Die elektronenmikroskopischen Analysen zeigten einen für ATPasen charakteristischen Aufbau, aus einer hydrophilen Domäne, die durch mindestens zwei Stiele mit der Membrandomäne verbunden ist. Anhand der Bildrekonstruktion von 17.238 Einzelpartikeln konnten zwei Klassen von ATPase-Molekülen unterschieden werden, die entweder über einen oder zwei periphere Stiele verfügten. Aus verschiedenen Einzelprojektionen wurden Summenbilder generiert, anhand dieser 2D- Rekonstruktion wurde die ATPase vermessen. Der Kopfteil, die Membrandomäne und der zentrale Stiel haben eine Größe von 11,5 x 9,4 nm, 10,6 x 6,4 nm und 8 x 3,9 nm (Länge x Breite). Die Gesamtlänge des Enzyms betrug 25,9 nm. Der zentrale Stiel der ATPase ist über der Membran von einer Kragen-ähnlichen Struktur umgeben, die wiederum mit den peripheren Stielen in Kontakt steht. Scheinbar steht nur einer der peripheren Stiele in direktem Kontakt mit der AO-Domäne. Die Überlagerung der 3D-Rekonstruktion eines A1-Subkomplexes aus Methanosarcina mazei mit der 2D-Rekonstruktion der A1AO-ATPase aus M. jannaschii zeigen deutlich, dass die peripheren Stiele mit dem oberen Ende der A1-Domäne in Kontakt stehen. Durch diese Analysen konnte erstmals die Struktur einer A1AO-ATPase mit einer Auflösung von 1,8 nm dargestellt werden. Sequenzanalysen haben gezeigt, dass das Proteolipid-Gen von Methanopyrus kandleri verdreizehnfacht ist. Das Gen wurde mittels PCR vervielfacht und in einen TOPO®-Vektor kloniert. Versuche das Gen in einen Expressionsvektor umzuklonieren, waren noch nicht erfolgreich.
Die vorliegende prospektive Studie untersucht 66 retrograde und 4 antegrade geschlossene Marknagelungen bei Humerusschaftfrakturen mit einem ab dem 22. Patienten modifizierten Russell-Taylor-Nagel in einem Untersuchungszeitraum von 5 Jahren (1995 bis 2000). Behandelt wurden 52 frische Verletzungen, davon 2 offene Frakturen, 17 pathologische Frakturen und eine verzögerte Knochenbruchheilung. Nach der AO-Klassifikation waren außer C2 und C3 Frakturen alle Frakturtypen vertreten. Das durchschnittliche Patientenalter betrug 54 Jahre. Als schwerwiegendste intraoperative Komplikation sahen wir in 4 Fällen (5,7%) eine iatrogene Humerusfraktur, die eine zusätzliche Plattenosteosynthese erforderte. 6 distale Fissuren bedurften keiner weiteren Therapie. Eine posttraumatische Osteitis trat in keinem Fall auf. Ein Verfahrenswechsel war nicht notwendig. Bei 88% der Patienten ergab sich nach einem Jahr ein Punktestand von gut oder sehr gut nach dem Score nach Kwasny, wo neben der klinischen und radiologischen Untersuchung auch subjektive Befunde und die Kosmetik miteinbezogen wurden. Zusammenfassend beurteilen wir den von retrograd eingebrachten Russell-Taylor-Nagel mit seiner von uns vorgenommenen Modifizierung als ein geeignetes Implantat zur Stabilisierung von Humerusschaftfrakturen. Wesentliche Komplikationen des Verfahrens können unter Beachtung bestimmter technischer Regeln vermieden werden.
Der mitochondriale Apoptose-Signalübertragungsweg spielt nicht nur bei der Death Rezeptor-induzierten Apoptose in Typ II-Zellen eine Rolle, sondern z.B. auch bei Bestrahlung und Behandlung mit Chemotherapeutika. Über Cytochrom-c Freisetzung, Apoptosombildung und Caspase-9 Aktivierung kommt es zur Spaltung und Aktivierung der Effektorcaspase-3. Die durch Bindung von dATP und zytosolischem Cyt-c induzierte Konformationsänderung von APAF-1 führt nach anschließender ATP-Hydrolyse zur Oligomerisierung von insgesamt sieben APAF-1-Molekülen unter gleichzeitiger Rekrutierung von Caspase-9 über die in beiden Molekülen vorhandene N-terminale Caspase-Rekrutierungsdomänen (CARD). Es entsteht der so genannte Apoptosomkomplex. Die autoproteolytische Prozessierung und Aktivierung von Caspase-9 mit anschließender Spaltung von Caspase-3 im Apoptosomkomplex führt zum Auslösen der apoptotischen Caspasekaskade und zur Spaltung wichtige zellulärer Substrate. Eine wichtige Rolle bei der Regulation der Apoptosom-vermittelten Caspase-9-Aktivierung spielen u.a. die Mitglieder der Bcl-2 Proteinfamilie, die IAPs und Hitzeschockproteine. Die Blockade des intrinsischen Apoptose-Signalübertragungsweges führt in Tumoren zur Resistenzentwicklung gegenüber Chemo- und Strahlentherapie. Deshalb wurde mit Hilfe des Hefe-Two-Hybrid Systems ein Screen nach neuen regulatorischen Proteinen, die an der Apoptosomkomplex-Bildung beteiligt sind, durchgeführt und dabei ein neuer APAF-1 Interaktionspartner entdeckt, den wir CABY („CED-4 and APAF-1 binding protein found in yeast“) genannt haben. CABY ist ein 160 Aminosäuren großes, pro-apoptotisches Protein, das eine so genannte DUF59 Domäne enthält, für die bisher noch keine Funktion beschrieben wurde. Es konnte nachgewiesen werden, daß CABY ein evolutionär hoch konserviertes Protein darstellt und daß die humane CABY cDNA zwei alternative Translations-Initiationsregionen enthält, die zu der Expression der CABYL bzw. der um 32 Aminosäuren verkürzten CABYS Isoformen führen. Im Rahmen dieser Arbeit sollte darüber hinaus eine detaillierte molekulare und funktionelle Analyse von CABY durchgeführt werden. Als Hilfsmittel für die molekularbiologische Analyse wurden sowohl CABY-spezifische polyklonale Antiseren als auch Hybridoma-Zelllinien hergestellt, die monoklonale anti-CABY Antikörper produzieren. Mit biochemischen Untersuchungen wie in vitro GST Pulldown und in vivo Ko-Immunpräzipitationsexperimenten, sowie durch Ko-Lokalisationsstudien mit überexprimierten und endogenen Proteinmengen konnte die Bindung von CABY an APAF-1 verifiziert werden. Mit Hilfe von APAF-1-Deletionsmutanten wurden die Aminosäuren 412-420 der zentralen Linkerdomäne als verantwortlicher Bereich für die Interaktion mit CABY identifiziert. Interessanterweise bindet CABY in vitro zusätzlich sowohl an die N-terminale CARD Domäne von APAF-1 als auch an Pro-Caspase-9. Ko-Immunpräzipitationsexperimente mit endogenen Proteinen konnten zeigen, daß CABY in gesunden Zellen nicht nur mit dem vollständigen APAF-1 Protein, sondern auch mit der verkürzten 84 kDa großen APAF-1-Isoform in einem Komplex assoziiert vorliegt. Zudem konnte nachgewiesen werden, daß CABY-Proteine homophile Interaktionen eingehen und Dimere ausbilden können. Neben den Untersuchungen zur Interaktion von CABY mit APAF-1 wurden auch funktionelle Analysen mit Hilfe dominant negativer CABY Deletionsmutanten sowie mit siRNA Zellkulturexperimenten durchgeführt, um die Bedeutung von CABY für den intrinsischen mitochondrialen Apoptose Signalübertragungsweg untersuchen zu können. Es wurde festgestellt, daß bei Überexpression von CABY die Zellen für Mitomycin C-induzierte Apoptose sensitisiert werden. Die Überexpression einer C-terminal um 20 Aminosäuren deletierten CABY Mutante wie auch der N-terminal verkürzten CABYS Isoform inhibieren jedoch Mitomycin C-induzierte Apoptose. Die Ergebnisse aus CABY siRNA-Knockdown-Experimenten lassen vermuten, daß CABY-ähnliche funktionell redundante Proteine existieren. In den mit CABY siRNA stabil transfizierten K562- und RKO-Zelllinien konnte festgestellt werden, daß der Verlust endogener CABY-Expression in diesen Zelllinien nur einen geringen Einfluss auf das Apoptoseverhalten ausübt, und zwar unabhängig von der Art des eingesetzten apoptotischen Stimulus. Einen Hinweis auf einen möglichen kompensatorischen Mechanismus liefert die Existenz des ribosomalen Proteins S28e, dessen DUF59-Domäne zu über 90% identisch ist mit der CABY-DUF59-Domäne. S28e könnte potentiell CABY-Funktionen ausüben. Ausgehend von mit der pro-apoptotischen Funktion von CABY wurde nach Tumortypen gesucht, in denen die CABY-Expression im Vergleich zum Normalgewebe signifikant herunterreguliert wird. Die Analyse endogener CABY Expressionsmengen in humanen Tumoren konnte dabei einen Verlust an CABY Expression in GIST-Tumoren nachweisen. Dieses Ergebnis weist auf eine mögliche Rolle von CABY als Tumorsuppressorprotein hin.
Das Ziel dieser Arbeit war, Unterschiede bezüglich der Körperbautypen an Elitekarateka zu eruieren. Hierzu wurden die Konstitutionstypologien nach Conrad, Knußmann, Parnell sowie Heath und Carter, Proportionsfiguren, und das Phantom stratagem verwendet, ebenso wie die Hautfettfalten-Dickenmessungen, die Bioelektrische-Impedanz-Analyse (BIA) und der Body-Mass-Index (BMI). Unter der Annahme Großmeisters Funakoshis, dass es durch ständiges Karatetraining zu körperbaulichen Konstitutionstypusänderungen kommt, wurde diese sportanthropologische Studie durchgeführt. Es sollte geklärt werden, ob innerhalb der Karatewettkampfdisziplinen Kata und Kumite unterschiedliche Körperbautypen, unter Einbeziehung des Sexualdimorphismus, zu finden sind. Die 80 untersuchten männlichen und weiblichen Karateka kamen aus den Disziplinen Kata (Schattenboxen) und Kumite (Freikampf). Im Vergleich dazu wurden 62 und 66 Breitensportkarateka als Kontrollgruppe gegenübergestellt. Das Vergleichskollektiv wurde aus zwei Fitnessstudios rekrutiert, in denen die Probanden 2 - 4 mal pro Woche trainierten. Die Messungen wurden unter standardisierten Bedingungen vom Verfasser dieser Arbeit (und einer Kollegin) durchgeführt. Die Ergebnisse wurden statistisch geprüft. Die Konstitutionstypognosen von Conrad, die durch die Betrachtungen der Somatocharts von Parnell bzw. Heath und Carter bestätigt wurden, zeigten Unterschiede der Leistungssportler gegenüber den Kontrollgruppen. Demnach ist der typische Kata- und Kumiteathlet kleiner und wiegt weniger als die Sportler des Vergleichskollektivs der Fitnessprobanden. Er ist athletischer gebaut und weist ein günstiges Verhältnis von aktiver und passiver Körpermasse auf. Des Weiteren sind innerhalb der Karatedisziplinen die Katasportler endomorpher als ihre Kollegen. Die Kumiteathleten nehmen mehr ektomorphe Positionen in den Somatocharts (Parnell, Heath und Carter) ein. Anhand der Ergebnisse lässt sich die ursprüngliche Vermutung Funakoshis nach differenzierten Konstitutionstypen sowohl für die beiden Untersuchungskollektive als auch innerhalb des Karate für die Wettkampfdisziplinen Kata und Kumite bestätigen. Die vorliegende Studie lässt den Schluss zu, dass es sowohl den Kata- als auch den Kumite-Konstitutionstypus im Karate gibt. Weiterer Forschungsbedarf besteht hinsichtlich longitudinaler Datenerhebungen des Konstitutionswandels jugendlicher Karateka im Laufe ihrer Wettkampfkarriere. Die Karriere beeinflussende Faktoren wie Trainingshäufigkeit, „Trainingsalter“ und Verletzungshäufigkeit, bezogen auf das Leistungsniveau, lassen Spielraum für weiterführende Untersuchungen. Dies gilt auch für eventuelle ethnische Körperbauunterschiede und das Leistungsniveau der Athleten.
Ca2+-aktivierte Kaliumkanäle mit großer Leitfähigkeit (MaxiK oder BK Kanäle) sind als Schlüsselelemente an der Regulation der elektrischen Aktivität vieler erregbarer Zellen beteiligt. Die duale Steuerung dieser Kanäle durch die intrazelluläre Kalziumkonzentration und das Membranpotential macht MaxiK Kanäle zu effektiven Integratoren multipler zellulärer Signalprozesse. Der MaxiK Kanal der glatten Gefäßmuskulatur ist entscheidend an der Repolarisierung von glatten Muskelzellen und der Terminierung des Kalziumeinstromes während der Vasokonstriktion beteiligt. Zahlreiche Arbeiten, u.a. an b1-Knock-out Mäusen (Brenner et al., 2000b) und humanen genetischen Variationen des b1-Gens (Amberg & Santana, 2003) belegen die wichtige Rolle des MaxiK Kanals für die Kontrolle des systemischen Blutdruckes in Säugern, einschließlich des Menschen (Nelson & Bonev, 2004; Amberg et al., 2003). Aktivierung des vaskulären MaxiK Kanals könnte somit ein neues therapeutisches Prinzip zur Behandlung des Bluthochdrucks und seiner Folgeerkrankungen darstellen. Als pharmakologische Zielstruktur besonders interessant wird der vaskuläre MaxiK Kanal durch seine gewebespezifische Zusammensetzung aus a- und b1-Untereinheit und die Möglichkeit diese Kombination selektiv zu aktivieren (Tanaka et al., 1997; McManus et al., 1993). In der vorliegenden Arbeit wurde ein induzierbares Zellmodell charakterisiert, welches die MaxiKa und -b1 Untereinheiten bicistronisch unter der Kontrolle eines Tetrazyklin-sensitiven Promotors exprimierte. Die Untersuchungen ergaben, dass in diesem System funktionelle MaxiK Kanäle, die sich äquivalent zu nativen vaskulären MaxiK Kanälen verhielten, detektiert werden konnten. Im Vergleich zu anderen heterologen Expressionsmodellen zeichneten sich die induzierbaren Zelllinien durch eine große Stabilität und Reproduzierbarkeit der MaxiK Expression aus. Beide Eigenschaften sind wichtige Voraussetzungen für den Einsatz dieser Zelllinien im Hochdurchsatz-Screening zur Identifizierung neuer MaxiK Aktivatoren. Die Nutzbarkeit dieses Testsystems zur Identifizierung von solchen Verbindungen wurde weiterhin durch die Untersuchung bekannter und neuer aktivierender Substanzen bestätigt. Dabei zeigte sich, dass insbesondere das Benzimidazolon CGS7181 sowie das Dehydroabietinderivat Pimarinsäure den Kanal potent aktivierten. Durch fluorimetrische Kalziummessungen konnte nachgewiesen werden, dass CGS7181 neben MaxiK-aktivierenden Eigenschaften auch einen potenten Ionophor für Ca2+ darstellt und damit wahrscheinlich keinen vielversprechenden Ausgangspunkt für die Entwicklung eines neuen Antihypertensivums darstellt. Unter Benutzung der CHO-Trex-MaxiK-a+b1-Zelllinie wurden inzwischen in der Screening- Abteilung von Sanofi-Aventis im Hochdurchsatzverfahren über 700 Strukturen mit aktivierender Wirkung auf den MaxiK Kanal identifiziert. Mit diesem Ergebnis ist eine solide Grundlage geschaffen, um im weiteren Verlauf des Projektes die Suche nach neuen blutdrucksenkenden Molekülen erfolgreich voranzutreiben. Zur weiteren molekularen Validierung der Zielstruktur MaxiK wurde eine bisher nicht beschriebene Spleißvariante, aDS8, die auch in kardiovaskulären Geweben exprimiert ist, untersucht. Die transiente Expression in HEK293-Zellen führte zu signifikanten, aber im Vergleich zum MaxiK-a-wt geringen Kaliumströmen. Immunfluoreszenz-Experimente zeigten eine Retention des Proteins im Zellinneren, ohne dass eine Translokation in die Plasmamembran oder in distinkte Kompartimente gezeigt werden konnte. Dies galt auch für die Expression in primären Glattmuskelzellen und der Endothelzelllinie EAhy926. Eine Beteiligung der S8-Domäne an der Assemblierung der neuen Spleißvariante konnte durch den biochemischen Nachweis von aDS8-Homomultimeren ausgeschlossen werden. Überraschenderweise wurde jedoch keine Interaktion von MaxiK-aDS8 und der Wildtyp-a-Untereinheit beobachtet. Man kann daher vermuten, dass die S8-Domäne eine Rolle beim Kanaltransport spielt und möglicherweise in distinkten Zelltypen eine Wechselwirkungsfläche für bislang unbekannte Interaktionspartner bildet.
Die Herstellung von Poly(butylcyanoacrylat)-Nanopartikeln (PBCA-NP) ist seit fast 25 Jahren bekannt. Sie erfolgt meist durch anionische Emulsionspolymerisation von Butylcyanoacrylat unter Verwendung von Dextran 70.000 als Stabilisator. Vereinzelt wurde in früheren Arbeiten bereits Pluronic® F68 als Emulgator für die Polymerisationsreaktion verwendet. Diese Arbeit hat ihren Schwerpunkt in der Herstellung von PBCA-NP mit F68 als Stabilisator. Es konnte gezeigt werden, dass sich mit diesem Hilfsstoff ebenfalls nanopartikuläre Trägersysteme reproduzierbar und im gewünschten Größenbereich um 200 nm herstellen lassen. Diese Partikel besitzen im Gegensatz zu Dextran-stabilisierten NP eine sehr enge Größenverteilung. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die hergestellten NP im Bezug auf ihr Molekulargewicht und ihre Dichte charakterisiert. Ein Partikel besitzt die Masse von ca. 2,5 * 109 Dalton und hat eine Dichte von etwa 1,148 g/cm³. Bei einem PBCA-Nanopartikel handelt es sich jedoch nicht um ein Riesenmolekül, vielmehr wird er durch Agglomeration von relativ kurzen Polymerketten gebildet. Ein Partikel besteht aus ca. einer Million Polymerketten, welche ein Molekulargewicht von ca. 2500 g/mol besitzen. Der Einfluss der Herstellungsparameter auf leere und arzneistoffbeladene Partikel wurde untersucht. Die Partikel wurden hierbei durch die Parameter Partikelgröße, Polydispersität, Partikelausbeute, Zetapotential und Molekulargewicht charakterisiert. Neben der Herstellung durch anionische Emulsionspolymerisation wurden NP durch radikalische Emulsionspolymerisation und Nanopräzipitation erhalten. Auch unter Verwendung dieser Verfahren wurden Trägersysteme im gewohnten Größenbereich um 200 nm gebildet. Zusätzlich zur Herstellung von NP hat sich diese Arbeit auch mit den Charakterisierungsmethoden für kleinpartikuläre Arzneiformen auseinandergesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass die häufig angewendete dynamische Lichtstreuung ein geeignetes Verfahren zur Ermittlung des mittleren Partikeldurchmessers darstellt. Die Ergebnisse dieser Methode stimmen weitgehend mit den Resultaten der zusätzlich verwendeten mikroskopischen Verfahren und der analytischen Ultrazentrifugation überein. Der Einsatz der analytischen Ultrazentrifugation lieferte die best aufgelöste Partikelgrößenverteilung und ermöglichte darüber hinaus die Bestimmung der Dichte der Partikel. Neben der mittleren Größe der Trägersysteme wurde auch das mittlere Molekulargewicht der gebildeten Polymerketten bestimmt. Die hierfür als Standard eingesetzte Gel-Permeations-Chromatographie wurde mit einem relativ neuen Verfahren, der MALDI TOF Massenspektrometrie verglichen. Beide Verfahren lieferten ein zahlenmittleres Molekulargewicht der Polymerketten von 2500 – 3000 Da. Lediglich im Bezug auf das gewichtsmittlere Molekulargewicht zeigten sich größere Unterschiede zwischen beiden Messverfahren, welche jedoch auf das zugrunde liegende Messprinzip und nicht auf das untersuchte PBCA zurückzuführen sind. Mit Hilfe der Massenspektrometrie konnte die chemische Struktur der Polymerketten näher aufgeklärt werden. Neben den Produkten des seit langem postulierten Reaktionsmechanismus finden sich Derivate des Polymers, welche formal durch Abspaltung bzw. Anlagerung von Formaldehyd entstehen. Die Menge an frei vorliegendem Formaldehyd scheint jedoch so gering zu sein, dass sie kaum die Hauptursache für die relative Toxizität der PACA-NP darstellen kann. Darüber hinaus ist es möglich, durch Wahl der Reaktionsbedingungen die Bildung von Derivaten des Ursprungspolymers und von Formaldehyd zu minimieren. Die Ergebnisse in der Herstellung und Charakterisierung von leeren Pluronic® F68-stabilisierten PBCA-NP ließen die Verwendung von Doxorubicin-beladenen NP unter Verwendung dieses Stabilisators für die Gehirntumor-Therapie viel versprechend erscheinen. Die hergestellten Nanopartikel zeigten eine im Vergleich zu Dextran-stabilisierten Doxorubicin-NP signifikant niedrigere Arzneistoffbeladung. Die dessen ungeachtet durchgeführte experimentelle Chemotherapie an Glioblastom-tragenden Ratten lieferte jedoch ermutigende Ergebnisse. Die neu entwickelte Zubereitung führte zu einem vergleichbaren Prozentsatz an Remissionen wie die bisherige Standard-PBCA-Formulierung. Die F68-stabilisierte Formulierung und die bisherige Standard-Formulierung mit Polysorbat 80 zeigten nach Inkubation mit humanem Plasma ein vergleichbares Adsorptionsmuster an Plasmaproteinen. Auf Basis der vorangegangenen Studien und dieser Arbeit erscheint es möglich, eine potente nanopartikuläre Doxorubicin-Zubereitung zu entwickeln, welche ausreichend charakterisiert ist, um ihre Anwendung am Menschen zu vertreten.
Tourismus in Pakistan : Darstellung, Stellenwert und Perspektiven aus entwicklungspolitischer Sicht
(2006)
Die Dissertation mit dem Titel „Zwischen Inter- und Transnationalismus: Die Kommunikationspolitik der UNESCO nach 1989/1990“ von Sami Rabieh widmet sich dem Wandel in der UNESCO-Kommunikationspolitik seit dem Ende des Ost-West Konflikts, um zu klären, welche demokratisierenden Gestaltungspotenziale eine auf die Organisation gerichtete Kommunikationspolitik bietet und welche anderen Pfade gegebenenfalls noch darüber hinaus beschritten werden müssen. Aufbauend auf v.a. gramscianischen Theoriesträngen werden zunächst aktuelle soziale Transformationsprozesse („Globalisierung“) als Interpretationsrahmen für die Analyse der UNESCO dargestellt. Dem folgt eine historische Aufarbeitung der internationalen Kommunikationspolitik bzw. der UNESCO bis 1989/1990 sowie ein empirischer Teil, der die Entwicklung der Organisation im Politikfeld bis in die Gegenwart untersucht. Eine Synopse und Erörterung alternativer Handlungsoptionen schließen die Arbeit ab. Zusammengenommen erweist sich die Eingangsthese zur Herausbildung eines transnationalen Systems und die damit verbundene Skepsis bezüglich der Demokratisierungspotentiale inter-staatlicher Apparate als korrekt. Die politische Form und Praxis der UNESCO, in der ausschließlich Staatenvertreter zu Kommunikationsprozessen und Entscheidungen fähig und befugt sind, hat im Internetzeitalter keine Grundlage mehr und wird wegen neuer politischer Terrains sowie der Beliebtheit amerikanischer Pop- und Cyberkulturen kein „comeback“ mehr erleben. Emanzipatorische Strategien sollten sich deshalb auf eine basisdemokratische Vernetzung mittels neuer Medien konzentrieren.
Die moderne Biochemie ist eine Wissenschaft, die sich im Wandel befindet. Während die bisherige Forschung sehr stark experimentell geprägt ist, existiert eine theoretische Biologie, analog zur theoretischen Chemie, nur in Ansätzen. Trotzdem wandelt sich auch diese Wissenschaft hin zu einer stärkeren Einbindung theoretischer Ansätze. Der Grund hierfür liegt in der Betrachtung von zunehmend komplexeren Systemen. So beschäftigt man sich in der Systembiologie, einem Teilbereich der Biochemie, unter anderem mit der Aufklärung komplexer Reaktionsnetzwerke. Während Ausschnitte dieser Netzwerke weiterhin experimentell aufgeklärt und verstanden werden, lässt sich das zusammenhängende Bild zunehmend nur noch durch eine theoretisch geprägte Modellbildung fassen. Darüber hinaus zeigen neuere Forschungsergebnisse die Bedeutung der Tatsache, dass Moleküle, Zellen und Zellhaufen, also wichtige Forschungsubjekte der Biochmie, dreidimensionale Gebilde sind – eine Tatsache, die bei der Modellbildung berücksichtigt werden muss. Eine Antwort auf die genannten Herausforderungen ist der konzertierte Einsatz von Simulation und Visualisierung als Mittel des Erkenntnisgewinns. Damit ist die Informatik gefordert entsprechende dedizierte Werkzeuge zu entwickeln, die Simulation, Visualisierung und Interaktion im Kontext des von der Anwendungsdisziplin gesetzten räumlich-zeitlichen Problemkreises miteinander verbinden. In dieser Arbeit wird ein integriertes Konzept zu Simulation, Interaktivität und Visualisierung vorgelegt, das auf einer Anforderungsanalyse in Bezug auf Anforderungen an die Simulation und Anforderungen an die Interaktivität und Visualisierung basiert. Zur Lösung der aufgeworfenen Probleme wird ein „Baukastensystem“ auf Basis von Multi-Agenten-Systemen vorgeschlagen. Die Auswahl des geeigneten Simulationsverfahrens, z. B. die Auswahl eines stochastischen Verfahrens gegenüber einem deterministischen Verfahrens, wird so zur Auswahl eines Bausteins, wobei gezeigt wird, wie z. B. mit Hilfe von Regeln die Auswahl auch automatisiert werden kann. Ebenso wird gezeigt, wie man „Baussteine“ auch im räumlichen Sinne verstehen kann, als Dinge, die in einem dreidimensionalen Kontext einen bestimmten Raum einnehmen und die, in ihrer Gesamtheit betrachtet, den Beobachtungsraum der Simulation ausfüllen. Diese Bausteine finden sich entsprechend ebenfalls im Kontext der Interaktion wieder. Ein wichtiger Aspekt in diesem Baukastenkonzept ist die Frage der Kommunikationsstruktur und des Kommunikationsprotokolls, für den ein Vorschlag erarbeitet wird. Das entwickelte Gesamtkonzept besteht aus zwei Teilen: Einem Konzept für Ein- und Ausgabegeräte mit einer gemeinsamen Metapher, die die Geräte logisch in den Anwendungskontext einbettet und einem Simulations- und Visualisierungskonzept auf der Basis der Kopplung heterogener intelligenter Agenten in eine gemeinsame Simulationsumgebung. Hierfür wurde ein spezieller Dialekt einer Agentenkommunikationssprache entwickelt, der dabei insbesondere den Aspekt der dreidimensionalen Visualierung einer solchen Simulation berücksichtigt.
Diese längsschnittliche Fragebogenstudie soll einen Beitrag zur Erforschung des Konzeptes Kundenorientierung im Kontext der arbeitsbezogenen Stressforschung leisten. Kundenorientierung wurde in der Vergangenheit vorwiegend von der betriebswirtschaftlichen Seite betrachtet und empirisch häufig im Zusammenhang mit Kundenzufriedenheit untersucht. In organisationspsychologischen Stressstudien wurde das Thema Kundenorientierung nur unzureichend berücksichtigt. Darüber hinaus bestehen Unklarheiten in der Definition des Konzeptes. Die hier vorliegende Untersuchung betrachtet Kundenorientierung als Rollenübernahme im Sinne einer positiven Einstellung zu bzw. Identifikation mit dem Berufsbild des Dienstleisters. Zur Konstruktvalidierung von Kundenorientierung wurden verschiedene organisations-, arbeitsplatz- und personenbezogene Antezedenzen formuliert. Die vorgebrachten Hypothesen konnten anhand des querschnittlichen Datensatzes (N=1571t1 / N=1180t2) überwiegend empirisch bestätigt werden. Es konnte gezeigt werden, dass Kundenorientierung ein heterogenes Konstrukt ist und verschiedene Antezedenzen vorliegen, die in einem bedeutsamen Zusammenhang zur Kundenorientierung stehen. Um die Bedeutung von Kundenorientierung als persönliche interne Ressource herauszuarbeiten, wurde sowohl der direkte als auch der indirekte bzw. moderierende Wirkungsmechanismus von Kundenorientierung auf das Wohlbefinden untersucht. Als Kriterium diente Burnout, mit den drei Dimensionen der Emotionalen Erschöpfung, Depersonalisation und Persönlichen Leistungsfähigkeit. Zur Überprüfung der moderierenden und indirekten Effekte wurde der Stressor Emotionale Dissonanz eingesetzt. Zur Überprüfung dieser Effekte wurde der längsschnittliche Datensatz (597 Dienstleister aus vier von ursprünglich sechs verschiedenen Organisationen wurden nach 12-18 Monaten erneut befragt) herangezogen. In den durchgeführten moderierten Regressionsberechnungen erwies sich Kundenorientierung als bedeutsamer Moderator, der in der Lage ist, die positive Beziehung zwischen dem Stressor Emotionale Dissonanz und den Burnout-Dimensionen abzupuffern. Die Effekte konnten sowohl im Querschnitt als auch im Längsschnitt gezeigt werden. Eine Moderatorwirkung von Kundenorientierung im Zusammenhang mit dem Konzept der Persönlichen Leistungsfähigkeit konnte dagegen nicht nachgewiesen werden. Mit Hilfe von Strukturgleichungsmodellen wurde die Wirkungsrichtung zwischen Kundenorientierung, Emotionaler Dissonanz und der Stressreaktion Burnout untersucht. Bei der multivariaten Kausalanalyse gelangte das LISREL-Verfahren zur Anwendung, wobei verschiedene Modelle bezüglich ihrer Angemessenheit überprüft wurden. Die Befunde zu den direkten Effekten bestätigen die hier postulierte Hypothese, dass Kundenorientierung den Charakter einer internen Ressource hat und zur Verbesserung des Wohlbefindens beiträgt. Gleichzeitig zeigten aber nur die Modelle einen guten bzw. besseren Fit, bei denen auch der umgekehrte Kausaleffekt von der abhängigen auf die unabhängige Variable freigesetzt wurde. Der stärkste direkte Zusammenhang besteht dabei zwischen Kundenorientierung und der Variable der Persönlichen Leistungsfähigkeit. Bei der Untersuchung der indirekten Effekte konnte gezeigt werden, dass zwischen Emotionaler Dissonanz und Kundenorientierung keine direkte signifikante Beziehung vorliegt. Dagegen erwies sich Emotionale Dissonanz als bedeutsamer Stressor für Emotionale Erschöpfung und Depersonalisation, wobei in gleicher Weise wie bei der Kundenorientierung nur Modelle, die auch gleichzeitig den umgekehrten Kausaleffekt modellierten, einen guten Fit erkennen ließen. Daraus kann gefolgert werden, dass gegenseitige Effekte zwischen den Konstrukten bestehen und Rückkopplungsschleifen die beste Erklärung für das Wirkungsgefüge der untersuchten Variablen darstellen. Abschließend werden die Ergebnisse hinsichtlich ihrer Einordnung in theoretische Zusammenhänge und ihrer praktischen Konsequenzen diskutiert.
Analyse von Heuristiken
(2006)
Heuristiken treten insbesondere im Zusammenhang mit Optimierungsproblemen in Erscheinung, bei solchen Problemen also, bei denen nicht nur eine Lösung zu finden ist, sondern unter mehreren möglichen Lösungen eine in einem objektiven Sinne beste Lösung ausfindig gemacht werden soll. Beim Problem kürzester Superstrings werden Heuristiken herangezogen, da mit exakten Algorithmen in Anbetracht der APX-Vollständigkeit des Problems nicht zu rechnen ist. Gegeben ist eine Menge S von Strings. Gesucht ist ein String s, so dass jeder String aus S Teilstring von s ist. Die Länge von s ist dabei zu minimieren. Die prominenteste Heuristik für das Problem kürzester Superstrings ist die Greedy-Heuristik, deren Approximationsfaktor derzeit jedoch nur unzureichend beschränkt werden kann. Es wird vermutet (die sogenannte Greedy-Conjecture), dass der Approximationsfaktor genau 2 beträgt, bewiesen werden kann aber nur, dass er nicht unter 2 und nicht über 3,5 liegt. Die Greedy-Conjecture ist das zentrale Thema des zweiten Kapitels. Die erzielten Ergebnisse sind im Wesentlichen: * Durch die Betrachtung von Greedyordnungen können bedingte lineare Ungleichungen nutzbar gemacht werden. Dieser Ansatz ermöglicht den Einsatz linearer Programmierung zum Auffinden interessanter Instanzen und eine Vertiefung des Verständnisses solcher schwerer Instanzen. Dieser Ansatz wird eingeführt und eine Interpretation des dualen Problems wird dargestellt. * Für die nichttriviale, große Teilklasse der bilinearen Greedyordnungen wird gezeigt, dass die Länge des von der Greedy-Heuristik gefundenen Superstrings und die des optimalen Superstrings sich höchstens um die Größe einer optimalen Kreisüberdeckung der Strings unterscheiden. Da eine optimale Kreisüberdeckung einer Menge von Strings stets höchstens so groß ist wie ein optimaler Superstring (man schließe einen Superstring zu einem einzelnen Kreis), ist das erzielte Ergebnis für die betrachtete Teilklasse der Greedyordnungen stärker als die klassische Greedy-Conjecture. * Es wird eine neue bedingte lineare Ungleichung auf Strings -- die Tripelungleichung -- gezeigt, die für das eben genannte Hauptergebnis wesentlich ist. * Schließlich wird gezeigt, dass die zum Nachweis der oberen Schranke von 3,5 für den Approximationsfaktor herangezogenen bedingten Ungleichungen (etwa die Monge-Ungleichung) inhärent zu schwach sind, um die Greedy-Conjecture selbst für lineare Greedyordnungen zu beweisen. Also ist die neue Tripelungleichung auch notwendig. Zuletzt wird gezeigt, dass das um die Tripelungleichung erweiterte System bedingter linearer Ungleichungen inhärent zu schwach ist, um die klassische Greedy-Conjecture für beliebige Greedyordnungen zu beweisen. Mit der Analyse von Queueing Strategien im Adversarial Queueing Modell wird auch ein Fall betrachtet, in dem Heuristiken auf Grund von anwendungsspezifischen Forderungen wie Online-Setup und Lokalität eingesetzt werden. Pakete sollen in einem Netzwerk verschickt werden, wobei jeder Rechner nur begrenzte Information über den Zustand des Netzwerks hat. Es werden Klassen von Queueing Strategien untersucht und insbesondere untersucht, wovon Queueing Strategien ihre lokalen Entscheidungen abhängig machen sollten, um ein gewisses Qualitätsmerkmal zu erreichen. Die hier erzielten Ergebnisse sind: * Jede Queueing Strategie, die ohne Zeitstempel arbeitet, kann zu einer exponentiell großen Queue und damit zu exponentiell großer Verzögerung (im Durchmesser und der Knotenzahl des Netzwerks) gezwungen werden. Dies war bisher nur für konkrete prominente Strategien bekannt. * Es wird eine neue Technik zur Feststellung der Stabilität von Queueing Strategien ohne Zeitnahme vorgestellt, die Aufschichtungskreise. Mit ihrer Hilfe können bekannte Stabilitätsbeweise prominenter Strategien vereinheitlicht werden und weitere Stabilitätsergebnisse erzielt werden. * Für die große Teilklasse distanzbasierter Queueing Strategien gelingt eine vollständige Klassifizierung aller 1-stabilen und universell stabilen Strategien.